Rekonstruktion der Genom-Evolution im Labor Reconstruction of

Jahrbuch 2006/2007 | Bock, Ralph | Rekonstruktion der Genom-Evolution im Labor
Rekonstruktion der Genom-Evolution im Labor
Reconstruction of genome evolution in the laboratory
Bock, Ralph
Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam-Golm
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Tierische und pflanzliche Zellen besitzen nicht nur einen Zellkern, in dem das Erbgut lokalisiert ist, sondern
darüber hinaus auch Zellorganellen, die gleichfalls Gene enthalten. Im Verlauf der Evolution w anderten
zahlreiche Gene aus diesen Organellen in den Kern ein und mussten sich an ihre neue Umgebung anpassen,
um funktionsfähig zu w erden. Durch neue Techniken und Selektionsverfahren ist es gelungen, diese Prozesse
bei Pflanzen im Labor nachzuvollziehen und experimentell zu untersuchen.
Summary
The transfer of genes from organelles to the nucleus and the conversion of such prokaryotic genes into
functional eukaryotic genes occur only on large evolutionary timescale and thus have escaped rigorous
experimental analysis. The design of stringent selection schemes for gene transfer from the plastid to the
plant’s nuclear genome has now made it possible to reproduce such extremely rare events in the laboratory.
Pflanzenzellen besitzen insgesamt drei Genome: ein großes im Zellkern und zw ei deutlich kleinere in den
Mitochondrien
und
Plastiden
(Chloroplasten). Mitochondrien
und
Plastiden
haben
eine
faszinierende
Entstehungsgeschichte. Sie stammen von ursprünglich selbständigen Lebew esen ab, die vermutlich vor über
einer Milliarde Jahren von einer so genannten präeukaryotischen (eukaryotisch = mit Zellkern) Vorläuferzelle
verschluckt, aber nicht verdaut w urden: Zunächst w urde ein Proteobakterium von einer Einstülpung der
Zellmembran umschlossen und schließlich vollständig in das Innere, das Protoplasma der präeukaryotischen
W irtszelle aufgenommen. Die W irtszelle hat das verschluckte Proteobakterium dann kompromisslos versklavt:
Das Bakterium verlor seine Unabhängigkeit, w urde zum Mitochondrium umfunktioniert und diente fortan seiner
W irtszelle zur Energiegew innung durch Atmung. Diesen Zelltyp mit zw ei Genomen (im Zellkern und in den
Mitochondrien) finden w ir heute in allen Tieren und Pilzen. Bei der Entstehung der Pflanzenzelle w iederholte
sich die Versklavung eines Bakteriums, die auch als Endosymbiose bezeichnet w ird, ein w eiteres Mal (Abb.1).
Nun w urde ein Cyanobakterium (eine Blaualge, die bereits zur Photosynthese befähigt w ar, also Lichtenergie
in chemische Energie umw andeln konnte) aufgenommen und zum zw eiten Typ DNA-haltiger Zellorganellen,
den Plastiden, umfunktioniert. Plastiden und Mitochondrien sind aufgrund dieser Entstehungsgeschichte von
zw ei Membranen umschlossen: die äußere stammt von der W irtszelle, die innere vom aufgenommenen
Bakterium.
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Entste hung de r P fla nze nze lle und ihre r DNA-ha ltige n
O rga ne lle n, de r Mitochondrie n (rot) und C hloropla ste n (grün)
Vorlä ufe r de r O rga ne lle n wa re n fre ile be nde Ba k te rie n, die von
e ine r „Urze lle “ (=prä e uk a ryotische Ze lle ) um schlosse n
wurde n. Auf die se W e ise sind a us so ge na nnte n
P rote oba k te rie n die für die Atm ung zustä ndige n Mitochondrie n
e ntsta nde n und a us C ya noba k te rie n (Bla ua lge n) die für die
P hotosynthe se ve ra ntwortliche n C hloropla ste n. Die P fe ile
inne rha lb de r Ze lle n ve rde utliche n R ichtung und Um fa ng de s
Ge ntra nsfe rs zwische n de n Ge nom e n de r P fla nze nze lle :
R ie sige Me nge n ge ne tische r Inform a tion wurde n im Ve rla uf
de r Evolution a us de n P la stide n- und Mitochondrie nge nom e n
in da s Ke rnge nom übe rtra ge n, k le ine re Me nge n a n
Inform a tion a uch a us de n P la stide n in die Mitochondrie n sowie
a us de m Ze llk e rn in die Mitochondrie n.
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Nach der Endosymbiose erfolgte im Zuge der allmählichen Umw andlung der aufgenommenen Bakterien in
Zellorganellen eine hochgradig komplexe genetische Umstrukturierung aller beteiligten Genome. Eine
gew altige Menge an bakteriellen (prokaryotischen) Genen w urde im Verlauf der Evolution aus den Genomen
der aufgenommenen Bakterien in das Kerngenom der W irtszelle transferiert (Abb. 1). Dies hat dazu geführt,
dass die Organellengenome heute nur noch einige Dutzend Gene enthalten, obw ohl die Bakterien, aus denen
sie hervorgegangen sind, vermutlich mindestens ein paar Tausend Gene besaßen [1, 2]. Indirekte Hinw eise
auf
diesen
Gentransfer
aus
den
Mitochondrien- und
Plastidengenomen
in
das
Kerngenom haben
Sequenzähnlichkeiten zw ischen Kerngenen und Genen aus Proteobakterien bzw . Cyanobakterien geliefert.
Auch gibt es einige Fälle von offensichtlich erst vor relativ kurzer Zeit transferierten Genen. Solche Gene liegen
bei einigen Pflanzenarten noch in den Organellen vor, w ährend sie bei anderen Arten aber bereits im
Kerngenom zu finden sind [2].
W ie kann ein Gen aus dem von zw ei Membranen umschlossenen Plastiden- oder Mitochondriengenom in das
Kerngenom gelangen? Da die Übertragung tausender Gene aus den Organellen in den Kern offenbar in
riesigen evolutionären Zeiträumen ablief und demzufolge niemand jemals ein solches Ereignis beobachten
konnte, entzog sich diese Frage bislang einem experimentellen Zugang. Die Entw icklung neuer Technologien,
die es erlauben, Plastidengenome höherer Pflanzen gentechnisch zu verändern [3, 4, 5], hat es in den letzten
Jahren ermöglicht, w ichtige Schritte dieses evolutionären Prozesses im Labor nachzuvollziehen und die
molekularen Grundlagen des Gentransfers zw ischen Organellen- und Kerngenomen zu analysieren.
Gentransfer im Zeitraffer
In einem Schlüsselexperiment zur Rekonstruktion des Gentransfers im Labor w urden Chloroplastengenome in
der Modellpflanze Tabak gentechnisch verändert, indem zw ei zusätzliche Gene eingebracht w urden. W ährend
eins der beiden Gene, aadA genannt, für das Chloroplastengenom maßgeschneidert ist durch seine bakterielle
(prokaryotische) Genstruktur und eine Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin vermittelt, ist das
zw eite Gen, nptII, für den Zellkern konstruiert w orden (eukaryotische Genstruktur) und verleiht den Pflanzen,
im Kern platziert, eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin (Abb.2).
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R e k onstruk tion de s Ge ntra nsfe rs a us de m
C hloropla ste nge nom in da s Ke rnge nom Mitte ls
C hloropla ste ntra nsform a tion we rde n zwe i Ge ne für
Antibiotik a re siste nze n in da s P la stide nge nom von
Ta ba k pfla nze n e inge fügt: e in Spe ctinom ycin-R e siste nzge n
(a a dA), da s pla stidä re Ex pre ssionssigna le be sitzt (de n
P la stide nprom otor P rrn und de n P la stide nte rm ina tor P psbA)
sowie e in Ka na m ycin-R e siste nzge n (nptII), da s übe r nuk le ä re
Ex pre ssionssigna le ve rfügt (P rom otor und Te rm ina tor de s
35S-Ge ns a us de m P fla nze nvirus C a MV). psa B, rps14, trnG
und ycf9 sind be na chba rte Ge ne im P la stide nge nom .
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Im Chloroplasten ist nptII dagegen nicht aktiv. Pflanzen mit transgenen Plastidengenomen sind demzufolge
zw ar resistent gegen Spectinomycin, reagieren aber empfindlich auf Kanamycin. Wenn Zellen dieser Pflanzen
in einem Gew ebekultursystem einer Selektion auf Kanamycinresistenz ausgesetzt w erden, so sollten nur
solche Zelle überleben können, die das nptII-Gen aus dem Plastidengenom in das Kerngenom verschoben
haben (Abb.3).
Se le k tion a uf Ge ntra nsfe r a us de m C hloropla ste nge nom in
da s Ke rnge nom Die e rze ugte n tra nspla stom ische n P fla nze n
sind re siste nt ge ge n Spe ctinom ycin, a be r nicht ge ge n
Ka na m ycin, da die nuk le ä re n Ex pre ssionssigna le im
P la stide nge nom nicht a bge le se n we rde n k önne n. W e nn da s
Ka na m ycin-R e siste nzge n je doch in de n Ze llk e rn springt, wird
e s dort a bge le se n und e rla ubt W a chstum de r P fla nze nze lle n
in Ge ge nwa rt von Ka na m ycin.
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Mit dieser experimentellen Strategie gelang es in der Tat, Pflanzen zu selektieren, die das nptII-Gen in den
Zellkern transferiert hatten [6]. Genetische und molekulare Untersuchungen bestätigten, dass das Gen im
Kerngenom angekommen w ar: Die Kanamycinresistenz w urde nach den Mendel'schen Regeln vererbt
(w ährend Chloroplastengene mütterlich vererbt w erden) und die DNA des nptII-Gens konnte im Genom des
Zellkerns nachgew iesen w erden. Erstaunlich hoch w ar die Frequenz, mit der ein solcher Gentransfer aus dem
Chloroplasten in den Zellkern detektiert w urde: In ungefähr einer von 5 Millionen Zellen w ar das nptII-Gen in
den Zellkern gesprungen [6] (Abb.4).
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Se le k tion von Ge ntra nsfe r-Ere ignisse n in tra nspla stom ische n
P fla nze n Be i Zuga be von Ka na m ycin zum Kulturm e dium
e rsche ine n die k a na m ycinre siste nte n Ze lllinie n e ntwe de r a ls
k le ine grüne Ze llha ufe n (sog. C a lli, rote r P fe il link s) ode r a ls
re ge ne rie re nde Sprosse (re chts). Da s um ge be nde ble iche
Ge we be stirbt a ufgrund se ine r Em pfindlichk e it ge ge n
Ka na m ycin a b.
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Worin bestehen die Konsequenzen einer solch hohen Rate an Gentransfer zw ischen den Organellen und dem
Zellkern? Zum einen verändern die Befunde unser Verständnis von genetischer Homogenität innerhalb einer
Art und innerhalb eines Organismus. Dies w ird offensichtlich, w enn man sich klarmacht, dass zum Beispiel ein
Tabakblatt aus w esentlich mehr als fünf Millionen Zellen besteht. Die Zellen in ein und demselben Blatt einer
Pflanze sind folglich nicht notw endigerw eise genetisch identisch, sondern können sich im Muster der in das
Kerngenom transferierten Organellensequenzen unterscheiden. Eine w eitere interessante Konsequenz ergibt
sich aus dem zufälligen Einbauort transferierter Organellengene im Kerngenom. Mit einer gew issen
Wahrscheinlichkeit kann der Einbau in ein Gen des Kerngenoms erfolgen und dieses damit zerstören. Somit
könnte der Transfer von Organellen-DNA in den Zellkern auch zum spontanen Auftreten von Mutationen (so
genannten „somatischen Mutationen“) beitragen.
Wie werden transferierte Gene aktiv?
Die Übertragung eines Gens aus den Plastiden in den Kern führt zunächst nicht zu einem neuen
funktionsfähigen Kerngen. W ie am Beispiel der beiden Resistenzgene aadA und nptII erläutert, liegt dies
daran, dass sich Plastidengene und Kerngene fundamental in ihrer Struktur unterscheiden: Ein Plastidengen
hat eine bakterielle (prokaryotische) Genstruktur und kann daher nicht im Zellkern funktionieren, w o die Gene
eine eukaryotische Genstruktur aufw eisen. Im oben beschriebenen Schlüsselexperiment w urde dieses
Problem umgangen, indem das nptII-Gen mit eukaryotischen Expressionssignalen (Promotor und Terminator;
Abb. 2) versehen w urde und so direkt nach seinem Transfer aus dem Plastiden- in das Kerngenom aktiv sein
konnte. Beim evolutionären Gentransfer w äre dies nicht der Fall: Das Gen w ürde im Zellkern ankommen und
könnte nicht abgelesen w erden, d.h. nicht in eine Boten-RNA übersetzt w erden. W ie kann aus einem solchen
inaktiven ehemaligen Chloroplastengen ein funktionsfähiges Kerngen w erden?
Diese Frage w urde einer experimentellen Analyse zugänglich, als es gelang, Pflanzenlinien zu isolieren, die ein
so großes Stück Plastiden-DNA in den Kern übertragen hatten, dass darauf nicht nur das KanamycinResistenzgen nptII, sondern auch das benachbarte Spectinomycin-Resistenzgen aadA lag (Abb. 2). Das aadAGen liefert nun genau das geeignete Untersuchungsobjekt: Es ist ein prokaryotisches Gen (mit einem
Plastidenpromotor und -terminator) und ist im Zellkern nicht aktiv. Folglich sind die Gentransferpflanzen mit
dem aadA-Gen im Zellkern empfindlich gegen das Antibiotikum Spectinomycin. In einem w eiteren groß
angelegten Selektionsexperiment w urde nun untersucht, ob und w ie dieses inaktive aadA-Gen im Kern
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angelegten Selektionsexperiment w urde nun untersucht, ob und w ie dieses inaktive aadA-Gen im Kern
funktionsfähig w erden kann. Dazu w urden Zellen einer Selektion auf spectinomycinhaltigem Kulturmedium
ausgesetzt. Auf diese Weise gelang es tatsächlich, Pflanzen zu erhalten, in denen das aadA-Gen im Zellkern
aktiv gew orden w ar [7].
Als nächstes galt es nun, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die zur Aktivierung des aadA-Gens
geführt hatten. Dabei stellte sich heraus, dass in allen acht selektierten Pflanzenlinien sehr ähnliche Vorgänge
an der Genaktivierung beteiligt w aren. In allen Fällen w ar es dem aadA-Gen gelungen, durch relativ einfache
Mutationen (sog. Deletionen), den Promotor des benachbarten Kerngens „einzufangen“ und nun für seine
eigene Expression zu nutzen. Erstaunlicherw eise reichte dieser eine molekulare Umbau aus, um das Gen im
Zellkern funktionsfähig zu machen. Ähnliche Veränderungen im Terminatorbereich des Gens w aren nicht
nachw eisbar. Tatsächlich ergab eine Analyse der aadA Boten-RNA, dass der Plastidenterminator von der
Genexpressionsmaschinerie des Zellkerns benutzt w erden konnte, obw ohl die molekularen Mechanismen zum
Stoppen des Ablesevorgangs im Zellkern völlig anders sind als im Chloroplasten [7].
Diese Experimente haben erste Einsichten in die molekularen Prozesse geliefert, die die Genome der
eukaryotischen Zelle seit ihrer Geburt vor mehr als einer Milliarde Jahren geformt haben. Mit neuen Methoden
und gentechnischen Verfahren ist es nun möglich, diese Prozesse im Labor in einem Zeitraum von nur w enigen
Jahren ablaufen zu lassen. Das eröffnet die aufregende Perspektive, Vorgänge, die normalerw eise nur in
riesigen evolutionären Zeiträumen ablaufen, im Zeitraffer experimentell nachzuvollziehen und die zugrunde
liegenden Mechanismen aufzuklären.
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