Charakterisierung immunpathologischer Prozesse unter besonderer

Hannover 2013
Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Pathologie
ISBN 978-3-86345-155-4
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH
35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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Hermann Maximilian Iseringhausen
Die demyelinisierende kanine Staupeenzephalitis:
Charakterisierung immunpathologischer Prozesse
unter besonderer Berücksichtigung
regulatorischer T-Zellen und der Apoptose
Hermann Maximilian Iseringhausen
Hannover 2013
Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2013
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Die demyelinisierende kanine Staupeenzephalitis:
Charakterisierung immunpathologischer Prozesse unter
besonderer Berücksichtigung regulatorischer T-Zellen und
der Apoptose
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Hermann Maximilian Iseringhausen
Hannover
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Andreas Beineke
Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter:
Prof. Dr. Andreas Beineke
Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachterin:
PD Dr. Maren Fedrowitz
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung:
23. Mai 2013
Für meine Familie
Teile der vorliegenden These wurden bereits als Kongressbeiträge präsentiert:
Posterpräsentation
ISERINGHAUSEN M., W. BAUMGÄRTNER u. A. BEINEKE (2012):
Phänotypisierung von Entzündungszellen bei der demyelinisierenden Hundestaupe
unter Berücksichtigung regulatorischer T-Zellen.
„Abstracts zur 55. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe „Pathologie“, 10./11. März
2012 in Fulda“, Tierärztl Prax K 3, A23
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ..................................................................1
2 Literaturübersicht.....................................................3
2.1
Das Hundestaupe-Virus ............................................................................... 3
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.2
Regulatorische T-Zellen ............................................................................. 14
2.2.1
2.3
Die Staupevirus-Infektion ...................................................................... 4
Pathogenese und Immunpathologie der Staupevirus-Infektion............. 6
Pathogenese und Immunpathologie der Staupeenzephalitis ................ 9
Regulatorische T-Zellen bei ZNS-Erkrankungen................................. 16
Apoptose .................................................................................................... 23
2.3.1
Apoptose bei der Staupevirus-Infektion .............................................. 27
3 Materialien und Methoden .....................................31
3.1
Untersuchte Hunde..................................................................................... 31
3.2
Gewebeproben für Histologie, Immunhistologie und TUNEL-Methode ...... 32
3.3
Lichtmikroskopische Untersuchung und Einteilung der Staupeläsionen..... 34
3.4
Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung ................................................. 36
3.4.1
3.5
Immunhistologie und TUNEL-Methode....................................................... 37
3.5.1
3.5.2
3.5.3
3.5.4
3.6
Protokoll für die Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung ................ 36
Antikörper, TUNEL-Kit und Seren ....................................................... 38
Protokoll für die Immunhistologie an Paraffinschnitten........................ 40
Protokoll für die TUNEL-Methode an Paraffinschnitten....................... 41
Kontrollen für die Immunhistologie und TUNEL-Methode ................... 43
Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung........................................................ 44
3.6.1
3.6.2
3.6.3
Antikörper, TUNEL-Kit und Seren ....................................................... 46
Protokoll für die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung....................... 46
Kontrollen für die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung .................... 48
3.7
Auswertung der Lichtmikroskopie, Immunhistologie und TUNEL-Methode 49
3.8
Auswertung der Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung.............................. 51
3.9
Statistische Auswertung ............................................................................. 51
I
4 Ergebnisse ..............................................................53
4.1
Lichtmikroskopische und immunhistologische Auswertung für die
Gruppeneinteilung ...................................................................................... 53
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.2
Immunhistologische Detektion von Oligodendrozyten, Astrozyten und
Albumin ...................................................................................................... 65
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.3
CD3+ T-Zellen ..................................................................................... 74
Foxp3+ regulatorische T-Zellen ........................................................... 76
CD79α+ B-Zellen ................................................................................. 80
BS-1+ Makrophagen/Mikroglia ............................................................ 82
MAC 387+ Monozyten ......................................................................... 84
MHC-II+ Antigen-präsentierende Zellen .............................................. 87
Immunhistologische Untersuchungen zur Apoptose................................... 89
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.4.5
4.4.6
4.4.7
4.5
Nogo-A................................................................................................ 65
Saures Gliafaserprotein (GFAP) ......................................................... 67
Aquaporin-4 (AQP-4) .......................................................................... 69
Albumin ............................................................................................... 73
Immunhistologische Phänotypisierung der Entzündung ............................. 74
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.4
Befunde bei den Kontrollhunden ......................................................... 53
Befunde bei den Staupevirus-infizierten Hunden ................................ 53
Staupevirus-Nukleoprotein.................................................................. 58
Myelin-basisches Protein (MBP) ......................................................... 62
Aktivierte Caspase-3 ........................................................................... 89
TUNEL-Methode ................................................................................. 92
Fas-Rezeptor ...................................................................................... 95
Bax Protein ......................................................................................... 97
Bcl-2 Protein ....................................................................................... 99
Survivin Protein ................................................................................. 101
cIAP-2 Protein................................................................................... 104
Immunfluoreszenzmikroskopische Auswertung........................................ 107
4.5.1
4.5.2
4.5.3
4.5.4
4.5.5
TUNEL+ Zellen und Expression aktivierter Caspase-3...................... 108
TUNEL+ Zellen und Expression des von Willebrand Faktors ............ 109
TUNEL+ Zellen und Expression von CD3.......................................... 110
TUNEL+ Zellen und Expression von GFAP ....................................... 111
TUNEL+ Zellen und Expression von Nogo-A..................................... 112
II
5 Diskussion ............................................................113
5.1
Pathologie der Staupeenzephalitis ........................................................... 113
5.1.1
5.2
Demyelinisierung bei der Staupeenzephalitis ................................... 115
Immunphänotypisierung bei der Staupeenzephalitis ................................ 116
5.2.1
Regulatorische T-Zellen bei der Staupeenzephalitis ......................... 118
5.3
Störung der Blut-Hirn-Schranke bei der Staupeenzephalitis .................... 123
5.4
Apoptose bei der Staupeenzephalitis ....................................................... 125
5.4.1
5.4.2
5.5
Pro-apoptotische Mechanismen bei der Staupeenzephalitis............. 127
Anti-apoptotische Mechanismen bei der Staupeenzephalitis ............ 128
Schlussbetrachtung .................................................................................. 129
6 Zusammenfassung...............................................131
7 Summary ...............................................................135
8 Literaturverzeichnis .............................................139
9 Anhang ..................................................................165
9.1
Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper................... 165
9.2
Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel ............................ 168
9.3
Lösungen und Puffer ................................................................................ 170
9.3.1
9.3.2
9.3.3
Histologie (Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung)..................... 170
Immunhistologie ................................................................................ 171
TUNEL-Methode (Peroxidase und Fluorescein KIT) ......................... 171
9.4
p-Werte..................................................................................................... 173
9.5
Abkürzungsverzeichnis............................................................................. 176
10 Danksagung..........................................................181
III
Einleitung
1
1
Einleitung
Das kanine Staupevirus (canine distemper virus; CDV) ist ein behülltes,
einzelsträngiges RNS-Virus aus der Familie der Paramyxoviridae. Beim Hund stellt
die demyelinisierende Leukoenzephalitis die typische Manifestationsform der
nervösen Staupe dar (BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005; GAEDKE et al. 1997).
Die Veränderungen im Zentralen Nervensystem (ZNS) bei der Hundestaupe zeigen
deutliche Ähnlichkeiten mit solchen bei der Multiplen Sklerose (MS) des Menschen.
Trotz zahlreichen Untersuchungen sind die genauen Mechanismen der Initiation und
Progression der CDV-induzierten Entmarkungsenzephalitis bisher ungeklärt. In der
Frühphase der Infektion dominieren Virus-bedingte Prozesse im Neuroparenchym,
wie z.B. Axono- und Oligodendropathien. Dieser initiale Gewebschaden ist weiterhin
mit
einer
Infiltration
von
zytotoxischen
T-Zellen
und
Mikroglia-Aktivierung
vergesellschaftet (ALLDINGER et al. 1996; SCHOBESBERGER et al. 2002;
SEEHUSEN u. BAUMGÄRTNER 2010; TIPOLD et al. 2001). In der Spätphase der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis finden sich entzündliche Prozesse vom Typ
einer verzögerten Überempfindlichkeitsreaktion (WÜNSCHMANN et al. 1999).
Regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung
der immunologischen Toleranz sowie der Hemmung immunpathologischer Prozesse
(VIGNALI et al. 2008). Bei der Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
(EAE) und der murinen Coronavirus-induzierten Enzephalitis führt die in vivo
Vermehrung oder der adoptive Transfer von Treg zu einer verminderten
Demyelinisierung (JEE et al. 2007; TRANDEM et al. 2010). Der therapeutische Effekt
von Treg konnte auch bei anderen immunpathologischen Erkrankungen, wie z.B.
dem autoimmunen Diabetes mellitus, gezeigt werden. Hierbei bewirken Treg eine
Inaktivierung autoreaktiver T-Zellen und verhindern damit einerseits die Entwicklung
und fördern andererseits die Heilung von der Erkrankung (TANG et al. 2004). Eine
Dysregulation der Treg-Differenzierung führt hingegen zu einer vermehrten
Aktivierung
von
Th17
T-Effektorzellen
und
damit
zur
Potenzierung
immunpathologischer Prozesse (BETTELLI et al. 2006). Andererseits führen Treg
aufgrund ihrer immunsuppressiven Eigenschaften zu einer verminderten spezifischen
2
Einleitung
Immunantwort und begünstigen so eine Erregerpersistenz bei chronisch-infektiösen
Krankheiten, wie beispielweise bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis
(TME), einem viralen Maus-Modell für demyelinisierende ZNS-Erkrankungen
(HERDER et al. 2012; RICHARDS et al. 2011). Welche Rolle Treg bei der
Hundestaupe spielen ist bisher jedoch unklar. Insbesondere stellt sich die Frage
nach der Bedeutung dieser immunmodulatorischen T-Zell-Population während der
Initiation und der Progression der CDV-vermittelten Leukoenzephalitis.
Die Apoptose hat einen entscheidenden Einfluss auf die Regulation entzündlicher
Prozesse im ZNS (REICHARDT u. LUHDER 2012; ZIPP 2000). So werden aktivierte
T-Zellen teilweise über den Mechanismus der Aktivierungs-induzierten Apoptose
(activation-induced cell death; AICD) zum Abschluss der Entzündung eliminiert.
Damit soll einer überschießenden und gewebeschädigenden Immunreaktion und der
Generierung potentiell autoreaktiver T-Zellen vorgebeugt werden (BRENNER et al.
2008). Beispielsweise wird die akute Phase der TME über eine vermehrte Rezeptorvermittelte Apoptose infiltrierender T-Zellen terminiert ohne dass es zu einer
vollständigen Virus-Elimination kommt (OLESZAK et al. 2003). Über die AICD kann
es also auch zu einer Unterdrückung der Virus-spezifischen Immunantwort kommen,
womit potentiell die Erregerpersistenz ermöglicht wird (IKEN et al. 2006). In der
chronischen demyelinisierenden Phase der TME und bei der MS hingegen wird eine
erhöhte Apoptose-Resistenz der Leukozyten beobachtet und für die progressive
Entzündung verantwortlich gemacht (OLESZAK et al. 2003; SHARIEF u. SEMRA
2001). Die Rolle der Apoptose im Verlauf der CDV-vermittelten Leukoenzephalitis ist
bisher nur unzureichend untersucht worden (SCHOBESBERGER et al. 2005).
Die Bedeutung der Immunmodulation im Verlauf der Hundestaupe ist weitgehend
unklar. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Frage, ob Treg einen
protektiven Effekt ausüben oder die Viruspersistenz und damit möglicherweise die
Entmarkung bei der Hundestaupe begünstigen. Weiterhin sollen die Beudeutung und
die Mechanismen der Apoptose von Leukozyten und Zellen des Neuroparenchyms in
diesem Zusammenhang näher untersucht werden.
Literaturübersicht
3
2
Literaturübersicht
2.1
Das Hundestaupe-Virus
Das Hundestaupe-Virus (canine distemper virus, CDV) ist ein Morbillivirus aus der
Familie der Paramyxoviridae, Unterfamilie Paramyxovirinae. Weitere SpeziesVertreter aus dem Genus Morbillivirus umfassen das Seehundstaupe-Virus (phocine
distemper virus, PDV), das Rinderpest-Virus (RPV), das Virus der Pest der kleinen
Wiederkäuer
(Peste-des-petits-ruminants
virus,
PPRV)
und
das
für
die
Humanmedizin bedeutsame Masernvirus (Measles Virus, MV; HAAS 2011). Bei den
Meeressäugern
werden
außerdem
das
dolphin
morbillivirus
(DMV),
das
Schweinswal-Morbillivirus (porpoise morbillivirus, PMV) und das Pilot whale
morbillivirus (PWMW) als Stämme des Genus Cetacean morbillivirus (CeMV)
beschrieben (BELLIÈRE et al. 2011).
Morbilliviren gehören zu der Ordnung Mononegavirales. Es handelt sich hierbei um
behüllte, einzelsträngige und nicht-segmentierte RNS-Viren mit negativer Polarität.
Das lineare Genom des Hundestaupe-Virus umfasst 15.690 Nukleotide und befindet
sich in enger Assoziation mit dem Nukleokapsid (N)-Protein (Ribonukleokapsid).
Zusammen mit dem Phospho (P)- und dem Large (L, RNS-Polymerase)-Protein wird
ein helikaler Ribonukleoprotein-Komplex gebildet. Dieser ist von einer Virushülle
umgeben in welche zwei Glykoproteine, das Hämagglutinin (H, attachment)- und das
Fusions (F)-Protein, integriert sind. Das Matrix (M)-Protein ist unterhalb der
Virushülle lokalisiert und verbindet diese mit dem Ribonukleoprotein-Komplex. Neben
den genannten sechs Strukturproteinen werden auch zwei Nicht-Strukturproteine,
das C- und V-Protein, exprimiert, deren genetische Information jeweils auf dem
P-Gen lokalisiert ist (CURRAN et al. 1992; HAAS 2011).
Am 3’-Ende des RNS-Strangs befindet sich eine nicht-kodierende Leader-Sequenz
an welcher die im Zytoplasma stattfindende Transkription beginnt. Es schließen sich,
in der genannten Reihenfolge, die Transkriptionseinheiten für das N-, P (C/V)-, M-,
F-, H- und L-Protein an. Das 5’-Ende wird von einer nicht-kodierenden TrailerSequenz gebildet. Die einzelnen Gene werden durch nicht-kodierende intergene
4
Literaturübersicht
Sequenzen, die so genannten untranslated regions (UTR’s), separiert. Diese spielen
für die Aktivität der RNS-Polymerase aufgrund ihrer Start/Stop-Funktion eine wichtige
Rolle, denn neben einer fortlaufenden linearen Enzymaktivität ist auch eine
Dissoziation der Polymerase im UTR-Segment vom viralen RNS-Strang möglich.
Folglich werden Gene am 3’-Ende häufiger transkribiert als solche am 5’-Ende. Es
entsteht ein abnehmender Konzentrationsgradient der synthetisierten mRNS oben
genannter Gene in der angeführten Reihenfolge (WRIGHT et al. 2005). Mit
Ausnahme der mRNS für das P-Protein kodieren die übrigen fünf ausschließlich für
ein Protein (monozystronische mRNS). Erstgenannte wird post-transkriptionell nach
Insertion eines G-Nukleotids über die RNS-Polymerase modifiziert (RNS-Editierung;
RNA editing), und es kommt zu einer Verschiebung des Leserahmens. Das Produkt
ist das V-Protein, welches eine mit dem P-Protein identische N-terminale jedoch
einzigartige C-terminale Aminosäuresequenz aufweist. Das C-Protein wird hingegen
durch das Ablesen eines zweiten, alternativen offenen Leserahmens (open reading
frame; ORF) synthetisiert und ist deutlich kürzer als das P-Protein (SAWATSKY et al.
2011; SUGAI et al. 2009; VIDAL et al. 1990).
Das CDV ist weltweit verbreitet und auf vielen Kontinenten endemisch. Das Virus ist
serologisch einheitlich, dennoch existieren zahlreiche Isolate (Stämme) mit
unterschiedlicher Virulenz. Aufgrund der höchsten genetischen Variation innerhalb
des
H-Proteins
Berücksichtigung
dienten
dessen
geographischer
genomische
Faktoren
zur
Sequenzanalysen
derzeitigen
unter
phylogenetischen
Einteilung in sieben so genannte Cluster von CDV-Stämmen: American-1
(Impfstämme), American-2, Arctic-like, Asia-1, Asia-2, Europe und European wildlife
(BLIXENKRONE-MØLLER et al. 1992; IWATSUKI et al. 2000; MCCARTHY et al.
2007).
2.1.1
Die Staupevirus-Infektion
Die Hundestaupe ist ein seit Jahrhunderten bekanntes Krankheitsbild und stellte vor
der Einführung spezifischer Vakzinen eine weit verbreitete, hochansteckende und
verlustreiche Krankheit bei Hunden dar (JENNER 1809; TIZARD 1998). In den
Literaturübersicht
5
Industrienationen mit weitgehend geschlossener Impfdecke werden auch heutzutage
gelegentlich Krankheitsausbrüche in der Hundepopulation beobachtet. Hier stellen
insbesondere Wildtiere ein permanentes Reservoir für das CDV dar (DENZIN et al.
2013; ORIGGI et al. 2012; SCHUMAKER et al. 2012).
Das Infektionsspektrum des Hundestaupe-Virus umfasst zahlreiche Spezies
aquatischer und terrestrischer Karnivoren. Empfängliche terrestrische Karnivore,
unter der ehemals gebräuchlichen Subordnung der Landraubtiere (Fissipedia)
zusammengefasst,
umfassen
die
Familien
der
Hundeartigen
(Canidae),
Katzenartigen (Felidae), Hyänenartigen (Hyanidae), Marderartigen (Mustelidae),
Kleinbären (Procyonidae), Großbären (Ursidae), Schleichkatzen (Viverridae) und des
kleinen Pandas (Ailuridae; DEEM et al. 2000; ITAKURA et al. 1979). Zu den
anfälligen aquatischen Karnivoren, in der ehemaligen Subordnung der Robben oder
Wasserraubtiere (Pinnipedia) klassifiziert, gehören Spezies aus der Familie der
Walrosse (Odobenidae) und Hundsrobben (Phocidae; KENNEDY 1998). Weiterhin
sind natürliche CDV-Infektionen bei Primaten und Halsbandpekaris beschrieben
(NOON et al. 2003; QIU et al. 2011; YOSHIKAWA et al. 1989). Experimentelle
Infektionen sind bei Mäusen, Meerschweinchen und Totenkopfäffchen möglich
(BERNARD et al. 1983; NAGATA et al. 1990; YOSHIKAWA et al. 1981).
Eine Infektion mit dem CDV führt in Abhängigkeit von der betroffenen Spezies, Alter,
Immunstatus, Umweltbedingungen und Virusstamm zu inapparenten Infektionen bis
hin zu schweren Krankheitsverläufen mit hoher Mortalität. Bei Frettchen liegt die
Letalität nach experimentellen Feldvirus-Infektionen bei bis zu 100% (GREENE u.
VANDEVELDE 2012; VAN MOLL et al. 1995; VON MESSLING et al. 2003).
Zunächst werden 3 bis 6 Tage nach der Infektion (p.i., post infectionem) ein
transientes Fieber und eine Leukopenie beobachtet (KRAKOWKA et al. 1980). In der
Folge stehen neben unspezifischen klinischen Symptomen wie Apathie, Anorexie,
Dehydrierung oder Affektionen im Bereich der Kopfschleimhäute (Konjunktivitis,
Rhinitis), insbesondere gastrointestinale (Durchfall, Vomitus) und respiratorische
Symptome (Dyspnoe, Husten, Pneumonie), zusammengefasst als katarrhalische
Formen, im Vordergrund. Weiterhin können neuronale Symptome (nervöse Form)
wie
Ataxie,
Hyperästhesie,
Kopftremor,
Spasmen
der
Kopf-,
Hals-
und
6
Literaturübersicht
Gliedmaßenmuskulatur, Paresen und Krampfanfälle beobachtet werden. Eine
Kombination aus katarrhalischer und nervöser Symptomatik ist möglich (systemische
Form).
Besonderheiten
im
Rahmen
von
CDV-Infektionen
können
sich
in
Hautreaktionen (Staupeexanthem, Staupepusteln), proliferativen Veränderungen des
Nasenspiegels und der Fußballen (Hartballenkrankheit; hard pad disease), in
Schmelzhypoplasien (Staupegebiss) oder einer hypertrophischen Osteopathie
darstellen (BAUMGÄRTNER et al. 1995; DEEM et al. 2000; DUBIELZIG et al. 1981;
GRÖNE et al. 2003; HIGGINS et al. 1982a). Aufgrund einer ausgeprägten
Immunsuppression
kommt
es
außerdem
häufig
zu
Sekundärinfektionen
(KRAKOWKA et al. 1975).
In der Regel sind Tiere jeden Alters empfänglich, jedoch sind nicht-geimpfte,
entwöhnte Welpen von 3 bis 6 Monaten am häufigsten betroffen. Die klinischen
Symptome der Hundestaupe können sich sehr unterschiedlich präsentieren und
erlauben lediglich bei der katarrhalischen, nervösen oder systemischen Form eine
presumptive Verdachtsdiagnose (MORITZ et al. 1998; TIPOLD et al. 1992). Für die
antemortem Diagnosefindung eignen sich Probenmaterialien wie Konjunktival- oder
Nasentupfer, Blut, Urin oder Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor cerebrospinalis,
cerebrospinal fluid, CSF), für die unterschiedliche molekularbiologische, serologische
und virologische Untersuchungsmethoden zur Verfügung stehen (AMUDE et al.
2006; AN et al. 2008; FRISK et al. 1999b; GREENE u. VANDEVELDE 2012).
2.1.2
Pathogenese und Immunpathologie der Staupevirus-Infektion
Die Infektion mit dem CDV verläuft in der Regel aerogen bzw. über das Aerosol
und/oder oral über virushaltige Se- und Exkrete durch direkten Kontakt mit infizierten
Tieren. Aufgrund der geringen Tenazität des CDV sind indirekte Infektionen selten.
Ein transplazentärer
Infektionsweg
ist
ebenfalls
beschrieben (HAAS 2011;
KRAKOWKA et al. 1974). Nach dem Viruseintritt kommt es zu einer Infektion und
Replikation
in
den
residenten,
Schleimhaut-assoziierten
Lymphozyten
und
Makrophagen des oberen Respirationstrakts. Es folgt eine Migration mit Replikation
in den regionären lymphatischen Geweben (2 bis 5 Tage p.i.) wie Tonsillen,
Literaturübersicht
7
retropharyngeale und bronchiale Lymphknoten. Während der ersten Virämiephase
6 bis 8 Tage p.i. kommt es zu einer zellgebundenen (mononukleäre Zellen und
Thrombozyten)
und/oder
nicht-zellgebundenen
hämatogenen
Ausbreitung
in
zahlreiche lymphoretikuläre Gewebe wie Milz, Thymus, Knochenmark, Lymphknoten,
Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe (z.B. im Magen-Darm-Trakt) und Zellen
des mononukleären Phagozytosesystems (z.B. Kupffer-Sternzellen in der Leber).
Nach einer zweiten, epitheliotropen Virämiephase 8 bis 9 Tage p.i. sind nahezu alle
Gewebe betroffen, darunter Zellen des Respirations-, Gastrointestinal- und
Urogenitaltrakts, des Endokrinums, Endothels und ZNS sowie der Haut. Neben der
überwiegenden Infektion epithelialer Zellen können aber auch mesenchymale Zellen
betroffen sein. Von diesem Zeitpunkt an ist infektiöses Virus in der Lage die
Wirtszellen und den Wirtsorganismus zu verlassen (viral shedding; APPEL 1970;
BEINEKE et al. 2009; FRISK et al. 1999b; KOUTINAS et al. 2004; KRAKOWKA et al.
1987; OKITA et al. 1997).
Der Krankheitsverlauf der Hundestaupe ist im Wesentlichen von der individuellen
immunologischen Reaktionslage abhängig. Tiere mit Ausbildung einer robusten
humoralen und zellvermittelten Immunantwort eliminieren das CDV aus den meisten
Geweben bis zum Tag 14 p.i. und zeigen einen subklinischen Verlauf mit
vorübergehender Virusausscheidung. Tiere mit einer schwächeren, intermediären
Immunantwort zeigen unterschiedliche klinische Symptome (s.o.), welche mit dem
verzögerten Erreichen eines belastbaren anti-CDV-Titers wieder abklingen können.
Eine vollständige Viruselimination wird nicht beobachtet. Es kommt in der Regel zu
einer Viruspersistenz in Zellen verschiedener Gewebe, darunter Zellen der Uvea,
Neuronen oder Keratinozyten (GRÖNE et al. 2003; SUMMERS et al. 1983;
ZURBRIGGEN et al. 1995). Neben der Höhe des anti-CDV-Titers ist sowohl die
initiale
Produktion
spezifischer
Immunglobuline
gegen
Strukturen
des
Ribonukleoprotein-Komplexes (N- und P-Protein) als auch die darauffolgende
Produktion von Immunglobulinen gegen Glykoproteine der Virushülle (F- und
H-Protein) erforderlich. Letztere spielen eine Rolle bei der Pathogenese von ZNSVeränderungen (RIMA et al. 1991). Tiere mit einer unzureichenden humoralen und
8
Literaturübersicht
zellulären Immunantwort zeigen eine fortwährende Viruspersistenz und schwere
klinische Symptome (s.o.), in der Regel mit letalem Ausgang (APPEL et al. 1982).
Die CDV-Infektion führt 3 bis 6 Tage p.i. zu einer ausgeprägten und lang
anhaltenden Immunsuppression mit einer bis zu 70 Tage fortbestehenden
Leukopenie. Diese ist durch eine hochgradige und andauernde Depletion von
T-Zellen, insbesondere CD4+ T-Zellen, sowie in geringerem Ausmaße von B-Zellen
und neutrophilen Granulozyten, charakterisiert. Eine Depletion von Monozyten
hingegen wird nur in geringem Umfang oder gar nicht beobachtet (APPEL et al.
1982; MCCULLOUGH et al. 1974; STEIN et al. 2008; TIPOLD et al. 2001). Weiterhin
zeigen Lymphozyten aus dem Blut CDV-infizierter Tiere eine verminderte
Proliferation in vitro (APPEL et al. 1982; KRAKOWKA et al. 1975). Bei experimentell
CDV-infizierten Frettchen konnte in der frühen Infektionsphase in peripheren
mononukleären Zellen eine V-Protein-abhängige verminderte Expression von AlphaInterferon (IFN-α), IFN-γ, Interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-6 und Tumornekrosefaktor-α
(TNF-α) festgestellt werden. Dadurch wird die Ausbildung einer protektiven,
antiviralen Immunantwort erschwert und gleichzeitig eine effektive Virusreplikation in
Lymphozyten begünstigt (VON MESSLING et al. 2006).
Eine wichtige pathogenetische Rolle in der frühen, lymphotropen Phase der CDVInfektion spielt die selektive Interaktion des attachment (H)-Proteins der Virushülle
mit
dem
signaling
lymphocyte
activation
molecule
(SLAM;
CD150),
ein
Membranprotein auf den wirtseigenen Immunzellen aus der Immunglobulin (Ig)Superfamilie (BARON 2005; TATSUO et al. 2001; VON MESSLING et al. 2005).
SLAM wird von aktivierten B- und T-Zellen, einschließlich regulatorischer T-Zellen,
T-Gedächtniszellen, Monozyten, dendritschen Zellen sowie immaturen Thymozyten
exprimiert. Neben der gezielten Infektion kommt es zu einer raschen Ausbreitung
und Replikation des CDV in den lymphatischen Geweben (BROWNING et al. 2004;
VON MESSLING et al. 2006). Weiterhin wird eine Aufregulation des SLAM-Moleküls
im Verlauf der CDV-Infektion beobachtet (WENZLOW et al. 2007). Neuere in vitro
und in vivo-Untersuchungen zeigen, dass Nectin-4, ein Zelladhäsionsmolekül aus der
Ig-Superfamilie, als Rezeptor auf epithelialen und neuronalen Zellen eine wichtige
Rolle im Hinblick auf SLAM-unabhänigige Infektionswege von Morbilliviren spielt
Literaturübersicht
9
(BIERINGER et al. 2013; MÜHLEBACH et al. 2011; PRATAKPIRIYA et al. 2012). Für
das Transmembranprotein CD9 ließ sich lediglich in vitro eine Bedeutung bei der
Infektion mit attenuierten CDV-Stämmen sowie für die Zell-Zell-Fusion nachweisen
(SCHMID et al. 2000). Attenuiertes MV kann über CD46, ein funktionell
inhibitorisches
Membranprotein
in
der
Komplement-Kaskade
mit
ubiquitärer
Expression, effektiv Vero Zellen in vitro infizieren, jedoch wird ihm bei der
CDV-Infektion bisher keine Rolle zugesprochen (FUJITA et al. 2007; SCHNEIDERSCHAULIES et al. 1995). Weitere Rezeptoren sind Gegenstand der Diskussion bei
Morbillivirus-Infektionen, insbesondere dem MV, deren Bedeutung für das CDV noch
nicht geklärt ist (SCHNEIDER-SCHAULIES u. SCHNEIDER-SCHAULIES 2008).
2.1.3
Pathogenese und Immunpathologie der Staupeenzephalitis
Die kanine Staupeenzephalitis (canine distemper encephalitis, CDE) entspricht
keinem einheitlichen Bild, sondern es werden in Abhängigkeit vom Alter des Tieres,
Immunstatus, Virusstamm und Untersuchungszeitpunkt verschiedene Formen
beobachtet. Die häufigste Form der CDE ist eine Leukoenzephalitis, verursacht
durch Stämme wie Cornell A75/17 (CDV-A75/17) oder Ohio R252 (CDV-R252). Sie
ist in unterschiedlichem Maße von einer Demyelinisierung und mononukleären
Entzündungszellinfiltration begleitet und findet sich vor allem in der weißen Substanz
des Kleinhirns (weniger häufig im Großhirn) sowie in der periventrikulären weißen
Substanz
des
vierten
Ventrikels,
des
Rückenmarks
und
der
optischen
Nervenbahnen. Seltener wird eine nicht-eitrige Polioenzephalitis, z.B. im Rahmen
einer Infektion mit dem Snyder Hill-Stamm (CDV-SH), in den Bereichen des
zerebralen Kortex und der Kerngebiete des Hirnstammes beobachtet. Hierbei wird
zwischen einer so genannten old dog encephalitis (ODE), einer post-vaccinal
encephalitis (PVE) und einer Sonderform, der inclusion body encephalitis (IBE),
unterschieden. Mischformen sind möglich, werden aber in der Regel von einer Form
dominiert (AMUDE et al. 2011; BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005; NESSELER
et al. 1999; SUMMERS et al. 1984; VANDEVELDE et al. 1980).
10
Literaturübersicht
Auf hämatogenen Weg kommt es zu einer Infektion des Neuroparenchyms,
Choroidplexusepithels und der Meningen. Dabei gelangt das CDV über kleinere
Blutgefäße zellassoziiert (mononukleäre Zellen) oder als freies, so genanntes
Plasma-Phasen
Virus
in
den
perivaskulären
Raum
oder
infiziert
direkt
Endothelzellen. Die Infektion schreitet intrazellulär zunächst über Perizyten,
meningeale Zellen und die astrozytären Fußfortsätze der Blut-Hirn-Schranke (BHS)
und dann vornehmlich über astrozytäre Zell-zu-Zell-Kontakte fort. Dem CDV gelingt
damit unter weitgehendem Ausschluss der lokalen Immunüberwachung eine
Migration über weite Strecken, wodurch ein zeitlich und räumlich getrenntes
Entstehen neuer Entzündungsherde möglich ist (AXTHELM u. KRAKOWKA 1987;
WYSS-FLUEHMANN
et
al.
2010).
Über
das
Choroidplexusepithel
erreicht
zellassoziiertes und freies CDV den Liquor cerebrospinalis und somit wird eine
Infektion periventrikulärer, subependymaler und subpialer Regionen entlang der
Neuraxis des ZNS ermöglicht (HIGGINS et al. 1982b). Bei Frettchen ließ sich
experimentell ein neurogener Infektionsweg über das Riechepithel nachweisen
(RUDD et al. 2006).
Zahlreiche in vitro und in vivo Untersuchungen belegen letztendlich, unter
Berücksichtigung
von
Virusstamm
CDV-Infektionsspektrum,
wobei
darstellen,
Neuronen,
gefolgt
von
und
Infektionsphase,
Astrozyten
die
Mikroglia,
ein
wichtigste
Ependym-,
umfangreiches
Zielzellpopulation
Leptomeninx-
und
Choroidplexusepithelzellen sowie auch Oligodendrozyten und gliale Vorläuferzellen
(GRABER et al. 1995; MUTINELLI et al. 1989; ORLANDO et al. 2008;
WÜNSCHMANN et al. 1999).
Die CDV-Leukoenzephalitis wird als biphasischer Krankheitsprozess verstanden.
Initial stehen dabei direkte Virus-induzierte Gewebeschäden im Vordergrund, welche
unmittelbar mit einer intraläsionalen Virusreplikation in Gliazellen korrelieren. Im
Zuge der Krankheitsprogression mit gleichzeitig zu beobachtender Viruselimination,
spielen
später
zunehmend
immunpathologische
Prozesse
eine
Rolle
(BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005; SUMMERS u. APPEL 1994; VANDEVELDE
et al. 1985).
Literaturübersicht
11
Ultrastrukturell können im ZNS 9 bis 10 Tage p.i. Viruspartikel detektiert werden und
vor dem Auftreten histopathologischer Veränderungen in der Lichtmikroskopie lassen
sich Virus-Antigen und -mRNS im Neuroparenchym nachweisen (GAEDKE et al.
1999; HIGGINS et al. 1982a). In dieser Phase zeigt sich bereits eine aufregulierte
Expression von Antigen-präsentierenden Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse IIMolekülen (major histocompatibility complex class II; MHC-II), welche im weiteren
Krankheitsverlauf kontinuierlich zunimmt (ALLDINGER et al. 1996).
Mit Krankheitsprogression treten in der akuten Phase der CDV-Leukoenzephalitis
erste
herdförmige
histopathologische
Veränderungen
auf,
welche
in
vivo
experimentell ab Tag 18 p.i. belegt sind. Die Läsionen, oder auch Plaques, werden
bis
zu
diesem
Zeitpunkt
auf
direkte,
Virus-induzierte
Pathomechanismen
zurückgeführt. Diese äußern sich in einer Vakuolisierung der weißen Substanz als
Folge einer Ödematisierung der Myelinscheiden sowie einer Astro- und Mikrogliose.
In diesem Stadium liegen bereits axonale Schäden vor, welche lichtmikroskopisch
insbesondere in Form geschwollener axonaler Fortsätze (Sphäroide) erkennbar sind
(HIGGINS et al. 1982a; SEEHUSEN u. BAUMGÄRTNER 2010). Trotz zeitgleich
bestehender systemischer Immunsuppression kommt es zu einer mononukleären
Entzündungszellinfiltration, überwiegend von zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten
(TIPOLD et al. 1999b; WÜNSCHMANN et al. 1999). Im ZNS-Gewebe wird außerdem
in diesen frühen Phasen eine Aufregulation der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6,
IL-8, IL-12 und TNF-α beobachtet während die anti-inflammatorischen Zytokine IL-10
und TGF-β keine signifikanten Erhöhungen aufweisen (MARKUS et al. 2002).
In der subakuten Phase der CDV-Leukoenzephalitis, in vivo experimentell 24 bis 27
Tage p.i. belegt, entwickeln sich flächenhafte Läsionen innerhalb derer hohe Mengen
von Virus-Protein und -mRNS vorhanden sind (ALLDINGER et al. 1993; GAEDKE et
al. 1999; HIGGINS et al. 1982b; VANDEVELDE et al. 1982). Sie zeichnen sich durch
eine zunehmende Vakuolisierung und nunmehr beginnende Demyelinisierung aus.
Dabei kommt es initial zu einer segmentalen Separierung des Myelins vom Axon
durch astrozytäre Zellausläufer. Im Folgenden werden die Myelinlamellen durch
aktivierte Makrophagen/Mikroglia vom Axon fortgezogen und phagozytiert (myelinstripping).
Myelinfragmente
finden
sich
außerdem
extrazellulär
und
12
Literaturübersicht
intrazytoplasmatisch in Astrozyten sowie vereinzelten Oligodendrozyten (HIGGINS et
al. 1982b; SUMMERS u. APPEL 1987). Der Myelinschaden in den Plaques wird
weiterhin durch die erhöhte Phagozytoseaktivität aktivierter Makrophagen/Mikroglia
unter zunehmender Freisetzung reaktiver, gewebsschädigender Sauerstoffspezies
(reactive oxygen species, ROS) verstärkt (STEIN et al. 2004). In vitro und in vivo
Untersuchungen zeigen, dass der reduzierte Myelingehalt auch Folge einer
metabolischen Störung von Oligodendrozyten ist. Diese weisen eine verminderte
Transkription Myelin-spezifischer Gene auf, so z.B. für das Proteolipid-Protein (PLP),
das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) oder das Myelin-basische Protein (MBP;
GRABER et al. 1995; SCHOBESBERGER et al. 2002; ZURBRIGGEN et al. 1998).
Der Anteil infizierter Oligodendrozyten in den Läsionen liegt interessanterweise nur
bei bis zu 8%, wobei sich diese durch eine restriktive Infektion mit unvollständiger
Virusreifung auszeichnen (ZURBRIGGEN et al. 1998). Mehrheitlich hingegen sind
Astrozyten infiziert. Sie zeigen bis in diese Phase hinein eine deutliche Aufregulation
des Hyalorunat-Rezeptors (CD44), welche in den entzündlich-demyelinisierenden
Phasen wieder abnimmt (ALLDINGER et al. 2000; MUTINELLI et al. 1989).
Mit dem Einsetzen der Rekonstitution der lymphatischen Gewebe 6-7 Wochen p.i.
kommt es zu einer erhöhten mononukleären Infiltration der demyelinisierten Areale
des Neuroparenchyms sowie des perivaskulären Raumes (BEINEKE et al. 2009;
SUMMERS u. APPEL 1987). Innerhalb der Läsionen sind interessanterweise die
Mengen an CDV-Protein und -mRNA im Gegensatz zur Plaque-Peripherie deutlich
reduziert (ALLDINGER et al. 1993; BAUMGÄRTNER et al. 1989; GAEDKE et al.
1999). In diesen subakut-demyelinisierenden Phasen mit perivaskulärer Entzündung
bzw. chronischen Phasen schreitet die Entmarkung weiter voran. Trotzdem wird in
den
Läsionen
neben
einer
Astrogliose
kein
ausgeprägter
Verlust
von
Oligodendrozyten beobachtet (SCHOBESBERGER et al. 2002). Perivaskulär finden
sich neben CD8+ T-Lymphozyten auch vermehrt CD4+ T-Lymphozyten und CD21+
B-Zellen, während die Plaques und das angrenzende Neuroparenchym überwiegend
mit CD8+ T-Zellen infiltriert sind (ALLDINGER et al. 1996; WÜNSCHMANN et al.
1999). Der zunehmende Gewebeschaden wird auch in Zusammenhang mit einer
Literaturübersicht
gesteigerten
13
intrathekalen
humoralen,
Antikörper-vermittelten
Immunantwort
gebracht (VANDEVELDE et al. 1982; VANDEVELDE et al. 1986).
Der entzündliche Charakter einer Hypersensitivitätsreaktion vom verzögertern Typ,
der reduzierte Virus-Gehalt und die ausgeprägte MHC-II-Expression in den Plaques
lassen nunmehr auf eine Beteiligung immunpathologischer Prozesse schließen
(ALLDINGER et al. 1996; BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005; WÜNSCHMANN
et al. 1999).
Einen seltenen Befund stellen die sklerotischen Plaques (old sclerotic plaques) dar.
Hier
stehen
fokale
Proliferationen
von
Astrozyten
und
eine
ausgeprägte
Demyelinisierung ohne bedeutende Infiltration von Makrophagen/Mikroglia im
Mittelpunkt. Die Astrozyten in diesen sklerotischen Plaques sind durch große
Mengen an Zytoplasma, plumpe Fortsätze sowie eine bündelartige Anordnung
charakterisiert (VANDEVELDE et al. 1981).
Aufgrund morphologischer und neuropathologischer Ähnlichkeiten mit der humanen
MS gilt die CDV-Leukoenzephalitis als ein infektiöses, spontan-auftretendes,
translationales
Tier-Modell
für
Entmarkungskrankheiten
beim
Menschen
(BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005). Morbillivirus-Infektionen werden zwar mit
dem Auftreten der MS diskutiert, ein ätiologischer Zusammenhang ist jedoch nicht
gesichert (LANG et al. 2002; ROHOWSKY-KOCHAN et al. 1995; SERAFINI et al.
2007). Interessanterweise wurde in zahlreichen Gewebeproben von Patienten mit
Morbus
Paget,
Staupevirus-RNS
einer
deformierenden
nachgewiesen,
wobei
Knochenerkrankung
auch
hier
ein
des
Menschen,
grundsätzlicher
Zusammenhang nicht abschließend geklärt ist (GORDON et al. 1991; MEE et al.
1998).
14
2.2
Literaturübersicht
Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen (Treg) sind für die Aufrechterhaltung der ImmunHomöostase verantwortlich und spielen eine zentrale modulatorische Rolle bei der
Kontrolle der Immunantwort (ZHOU 2008). Die immunsuppressiven Eigenschaften
von Treg dienen insbesondere der Verhinderung autoimmuner Erkrankungen oder
immunpathologischer Prozesse bedingt durch infektiöse und nicht-infektiöse Noxen
(VIGNALI et al. 2008). Die Entwicklung von Treg findet im Thymus statt (natürliche
Treg) oder sie erfolgt im Rahmen der peripheren Immunantwort (induzierte Treg;
SAKAGUCHI et al. 2009; ZHAO et al. 2011). Natürliche Treg erkennen
charakteristischerweise
Autoantigene,
werden
aber
im
Gegensatz
zu
autoaggressiven T-Zellen nicht im Rahmen der negativen Selektion im Thymus
eliminiert (JORDAN et al. 2001; O'GARRA u. VIEIRA 2004). Die Thymusinvolution
hat interessanterweise keinen Einfluss auf die Anzahl und Funktionalität von Treg
(GREGG et al. 2005). Natürliche Treg zeigen eine konstitutive Expression
spezifischer Oberflächenantigene wie CD4, CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors),
CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen-4) und GITR (glucocorticoid-inducible tumor
necrosis factor receptor) sowie des Transkriptionsfaktors forkhead box P3 (Foxp3;
BELKAID u. ROUSE 2005; CERVANTES-BARRAGÁN et al. 2012; SAKAGUCHI et
al. 2001). Foxp3 konnte bei Mensch, Maus und Hund als Treg-spezifisches Molekül
identifiziert werden und ist damit ein wichtiger Marker für die Detektion von Treg.
Dabei ist Foxp3 essentiell für die Funktion natürlich vorkommender Treg
(FONTENOT et al. 2003; HORI et al. 2003; PINHEIRO et al. 2011). So führen
Mutationen
des
FOXP3-Gens
beim
Menschen
zum
immunodysregulation
polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome (IPEX-Syndrom). Betroffene
Personen zeigen durch die Dysfunktion der Treg ausgeprägte autoimmune
Reaktionen (BENNETT et al. 2001; OTSUBO et al. 2011). Vergleichbar hiermit führt
die Mutation bei männlichen Mäusen zum scurfy-Phänotyp mit einer nach
ca. 4 Wochen post partum letal verlaufenden, autoimmunen Erkrankung (SHARMA
u. JU 2010). Im Rahmen der peripheren Immunantwort differenzieren sich die so
genannten induzierten Treg aus CD4+Foxp3- T-Vorläuferzellen nach T-Zell-Rezeptor
Literaturübersicht
15
(T-cell receptor; TCR)-Stimulation unter Beteiligung Antigen-präsentierender Zellen
und in Abhängigkeit von TGF-β. Darüber hinaus ist IL-2 für die Aufrechterhaltung der
Funktion und Proliferation peripherer Treg wichtig (KRETSCHMER et al. 2005;
SETOGUCHI et al. 2005; WAINWRIGHT et al. 2011). Eine entscheidende Rolle bei
der Differenzierung von Treg spielt das lokale Zytokinmilieu. So kommt es unter der
Expression von IL-6 und TGF-β zu einer Differenzierung von T-Vorläuferzellen in proinflammatorische Th17 T-Effektorzellen (Teff) anstelle von Treg. Th17 Teff spielen
wiederum eine wichtige Rolle bei autoimmunen Erkrankungen wie der EAE und MS
(MIOSSEC 2009; QUINTANA et al. 2008; STOCKINGER et al. 2007; VELDHOEN et
al. 2006; WALSH u. KIPNIS 2011). Im Gegensatz dazu wirkt das für die
Treg-Funktion wichtige IL-2 inhibitorisch auf die Th17-Differenzierung (LAURENCE
et al. 2007).
Treg können über verschiedene Mechanismen eine ganze Reihe von Immunzellen
supprimieren. Dazu gehören T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen,
Mastzellen und natürliche Killerzellen (CERVANTES-BARRAGÁN et al. 2012;
SHEVACH 2009). Treg üben sowohl eine direkte, TCR-vermittelte als auch eine
indirekte immunsuppressive Wirkung auf ihre Zielzellen aus (VIGNALI et al. 2008).
Eine zentrale Funktion von Treg ist die Sekretion inhibitorischer Zytokine wie IL-10,
IL-35 und TGF-β. So spielt IL-10 bei der Hemmung und Termination entzündlicher
Prozesse durch Inhibition zahlreicher pro-inflammatorischer Effektorzellen eine
wichtige Rolle. Außerdem fördert IL-10 die Entwicklung und Funktion von Treg selbst
(CHAUDHRY et al. 2011; MOORE et al. 2001). TGF-β ist für die Inhibition
CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxischer T-Zellen wichtig. TGF-β-depletierte
Mäuse sterben frühzeitig an Organversagen im Rahmen eines multizentrischen
Entzündungsgeschehens (BANCHEREAU et al. 2012; SHULL et al. 1992). Der
Effekt von TGF-β wird im Wesentlichen durch das Zusammenspiel mit anderen
Zytokinen bestimmt. So fördert TGF-β in Kombination mit IL-2 die Entwicklung
protektiver Treg und in Kombination mit IL-6 die Differenzierung von proinflammatorischen Th17 Teff (GUTCHER et al. 2011; ZHENG et al. 2008). IL-35 übt
eine stark hemmende Wirkung aus, z.B. auf die Proliferation von Teff, und führt
außerdem zu einer Transformation CD4+ Teff in eine immunmodulatorische T-Zell-
16
Literaturübersicht
Population (COLLISON et al. 2007). Unter Beteiligung membranwirksamer Proteine
(Granzym A/B und Perforin) erfolgt eine Treg-vermittelte Zytolyse der Zielzellen, wie
z.B. aktivierte B-Zellen (GONDEK et al. 2005). Über den Mechanismus der
Fas-vermittelten Apoptose können Treg eine Proliferation CD8+ Teff unterdrücken
(STRAUSS et al. 2009). Im Gegensatz dazu steht eine Treg-vermittelte Apoptose
von CD4+ T-Zellen über TRAIL-DR5 (TNF-related apoptosis inducing ligand/death
receptor 5; REN et al. 2007). Ein weiterer Mechanismus ist die metabolische Störung
von Teff, z.B. über eine Reduktion von IL-2 (cytokine deprivation-mediated
apoptosis) durch Treg (PANDIYAN et al. 2007; THORNTON u. SHEVACH 1998;
VIGNALI et al. 2008). In diesem Zusammenhang kann auch eine Treg-vermittelte
Aufregulation des zyklischen Adenosinmonophosphats in den Zielzellen eine
effektive Proliferation hemmen (BOPP et al. 2007; VIGNALI et al. 2008). Indirekt
können Treg eine Aktivierung von Teff verhindern. Dieser Mechanismus wird über
dendritische Zellen und die Moleküle CTLA-4 und Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO)
vermittelt (FALLARINO et al. 2003; READ et al. 2000; VIGNALI et al. 2008).
2.2.1
Treg
Regulatorische T-Zellen bei ZNS-Erkrankungen
spielen
eine
entscheidende
Rolle
für
die
Aufrechterhaltung
der
immunologischen Toleranz in Gehirn und Rückenmark. Neben der Treg-vermittelten
Modulation der Immunantwort in peripheren lymphatischen Organen werden
zusätzlich lokale Entzündungsprozesse direkt durch die Wechselwirkung von Treg
und residenten Zellen des ZNS beeinflusst und dadurch immunpathologische
Vorgänge abgeschwächt bzw. verhindert (LOWTHER u. HAFLER 2012). Aktivierte
Mikroglia führen durch die Produktion von CCL22 (C-C motif chemokine ligand 22)
zur vermehrten Immigration von peripheren Treg in das ZNS (KIPNIS et al. 2004; LIU
et al. 2006). Treg wiederum hemmen die pro-inflammatorischen Eigenschaften der
Mikroglia durch Produktion von IL-4 (ZHAO et al. 2012). Darüber hinaus induzieren
Treg einen M2-Phänotyp der Mikroglia in Verbindung mit einer verminderten
Produktion neurotoxischer Faktoren wie NOX2 (NADPH oxidase 2), iNOS (inducible
nitric
oxide
synthase)
und
Stickoxide,
wodurch
Regenerationsprozesse
im
Literaturübersicht
17
geschädigten ZNS gefördert werden (BEERS et al. 2011; TIEMESSEN et al. 2007;
ZHAO et al. 2012). Neben der Infiltration peripherer Treg können auch lokal im
entzündlichen Milieu Immunzellen durch den Kontakt mit residenten Zellen direkt in
Treg konvertieren. So wurde gezeigt, dass durch Ko-Inkubation von Astrozyten und
Lymphozyten, CD4+ und CD8+ T-Zellen mit immunmodulatorischen Eigenschaften in
vitro entstehen (TRAJKOVIC et al. 2004). Bei der Experimentellen autoimmunen
Enzephalomyelitis (EAE) führt die Interaktion von Neuronen mit infiltrierenden TZellen zur Differenzierung suppressiver CD4+CD25+TGF-β1+CTLA-4+Foxp3+ Treg,
welche nach adoptiven Transfer die Induktion der EAE verhindern (LIU et al. 2006).
Andererseits können Treg protektive Entzündungsreaktionen z.B. im Rahmen der
erregerspezifischen und antitumoralen Immunabwehr hemmen und damit die
Erregerpersistenz bzw. Progression neoplastischer Prozesse im Gehirn begünstigen
(BELKAID u. ROUSE 2005; JACOBS et al. 2010; REUTER et al. 2012; SONABEND
et al. 2008; WAINWRIGHT et al. 2011).
Eine Myelin-spezifische Autoimmunität wird für die Demyelinisierung bei der
Multiplen Sklerose (MS) des Menschen verantwortlich gemacht. Autoaggressive
T-Lymphozyten gelangen über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) in das ZNS und werden
dort aktiviert. Gegenwärtig wird pathogenetisch eine gestörte Immunregulation durch
dysfunktionale Treg diskutiert. Beispielsweise konnte eine reduzierte Foxp3Expression im Blut von MS-Patienten nachgewiesen werden (COSTANTINO et al.
2008; HUAN et al. 2005). Darüber hinaus findet sich eine Störung der Tregvermittelten Immunsuppression bei den betroffenen Personen, wodurch die
Proliferation und IFN-γ-Produktion potentiell autoreaktiver T-Zellen nur unzureichend
gehemmt wird (COSTANTINO et al. 2008; VENKEN et al. 2006). Weiterhin wird eine
verminderte ZNS-Infiltration Foxp3+ Treg für eine überschießende Entzündung und
Demyelinisierung in aktiven MS-Plaques verantwortlich gemacht (TZARTOS et al.
2008). In frühen MS-Läsionen wurden trotz immunhistologischen Nachweises von
CD4+ T-Zellen keine oder nur sehr geringe Mengen von Foxp3+ Treg gefunden.
Möglicherweise ist dieser Treg-Mangel im Gehirn von MS-Patienten auf eine
CD95L-vermittelte Apoptose von Treg zurückzuführen (FRITZSCHING et al. 2011).
18
Literaturübersicht
Die EAE ist ein Tiermodell für autoimmune, demyelinisierende ZNS-Erkrankungen
wie z.B. die MS (BONETTI et al. 1997). Im Verlauf der EAE spielen neben einer
zunehmenden Th2-vermittelten Immunantwort auch die Treg eine bedeutende Rolle
bei der Reduktion Th1-bedingter Überempfindlichkeitsreaktionen (KOHM et al. 2002).
Durch in vivo-Depletion CD25+ Treg kann bei der EAE eine Zunahme der klinischen
Symptomatik mit erhöhter Mortalität und reduzierter Rekonvaleszenz beobachtet
werden (GÄRTNER et al. 2006; STEPHENS et al. 2005). Der adoptive Transfer
CD25+ Treg führt hingegen durch die vermehrte Infiltration dieser Zellen in das ZNS
zu einer Besserung der klinischen Symptomatik (MCGEACHY et al. 2005). Während
der Rekonvaleszenzphase der EAE finden sich im Vergleich zur akuten Erkrankung
deutlich erhöhte Anzahlen von Treg in Verbindung mit einer gesteigerten
IL-10-Produktion (KORN et al. 2007). In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass
der Transfer von IL-10-exprimierenden Treg zu einer verminderten Proliferation
CD4+ und CD8+ T-Zellen in Verbindung mit einer reduzierten IFN-γ-Produktion durch
autoreaktive T-Zellen führt (O'GARRA u. VIEIRA 2004). In vivo vermehrte und in vitro
expandierte
Treg
Demyelinisierung
führten
bei
der
nach
adoptiven
EAE
(JEE
et
Transfer
al.
2007;
zu
einer
KORN
verminderten
et
al.
2007).
Ein therapeutischer Effekt von Treg konnte ebenfalls bei anderen autoimmunen
Erkrankungen wie der antigeninduzierten Arthritis und dem autoimmunen Diabetes
mellitus in Tierversuchen bestätigt werden. Hier bewirken Treg die Inaktivierung
autoreaktiver T-Zellen und verhindern so eine unkontrollierte und überschießende
Entzündung (FREY et al. 2005; TANG et al. 2004).
Im Gegensatz zu den vorwiegend positiven Eigenschaften bei autoimmunen
Erkrankungen finden sich bei neuroinflammatorischen und -degenerativen Prozessen
unterschiedliche Bedeutungen der Treg für den Krankheitsverlauf (WALSH u. KIPNIS
2011). Beispielsweise führt der adoptive Transfer von Treg in Mausmodellen für
Rückenmarksverletzungen
zu
einer
Verminderung
der
neuroprotektiven
Autoimmunität, während die Treg-Depletion Neuronenschäden verhindert (KIPNIS et
al. 2002; ZIV et al. 2006). Im Gegensatz hierzu ist ein Treg-Mangel während der
Frühphase spontan auftretender spinaler Traumata beim Hund möglicherweise für
eine
exzessive
Gliaaktivierung
und
damit
einhergehende
Sekretion
pro-
Literaturübersicht
19
inflammatorischer und neurotoxischer Zytokine verantwortlich (SPITZBARTH et al.
2011).
In
experimentellen
Modellen
für
zerebrovaskuläre
Krankheiten
(Schlaganfallmodelle) reduzieren Treg die Expression von TNF, IFN-γ und IL-1β
sowie die Infiltration neutrophiler Granulozyten und Aktivierung mikroglialer Zellen im
murinen ZNS (LIESZ et al. 2009). Eine genetische Depletion Foxp3+ Treg begünstigt
in diesem Zusammenhang die Ausdehnung des Gehirninfarktes (PLANAS u.
CHAMORRO 2009). Im Gegensatz hierzu hat die Antikörper-vermittelte Depletion
CD25+ Treg keinen neuroprotektiven Effekt (REN et al. 2011).
Bei infektiösen Krankheiten hemmen Treg die Entzündungsreaktion, begünstigen
aber durch ihre immunsuppressive Wirkung auch die Erregerpersistenz, wie z.B. bei
der humanen Hepatitis C, Retrovirus-Infektionen von Mensch (HIV) und Katze (FIV)
sowie der murinen Hantavirus-Infektion (EASTERBROOK et al. 2007; TOMPKINS u.
TOMPKINS 2008; VAHLENKAMP et al. 2005). Im Gegensatz hierzu wird in murinen
Modellen für HIV-assoziierte Neuropathien eine Reduktion der Astrogliose und
mikroglialen Aktivität mit der Infiltration von Treg in die Entzündungsherde in
Zusammenhang gebracht. Dabei kommt es zu einer verminderten Expression
pro-inflammatorischer Zytokine sowie zu einer Reduktion des oxidativen Stress und
der neuronalen Apoptose. Weiterhin induzieren Treg im Gehirn der Mäuse eine
vermehrte Bildung der neurotrophen Faktoren BDNF (brain-derived neurotrophic
factor) und GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor) wodurch zusätzlich die
Neuroregeneration gefördert wird (GONG et al. 2011; LIU et al. 2009).
Interessanterweise führen Treg zu einer Caspase-3- und Perforin-vermittelten
Apoptose von HIV-infizierten Makrophagen und damit zu einer verminderten VirusReplikation (HUANG et al. 2010). Darüber hinaus transformieren Treg HIV-infizierte
Makrophagen vom pro-inflammatorischen M1-Phänotyp in einen protektiven
M2-Phänotyp
wodurch
es
zu
einer
reduzierten
iNOS-
und
gesteigerten
Arginase-1-Expression kommt (GONG et al. 2011; HUANG et al. 2010).
Im Rahmen der Herpes simplex Virus (HSV)-Infektion wurde bei transgenen Mäusen
gezeigt, dass der Verlust Foxp3+ Treg zu einer verzögerten Infiltration von T-Zellen,
natürlichen Killerzellen und dendritischen Zellen in das ZNS führt, vergesellschaftet
mit einem raschen klinischen Verlauf und erhöhten Viruskonzentrationen im Gehirn.
20
Literaturübersicht
Die Untersuchungen zeigen damit einen Treg-vermittelten protektiven Effekt durch
Potenzierung
der
antiviralen
Immunantwort
und
Koordination
infiltrierender
Immunzellen während der frühen HSV-Infektionsphase (LUND et al. 2008).
Im Gegensatz dazu führte eine Treg-Depletion mittels anti-CD25-Antikörper in
HSV-infizierten Mäusen während der akuten Infektionsphase zu einer vermehrten
Stimulation Virus-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen und einem reduzierten
Virusgehalt im ZNS. In infizierten neonatalen Mäusen konnte außerdem eine
Hemmung der IFN-γ- und Granzym B-Expression in CD8+ T-Zellen durch
Virus-induzierte Treg beobachtet werden (FERNANDEZ et al. 2008).
Vergleichbar mit der Hundestaupe führt die experimentelle Infektion von Mäusen mit
dem Theilerschen murinen Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) zur Viruspersistenz und
Demyelinisierung (KUMMERFELD et al. 2012). Die Antikörper-vermittelte Depletion
CD25+ Treg führte bei der TMEV-Infektion empfänglicher Mäusen zu einer erhöhten
Virus-spezifischen zellulären und humoralen Immunantwort (RICHARDS et al. 2011).
Die erhöhte Infiltration Foxp3+ Treg in das Gehirn ist hingegen mit einer vermehrten
Expression des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 und einer verzögerten
Viruselimination vergesellschaftet (HERDER et al. 2012). Bei der Maushepatitis-Virus
(MHV)-induzierten
Enzephalomyelitis
finden
sich
während
der
akuten
und
chronischen Infektionsphase Virus-spezifische Treg im Gehirn. Sie weisen eine
höhere suppressive Aktivität in Verbindung mit einer gesteigerten Expression von
CD69, ICOS (inducible T-cell costimulator; CD278) und CTLA-4 auf als Treg in der
Milz dieser Tiere (ZHAO et al. 2011). Bei dieser Infektion verhindern Treg durch die
Reduktion immunpathologischer Prozesse eine akute, fatal verlaufende Enzephalitis
(ANGHELINA et al. 2009). Im Gehirn hemmen Treg hierbei die Entzündung durch
Störung der Antigen-Präsentation über dendritische Zellen und Reduktion proinflammatorischer Chemokine und Zytokine. Der adoptive Transfer von Treg führte
zu einer deutlichen Verbesserung der klinischen Symptomatik infolge einer
verminderten
Demyelinisierung
ohne
dass
es
zu
einer
Verzögerung
der
Viruselimination in der chronischen Infektionsphase kam (TRANDEM et al. 2010).
Darüber hinaus führte die experimentelle Foxp3-Depletion in Treg zu einer
verstärkten Entzündung mit neuronalen Schäden (CERVANTES-BARRAGÁN et al.
Literaturübersicht
21
2012). Vergleichbar mit den Effekten durch den adoptiven Transfer von Treg bleibt
die Effektivität Virus-spezifischer T-Zellen hierbei unverändert, so dass Treg
möglicherweise selektiv immunpathologische Prozesse hemmen und die antivirale
Immunität bei der MHV-Infektion nicht beeinflussen (CERVANTES-BARRAGÁN et al.
2012; TRANDEM et al. 2010). Eine entscheidende Rolle für die Reduktion
immunpathologischer Gewebeschäden ist die Expression von IL-10 (TRANDEM et
al. 2011a). Neben klassischen CD25+ Treg wird IL-10 zusätzlich von weiteren
CD4+
und
CD8+
T-Zell-Populationen
mit
immunmodulatorischen
Funktionen
exprimiert. IL-10 führt einerseits zu einer verminderten Immunpathologie und
Mortalität, allerdings wird durch das immunsuppressive Zytokin die Viruspersistenz
im ZNS begünstigt (PUNTAMBEKAR et al. 2011; TRANDEM et al. 2011b).
Vergleichbare Vorgänge werden bei der experimentellen und natürlichen Infektion
mit dem West Nile-Virus bei der Maus bzw. dem Menschen angenommen (LANTERI
et al. 2009; STEWART et al. 2011). Außerdem werden bei der experimentellen
Infektion mit dem Chandipura Virus vermehrt Treg generiert, welche den
Gewebeschaden bei der akuten Enzephalitis potentiell reduzieren (ANUKUMAR u.
SHAHIR 2011). Eine unzureichende Immunmodulation wird für schwere Fälle von
akutem Dengue Fieber beim Menschen verantwortlich gemacht, während mildere
klinische Verläufe mit einer signifikanten Expansion von Treg vergesellschaftet sind
(LÜHN et al. 2007). In experimentell mit Masernvirus (MV)-infizierten Mäusen kann
eine vermehrte Infiltration Foxp3+ Treg in peripheren Organen und Gehirn festgestellt
werden. Trotz Ausbildung einer Virus-spezifischen Immunität zeigen die Tiere
verminderte Immunreaktionen gegen Virus-unabhängige Antigene (SELLIN et al.
2009). Andere Studien zeigen, dass durch Foxp3-Depletion die Virus-spezifische
Zytotoxizität gesteigert wird, was auf die potentielle Bedeutung von Treg für die
Viruspersistenz
bei
der
MV-Infektion
hindeutet
(REUTER
et
al.
2012).
Die unterschiedlichen Effekte von Treg in experimentellen MV-Infektionen von
Nagern auf das Immunsystem und die Pathogenese sind vermutlich auf
Krankheitsphasen-
und
Mausstamm-spezifische
Mechanismen
zurückzuführen
(REUTER et al. 2012; SELLIN et al. 2009). Die Bedeutung von Treg bei der
MV-Infektion des Menschen ist bislang unklar, da Beschreibungen erhöhter Treg bei
22
Literaturübersicht
Patienten wiederum von anderen Arbeitsgruppen nicht bestätigt werden konnten
(KOGA et al. 2010; WU et al. 2012; YU et al. 2008).
Die Rolle von Treg bei der Hundestaupe ist bisher unklar. Insbesondere stellt sich die
Frage nach der Bedeutung dieser immunmodulatorischen T-Zell-Population während
der Initiation und Progression der demyelinisierenden Staupeenzephalitis. Die teils
kontroversen Ergebnisse bei Infektionskrankheiten basieren möglicherweise auf
verschiedenen
Faktoren,
wie
unterschiedliche
Untersuchungszeitpunkte
post infectionem oder dem genetischen Hintergrund der Versuchstiere. Außerdem
führt die Depletion von Foxp3 in transgenen Mäusen zu einer selektiven Depletion
von Foxp3+ Treg, während durch anti-CD25-spezifische Antikörper neben CD25+
Treg zusätzlich aktivierte T-Effektorzellen depletiert werden. Diese Faktoren
beeinflussen den Infektionsverlauf und müssen bei der Interpretation der Ergebnisse
experimenteller Studien berücksichtigt werden. Die Untersuchungen werfen daher
häufig die Frage bezüglich der Übertragbarkeit auf Gegebenheiten bei spontan
auftretenden Enzephalitiden bei Mensch und Haustieren auf. Bislang liegen
allerdings nur sehr wenige Studien über die Bedeutung von Treg bei natürlich
vorkommenden infektiösen ZNS-Krankheiten in der Tiermedizin vor.
Literaturübersicht
2.3
23
Apoptose
Die Apoptose bezeichnet den genetisch-programmierten Prozess des koordinierten
Zelltods und spielt bei der Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen
eine wichtige Rolle (KRYSKO et al. 2008; TAIT u. GREEN 2010). Ihr Prinzip wurde
erstmals 1842 von Carl Vogt im Rahmen der Ontogenese der Geburtshelferkröte
(Alytes obstetricans) beschrieben (VOGT 1842). Der Terminus Apoptose fand
dagegen erst sehr viel später, im Jahre 1972, Eingang in die wissenschaftliche
Sprache. Er leitet sich vom altgriechischem Wort άπόπτωσισ ab und bedeutet soviel
wie das Abfallen der Blütenblätter von den Blumen oder das Abfallen der Blätter von
den Bäumen im Herbst (KERR et al. 1972).
Die Apoptose stellt eine Form des „programmierten Zelltods“ dar und ist ein strengregulierter Mechanismus, welcher sowohl im Rahmen physiologischer als auch
pathologischer Prozesse beobachtet wird. Erstere finden wir beispielsweise während
der Embryogenese, der (z.T. Hormon-abhängigen) Involution von Geweben, der
Selektion und Reifung von Immunzellen/Termination von Entzündungsprozessen
(Immun-Homöostase) und der Homöostase rasch proliferierender Gewebe wie z.B.
das intestinale Kryptepithel (KUMAR et al. 2010). Kommt es unter pathologischen
Umständen zu irreversiblen Zellschäden, z.B. verursacht durch Strahlung, Hitze,
Hypoxie, zytotoxische Substanzen oder Infektionserreger, so können betroffene
Zellen über apoptotische Signalwege eliminiert werden. Aber auch endogene
Faktoren wie z.B. die Reduktion oder das Ausbleiben von Wachstumsfaktorsignalen
oder die Ansammlung fehlsynthetisierter Proteine können den programmierten
Zelltod
einleiten.
Ferner
wird
eine
Dysregulation
der
Apoptose
u.a.
für
Entwicklungsstörungen und neoplastische Erkrankungen des ZNS verantwortlich
gemacht
und
spielt
dort
möglicherweise
auch
eine
Rolle
im
Rahmen
neurodegenerativer, infektiöser, traumatischer, ischämischer und demyelinisierender
Prozesse (BREDESEN et al. 2006; KUMAR et al. 2010).
Die Apoptose zeichnet sich durch spezifische morphologische Veränderungen und
biochemische Prozesse aus. Hierbei kommt es charakteristischerweise zu einer
Zellschrumpfung mit Kondensation und Margination des Kernchromatins bis hin zur
24
Literaturübersicht
Kernfragmentation. Weiterhin bilden sich zahlreiche Ausstülpungen der Zellmembran
(membrane blebbing), die sich im weiteren Verlauf abschnüren und damit als so
genannte apoptotische Körperchen (apoptotic bodies) mit variablen Anteilen von
Zytoplasma- und Kernbestandteilen der Phagozytose zugänglich gemacht und
beseitigt werden. Die biochemischen Prozesse sind in erster Linie durch die
degradierende enzymatische Aktivität zelleigener Cystein-Proteasen (Caspasen) und
Endonukleasen charakterisiert. Außerdem kommt es zu einer Translokation
bestimmter Membran-Phospholipide, z.B. Phosphatidylserin, in Richtung äußere
Zellmembran wodurch betroffene Zellen gegenüber Phagozyten kenntlich gemacht
und damit elimiert werden (DENECKER et al. 2000; KRYSKO et al. 2008; KUMAR et
al. 2010). Diese Prozesse werden sich als wichtiges diagnostisches Hilfsmittel zur
Differenzierung apoptotischer Zellen zueigen gemacht, z.B. über die Detektion
aktivierter
Caspasen,
fragmentierten
Chromatins,
einzelsträngiger
DNS,
translozierten Phosphatidylserins sowie von Fragmenten zelleigener Proteine oder
Enzyme.
Dabei
Phosphatidylserins
wird
zwischen
Annexin
V)
frühen
oder
Phasen
späten
(z.B.
Phasen
Translokation
(fragmentierte
des
oder
einzelsträngige DNS) des programmierten Zelltods unterschieden. Die Darstellung
letztgenannter erfolgt in situ üblicherweise mittels TUNEL-(terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick-end labeling) Methode oder nach
dem Prinzip der Apoptose- oder DNA-Leiter über die Auftrennung und Detektion
einzelsträngiger DNS (FRANKFURT et al. 1996; GAVRIELI et al. 1992; GOWN u.
WILLINGHAM 2002; GREEN 2000; LEERS et al. 1999; O'BRIEN et al. 2001).
Der Ablauf der Apoptose, ihre beteiligten Gene und Proteine, sind bei mehrzelligen
Organismen hochkonserviert. Der Prozess beginnt in der Initiatorphase im
Wesentlichen mit der Spaltung inaktiver Pro-Enzyme aus der Caspase-Familie.
Durch
die
Aktivität
der
Initiator-Caspasen
wird
im
weiteren
Verlauf
der
Enzymkaskade die Exekutionsphase erreicht, innerhalb derer es zur Degradation der
Zellkomponenten kommt. Die Initiation erfolgt über einen von zwei distinkten,
weitgehend unabhängigen Signalwegen: den extrinsischen (Rezeptor-vermittelten)
oder den intrinischen (mitochondrialen) Signalweg. Beide Signalwege münden
Literaturübersicht
schließlich
mit
25
der
Aktivierung
spezifischer
Effektor-Caspasen
in
der
Exekutionsphase (HENGARTNER u. HORVITZ 1994; METZSTEIN et al. 1998).
Der intrinsische Signalweg wird über eine Störung der Integrität der mitochondrialen
Zellmembran
ausgelöst.
Unter
dem
Einfluss
zellschädigender
Stimuli
wie
geschädigter DNS oder Wachstumsfaktor-Deprivation werden pro-apoptotische
Proteine aus der Bcl (B-cell lymphoma)-2-Familie aktiviert. Diese werden anhand der
gemeinsamen Anzahl ihrer insgesamt vier homologen Domänen, BH (Bcl-2
homology) 1, 2, 3 und 4, in zwei pro-apoptotische Subfamilien unterteilt. Zunächst
werden die sensorischen Proteine aus der BH3-only-Subfamilie (z.B. Bim, Bid und
Bad) aktiviert welche wiederum die Effektor-Proteine aus der BH-multidomainSubfamilie (mit bis zu drei homologen Domänen, z.B. Bax und Bak) aktivieren
(HARDWICK et al. 2012; OLA et al. 2011). Unter ihrem Einfluss kommt es zu einer
Permeabilitätsstörung
der
Mitochondrienmembran
mit
Freisetzung
u.a.
von
Cytochrom c in das Zytoplasma, ein Vorgang der schließlich mit der Aktivierung der
spezifischen Initiator-Caspase-9 den Weg für die Apoptose ebnet (KUMAR et al.
2010).
Der extrinsische Signalweg wird über Todeszeptoren (Transmembranproteine aus
der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor (R)-Superfamilie) gesteuert, welche auf
zahlreichen Zellen des Organismus exprimiert werden. Sie besitzen genetischhochkonservierte, zytoplasmatische, so genannte Todesdomänen (death domains,
DD) als Ausgangspunkt zur Initiation der intrazellulären Apoptosekaskade. Zu den
Rezeptoren gehören z.B. TNF-R1, TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1
(TRAIL-R1) und Fas (CD95). Nach Interaktion spezifischer Liganden, z.B. TNF,
TRAIL oder Fas-Ligand (FasL), mit der extrazelluären Bindungsstelle kommt es zur
Bildung von Oligomeren, meistens Trimeren, der jeweiligen Todesrezeptoren.
Daraufhin entsteht am zytoplasmatischen Anteil über die DD eine Bindungsstelle für
die Anlagerung spezifischer Adaptermoleküle mit eigener Todesdomäne, z.B. das
Fas-associated protein with death domain (FADD). Diese Adaptermoleküle besitzen
weitere Bindungsstellen, am Beispiel von FADD die Todeseffektordomäne (death
effector domain; DED). Hier kommt es zur Oligomerisation von inaktiver proCaspase-8 (beim Menschen auch pro-Caspase-10) und der Bildung des so
26
Literaturübersicht
genannten death-inducing signaling complex (DISC). Durch autokatalytische Aktivität
dieser Pro-Enzyme wird schließlich aktivierte Caspase-8 generiert und über die
Spaltung und Aktivierung weiterer pro-Caspasen die Exekutionsphase eingeleitet
(CHOI u. BENVENISTE 2004; MC GUIRE et al. 2011; PETER u. KRAMMER 2003).
Es gibt Überschneidungen des extrinsischen und intrinsischen Signalweges. So kann
beispielsweise über den Fas-Rezeptor-vermittelten Signalweg das pro-apoptotische
Protein Bid aktiviert und damit der mitochondriale Signalweg beschritten werden (LI
et al. 1998). Zytotoxische T-Lymphozyten können neben einer Fas/FasL-vermittelten
Apoptose auch über den Perforin/Granzym B-Mechanismus direkt intrazelluläre
Caspasen aktivieren und die Effektor-Phase der Apoptose einleiten (RUSSELL u.
LEY 2002).
Mit Aktivierung der Initiator-Caspasen-8 (10) und 9 münden schließlich extrinsischer
und intrinsischer Siganlweg in der Effektorphase mit Aktivierung der EffektorCaspasen, z.B. Caspase-3 und -6. Diese setzen über ihrer enzymatische Aktivität die
Apoptose-Kaskade direkt durch die Spaltung zellulärer Komponenten, oder indirekt,
z.B. durch Spaltung inhibitorischer Proteine, fort (KUMAR et al. 2010).
Ein wichtiger Mechanismus der Immun-Homöostase ist die Aktivierungs-induzierte
Apoptose (activation-induced cell death; AICD). Sie dient der Elimination (potentiell)
autoreaktiver T-Zellen im Thymus und in der Körperperipherie als auch chronisch
aktivierter T-Zellen via extrinsischer und intrinsischer Signalwege (BRENNER et al.
2008). Eine wichtige Rolle spielt dabei der Aktivierungsstatus von T-Zellen: besteht in
der Initialphase der Immunantwort zunächst eine vermehrte Resistenz, so liegt in der
Spätphase eine gesteigerte Sensibilisierung gegenüber der AICD vor (OWENSCHAUB et al. 1992; RADVANYI et al. 1996). Diese strenge Regulation erfolgt
intrazellulär
über
die
Aktivität/Inaktivität
anti-apoptotischer
Moleküle
auf
verschiedenen Ebenen der Apoptose-Kaskade. So wirkt z.B. das cellular FLICEinhibitory protein (c-FLIP) inhibitorisch auf der Ebene des DISC durch kompetitive
Anlagerung an die Todesdomänen der oligomerisierten Todesrezeptoren. Auf
mitochondrialer
Ebene
regulieren
zytosolische
und
membranständige
anti-
apoptotische Proteine aus der Bcl-2-Subfamilie mit vier homologen Domänen
(BH1-4; z.B. Bcl-2 und Bcl-xL; Ausnahme mit drei Domänen: Mcl-1) die
Literaturübersicht
27
Membranpermeabilität (HARDWICK et al. 2012; OLA et al. 2011). Eine weitere
Gruppe bilden die inhibitor of apoptosis proteins (IAP’s), Proteine, welche direkt an
Initiator- oder Effektor-Caspasen binden und diese damit inaktivieren. Sie werden
ebenfalls nach genetisch hochkonservierten, bis zu drei so genannten baculoviral
IAP repeat (BIR)-Domänen, unterteilt. Zu ihnen gehören z.B. X-linked IAP (XIAP),
cellular IAP-1 (cIAP-1), cIAP-2 und neuronal apoptosis inhibitory protein (NAIP) aus
der Gruppe mit drei BIR-Domänen oder Survivin aus der Gruppe mit einer BIRDomäne (DEVERAUX u. REED 1999; KORNACKER et al. 2001; ROY et al. 1997).
2.3.1
Apoptose bei der Staupevirus-Infektion
Die Apoptose infizierter Zellen spielt eine wichtige Rolle im Rahmen der antiviralen
Immunantwort. Durch den programmierten Zelltod wird die Virus-Replikation und
-Distribution eingeschränkt und eine gesteigerte Clearance über die Phagozytose
apoptotischer Zellen ermöglicht. Demgegenüber stehen die nachteiligen Effekte
infolge des lokalen Gewebeschadens oder auf systemischer Ebene (BENEDICT et
al. 2002). Bisherige Untersuchungen zur Apoptose bei der Staupe zeigen
unterschiedliche Ergebnisse. Die CDV-Infektion führt allgemein zu einer schweren
Leukopenie und dem Verlust der lymphozytären Proliferationskapazität bereits vor
dem Auftreten klinischer Symptome (APPEL et al. 1982; KRAKOWKA et al. 1975;
TIPOLD et al. 2001). Bei experimentell mit CDV-A75/17-infizierten Hunden kommt es
in der Frühphase zu einer ausgeprägten lymphozytären und geringgradigen
monozytären Depletion im peripheren Blut vergesellschaftet mit einer erhöhten
Apoptose. Zum frühesten Untersuchungszeitpunkt (Tag 3 p.i.) ist dabei kein Virus in
Blut und Leukozyten nachweisbar, so dass andere Mechanismen als eine direkte
Virus-induzierte Apoptose angenommen werden müssen. Erst ab Tag 6 p.i. nimmt
der Virusgehalt in den Leukozyten kontinuierlich zu, und auch zu diesem und
späteren Zeitpunkten sind die apoptotischen Zellen nur in geringer Anzahl Virusinfiziert (SCHOBESBERGER et al. 2005). Hingegen zeigen Analysen des peripheren
Blutes von natürlich-infizierten Hunden keine Veränderungen des Blutbildes im
Vergleich zu nicht-infizierten Hunden sowie keine erhöhte Expression apoptotischer
28
Literaturübersicht
Gene. Dieser Umstand wird mit einem möglicherweise bereits länger in vivo
zurückliegenden Infektionsgeschehen interpretiert. Auch in der Untersuchung von
Schobesberger et al. (2005) zeigen sich ab Tag 13 p.i. vergleichbare prozentuale
Anteile apoptischer Zellen im Vergleich zur Situation prae infectionem mit Ausnahme
eines
kleinen
Anstiegs
an
Tag
21
p.i.
(DEL
PUERTO
et
al.
2010;
SCHOBESBERGER et al. 2005). Eine vermehrte Apoptose wird generell bei
experimentell und natürlich CDV-infizierten Hunden in den lymphatischen Geweben
beobachtet. Eine Aufregulation von Caspase-3 und -8 in retropharyngealen
Lymphknoten
in
diesem
Zusammenhang
deuten
auf
Mechanismen
des
extrinisischen Signalweges hin (DEL PUERTO et al. 2010; MORO et al. 2003a). In
einer Studie an lymphatischen Geweben akuter bis subakuter, natürlich-infizierter
Hunde zeigt sich eine Korellation zwischen lymphatischer Depletion und dem CDVAntigengehalt und es werden sowohl apoptotische nicht-infizierte als auch
apoptotische und infizierte Leukozyten gefunden (KUMAGAI et al. 2004).
Andererseis besteht bei experimentell CDV-infizierten Frettchen trotz ausgeprägter
Leukopenie generell keine deutlich erhöhte Apoptose in peripheren mononukleären
Blutzellen und in den lymphatischen Geweben. Vielmehr zeigen sich infizierte
Leukozyten ex vivo vermehrt resistent gegenüber der Apoptose-Progression im
deutlichen Gegensatz zu nicht-infizierten Zellen (PILLET u. VON MESSLING 2009).
In vitro Studien zeigen, dass zytopathische Effekte und/oder die Apoptose-Induktion
und -Progression von den verwendeten Zelllinien oder Gewebekulturen sowie den
CDV-Stämmen abhängig sind. Eine verminderte oder ausbleibende Apoptose kann
in einigen Fällen zu einer Viruspersistenz im Wirtssystem führen und ist damit, wie
am Beispiel des CDV-A75/17-Stammes gezeigt, mit der Situation in vivo vergleichbar
(NISHI et al. 2004; SCHOBESBERGER et al. 1999). In einer kaninen epithelialen
Nierenzelllinie (Madin-Darby canine kidney [MDCK] cells) führt die CDV-Infektion nur
zu einem marginalen Anstieg der Apoptose überwiegend nicht-infizierter Zellen,
wohingegen gleichzeitig mit steigender Infektionsrate sich die Zellen zunehmend
refraktär gegenüber der chemisch-induzierten Apoptose mittels Staurosporin
(Proteinkinaseinhibitor) zeigen (PILLET u. VON MESSLING 2009). In Vero-Zellen
(Nierenzelllinie aus der Grünen Meerkatze) induziert CDV eine Apoptose. Hierbei
Literaturübersicht
29
wird eine Aufregulierung pro-apoptotischer Moleküle des extrinsischen Signalweges
wie Fas und Caspase-8 beobachtet. Die Expression anti- und pro-apoptotischer
Proteine des intrinsischen Signalweges wie Bcl-2 und Bax bleibt unverändert (DEL
PUERTO et al. 2011a; GUO u. LU 2000; KAJITA et al. 2006). Eine andere
Untersuchung an CDV-infizierten Vero-Zellen belegt jedoch die Induktion eines
zellulären, endoplasmatischen Stresses und einer gestörten Kalzium-Homöostase
(BRUNNER et al. 2012). In humanen HeLa-Zellen, einer epithelialen Tumor-Zelllinie
mit anti-apoptotischen Eigenschaften, verursacht die CDV-Infektion eine Apoptose
ohne Aufregulierung aktivierter Caspase-8, so dass hier vermutlich intrinsische
Signalwege eine Rolle spielen (DEL PUERTO et al. 2011b).
In primären kaninen Hirnzellkulturen wird nach Infektion mit einem adaptierten,
passagierten, nicht-virulenten CDV-Onderstepoort (OP)-Stamm ein deutlicher
zytolytisch-nekrotischer Effekt ohne morphologische und molekulare Hinweise auf
eine Apoptose festgestellt, während im gleichen System unter Verwendung des
hochvirulenten
und
Beobachtungen
sogar
neurotropen
ausbleiben
CDV-A75/17-Stammes
und
eine
vergleichbare
Virus-Persistenz
besteht
(SCHOBESBERGER et al. 1999). Hingegen induziert ein verwandter, rekombinanter
CDV-A75/17-Stamm in murinen Hirnzellkulturen aus dem Hippokampus eine
ausgeprägte Apoptose von Neuronen im Gegensatz zu Astrozyten, welche im
Anschluss vielmehr ein proliferatives Verhalten zeigen. Hier lässt sich die Apoptose
aufgrund der niedrigen Infektionsrate nicht nur als unmittelbare Folge der ZellInfektion intrepretieren, sondern wird auch mit der Induktion einer erhöhten
Konzentration des neuroexzitatorischen Transmitters Glutamat in Verbindung
gebracht (BRUNNER et al. 2007).
Morphologische Untersuchungen des Neuroparenchyms zur Apoptose in vivo bei der
CDV-Infektion liegen nur begrenzt vor. Schobesberger et al. weisen in frühen nichtentzündlichen, demyelinisierenden Läsionen bei experimentell- und natürlichinfizierten Hunden vereinzelte und nicht näher charakterisierte TUNEL+ Zellen nach.
In chronisch-demyelinisierenden Läsionen liegen TUNEL+ Zellen überwiegend im
perivaskulären Raum, wobei es sich vermutlich um mononukleäre Zellen handelt,
und geringerer Anzahl im benachbarten Neuroparenchym (SCHOBESBERGER et al.
30
Literaturübersicht
1999). Eine Untersuchung an Kleinhirnen natürlich-infizierter Hunde zeigt in akuten
und chronischen demyelinisierenden Läsionen der weißen sowie der angrenzenden
grauen Substanz TUNEL+ Zellen. Neben morphologisch nicht-klassifizierbaren
pyknotischen Zellen sind hierbei auch TUNEL+ Zellen mit Gemistozyten- und
Gitterzell-Morphologie auszumachen (MORO et al. 2003b). Molekularbiologische
Analysen mittels PCR an Kleinhirnen natürlich CDV-infizierter Hunde zeigen eine
Aufregulation der pro-apoptotischen Moleküle Caspase-3, -8 und -9 sowie Bax, und
damit eine mögliche Bedeutung extrinsischer und intrinsischer Signalwege bei der
Apoptose im Gehirn im Rahmen der Staupevirus-Infektion. Hingegen wird keine
signifikante Aufregulation des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 festgestellt (DEL
PUERTO et al. 2010). Experimentell mit einem modifizierten CDV-SH-Stamm
infizierte Frettchen weisen im Kleinhirn einen Verlust von bis zu 35% der PurkinjeZellen auf ohne Nachweis von TUNEL+ DNS-Fragmenten, so dass hier andere
Mechanismen des Zelltodes vermutet werden (RUDD et al. 2010).
Eine
quantitative,
Phasen-spezifische
Auswertung
und
Charakterisierung
apoptotischer Prozesse in vivo bei der Staupeenzephalitis des Hundes erfolgte
bislang
nicht.
Insbesondere
liegen
keine
Untersuchungen
zu
den
frühen
Infektionsphasen im ZNS vor. So stellt sich beispielsweise die Frage, ob frühe
astrozytäre und oligodendrogliale Schäden Folge einer direkten oder indirekten
Apoptose-Induktion sind und damit als mögliche Pathomechanismen im Rahmen von
Axonopathien und/oder Demyelinisierungsprozessen eine Rolle spielen können.
Weiterhin stellt sich die Frage, ob eine gestörte Immun-Homöostase zur Initiation
und/oder Progression der Staupeenzephalitis beiträgt, denn für die Erkrankung
werden u.a. immunpathologische Mechanismen diskutiert (BAUMGÄRTNER u.
ALLDINGER 2005). Eine Dysregulation der Aktivierungs-induzierten Apoptose und
damit reduzierte Elimination aktivierter, möglicherweise autoreaktiver Immunzellen
könnte beispielsweise ursächlich oder begünstigend für eine überschießende und
unkontrollierte Immunreaktion sein.
Materialien und Methoden
31
3
Materialien und Methoden
3.1
Untersuchte Hunde
Im
Rahmen
der
für
die
Studie
durchgeführten
Untersuchungen
wurden
Gewebeproben von insgesamt 33 Hunden verwendet (Tabelle 1). 28 Tiere (Tier-Nr.
6 bis 33) waren an einer Staupevirus-Enzephalitis erkrankt, welche mittels eines
immunhistologischen Nachweises von Staupevirus-Nukleoprotein (CDV-NP; Kapitel
3.3) im ZNS bestätigt wurde. Die übrigen fünf Tiere (Tier-Nr. 1 bis 5) stellten die
Kontrollgruppe dar (Tierversuch Aktenzeichen 08A550). Diese Tiere wiesen
histologisch keine Anzeichen einer ZNS-Erkrankung auf. Eine immunhistologische
Untersuchung auf Staupevirus-Antigen verlief bei ihnen negativ.
Die Gewebeproben von 14 der an Staupe erkrankten Hunde entstammten dem
Sektionsgut des Instituts für Veterinär-Pathologie der Justus-Liebig-Universität
Gießen sowie von weiteren 10 Tieren aus dem Institut für Pathologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover. Gewebeproben von drei Hunden wurden
freundlicherweise von Prof. David Driemeier, Faculdade Veterinária, Departamento
de Patologia Clínica Veterinária, Setor de Patologia Veterinária, Porto Alegre,
Brasilien, sowie von einem Hund von Dr. Juan Alberto Morales, Servicio de
Patologia, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional, Heredia, Costa
Rica zur Verfügung gestellt.
Alle an Staupe erkrankten Hunde wiesen eine natürliche Staupevirus-Infektion auf.
Dabei war ein Teil der Tiere geimpft. Allerdings ließen sich Impfhistorie und Art der
Vakzine nicht mehr nachvollziehen. Die Tiere sind entweder infolge des
Krankheitsgeschehens verstorben oder wurden aufgrund einer infausten Prognose
von einem Tierarzt euthanasiert. Es erfolgte eine diagnostische Sektion jeweils in
einem der o.a. Institute innerhalb weniger Stunden bis zu drei Tagen post mortem.
Die
gesunden
Tiere
aus
der
Kontrollgruppe
wurden
im
Rahmen
einer
parasitologischen Studie gemäß Protokoll euthanasiert und am Institut für Pathologie
32
Materialien und Methoden
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wenige Stunden post mortem seziert.
Tiernummer, Sektionsnummer, Sektionsort, Alter, Geschlecht und Rasse sind in
Tabelle 1 zur Übersicht dargestellt.
In Rahmen der Sektion wurde routinemäßig ein breites Organspektrum asserviert.
Gehirn und Rückenmark wurden dabei in toto entnommen. Es folgte eine Fixation
der Gewebeproben in 10%igem, nicht-gepuffertem Formalin für mindestens 24
Stunden bis zu mehreren Tagen. Danach erfolgte eine Auflamellierung des Gehirns
mit Entnahme repräsentativer Proben aus den Bereichen des Groß-, Klein- und
Stammhirns sowie eine umfangreiche Beprobung der parenchymatösen Organe
einschließlich ihrer lymphatischen Einrichtungen. Anschließend wurde das Gewebe
nach maschineller Dehydrierung bei 58°C (Shandon Pathcentre) in einer
aufsteigenden Alkoholreihe in einem Paraffin-Paraplast-Gemisch (Histo-Comp®, Fa.
Vogel) eingebettet (Einbettsystem Tissue-Tek® TEC® 5, Sakura Finetek Europe
B.V.). Die Lagerung der Gewebeblöcke erfolgte schließlich in trockener Umgebung
bei Raumtemperatur.
3.2
Gewebeproben für Histologie, Immunhistologie und TUNEL-Methode
Für die histochemischen und immunhistologischen Untersuchungen wurde jeweils
ein Paraffinblock von den Studientieren mit Kleinhirn- und Stammhirngewebe
verwendet. Mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms wurden 2-3 µm dicke Serienschnitte
(in Abhängigkeit von der Blockdicke bis zu 50 Stück) angefertigt, auf SuperFrost®
Plus-Objektträger
(Menzel-Gläser)
aufgezogen,
in
aufsteigender
Reihenfolge
nummeriert und bei Raumtemperatur gelagert.
Von den Serienschnitten mit den Nummern 1 und 30 wurde routinemäßig eine
Hämatoxylin-Eosin
(HE)-Färbung
(MULISCH
u.
WELSCH
2010)
in
einem
Färbeautomaten (Leica ST 4040, Leica Instruments GmbH) durchgeführt. Für Schnitt
2 folgte eine Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett (LFB-KEV)-Färbung (KLÜVERBARRERA in MULISCH u. WELSCH 2010) zur Darstellung des Myelingehalts bzw.
Materialien und Methoden
33
des Demyelinisierungsgrades. Schnitt 3 diente zum immunhistologischen Nachweis
des Staupevirus-Nukleoproteins (Kapitel 4.1.3).
Die Schnitte 10-29 waren für die immunhistologischen Untersuchungen auf die in
Tabelle 2 angeführten Antigene vorgesehen, während die verbleibenden Schnitte
dem Zwecke von Wiederholungs- und Doppelmarkierungsversuchen dienten.
Tabelle 1:
Tier-Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Übersicht zu den untersuchten Tieren
Tagebuch-Nr.
Ort
Alter in Monaten
Geschlecht
Rasse
V 368-08
V 369-08
V 376-08
V 377-08
V 378-08
2405-85
1357-86
1843-87
2965-88
1913-90
2290-90
1443-95
1776-95
22-96
415-96
2395-97
936-98
941-98
2153-99
1107-00
S 2276-03
S 2658-04
S 58-05
S 954-05
S 1725-05
S 1814-05
S 481-07
S 682-08
S 1635-09
ND 12-92
N 404-07
N 407-07
N 537-08
H
H
H
H
H
G
G
G
G
G
G
H
G
G
G
G
G
G
G
G
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CR
BRA
BRA
BRA
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
36
4
24
5
n. b.
10
8
n. b.
3
6
72
n. b.
n. b.
2
2
84
n. b.
7
6
3
3,5
5
12
2
108
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
m
w
w
w
m
m
w
n. b.
w
wk
m
w
n. b.
w
m
m
w
w
m
m
w
w
w
w
w
n. b.
n. b.
n. b.
Beagle
Beagle
Beagle
Beagle
Beagle
Mischling
Dackel
Mischling
Wachtel
Deutscher Schäferhund
Deutscher Schäferhund
Retriever
n. b.
Teckel
Mischling
Mischling
n. b.
n. b.
Labrador Retriever
Mischling
Zwergpinscher
Mischling
Husky
Mischling
Shih Tzu
Jack Russel Terrier
Chihuahua
Mischling
n. b.
Boxer
n. b.
n. b.
n. b.
BRA = Brasilien; CR = Costa Rica; G = Gießen; H = Hannover; n. b. = nicht bekannt; m = männlich; w = weiblich
34
Materialien und Methoden
3.3
Lichtmikroskopische
Untersuchung
und
Einteilung
der
Staupeläsionen
Die Einteilung der Staupeläsionen in der weißen Substanz des Kleinhirns und
Stammhirns
basierte
auf
den
Ergebnissen
der
histochemischen
und
immunhistologischen Untersuchungen. Folgende acht Gruppen wurden dabei
unterschieden (SEEHUSEN u. BAUMGÄRTNER 2010):

Gruppe 1:
Kontrolltiere (Kontrolle)

Gruppe 2:
unveränderte weiße Substanz Staupevirus-infizierter Tiere
(normal appearing white matter; NAWM)

Gruppe 3:
Antigennachweis ohne offensichtliche Läsion (AOL)

Gruppe 4:
Antigennachweis und Vakuolisierung (VAK)

Gruppe 5:
Antigennachweis und akute Läsion (AKUT)

Gruppe 6:
Antigennachweis und subakut-demyelinisierende Läsion
ohne perivaskuläre Entzündung (SOE)

Gruppe 7:
Antigennachweis und subakut-demyelinisierende Läsion
mit perivaskulärer Entzündung (SME)

Gruppe 8:
Antigennachweis und chronisch-demyelinisierende Läsion
(CHR)
Für die Gruppe 1 wurden Kleinhirnareale von den klinisch gesunden Hunden aus der
Kontrollgruppe ohne ZNS-Läsionen ausgewählt. Dabei wurden pro Tier in der weißen
Substanz jeweils zwei Lokalisationen im Bereich des Markkörpers (Corpus medullare
cerebelli) und der Marklamellen ausgewählt.
Zur Gruppe 2 (NAWM) gehörten Lokalisationen in der weißen Substanz Staupevirusinfizierter
Tieren,
welche
weder
in
der
HE-Färbung
histopathologische
Veränderungen aufwiesen noch in der Immunhistologie eine positive Reaktion auf
Staupevirus-Antigen zeigten.
Materialien und Methoden
35
Der Gruppe 3 (AOL) entsprachen Areale in der weißen Substanz, welche in der HEFärbung keine pathomorphologischen Veränderungen aufwiesen allerdings in der
Immunhistologie einen Nachweis von Staupevirus-Antigen erbrachten.
In die Gruppe 4 (VAK) wurden diejenigen Antigen-positiven Läsionen infizierter Tiere
eingeordnet, die lichtmikroskopisch in der HE-Färbung eine Vakuolisierung der
weißen Substanz ohne begleitende Gliose oder Myelinophagie erkennen ließen. Die
Vakuolisierung
entsprach
damit
keinem
Myelin-Verlust
(unveränderte
LFB-
Anfärbbarkeit) sondern sie wurde als Ödem der Myelinscheiden interpretiert.
Die Gruppe 5 (AKUT) umfasste Areale, in welchen sich in der HE-Färbung eine
Vakuolisierung vergesellschaftet mit einer Hyperzellularität, vornehmlich bedingt
durch eine Astro- und Mikrogliose, darstellte. Weiterhin waren sie durch das
vereinzelte
Auftreten
von
Gemistozyten
sowie
intranukleären,
teils
intrazytoplasmatischen Einschlusskörperchen gekennzeichnet. Die Vakuolisierung
entsprach, vergleichbar der Gruppe 4, einem Ödem der Myelinscheiden und keiner
Entmarkung mit Myelinophagie.
Läsionen aus der Gruppe 6 (SOE) zeigten in der HE-Färbung neben einer
Vakuolisierung der weißen Substanz eine Astrogliose sowie das Auftreten von
Gemistozyten, Gitterzellen, aktivierten Makrophagen und einzelnen Lymphozyten.
Die einsetzende Demyelinisierung stellte sich durch eine Abnahme der LFBAnfärbbarkeit dar, wobei zum Teil LFB-positive Strukturen im Zytoplasma von
Gitterzellen (Myelinophagen) aufgefunden wurden.
Läsionen aus der Gruppe 7 (SME) wiesen neben den bereits in Gruppe 6
angeführten Veränderungen eine 1-2lagige, perivaskuläre, teils intraparenchymatöse
Infiltration mit Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen auf.
36
Materialien und Methoden
Läsionen der Gruppe 8 (CHR) entsprachen denen der Gruppe 7 mit der Ausnahme,
dass die perivaskuläre Entzündungszellinfiltration mindestens drei Zelllagen
umfasste.
3.4
Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung
Bei der LFB-KEV-Färbung handelt es sich um eine kombinierte Zell- und
Markscheidenfärbung. Dabei werden mittels der Luxol Fast Blue-Färbung nach
Klüver-Barrera
(MULISCH
u.
WELSCH
2010)
über
Cholinbausteine
die
Phospholipide der Markscheiden angefärbt (Markscheiden leuchtend blaue Farbe,
graue Substanz blassgrüne Farbe). In einem zweiten Schritt erfolgt die Darstellung
von Zellkernen und Nissl-Schollen (rotviolette bis violette Farbe) nach der NisslFärbung (MULISCH u. WELSCH 2010).
3.4.1
Protokoll für die Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf SuperFrost® Plus-Objektträger und
anschließendes Trocknen im Wärmeschrank bei 57°C für mindestens
30 Minuten
2. Entparaffinierung der Schnitte in Roticlear® und Isopropanol zweimal für
jeweils 5 Minuten
3. 16-24 Stunden in der LFB-Lösung bei 57°C im Wärmeschrank inkubieren
4. Spülen in A. dest.
5. bis zu 20 Sekunden in 0,05%iger Lithiumcarbonatlösung differenzieren
6. 20-30 Sekunden in 70%igem Ethanol differenzieren (bis die graue
Substanz sichtbar wird)
7. Spülen in A. dest.
8. 10-25 Sekunden in 0,05%iger Lithiumcarbonatlösung differenzieren
9. kurz in 70%iges Ethanol tauchen
10. evtl. Schritte 8 und 9 wiederholen
11. Spülen in A. dest.
Materialien und Methoden
37
12. ca. 6 Minuten in 0,1%iger Kresylechtviolett-Lösung bei 37°C im
Wärmeschrank inkubieren (Lösung muss vorgewärmt sein)
13. Entwässern zwei- bis dreimal in 96%igem Ethanol, einmal in 100%igem
Ethanol
14. Eindecken der Schnitte (Roti® Histokitt II)
3.5
Immunhistologie und TUNEL-Methode
Die immunhistologischen Untersuchungen an Paraffinschnitten erfolgten nach der
Avidin-Biotin-Complex (ABC)-Peroxidase-Methode (ALLDINGER et al. 1996). Als
Chromogen
für
die
farbliche
Markierung
diente
3,3’-Diaminobenzidin-
Tetrahydrochlorid (DAB). Für alle verwendeten Primärantikörper (Tabelle 2) wurden
bestehende Literaturangaben für Anwendungen auf kaninem Gewebe berücksichtigt
und
die
Kreuzreaktivität
erneut
an
spezifisch
ausgewählten
kaninem
Kontrollgeweben bestätigt.
Im Rahmen der Herdcharakterisierung wurden Staupevirus-Nukleoprotein (CDV-NP;
Klon 3991), saures Gliafaserprotein (glial fibrillary acidic protein; GFAP) in Astrozyten
sowie Myelin-basisches Protein (MBP) und neurite outgrowth inhibitor protein A
(Nogo-A) in Oligodendrozyten detektiert.
Die Darstellung der Entzündungsantwort erfolgte durch den Nachweis der
Lymphozytendifferenzierungsantigene CD3 für T-Zellen und CD79α für B-Zellen, des
Transkriptionsfaktors forkhead box P3 (Foxp3) aus der forkhead/winged-helix-Familie
für regulatorische T-Zellen, das myeloisch/histiozytäre Antigen, Klon MAC 387
(Kalzium-bindendes Molekül) für zirkulierende und emigrierende Monozyten (bloodborne macrophages), dem Lektin BS-1 (Bandeiraea simplicifolia) für aktivierte
Mikroglia/Makrophagen sowie der Expression von Haupthistokompatibilitätskomplex
Klasse II-Antigen (major histocompatibility complex class II-antigen; MHC-II).
Zum Nachweis von Faktoren der Apoptose-Kaskade dienten Proteine des
extrinsischen Signalweges, wie das Oberflächenglykoprotein Fas (CD95), und des
intrinsischen Signalweges aus der Bcl-2-Familie mit anti- (Bcl-2) als auch
pro-apoptotischer (Bax) Funktion. Weiterhin wurden inhibitorische Proteine aus der
38
Materialien und Methoden
inhibitors of apoptosis (IAP)-Familie, wie cIAP-2 und Survivin, dargestellt. Schließlich
wurden apoptotische Zellen durch die aktivierte Effektor-Caspase-3 aus der
cysteine-aspartic acid protease-Familie nachgewiesen.
Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke wurde hinsichtlich Permeabilitätsstörungen
mittels Nachweis intra- und extravaskulären Albumins sowie der astrozytären
Expression des Wasserkanal-Membranproteins Aquaporin-4 untersucht.
Mittels
TUNEL
(terminal
deoxynucleotidyl
transferase
[TdT]-mediated
dUTP-digoxigenin nick-end labeling)-Methode wurden apoptotische Zellen detektiert.
Das Prinzip beruht auf dem enzymatischen Nachweis von 3’-OH Enden einzel- als
auch doppelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Fragmente (GAVRIELI et al.
1992). Das Protokoll wurde den Herstellerangaben entsprechend mit wenigen
Modifikationen durchgeführt.
3.5.1
Antikörper, TUNEL-Kit und Seren
Die verwendeten Primärantikörper wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
(phosphate-buffered saline; PBS) unter Zusatz von 1% bovinem Serumalbumin
(BSA) den Angaben entsprechend Tabelle 2 verdünnt.
Die biotinilierten Sekundärantikörper wurden in PBS ohne Zusatz von BSA in einer
Verdünnung von 1:200 verwendet. In Abhängigkeit von der Herkunftsspezies der
Primärantikörper handelte es sich um:

biotinilierte
Ziege-anti-Kaninchen
IgG-Antikörper
(goat-anti-rabbit-
biotinylated; GaR-b; Vector Laboratories, BA-1000)

biotinilierte Ziege-anti-Maus IgG-Antikörper (goat-anti-mouse-biotinylated;
GaM-b; Vector Laboratories, BA-9200)

biotinilierte
Kaninchen-anti-Ziege
IgG-Antikörper
(rabbit-anti-goat-
biotinylated; RaG-b; Vector Laboratories, BA-5000)

biotinilierte
Kaninchen-anti-Ratte
IgG-Antikörper
biotinylated; RaRt-b; Vector Laboratories, BA-4001)
(rabbit-anti-rat-
Materialien und Methoden

biotinilierte
39
Kaninchen-anti-Schaf
IgG-Antikörper
(rabbit-anti-sheep-
biotinylated; RaSh-b; Vector Laboratories, BA-6000)
Das Detektionssystem wurde in PBS ohne Zusatz von BSA angesetzt. Anwendung
fand dabei:

für alle biotinilierten Sekundärantikörper das Vectastain® Elite ABC Kit
Standard (PK-6100, Vector Laboratories). Der Ansatz erfolgte durch
Vorlage
von
1
ml
PBS,
Hinzugabe
von
15
μl
Reagenz
A
(gut durchmischen) und anschließender Hinzugabe von 15 μl Reagenz B
(gut durchmischen).

für das biotinilierte Lektin BS-1 das Vectastain® ABC Kit Standard
(PK-4000, Vector Laboratories). Der Ansatz erfolgte durch Vorlage von
1 ml PBS, Hinzugabe von 9 μl Reagenz A (gut durchmischen) und
anschließender Hinzugabe von 9 μl Reagenz B (gut durchmischen).
Im Falle einer erforderlichen Antigen-Demaskierung (Tabelle 2) wurden die Schnitte
für 20 Minuten in Zitratpuffer (Raumtemperatur, pH-Wert 6,0; s. Anhang) in der
Mikrowelle bei 800 Watt gekocht und kühlten im Anschluss bei Raumtemperatur für
ca. 10 Minuten ab.
Zur Unterdrückung einer unspezifischen Hintergrundsreaktion wurden die Schnitte
vor Applikation der Primärantikörper einer 20-minutügen Inkubation mit 1:5 in PBS
verdünnten Normalseren derjenigen Tierarten unterzogen, aus welchen der
verwendete Sekundärantikörper stammte (Kaninchen- oder Ziegennormalserum).
Für die Apoptosedetektion mittels TUNEL-Methode wurde das ApopTag® Plus
Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore) verwendet.
40
3.5.2
Materialien und Methoden
Protokoll für die Immunhistologie an Paraffinschnitten
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf SuperFrost® Plus-Objektträger und
anschließendes Trocknen im Wärmeschrank bei 57°C für mindestens
30 Minuten
2. Entparaffinierung der Schnitte in Roticlear® zweimal für jeweils 5 Minuten,
in Isopropanol und 96%igem Ethanol für jeweils 3 Minuten
3. Hemmung
der
endogenen
Peroxidase
mittels
197
ml
Methanol
(Rotipuran®) + 3 ml frisch zugesetztem 30%igen Wasserstoffperoxid
(H2O2; entspricht in endgültiger Lösung 0,5%igem H2O2) unter langsamen
Rühren für 30 Minuten
4. Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS (s. Anhang)
5. Demaskierung der Antigene (entfällt für AQP-4, BS-1, GFAP und MBP) in
Zitratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten in der Mikrowelle (800 Watt); im
Anschluss Abkühlung im Kochgefäß bei Raumtemperatur für ca.
10 Minuten
6. Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS
7. Einsetzen der Schnitte in Coverplates™ (Fa. Shandon Sequenza)
8. Spülen der Schnitte mit PBS für 5 Minuten
9. Überschichten der Schnitte mit jeweils 100 μl Blockserum - in
Abhängigkeit
vom
Sekundärantikörper
mit
Kaninchen-
oder
Ziegennormalserum 1:5 in PBS verdünnt für 20 Minuten
10. Auftragen von jeweils 100 μl Primärantikörper verdünnt in PBS mit 1%
BSA bzw. entsprechend verdünnten Kontrollseren der Herkunftsspezies
der Primärantikörper zum Zwecke der Negativkontrolle; Inkubation bei 4°C
über Nacht
11. Erwärmen der Schnitte bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten;
anschließend Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS
12. Überschichten mit jeweils 100 μl Sekundärantikörper 1:200 verdünnt in
PBS und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur
13. Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS
Materialien und Methoden
41
14. Auftragen von jeweils 100 μl ABC-Reagenz und Inkubation für 30 Minuten
bei
Raumtemperatur
(Herstellung
des
ABC-Reagenz
mindestens
30 Minuten vor Gebrauch)
15. Spülen der Schnitte zweimal für jeweils 5 Minuten in PBS; anschließend
Verbringen der Schnitte in eine Glasküvette mit PBS
16. Inkubation der Schnitte in DAB mit 0,03%igem H2O2 (s. Anhang) unter
langsamen Rühren für 5 Minuten bei Raumtemperatur
17. Spülen der Schnitte zweimal für jeweils 5 Minuten in PBS; anschließend
Verbringen der Schnitte in kaltes Leitungswasser für 5 Minuten
18. Gegenfärbung der Schnitte in Hämalaun nach Mayer (MULISCH und
WELSCH, 2010) für 15 Sekunden
19. Bläuen der Schnitte in fließendem, kaltem Leitungswasser für 10 Minuten
20. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für jeweils
2-3 Minuten in 50%igem, 70%igem und 96%igem Ethanol, 5 Minuten in
Isopropanol und zweimal jeweils 5 Minuten in Essigsäurebutylester (EBE)
21. Eindecken der Schnitte (Roti® Histokitt II) mit Hilfe des GlasEindeckautomaten Promounter® RCM2000 (Fa. Medite GmbH)
3.5.3
Protokoll für die TUNEL-Methode an Paraffinschnitten
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf SuperFrost® Plus-Objektträger und
anschließendes Trocknen im Wärmeschrank bei 57°C für mindestens
30 Minuten
2. Entparaffinierung der Schnitte in Roticlear® zweimal für jeweils 5 Minuten,
in Isopropanol, 96%igem, 70%igem und 50 %igem Ethanol einmal für
jeweils 5 Minuten
3. Spülen der Schnitte für 5 Minuten in PBS
4. Ansetzen der Endverdünnung (20 μg/ml) von Proteinase K-Lösung: 4 μl
Proteinase K-Stammlösung in 1996 μl Verdaupuffer (s. Anhang;
ausreichend für 20 Schnitte)
5. Objektträger abtrocknen und Gewebe mit Fettstift umranden
42
Materialien und Methoden
6. Auftragen von 100 μl Proteinase K-Lösung pro Schnitt und Andauen für
10 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer
7. Working Strength TdT-Solution (s. Anhang) ansetzen und bis zum
Gebrauch auf Eis lagern
8. Working Strength Stop/Wash-Puffer (s. Anhang) in einer Küvette ansetzen
9. Überführen der Schnitte aus der feuchten Kammer in eine Küvette und
viermaliges Spülen unter ständigem Rühren für jeweils 2 Minuten in Aqua
destillata (A. dest.)
10. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 56 ml PBS + 4 ml frisch
zugesetztem 30%igen H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung 2%igem
H2O2) unter langsamen Rühren für 5 Minuten
11. Spülen der Schnitte zweimal für jeweils 5 Minuten in PBS
12. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen in eine feuchte Kammer
13. Auftragen von 75 μl Equilibrationspuffer pro Schnitt und Inkubation für
10 Minuten
14. Überschuss
an
Equilibrationspuffer
abschütten
und
Objektträger
abtrocknen
15. Auftragen von 55 μl Working Strength TdT-Solution pro Schnitt, mit
Coverslips bedecken und Inkubation für 60 Minuten bei 37°C im
Brutschrank
16. Küvette mit Working Strength Stop/Wash-Puffer ins Wasserbad (37°C)
setzen und vorwärmen
17. Entfernen der Coverslips
18. Überführen der Schnitte in Working Strength Stop/Wash-Puffer und im
Wasserbad unter ständiger Bewegung (Schüttelrost) für 30 Minuten
inkubieren
19. Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS
20. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen in eine feuchte Kammer
21. Auftragen von 55 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase pro Schnitt, mit
Coverslips bedecken und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur
22. Überführen der Schnitte in eine Küvette
Materialien und Methoden
43
23. Spülen der Schnitte viermal für jeweils 2 Minuten in PBS
24. Inkubation der Schnitte in DAB mit 0,03%igem H2O2 (s. Anhang) unter
langsamen Rühren für 5 Minuten bei Raumtemperatur
25. Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS
26. Kurzes Eintauchen der Schnitte in A. dest.
27. Gegenfärbung der Schnitte in Hämalaun nach Mayer für 10 Sekunden
28. Bläuen der Schnitte in fließendem, kaltem Leitungswasser für 5 Minuten
29. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für jeweils
2-3 Minuten in 50%igem, 70%igem und 96%igem Ethanol, 5 Minuten in
Isopropanol und zweimal jeweils 5 Minuten in EBE
30. Eindecken der Schnitte (Roti® Histokitt II) mit Hilfe des GlasEindeckautomaten Promounter® RCM2000 (Fa. Medite GmbH)
3.5.4
Kontrollen für die Immunhistologie und TUNEL-Methode
Als Positivkontrolle für die Detektion von Staupevirus-Nukleoprotein (CDV-NP) diente
Gewebe von nachweislich Staupevirus-infizierten Hunden aus dem Archiv des
Instituts für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Das ZNSGewebe der gesunden Kontrolltiere wurde zum Nachweis von GFAP, MBP und
Nogo-A herangezogen. Von denselben Tieren diente lymphatisches Gewebe
(Lymphknoten,
Milz,
Thymus)
einerseits
zum
Nachweis
von
Leukozyten,
einschließlich Antigen-präsentierender Zellen (CD3, CD79α, Foxp3, MAC 387, BS-1
und MHC-II) und andererseits zum Nachweis von Proteinen der Apoptosekaskade
(Fas, Bcl-2, Bax, cIAP-2, Survivin und aktivierte Caspase-3). AQP-4 wurde an
Gehirnschnitten einer gesunden, adulten Ratte und innerhalb der kaninen Retina
nachwiesen. Zur Detektion von Albumin diente kanines Lebergewebe sowie eine
kanine Niere mit Filtrationsstörung (Glomerulonephritis).
Als
Negativkontrolle
diente
in
Abhängigkeit
der
Herkunftsspezies
des
Primärantikörpers eine entsprechende Verdünnung einer Aszitesflüssigkeit von
BALB/c Mäusen (CDV-NP, CD79α, MAC 387, MHC-II, Bcl-2), von Serum nichtimmunisierter Kaninchen (GFAP, MBP, Nogo-A, CD3, Fas, Bax, Survivin, aktivierte
44
Materialien und Methoden
Caspase-3, AQP-4), Schafen (Albumin) oder Ziegen (cIAP-2) sowie eine Ratten
IgG2a-Isotyp-Kontrolle (Foxp3).
Als Positivkontrolle für die TUNEL-Methode diente ein dem ApopTag® Plus
Peroxidase
In
Situ
Apoptosis
Detection
Kit
beigefügtes
Kontrollgewebe
(Mammagewebe einer Ratte) sowie lymphatisches Gewebe (Lymphknoten, Milz,
Thymus) der Kontrollhunde. Zum Zwecke einer Negativkontrolle wurde das
TdT-Enzym in der Working Strength TdT-Solution ausgelassen und die Schnitte
lediglich mit dem Reaktionspuffer inkubiert.
3.6
Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung
Das Protokoll für die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung wurde nach Seehusen et
al. (2007) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Dabei stand eine nähere
Charakterisierung
apoptotischer
Zellen
an
repräsentativ
ausgewählten
Paraffinschnitten von Tieren verschiedener Gruppen zur Verfügung.
Im ersten Reaktionsschritt wurden Astrozyten (GFAP), Oligodendrozyten (Nogo-A),
Endothelzellen (von Willebrand-Faktor; vWF), T-Zellen (CD3) und Zellen mit
Expression aktivierter Caspase-3 über einen Primärantikörper detektiert und in einer
indirekten
Immunfluoreszenz
mittels
eines
Indocarbocyanin
(Cy3)-markierten
Sekundärantikörpers visualisiert (rote Fluoreszenz; excitation peak 549 nm, emission
peak 562 nm). Im zweiten Reaktionsschritt wurden apoptotische Zellen anhand der
TUNEL-Reaktion
detektiert
und
ebenfalls
auf
Grundlage
einer
indirekten
Immunfluoreszenz mittels eines anti-Digoxigenin-Fluorescein Isothiocyanat (FITC)gekoppelten Antikörpers visualisiert (grüne Fluoreszenz; excitation peak 495 nm,
emission peak 517 nm). Im Anschluss wurde eine Kerngegenfärbung mit
4’,6-Diamidin-2-phenylindil (DAPI; Darstellung nukleärer Desoxyribonukleinsäure;
DNS) durchgeführt (blaue Fluoreszenz; excitation peak 358 nm, emission peak
463 nm).
Die Primärantikörper fanden entsprechend bestehenden Literaturangaben für
kanines Gewebe Anwendung und/oder ihre Kreuzreaktivität wurde an spezifisch
ausgewähltem kaninen Kontrollgeweben bestätigt bzw. etabliert.
Materialien und Methoden
Tabelle 2:
45
Übersicht zu den verwendeten Primärantikörpern/Lektinen
Antikörper
Hersteller
Kat.-Nr./Klon
Herkunft
Demask.
Block-
Verd.
Sek.-AK
ZNS 1:5
1:6000
GaM-b
ZNS 1:5
1:800
GaR-b
ZNS 1:5
1:500
GaR-b
Oligodendrozyten
-
ZNS 1:5
1:500
GaR-b
Aquaporin-4
-
ZNS 1:5
1:2000
GaR-b
Astrozyten
KNS 1:5
1:2000
RaSh-b
Albumin
ZNS 1:5
1:1000
GaR-b
T-Zellen
ZNS 1:5
1:60
GaM-b
B-Zellen
KNS 1:5
1:10
RaRt-b
CDV-NP
Örvell, C.
Zitratpuffer/
Clone 3991
mAk - Maus
Mikrowelle
MBP
Merck Millipore
AB 980
pAk - Kaninchen
Nogo-A
Merck Millipore
Zitratpuffer/
AB 5664 P
pAk - Kaninchen
Mikrowelle
AQP-4
Merck Millipore
AB 3594
pAk - Kaninchen
GFAP
Dako
Z 0334
pAk - Kaninchen
Albumin
Abcam
Zitratpuffer/
AB 8940
pAk - Schaf
Mikrowelle
CD3
Dako
Zitratpuffer/
A 0452
pAk - Kaninchen
Mikrowelle
CD79α
Dako
Zitratpuffer/
M 7051 Clone HM57
mAk - Maus
Mikrowelle
Foxp3
eBioscience
Zitratpuffer/
14-5773 Clone FJK-16s
mAk - Ratte
Mikrowelle
BS-1
Sigma
L 3759
Lektin-b
MAC 387
Dako
Zitratpuffer/
A 0747
mAk - Maus
Mikrowelle
MHC-II
Dako
Zitratpuffer/
M 0746 Clone TAL.1B5
mAk - Maus
Mikrowelle
Bcl-2
Leica Microsyst.
Zitratpuffer/
NCL-bcl-2-486 Clone 3.1
mAk - Maus
Mikrowelle
cIAP-2
R&D Systems
Zitratpuffer/
AF 8171
pAk - Ziege
Mikrowelle
Survivin
Novus Biologicals
Zitratpuffer/
NB 500-201
pAk - Kaninchen
Mikrowelle
Bax
Santa Cruz
Zitratpuffer/
(P-19) sc-526
pAk - Kaninchen
Mikrowelle
Fas
Santa Cruz
Zitratpuffer/
(X-20) sc-1024
pAk - Kaninchen
Mikrowelle
cleaved Caspase-3
Cell Signaling
Zitratpuffer/
(Asp175) #9661
pAk - Kaninchen
Mikrowelle
vWF
Dako
A 0082
pAk - Kaninchen
-
-
Pronase
serum
-
3μl auf
1ml PBS
-
Nachweis
Staupevirus-NP
Myelin-basisches
Protein
regulatorische
T-Zellen
Makrophagen/
Mikroglia/Endothel
ZNS 1:5
1:200
GaM-b
Monozyten
ZNS 1:5
1:80
GaM-b
ZNS 1:5
1:1000
GaR-b
Bcl-2 Protein
KNS 1:5
1:1000
RaG-b
cIAP-2 Protein
ZNS 1:5
1:1000
GaR-b
Survivin Protein
ZNS 1:5
1:2000
GaR-b
Bax Protein
ZNS 1:5
1:1000
GaR-b
Fas-Rezeptor
ZNS 1:5
1:200
GaR-b
aktivierte Caspase-3
ZNS 1:5
1:500
GaR-b
Endothel
Leukozyten/
Mikroglia/Endothel
mAk = monoklonaler Antikörper; pAk = polyklonaler Antikörper; KNS = Kaninchenneutralserum; ZNS = Ziegenneutralserum;
GaR-b = goat-anti-rabbit-biotinylated (Ziege-anti-Kaninchen-biotiniliert); GaM-b = goat-anti-mouse-biotinylated (Ziege-antiMaus-biotiniliert); RaRt-b = rabbit-anti-rat-biotinylated (Kaninchen-anti-Ratte-biotiniliert); RaG-b = rabbit-anti-goat-biotinylated
(Kaninchen-anti-Ziege-biotiniliert); RaSh-b = rabbit-anti-sheep-biotinylated (Kaninchen-anti-Schaf-biotiniliert)
46
3.6.1
Materialien und Methoden
Antikörper, TUNEL-Kit und Seren
Die verwendeten Primärantikörper wurden in PBS unter Zusatz von 1% BSA den
Angaben entsprechend Tabelle 2 verdünnt.
Ein
fluoreszenzmarkierter
conjugated
AffiniPure
Goat
Ziege-anti-Kaninchen
Anti-Rabbit
IgG
Sekundärantikörper
(Cy™3-
111-165-045,
Jackson
(H+L),
ImmunoResearch) wurde in PBS ohne Zusatz von BSA in einer Verdünnung von
1:200 verwendet.
Für die Apoptosedetektion mittels TUNEL-Methode wurde das ApopTag® Plus
Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (S7111, Millipore) verwendet.
3.6.2
Protokoll für die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf SuperFrost® Plus-Objektträger und
anschließendes Trocknen im Wärmeschrank bei 57°C für mindestens
30 Minuten
2. Entparaffinierung der Schnitte in Roticlear® zweimal für jeweils 5 Minuten,
in Isopropanol, 96%igem und 70%igem Ethanol einmal für jeweils
5 Minuten
3. Spülen der Schnitte für 5 Minuten in PBS
4. Ansetzen der Endverdünnung (20 μg/ml) von Proteinase K-Lösung:
4 μl Proteinase K-Stammlösung in 1996 μl Verdaupuffer (s. Anhang;
ausreichend für 20 Schnitte)
5. Demaskierung der Antigene:
o
in Zitratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten in der Mikrowelle (800 Watt;
aktivierte Caspase-3, CD3, GFAP, Nogo-A); im Anschluss Abkühlung
im Kochgefäß bei Raumtemperatur für ca. 10 Minuten
Materialien und Methoden
o
47
Auftragen von 100 μl Proteinase K-Lösung pro Schnitt und Andauen
für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer (vWF);
Objektträger zuvor abtrocknen und Gewebe mit Fettstift umranden
6. Spülen der Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS
7. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen in eine feuchte Kammer
(Gewebe aus der Mikrowellen-Demaskierung mit Fettstift umranden)
8. Überschichten der Schnitte mit jeweils 100 μl Ziegennormalserum 1:5 in
PBS verdünnt für 20 Minuten
9. Abschütten des Blockserums und Waschen der Schnitte zweimal für
1 Minute in PBS
10. Auftragen von jeweils 100 μl Primärantikörper verdünnt in PBS mit 1%
BSA bzw. entsprechend verdünntem Kaninchenserum zum Zwecke der
Negativkontrolle; Inkubation bei 4°C über Nacht in einer feuchten Kammer
11. Auftauen des ApopTag® Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit
(S7111, Millipore)
12. Erwärmen der Schnitte bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten;
anschließend Spülen der Schnitte zweimal für jeweils 5 Minuten in PBS
13. Überschichten mit jeweils 100 μl Cy-3 konjugiertem Sekundärantikörper
1:200 verdünnt in PBS und Inkubation für 60 Minuten in einer feuchten
Kammer
14. Working Strength TdT-Solution (s. Anhang) ansetzen und bis zum
Gebrauch auf Eis lagern
15. Working Strength Stop/Wash-Puffer (s. Anhang) in einer Küvette ansetzen
16. Spülen der Schnitte im Dunkeln zweimal für jeweils 2 Minuten in PBS
17. Auftragen von 75 μl Equilibrationspuffer pro Schnitt und Inkubation für
10 Minuten in einer feuchten Kammer
18. Überschuss
an
Equilibrationspuffer
abschütten
und
Objektträger
abtrocknen
19. Auftragen von 55 μl Working Strength TdT-Solution pro Schnitt, mit
Coverslips bedecken und Inkubation für 60 Minuten bei 37°C im
Brutschrank
48
Materialien und Methoden
20. Küvette mit Working Strength Stop/Wash-Puffer ins Wasserbad (37°C)
setzen und vorwärmen
21. Anti-Digoxigenin-Fluorescein-Konjugat (s. Anhang) ansetzen und bis zum
Gebrauch bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern
22. Entfernen der Coverslips
23. Überführen
der
Schnitte
in
Working
Strength
Stop/Wash-Puffer
(abgedunkelt) und im Wasserbad unter Bewegung (Schüttelrost) für
15 Sekunden, anschließend für 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubieren lassen
24. Spülen der Schnitte im Dunkeln dreimal für jeweils 1 Minute in PBS
25. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen in eine feuchte Kammer
26. Auftragen von 65 μl Anti-Digoxigenin-Fluorescein-Konjugat pro Schnitt, mit
Coverslips bedecken und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur
27. Überführen der Schnitte in eine abgedunkelte Küvette
28. Spülen der Schnitte viermal für jeweils 2 Minuten in PBS
29. Auftragen von 10-15 μl DAPI/Antifade Solution, Ready to use (S7113,
Millipore)
30. Eindecken der Schnitte mit Deckgläsern (Fa. Engelbrecht Medizin- und
Labortechnik GmbH) von Hand und Lagerung im Dunkeln bei 4°C
3.6.3
Kontrollen für die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung
Als Positivkontrolle für die Detektion von GFAP, Nogo-A und vWF diente ZNSGewebe der Kontrollhunde. Das lymphatische Gewebe (Milz, Thymus, Lymphknoten)
derselben Tiere wurde zum Nachweis der aktivierten Caspase-3 und von CD3
verwendet. Als Positivkontrolle für die TUNEL-Methode diente ein dem ApopTag®
Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit beigefügtes Kontrollgewebe
(Mammagewebe einer Ratte) sowie lymphatisches Gewebe (Milz, Thymus,
Lymphknoten) der Kontrollhunde.
Als Negativkontrolle für den ersten Reaktionsschritt wurde eine dem Primärantikörper
entsprechende Verdünnung von Serum nicht-immunisierter Kaninchen auf die
Materialien und Methoden
49
Schnitte aufgetragen. Für die Negativkontrolle im zweiten Reaktionsschritt wurde das
TdT-Enzym in der Working Strength TdT-Solution ausgelassen und die Schnitte
lediglich mit dem Reaktionspuffer inkubiert.
Insgesamt wurden für jedes Tier vier Schnitte im Protokoll mitgeführt:

Schnitt 1:
Primärantikörper
+
TdT-Enzym

Schnitt 2:
Primärantikörper
+
Reaktionspuffer ohne TdT-Enzym

Schnitt 3:
Kaninchenserum
+
TdT-Enyzm

Schnitt 4:
Kaninchenserum
+
Reaktionspuffer ohne TdT-Enzym
3.7
Auswertung der Lichtmikroskopie, Immunhistologie und TUNELMethode
Von je einem HE-gefärbten Schnitt pro Tier wurde ein Flachbildscan zwecks
Topographierung der einzelnen Herdläsionen bzw. Kontrollareale angefertigt. Diese
erhielten eine Ziffer und wurden in die Übersicht skizziert. Als Voraussetzung für die
Auswertung musste jede Lokalisation lichtmikroskopisch in Serienschnitt 1 und 30
vorliegen.
Die Auswertung des Virusgehalts, der Nogo-A Expression von Oligodendrozyten, der
Entzündungsantwort (CD3, CD79α, Foxp3, Mac 387, BS-1 und MHC-II) und der
Apoptose-Kaskade (Fas, Bcl-2, Bax, cIAP-2, Survivin, aktivierte Caspase-3 und
TUNEL) erfolgte quantitativ. Einzig die Auswertung für Albumin wurde qualitativ
vorgenommen und das in der Folge erläuterte Evaluationsschema findet für diesen
Antikörper keine Berücksichtigung.
Es wurde zwischen intraparenchymatösen (ip) und perivaskulären (pv) Zellen
unterschieden. Als perivaskulär galten Zellen im Virchow-Robin-Raum, welche sich
in einer einfachen bis mehrlagigen konzentrischen Anordnung um das Gefäß
darstellten. Weiterhin wurden zentral ein Gefäßlumen mit oder ohne intraluminale
Erythrozyten, ein auskleidendes Endothel und in Abhängigkeit von Gefäßtyp und
50
Materialien und Methoden
Wandstärke weitere Elemente der Gefäßwand unterschieden. Intravasal gelegene
Zellen wurden bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
Mit Hilfe einer in das Okular des Mikroskops eingelassenen Netzmikrometerplatte
(U-OCMSQ10/10,
OLYMPUS
Deutschland
GmbH,
Hamburg)
erfolgte
die
Auszählung innerhalb eines begrenzten Zählfelds (ZF), dessen Gesamtfläche in 100
Quadrate unterteilt war und bei Verwendung eines 10-fach Okulars und 40er
Objektivs eine Größe von 0,0625mm2 pro ZF umfasste. Es wurden 10 ZF pro
Areal/Läsion ausgezählt. Bei mehr als 10 möglichen ZF wurden mit Hilfe des 10-fach
Okulars und 3,2er Objektivs in der Netzmikrometerplatte in der Übersicht 10 ZF in
einer gleichmäßigen Verteilung ausgewählt und anschließend ausgezählt. Die
Angabe positiver Zellen/Zellkerne erfolgte in ihrer absoluten Anzahl/0,0625mm2.
Die
Auswertung
perivaskulärer
Zellinfiltrate
erfolgte
gleichermaßen
unter
Verwendung eines 10-fach Okulars und 40er Objektivs. Es wurde der Quotient aus
der absoluten Anzahl positiver Zellen/Zellkerne und der Gesamtzahl (sowohl positive
als auch negative perivaskuläre Zellen) und die Angabe in Prozent umgerechnet.
Dabei wurden 10 Gefäße pro Areal/Läsion ausgewertet.
Die Auswertung der astrozytären GFAP- und AQP-4-Expression als auch der
MBP-Expression von Oligodendrozyten erfolgte morphometrisch. Für diesen Zweck
wurde jedes Areal/Läsion bei Verwendung eines 10-fach Okulars und 10er Objektivs
photographisch erfasst (Mikroskop: Olympus BX51; Kamera: Olympus DP72;
OLYMPUS Deutschland GmbH, Hamburg). Unter Verwendung der analySIS® 3.2
Software (Soft Imaging Solutions GmbH, Münster) erfolgte im Anschluss manuell die
Abgrenzung der Kontrollareale sowie der Staupe-Läsionen als sogenannte regions of
interest
(ROI).
Innerhalb
dieser
ROI
wurden
die
Fläche
der
relevanten
immunopositiven Strukturen in Relation zur Gesamtfläche detektiert und das
Ergebnis in Prozent angegeben.
Materialien und Methoden
3.8
51
Auswertung der Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung
Die Auswertung der Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung wurde zunächst qualitativ
an exemplarisch ausgewählten Herdläsionen der frühen prädemyelinisierenden und
fortgeschrittenen demyelinisierenden Infektionsphasen durchgeführt. Einerseits
sollten die immunhistologischen Ergebnisse bestätigt werden, andererseits eine
Ko-Lokalisation TUNEL+ apoptotischer Zellen mit GFAP, Nogo-A, vWF, CD3 oder
aktivierter Caspase-3 erfolgen.
Die
Beurteilung
repräsentativer
Schnittpräparaten
erfolgte
mittels
Areale
eines
innerhalb
der
Läsionen
aus
den
Umkehrfluoreszenzmikroskops
und
photographischer Dokumentation jeder Emissionsebene (Mikroskop: Olympus IX70;
Kamera: Olympus DP72; OLYMPUS Deutschland GmbH, Hamburg). Für die
Visualisierung der Fluorochrome wurden die folgenden optischen Filtersysteme
angewendet:

Blaufilter:
U-MNU2; Exzitationsfilter BP 360-370; Emissionsfilter BA
420; dichromatischer Filter DM 400

Grünfilter:
U-MWB2; Exzitationsfilter BP 460-490; Emissionsfilter BA
520IF; dichromatischer Filter DM 500

Rotfilter:
U-MNG2; Exzitationsfilter BP 530-550; Emissionsfilter BA
BA 590; dichromatischer Filter DM 570
3.9
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen erfolgte mit
dem Statistikprogramm SPSS® Statistics (IBM® SPSS® Statistics Version 20, New
York, USA) im Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
Eine Normal- bzw. Lognormalverteilung der gemessenen Parameter lag nicht vor, so
dass für die anstehenden Vergleichstests nicht-parametrische Verfahren Anwendung
fanden. Als Globaltest für den Gruppenvergleich wurde zunächst eine nicht-
52
Materialien und Methoden
parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse (Kruskal-Wallis-Test) durchgeführt. Für den
Fall signifikanter Unterschiede innerhalb der Gruppen wurde anschließend zum
paarweisen Gruppenvergleich der Mann-Whitney U-Test herangezogen. Für alle
Berechnungen wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 ohne α-Adjustierung festgelegt.
P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant, p-Werte < 0,01 als statistisch sehr
signifikant und p-Werte < 0,001 als statistisch hochsignifikant angesehen.
Die graphische Darstellung der Ergebnisse in Form von box-and-whisker-plots
erfolgte mittels der GraphPad Prism® Software (Version 5.04; GraphPad Software,
Inc., La Jolla, USA). Im Falle eines statistisch signifikanten Unterschieds einer
Gruppe der Staupevirus-infizierten Tiere (Gruppen 2 bis 8) zur Kontrollgruppe
(Gruppe 1) wurde diese oberhalb des box-and-whisker-plots mit einem Sternchen (*)
gekennzeichnet.
Ergebnisse
53
4
Ergebnisse
4.1
Lichtmikroskopische und immunhistologische Auswertung für die
Gruppeneinteilung
Die Einteilung der untersuchten Lokalisationen im Kleinhirn und Stammhirn der
Kontrolltiere und der Staupevirus-infizierten Tiere erfolgte nach den Kriterien wie sie
in Kapitel 3.3 beschrieben sind. Insgesamt wurden 203 Lokalisationen bei den
33
Studientieren
berücksichtigt.
Die
lichtmikroskopische
Auswertung
und
Gruppeneinteilung erfolgte qualitativ anhand der HE- und LFB-KEV-Färbung und
unter Zuhilfenahme der Staupevirus- und MBP-Immunhistologie.
4.1.1
Befunde bei den Kontrollhunden
Bei den fünf gesunden Hunden der Kontrollgruppe 1 wurden 20 Areale in der weißen
Substanz beurteilt. In der HE- und LFB-KEV-Färbung sowie in der Staupevirus- und
MBP-Immunhistologie
wurden
keine
histopathologischen
Veränderungen
beobachtet.
4.1.2
Befunde bei den Staupevirus-infizierten Hunden
Die Staupevirus-infizierten Tiere wiesen mit wenigen Ausnahmen (Tier-Nr. 15, 20
und
29)
histopathologische
Veränderungen
verschiedener
Läsionen
auf
(Gruppen 2 bis 8).
Für jedes Tier wurde zunächst eine neuropathologische Einordung im Sinne einer
übergeordneten
Gesamtdiagnose
vorgenommen.
Diese
erfolgte
unter
Berücksichtigung des am weitest fortgeschrittenen Läsionstyps. Eine Übersicht für
das jeweilige Einzeltier wird in Tabelle 3 gegeben.
54
Ergebnisse
Bei 15 Staupevirus-infizierten Hunden (Tier-Nr. 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 21,
26, 28, 31 und 32) wurden insgesamt 28 Areale ausgewertet, welche den Kriterien
der unveränderten weißen Substanz (Gruppe 2; NAWM) entsprachen. In der
HE-
sowie
in
der
LFB-KEV-Färbung
ergaben
sich
keine
Hinweise
auf
pathomorphologische Veränderungen. Die übrigen 13 Tiere zeigten in der
Immunhistologie eine diffuse Verteilung von Staupevirus-NP in der weißen Substanz
und konnten daher für die NAWM nicht berücksichtigt werden.
Ein
immunhistologischer
Nachweis
von
Staupevirus-NP
ohne
begleitende
pathologische Alterationen in der Lichtmikroskopie (Gruppe 3; AOL) wurde bei
16 infizierten Tieren (Tier-Nr. 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 31
und 33) in insgesamt 28 Lokalisationen beobachtet. Hyperzelluläre Areale wurden
nicht berücksichtigt.
Eine Vakuolisierung der weißen Substanz stellte sich in der HE-Färbung bei
11 Tieren (Gruppe 4; VAK; Tier-Nr. 13, 14, 16, 17, 21, 22, 25, 26, 27, 31 und 33) in
19 Lokalisationen dar. Eine Verminderung der LFB-Anfärbbarkeit der Myelinscheiden
wurde nicht beobachtet. Die Abgrenzung gegenüber hyperzellulären, vakuolisierten
Arealen der Gruppe 5 erschwerte die Auswahl der Lokalisationen und schränkte
daher deren Anzahl ein.
11 Tiere (Tier-Nr. 8, 9, 13, 14, 16, 17, 23, 24, 25, 26 und 31) wiesen Läsionen in 22
Lokalisationen auf und wurden der Gruppe 5 (AKUT; s. Abbildung 1A) zugeordnet.
Im Vordergrund stand neben einer Vakuolisierung der weißen Substanz die
Hyperzellularität der Areale. Bei einigen Tieren wurden prominente, überwiegend
intranukleäre, teils intrazytoplasmatische, eosinophile Einschlusskörperchen vom
Typ Cowdry A sowie vereinzelte Gemistozyten beobachtet. Eine reduzierte LFBAnfärbbarkeit der Myelinscheiden lag nicht vor.
Ergebnisse
55
Den größten Anteil der untersuchten Läsionen bildete die Gruppe 6 (SOE;
s. Abbildung 1C) der subakut-demyelinisierenden Enzephalitis ohne perivaskuläre
Entzündung bei 12 Tieren (Tier-Nr. 9, 13, 14, 15, 19, 20, 23, 24, 25, 27, 31 und 33) in
42 Lokalisationen. Im Vordergrund stand neben einer Hyperzellularität und mittel- bis
hochgradigen Vakuolisierung der weißen Substanz nun eine Reduktion der
LFB-Anfärbbarkeit mit Auftreten zahlreicher Gitterzellen, welche teils LFB-positives,
intrazytoplasmatisches Material (s. Abbildung 5C) enthielten. Einschlusskörperchen
(s. Abbildung 1B) und Gemistozyten (s. Abbildung 1D) wurden im Vergleich zur
Gruppe 5 in einem höheren Ausmaße beobachtet.
Aus Gruppe 7 der subakut-demyelinisierenden Enzephalitis mit perivaskulärer
Entzündung (SME) standen 10 Tiere (Tier-Nr. 6, 7, 8, 10, 11, 12, 18, 21, 28 und 30)
mit insgesamt 23 untersuchten Lokalisationen zur Verfügung. Neben Merkmalen wie
Hyperzellularität, Vakuolisierung, Demyelinisierung und viralen Einschlusskörperchen
wurde in dieser Gruppe im perivaskulären Raum eine lymphohistiozytäre
Zellinfiltration beobachtet, welche nicht mehr als drei Zelllagen ausmachte.
Für die Gruppe 8 der chronisch-demyelinisierenden Enzephalitis mit perivaskulärer
Entzündung (CHRON) wurden 21 Lokalisationen von 10 Tieren (Tier-Nr. 6, 7, 8, 10,
11, 12, 18, 28, 30 und 32) untersucht. Abweichend von der Gruppe 7 umfasste das
perivaskuläre
lymphohistiozytäre
Zellinfiltrat
mindestens
drei
Lagen
(s. Abbildung 1E und 1F).
Ausmaß und Grad der Demyelinisierung in den Gruppen 6 bis 8 war interindividuell
zum Teil unterschiedlich. Unabhängig vom Läsionstyp zeigten einige Tiere relativ
kleine und umschriebene Herdveränderungen mit geringgradiger Reduktion der
LFB-Anfärbbarkeit sowie geringer Anzahl von Gitterzellen/Myelinophagen. Wiederum
andere
Tiere
zeigten
großflächige,
teils
konfluierende
Malazieherde
unter
ausgeprägtem Verlust der LFB-Anfärbbarkeit (s. Abbildung 5B) als auch der
organotypischen Architektur. Hier dominierten, neben einem unterschiedlichen
lymphozytären Zellinfiltrat, Gitterzellen/Myelinophagen das Entzündungsgeschehen.
56
Ergebnisse
Abbildung 1: frühe und späte Phasen im Kleinhirn und Stammhirn Staupevirus-infizierter Tiere
A–F: HE-Färbung; A: akute Läsion in der zerebellären weißen Substanz mit Hyperzellularität und
Vakuolisierung, Tier 23, Balken = 200 μm; B: demyelinisierender Herd mit Gitterzellen (Pfeilspitzen)
und intranukleären, eosinophilen Einschlusskörperchen (Pfeile), Tier 8, Balken = 20 μm; C: subakut
demyelinisierender Herd ohne perivaskuläre Entzündung in der paraventrikulären weißen Substanz
mit ausgeprägter Vakuolisierung, Hyperzellularität und Gefäßaktivierung, Tier 27, Balken = 200 μm;
D: demyelinisierender Herd mit Gitterzellen, Gemistozyten (Pfeilspitzen) und Kerntrümmern (Pfeile),
Tier 20, Balken = 50 μm; E: chronisch-demyelinisierender Herd mit Vakuolisierung, perivaskulärer
Entzündungszellinfiltration und Hyperzellularität, Tier 30, Balken = 200 μm; F: chronischdemyelinisierender Herd: mononukleäre Infiltration des Virchow-Robin-Raumes, Tier 30, Balken = 50
μm; Sternchen = Gefäß.
Ergebnisse
Tabelle 3:
57
neuropathologische Gesamtdiagnose der Staupevirus-infizierten Tiere
NEUROPATHOLOGISCHE DIAGNOSE
akute Enzephalitis
akute Enzephalitis bis subakut-demyelinisierende
Enzephalitis ohne perivaskuläre Entzündung
subakut-demyelinisierende Enzephalitis ohne
perivaskuläre Entzündung
subakut bis chronisch-demyelinisierende
Enzephalitis mit perivaskulärer Entzündung
TAGEBUCH-NR.
TIER-NR.
2395-97
16
936-98
17
S 2658-04
22
S 1814-05
26
S 1635-09
29
2965-88
9
1776-95
13
22-96
14
S 954-05
24
S 1725-05
25
S 481-07
27
S 58-05
23
N 404-07
31
N 537-08
33
415-96
15
2153-99
19
1107-00
20
2405-85
6
1357-86
7
1843-87
8
1913-90
10
2290-90
11
1443-95
12
941-98
18
S 2276-03
21
S 682-08
28
ND 12-92
30
N 407-07
32
58
4.1.3
Ergebnisse
Staupevirus-Nukleoprotein
Zur Detektion von Staupevirus-Antigen fand ein Maus-monoklonaler Antikörper
(Klon 3991) gegen das Nukleoprotein (NP) Anwendung. Der Virusnachweis gelang
mehrheitlich in der weißen Substanz des Klein- und Stammhirns sowie in geringerer
Menge in den Schichten des zerebellären Kortex (Stratum moleculare, ganglionare
und granulare) und einiger Kerngebiete. Das Präzipitat stellte sich intensiv mittel- bis
dunkelbraun gegen einen schwachen Reaktionshintergrund dar.
Staupevirus-NP fand sich überwiegend im kernnahen Zytoplasma glialer Zellen und
zum Teil eindrucksvoll in den Ausläufern von Faserastrozyten der weißen Substanz
sowie von protoplasmatischen Astrozyten und Bergmann-Stützzellen der grauen
Substanz (s. Abbildung 3A und 3B). Bei Tieren mit viralen Einschlusskörperchen
fand sich entsprechend ein positives Kern-assoziiertes Signal. Weiterhin lag
Staupevirus-Antigen in Endothelien und Perizyten, Ependymzellen, aktivierten
Mikroglia/Gitterzellen, Gemistozyten, Neuronen, Plexusepithelien und Zellen der
Pia mater vor (s. Abbildung 3).
In den Kontrollherden und in der NAWM infizierter Tiere (Gruppen 1 und 2) wurde
kein Staupevirus-NP nachgewiesen. Der Median lag bei 0 Zellen pro Zählfeld (ZF).
In der Gruppe 3 fand sich Staupevirus-NP in Arealen, welche eindeutig demarkiert in
Nachbarschaft zur Virusantigen-freien weißen Substanz lagen. Morphologisch fielen
insbesondere positive Faserastrozyten, Endothelzellen und unmittelbar perivaskulärorientierte Zellen, wie Perizyten, mononukleäre oder gliale Zellen auf. Der Median lag
bei 9,8 Zellen/ZF.
Läsionen
aus
den
prädemyelinisierenden
Gruppen
4
und
5
zeigten
ein
vergleichbares Verteilungsmuster von Virusprotein, wobei der Median bei 12,6 bzw.
15,6 Staupevirus-positiven Zellen/ZF lag. Neben den Beobachtungen aus Gruppe 3
wurden hier zusätzlich ab Gruppe 5 Antigen-positive Gemistozyten, aktivierte
Mikroglia und Einschlusskörperchen aufgefunden.
In der Phase der frühen Entmarkung (Gruppe 6) war der höchste Anteil Staupeviruspositiver Zellen festzustellen (Median: 28,7 Zellen/ZF). Besonders hervortaten sich
Ergebnisse
teils
59
massenhaft
Antigen-positive
Gitterzellen
in
Herden
mit
ausgeprägter
Abräumreaktion und Demyelinisierung.
Die Gruppen 7 und 8 der subakut- bis chronisch-entzündlichen Läsionen zeigten
charakteristischerweise im Vergleich zu den obigen Gruppen der infizierten Tiere
innerhalb der Läsionen eine auffällige Reduktion bis Abwesenheit, peripher in der
angrenzenden grauen und/oder weißen Substanz hingegen eine bleibend hohe
Expression von Staupevirus-Antigen. Infolge dessen kam es zu einer allgemeinen
Abnahme von Virusantigen (Median: 8,8 bzw. 11,2 positive Zellen/ZF). In den
perivaskulären Infiltraten konnten nur vereinzelt positive mononukleäre Zellen
detektiert werden (Median bei 1,5 bzw. 0,9%).
Unabhängig von der neuropathologischen Gesamtdiagnose wurde bei den meisten
Tieren Staupevirus in Choroidplexusepithel-, Ependym- oder meningealen Zellen
nachgewiesen. Vergleichbar stellten sich in den Schichten der zerebellären grauen
Substanz und in den Kerngebieten positive Zellen, insbesondere protoplasmatische
Astrozyten, Endothelien und Neuronen, dar. Im Stratum ganglionare fielen darüber
hinaus vereinzelt positive Purkinje-Zellen und Bergmann-Stützzellen auf. Die
angeführten Herdveränderungen fanden bei der Auswertung keine Berücksichtigung.
Mittels Kruskal-Wallis Test wurden hochsignifikante Unterschiede zwischen den
Gruppen festgestellt (p < 0,001). Die Unterschiede zwischen den perivaskulären,
NP-positiven
Zellen
waren
nicht
signifikant
(p
=
0,963).
Im
paarweisen
Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test zeigten die Gruppen 3 bis 8 sehr
signifikante (p < 0,01) und hochsignifikante (p < 0,001) Unterschiede zu den Gruppen
1 und 2. Die Gruppe 7 wies eine hochsignifikante (p < 0,001) und die Gruppe 8 eine
sehr signifikante (p < 0,01) Reduktion des Virus-Gehalts im Vergleich zur Gruppe 6
auf.
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 4).
60
Abbildung 2: Statistik der quantitativen Auswertung der Staupevirus-Immunhistologie
Ergebnisse
Ergebnisse
61
Abbildung 3: Kleinhirn und Stammhirn Staupevirus-infizierter Tiere
A-F: Staupevirus-Nukleoprotein-Immunhistologie (DAB) A: Kerngebiet im Stammhirn: Virusantigen in
Astrozyten, Tier 25, Balken = 50 μm; B: Ganglienzell- und Molekularschicht: Virusantigen in
Bergmann-Stützzellen und Purkinje-Zellen, Tier 25, Balken = 100 μm; C: IV. Ventrikel: Virusantigen in
Ependymzellen und paraventrikulärer weißer Substanz, Tier 26, Balken = 100 μm;
D: Virusantigen in Endothelien/Perizyten und Zellen der benachbarten weißen Substanz, Tier 22,
Balken = 20 μm; E: akuter Herd mit flächenhaften und F: chronisch-demyelinisierender Herd mit
zentral verminderten Gehalt von Virusantigen, Tier 9 bzw. 30, Balken = 200 μm; Sternchen = Gefäß.
62
4.1.4
Ergebnisse
Myelin-basisches Protein (MBP)
Der polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen ist gegen das humane MBP gerichtet
und markiert kanine Oligodendrozyten einschließlich ihrer Myelin-haltigen Ausläufer
gegen einen mäßig ausgeprägten Reaktionshintergrund.
Die MBP-Expression in den Kontrollherden der Gruppe 1 und in der NAWM infizierter
Tiere (Gruppe 2) stellte sich in fibrillären Strukturen der weißen Substanz in Form
eines hellbraunen bis braunen Präzipitats (Median: 71,8 bzw. 67,7%) dar.
Vereinzelte Ausläufer fanden sich in der Körner- und Ganglienzellschicht sowie in
benachbarten
Kerngebieten
bei
gleichbleibender
Intensität,
wohingegen
die
zerebelläre Molekularschicht ausgespart blieb (s. Abbildung 5A’). Negativ stellten
sich sowohl der perivaskuläre Raum und die Somata neuronaler Zellen dar. Die
Gruppe 3 der Antigen-haltigen Areale zeigte keine morphologischen Unterschiede zu
den Gruppen 1 und 2 (Median: 70,0%).
Expressionsmuster und Signalqualität der Gruppen 4 und 5 waren sowohl innerhalb
als auch außerhalb der Läsionen mit den Gruppen 1 bis 3 vergleichbar. Die
verminderte morphometrische Signaldichte (Median: 58,1 bzw. 54,0%) wurde nicht
als Folge einer Entmarkung sondern der Vakuolisierung der weißen Substanz
interpretiert. Läsionen der Gruppen 6 bis 8 zeigten in Abhängigkeit von der
Abräumreaktion einen gering- bis hochgradigen MBP-Verlust (Median: 24,9, 31,0
und 20,1%). Dieser war zusätzlich charakterisiert durch eine Reduktion der
Signalintensität als auch durch das Auffinden fragmentierter MBP-positiver
Strukturen. Teilweise ließ sich in den Gitterzellen ein deutlich positives,
intrazytoplasmatisches Signal beobachten (s. Abbildung 5B’ und 5C’).
Der Kruskal-Wallis Test zum Vergleich der Gruppen untereinander ergab einen hoch
signifikanten Unterschied in Bezug auf die MBP-Expression (p < 0,001). Der
paarweise Gruppenvergleich im Mann-Whitney U-Test ergab signifikant reduzierte
MBP-Expressionen im Vergleich der Gruppen 1 bis 3 zu den Gruppen 4 bis 8
(p < 0,05). Bei den infizierten Tieren war der MBP-Gehalt in den Läsionen mit Beginn
Ergebnisse
63
der Entmarkungsphasen (Gruppen 6 bis 8) jeweils hochsignifikant reduziert im
Vergleich zu den prädemyelinisierenden Phasen (Gruppen 3 bis 5; p < 0,001).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 4).
Abbildung 4: Statistik der morphometrischen Auswertung der MBP-Immunhistologie
64
Ergebnisse
Abbildung 5: Myelinverteilung in der zerebellären weißen Substanz eines Kontrollhundes und in
einem Entmarkungsherd bei der Hundestaupe
A-C: linke Seite LFB-KEV-Färbung; A’-C’: rechte Seite MBP-Immunhistologie (DAB); A, A’: weiße
Substanz eines Kontrolltieres mit gleichmäßiger Anfärbbarkeit für LFB (A) und MBP (A’, Folgeschnitt
zu A) innerhalb der Marklamellen, Tier 4, Balken = 200 μm; B, B’: subakute Läsion ohne perivaskuläre
Entzündung in der paraventrikulären weißen Substanz mit zentral reduzierter Anfärbbarkeit
(Sternchen) für LFB (B) und MBP (B’, Folgeschnitt zu B), Tier 27, Balken = 200 μm; C, C’: subakute
Läsion ohne perivaskuläre Entzündung mit LFB+ (C) und MBP+ (C’) Myelinophagen (Pfeile), Tier 20,
Balken = 20 μm.
Ergebnisse
4.2
65
Immunhistologische Detektion von Oligodendrozyten, Astrozyten
und Albumin
4.2.1
Nogo-A
Der polyklonale Kaninchen Antikörper ist gegen das Neurite Outgrowth Inhibitor
Protein A (Nogo-A) aus der Ratte gerichtet. Dabei handelt es sich um ein
Myelin-assoziiertes, auf das Neuritenwachstum inhibitorisch-wirkendes Protein
oligodendroglialen Ursprungs. Es gilt als Marker für reife humane und murine
Oligodendrozyten (KUHLMANN et al. 2007).
In
der
immunhistologischen
Reaktion
wurde
ein
hell-
bis
dunkelbraunes,
feingranuläres, zytoplasmatisches und membranöses Präzipitat, insbesondere im
perinukleären Bereich der Oligodendrozyten beobachtet, welches sich gegen eine
schwach bis mäßig ausgeprägte Hintergrundsreaktion darstellte. Ein helleres und
feineres Signal konnte in den oligodendrozytären Zellausläufern als loses und
dünnes Maschenwerk festgestellt werden. Neurone in den Kerngebieten und
Purkinje-Zellen im Stratum ganglionare wiesen ein leicht hellbraunes, feingranuläres,
zytoplasmatisches und membranöses Präzipitat auf, welches sich bis auf den
Axonhügel erstreckte.
Die höchste Dichte Nogo-A+ Oligodendrozyten fand sich in der zerebellären weißen
Substanz gefolgt von den dort liegenden Kerngebieten. Hier lagen sie großteils
einzeln, teils paarweise oder in kurzen Ketten angeordnet vor. Im Stratum granulare
und ganglionare hingegen wurden nur vereinzelte Nogo-A+ Zellen beobachtet,
während diese im Stratum moleculare mit seinen überwiegend marklosen Fasern
annähernd fehlten und zumeist nur in unmittelbarer Proximität zu den Purkinje-Zellen
lagen.
In den ausgewählten Arealen der Kontrolltiere sowie in der NAWM und den Antigenhaltigen Arealen der infizierten Tiere (Gruppen 1 bis 3) wurden gleichmäßig verteilte
Nogo-A+ Zellen detektiert. Die Mediane lagen bei 19,6, 18,2 bzw. 18,3 Zellen/ZF.
66
Ergebnisse
Zellen in den vakuolisierten und akuten Läsionen (Gruppen 4 und 5) zeigten eine
vergleichbare Signalstärke und -verteilung. Dennoch fiel im Unterschied zur
periläsionalen weißen Substanz vereinzelt eine deutliche Abschwächung der
Nogo-A-Reaktivität auf. Die Mediane lagen bei 14,6 und 16,3 Zellen/ZF.
Demyelinisierende Bereiche aus den Gruppen 6 bis 8 zeigten neben oben
angeführten (o.a.) Beobachtungen Nogo-A+ Zellen mit geschwollener als auch
pyknotischer Morphologie (s. Abbildung 7). Das Maschenwerk der Fortsätze war in
einigen Läsionen teilweise nicht mehr zu erkennen, wiederum andere zeigten eine
erhöhte Reaktivität. Im Median wurden 9,0, 9,1 bzw. 7,7 Zellen/ZF gefunden.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
Anzahl Nogo-A+ Zellen zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001). Im paarweisen
Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test wurde eine signifikante Reduktion
Nogo-A+ Zellen in den Gruppen 4 bis 8 im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt
(p < 0,05). Die Gruppen der Staupevirus-infizierten Tiere unterschieden sich im
Einzelnen jedoch nur in den prädemyelinisierenden Phasen (Gruppen 2 bis 5) im
jeweiligen Vergleich zu den demyelinisierenden Phasen (Gruppen 6 bis 8) signifikant
voneinander (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 4).
Ergebnisse
67
Abbildung 6: Statistik der quantitativen Auswertung der Nogo-A-Immunhistologie
Abbildung 7: Oligodendrozyten in frühen und späten Phasen der Staupeenzephalitis
A, B: Nogo-A-Immunhistologie (DAB); A: Nogo-A+ Oligodendrozyten in einem akuten Herd, Tier 24,
Balken = 100 μm; B: reduzierte Anzahl Nogo-A+, teils geschwollener Oligodendrozyten im Zentrum
eines chronisch-demyelinisierenden Herdes, Tier 32, Balken = 100 μm; Sternchen = Gefäß.
4.2.2
Saures Gliafaserprotein (GFAP)
Der polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen gegen bovines GFAP markierte im
ZNS der Hunde das astrozytäre Zytoplasma und deren Ausläufer. Das feingranuläre,
68
Ergebnisse
teils grobschollige Präzipitat war charakterisiert durch ein mittel- bis dunkelbraunes
Farbsignal
gegen
einen
mäßig
reaktiven
Hintergrund.
Außerhalb
der
zu
untersuchenden Areale/Läsionen ließ sich perivaskulär, subependymal und subpial
ein mäßig bis intensiver, positiver Saum astrozytärer Ausläufer, teils auch Somata
detektieren. Die Dichte protoplasmatischer Astrozyten in den Kerngebieten und in
den zerebellären Lagen der Granular- und Purkinjezellschicht war weitaus geringer
als in der weißen Substanz. Ein auffälliges Merkmal der äußeren Molekularschicht
war ein feinfibrilläres, perpendikulares, sich in Richtung Pia mater verdichtendes
Netzwerk GFAP-positiver Ausläufer der Bergmann-Stützzellen.
In der weißen Substanz der Kontrolltiere und der NAWM sowie der AOL der
infizierten Tiere (Gruppen 1 bis 3) wurden in einer gleichmäßigen Verteilung
regelmäßig ausgebildete Faserastrozyten beobachtet. Der Median lag bei 8,58, 11,0
bzw. 11,5 GFAP+ Zellen/ZF. Vakuolisierte Herde der Gruppe 4 zeigten im Median
13,93 GFAP+ Zellen/ZF ohne morphologische Besonderheiten. In Gruppe 5 der
akuten Herdveränderungen fielen innerhalb jener neben den Faserastrozyten
erstmals vergrößerte und plumpe, GFAP+ Somata mit einem homogen bis
feinkörnigen, hellbraunen zytoplasmatischen Signal auf (Gemistozyten; s. Abbildung
10C). Der Median lag bei 14,33 Zellen/ZF.
Im Stadium der frühen Entmarkung (Gruppe 6) fiel eine besonders hohe Anzahl von
Gemistozyten auf. Gleichzeitig wurde tendenziell eine geringgradige numerische
Reduktion von Astrozyten und deren Ausläufern im Vergleich zu den Gruppen 4 und
5 beobachtet. Die verbleibenden GFAP+ Zellfortsätze zeichneten sich häufig durch
eine ausgeprägte Umfangszunahme aus. Der Median lag bei 11,4 Zellen/ZF. Die
Gruppen 7 und 8 wiesen in den Zentren der Läsionen einen mittel- bis hochgradigen
Verlust von Astrozyten auf (s. Abbildung 10B). Hingegen zeichnete sich in der
Peripherie eine wallartige Demarkierung der Entmarkungsherde mit einer relativ
erhöhten Anzahl von Astrozyten ab. Der Median lag bei 9,15 bzw. 8,91 Zellen/ZF.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den
Gruppen (p = 0,010). Beim paarweisen Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney
Ergebnisse
69
U-Test fiel eine signifikante Erhöhung der Anzahl GFAP+ Zellen in den
Gruppen 2 und 5 im Vergleich zur Kontrolle (Gruppe 1; p < 0,05) auf.
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 4).
Abbildung 8: Statistik der quantitativen Auswertung der GFAP-Immunhistologie
4.2.3
Aquaporin-4 (AQP-4)
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen AQP-4 aus der Ratte zeigte im Neuropil
der weißen Substanz ein diffuses, feinfibrilläres, teils granuläres, hell- bis
mittelbraunes Signal gegen einen mäßig-ausgeprägten Reaktionshintergrund. Die
Fußfortsätze der Astrozyten um die Kapillaren und größeren Gefäße stellten sich in
einem kontinuierlichen, kräftigen Braunton dar und markierten damit deutlich den
astrozytären Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Das perivaskuläre Signal in
der Granularzell-, Purkinjezell- und Molekularschicht war vergleichbar, wohingegen
im angrenzenden Neuropil eine Reduktion und Abschwächung eines vornehmlich
granulären Präzipitats beobachtet wurde. Das Neuropil und Strukturen der BHS der
Kerngebiete in Klein- und Stammhirn wiesen keine oder nur eine geringgradige und
70
Ergebnisse
unregelmäßige Anfärbbarkeit für AQP-4 auf. Subependymal konnte ein kräftiges und
subpial ein mäßig braunes Signal beobachtet werden.
Die Kontrollareale der Gruppe 1 und die Gruppen 2 und 3 der Staupevirus-infizierten
Tiere zeigten eine vergleichbare Signalgebung und -struktur. Die morphometrischermittelte Dichte lag im Median bei 45,5, 42,9 und 35,9%.
Läsionen aus den frühen Phasen der Gruppen 4 und 5 wiesen eine deutlich
verminderte AQP-4-Expression auf (Median: 25,3 bzw. 23,7%). Dieses Phänomen
erklärte sich als Folge der Vakuolisierung sowie einer allgemeinen Reduktion der
Dichte
im
Neuropil,
während
Strukturen
der
BHS
unverändert
blieben
(s. Abbildung 10A’).
Demyelinisierende Herdveränderungen der Gruppe 6 und insbesondere der Gruppen
7 und 8 zeigten eine deutliche Reduktion der morphometrischen Dichte (12,6, 9,8
und 6,2%). Diese erklärte sich aus einem mittel- bis hochgradigen Verlust der AQP4-Anfärbbarkeit im Neuropil sowie einem teilweise bis totalen Verlust in den
perivaskulär-orientierten astrozytären Fußfortsätzen (s. Abbildung 10B’). Die AQP-4
Expression
verlagerte
sich
Richtung
Astrozyten-
und
Gemistozytensomata
(s. Abbildung 10C’) und stellte sich hier charakteristischerweise als dunkelbraunes,
granuläres Membran-assoziiertes sowie als zartes hellbraunes, zytoplasmatisches,
feingranuläres Signal dar.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied zwischen den
Gruppen (p < 0,001). Beim paarweisen Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney
U-Test fiel eine signifikante Reduktion der AQP-4-Expression in den Gruppen 4 bis 8
im jeweiligen Einzelvergleich zu den Gruppen 1 bis 3 auf (p < 0,05). Die
AQP-4-Dichte in den Gruppen 6 bis 8 der Entmarkungsphasen war im Vergleich zu
den prädemyelinisierenden Phasen 4 und 5, mit Ausnahme des Vergleichs von
Gruppe 5 mit Gruppe 7 (p = 0,002), hochsignifikant reduziert (p < 0,001).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 4).
Ergebnisse
Abbildung 9: Statistik der morphometrischen Auswertung der AQP-4-Immunhistologie
71
72
Ergebnisse
Abbildung 10: Astrozyten und astrozytäre Fußfortsätze in frühen und späten Staupeläsionen
A-C: linke Seite GFAP-Immunhistologie (DAB); A’-C’: rechte Seite AQP-4-Immunhistologie (DAB);
A, A’: paraventrikulärer akuter Herd mit Astrogliose (A) und gleichzeitig reduzierter AQP-4 Dichte in
den astrozytären Fußfortsätzen (A’, Folgeschnitt zu A), Tier 14, Balken = 200 μm; B, B’: chronischdemyelinisierender Herd mit reduzierter Anzahl GFAP+ Astrozyten (B) und Verlust AQP-4+ Strukturen
(B’, Folgeschnitt zu B), Tier 30, Balken = 200 μm; C, C’: subakut demyelinisierender Herd ohne
perivaskuläre Entzündung mit GFAP+ geschwollenen Astrozyten und Gemistozyten (C, Pfeile) und
AQP-4+ Astrozytensomata (C’, Pfeile), Tier 24, Balken = 50 μm; Sternchen = Läsionszentrum.
Ergebnisse
4.2.4
73
Albumin
Der polyklonale Schaf-Antikörper ist gegen humanes Serumalbumin gerichtet. Als
Positivkontrolle zum Nachweis von Albumin in kaninen Geweben gelang im
Zytoplasma von Hepatozyten, im Tubulussystem einer Niere mit Filtrationsstörung
(Glomerulonephritis) sowie in den Lumina gestauter Gefäße diverser Organe. Das
Signal stellte sich im Falle der Hepatozyten als grobscholliges, dunkelbraunes,
intrazytoplasmatisches sowie im Zusammenhang mit einer luminalen Deposition als
homogenes, extrazelluläres, dunkelbraunes Präzipitat dar. Der Reaktionshintergrund
bei den Staupevirus-infizierten Hunden im ZNS war ausgeprägt und umfasste das
Zytoplasma glialer Zellen, Gemistozyten, Gitterzellen sowie von Neuronen der
Kerngebiete und des Stratum ganglionare.
Bei der Kontrollgruppe sowie den Gruppen 2 bis 6 der Staupevirus-infizierten Tiere
fand sich ein eindeutig positives Signal für Albumin ausschließlich, in Abhängigkeit
vom Grad der Blutsstauung, in den Lumina leptomeningealer und parenchymatöser
Gefäße. Eine Ausnahme zeigte sich in einem vakuolisierten Herd (Gruppe 4;
Tier Nr. 26) in Form eines Albumin-Nachweises im Virchow-Robin-Raum
(s. Abbildung 11A). In den Gruppen 7 und 8 der demyelinisierenden Phasen wurde
bei 4 Tieren (Tier-Nr. 12, 28, 30 und 32) eine Albumin-Durchlässigkeit festgestellt.
Hier
ließen
sich
positive
Signale
im
gefäßnahen
Neuroparenchym
Gefäß-assoziierten Gitterzellen beobachten (s. Abbildung 11B).
oder
74
Ergebnisse
Abbildung 11: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere, Gefäße mit Permeabilitätsstörung
A, B: Albumin-Immunhistologie (DAB); A: Herd mit Vakuolisierung: Akkumulation von Albumin im
Virchow-Robin-Raum, Tier 26, Balken = 50 μm; B: subakuter Herd mit perivaskulärer Entzündung:
Ansammlung Albumin in perivaskulären Gitterzellen (Pfeilspitzen), Tier 28, Balken = 50 μm;
Sternchen = Gefäß.
4.3
Immunhistologische Phänotypisierung der Entzündung
4.3.1
CD3+ T-Zellen
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper ist gegen das ε-Epitop des T-Zell-Rezeptorassoziierten humanen CD3-Moleküls gerichtet. CD3+ kanine Lymphozyten in den
lymphatischen Kontrollgeweben (Lymphknoten, Milz, Thymus) und im ZNS zeigten
dabei ein überwiegend Zellmembran-assoziiertes und zytoplasmatisches mittel- bis
dunkelbraunes, feingranuläres Signal gegen einen schwach-reaktiven Hintergrund.
In einzelnen Fällen zeigten die Somata der Purkinje-Zellen und Neuronen in den
Kerngebieten ein schwach-braunes, diffuses, feingranuläres Signal.
Im Kleinhirn und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) fanden sich vereinzelte
CD3+ T-Lymphozyten im Neuroparenchym und im perivaskulären Raum der grauen
und weißen Substanz sowie in den Meningen (Median 0,5 Zellen/ZF).
Bei den Staupevirus-infizierten Tieren zeigte sich in der NAWM (Gruppe 2) eine
vergleichbare
Verteilung
von
CD3+ T-Lymphozyten
wie
in
den
Kontrollen
(Median 1,2 Zellen/ZF). Läsionen aus den Gruppen 3 bis 6 wiesen eine kontinuierlich
Ergebnisse
75
ansteigende Infiltration mit CD3+ Zellen im Neuroparenchym auf (Median 2,3, 2,6, 3,7
bzw. 5,6 Zellen/ZF). Vereinzelte T-Lymphozyten wurden dabei im perivaskulären
Raum beobachtet (s. Abbildung 14A). Diese waren jedoch nicht wie in den Gruppen
7 und 8 in einer kontinuierlichen, perivaskulären Entzündungszellinfiltration
angeordnet. In den beiden letztgenannten der wurde neben einer hochgradigen
intraparenchymatösen (Median: 23,3 und 27,7 Zellen/ZF) eine perivaskuläre
Infiltration mit CD3+ T-Lymphozyten beobachtet (Median: 42,8 bzw. 41,9%;
s. Abbildung 14B).
Bei den infizierten Tieren wurden in Nachbarschaft zu den Läsionen sowie in der
grauen Substanz und den Meningen vereinzelte CD3+ Zellen nachgewiesen.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen Zellinfiltrate zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001), für
die perivaskulären Infiltrate jedoch keinen (p = 0,821). Mit Ausnahme der Gruppe 4
(p = 0,069) fiel beim paarweisen Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test eine
signifikante Zunahme von CD3+ T-Lymphozyten aller Gruppen der Staupevirusinfizierten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe auf (p < 0,05). Die Anzahl von
T-Zellen in den Läsionen der Gruppen 7 und 8 waren in jedem Falle zu den übrigen
Gruppen hochsignifikant erhöht (p < 0,001).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 5).
76
Ergebnisse
Abbildung 12: Statistik der quantitativen Auswertung der CD3-Immunhistologie
4.3.2
Foxp3+ regulatorische T-Zellen
Der monoklonale Ratten-anti-Maus Antikörper ist gegen den für regulatorische
T-Zellen
spezifischen
Transkriptionsfaktor
Foxp3
gerichtet.
Er
markierte
ausschließlich rund bis rundovale Zellkerne lymphozytärer Zellen in den kaninen
lymphatischen Kontrollgeweben (Lymphknoten, Milz, Thymus) sowie innerhalb der
ZNS-Läsionen. Das Signal stellte sich in einem fein- bis dunkelbraunen, granulären
Struktur gegen einen sehr schwachen Reaktionshintergrund dar.
Ergebnisse
77
In den Kontrollarealen der Gruppe 1 wurden keine Foxp3+ T-Lymphozyten
aufgefunden (Median 0,0 Zellen/ZF). Im unveränderten Neuroparenchym der weißen
Substanz infizierter Tiere (Gruppe 2) sowie in den frühen, prädemyelinisierenden
Läsionen (Gruppen 3 bis 5) gelang lediglich der Nachweis vereinzelter Foxp3+ Zellen
(Median: 0,05, 0,06, 0,01 und 0,06 Zellen/ZF; s. Abbildung 14C).
Eine geringgradige Zunahme Foxp3+ regulatorischer T-Zellen wurde in der frühen
Entmarkungsphase festgestellt (Gruppe 6; Median 0,3 Zellen/ZF). Hier lagen die
Zellen überwiegend einzeln und regelmäßig in den Läsionen. Die Gruppen 7 und 8
der
späten
Entmarkungsphase
+
intraläsionaler Foxp3
hingegen
wiesen
einen
deutlichen
Anstieg
Zellen auf (Median 2,7 bzw. 4,4 Zellen/ZF). Teilweise
vereinzelt auftretend wurden sie auch häufig innerhalb zellreicher Areale, welche
vorwiegend durch infiltrierende CD3+ T-Lymphozyten dominiert wurden, in kleinen
Zellgruppen aufgefunden. Der Anteil Foxp3+ Zellen an den perivaskulären Infiltraten
lag im Median bei 2,8 bzw. 3,6% (s. Abbildung 14D).
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen Zellinfiltrate zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001). Ein
Unterschied für die perivaskulären Infiltrate (p = 0,462) bestand nicht. Im paarweisen
Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test erwiesen sich die Infiltrate Foxp3+
regulatorischer T-Zellen in den Läsionen der Entmarkungsphasen (Gruppen 6 bis 8)
als signifikant erhöht im Vergleich zu den Gruppen 1 bis 5 (p < 0,05). Innerhalb
dieser bestand nochmals eine sehr signifikante Zunahme im Vergleich von Gruppe 6
mit Gruppe 7 (p = 0,001) und eine hochsignifikante Zunahme im Vergleich von
Gruppe 6 mit Gruppe 8 (p < 0,001).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 5).
78
Abbildung 13: Statistik der quantitativen Auswertung der Foxp3-Immunhistologie
Ergebnisse
Ergebnisse
79
Abbildung 14: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere, T-Zellen und regulatorische T-Zellen in frühen
und späten Phasen der Staupeenzephalitis
A, B: CD3-Immunhistologie (DAB); A: akute Läsion mit Infiltration von vereinzelten CD3+ T-Zellen in
das Neuroparenchym, Tier 26, Balken = 100 μm; B: perivaskuläre und intraparenchymatöse
Infiltration von CD3+ T-Zellen in einem chronisch-demyelinisierenden Herd, Tier 7, Balken = 100 μm;
C, D: Foxp3-Immunhistologie (DAB); C: einzelne Foxp3+ regulatorische T-Zelle in einem
Staupevirusantigen-haltigen Areal, Tier 29, Balken = 20 μm; D: perivaskuläre und
intraparenchymatöse Infiltration Foxp3+ regulatorischer T-Zellen in einem chronischdemyelinisierenden Herd, Tier 32, Balken = 20 μm; Sternchen = Gefäß.
80
4.3.3
Der
Ergebnisse
CD79α+ B-Zellen
monoklonale
transmembranen
Maus-Antikörper
humanen
B-Zell-Rezeptorkomplexes
ist
CD79
gerichtet.
gegen
das
Heterodimers
CD79α+
kanine
α-Glycoprotein
als
Bestandteil
Lymphozyten
in
des
des
den
lymphatischen Kontrollgeweben (Lymphknoten, Milz, Thymus) und im ZNS zeigten
ein grobgranuläres, dunkelbraunes, Zellmembran-assoziiertes und eine hellbraunes,
feingranuläres, zytoplasmatisches Signal gegen einen mäßig reaktiven Hintergrund.
Zellkerne großer Neurone in den Kerngebieten sowie kleinerer Neurone in den
zerebellären Lagen der grauen Substanz wurden ebenso regelmäßig detektiert wie
die Kerne der Endothelzellen der parenchymatösen und meningealen Gefäße.
Arterielle Gefäße zeigten darüber hinaus eine kontinuierliche mittel- bis grobschollige
dunkelbraune Färbung der Tunica media.
Im Neuroparenchym und perivaskulären Raum der grauen und weißen Substanz
sowie der den Meningen des Klein- und Stammhirns der Kontrolltiere als auch in den
Läsionen der prädemyelinisierenden Phasen (Gruppen 1 bis 5) fanden sich keine
CD79α+ Lymphozyten im (Median 0,0 Zellen/ZF).
Die Herdveränderungen der Entmarkungsphasen der Staupevirus-infizierten Tiere
(Gruppen 6 bis 8) wiesen im Parenchym den Läsionen nur vereinzelte CD79α+
B-Zellen auf (Median: 0,3 2,4 und 2,4 Zellen/ZF). Der Anteil in den perivaskulären
Infiltraten der Gruppen 7 und 8 lag bei 6,2 bzw. 7,6% (s. Abbildung 16).
Der Kruskal-Wallis Test in Bezug auf die intraparenchymatösen CD79α+ B-ZellInfiltrate ergab einen hochsignifikanten Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen (p < 0,0001) während die Unterschiede für die perivaskulären B-Zellen nicht
signifikant waren (p = 0,48). Im paarweisen Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney
U-Test stellte sich die Anzahl der CD79α+ Lymphozyten der Gruppen 7 und 8
signifikant erhöht zu den Gruppen 1 bis 6 dar (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 5).
Ergebnisse
Abbildung 15: Statistik der quantitativen Auswertung der CD79α-Immunhistologie
81
82
Ergebnisse
Abbildung 16: B-Zellen im Kleinhirn eines Staupevirus-infizierten Tieres
A, B: CD79α-Immunhistologie (DAB); CD79α+ B-Zellen im Neuroparenchym (A) und in perivaskulären
Infiltraten (B) innerhalb eines chronisch-demyelinisierenden Herdes, Tier 32, Balken = 50 μm;
Sternchen = Gefäß.
4.3.4
BS-1+ Makrophagen/Mikroglia
BS-1 ist ein Lektin (Kohlenhydrat-bindendes Protein), welches spezifisch die
Glykan-Ketten α-Galactosamin und α-N-Acetylgalactosamin (α-Gal und α-GalNAc)
Zelloberflächen-assoziierter Glykoproteine bindet und kann damit unter anderem zur
Leukozyten-Differenzierung herangezogen werden. Das BS-1-Signal stellte sich als
membranöses und zytoplasmatisches mittel- bis grobscholliges und mittel- bis
dunkelbraunes Präzipitat gegen einen leicht bis mäßig reaktiven Hintergrund dar.
Dabei detektierte das Lektin Endothelien meningealer und parenchymatöser Gefäße,
monozytäre Zellen und aktivierte Mikroglia sowie eindrucksvoll das Zytoplasma von
Gitterzellen/Myelinophagen. Insgesamt zeichnete sich eine kontinuierlich steigende
Anzahl BS-1+ Zellen für die einzelnen Gruppen sowie für die periläsionale graue und
weiße Substanz ab.
Im gesunden kaninen ZNS der Kontrolltiere (Gruppe 1) zeigte BS-1 eine geringe
Affinität zu meningealen und parenchymatösen Endothelzellen, welche vergleichbar,
nur mit zunehmender Signalstärke in der Gruppe 2 (NAWM) der Staupevirusinfizierten Tiere erkennbar war (Median jeweils 0,4 Zellen/ZF). In Virusantigen-
Ergebnisse
83
positiven und vakuolisierten Arealen (Gruppen 3 und 4) stellten sich zusätzlich
mononukleäre und „kommaförmige“, aktivierter Mikroglia-ähnliche positive Zellen in
einer gleichmäßigen Verteilung dar (Median: 3,1 bzw. 7,5 Zellen/ZF). Ein deutlicher
Anstieg war in den akuten Läsionen (Gruppe 5, Median 15,0 Zellen/ZF) erkennbar.
Mit dem Einsetzen der Abräum- und Entmarkungsreaktion in den Gruppen 6 bis 8
kam es zu einem deutlichen Anstieg BS-1+ Zellen (Median: 32,5, 43,3 und
58,1 Zellen/ZF). Hier fielen besonders flächenhafte Ansammlungen aktivierter
Mikroglia/Makrophagen sowie Gitterzellen/Myelinophagen auf (s. Abbildung 19A
und 19B), welche in den Läsionszentren mit fortgeschrittener Entmarkung wiederum
numerisch reduziert waren bzw. teilweise fehlten. Die perivaskulären Infiltrate
mononukleärer Zellen (s. Abbildung 19C und 19D) stellten sich in den
Gruppen 7 und 8 im Median zu 43,8 bzw. 38,5% positiv dar.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen Zellinfiltrate zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001), für
die perivaskulären Infiltrate bestand jedoch keiner (p = 0,597). Mit Ausnahme der
Gruppen 2 und 3 zeigte der paarweise Gruppenvergleich mit Hilfe des Mann-Whitney
U-Tests eine sehr signifikante (p < 0,01) bis hochsignifikante (p < 0,001) Zunahme
BS-1+ Zellen in den übrigen Gruppen Virus-infizierter Tiere im Vergleich zu der
Kontrollgruppe auf. Innerhalb der Gruppen Staupevirus-infizierter Tiere wurden mit
Ausnahme der Gruppen 4 und 5 sowie 6 bis 8 untereinander signifikante
Unterschiede festgestellt (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 5).
84
Ergebnisse
Abbildung 17: Statistik der quantitativen Auswertung der BS-1-Lektinhistochemie
4.3.5
MAC 387+ Monozyten
Der monoklonale Maus-Antikörper detektiert das humane myeloisch/histiozytäre
Antigen, ein Kalzium-bindendes Molekül aus der S100-Familie. In den kaninen
lymphatischen Organen sowie in den Gefäßlumina sämtlicher Parenchyme zeigten
sich monozytäre Zellen mit einem mittel- bis grobscholligen, intensiv-dunkelbraunen,
zytoplasmatischen Signal gegen einen sehr reaktionsschwachen Hintergrund.
Im Neuroparenchym und perivaskulären Raum der grauen und weißen Substanz
sowie in den Meningen des Klein- und Stammhirns der Kontrolltiere als auch in den
Ergebnisse
85
Läsionen der prädemyelinisierenden Phasen (Gruppen 1 bis 5) fanden sich keine
MAC 387+ Leukozyten (Median 0,0 Zellen/ZF). Positive Signale wurden vereinzelt in
den Lumina meningealer und parenchymatöser Gefäße unterschiedlichsten Kalibers
beobachtet (s. Abbildung 19E und 19F). Für die Auswertung wurden jedoch nur die
perivaskulären Infiltrate berücksichtigt.
Die
Läsionen
der
Entmarkungsphasen
der
Staupevirus-infizierten
Tiere
(Gruppen 6 bis 8) ließen im Parenchym vereinzelte monozytäre Zellen erkennen
(Median: 0,06, 0,07 und 0,12 Zellen/ZF). Der Anteil in den perivaskulären Infiltraten
der Gruppen 7 und 8 lag bei jeweils 0,0%.
Der Kruskal-Wallis Test in Bezug auf die intraparenchymatösen Infiltrate ergab keine
signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (p ≥ 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 5).
Abbildung 18: Statistik der quantitativen Auswertung der MAC 387-Immunhistologie
86
Ergebnisse
Abbildung 19: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere, Monozyten und Makrophagen/Mikroglia
A-D: BS-1-Lektinhistochemie (DAB); A, B: subakut-demyelinisierende Staupeenzephalitis ohne
perivaskuläre Entzündung mit intraläsionalen BS-1+ Makrophagen/Mikroglia und Gitterzellen; A: Tier
27, Balken = 100 μm; B: Tier 14, Balken = 20 μm; C, D: chronisch-demyelinisierende
Staupeenzephalitis mit intraparenchymatösen und perivaskulären BS-1+ Makrophagen/Mikroglia und
Gitterzellen, Tier 30; C: Balken = 200 μm; D: Ausschnittsvergrößerung aus C, Balken = 20 μm;
E, F: MAC 387-Immunhistologie (DAB); akute (E) und chronisch-demyelinisierende (F) Läsion mit
intravaskulären MAC 387+ Monozyten; E: Tier 24, Balken = 50 μm; F: Tier 11, Balken = 50 μm.
Ergebnisse
4.3.6
87
MHC-II+ Antigen-präsentierende Zellen
Der monoklonale Maus-Antikörper ist gegen die α-Kette des HLA (human leukocyte
antigen) Klasse II DR-Antigens gerichtet (major histocompatibility complex
class II-antigen; MHC-II). Das Signal zeichnete sich als mittel- bis grobscholliges,
mittel- bis dunkelbraunes, sowohl Membran-assoziiertes und zytoplasmatisches
Präzipitat gegen einen schwachen Reaktionshintergrund ab. Endothelzellen,
Leukozyten (einschließlich intravaskulärer Leukozyten) in den kaninen lymphatischen
Kontrollgeweben
(Lymphknoten,
Milz,
Thymus)
sowie
im
ZNS
zusätzlich
Gitterzellen/Myelinophagen und aktivierte residente Gliazellen zeigten eine positive
Reaktion. Im Allgemeinen zeichnete sich, vergleichbar der BS-1-Lektinhistochemie,
ein kontinuierlicher Anstieg MHC-II+ Zellen in den Arealen/Läsionen sowie in den
perifokalen Bereichen der angrenzenden grauen und weißen Substanz ab.
Im Neuroparenchym von Klein- und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) stellten
sich multifokal in mittlerer Farbintensität Endothelien, Perizyten und in den Meningen
zusätzlich sehr vereinzelt perivaskulär-orientierte, monozytäre Zellen positiv dar
(Median: 1,4 Zellen/ZF). In der grauen Substanz fiel dabei eine geringere
MHC-II-Expression auf.
Bereits in der NAWM Staupevirus-infizierter Tiere (Gruppe 2) lag der Median bei
8,4 Zellen/ZF. Diese umfassten regelmäßig verteilte aktivierte Gliazellen, einzelne
mononukleäre Zellen sowie Endothelien und Perizyten. Mit dem Auftreten von
Virusantigen (Gruppe 3) zeichneten sich die Herde durch eine deutliche,
plaqueähnliche MHC-II-Expression der unter Gruppe 2 angeführten Zellen von der
unveränderten grauen und weißen Substanz ab. Auffällig waren weiterhin teils
positive Ausläufer der Neuroglia. Die Zahl MHC-II+ Zellen lag bei 21,6 Zellen/ZF.
Unter gleichartigen Beobachtungen nahm in den Gruppen 4 und 5 der
prädemyelinisierenden
Phasen
die
Anzahl
MHC-II+
Zellen
weiter
zu
(Median: 31,7 bzw. 47,5 Zellen/ZF; s. Abbildung 21A).
Mit dem Einsetzen der Demyelinisierung in Gruppe 6 kam es zu einer hochgradigen
Aufregulierung der intraläsionalen MHC-II-Expression (Median: 74,8 Zellen/ZF). Die
88
Ergebnisse
erhöhte Anzahl aktivierter Mikroglia/Makrophagen, Gitterzellen/Myelinophagen sowie
Lymphozyten
waren
für
dieses
Phänomen
mitverantwortlich.
Die
Anzahl
+
MHC-II Zellen steigerte sich nochmals mit Beginn der perivaskulären Infiltration in
den Gruppen 7 und 8 (Median: 90,3 bzw. 126.6 Zellen/ZF). Die perivaskulären
Zellinfiltrate waren zu 100% positiv (s. Abbildung 21B).
Alle Virus-infizierten Tiere zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe eine gering- bis
mittelgradig erhöhte MHC-II-Aufregulation in der zerebellären grauen Substanz, den
Kerngebieten sowie den Meningen.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen MHC-II-Expression in den einzelnen Gruppen (p < 0,001). Für
die perivaskulären Infiltrate bestand kein Unterschied (p = 1,000). Mit Ausnahme der
Gruppen 4 und 5 bzw. der Gruppen 6 bis 8 untereinander konnte beim paarweisen
Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test jeweils ein signifikanter Unterschied
bezüglich der MHC-II-Expression zwischen den Gruppen ermittelt werden (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 5).
Abbildung 20: Statistik der quantitativen Auswertung der MHC-II-Immunhistologie
Ergebnisse
89
Abbildung 21: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere, MHC-II Aufregulierung
A, B: MHC-II-Immunhistologie (DAB); A: MHC-II-Expression in einer akuten Läsion, Tier 16,
Balken = 200 μm; B: hochgradige intraparenchymatöse und perivaskuläre MHC-II-Expression in
einem chronisch-demyelinisierenden Herd, Tier 6, Balken = 200 μm.
4.4
Immunhistologische Untersuchungen zur Apoptose
4.4.1
Aktivierte Caspase-3
Der polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen ist gegen das große Fragment
(17/19 kDA) der aktivierten Caspase-3 gerichtet. Andere Caspasen oder das inaktive
Zymogen der Caspase-3 werden nicht erkannt. Zellen mit erhöhter endogener,
aktivierter Caspase-3 zeigten in den kaninen Kontrollgeweben (Lymphknoten, Milz,
Thymus)
ein
deutliches,
mittel-
bis
dunkelbraunes,
grobscholliges,
zytoplasmatisches, teils nukleäres Präzipitat in leukozytären Zellen. In Abhängigkeit
vom Apoptose-Stadium stellten sich, im Vergleich zu den überwiegend positiven
Kernstrukturen in der TUNEL-Reaktion, aktivierte Caspase-3+ Zellen in ihrer
Morphologie sehr unterschiedlich dar. So wurden einerseits geschwollene oder
morphologisch unauffällige Zellen mit intensiver nukleärer und zytoplasmatischer
Reaktion sowie andererseits pyknotische Zellen oder fragmentierte Zellstrukturen
(apoptotic bodies) beobachtet.
Im ZNS stellten sich aktivierte Caspase-3+ Zellen überwiegend mit pyknotischer
Morphologie dar, teilweise waren sie aber auch phänotypisch näher einzuordnen.
90
Ergebnisse
So konnten beispielsweise aufgrund zytoplasmatischer Ausläufer gliale Zellen
identifiziert werden. Außerdem fanden sich charakteristischerweise aktivierte
Caspase-3+ leukozytäre Zellen in den perivaskulären Infiltraten sowie positive Zellen
der Gefäßstrukturen (Endothelzellen und Perizyten). Teilweise wurden auch
schwache
zytoplasmatische
Signale
in
Gemistozyten
und
Gitterzellen/Myelinophagen beobachtet (s. Abbildung 24B). Bei einigen Tieren
stellten sich die Nuklei einzelner Gliazellen sowie Neurone in den Kerngebieten mit
einem schwach-granulären Präzipitat positiv dar, jedoch ohne morphologische
Anzeichen der Apoptose. Diese Zellen wurden nicht bei der Auswertung
berücksichtigt. Der Reaktionshintergrund war insgesamt schwach bis mittelgradig
ausgeprägt.
Im Kleinhirn und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) fanden sich sehr vereinzelt
aktivierte Caspase-3+ Zellen im Neuroparenchym der grauen und weißen Substanz,
in den Meningen und intravaskulär. Der Median betrug 0,2 Zellen/ZF. Einige infizierte
Tiere wiesen in der NAWM positive Zellen auf, der Median für die Gruppe 2 lag hier
allerdings noch bei 0,0 Zellen/ZF. Ein leichter Anstieg (Median 0,7 bzw.
1,0 Zellen/ZF) wurde in der Gruppe 3 Virusantigen-haltiger Areale und in
vakuolisierten Herden der Gruppe 4 beobachtet. Hier zeigten sich erstmals neben
intraparenchymatösen auch im perivaskulären Raum liegende, aktivierte Caspase-3+
Zellen mit Leukozyten-Morphologie sowie positive Endothelien und/oder Perizyten
(s. Abbildung 24A). In akuten Läsionen der Gruppe 5 kam es bei vergleichbaren
Beobachtungen zu einem weiteren Anstieg (Median 2,3 Zellen/ZF). In der frühen
Entmarkungsphase
(Gruppe 6) lag der Median bei 2,2 Zellen/ZF. Eine deutliche Zunahme aktivierter
Caspase-3+ Zellen war schließlich in den Gruppen 7 und 8 zu verzeichnen. Hier lag
der
Median
bei
3,4
bzw.
6,2
Zellen/ZF
für
das
Neuroparenchym
und
bei 8,2 bzw. 8,3% für die perivaskulären Infiltrate (s. Abbildung 24C).
Alle infizierten Tiere wiesen aktivierte Caspase-3+ Zellen in den periläsionalen
Regionen sowie in der übrigen grauen und weißen Substanz, den Meningen und
auch intravaskulär auf.
Ergebnisse
91
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied für die Anzahl
aktivierter Caspase-3+ Zellen zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001), jedoch
nicht für den Anteil perivaskulärer Infiltrate (p = 0,940). Im paarweisen
Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test bestand eine signifikante Erhöhung
aktivierter Caspase-3+ Zellen der Gruppen 3 bis 8 im Vergleich zur Kontrollgruppe
(p < 0,05). Innerhalb der Gruppen Staupevirus-infizierter Hunde wurde eine
signifikante Zunahme zwischen den Gruppen 1 bis 4 im Vergleich zu den
Gruppen 6 bis 8 beobachtet (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Abbildung 22: Statistik der quantitativen Auswertung der Caspase-3-Immunhistologie
92
Ergebnisse
4.4.2
TUNEL-Methode
Die TUNEL-Methode dient als semiquantitativer Nachweis erhöhter Gehalte an
DNS-Fragmenten
Kontrollgeweben
+
TUNEL
Zellen
pyknotischen
in
apoptotischen
(Lymphknoten,
durch
oder
ein
Zellen.
Milz,
In
den
kaninen
Thymus)
und
im
tief-dunkelbraunes,
fragmentierten
Zellkerne
ZNS
grobscholliges
dar.
Außerdem
lymphatischen
stellten
sich
Präzipitat
der
zeigten,
in
unterschiedlichem Ausmaße und in Abhängigkeit vom untersuchten Individuum,
Zellkerne normaler, nicht-apoptotischer Zellen eine gering- bis mittelgradige,
unspezifische Reaktion, allerdings ohne die morphologischen Charakteristika der
Apoptose. Diese wurden bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
Sowohl im Neuroparenchym als auch in den perivaskulären Infiltraten und
Gefäßwandstrukturen (Endothelzellen und Perizyten) konnten TUNEL+ Kernstrukturen beobachtet werden.
Im Kleinhirn und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) fanden sich vereinzelt
TUNEL+ Kernstrukturen im Neuroparenchym der grauen und weißen Substanz, in
den Meningen und teilweise intravaskulär. (Median 0,09 Zellen/ZF). In der NAWM
Staupevirus-infizierter Tiere (Gruppe 2) sowie in Virusantigen-haltigen Arealen der
Gruppe 3 wurden ebenfalls nur wenige TUNEL+ Nuklei (Median 0,02 bzw. 0,37
Zellen/ZF) beobachtet (s. Abbildung 24A’). Die prädemyelinisierenden, vakuolisierten
und akuten Stadien (Gruppen 4 und 5) zeigten im Median 0,92 bzw. 1,22 positive
Zellen/ZF. Diese waren im Neuroparenchym, perivaskulären Raum und zum Teil in
der Gefäßwand selbst lokalisiert. Letztere wurden nicht in der quantitativen
Auswertung
berücksichtigt.
Die
Stadien
der
Entmarkungsenzephalitis
(Gruppen 6 bis 8) wiesen eine stetig zunehmende Zahl TUNEL+ Zellen auf (Median:
1,79, 1,92 und 3,63 Zellen/ZF). Der Anteil TUNEL+ perivaskulär-orientierter Zellen in
den Gruppen 7 und 8 lag im Median bei 2,8 bzw. 4,1% (s. Abbildung 24B’ und 24C’).
Für alle Gruppen der Staupevirus-infizierten Tiere fielen ebenso in den periläsionalen
Bereichen sowie in der grauen Substanz, den Meningen und intravaskulär
vereinzelte TUNEL+ Kernstrukturen auf.
Ergebnisse
93
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen TUNEL+ Zellen zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001).
Die perivaskulären Infiltrate zeigten keinen Unterschied (p = 0,259). Die
Gruppen 5 bis 8 zeigten im paarweisen Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney
U-Test
eine
signifikante
Zunahme
von
TUNEL+ Zellen
im
Vergleich
zur
Kontrollgruppe (p < 0,05). Mit Ausnahme des Vergleichs von Gruppe 4 mit Gruppe 8
(p = 0,014) ergab der Vergleich der Gruppen 4 bis 8 untereinander keine
signifikanten Unterschiede (p ≥ 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Abbildung 23: Statistik der quantitativen Auswertung der TUNEL-Methode
94
Ergebnisse
Abbildung 24: Apoptose in Klein- und Stammhirn Staupevirus-infizierter Tiere
A-C: linke Seite aktivierte Caspase-3-Immunhistologie (DAB); A’-C’: rechte Seite TUNEL-Reaktion
(DAB); A: aktivierte Caspase-3+ Endothelien/Perizyten und perivaskuläre Zellen in einem
vakuolisierten Herd, Tier 22, Balken = 20 μm; A’: TUNEL+ Zelle in Nachbarschaft zu einer Kapillare in
einem Staupevirusantigen-haltigen Areal, Tier 29, Balken = 10 μm; B, B’: aktivierte Caspase-3+ (B)
und TUNEL+ Zellen (B’) in subakut-demyelinisierenden Läsionen ohne perivaskuläre Entzündung; B:
Tier 20, Balken = 50 μm; B’: Tier 25, Balken = 50 μm; C, C’: aktivierte Caspase-3+ (C) und TUNEL+
Zellen (C’) in perivaskulären Infiltraten chronisch-demyelinisierender Läsionen; C: Tier 6, Balken = 50
μm; C’: Tier 32, Balken = 50 μm; Sternchen = Gefäß.
Ergebnisse
4.4.3
95
Fas-Rezeptor
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper ist gegen ein dem C-Terminus naheliegendes
Epitop des murinen Oberflächenrezeptors Fas gerichtet. In der immunhistologischen
Reaktion konnte in den kaninen lymphatischen Kontrollgeweben (Lymphknoten, Milz,
Thymus) und im ZNS ein überwiegend Zellmembran-assoziiertes als auch
zytoplasmatisches, tief dunkelbraunes, feingranuläres bis diffuses Signal gegen
einen mäßig-reaktiven Hintergrund beobachtet werden. Fas+ Zellen waren
phänotypisch
überwiegend
einer
rundzelligen,
leukozytären
Zellpopulation
zuzuordnen. Hinweise auf eine gleichzeitig bestehende apoptotische Morphologie,
wie z. B. Kernpyknosen oder apoptotische Kernkörperchen, fanden sich nicht.
Im Kleinhirn und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) fanden sich mit nur wenigen
Ausnahmen keine Fas+ Zellen im Neuroparenchym und im perivaskulären Raum der
grauen und weißen Substanz sowie in den Meningen (Median 0,0 Zellen/ZF).
Staupevirus-infizierte Tieren wiesen in der NAWM, den Staupevirusantigen-haltigen
und den vakuolisierten Arealen (Gruppen 2 bis 4) nur vereinzelte Fas+ Zellen auf
(Median jeweils 0,0 Zellen/ZF). In den akuten Läsionen wurde eine geringgradig
erhöhte Anzahl festgestellt (Median 0,5 Zellen/ZF). Dabei waren sie innerhalb des
Neuroparenchyms mehrheitlich im perivaskulären Raum oder unmittelbarer Nähe
kleinerer Gefäße und Kapillaren gelegen (s. Abbildung 27C).
In der ersten Phase der Entmarkungsenzephalitis (Gruppe 6) stieg die Anzahl
intraparenchymatöser Fas+ Zellen deutlich an (2,72 Zellen/ZF). Diese erhöhte sich in
den von einer perivaskulären Entzündung begleiteten Phasen (Gruppen 7 und 8)
nochmals auf 4,65 bzw. 4,11 Zellen/ZF. Der Anteil der perivaskulären positiven
Zellen lag in den letztgenannten Gruppen bei 8,96 und 8,23% (s. Abbildung 27D).
Extraläsional wurden vor allem in den Meningen in Abhängigkeit von der
entzündlichen Infiltration teils zahlreiche Fas+ Zellen beobachtet.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen Zellinfiltrate zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001), für
96
die
Ergebnisse
perivaskulären
Gruppenvergleich
Infiltrate
mittels
jedoch
keinen
Mann-Whitney
(p
U-Test
=
0,674).
zeigte
Der
einen
paarweise
signifikanten
Unterschied in der Zunahme von Fas+ Zellen zwischen den Gruppen 1 bis 5
(Kontrolle und nicht-demyelinisierende Infektionsphasen) im jeweiligen Vergleich zu
den Gruppen 6 bis 8 (demyelinisierende Phasen; p < 0,05). Zwischen den
perivaskulären Infiltraten der Gruppen 7 und 8 wurde kein signifikanter Unterschied
beobachtet.
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Abbildung 25: Statistik der quantitativen Auswertung der Fas-Immunhistologie
Ergebnisse
4.4.4
97
Bax Protein
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper ist gegen ein dem N-Terminus naheliegendes
Epitop des murinen Bax-Proteins (Bcl-2-associated X protein) gerichtet. Eine positive
immunhistologische Reaktion in den kaninen lymphatischen Kontrollgeweben
(Lymphknoten, Milz, Thymus) stellte sich durch ein fein- bis mittelgrobes,
dunkelbraunes,
zytoplasmatisches
Präzipitat
in
den
Leukozyten,
teils
mit
einhergehender apoptotischer Zellmorphologie, dar. Im ZNS aller untersuchten Tiere
färbten sich regelmäßig intensiv-dunkelbraun die Somata der Neuronen in den
Kerngebieten sowie in Stratum ganglionare an. Weiterhin konnte ebenso regelmäßig
ein feingranuläres, perinukleäres, mittel- bis dunkelbraunes Bax+ Präzipitat in
astrozytären Zellen festgestellt werden. Der Reaktionshintergrund war insgesamt
mäßig bis stark ausgeprägt.
Im Kleinhirn und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) sowie in den
prädemyelinisierenden Phasen der Gruppen 2 bis 4 der Staupevirus-infizierten Tiere
fanden sich nur vereinzelt Bax+ Zellen (Median 0,025, 0,0, 0,0, bzw. 0,08 Zellen/ZF).
Ein erster Anstieg wurde in den akuten Herdveränderungen (Gruppe 5) festgestellt
(Median 0,6 Zellen/ZF).
Mit Einsetzen der Entmarkungsenzephalitis wurde in den Gruppen 6 bis 8 fortan eine
vergleichbar hohe Anzahl Bax+ Zellen im Neuroparenchym aufgefunden (Median
3,13, 5,35 und 4,55 Zellen/ZF; s. Abbildung 27A). Ihr Anteil in den perivaskulären
Infiltraten der subakut- bis chronisch-entzündlichen Läsionen war sehr gering
(Median 0,0 und 0,86%; s. Abbildung 27B). In den angrenzenden Bereichen des
Neuroparenchyms waren keine Bax+ Zellen detektierbar.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen Zellinfiltrate zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001), für
die
perivaskulären
Gruppenvergleich
Infiltrate
mittels
jedoch
keinen
Mann-Whitney
(p
U-Test
=
0,435).
ergab
Der
einen
paarweise
signifikanten
Unterschied in der Zunahme Bax+ Zellen im jeweiligen Vergleich der Gruppen 1 bis 5
98
Ergebnisse
(Kontrolle und nicht-demyelinisierende Infektionsphasen) zu den Gruppen 6 bis 8
(demyelinisierende Phasen; p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Abbildung 26: Statistik der quantitativen Auswertung der Bax-Immunhistologie
Ergebnisse
99
Abbildung 27: Kleinhirn und Stammhirn Staupevirus-infizierter Tiere, Expression pro-apoptotischer
Proteine des extrinsischen und intrinsischen Signalweges
A, B: Bax-Immunhistologie (DAB); A: Bax+ Zelle mit glialer und pyknotischer Zellmorphologie, Tier 31,
Balken = 50 μm; B: Bax+ mononukleäre Zellen im perivaskulären Raum innerhalb eines chronischdemyelinisierenden Herdes, Tier 28, Balken = 50 μm; C, D: Fas-Immunhistologie (DAB);
C: vereinzelte intraparenchymatöse Fas+ Zellen mit mononukleärer Morphologie in einem
vakuolisierten Herd, Tier 22, Balken = 20 μm; D: Fas+ mononukleäre Zellen in perivaskulären und
parenchymatösen Infiltraten eines chronisch-demyelinisierenden Herdes, Tier 32, Balken = 100 μm;
Sternchen = Gefäß.
4.4.5
Bcl-2 Protein
Der monoklonale Maus-Antikörper ist gegen das humane Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)
Onkoprotein gerichtet. Im kaninen lymphatischen Gewebe (Lymphknoten, Milz,
Thymus) wurde in der immunhistologischen Reaktion ein intensiv-dunkelbraunes,
zytoplasmatisches, besonders perinukleäres Präzipitat in leukozytären Zellen
beobachtet.
100
Ergebnisse
Im ZNS färbte sich das Zytoplasma einzelner glialer Zellen mit großen,
euchromatinreichen Kernen (vermutlich Astrozyten) in der grauen und weißen
Substanz feingranulär und hellbraun gegen einen schwachen Reaktionshintergrund.
Das Neuroparenchym von Klein- und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) enthielt
im Median 7,13 Bcl-2+ Zellen/ZF, welche überwiegend von einer Astrozytenähnlichen
Morphologie
waren.
Vereinzelt
fanden
sich
Gefäß-assoziierte
lymphozytäre sowie gestreckte bis spindelförmige (vermutlich Endothelien/Perizyten)
Bcl-2+ Zellen und/oder Bcl-2+ Mikroglia. In der NAWM und den Staupevirusantigenhaltigen Läsionen der Staupevirus-infizierten Tiere (Gruppen 2 und 3) lag der Median
bei vergleichbaren Befunden bei 6,5 und 6,28 Zellen/ZF. Die frühen Gruppen 4 und 5
mit vakuolisierten bzw. akuten Läsionen ließen im Median 7,64 bzw. 8,83
Bcl-2+ Zellen/ZF erkennen. Teilweise lag ein im Vergleich zur umgebenden weißen
Substanz
geringgradig erhöhter diffuser Reaktionshintergrund innerhalb der
Läsionen vor.
Den höchsten Anteil mit im Median 10,75 Bcl-2+ Zellen/ZF machten Läsionen der
frühen Entmarkungsphase (Gruppe 6) aus. Hier wurden bei einigen Tieren in den
Entzündungsherden mit ausgeprägter Abräumreaktion (Tier Nr. 27 und 31) zusätzlich
hohe Zahlen Bcl-2+ Gitterzellen beobachtet (s. Abbildung 31C). Die beiden letzten
Gruppen 7 und 8 wiesen im Median 9,18 und 10,58 positive Zellen/ZF auf. Dabei
zeigten sich wie auch in Gruppe 6 in Abhängigkeit von der Gitterzellinfiltration
erhebliche
interindividuelle
Unterschiede.
Der
Anteil
Bcl-2+
Zellen
in
den
perivaskulären Infiltraten letztgenannter Gruppen lag bei 10,51% bzw. 13,51%
(s. Abbildung 31D).
Der
Kruskal-Wallis
intraparenchymatösen
Test
ergab
einen
Bcl-2-Expression
signifikanten
zwischen
den
Unterschied
einzelnen
der
Gruppen
(p = 0,028). Für die perivaskulären Infiltrate bestand kein Unterschied (p = 0,921).
Dabei zeigte ausschließlich die Gruppe 6 eine signifikante Erhöhung im Vergleich zu
den Gruppen 1 bis 3 (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Ergebnisse
101
Abbildung 28: Statistik der quantitativen Auswertung der Bcl-2-Immunhistologie
4.4.6
Survivin Protein
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper ist gegen das humane Survivin-Protein
gerichtet.
Die
Kontrollgeweben
immunhistologische
(Lymphknoten,
Milz,
Reaktion
Thymus)
in
war
kaninen
durch
lymphatischen
ein
mittel-
bis
grobgranuläres, intranukleäres, dunkelbraunes Präzipitat in den Leukozyten
gekennzeichnet. Im ZNS waren die Zellkerne großer Neurone in den Kerngebieten,
teils auch die der Purkinje-Zellen im Stratum ganglionare positiv. Im Zytoplasma
dieser Zellen ließ sich ein mehr oder weniger schwach ausgeprägtes, feingranuläres,
hellbraunes Signal beobachten. Darüber hinaus wurden vereinzelt große und runde,
102
Ergebnisse
positive Nuklei im Neuroparenchym der zerebellären grauen und weißen Substanz
aufgefunden.
Aufgrund
dieser
morphologischen
Kriterien
handelte
es
sich
wahrscheinlich um Astrozyten.
Im Kleinhirn und Stammhirn der Kontrolltiere (Gruppe 1) fanden sich vereinzelte
Survivin+ Zellkerne im Neuroparenchym der grauen und weißen Substanz (Median
0,43 Zellen/ZF).
In der NAWM Staupevirus-infizierter Tiere (Gruppe 2) konnte eine vergleichbare
Verteilung von Survivin+ Zellkernen wie in den Kontrollen gefunden werden, der
Median lag hier bei 0,3 Zellen/ZF. Staupevirusantigen-haltige Areale der Gruppe 3
wiesen einen Median von 0,61 Zellen/ZF auf. In den vakuolisierten und akuten
Herden der fortgeschrittenen, prädemyelinisierenden Phasen stieg die Anzahl
Survivin+ Zellkerne deutlich an (Median 2,13 und 2,75 Zellen/ZF).
Mit dem Einsetzen der Entmarkung zeigte sich in Gruppe 6 ein sprunghafter Anstieg
auf im Median 6,14 Zellen/ZF. Auffallend war in dieser Gruppe neben den nukleären
Signalen ein grobscholliges, dunkelbraunes, intrazytoplasmatisches Präzipitat in den
Gitterzellen bei einer großen Anzahl von Tieren (s. Abbildung 31E und 31F).
Weiterhin konnten intraläsional gelegentlich spindelförmige, Survivin+ Nuklei in
Endothelien/Perizyten beobachtet werden. Vergleichbare Befunde lagen in den
Gruppen 7 und 8 der Entmarkungsphase vor (Median 3,77 und 6,03 Zellen/ZF). In
den perivaskulären Entzündungszellinfiltraten letztgenannter Gruppen ließen sich im
Median 2,33 und 2,8 Survivin+ Zellkerne nachweisen.
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich in
Bezug auf die Anzahl intraparenchymatöser Survivin+ Zellen zwischen den einzelnen
Gruppen (p < 0,001), für die perivaskulären Infiltrate hingegen keinen (p = 0,902). Im
paarweisen Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test wurde eine signifikant
erhöhte Anzahl Survivin+ Zellen in den Gruppen 4 bis 8 im jeweiligen Vergleich zu
den Gruppen 1 bis 3 festgestellt (p < 0,05). Eine signifikante Zunahme
Survivin+ Zellen
wurde
im
jeweiligen
Vergleich
der
Gruppen
4
und
5
(prädemyelinisierende Phasen) mit den Gruppen 6 bis 8 (demyelinisierende Phasen;
Ergebnisse
103
p < 0,05), mit Ausnahme des Vergleichs zwischen Gruppe 5 und 7 (p = 0,095),
festgestellt. Die Gruppen 6 bis 8 der demyelinisierenden Phasen wiesen
untereinander keine signifikanten Unterschiede auf.
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Abbildung 29: Statistik der quantitativen Auswertung der Survivin-Immunhistologie
104
Ergebnisse
4.4.7
cIAP-2 Protein
Der polyklonale Ziegen-Antikörper ist gegen ein rekombinantes humanes cIAP-2
(cellular
inhibitor
of
apoptosis
protein-2)
Protein
gerichtet.
Die
positive
immunhistologische Reaktion in den kaninen lymphatischen Kontrollgeweben
(Lymphknoten, Milz, Thymus) war durch ein zytoplasmatisches, dunkelbraunes, feinbis mittelgranuläres Präzipitat in den Leukozyten gegen einen mäßig reaktiven
Hintergrund charakterisiert.
Im ZNS der Kontrolltiere (Gruppe 1) wurden keine cIAP-2+ Zellen aufgefunden, der
Median lag bei 0,0 Zellen/ZF.
In den Gruppen 2 bis 6 der Staupevirus-infizierten Tiere ließen sich innerhalb der
Läsionen nur ganz vereinzelt cIAP-2+ Zellen darstellen, wobei diese häufig in
Nachbarschaft zu kleineren Gefäßen und Kapillaren lagen (s. Abbildung 31A). Der
Median lag in jedem Falle bei 0,0 Zellen/ZF. In den beiden letzten Phasen der
Entmarkungsenzephalitis (Gruppen 7 und 8) kam es zu einem deutlichen Anstieg
cIAP-2+ Zellen im Neuroparenchym (Median 2,53 bzw. 3,1 Zellen/ZF). In den
perivaskulären Infiltraten lag ihr Anteil bei 6,91 bzw. 8,31% (s. Abbildung 31B).
Der Kruskal-Wallis Test ergab einen hochsignifikanten Unterschied bezüglich der
intraparenchymatösen Zellinfiltrate zwischen den einzelnen Gruppen (p < 0,001), für
die
perivaskulären
Infiltrate
jedoch
keinen
(p
=
0,721).
Der
paarweise
Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test zeigte signifikant erhöhte Zunahmen
cIAP-2+ Zellen in den Gruppen 7 und 8 im jeweiligen Vergleich zu den
Gruppen 1 bis 6 (p < 0,05).
Eine Auflistung der p-Werte findet sich im Anhang (Tabelle 6).
Ergebnisse
Abbildung 30: Statistik der quantitativen Auswertung der cIAP-2-Immunhistologie
105
106
Ergebnisse
Abbildung 31: Kleinhirn und Stammhirn Staupevirus-infizierter Tiere, Expression von Proteinen
anti-apoptotischer Signalwege
A, B: cIAP-2-Immunhistologie (DAB); A: cIAP-2+ Zelle mit mononukleärer Morphologie in einem
Staupevirusantigen-haltigen Areal, Tier 29, Balken = 50 μm; B: cIAP-2+ mononukleäre Zellen in
perivaskulären und parenchymatösen Infiltraten eines chronisch-demyelinisierenden Herdes, Tier 32,
Balken = 50 μm; C, D: Bcl-2-Immunhistologie (DAB); C: Bcl-2+ Zellen mit lymphozytärer Morphologie
(Pfeile) und Bcl-2+ Gitterzelle (Pfeilspitze) in einem subakut-demyelinisierenden Herd, Tier 31,
Balken = 20 μm; D: zahlreiche Bcl-2+ lymphozytäre Zellen im perivaskulären Infiltrat eines chronischdemyelinisierenden Herdes, Tier 32, Balken = 50 μm; E, F: Survivin-Immunhistologie (DAB); Survivin+
Zellkerne (Pfeile) und Survivin+ Gitterzellen (Pfeilspitzen) in subakut-demyelinisierenden Herden,
E: Tier 24, Balken = 20 μm; F: Tier 27, Balken = 20 μm; Sternchen = Gefäß.
Ergebnisse
4.5
107
Immunfluoreszenzmikroskopische Auswertung
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen
wurde im Anschluss eine Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung zur phänotypischen
Charakterisierung apoptotischer Zellen durchgeführt. Als Maßstab für eine Zelle,
welche sich in der progressiven Phase des programmierten Zelltods befindet, galt
dabei eine positive TUNEL-Reaktion. Dafür wurden exemplarisch repräsentative
Herdläsionen der prädemyelinisierenden Infektionsphase (Tier-Nr. 17, 22, 26 und 29)
und der fortgeschrittenen Infektionsphase mit Demyelinisierung (Tier-Nr. 31 und 32)
ausgewählt. Es wurde eine qualitative Bewertung der Reaktion durchgeführt, mit
Ausnahme der CD3/TUNEL-Doppelimmunfluoreszenz. Hier wurden aufgrund einer
gehäuften Ko-Lokalisation der prozentuale Anteil TUNEL+ an den CD3+ Zellen und
umgekehrt ermittelt.
Die Kernfärbung (blaue Fluoreszenz = DAPI) von gleichzeitig TUNEL+ Zellen (grüne
Fluoreszenz = FITC) war häufig abgeschwächt, so dass in Abhängigkeit von der
DAPI-Intensität
in
der
additiven
Farbmischung
des
blauen
und
grünen
Fluoreszenzsignals ein mehr oder weniger ausgeprägtes Cyan sichtbar wurde.
Eine Darstellung der additiven Farbmischung der Primärfarben Rot, Grün und Blau
ist in Abbildung 32 gegeben.
Rot
+
Grün
=
Gelb
Grün
+
Blau
=
Cyan
Rot
+
Blau
=
Magenta
Rot + Grün + Blau
=
Weiß
Abbildung 32: additive Farbmischung
108
4.5.1
Ergebnisse
TUNEL+ Zellen und Expression aktivierter Caspase-3
Mittels Doppelmarkierung ließen sich in den frühen und in den späten Phasen der
Staupeenzephalitis TUNEL+ DNS-Fragmente und aktivierte Caspase-3 darstellen
(s. Abbildung 33). Unabhängig vom Läsionstyp wurde in den Entzündungsherden
überwiegend keine Ko-Lokalisation beobachtet. Eine Ko-Lokalisation gelang
innerhalb eines vakuolisierten Herdes (Tier 22; s. Abbildung 33B).
Aktivierte Caspase-3+ stellte sich als diffuses rotes (Cy3) zytoplasmatisches Signal
dar. Bei Überlagerung mit Anteilen von Kernstrukturen (blaue Farbe = DAPI) wurde
ein Magenta in der additiven Farbmischung beobachtet. Anzahl und Verteilung und
Zellen entsprachen dem Bild der immunhistologischen Ergebnisse.
Abbildung 33: Kleinhirn und Stammhirn Staupevirus-infizierter Tiere in der Frühphase
A, B: TUNEL- (grün = FITC) und aktivierte Caspase-3- (rot = Cy3) Doppelimmunfluoreszenz, blaue
Kernfärbung = DAPI; A: Staupevirusantigen-haltiger Herd, keine Ko-Lokalisation, Tier 29, Balken = 25
μm; B: vakuolisierter Herd mit zahlreichen Caspase-3+ Zellen mit endothelialer und mononukleärer
Morphologie im perivaskulären Raum und gefäßnahen Bereich, keine Ko-Lokalisation mit TUNEL+
Strukturen, Balken = 50 μm; Inset: Ko-Lokalisation von aktivierter Caspase-3+ und TUNEL-Reaktion,
Tier 22, Balken = 12,5 μm.
Ergebnisse
4.5.2
109
TUNEL+ Zellen und Expression des von Willebrand Faktors
Die immunfluoreszenzmikroskopische Doppelmarkierung von TUNEL+ Strukturen
und des endothelialen von Willebrand Faktors (vWF) gelang unabhängig vom
Läsionstyp in frühen und späten Phasen der Staupeenzephalitis (s. Abbildung 34).
Eine Ko-Lokalisation wurde nicht beobachtet.
Das rote Fluoreszenzsignal (Cy3) ließ sich in granulärer Form intrazytoplasmatisch
beobachten. Eine Überlagerung mit Anteilen von Kernstrukturen (blaue Fluoreszenz
= DAPI) wurde nicht detektiert.
Abbildung 34: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere in früher und später Entmarkungsphase
A, B: TUNEL- (grün = FITC) und vWF- (rot = Cy3) Doppelimmunfluoreszenz, blaue Kernfärbung =
DAPI; A: akuter Herd mit intraläsionaler TUNEL+ Zelle und vWF+ Endothelien, keine Ko-Lokalisation,
Tier 17, Balken = 25 μm; B: chronisch-demyelinisierender Herd mit zahlreichen TUNEL+ Zellen und
vWF+ Endothelien, keine Ko-Lokalisation, Tier 32, Balken = 50 μm.
110
Ergebnisse
TUNEL+ Zellen und Expression von CD3
4.5.3
In der Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung waren in exemplarisch ausgewählten
Läsionen der frühen prädemyelinisierenden Phasen keine (Tier 26) und teils bis zu
50% (Tier 29) TUNEL+ Zellen mit einem CD3-Signal ko-lokalisiert (s. Abbildung 35A).
Der Anteil TUNEL+ Zellen an den CD3+ Zellen reichte von 0% (Tier 26) bis zu 12,5%
(Tier 29). Die demyelinisierenden Läsionen ohne perivaskuläre Entzündung (Tier 31)
wiesen eine Ko-Lokalisation bei 33% der TUNEL+ Zellen und bei 8% der
CD3+
T-Zellen
auf.
Der
Anteil
ko-lokalisierter
Signale
in
den
chronisch-
+
demyelinisierenden Herden (Tier 32) lag bei 14,7% der TUNEL Zellen und bei
2% der CD3+ T-Zellen (s. Abbildung 35B).
Die
rote
Fluoreszenz
(Cy3)
für
die
CD3+
T-Zellen
ergab
analog
der
immunhistologischen Befunde ein diffuses membranöses und ein teils granuläres
zytoplasmatisches Signal. Eine direkte Überlagerung mit Anteilen von DAPI+
Zellkernen wurde nicht beobachtet.
Abbildung 35: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere in den Entmarkungsphasen
A, B: TUNEL- (grün = FITC) und CD3- (rot = Cy3) Doppelimmunfluoreszenz, blaue Kernfärbung =
DAPI; A: subakut-demyelinisierender Herd ohne perivaskuläre Entzündung: die Ko-Lokalisation von
TUNEL-Reaktion, CD3 und Kernfärbung ergibt in der additiven Farbmischung teils die Tertiärfarbe
Weiß, Tier 31, Balken = 50 μm, Inset: Ausschnittsvergrößerung aus A, Balken = 12,5 μm;
B: chronisch-demyelinisierender Herd mit perivaskulären und intraparenchymatösen CD3+ T-Zellen
und intraläsionalen TUNEL+ Zellen, offener Pfeil: Ko-Lokalisation, Tier 32, Balken = 50 μm.
Ergebnisse
4.5.4
111
TUNEL+ Zellen und Expression von GFAP
Mittels Doppelmarkierung wurden sowohl in den frühen als auch in den späten
Phasen der Staupeenzephalitis TUNEL+ Kernfragmente und GFAP+ Zellen
aufgefunden. Unabhängig vom Läsionstyp wurde in den Entzündungsherden
überwiegend keine Ko-Lokalisation beobachtet. Eine Ko-Lokalisation gelang lediglich
in einem perivaskulär-gelegenen Astrozyten innerhalb eines akuten Herdes (Tier 17;
s. Abbildung 36A).
Astrozyten und Gemistozyten stellten sich in der roten Fluoreszenz (Cy3) quantitativ
und morphologisch vergleichbar dem Bild in der Immunhistologie dar. Das Farbsignal
war diffus zytoplasmatisch und zeigte neben positiven Zellsomata eindrucksvoll das
Netzwerk astrozytärer Ausläufer (s. Abbildung 36B).
Abbildung 36: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere in früher und später Infektionsphase
A, B: TUNEL- (grün = FITC) und GFAP- (rot = Cy3) Doppelimmunfluoreszenz, blaue Kernfärbung =
DAPI; A: akuter Herd mit TUNEL+ Zelle (Pfeil, cyane Mischfarbe) und GFAP+ Astrozyten (Pfeilspitze),
keine Ko-Lokalisation, Balken = 50 μm; Inset: perivaskuläre Ko-Lokalisation von GFAP und TUNELReaktion (offener Pfeil), Tier 17, Balken = 25 μm; B: GFAP+ Astrozyten und Gemistozyt (Pfeilspitze) in
einem chronisch-demyelinisierenden Herd und TUNEL+ Zelle (Pfeil), keine Ko-Lokalisation, Tier 32,
Balken = 50 μm.
112
Ergebnisse
TUNEL+ Zellen und Expression von Nogo-A
4.5.5
In
der
+
Nogo-A
immunfluoreszenzmikroskopischen
Oligodendrozyten und TUNEL
+
Doppelmarkierung
zur
Detektion
Kernfragmente gelang die Darstellung
beider Komponenten in den frühen und späten Phasen der Staupeläsionen
(s. Abbildung 37). Unabhängig vom Läsionstyp wurde in den Entzündungsherden
überwiegend keine Ko-Lokalisation beobachtet. Eine Ko-Lokalisation gelang
innerhalb eines chronisch-demyelinisierenden Herdes (Tier 32; s. Abbildung 37B).
Nogo-A+ Zellen stellten sich mit einem roten Fluoreszenzsignal (Cy3) morphologisch
und quantitativ wie in der Immunhistologie dar. Dabei war das Farbsignal diffus
sowohl im Zytoplasma gelegen als auch in zytoplasmatischen Ausläufern.
In fortgeschrittenen Läsionen fielen teilweise geschwollene Nogo-A+ Somata auf
(s. Abbildung 37B).
Abbildung 37: Kleinhirn Staupevirus-infizierter Tiere in früher und später Infektionsphase
A, B: TUNEL- (grün = FITC) und Nogo-A- (rot = Cy3) Doppelimmunfluoreszenz, blaue Kernfärbung =
DAPI; A: akuter Herd mit TUNEL+ Zelle und Nogo-A+ Oligodendrozyten, keine Ko-Lokalisation, Balken
= 50 μm, Tier 17, Balken = 50 μm; B: geschwollene Nogo-A+ Oligodendrozyten) und TUNEL+ Zellen in
einem chronisch-demyelinisierenden, keine Ko-Lokalisation; Inset: Ko-Lokalisation Nogo-A und
TUNEL, Tier 32, Balken = 12,5 μm.
Diskussion
5
113
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels histochemischer, immunhistologischer und
immunfluoreszenzmikroskopischer
Methoden
eine
Phänotypisierung
der
Entzündungsreaktion bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes in
der weißen Substanz des Klein- und Stammhirns durchgeführt. Die Untersuchungen
umfassten Kontrollareale aus entsprechenden Regionen nicht-infizierter Hunde
sowie
Antigen-freie,
unterschiedlicher
unveränderte
Stadien
bei
weiße
CDV-infizierten
Substanz
und
Hunden.
Herdläsionen
Es
erfolgte
eine
Charakterisierung der Herdläsionen anhand des Staupevirus-Antigengehalts, der
Zellularität, des Demyelinisierungsgrades und der glialen Reaktion. In diesem
Zusammenhang wurden auch astrogliale Anteile der Blut-Hirn-Schranke und eine
mögliche
Störung
ihrer
Barrierefunktion
anhand
der
Albumin-Permeabilität
untersucht. Die Differenzierung der Entzündung umfasste T-Zellen, einschließlich
regulatorischer
T-Zellen,
B-Zellen,
Makrophagen/Mikroglia
und
die
MHC-II-
assoziierte Antigen-Präsentation.
Der zweite Schwerpunkt der Arbeit galt der Detektion unterschiedlicher Moleküle und
Signalwege der Apoptose-Kaskade sowie apoptotischen Zellen in den verschiedenen
Phasen der demyelinisierenden Staupeenzephalitis. Die nähere Differenzierung
apoptotischer Zellen erfolgte schließlich mittels Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung
an repräsentativen Herdläsionen. In diesem Zusammenhang wurden ausgewählte
Immun- und Gliazellen sowie Endothelzellen untersucht.
5.1
Pathologie der Staupeenzephalitis
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Einteilung der Herdveränderungen im Gehirn
der Staupevirus-infizierten Hunde und der Kontrolltiere mittels histochemischer und
immunhistologischer
Methoden
nach
der Klassifikation von Seehusen und
Baumgärtner (2010). Insgesamt wiesen die Beobachtungen über die histologische
Herdklassifikation,
einschließlich
der
Virusantigen-Expression,
der
beteiligten
Entzündungszellen, sowie den zeitlichen Verlauf des Myelinschadens eine
114
Diskussion
Übereinstimmung mit Untersuchungsergebnissen vorausgegangener Studien auf
(ALLDINGER et al. 1993; GRÖTERS et al. 2005; SEEHUSEN u. BAUMGÄRTNER
2010; WÜNSCHMANN et al. 1999). Dennoch war diese detaillierte Aufarbeitung der
zu untersuchenden Läsionen im Hinblick auf die vorzunehmende Interpretation der
neuen Untersuchungsergebnisse unerlässlich.
Die Herdveränderungen wurden, ausgenommen lichtmikroskopisch unveränderter,
Virusantigen-freier Areale (n = 28; Gruppe 2; NAWM), grundsätzlich einer frühen,
ohne
Myelinverlust
und
einer
fortgeschrittenen,
mit
Demyelinisierung
einhergehenden Infektionsphase zugeordnet. Die frühe Infektionsphase umfasste
Virusantigen-haltige Areale ohne lichtmikroskopisch offensichtliche Läsion (n = 28;
Gruppe 3; AOL), vakuolisierte Herde (n = 19; Gruppe 4; VAK) sowie akute,
vakuolisierte und zudem hyperzelluläre Herde (n = 22; Gruppe 5; AKUT). Der
Myelinverlust innerhalb der Läsionen der fortgeschrittenen Infektionsphasen wurde
zunächst über eine reduzierte LFB-KEV-Anfärbbarkeit ermittelt. Diese wurden
ihrerseits in ein frühes, subakutes Stadium ohne perivaskuläre Entzündung (n = 42;
Gruppe 6; SOE) und in zwei späte subakut bis chronische Entmarkungsphasen
unterteilt, wobei sich letztere durch eine zunehmende und auch perivaskulärorientierte Entzündungszellinfiltration auszeichneten (n = 23; Gruppe 7; SME und
n = 21; Gruppe 8; CHRON). Die meisten Tiere wiesen typischerweise zeitgleich
Läsionen aus verschiedenen Phasen der Staupeenzephalitis auf. Dieses räumlich
und zeitlich getrennte Auftreten steht dabei im direkten Zusammenhang mit dem
CDV-spezifischen Zelltropismus
(AXTHELM
u.
KRAKOWKA
sowie
1987;
der
CDV-Replikation
BAUMGÄRTNER
et
al.
und
-Verteilung
1989;
WYSS-
FLUEHMANN et al. 2010).
Die
durchgeführten
Untersuchungen
von
Arealen
der
frühen
und
späten
Infektionsphasen (Gruppen 2 bis 8) zeigten für den Verlauf der Staupeenzephalitis
insgesamt einen kontinuierlichen Anstieg der Entzündungszellinfiltration und/oder
Zellularität. Lichtmikroskopisch stellten sich diese zunächst erst eindeutig in akuten
Läsionen (Gruppe 5) dar. Sie wiesen mononukleäre Entzündungszellen, eine Astround Mikrogliose, Gemistozyten sowie ab Gruppe 6 auch Gitterzellen und
perivaskuläre Entzündungszellinfiltrate auf. Ihre stärkste Ausprägung bestand in der
Diskussion
115
chronisch-demyelinisierenden Phase der Staupeenzephalitis (Gruppe 8) mit einer
mindestens
drei
Zelllagen
umfassenden,
lymphohistiozytären,
perivaskulären
Infiltration (SEEHUSEN u. BAUMGÄRTNER 2010; WÜNSCHMANN et al. 1999).
In der frühen Phase der Staupevirusinfektion kam es im Klein- und Stammhirn
bereits vor dem Auftreten einer offensichtlichen Entzündungszellinfiltration oder
glialen Reaktion bzw. mit dem Einsetzen einer leichten Vakuolisierung des
Neuroparenchyms zu einer Zunahme von CDV-Antigen in der weißen Substanz
(Gruppen 3 und 4). Kontinuierlich zunehmend wurde die höchste intraläsionale
Viruslast in der Phase der frühen Entmarkung (Gruppe 6) beobachtet. In den späten
Entmarkungsphasen
(Gruppen
7
und
8),
welche
von
einer
prominenten
parenchymatösen und perivaskulären Entzündungszellinfiltration begleitet waren,
nahm die Virusmenge insgesamt wieder deutlich ab. Zu diesem Zeitpunkt wurde in
den Läsionszentren eine auffällige Reduktion oder gar Abwesenheit von CDVAntigen beobachtet während die Peripherie durch einen hohen CDV-Antigengehalt
charakterisiert war. Der Verlust von Virusantigen im Zentrum der späten Läsionen
deutet auf eine effektive, antivirale Immunantwort im Sinne einer Virus-Elimation hin
(WÜNSCHMANN et al. 1999). Andererseits könnte auch eine metabolische Störung
der Zielzellen zu einer eingeschränkten Virusreplikation und Virusprotein-Expression
im Sinne einer so genannten restriktiven Infektion vorliegen. Diese stellt
möglicherweise einen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Viruspersistenz dar
(BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005; ZURBRIGGEN et al. 1993).
5.1.1
Demyelinisierung bei der Staupeenzephalitis
Die Demyelinisierung bei der Staupeenzephalitis kann durch unterschiedliche
Pathomechanismen bedingt sein. Hierbei spielt die lokale antivirale Immunantwort
durch Makrophagen/Mikroglia, zytotoxische T-Zellen und B-Zellen eine wichtige
Rolle. Der Myelinschaden wird durch eine Freisetzung pro-inflammatorischer
Zytokine, reaktiver Sauersoffspezies (ROS), proteolytischer Enzyme und antiviraler
Antikörper hervorgerufen. Diese Mechanismen werden als so genannte bystander
demyelination beschrieben (SPITZBARTH et al. 2012; STEIN et al. 2004; TIPOLD et
116
Diskussion
al. 1999a; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 1995; WISNIEWSKI 1977). Die
Demyelinisierung
bei
der
Staupeenzephalitis
ist
außerdem
Folge
einer
metabolischen Störung von Oligodendrozyten und nicht notwendigerweise ihres
Verlustes. Hierbei kommt es z.B. zu einer verminderten Transkription verschiedener
Myelin-spezifischer Gene (GRABER et al. 1995; SCHOBESBERGER et al. 2002). In
der vorliegenden Arbeit wurde der Myelinverlust qualitativ und quantitativ beurteilt
und mit der Anzahl der Myelin-bildenden Oligodendrozyten verglichen. Mittels
morphometrischer Analysen wurde in den subakuten bis chronischen Herdläsionen
(Gruppen 6 bis 8) eine ausgeprägte und signifikante Demyelinisierung detektiert. In
diesen späten Phasen der Staupeenzephalitis kam es auch zu einer Reduktion von
Oligodendrozyten.
Dennoch
war
diese
weniger
stark
ausgeprägt
als
der
Myelinverlust. In keiner Phase der demyelinisierenden Staupeenzephalitis wurde ein
vollständiges Fehlen von Oligodendrozyten innerhalb der Läsionen beobachtet.
Erstmalig in dieser Arbeit wurde die Quantifizierung dieser Zellen mittels Detektion
des Proteins Nogo-A vorgenommen. Es ist ursprünglich als zuverlässiger und
spezifischer
Marker
zum
Nachweis
von
reifen
humanen
und
murinen
Oligodendrozyten beschrieben (KUHLMANN et al. 2007). Diese Studie zeigt, dass
Nogo-A in gleicher Weise beim Hund eingesetzt werden kann und daher als neuer
Marker für kanine Oligodendrozyten dienen sollte.
5.2
Immunphänotypisierung bei der Staupeenzephalitis
Die Untersuchungen zur Immunphänotypisierung wiesen für den Infektionsverlauf
insgesamt
eine
deutliche
intraläsionale
Zunahme
der
verschiedenen
Entzündungszellen auf. Hierbei erfolgte eine Quantifizierung der beteiligten T-Zellen,
B-Zellen, und Makrophagen/Mikroglia. Auffällig war, dass ein sprunghafter Anstieg
infiltrierender CD3+ T-Zellen und CD79+ B-Zellen erst in den späten Phasen der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis (Gruppen 7 und 8) beobachtet wurde. Ein
wichtiges Untersuchungsergebnis in diesem Zusammenhang stellte insbesondere
die deutlich verzögerte Infiltration von Foxp3+ Treg im Vergleich zu CD3+ T-Zellen in
die Entzündungsherde dar. Die Anzahl Foxp3+ Treg in den Läsionen war dabei erst
Diskussion
117
mit Beginn der Demyelinisierung (Gruppe 6) signifikant und in den späten Phasen
der demyelinisierenden Staupeenzephalitis (Gruppen 7 und 8) noch einmal deutlich
erhöht. Im Gegensatz hierzu wurde in den prädemyelinisierenden Phasen bereits
eine
dominierend
hohe
und
kontinuierlich
Makrophagen/Mikroglia und MHC-II
+
zunehmende
Anzahl
BS-1+
Antigen-präsentierender Zellen festgestellt.
Folglich muss schon in der Frühphase der Staupevirusenzephalitis von einer durch
Makrophagen/Mikroglia
wesentlich
beeinflussten
oder
gar
dominierten
Immunreaktion ausgegangen werden. Dabei stellt vor allem eine frühe und
anhaltende Aktivierung residenter Mikroglia eine wichtige Voraussetzung für die
folgende
lymphozytäre
Immunantwort
und
den
beginnenden
Demyelinisierungsprozess dar (ALLDINGER et al. 1996; STEIN et al. 2004).
Insbesondere unter Berücksichtigung der frühen Immunsuppression bei der CDVInfektion muss der Aktivierung lokaler angeborener Immunmechanismen eine
besondere Bedeutung für die Krankheitsinitiation und -progression beigemessen
werden (RUDD et al. 2010).
Bisherige Untersuchungen haben gezeigt, dass, trotz der ausgeprägten und
langanhaltenden lymphatischen Depletion, CD8+ zytotoxische T-Zellen bereits
während der Frühphase der Staupeenzephalitis in das ZNS infiltrieren und damit eine
wichtige Rolle im Rahmen der Initiation und möglicherweise Progression der
Krankheit spielen könnten (s. Abbildung 38A). Für diese Migration wird insbesondere
eine erhöhte intrathekale und periphere IL-8-Expression verantwortlich gemacht,
deren Ursache wahrscheinlich im Zusammenhang mit der auch in dieser
Untersuchung beobachteten Aktivierung der residenten Mikroglia stehen könnte
(GRÖNE et al. 1998; SPITZBARTH et al. 2012; TIPOLD et al. 1999a). Folglich
könnten CD8+ T-Zellen im Rahmen der CDV-Infektion eine erhöhte Refraktärität
gegenüber physiologischen und/oder Virus-bedingten Eliminationsmechanismen
besitzen. So wurde gezeigt, dass CD8+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ T-Zellen im
peripheren Blut während der frühen Immunsuppression in weitaus geringerem
Umfang eliminiert wurden und auch noch nach Wochen bei Hunden mit
überstandener CDV-Infektion im ZNS nachweisbar waren (TIPOLD et al. 2001). Im
118
Diskussion
Vergleich hierzu kommt es in den späten demyelinisierenden Phasen der
Staupeenzephalitis zu einer stark ansteigenden entzündlichen Infiltration zunehmend
unter
Beteiligung
CD4+
T-Zellen,
welche
überwiegend
perivaskulär
liegen
(WÜNSCHMANN et al. 1999). Weiterhin wird auch, in Übereinstimmung mit den
Ergebnissen dieser Arbeit, eine deutliche Infiltration von B-Zellen beobachtet,
einhergehend
mit
einer
ausgeprägten
intrathekalen
Antikörperproduktion
(VANDEVELDE et al. 1986). Daher werden in der Spätphase der Staupeenzephalitis
zunehmend immunpathologische Prozesse im Sinne einer Hypersensitivitätsreaktion
vom verzögerten Typ sowie Antikörper-vermittelte Immunreaktionen für das
Krankheitsbild verantwortlich gemacht (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005;
WÜNSCHMANN et al. 1999).
5.2.1
Regulatorische T-Zellen bei der Staupeenzephalitis
Untersuchungen zu regulatorischen T-Zellen wurden bei der Hundestaupe bisher
nicht durchgeführt, so dass deren Rolle im Rahmen der Krankheitsinitiation und
-progression in der vorliegenden Arbeit einen besonderen Schwerpunkt darstellt.
Ein wichtiges Untersuchungsergebnis war ein lediglich vereinzelter bis überwiegend
fehlender Nachweis immunmodulatorischer Foxp3+ Treg in der von CD3+ T-Zellen
und Makrophagen/Mikroglia dominierten Frühphase der Staupeenzephalitis. Dieser
Mangel an Treg könnte einen pathogenetischen Zusammenhang mit der Induktion
immunpathologischer
Prozesse
bzw.
einer
überschießenden,
fehlregulierten
Immunantwort im frühen als auch weiteren Entzündungsverlauf erklären. So könnte
es durch das Fehlen immunsuppressiver Signale beispielsweise zu einer vermehrten
Aktivierung residenter glialer Zellen und/oder infiltrierender Leukozyten kommen
(s. Abbildung 38A; BEINEKE et al. 2009; MARKUS et al. 2002). Interessanterweise
sind die Treg-spezifischen anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β in der
Frühphase der Staupeenzephalitis nicht aufreguliert (BEINEKE et al. 2008; MARKUS
et al. 2002), so dass sich der frühe Treg-Mangel auch durch das Fehlen eines
protektiven Zytokinmilieus erklären lässt. Es konnte zwar gezeigt werden, dass in
den späten Phasen der demyelinisierenden Staupeenzephalitis deutlich erhöhte
Diskussion
119
Foxp3+ Treg in den Läsionen aufzufinden waren, aber ihre zeitlich verzögerte
Infiltration den bereits bestehenden und fortgeschrittenen Entzündungs- bzw.
Demyelinisierungsprozess
(s. Abbildung 38B).
in
dieser
Phase
nicht
mehr
eindämmen
konnte
120
Diskussion
Abbildung 38: Die Rolle von regulatorischen T-Zellen und der Apoptose bei der Staupeenzephalitis
Diskussion
121
Abbildung 38: Die Rolle von regulatorischen T-Zellen und der Apoptose bei der Staupeenzephalitis
A: Die möglichen Folgen eines Mangels an regulatorischen T-Zellen in der Frühphase der
Staupeenzephalitis sind erstens eine erhöhte Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-6,
IL-8, IL-12 und TNF) und zweitens eine unzureichende Hemmung zytotoxischer CD8+ T-Zellen und
Makrophagen/Mikroglia. Dieses könnte die Grundlage für den initialen Gewebeschaden und für die
Krankheitsprogression darstellen.
B: In der späten Phase der demyelinisierenden Staupeenzephalitis kommt es zu einer vermehrten
Infiltration von regulatorischen T-Zellen. Dieser Anstieg kann die überschießende
Entzündungsreaktion in den Läsionen nicht eindämmen. Zusätzlich werden in der späten Phase
vermehrt Apoptosen nachgewiesen, die in erster Linie Leukozyten betreffen. Obwohl sich
überwiegend Leukozyten im programmierten Zelltod befinden, gelingt es über diesen Mechanismus
nicht, genügend Entzündungszellen zu eliminieren und damit die Entzündung zu terminieren. Ein
großer Anteil apopotischer Zellen bleibt unbekannt. Nur vereinzelt kommt es zur Apoptose von
Astrozyten, Oligodendrozyten und möglicherweise Makrophagen/Mikroglia.
BHS = Blut-Hirn-Schranke (Basalmembran und Endothelzellen); CD4+ = CD4+ T-Zellen;
CD8+ = CD8+ T-Zellen; Foxp3+ = Foxp3+ regulatorische T-Zellen; IL = Interleukin; Mø = Makrophagen;
TNF = Tumornekrosefaktor.
122
Diskussion
Dieses phasenspezifische, späte Auftreten von Treg könnte dennoch als
gegenregulativer, wenn auch unzureichender, kompensatorischer Mechanismus zur
Eindämmung
der
exazerbierten
Entzündungsreaktion
im
Prozess
der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis interpretiert werden. Eine Abmilderung oder
gar Termination der entzündlichen Prozesse unter Beteiligung Foxp3+ Treg, wie sie
beispielsweise bei der Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE;
MCGEACHY et al. 2005) oder der murinen Coronavirus-induzierten Enzephalitis
(TRANDEM et al. 2010) beobachtet wurden, konnten bei der demyelinisierenden
kaninen Staupeenzephalitis im Rahmen dieser Arbeit nicht festgestellt werden.
Es stellt sich damit die Frage, warum es zu einem phasenspezifischen Auftreten von
Foxp3+ Treg im Verlauf der demyelinisierenden Staupeenzephalitis im ZNS kommt
und warum die im entzündeten Gewebe nachgewiesenen Foxp3+ Treg keinen
offensichtlich protektiven Effekt im Krankheitsgeschehen ausüben.
Einerseits könnte in Bezug auf die Krankheitsentwicklung der Staupeenzephalitis
eine zu späte oder in zu geringem Ausmaße erfolgte ZNS-Infiltration der Treg
erfolgen. Außerdem ist ein Verlust von CD4+Foxp3+ Treg aufgrund der ausgeprägten
und langanhaltenden Depletion CD4+ T-Zellen bei der CDV-Infektion im Rahmen der
frühen Immunsuppression wahrscheinlich. So wird bei der demyelinisierenden
Multiplen Sklerose (MS) des Menschen pathogenetisch eine verminderte Foxp3Expression im Blut wie auch eine verminderte oder fehlende Infiltration von Treg in
frühen oder aktiven MS-Plaques diskutiert (FRITZSCHING et al. 2011; HUAN et al.
2005;
TZARTOS
et
al.
2008).
Ursächlich
müssen
dabei
unterschiedliche
Mechanismen berücksichtigt werden. Weiterhin könnte die Funktion vorhandener
Treg im Sinne reduzierter protektiver Eigenschaften, wie sie z.B. bei MS-Patienten
beobachtet wurde (VIGLIETTA et al. 2004), auch bei der Staupeenzephalitis eine
Rolle spielen. Eine andere Ursache könnte in einer gestörten Differenzierung von
T-Vorläuferzellen begründet sein, z.B. im Zusammenhang mit einer ungünstigen
lokalen oder systemischen Zytokin-Expression. So wurde bei Hunden mit
demyelinisierender
IL-6-Expression
Staupeenzephalitis
intrathekal
und
im
eine
peripheren
kontinuierlich
ansteigende
Blut
der
während
frühen
Infektionsphase gefunden (GRÖNE et al. 2000; GRÖNE et al. 1998). Dabei
Diskussion
123
begünstigt IL-6 zusammen mit TGF-β eine Differenzierung von T-Vorläuferzellen in
Th17 T-Effektorzellen (Teff), wohingegen ohne den Einfluss von IL-6 eine
Differenzierung in Treg erfolgt. Den Th17 Teff werden neben pro-inflammatorischen
auch autoimmune Eigenschaften zugesprochen (QUINTANA et al. 2008; STEVENS
u. BRADFIELD 2008; STOCKINGER et al. 2007). Ein weiterer Pathomechanismus
könnte nicht in den Treg selbst begründet sein. Beispielsweise könnten trotz
bestehender
Treg-Funktionalität
die
beteiligten
Entzündungszellen
und/oder
residente Gliazellen einen nicht-responsiven Phänotyp besitzen. Folglich könnten die
refraktären Zellen trotz eines Treg-vermittelten protektiven Zytokinmilieus in der
Spätphase nicht auf die Signale reagieren. So wurde bei der EAE gezeigt, dass
IL-6- und TNF-produzierende Teff aus dem entzündeten ZNS eine intrinsische
Refraktäritiät, im Gegensatz zu peripheren Teff, gegenüber enzephalitogenen,
Antigen-spezifischen und funktionellen Foxp3+ Treg besaßen (KORN et al. 2007).
Insgesamt
muss
berücksichtigt
werden,
dass
Treg
auch
nicht-protektive
+
Eigenschaften besitzen. So könnten funktionelle Foxp3 Treg in der Spätphase der
Staupeenzephalitis aufgrund ihrer immunsuppressiven Eigenschaften eine robuste
und effektive, antivirale Immunantwort verhindern und damit gleichzeitig die
Erregerpersistenz
sowie
Krankheitsprogression
begünstigen.
Vergleichbare
Prozesse konnten bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis, einem
Mausmodell für Virus-induzierte demyelinisierende ZNS-Erkrankungen, und der
West-Nil-Virus-bedingten Enzephalitis der Maus nachgewiesen werden (HERDER et
al. 2012; RICHARDS et al. 2011; STEWART et al. 2011). Darüber hinaus werden
Treg für die Suppression einer effektiven antitumoralen Immunantwort bei
neoplastischen Erkrankungen verantwortlich gemacht (O'NEILL et al. 2009;
SONABEND et al. 2008).
5.3
Störung der Blut-Hirn-Schranke bei der Staupeenzephalitis
Ein weiteres pathogenetisch bedeutsames Untersuchungsergebnis stellt die
Dominanz von Makrophagen/Mikroglia sowohl in der frühen als auch in der
fortgeschrittenen Krankheitsphase bei der Staupeenzephalitis dar. Insbesondere die
124
Diskussion
Aktivierung residenter Mikroglia in der Frühphase der Staupeenzephalitis könnte als
eine Ursache für die gesteigerte Expression pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-6,
IL-8, IL-12 und TNF-α (s. Abbildung 38A) und damit einen entscheidenden
Pathomechanismus im Hinblick auf die Krankheitsinitiation und -progression
darstellen (BEINEKE et al. 2008; FRISK et al. 1999a; GRÖNE et al. 2000; MARKUS
et al. 2002).
Mögliche Folge der erhöhten Zytokinexpression könnte eine Schädigung der
Blut-Hirn-Schranke
(BHS)
sein,
z.B.
durch
eine
gesteigerte
Permeabilität,
Umstrukturierung des endothelialen Zytoskelets und der Aufregulierung von
Adhäsionsmolekülen
(DELI
et
al.
1995;
SPITZBARTH
et
al.
2012;
TUTTOLOMONDO et al. 2008; WEBB u. MUIR 2000). Ferner sind Astrozyten mit
ihren Zellausläufern wesentlich am Aufbau der BHS beteiligt (ITOH et al. 2011). Ein
denkbarer Mechanismus im Zusammenhang mit einer Störung der BHS könnte damit
in einer direkten oder indirekten Beeinträchtigung des astroglialen Metabolismus
begründet sein. Das Wasserkanal-Membranprotein Aquaporin-4 (AQP-4) in den
astrozytären Fußfortsätzen spielt eine wichtige Rolle im Rahmen der funktionellen
Integrität der BHS (JUNG et al. 1994; NAGELHUS et al. 2004). Bei der
idiopathischen Neuromyelitis optica (NMO) des Menschen finden sich für das
Krankheitsbild spezifische anti-AQP-4 IgG im Blut der Patienten und die Läsionen
sind durch einen ausgeprägten AQP-4-Verlust charakterisiert (LENNON et al. 2005;
MISU et al. 2007). Die Untersuchungsergebnisse zeigten in den frühen Phasen der
Staupeenzephalitis eine Aktivierung und Proliferation GFAP+ Astrozyten im
Gegensatz zu deren deutlicher Reduktion in den demyelinisierenden Spätphasen.
Hinweisend auf eine frühe Störung der BHS und des Astrozytenmetabolismus
könnte, trotz ihrer Aktivierung und Proliferation, eine deutliche Herabregulierung der
intraläsionalen AQP-4-Expression sein. So wurde in der vorliegenden Untersuchung
bereits in den frühen Phasen (Gruppen 4 und 5) eine signifikante Reduktion der
AQP-4-Dichte gezeigt. Folglich könnte AQP-4 einen geeigneten Marker zur Detektion
früher BHS-Störungen beim Hund darstellen. Die Untersuchung zeigte allerdings,
dass der mittels AQP-4-Immunhistologie detektierte BHS-Schaden in der Frühphase
nicht zu einem Austritt von Albumin in den Virchow-Robin-Raum führte. Im
Diskussion
125
Gegensatz hierzu wurde gezeigt, dass ein BHS-Schaden bei der Staupeenzephalitis
grundsätzlich mit einem erhöhten Albumin-Austritt in den Liquor und in das
Neuroparenchym einherging. Dieser war allerdings mit dem finalen Stadium einer
fatalen CDV-Erkrankung assoziiert und keiner spezifischen Phase der Enzephalitis
zugeordnet (JOHNSON et al. 1987). In der vorliegenden Arbeit konnte Albumin
intraläsional erst in den späten Phasen der demyelinisierenden Staupeenzephalitis
vereinzelt nachgewiesen werden, parallel zu einer drastischen und möglicherweise
begünstigenden Reduktion der AQP-4-Expression.
5.4
Apoptose bei der Staupeenzephalitis
Aus den bisherigen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ergeben sich für die
Frühphase der Staupeenzephalitis drei wesentliche Ergebnisse. Erstens ist die
prädemyelinisierende Frühphase durch eine Makrophagen/Mikroglia dominierte
Immunreaktion charakterisiert. Im Vergleich dazu wurde zweitens eine weniger stark
ausgeprägte Infiltration CD3+ T-Zellen festgestellt. Darüber hinaus wurde drittens ein
deutlicher Mangel an Foxp3+ Treg beobachtet. Eine Ursache für die selektive
Reduktion oder Elimination der T-Zell-Population könnte die Aktivierungs-induzierte
Apoptose (activation-induced cell death; AICD) sein, ein regulativer Mechanismus
zur Eindämmung der Immunantwort (BRENNER et al. 2008; STRANGES et al.
2007). Im Gegensatz dazu könnten in diesem Prozess gleichzeitig bestimmte
Entzündungszellen, wie z.B. Makrophagen/Mikroglia oder T-Zell-Subpopulationen
einen Apoptose-resistenten Phänotyp aufweisen und damit die Elimination umgehen.
Aus diesem Grund wurde in der Früh- und Spätphase der demyelinisierenden
Staupeenzephalitis
eine
detaillierte
Untersuchung
auf
apoptotische
Zellen
durchgeführt.
Die
Apoptose
wurde
in
dieser
Arbeit
auf
zwei
Ebenen
mittels
einer
immunhistolgischen Detektion von aktivierter Caspase-3 sowie der TUNEL-Methode
untersucht. Hierbei blieb der betroffene Zelltyp zunächst unberücksichtigt. Die
Ergebnisse zeigten eine kontinuierliche Zunahme intraläsionaler apoptotischer
Zellen, wobei die höchste Anzahl in den späten Phasen der demyelinisierenden
126
Diskussion
Staupeenzephalitis beobachtet wurde (s. Abbildung 38B). Die Anzahl aktivierter
Caspase-3+ Zellen lag konstant über der mittels TUNEL-Methode detektierten Zellen.
Aufgrund des kontinuierlichen und parallelen Anstiegs aktivierter Caspase-3 und des
TUNEL-Signals, gehen möglicherweise alle Zellen mit aktivierter Caspase-3
endgültig in den programmierten Zelltod über. Grundsätzlich werden apoptotische
Zellfragmente in sehr kurzer Zeit phagozytiert (GAVRIELI et al. 1992; MAJNO u.
JORIS 1995). Folglich wäre denkbar, dass fragmentierte TUNEL+ Zellen schnell vom
Ort des Geschehens entfernt werden. Möglicherweise exprimieren Zellen aktivierte
Caspase-3 über einen längeren Zeitraum und sind damit in höherer Anzahl zu einem
bestimmten Zeitpunkt nachweisbar. Untermauert wurde diese Vermutung durch die
Ergebnisse der Doppelmarkierung. Hier lag ein höherer Nachweis einfach aktivierter
Capase-3+ Zellen in den Läsionen verglichen mit einfach TUNEL+ Zellen vor.
Es fanden sich nur vereinzelt doppelt positive Zellen. Andererseits könnte teilweise
auch eine Caspase-Aktivierung ohne Übergang in die Apoptose vorliegen, so dass
sich die Zellen auf einem sublethalen Stress-Niveau befinden (D'AMELIO et al. 2011;
HYMAN 2011).
Im Anschluss wurden Doppelmarkierungen mit dem Ziel durchgeführt, den Phänotyp
der apoptotischen Zellen nachzuweisen. Dazu wurden repräsentative Tiere
ausgewählt, welche Läsionen aus den Gruppen der Früh- und Spätphase der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis aufwiesen. Die häufigste Ko-Lokalisation der
TUNEL-Reaktion fand sich mit CD3+ T-Zellen. Im Gegensatz dazu konnten keine
nennenswerten
Apoptosen
von
Oligodendrozyten
gefunden
werden.
Diese
Ergebnisse in Kombination mit der Nogo-A Immunhistologie legen nahe, dass der
Myelinverlust im Rahmen der Staupeenzephalitis wahrscheinlich keine Folge eines
apoptotischen Zelluntergangs von Oligodendrozyten ist. Vielmehr sollte die
Reduktion
von
MBP
infolge
eines
reduzierten
Zellmetabolismus
der
Oligodendrozyten interpretiert werden (GRABER et al. 1995; SCHOBESBERGER et
al. 2002). Desgleichen wurden nur vereinzelt GFAP+ Astrozyten mit einem
ko-lokalisierten TUNEL-Signal in unterschiedlichen Läsionen gefunden. Zu keinem
Zeitpunkt gelang eine Ko-Lokalisation mit Endothelzellen (von Willebrand-Faktor).
Diskussion
127
Dabei zeigten sich in der Immunhistologie insbesondere während der frühen Phasen
intraläsional häufig aktivierte Caspase-3+ Endothelien und/oder Perizyten sowie
unmittelbar benachbarte Zellen mit mononukleärer Morphologie. Bei letzteren könnte
es sich um infiltrierende Lymphozyten, Makrophagen oder dendritische Zellen
handeln (BALLABH et al. 2004; IFERGAN et al. 2008).
Aufgrund der Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit kann davon ausgegangen
werden, dass die T-Zell-Apoptose bei der Staupeenzephalitis eine größere Rolle
spielt als bei Gliazellen und Endothelien (s. Abbildung 38B). Dabei ist die Apoptose
als verantwortlicher Mechanismus für der Elimination von Lymphozyten im Rahmen
der frühen und schweren CDV-bedingten Immunsuppression bereits bekannt
(SCHOBESBERGER et al. 2005). Allerdings muss berücksichtigt werden, dass
neben
der
Apoptose
weitere
Mechanismen des sublethalen Zellschadens,
z.B. zellulärer Stress, und des Zelltods, z.B. Autophagie, in Frage kommen, welche
pathogenetisch für die Staupeenzephalitis eine Rolle spielen könnten (BREDESEN
et al. 2006; D'AMELIO et al. 2011).
5.4.1
Pro-apoptotische Mechanismen bei der Staupeenzephalitis
Basierend auf den Untersuchungsergebnissen zur Bedeutung der Apoptose bei der
Staupeenzephalitis wurde in einem zweiten Schritt die nähere Charakterisierung
pro- und anti-apoptotischer Mechanismen vorgenommen.
Die pro-apoptotischen Marker Bax und Fas zeigten über die Phasen der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis eine kontinuierlich ansteigende Expression in
den Läsionen. Hierbei wurden Bax+ und insbesondere Fas+ Zellen mit überwiegend
leukozytärer Morphologie detektiert, was darauf hinweisen könnte, dass der
programmierte Zelltod vornehmlich bei Leukozyten im Sinne der Aktivierungsinduzierten Apoptose (AICD) eine pathogenetische Rolle spielt (BRENNER et al.
2008). Möglicherweise kommt es in der Frühphase der Hundestaupe, noch vor der
ZNS-Infektion, im Rahmen der Apoptose-bedingten Immunsuppression zu einer
Apoptose CD4+Foxp3+ Treg wodurch sich das initiale Fehlen dieser Zellpopulation
erklären ließe (SCHOBESBERGER et al. 2005). Bei der MS wird eine gezielte
128
Diskussion
Fas-vermittelte intrathekale Elimination Foxp3+ Treg diskutiert (FRITZSCHING et al.
2011). Weiterführende Studien müssen klären, ob die selektive Apoptose von Treg
eine pathogenetische Bedeutung bei der Staupeenzephalitis hat.
5.4.2
Anti-apoptotische Mechanismen bei der Staupeenzephalitis
Neben den pro-apoptotischen Markern wurden in dieser Studie auch antiapoptotische Moleküle immunhistologisch untersucht. Die Aufregulation des
anti-apoptotischen Markers cIAP-2 in der Spätphase der Entmarkung könnte ein
Absterben und damit die Elimination der Leukozyten verhindern und so die
Entzündung aufrechterhalten. Bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis wird
eine Aufregulation des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 in T-Zellen für die
übermäßige Entzündung und damit einhergehende Demyelinisierung in der
chronischen
Phase
verantwortlich
gemacht
(OLESZAK
et
al.
2003).
Interessanterweise kommt es ab der initialen Phase der Entmarkung (Gruppe 6) zu
einer deutlichen Expression der anti-apoptotischen Marker Survivin und Bcl-2 in
Zellen mit Gitterzellmorphologie. Die signifikant aufregulierte Expression des
anti-apoptotischen
(Gruppen
4
und
Markers
5)
Survivin
der
in
den
prädemyelinisierenden
Staupeenzephalitis
liegt
Phasen
möglicherweise
in
Makrophagen/Mikroglia ohne Gitterzellmorpholgie vor. Dieser anti-apoptotische
Phänotyp der Makrophagen/Mikroglia könnte die Persistenz dieser Zellen und damit
ihre gewebsschädigende Aktivität, z.B. im Sinne einer bystander demyelination,
fördern. Survivin spielt z.B. eine wichtige Rolle bei der Akkumulation und Persistenz
von Makrophagen in artherosklerotischen Plaques (BLANC-BRUDE et al. 2007)
sowie allgemein bei der primär-progressiven MS, einer besonders aggressiven
MS-Form (HEBB et al. 2008). Murine Astrozyten-Zellkulturen zeigten nach Infektion
mit dem Theilerschen murinen Enzephalomyelitis-Virus eine Aufregulierung von
Caspase-3 und Survivin, ohne das eine enzymatische Aktivität des Enzyms vorlag.
Dabei stellte sich heraus das Survivin die Caspase-3 in einem Komplex bindet und
funktionell inhibiert (RUBIO et al. 2012).
Diskussion
5.5
129
Schlussbetrachtung
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Apoptose und Foxp3+ Treg
im Verlauf der demyelinisierenden Staupeenzephalitis phasenspezifisch eine
wichtige pathogenetische Rolle spielen.
Der
Mangel
an
demyelinisierenden
immunmodulatorischen
Staupeenzephalitis
ist
Treg
in
der
möglicherweise
Frühphase
für
der
unzureichende
immunsuppressive Mechanismen verantwortlich. Das Fehlen dieser Gegenregulation
begünstigt so die Krankheitsinitiation und -progression und den damit assoziierten
Gewebeschaden. Folglich könnte ein höherer Anteil an Treg in der Frühphase die
Progression
der
Staupeenzephalitis
verhindern.
Aufgrund
des
Nachweises
pro-apoptotischer Marker (Fas) in Leukozyten stellt die Apoptose eine mögliche
Ursache des frühen Treg-Mangels dar.
Im Gegensatz dazu kommt es in der Spätphase der demyelinisierenden
Staupeenzephalitis zu einer erhöhten intraläsionalen Treg-Infiltration. Dies könnte
einen möglichen, aber zu diesem Zeitpunkt ineffektiven, gegenregulatorischen
Mechanismus mit dem Ziel einer Limitierung der exazerbierten Entzündung
darstellen. Ursächlich dafür könnten a) ein zu spätes Auftreten der Treg am
Entzündungsort, b) eine Dysfunktion der Treg oder c) ein Nicht-Ansprechen der
Effektorzellen in den Läsionen sein.
Die Apoptose wurde sowohl in den frühen als auch späten Phasen der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis bei Leukozyten und hier insbesondere bei
T-Zellen festgestellt. Die Apoptose von Leukozyten stellt grundsätzlich einen
wichtigen Mechanismus zur Termination entzündlicher Prozesse dar (BRENNER et
al.
2008).
Die
demyelinisierenden
Apoptose
protektiver
Staupeenzephalitis
Immunzellen,
führt
z.B.
Treg,
möglicherweise
zu
bei
der
einem
Ungleichgewicht der Immunantwort zugunsten pro-inflammatorischer Zellen, wie
CD8+ T-Zellen, oder Makrophagen/Mikroglia, und damit zur Gewebsschädigung.
Der Nachweis anti-apoptotischer Marker (Survivin) in der Frühphase und
insbesondere
in
Gitterzellen
in
der
Spätphase
der
demyelinisierenden
130
Diskussion
Staupeenzephalitis könnte auf eine Apoptose-Resistenz gewebsschädigender Zellen
hinweisen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Apoptose und Treg mögliche therapeutische
Ansätze bieten. Hierbei könnte ein adoptiver Transfer protektiver Treg bzw. deren
Stimulation oder Apoptose-Inhibition in der frühen Infektionsphase die Initiation der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis verhindern (TRANDEM et al. 2010). Im
Gegensatz dazu könnte eine selektive Apoptose-Induktion oder Herabregulierung
anti-apoptotischer Moleküle in Effektorzellen, wie z.B. Makrophagen/Mikroglia oder
zytotoxische CD8+ T-Zellen, möglicherweise den Gewebeschaden limitieren
(SHARIEF u. SEMRA 2002).
In weiteren Studien sollte der funktionelle Einfluss von enzephalitogenen und
peripheren Treg auf die beteiligten Zellen sowie deren Interaktion näher untersucht
werden. In diesem Zusammenhang sollte auch die Apoptose von Treg und
Makrophagen/Mikroglia besondere Berücksichtigung finden.
Zusammenfassung
6
Die
131
Zusammenfassung
demyelinisierende
immunpathologischer
kanine
Prozesse
Staupeenzephalitis:
Charakterisierung
unter
Berücksichtigung
besonderer
regulatorischer T-Zellen und der Apoptose
Hermann Maximilian Iseringhausen
Bei der Staupe handelt es sich um eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit des
Hundes hervorgerufen durch das kanine Staupevirus, einem Morbillivirus aus der
Familie Paramyxoviridae. Im Rahmen der Infektion kommt es zu einer ausgeprägten
und langanhaltenden Immunsuppression und damit assoziierten schwerwiegenden
respiratorischen, gastrointestinalen und/oder nervösen Symptomen. Beim Hund stellt
die demyelinisierende Leukoenzephalitis die typische Manifestationsform der
nervösen Staupe dar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die regulatorischen T-Zellen (Treg) und die
Apoptose
bei
der
kaninen
demyelinisierenden
Staupeenzephalitis
zu
charakterisieren. Die Untersuchungen wurden an Klein- und Stammhirn-Proben der
weißen Substanz von 28 natürlich mit CDV-infizierten Hunden und 5 Kontrolltieren
durchgeführt. Es erfolgte eine Einteilung der Herdläsionen anhand des StaupevirusAntigengehalts,
der
Zellularität,
der
Entzündungszellinfiltration,
des
Demyelinisierungsgrades und der glialen Reaktion in folgende 8 Gruppen:
Kontrollareale (Gruppe 1), Virusantigen-freie Areale (Gruppe 2), Virusantigen-haltige
Areale ohne offensichtliche Läsion (Gruppe 3), vakuolisierte Herde (Gruppe 4), akute
Herde (Gruppe 5), subakute Herde ohne perivaskuläre Entzündung (Gruppe 6),
subakute Herde mit perivaskulärer Entzündung (Gruppe 7) und chronische Läsionen
(Gruppe 8). Bei der Gruppeneinteilung wurde zwischen einer prädemyelinisierenden
Phase (Gruppen 2 bis 5) und einer demyelinisierenden Phase (Gruppen 6 bis 8)
unterschieden.
Mittels histochemischer, immunhistologischer und immunfluoreszenzmikroskopischer
Methoden wurde die Staupevirus-Verteilung, die gliale Reaktion (GFAP+ Astrozyten
132
Zusammenfassung
und Nogo-A+ Oligodendrozyten), die Myelinisierung, die Integrität der Blut-HirnSchranke
(CD3
+
(Albumin
und
+
T-Zellen, Foxp3
MAC 387
+
Aquaporin-4)
Treg, CD79α
Monozyten und MHC-II
+
+
und
die
Entzündungszellinfiltration
B-Zellen, BS-1
+
Makrophagen/Mikroglia,
Antigen-präsentierende Zellen) untersucht.
Darüber hinaus wurden apoptotische Zellen (aktivierte Caspase-3 und TUNELReaktion) sowie unterschiedliche anti-apoptotische (Bcl-2, cIAP-2 und Survivin) und
pro-apoptotische (Bax und Fas) Moleküle dargestellt.
In der Frühphase der demyelinisierenden Staupeenzephalitis wurde ein deutlicher
Mangel an Foxp3+ Treg sowie eine Infiltration von CD3+ T-Zellen und eine erhöhte
Anzahl von Makrophagen/Mikroglia festgestellt. Die Doppelimmunfluoreszenz zeigte
Apoptosen überwiegend in CD3+ T-Zellen. Darüber hinaus wiesen Zellen mit
Leukozyten-Morphologie eine erhöhte Expression des pro-apoptotischen Markers
Fas
auf.
Die
Ergebnisse
der
Frühphase
weisen
auf
unzureichende
immunmodulatorische Mechanismen aufgrund des Fehlens von Treg hin. Dies
könnte auf eine Fas-vermittelte Apoptose Foxp3+ Treg zurückzuführen sein. Das
Fehlen der Treg-assoziierten Gegenregulation begünstigt möglicherweise die
Krankheitsinitiation und -progression.
Im Gegensatz dazu kommt es in der Spätphase der Staupeenzephalitis zu einer
verzögerten Infiltration von Treg sowie zu einem drastischen Anstieg von CD3+
T-Zellen und Makrophagen/Mikroglia. Die Expression des pro-apoptotischen Markers
Fas in Leukozyten bleibt bis in die Spätphase bestehen. Zusätzlich wurde eine
Aufregulation der anti-apoptotischen Moleküle Bcl-2 und Survivin in Zellen mit
Gitterzell-Morphologie nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Spätphase
kann
angenommen
werden,
dass
es
trotz
der
Treg-Infiltration
und
der
Fas-vermittelten Apoptose von Leukozyten, zu keiner effektiven Gegenregulation und
damit
Eindämmung
der
exazerbierten
Entzündung
kommt.
Der
Nachweis
anti-apoptotischer Marker, insbesondere Survivin, in Gitterzellen könnte auf eine
Apoptose-Resistenz hinweisen. Dies steht vermutlich mit einer reduzierten
Elimination aktivierter Mikroglia und Makrophagen im Zusammenhang.
Zusammenfassung
133
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde Aquaporin-4 als Marker für Astrozyten und
eine mögliche Störung der Blut-Hirn-Schrankenfunktion beim Hund etabliert. Darüber
hinaus stellt Nogo-A einen neuen, validen Marker zum Nachweis kaniner
Oligodendrozyten dar.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass die Apoptose und
Treg
im
Verlauf
der
demyelinisierenden
Staupeenzephalitis
eine
wichtige
pathogenetische Rolle spielen. Folglich könnte der Gewebeschaden bei der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis durch drei phasenspezifische Mechanismen
verursacht
sein:
a)
ein
Treg-Mangel,
Immunmodulation
und
Immunzellen.
weiteren
In
c)
eine
Studien
b)
eine
ineffektive
Apoptose-Resistenz
sollte
der
Treg-vermittelte
pro-inflammatorischer
funktionelle
Einfluss
von
enzephalitogenen und peripheren Treg auf die beteiligten Zellen sowie deren
Interaktion im Rahmen der Staupevirus-Infektion näher untersucht werden. Darüber
hinaus sollte in diesem Zusammenhang geklärt werden, welche Rolle die Apoptose
oder
Apoptose-Resistenz
von
Immunzellen
spielt
und
welche
möglichen
therapeutischen Ansätze sich für virale Enzephalitiden beim Hund ergeben könnten.
Summary
7
135
Summary
Demyelinating
canine
distemper
encephalitis:
Characterization
of
immunopathological processes with special emphasis on regulatory T cells
and apoptosis
Hermann Maximilian Iseringhausen
Canine distemper is an infectious and systemic disease of the dog with a worldwide
distribution. The disease is caused by the canine distemper virus (CDV),
a morbillivirus of the Paramyxoviridae family. Following CDV-infection, dogs develop
a severe and long-lasting immunosuppression associated with clinical signs of
respiratory, gastrointestinal and/or central nervous disease. In the central nervous
system (CNS) of dogs a demyelinating leukoencephalitis is the typical manifestation
of CDV-infection.
Aim of the present study was to characterize regulatory T cells (Treg) and apoptosis
during demyelinating canine distemper encephalitis. For the study, tissue samples of
the cerebellum and brain stem originating from 28 naturally CDV-infected dogs
and 5 non-infected control animals were examined. Based on the presence and
amount of CDV antigen, cellularity, infiltration of inflammatory cells, level of
demyelination and glial reaction, 8 different CNS lesion patterns were distinguished:
control areas (group 1), areas lacking CDV antigen (group 2), areas containing CDV
antigen without histopathological changes (group 3), areas of white matter
vacuolization (group 4), acute lesions (group 5), subacute lesions without
perivascular inflammation (group 6), subacute lesions with perivascular inflammation
(group 7) and chronic lesions (group 8). The pre-demyelinating disease stage
comprised groups 2 to 5 and the demyelinating disease stage included groups 6 to 8.
Applying
histochemical,
immunohistochemical
and
immunofluorescence-
microscopical methods, CDV distribution, glial reaction (GFAP+ astrocytes and
Nogo-A+ oligodendrocytes), myelination, integrity of the blood-brain barrier (albumin
and aquaporin-4) and inflammatory cells (CD3+ T-cells, Foxp3+ Treg, CD79α+ B-cells,
136
Summary
BS-1+ macrophages/microglia, MAC 387+ monocytes and MHC-II+ antigen presenting
cells) were characterized. Furthermore, the presence of apoptotic cells (cleaved
caspase-3 and TUNEL reaction) as well as different anti-apoptotic (Bcl-2, cIAP-2 and
survivin) and pro-apoptotic (Bax and Fas) molecules were investigated.
In the early disease stage of demyelinating distemper encephalitis a significant lack
of Foxp3+ Treg, an infiltration of CD3+ T-cells and increased numbers of
macrophages/microglia were found. Using double immunofluorescence, apoptosis
was primarily detected in CD3+ T-cells. In addition, an increased expression of the
pro-apoptotic marker Fas was present in cells with leukocyte morphology.
Thus, results of the early disease stage suggested the occurrence of insufficient
immunomodulatory mechanisms due to the lack of Treg. This could be attributed to a
Fas-dependent apoptosis of Foxp3+ Treg. Therefore, an absence of Treg-mediated
counterregulatory mechanisms possibly facilitates disease initiation and progression.
In the late disease stage of demyelinating distemper encephalitis a delayed
infiltration of Treg and a severe increase of CD3+ T-cells and macrophages/microglia
were detected. Expression of pro-apoptotic Fas sustained within leukocytes.
In addition, an up-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 and survivin was present in cells
displaying gitter cell morphology. These data suggest that counterregulatory
mechanisms in order to limit exacerbated CNS inflammation fail despite the presence
of Treg and Fas-dependent leukocyte apoptosis. However, up-regulation of
anti-apoptotic markers, especially survivin, in gitter cells may suggest an apoptosisresistant phenotype, probably explaining a reduced elimination of activated microglia
and macrophages.
Furthermore, within the context of this study, aquaporin-4 proved to be a suitable
immunohistochemical marker for canine astrocytes and impairment of blood-brain
barrier function. Furthermore, Nogo-A was established as an appropriate marker for
the detection of mature oligodendrocytes in the canine CNS.
Summary
137
Results of the present study indicated that apoptosis and Treg play an important
pathogenetic role in the course of demyelinating canine distemper encephalitis.
Therefore and based on these data, tissue damage due to naturally occurring
CDV-infection can be based on three disease stage-specific mechanisms:
a) a lack of Treg, b) an ineffective Treg-dependent immunomodulation and
c) an apoptosis-resistant phenotype of pro-inflammatory immune cells. Further
studies should elucidate the functional role and impact of encephalitogenic and
peripheral Treg upon immune cells as well as their interaction during CDV-infection.
Moreover, the role of apoptosis or apoptosis resistance of immune cells and thus
possible therapeutic approaches targeting viral encephalitis in the dog should be
addressed.
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Restricted canine distemper virus infection of oligodendrocytes.
Lab Invest 68, 277-284
Anhang
165
9
Anhang
9.1
Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper
Abcam plc, Cambridge, UK
polyklonaler Schaf-anti-Albumin Antikörper, A 8940
Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K. Immunbiologische Produkte, Kronshagen,
Deutschland
Aszitesflüssigkeit von Balb/c Mäusen, CL8100
Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, USA
polyklonaler Kaninchen-anti-aktivierte Caspase-3 Antikörper, #9661
Chroma Gesellschaft GmbH & Co., Köngen, Deutschland
Luxolechtblau (LFB), 1B 389
Kresylechtviolett (KEV), 1A 396
DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland
polyklonaler Kaninchen-anti-CD3 Antikörper, A 0452
monoklonaler Maus-anti-CD79α Antikörper, M 7051 Clone HM57
polyklonaler Kaninchen-anti-GFAP Antikörper, A 0334
monoklonaler Maus-anti-MAC 387 Antikörper, M 0747
monoklonaler Maus-anti-MHC-II Antikörper, M 0746 Clone TAL.1B5
polyklonaler Maus-anti-von Willebrand Factor Antikörper, M 0082
eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA
monoklonaler Ratte-anti-Foxp3 Antikörper, 14-5773 Clone FJK-16s
Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA
Cy™3-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen Sekundärantikörper, 111-165-003
166
Anhang
Leica Microsystems Ltd., Newcastle, UK
monoklonaler Maus-anti-Bcl-2 Antikörper, NCL-bcl-2-486 Clone 3.1
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl · 2 H2O), 1.02382
Pronase E, 1.07433.0001
Proteinase K, 1.24568.0100
Tween 20, 8.22184.1000
Merck Millipore, Billerica, USA
ApopTag® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101
ApopTag® Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit, S7111
DAPI/Antifade Solution, Ready to use, S7113
polyklonaler Kaninchen-anti-AQP-4 Antikörper, AB 3594
polyklonaler Kaninchen-anti-MBP Antikörper, AB 980
polyklonaler Kaninchen-anti-Nogo-A Antikörper, AB 5664 P
Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, UK
polyklonaler Kaninchen-anti-Survivin Antikörper, NB 500-201
Örvell C., Karolinska University Hospital, Department of Clinical Virology,
Huddinge, Stockholm, Schweden
monoklonaler Maus-anti-Staupevirus-Nukleoprotein Antikörper, clone 3991
R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA
polyklonaler Ziege-anti-cIAP-2 Antikörper, AF 8171
Ratten IgG2A Isotyp-Kontrolle, MAB006, Clone 54447
Riedel de Haën, Seelze, Hannover, Deutschland
Lithiumcarbonat (Li2CO3), 13009
Anhang
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
2-Propanol (Isopropanol), 9866.4
Albumin Fraktion V (BSA), biotinfrei, 0163.2
Citronensäure-Monohydrat (C6H8O7 · H2O), 3958.1
Diethylpyrocarbonat (DEPC), K028.2
Essigsäure 10%, 4341.1
Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.4
Ethanol, vergällt, K928.2
Ethylendiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA), X986.2
Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2
Methanol, Rotipuran® 99,9% p.a., 4627.6
Natriumchlorid (NaCl), 9265.1
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 · H2O), K300.2
Natriumhydroxid (NaOH), 6771.1
Roti® Histokitt II, T160.2
Roticlear®, A538.3
Salzsäure (HCl) 1mol/L – 1 N Lösung, K025.1
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), Pufferan® ≥ 99,9%, 5429.3
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30%, 9681.1
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA
polyklonaler Kaninchen-anti-Bax Antikörper, sc-526
polyklonaler Kaninchen-anti-Fas Antikörper, sc-1024
Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA
biotiniliertes Lektin aus Bandeiraea simplicifolia (BS-1), L 3759
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Dihydrat purum (DAB) p.a., 32750-25G-F
Kaninchennormalserum, R4505
167
168
Anhang
Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für kleine Klauentiere, Hannover,
Deutschland
Ziegennormalserum
Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA
biotinilierter Ziege-anti-Kaninchen IgG-Antikörper, BA-1000
biotinilierter Kaninchen-anti-Ratte IgG-Antikörper, BA-4001
biotinilierter Kaninchen-anti-Ziege IgG-Antikörper, BA-5000
biotinilierter Kaninchen-anti-Schaf IgG-Antikörper, BA-6000
biotinilierter Ziege-anti-Maus IgG-Antikörper, BA-9200
Vectastain® ABC Kit Standard, PK-4000
Vectastain® Elite ABC Kit Standard, PK-6100
9.2
Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel
Engelbrecht Medizin- und Labortechnik GmbH, Edermünde, Deutschland
Deckgläser 24 x 50 mm
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Safe-Lock Gefäße™ 0,5 ml, 1,5 ml und 2,0 ml
Pipette Reference® 10 μl, 100 μl und 1000 μl
Pipettenspitzen epT.I.P.S.® 10 μl, 100 μl und 1000 μl
GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA
GraphPad Prism® Software Version 5.04
IBM, New York, USA
IBM® SPSS® Statistics Version 20
Anhang
169
Leica Instruments GmbH, Nussloch, Deutschland
Rotationsmikrotom, RM 2035
Färbeautomat, ST 4040
Medite Medizintechnik, Burgdorf, Deutschland
Glas-Eindeckautomat Promounter® RCM2000
Menzel Gläser, Glasbearbeitungswerke GmbH & Co KG, Braunschweig,
Deutschland
Thermo Scientific, SuperFrost® Plus-Objektträger, 041300
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland
Netzmikrometerplatte U-OCMSQ10/10
Mikroskope BX51 und IX70
Kamera DP72
Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland
analySIS® 3.2 Software
Sakura Finetek Europe B.V., Alphen aan den Rijn, Niederlande
Einbettsystem Tissue-Tek® TEC™ 5
Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
elektronische Präzisionswaage PT210-000V1
Thermo Electron GmbH, Dreieich, Deutschland
Shandon Coverplates™, 72110013
Shandon Sequenza™ Slide Racks, 7331017
Shandon Pathcentre (Autotechnikon)
170
Anhang
Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Wärmeschränke Heraeus UT 6120 und B 6030
Vogel GmbH, Gießen, Deutschland
Histo-Comp® 56°C, VO-5-1002
9.3
Lösungen und Puffer
9.3.1
Histologie (Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung)
Luxol Fast Blue-Lösung
0,1 g
Luxol Fast Blue
100 ml
Ethanol, absolute
0,5 ml
Essigsäure 10%
Kresylechtviolett-Lösung
0,1 g
Kresylechtviolett
100 ml
Aqua dest.
kurz vor Gebrauch 5 Tropfen 10%ige Essigsäure auf 30 ml Lösung
0,05%ige Lithiumcarbonatlösung
Anhang
9.3.2
171
Immunhistologie
Natronlauge-Maßlösung (1 mol/l)
40 g
Natriumhydroxid (NaOH)
ad 1 l
Aqua dest.
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline; PBS)
40,00 g
Natriumchlorid (NaCl)
8,97 g
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 · H2O)
ad 5 l
Aqua dest.
mit Natronlauge-Maßlösung (1 mol/l) auf pH 7,1 einstellen
Zitratpuffer
2,1 g
Citronensäure-Monohydrat (C6H8O7 · H2O)
ad 1 l
Aqua dest.
mit Natronlauge-Maßlösung (1 mol/l) auf pH 6,0 einstellen
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Lösung
0,1 g
DAB
200 ml
PBS
200 μl
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30%
9.3.3
TUNEL-Methode (Peroxidase und Fluorescein KIT)
Aqua bidest.-DEPC
1 ml
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
ad 1000 ml Aqua bidest.
über Nacht rühren bis zur vollständigen Lösung
172
Anhang
Proteinase K-Stammlösung
100 mg
Proteinase K
2 ml
TRIS-HCl (1 mol/l, pH 8,0)
20 μl
Calciumchlorid (0,1 mol/l)
ad 10 ml
Auqa bidest.-DEPC
steriler Ansatz und Lagerung bei -20°C
Verdaupuffer
5 ml
TRIS-HCl (1 mol/l, pH 8,0)
10 ml
EDTA (0,5 mol/l, pH 8,0)
0,5 ml
Tween 20
ad 100 ml
Aqua bidest.-DEPC
Autoklavieren und Lagerung bei 4°C
Working Strength TdT-Solution
38 μl
Reaktions-Puffer
16 μl
TdT-Enzym
Working Strength Stop/Wash-Puffer
5 ml
Stop/Wash-Konzentrat
170 ml
Aqua dest.
anti-Digoxigenin-Fluorescein-Konjugat
68 μl
Blocking Solution
62 μl
anti-Digoxigenin-Konjugat
Anhang
173
9.4
p-Werte
Tabelle 4:
Auflistung der p-Werte
Gruppenvergleich
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
6
6
7
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
2
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
4
5
6
7
8
5
6
7
8
6
7
8
7
8
8
Staupe-NP
MBP
Nogo-A
GFAP
AQP-4
1,000
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,001
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,394
0,039
< 0,001
0,660
0,718
0,217
0,006
0,223
0,603
0,037
0,051
0,331
< 0,001
0,002
0,497
0,245
0,645
0,014
0,001
0,001
0,003
0,003
0,375
0,036
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,349
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,152
0,412
0,040
0,257
0,306
0,040
0,008
< 0,001
0,001
0,001
0,715
0,138
0,108
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,160
0,177
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,796
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,863
0,314
0,353
0,042
0,091
0,052
0,038
0,082
0,953
0,859
0,800
0,198
0,097
0,755
0,196
0,019
0,251
0,134
0,873
0,135
0,023
0,606
0,316
0,043
0,010
0,190
0,020
0,006
0,159
0,036
0,684
0,574
0,095
< 0,001
0,001
< 0,001
0,003
0,003
0,087
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,011
0,005
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,918
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,002
< 0,001
0,375
0,001
0,710
paarweiser Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test:
weiße Felder: p ≥ 0,05; hellgraue Felder: p < 0,05; dunkelgraue Felder: p < 0,001
Staupe-NP
MBP
Nogo-A
GFAP
AQP-4
Neuroparenchym
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,010
< 0,001
perivaskuläre
Infiltrate
0,963
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
Kruskal-Wallis Globaltest
weiße Felder: p ≥ 0,05; hellgraue Felder: p < 0,05; dunkelgraue Felder: p < 0,001
Staupe-NP = Staupevirus-Nukleoprotein; MBP = Myelin-basisches Protein; Nogo-A = neurite outgrowth inhibitor
protein A ; GFAP = glial fibrillary acidic protein ; AQP-4 = Aquaporin-4; n.d. = nicht durchgeführt
174
Anhang
Tabelle 5:
Auflistung der p-Werte
Gruppenvergleich
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
6
6
7
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
2
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
4
5
6
7
8
5
6
7
8
6
7
8
7
8
8
CD3
Foxp3
CD79α
BS-1
MAC 387
MHC-II
0,444
0,003
0,069
< 0,001
< 0,001
0,001
0,001
0,179
0,029
0,002
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,577
0,080
0,004
< 0,001
< 0,001
0,562
0,051
< 0,001
< 0,001
0,104
< 0,001
< 0,001
0,001
< 0,001
0,579
0,672
0,719
0,827
0,441
0,010
0,001
0,001
0,984
0,838
0,646
0,006
< 0,001
< 0,001
0,865
0,645
0,007
< 0,001
< 0,001
0,478
0,004
< 0,001
< 0,001
0,030
< 0,001
< 0,001
0,001
< 0,001
0,156
1,000
1,000
1,000
1,000
0,827
0,019
0,006
1,000
1,000
1,000
0,721
0,001
< 0,001
1,000
1,000
0,716
0,001
< 0,001
1,000
0,748
0,002
0,001
0,756
0,003
0,001
0,010
0,004
0,743
0,142
0,050
0,002
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,011
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,101
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,004
0,001
0,002
0,151
0,180
0,512
1,000
1,000
1,000
1,000
0,328
0,254
0,254
1,000
1,000
1,000
0,152
0,103
0,103
1,000
1,000
0,146
0,097
0,097
1,000
0,203
0,143
0,143
0,190
0,132
0,132
0,821
0,582
0,796
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,001
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,034
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,065
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,009
0,004
0,002
0,254
0,059
0,165
paarweiser Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test:
weiße Felder: p ≥ 0,05; hellgraue Felder: p < 0,05; dunkelgraue Felder: p < 0,001
CD3
Foxp3
CD79α
BS-1
MAC 387
MHC-II
Neuroparenchym
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,010
0,001
< 0,001
perivaskuläre
Infiltrate
0,821
0,462
0,480
0,597
-
1,000
Kruskal-Wallis Globaltest
weiße Felder: p ≥ 0,05; hellgraue Felder: p < 0,05; dunkelgraue Felder: p < 0,001
CD = cluster of differentiation ; Foxp3 = forkhead box P3 ; BS-1 = Bandeiraea simplicifolia-1 ; MAC 387 = myeloisch / histiozytäres
Antigen Klon MAC 387; MHC-II = major histocompatibility complex class II-antigen ; n.d. = nicht durchgeführt
Anhang
175
Tabelle 6:
Auflistung der p-Werte
Gruppenvergleich
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
6
6
7
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
und
2
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
4
5
6
7
8
5
6
7
8
6
7
8
7
8
8
Caspase-3
TUNEL
FAS
Bax
Bcl-2
Survivin
cIAP-2
0,168
0,008
0,005
< 0,001
< 0,001
0.001
0.001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,212
0,003
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0.217
0.016
0.010
< 0,001
0.347
0.197
0.005
0.974
0.025
0.105
0,160
0,186
0,040
0,019
0,005
0,003
0,003
0,008
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,122
0,024
0,018
0,025
< 0,001
0,573
0,349
0,315
0,014
0,545
0,779
0,054
0,930
0,126
0,097
0,849
0,879
0,724
0,065
0,001
< 0,001
< 0,001
0,689
0,414
0,020
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,734
0,098
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,442
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,001
0,003
0,956
0,119
0,780
0,441
0,090
< 0,001
0,001
0,001
0,264
0,041
0,002
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,251
0,005
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,065
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,023
0,002
0,001
0,080
0,107
0,631
0,395
0,275
0,827
0,827
0,009
0,679
0,953
0,922
0,574
0,357
< 0,001
0,071
0,115
0,680
0,251
0,001
0,077
0,097
0,606
0,051
0,132
0,173
0,091
0,282
0,349
0,821
1,000
1,000
0,800
0,275
0,027
< 0,001
< 0,001
0,002
0,001
0,151
0,008
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,080
0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,217
0,001
0,012
0,001
0,006
0,095
0,008
0,464
0,872
0,278
0,246
0,257
0,441
0,364
0,441
0,002
0,002
1,000
0,955
0,845
1,000
0,001
< 0,001
0,809
0,926
0,936
0,001
< 0,001
1,000
0,847
0,001
< 0,001
0,941
0,002
< 0,001
0,004
0,002
0,645
paarweiser Gruppenvergleich mittels Mann-Whitney U-Test:
weiße Felder: p ≥ 0,05; hellgraue Felder: p < 0,05; dunkelgraue Felder: p < 0,001
Caspase-3
TUNEL
FAS
Bax
Bcl-2
Survivin
cIAP-2
Neuroparenchym
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,028
< 0,001
< 0,001
perivaskuläre
Infiltrate
0,940
0,225
0,674
0,435
0,921
0,902
0,721
Kruskal-Wallis Globaltest
weiße Felder: p ≥ 0,05; hellgraue Felder: p < 0,05; dunkelgraue Felder: p < 0,001
TUNEL = terminal deoxynucleotidyl transferase [TdT]-mediated dUTP-digoxigenin nick-end labeling ; FAS = FAS-Rezeptor; Bax = Bcl-2 associated
protein X ; Bcl-2 = B-cell lymphoma 2 ; cIAP-2 = cellular inhibitor of apoptosis protein 2
176
9.5
Anhang
Abkürzungsverzeichnis
ABC
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
A. bidest.
Aqua bidestillata
A. dest.
Aqua destillata
APC
antigen presenting cell
AQP-4
Aquaporin-4
Bax
Bcl-2 associated protein X
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
BDNF
brain-derived neurotrophic factor
BH
Bcl-2 homology
BHS
Blut-Hirn-Schranke
BS-1
Bandeiraea simplicifolia-1
BSA
bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
ca.
circa
CCL22
C-C motif chemokine ligand 22
CD
cluster of differentiation
CD3
CD3-Antigen
CD79α
CD79α-Antigen
CDE
canine distemper encephalitis
CDV
canine distemper virus
CeMV
Cetacean morbillivirus
c-FLIP
cellular FLICE-inhibitory protein
cIAP-1/2
cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2
CSF
cerebrospinal fluid
CTLA-4
cytotoxic T-lymphocyte antigen-4
Cy3
Indocarbocyanin
Anhang
177
DAB
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DAPI
4’,6-Diamidin-2-phenylindil
DED
death effector domain;
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DISC
death-inducing signaling complex
DMV
dolphin morbillivirus
DNS
Desoxyribonukleinsäure
EAE
experimental autoimmune encephalomyelitis
EBE
Essigsäure-n-butylester
EDTA
Ethylendiamin-tetraessigsäure
Fa.
Firma
FADD
Fas-associated protein with death domain
FAS
Fas-Rezeptor (CD95)
FITC
Fluorescein Isothiocyanat
FIV
felines Immundefizienz-Virus
Foxp3
forkhead box P3
g
Gramm
GDNF
glial cell-derived neurotrophic factor
GFAP
glial fibrillary acidic protein
GITR
glucocorticoid-inducible tumor necrosis factor receptor
GME
granulomatöse Meningoenzephalitis
HCl
Salzsäure
HE
Hämatoxylin/Eosin
HIV
humanes Immundefizienz-Virus
HSV
Herpes simplex Virus
178
Anhang
IAP
inhibitor of apoptosis protein
ICOS
inducible T-cell costimulator
IDO
Indolamin-2,3-Dioxygenase
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IHC
Immunhistologie
IL
Interleukin
iNOS
inducible nitric oxide synthase
IPEX
immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked
syndrome
kDa
KiloDalton
l
Liter
LFB-KEV
Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett
MAC 387
myeloisch/histiozytäres Antigen Klon MAC 387
MAG
Myelin-assoziiertes Glykoprotein
MBP
Myelin-basisches Protein
MDCK cells
Madin-Darby canine kidney cells
MHC-II
major histocompatibility complex class II-antigen
MHV
Maushepatitis-Virus
ml
Milliliter
μl
Mikroliter
mRNS
messenger RNS
MS
Multiple Sklerose
MV
Masernvirus
n
Anzahl
N.
Nervus
NaCl
Natriumchlorid
Anhang
179
NaOH
Natriumhydroxid
NAIP
neuronal apotosis inhibitory protein
n.b.
nicht bekannt
n.d.
nicht durchgeführt
NME
nekrotisierende Meningoenzephalitis
NMO
Neuromyelitis optica
NOX2
NADPH oxidase 2
NP
Nukleoprotein
Nr.
Nummer
o.a.
oben angeführten
ORF
open reading frame
p.a.
pro analysi
PBS
phosphate buffered saline
PCR
polymerase chain reaction
PDV
phocine distemper virus
p.i.
post infectionem
PLP
Proteolipid-Protein
PPRV
Peste-des-petits-ruminants virus
PWMW
Pilot whale morbillivirus
RNA
ribonucleid acid
RNS
Ribonukleinsäure
ROI
region of interest
ROS
reactive oxygen species
RPV
Rinderpest-Virus
s.
siehe
SLAM
signalling lymphocyte activation molecule
s.o.
siehe oben
180
Anhang
TCR
T-cell receptor
Teff
T-Effektorzellen
TGF-ß
transforming growth factor-ß
Th1/2/17
T-helper cells type 1/2/17
TMEV
Theiler’s murine encephalomyelitis virus
TNF
tumor necrosis factor
TUNEL
terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTPdigoxigenin nick-end labeling
UTR
untranslated region
vWF
von Willebrand-Faktor
XIAP
X-linked inhibitor of apoptosis protein
z.B.
zum Beispiel
ZF
Zählfeld
ZNS
zentrales Nervensystem
z.T.
zum Teil
Danksagung
10
181
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Andreas Beineke für die Überlassung und
Betreuung des Themas und damit für die einmalige Erfahrung an einem solchen
Schaffungsprozess. Er hat mich konsequent und unermüdlich über diesen langen
Zeitraum auch durch schwierige Phasen begleitet und mir jederzeit geduldig und
hilfsbereit zur Seite gestanden. Sein Engagement und seine besondere Gelassenheit
gaben mir immer die Zuversicht, auf dem richtigen Weg zu sein.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner gilt ebenfalls ein besonderer Dank für die
hervorragende wissenschaftliche Beratung auf den Gebieten der Neuropathologie
und Hundestaupe. Es bleiben auch die guten Gespräche und die stete Erinnerung
daran, seinen beruflichen und persönlichen Lebensweg nicht aus den Augen zu
verlieren.
Bei Frauke, Christina und Stephi möchte ich mich für die Hilfe bei der Einarbeitung in
die
Thematik
und
der
Sichtung
bzw.
Bereitstellung
des
umfangreichen
Probenmaterials bedanken.
Prof. David Driemeier und Dr. Juan Alberto Morales haben mir freundlicherweise
Gewebeproben für diese Studie überlassen.
Petra, Bettina, Claudia, Danuta und Julia waren mir eine wichtige und kompetente
Hilfe beim Einstieg in die Labortätigkeiten.
Dr. Karl Rohn gilt mein Dank für die Hilfestellung bei der Statistik.
Der DFG Forschergruppe 1103 einen Dank für die Unterstützung dieses Projekts.
182
Danksagung
Meine vielen lieben Kollegen am Institut für Pathologie haben in dieser Zeit eine
unvergessliche, persönliche und familiäre Atmosphäre geschaffen. Diese Arbeit ist
auch Ausdruck und Ergebnis der vielen kleinen, tagtäglichen, (vielleicht auch)
unbewussten, so wichtigen gegenseitigen Hilfestellungen. An dieser Stelle seien
besonders Vanessa und Florian, Annika, Johannes, Susi und Ingo erwähnt.
Liebe Vanne,
ich danke Dir für unser tolles Büro!
Björn, Marcel, Basti und Thomas! Vielen Dank für Eure Unterstützung fernab des
Geschehens.
Meinen Eltern und Geschwistern, daheim oder in gefühlter Nähe, und meiner Oma
Putte danke ich für Ihre Unterstützung und ihr Verständnis sowie den Glauben an
mich und an ein gutes Gelingen.
Es ist schön, dass ich am Ende meine Freude teilen darf. Für manche Dinge gibt es
dann keine Worte mehr.
Hannover 2013
Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Pathologie
ISBN 978-3-86345-155-4
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH
35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de
Hermann Maximilian Iseringhausen
Die demyelinisierende kanine Staupeenzephalitis:
Charakterisierung immunpathologischer Prozesse
unter besonderer Berücksichtigung
regulatorischer T-Zellen und der Apoptose
Hermann Maximilian Iseringhausen
Hannover 2013