Use of the anti-Prelog stereospecific alcohol dehydrogenase from

Use of the anti-Prelog stereospecific alcohol dehydrogenase
from Leifsonia and Pseudomonas for producing chiral
alcohols
Mini-Review (2014) by Nobuya Itoh
Die Herstellung chiraler Alkohole als Bausteine für die Synthese von Feinchemikalien, Pharmazeutika,
sowie für die Agrarwirtschaft, als auch für die Lebensmittelindustrie im Bereich der
Geschmacksstoffe und Aromen, gewinnt immer mehr an Bedeutung in der chemischen Industrie.
Seit Jahren nun hat sich die Produktion chiraler Alkohole auf enzymatischem Weg mittels
Alkoholdehydrogenasen etabliert, zumal aus ökologischen als auch aus stereoselektiven Gründen.
Alkoholdehydrogenasen kommen in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen vor und sind
verantwortlich für u.a. die Energieversorgung, Gärungsprozesse, oxidative Abbauprozesse der
Zellabwehrfunktion und assimilatorische und disimilatorische Stoffwechselwege.
Die Alkoholdehydrogenase gehört zur 1.Enzymklasse der Oxidoreduktasen und katalysiert einen
Hydridtransfer. Sie ist abhänging von Coenzymen wie NADH/NADPH und katalysiert die Reduktion
prochiraler Ketone/Aldehyde/Ester in ihre entsprechenden Alkohole.
Abb.1: Allgemeiner Reaktionsmechanismus der Alkoholdehydrogenase
Alkoholdehydrogenasen lassen sich in verschieden Enzymunterfamilien, je nach Länge ihrer
Aminosäuresequenz, einteilen, wobei die meisten Alkoholdehydrogenasen der Unterfamilie der SDRs
angehören:
1. LDR (long chain deyhdrogenase/reductase)
>400 Aa
2. MDR (medium chain dehydrogenase/reductase)
350-400 Aa
3. SDR (short chain dehydrogenase/reductase)
<350 Aa
Alkoholdehydrogenasen können (R)-oder (S)-spezifisch sein, abhängig davon, ob das übertragene
Hydridion an der Si-Seite bzw. an der Re-Seite das prochirale Keton angreift. Bei Übertragung des
Hydridions von der Re-Seite entsteht ein chiraler-Prelog-Alkohol, bei Angriff von der Si-Seite
dementsprechend ein chiraler-Anti-Prelog-Alkohol.
Die meisten Keton-reduzierenden Alkoholdeyhdrogenasen entsprechen der Prelog-Regel und
kataysieren chirale Alkohole mit Prelog Konfiguration, es gibt jedoch auch Ausnahmen, wie
beispielsweise die Alkoholdeyhdrogenasen aus Leifsonia und Pseudomonas, welche Gegenstand des
Papers waren. Anti-Prelog chirale Alkohole kommen in der Natur sehr selten vor und sind in der
Pharma-Industrie von besonderem Interesse.
Trotz der hohen Enantio-und Regioselektivität der Alkoholdehydrogenasen, weisen diese einige
Limitationen auf. Zum einen sind ADH-katalysierte Reaktionen, aufgrund ihrer selektiven
Biotransformation und des daraus resultierenden geringen Substratspektrums und geringer Aktivität,
begrenzt einsetzbar. Zum anderen sind ADH auf teure Coenzyme wie NAD(P)H angewiesen. Lösung
für letzteres sind sogenannte Regenerationssysteme, in denen das Coenzym auf zwei verschiedenen
Wegen (Coupled-Substrate-Recycling bzw. Coupled-System-Recycling) regeneriert werden kann.
Um ein Enzym nun auf die vorher genannten Aspekte wie beispielsweise Substratspektrum, Aktivität
und Stabilität hin zu optimieren bzw. neuartige Enzyme zu identifizieren, stehen generell drei
Methoden zur Verfügung. Zunächst können Proben aus der Natur (Boden etc.) gewonnen werden,
zweitens existiert die Möglichkeit des Enzyme engineering und zuletzt die Möglichkeit der Erstellung
von Metagenom Banken. Zwei von den genannten Methoden werden nachfolgend näher
beschrieben.
Zunächst wurde in dem Mini-Review beschrieben, wie man mittels Probenentnahme aus der Natur
bestrebt war, eine neuartige
Alkohol-Deyhdrogenase zu isolieren, welche anti-PrelogStereoselektivität besaß und ein anti-Prelog-Alkohol produziert. Dazu wurden Mikroorganismen einer
Bodenprobe auf mineralhaltigem Medium mit Styrol kultiviert und auf ihr Überleben gescreent.
Alkohol Dehydrogenasen (ADH) können vom Organismus aufgenommene Stoffe aus der Umgebung,
wie in diesem Experiment Styrol (=3-Fluormethylketon) aufnehmen und für den Energiestoffwechsel
nutzen. Organismen, die auf den Styrol-haltigen Agarplatten überlebt haben, waren in der Lage Styrol
zu verstoffwechseln und in PTE umzuwandeln, um dieses für den Energiestoffwechsel zu nutzen. PTE
ist ein anti-Prelog-Alkohol und konnte somit nur von denjenigen Organismen synthetisiert werden,
welche die dementsprechende Anti-Prelog-Alkoholdehydrogenase verfügten.
Im Anschluss wurde die molare Ausbeute des entstanden Anti-Prelog-Alkohols mittels
Gaschromatographie gemessen und gegen die optische Reinheit der beiden Enantiomerformen
aufgetragen. Es hat sich ergeben, dass das koryneforme gram-positive Bakterium Leifsonia des
Stammes S749 die effizienteste Alkoholdehydrogenase mit der höchsten Ausbeute an PTE und
optischer Reinheit des S-Enantiomers (Anti-Prelog Alkohol) besaß. Somit war durch einfache
Probenentnahme aus der Natur und anschließendem Screening auf einem Selektionsmedium
möglich einen neuen Kandidaten zu identifizieren.
Die in dem Mini-Review zweite beschriebene Methode, um Alkoholdehydrogenasen mit optimierten
Enzymeigenschaften zu identifizieren, war die Erstellung von metagenomischen Bibliotheken. Dazu
wurden 17 Bodenproben aus verschiedenen Regionen Japans genommen und das darin enthaltene
Metagenom isoliert. Bei der Erstellung der metagenomischen Bibliothek konnte festgestellt werden,
das die Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas der ADH aus Leifsonia in ihren Eigenschaften sehr
ähnlich war und diese sich im phylogentischen Stammbaum nahe zueinander befanden.
Im Anschluss daran, wurden die in Pseudomonas insgesamt enhaltenen 16 AlkoholdehydrogenaseGene (HBADH/HPADH) mittels spezifischer Primer in einer PCR amplifiziert, um diese dann in E.coli zu
klonieren und auf ihre Substratspezifität hin zu testen. Es hat sich ergeben, dass alle
Alkoholdehydrogenasen der Gattung Pseudomonas relativ unterschiedliche Substratspezifitäten
gegenüber verschiedenen Substratklassen wie Aldehyde, Ketone und Ester aufwiesen und ein
potentielles Ziel für die Optimierung des Substratspektrums darstellen.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Screenen von Mikroorganismen aus Böden
heute noch eine nützliche und wichtige Methode darstellt, um neuartige Enzyme wie
Alkoholdehydrogenasen zu identifizieren. Es hat sich gezeigt, dass SDR-Alkoholdehydrogenasen in
der Natur reichlich vorhanden sind und sie ein potentielles Ziel für das Enzyme Engineering sind, um
bestimmte Enzymeigenschaften wie Stabilität und Substratspektrum zu optimieren. Darüber hinaus
können mittels metagenomischer Bibliotheken erfolgreich neuartige Alkoholdehydrogenasen isoliert
und identifiziert werden. Um die Enzymstabilität zu erhöhen ist es einfacher eine EnzymImmobilisierung durchzuführen, als das entsprechende Enzym an bestimmten Stellen genetisch zu
verändern. Die Kombination aus bestimmten Enzymoptimierungs-Methoden ist nötig und
wünschenswert, um verbesserte Eigenschaften einer Alkoholdehydrogenase zu entwickeln.