Vorlesung Bakterielle Sekretion
Werbung
Proteinsekretion & Membranproteinsynthese in Bakterien" 1 2 Proteinsekretion & Membranprotein- synthese in Bakterien, Brock Kap 6:" 1 2 Membranproteinbiogenese und Proteinsekretion in Bakterien" 1 2 3 4 1. Insertion in die Innere Membrane (IM)" 2. Transport ins Periplasma" 3. Insertion in die äussere Membran" 4. Export aus der Zelle" E. coli: Proteinexport ins Periplasma" Faktoren für gerichteten Transport und Translokation" P" Vorraussetzung für Proteintransport über die innere Membran Signalsequenz! zytosolische Chaperone (SecB, SRP)" Translokationsmotor (SecA, Ribosom)! Translokationskanal (SecYEG) ! [Chaperone und modifizierende Enzyme im" Periplasma]! Signalsequenzen + + Signalsequenz" kein " Glu, Asp," Lys, Arg." kein Pro " " aa mit kurzen" kein Pro " Seitenketten" " " Consensus" • in sekretorischen Proteinen" • durchschnittlich15 - 30 aa; hydrophober Kern & " netto-positive Ladung am N-Terminus" • i.A. am N-Terminus von Proteinen" • meist während oder nach der Translokation abgespalten durch Signal-Peptidase" • Spaltstelle bestimmt durch aa an Positionen -3 and -1 Sec-abhängiger Proteintransport durch die innere Membran von Bakterien 1. Schritt: Targeting (gerichteter Transport zur ! ! Membran)" ! Signalsequenz! ! 2 Formen der Translokation! ! 1. Sec B /SecA/ATP, posttranslational, für lösliche sekretorische Proteine! ! SecB “targeting“ Chaperon" SecA Translokationsmotor (ATPase)! 2. SRP/SRP receptor (SR), cotranslational, für Membranproteine" E.coli SRP besteht aus ! Ffh: fifty four homolog (GTPase) / 4.5S RNA" FtsY = SRP Rezeptor! Hydrophobizität der Signalsequenz bestimmt targeting durch SecB oder SRP Chaperon Definition:" Ein Molekül (muss kein Protein sein), das unerwünschte Interaktionen zwischen Proteinen und dadurch Aggregation verhindert und Proteinfaltung vorantreibt." " SecB/SecA-abhängige Translokation von sekretorischen Proteinen • SecB: homotetrameres zytoplasmatisches Chaperon; erhält sekretorische Proteine translokationskompetent" • sekretorische Protein/Sec B-Komplexe induzieren ATP-Bindung an Sec A" • SecA/ATP bindet ans Translocon (SecYEG), ändert dessen Konformation und inseriert z. T. selbst" • bei ATP-Hydrolyse zieht sich SecA aus dem Translokationskanal zurück" " SecB und SecA gibt es nur in Bakterien" SecA Zyklus " SPase Pollard and Earnshaw, Cell Biology " SecA Konformationsänderung" Ruhezustand" an SecYEG" gebunden" Collinson et al., 2015" SecA Konformationsänderung" - SecA-ATP mit sekretorischem Protein" (blau) bindet an SecYEG" " - PPXD Domäne (braun) faltet sich " das sekretorische Protein und klemmt" es fest" " - die HF-Domäne schiebt sich in den " Eingang des SecYEG Kanals" " - die Bewegung der PPXD Domäne löst" ATP-Hydrolyse durch die Nukleotid-" bindedomänen aus" Collinson et al., 2015" Zwei Modelle des SecAgetriebenen Proteintransports:" Collinson et al., 2015" Zwei Modelle des SecA-getriebenen Proteintransports: Powerstroke" die Bewegung der kleinen HF-Domäne " ins Vestibül des SecYEG Kanals ist zu" gering, um die Bewegung von 25-50 aa" pro ATP-Hydrolyse durch den Kanal zu" erklären" " späte Phase der Translokation ist" PMF-abhängig; mit diesem Modell" schwer zu erklären" ursprünglich wurde angenommen, dass sich ein wesentlich " grösserer Teil von SecA in den Kanal schiebt, weil ein grosser" Teil des Proteins bei Kanalbindung protease-resistent wird" Collinson et al., 2015" SecA Cycle " SPase Pollard and Earnshaw, Cell Biology " Zwei Modelle des SecA-getriebenen Proteintransports: ratcheted diffusion" - Diffusion ist schneller als powerstroke" - braucht keine spezifische Sequenz" - kann die PMF-Abhängigkeit besser " erklären" Geschwindigkeit passt besser zu den zellulären Anforderungen:" ca 1 Protein pro SecYEG Kanal pro Sekunde" " Zurückrutschen im Kanal verhindert durch PPXD-Klemme in SecA?" Collinson et al., 2015" E. coli SRP & SRP receptor SRP= signal recognition particle" " required for targeting of most large membrane proteins" ! SRP consists of Ffh (fifty four homolog) & 4.5S RNA! " SRP receptor FtsY = docking site for E.coli SRP/ ribosome/nascent chain complexes at the plasma membrane" E. coli: Proteinexport ins Periplasma" Faktoren für gerichteten Transport und Translokation" P" : für Membranproteine" Beispiel: SRP-abhängige Insertion der Lac Permease in die innere Membran Cytosol" Periplasm" SRP Targeting Systeme... Mammalian Archaeal Bacterial 9 14 SRP 72 68 54 19 Mammalian SR SRα 54 48 19 Archaeal & Bacterial FtsY SRβ Entscheidung fällt am Ribosom: co- oder posttranslationaler Transport hydrophobe Signalsequenz/transmembrane Domäne" weniger hydrophobe Signalsequenz " SRP – signal recognition particle" MAP – methionine aminopeptidase" PDF – peptide deformylase Gloge et al. Curr Opinion Struct Biology., 2014" Proteine ohne Signalsequenz bleiben im Zytosol und falten dort SRP – signal recognition particle" MAP – methionine aminopeptidase" PDF – peptide deformylase Gloge et al. Curr Opinion Struct Biology., 2014" Seminar, heute, 17:15 hier The busy life of nascent chains: cotranslational folding, " membrane targeting, and assembly of proteins" " " Prof. Bernd Bukau, ZMBH Universität Heidelberg Der Proteintranslokationskomplex oder das ʻTransloconʼ • der bakterielle Proteintranslokationskanal besteht aus 3 Proteinen: SecY, SecE, SecG" • SecYEG bildet eine Pore, die sich lateral zur Lipiddoppelschicht und transversal (durch die Membran öffnen kann" • die Translocon-Untereinheiten sind hochkonserviert und bilden in Säugern einen Kanal in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (Sec61 α,β,γ in Metazoa; Sec61 Kanal)" Translocon" Struktur & Öffnung SecYEG(αβγ) Rapoport et al. TICB, 2004 Translocon opening Collinson et al. Royal Soc Trans., 2015" SecA-Bindung öffnet den SecYEG Kanal zu Translocon opening offen Collinson et al. Royal Soc Trans., 2015" MBOC 4th ed. Translokation löslicher Proteine Membranproteinintegration Membrandomänen verlassen SecYEG lateral und integrieren in die Lipiddoppelschicht Collinson et al. Royal Soc Trans., 2015" Insertion von Proteinen mit mehreren Transmembrandomänen" Ladungsverteilung (positiv im Zytosol!) um die erste " Transmembrandomäne bestimmt Orientierung des gesamten Proteins!" Comparison of Sec and Tat pathways in E. coli Robinson, Nat. Rev. 2001" Beispiel: SRP-abhängige Insertion der Lac Permease in die innere Membran Cytosol" Periplasm" E. coli twin arginine translocation (Tat) System" - das E. coli Tat-System besteht aus den Membranproteinen " TatA, TatB und TatC " " - der TatBC-Komplex erkennt das twin-arginine Signalpeptid " und bindet Substrate an die Membran" " - TatA Oligomere bilden einen sehr grossen Ring in der " Membran, der vermutlich den Proteintransportkanal darstellt" " - Transport ist abhängig von der PMF und der Faltung der" Substratproteine!" - nicht essentiell in den meisten Organismen; nicht ubiquitär" Tat-abhängige Translokation • Tat-Signalpeptide vermitteln Transport gefalteter Proteine ins Periplasma" • ähneln Sec-Signalpeptiden" • wichtig: RR, XFLK" • weniger hydrophob als Sec-Signalpeptide Der Tat-Translokationszyklus" TatA" TatB, TatC! Leader! peptidase" Berks et al. Curr. Op. Mic. 2005" Strukturen der Tat Proteine sind bekannt" Leader! peptidase" ... Funktionsmechanismus noch nicht Collinson et al., 2015" Proteintranslokation über die IM in Bakterien" Collinson et al., 2015" Signalsequenz-abhängige Translokation über die innere Membran SecY and Secretin-dep. e.g. Typ II spezielles Export signal Typ I IM Periplasmic space OM PM of the host cell Proteintranslokationssysteme in Pro- und Eukaryoten" Translocation Eukaryotes Bacteria Archaea Organelles Eury Cren Mito Chlo YidC - + + - + + SRP / + SecYEG + + + - + Tat + + + - + - Brock Kap 6: Was ist hier falsch?" 1 2 Proteinsekretion & Membranproteinsynthese in Bakterien" 1 Literatur:" " - Channel crossing: how are proteins shipped across the " bacterial plasma membrane. 2015. " 2 Transactions Royal Society B, 370" Collinson et al., Philophical " - Cotranslational mechanisms of protein maturation. 2014." Gloge et al., Curr. Opinion Struct. Biol. 24:24-33"
