Proteinsekretion bei Bakterien

Proteinsekretion bei Bakterien
Die Zellhülle gramnegativer Bakterien setzt sich zusammen aus zwei
Membranschichten, der zytoplasmatischen Membran und der äußeren Membran.
Beide Membranen sind durch den periplasmatischen Raum getrennt. Ob diese
beiden Membranen an bestimmten Stellen adhärieren ("Adhesion"-Stellen oder
sog. "Bayer bridges") wird immer noch heiß debattiert. Auf alle Fälle muß ein
Protein, das normalerweise in der äußeren Membran lokalisiert ist, zuerst die
zytoplasmatische Membran passieren. Das Durchschleusen eines Proteins durch
die zytoplasmatische Membran wird als "Translokation" bezeichnet. Im
folgenden soll geschildert werden, wie sekretorische Proteine bei Escherichia
coli zur Innenseite der Zytoplasmamembran dirigiert wird und welche
Komponenten am Translokationsprozeß beteiligt sind.
Einige Beispiele für die Lokalisation von Proteinen in Bakterien ist in der
nachfolgenden Tabelle gegeben.
Protein-Sortierung bei Bakterien
Lokalisation
Beispiele
Cytoplasma
Cytoplasmamembran
Periplasma
Äussere Membran
Medium
Medium
Glycolyseenzyme
alle
Cytochrome
alle
MalE, Bla, APase
GramOmpA, C, F
GramHämolysin, IgA-Protease GramHydrolasen, viele andere Gram+
Ankerproteine:
Cytoplasmamembran
Murein
Zellhülle
Flagellum
Lipoproteine
Fn-BP, IgG-BP
Autolysine
Flagellin
Translokation in Wirtszelle:
tierische/pflanzliche
Yop-Proteine
Zellen
Typ III Sekretion
Bakterien
Gram-/+
Gram+
Gram+
Gram-/+
Gram(pathogene)
Die Sec-abhängige Proteinsekretion in Bakterien:
Die Sec-abhängige Proteintranslokation durch die Cytoplasmamembran ist bei
weitem die häufigste Weise auf die Pre-proteine durch die bakterielle CM
geschleust werden. Das System besteht aus verschiedenen Komponenten (s.
Tabelle):
2
mRNA
SecA
SecB
(GroEL)
N
SP
Schema der Sec-abhängigen
Proteinsekretion
SecA,B,D,E,F,G,Y
COO-
ATP
Sec
G
A
Y
Por e
+++
N
ADP + Pi
∆p
A
ca 20 AS
E
Lep
(Lsp)
pro Translokationsschritt
D G
Y
++ + N
E
F
CM
PERIPLASMA
Sec E,G,Y =
Sec-Komponenten der bakteriellen Proteintranslakation
Sec-Proteine
Lokalisation /
Funktion
Größe
SecA
Cytoplasmatisch
SecA hilft bei der
löslich;
Translokation des Pre-proteins
100 kD, 2-mer
über die CM, unter Beteiligung
des SecYEG Kanals
SecB
Cytoplasmatisch, Neu synthetisierte Proteine
Löslich;
werden von SecB zur Innenseite
17 kD; 4-mer
der CM eskortiert; Chaperon
SecE
Membrankanal,
Transportkanal
9 kD
SecG
Membrankanal,
Transportkanal
11 kD
SecY
Membrankanal,
Transportkanal
47 kD; mit 2
periplasmatische
Domänen
SecD/F
Refaltung von Proteinen
SignalRagt in das
Spaltet Signalpeptid ab;
peptidase I
Periplasma;
typische Spaltsequenz ist Ala(SP-I)
verankert in CM X-Ala;
min N-terminus
Wenn Spaltsequenz fehlt bleibt
das Protein in der CM stecken
(eventuell Zelllyse, Zelltod)
Faktoren, die an der Proteintranslokation über die Cytoplasmamembran
beteiligt sind.
3
Genetische Analysen bei E. coli an ausgewählten exportierten Proteinen haben
gezeigt, dass ein bestimmter Satz von sog. "Sec"-Proteinen ("Sec" steht für
"Sekretion") eine entscheidende Rolle spielen. Die meisten Erkenntnisse wurde
dabei mit dem Precursorprotein (preOmpA) gewonnen.
SecB: Ein "Chaperone", das Proteine an die Membran hinführt
SecB ist ein 17 kDa lösliches Protein, das als Tetramer vorliegt.
Eine SecBnull-Mutation hemmt den Export folgender Proteine: a)
Maltosebindeprotein (MBP), OmpF, Lambda-Rezeptor (LamB), OmpA, und
PhoE. Die Mutation hat keinen Einfluß auf: alkalische Phosphatase, Lipoprotein,
Robsebindeprotein, und ß-Laktamase.
SecB ist nur für E. coli-Zellen wichtig, die auf reichem Medium wachsen.
SecB erkennt die Signalsequenz und Regionen außerhalb der Signalsequenz
des zu exportierenden Proteins.
Sogar nichtsekretorische Proteine treten im Wechselwirkung mit SecB, wenn sie
in einer nichtnativen Konformation sind (Randall, 1992).
Die Spezifizität von SecB für exportierte Protein erklärt man sich durch die
verringerte Faltungskinetik von signalsequenztragenden Proteinen (Hardy und
Randall, 1991; MacIntyre et al., 1991).
Die selektive Bindung von SecB an entstehende Precursors von MBP, LamB,
OmpA, und OmpF konnte gezeigt werden (Kumamoto und Francetic, 1993).
Die Funktion von SecB:
SecB besitzt eine Antifaltungsaktivität ("chaperoning-activity"). In
Abwesenheit von SecB haben bestimmte Precursorproteine eine Tendenz, rasch
eine transportinkompetente Struktur anzunehmen (Collier und Bassford, 1989;
Liu et al., 1989; Weiss et al., 1988). Bei dem Exoprotein PhoE hat die Bindung
von SecB an prePhoE wenig Einfluß auf die Faltung, aber es verhindert damit
die Aggregation des Precursors (Breuking et al., 1992).
Im Gegensatz zu SecB ist der allgemeine Faltungsmodulator, GroEL, nicht
spezifisch für exportierte Proteine. Nur der Export der ß-Laktamase wird von
GroEL-Mutanten beeinflußt.
Es hat sich herausgestellt, dass SecB und das eukaryontische Signal-recognition
particle (SRP) miteinander konkurrieren. Man hat deshalb angenommen, dass
SecB eine Signalerkennungsfunktion besitzt (Watanabe und Blobel, 1989).
Neuere Arbeiten lassen vermuten, dass die Hauptfunktion von SecB darin
besteht, dass es Precursorproteine an die Innenseite der Membran hinführt, an
der die Translokation stattfindet (Swidersky et al., 1990; Hartl et al., 1990; de
Cock und Tommassen, 1992).
Wenn SecB den Kontakt zwischen Precursorprotein und Membran herstellt,
dann trägt dies dazu bei, eine vorschnelle Faltung des Precursorproteins zu
verhindern.
SecA: Ein autoregulierter Targeting Factor
SecA ist ein 102 kDa Protein; es ist in leicht abtrennbarer Form an die Innenseite
der Cytoplasmamembran gebunden und es ist assoziiert mit Ribosomen (Oliver
et al., 1990b, Review article).
SecA-Mutanten sind letal und konditionale SecA-Mutanten weisen eine SecAAbhängigkeit für den Export aller periplasmatischer und äußerer
Membranproteine auf.
4
SecA besitzt eine relativ niedrige ATPase-Aktivität, die durch Precursorproteine
und Cytoplasmamembranvesikel stimuliert wird.
Blockiert man die ATP-Bindestelle von SecA durch 8-azido-ATP oder
Natriumazid, erlischt die Translokationsaktivität von SecA. SecA bindet an die
Signalsequenz exportierter Proteine und tritt in Wechselwirkung mit dem in der
Membran eingebetteten SecY-Protein (Hartl et al., 1990; Bieker-Brady und
Silhavy, 1992).
Saure Phospholipide tragen dazu bei, SecA an der Plasmamembran zu fixieren
(Hendrick und Wickner, 1991; Ulbrandt et al., 1992).
Die Konzentration von SecA wird durch die Proteinexportkapazität der Zelle
reguliert. SecA wirkt dabei als ein autogener Repressor, der ATP-abhängig mit
seiner eigenen mRNA interagiert (Schmidt et al., 1991; Dolan und Oliver, 1991).
SecA erfüllt in der Zelle drei wesentliche Funktionen:
1. Es reguliert seine Synthese durch die ATP-abhängige RNAHelikaseaktivität (Koonin und Gorbalenya, 1992).
2. Es dirigiert die Precursorproteine an das SecY der Membran. Dabei übt es
ähnlich wie SecB eine gewisse "Chaparoningfunktion" aus. Dies konnte
dadurch gezeigt werden, dass ein SecA-Defekt durch GroE supprimiert
werden kann (Ueguchi und Ito, 1992).
3. Es ist am Transfer eines Proteins durch die Cytoplasmamembran beteiligt, in
dem es die Reversetranslokation hemmt (Schiebel et al., 1991).
Eine funktionelle Kartierung des SecA-Proteins ergab Bindestellen für ATP, für
Precursormoleküle, für die Membranen und mRNA.
SecY: Eine Hauptkomponente der Translokationspore
SecY ist ein 49 kDa Protein, das im Lipid bilayer der Cytoplasmamembran
eingebettet ist. Es ist für den Export periplasmatischer und äußerer
Membranproteine bei E. coli notwendig.
Mutationen im SecY-Gen resultieren im temperatursensitiven Exportdefekt.
Unter bestimmten in-vitro-Bedingungen ist SecY entbehrlich (Watanabe et al.,
1990). Ein Modell seiner Membrantopographie postuliert 10 hydrophobe
Transmembransegmente mit einem kurzen amino- und karboxyterminalen
Bereich, die in das Cytoplasma ragen.
Diese Art der Transmembranorientierung bei SecY läßt auf eine hydrophile Pore
durch die Membran schließen, die die Translokation exportierter Proteine
ermöglicht. Diese Translokations- porenbildende Funktion von SecY konnte vor
allem untermauert werden durch selektive Quervernetzung einer
translozierenden Polypeptidkette an SecY (Joly und Wickner, 1993).
Die in das Cytoplasma hineinragenden Schleifen des Moleküls zusammen mit
dem amino- und C-terminalen Peptiden sind an der Bindung des
Precursorproteins beteiligt. Die Hinführung der Precursormoleküle an SecY wird
durch SecA vermittelt, da es einige Evidenzien gibt für die Interaktion zwischen
SecY und SecA. Ob SecY direkt mit der Signalsequenz in Wechselwirkung tritt,
ist immer noch umstritten. Bestimmte SecY-Mutationen (PrlA-Mutationen)
ermöglichen den Export von Proteinen, denen die Signalsequenz fehlt (Derman
et al., 1993).
Die Funktion der Signalsequenzen wird jedoch nicht eine Konsensussequenz
vermittelt, sondern durch eine gemeinsame Tertiärstruktur (Bieker et al., 1990;
Ito, 1990).
5
Es wird auch diskutiert, dass das Signalpeptid in der Lage ist, durch direkte
Bindung an die Porenproteine SecY/SecE die Transmembrankanäle zu öffnen
(Simon und Blobel, 1992). SecY und SecE-Protein werden meist gemeinsam
gereinigt, so dass man eine funktionelle Interaktion vermutet.
SecE:
Das SecE-Gen wurde identifiziert durch Mutationen, die einen pleiotropen
Defekt im Proteinexport und einen kältesensitiven Wachstumsdefekt aufwiesen
(Riggs et al., 1988).
SecE ist ein 13.6 kDa Protein, das in der Cytoplasmamembran über drei
transmembrane Segmente integriert ist. Ein bestimmtes Transmembransegment
scheint für die Aktivität von SecE ausreichend zu sein. Ähnlich wie bei SecY, so
wird auch bei SecE angenommen, dass es mit der Signalsequenz interagiert. Es
wird angenommen, dass SecE einen Schritt früher als SecY während des
Proteinexports in Aktion tritt.
SecD/SecF:
Mutationen im SecB-Locus resultieren in einem schweren Proteinexportdefekt
und in kältesensitivem Wachstum. Die beiden Gene SecD und SecE werden
kotranskribiert, beide Gene kodieren für integrale Membranproteine mit großen
periplasmatischen Domänen (Gardel et al., 1990). SecD und SecF interagieren
auch mit SecY. Blockiert man SecD durch spezifische Antikörper, so kann z.B.
MBP und OmpA nicht freigesetzt werden, was dann zu einer Akkumulation
beider Proteine in der Zelle führt (Matsuyama et al., 1993). SecD und SecF
interagieren vermutlich mit SecY.
Energetisierung der Proteintranslokation
Der Exportprozeß kann unterteilt werden in einzelne Schritte, von denen jeder
Schritt eine individuelle Energieform benötigt. Die Membranbindung des
Precursorproteins erfolgt in Abwesenheit von ATP. Die Translokation der ersten
40 bis 50 Aminosäuren, die zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur führen,
benötigt ATP aber kein PMF. Die Vervollständigung der Translokation erfordert
weitere Schritte, die ATP-Hydrolyse und/oder PMF erfordern.
SecA-vermittelte ATP-Hydrolyse ist nicht unmittelbar gekoppelt mit der
Proteintranslokation. Die ATP-Hydrolyse durch SecA geht vermutlich einher mit
der Dissoziation des Precursors von SecA, um weitere Translokation zu
ermöglichen.
Offene Fragen:
1. Die Translokationseffizienz bei in-vitro-Versuchen mit dem beschriebenen
Sec-Komponenten ist niedrig; man vermutet, dass zusätzliche
Komponenten eine Rolle spielen, die man allerdings erst noch finden muß.
2. SecY und SecE funktionieren nur im Zusammenwirken mit anderen
Membranproteinen wie dem Ydr (Ito, 1992).
3. Bestimmte Precursorproteine werden in Membranvesikel transportiert in
Abwesenheit von SecY (Watanabe et al., 1990).
4. Der Signalerkennungsvorgang ist wenig verstanden. Während SecA die
positiven Ladungen der Signalsequenz erkennt (Akita et al., 1990),
erkennt das eukaryontische SRP die hydrophobe Domäne.
5. E. coli besitzt ein Ribonukleoprotein, das Analogien zum SRP aufweist.
Dieses Ribonukleoprotein ist jedoch noch wenig untersucht.
6
6.
Die meisten Precursorproteine können posttranslational in E. coli
transloziert werden. Es ist jedoch noch wenig untersucht, welche
Komponenten des Exports mit dem naszierenden Precursormolekül in
Wechselwirkung treten.
Übersichtsartikel:
"The Sec protein-translocation pathway"
Hiroyuki Mori and Koreaki Ito
Trends in Microbiology 2001, 9:494-500
Das bakterielle "signal recognition particle" (SRP)
de Gier, J. W., Scotti, P. A., Saaf, A., Valent, Q. A., Kuhn, A., Luirink, J., and von
Heijne, G. (1998). Differential use of the signal recognition particle translocase
targeting pathway for inner membrane protein assembly in Escherichia coli. Proc
Natl Acad Sci U S A 95, 14646-51.
Assembly of several inner membrane proteins-leader peptidase (Lep), a Lep
derivative (Lep-inv) that inserts with an inverted topology compared with the
wild-type protein, the phage M13 procoat protein, and a procoat derivative
(H1-procoat) with the hydrophobic core of the signal peptide replaced by a
stretch from the first transmembrane segment in Lep-has been studied in vitro
and in Escherichia coli strains that are conditional for the expression of either
the 54 homologue (Ffh) or 4.5S RNA, which are the two components of the E.
coli signal recognition particle (SRP), or SecE, an essential core component of
the E. coli preprotein translocase. Membrane insertion has also been tested in a
SecB null strain. Lep, Lep-inv, and H1-procoat require SRP for correct
assembly into the inner membrane; in contrast, we find that wild-type procoat
does not. Lep and, surprisingly, Lep-inv and H1-procoat fail to insert properly
when SecE is depleted, whereas insertion of wild-type procoat is unaffected
under these conditions. None of the proteins depend on SecB for assembly.
These observations indicate that inner membrane proteins can assemble either
by a mechanism in which SRP delivers the protein at the preprotein translocase
or by what appears to be a direct integration into the lipid bilayer. The observed
change in assembly mechanism when the hydrophobicity of the procoat signal
peptide is increased demonstrates that the assembly of an inner membrane
protein can be rerouted between different pathways.
de Leeuw, E., Graham, B., Phillips, G. J., ten Hagen-Jongman, C. M., Oudega, B.,
and Luirink, J. (1999). Molecular characterization of Escherichia coli FtsE and
FtsX. Mol Microbiol 31, 983-93.
The genes ftsE and ftsX are organized in one operon together with ftsY. FtsY
codes for the receptor of the signal recognition particle (SRP) that functions
in targeting a subset of inner membrane proteins. We have found no
indications for a structural relationship between FtsE/X and FtsY. Evidence is
presented that FtsE and FtsX form a complex in the inner membrane that bears
the characteristics of an ATP-binding cassette (ABC)-type transporter. FtsE is a
hydrophilic nucleotide- binding protein that has a tendency to dimerize and
associates with the inner membrane through an interaction with the integral
membrane protein FtsX. An FtsE null mutant showed filamentous growth and
7
appeared viable on high salt medium only, indicating a role for FtsE in cell
division and/or salt transport.
2. SRP- abhängige Sekretion in Bakterien
(SRP-Pathway)
1.
SRP: "signal recognition particle" ist ein
RNA-Protein Komplex
2. bakterielles SRP-Protein ist homolog zum
eukaryotischen SRP 54
3. Untersucht: E. coli + B. subtilis
4. bakterielles SRP setzt sich zusammen aus:
Protein (Ffh)
+
RNA (4,5S RNA)
5. Funktion in E. coli:
Einlagerung von CM-Proteinen, wie z.B.
Signalpeptidase (Lep)
Dirigiert Membranproteine zur Translocase
(Protein-Transportpore)
SecA unterstützt SRP
de Gier et al. (1998). Differential use of the signal
recognition particle translocase targeting pathway
for inner membrane protein assembly in E. coli.
PNAS 95, 14646-51.
von Heijne, G. (1998). Life and death of a signal peptide.
Nature 396, 111, 113.
8
SRP in E. coli
Ffh (48 kDa )
N
NG
M
Bindung an
4,5 S RN A
C
-GTPase
-Bindung an FtsY
(SRP Rezeptor)
4,5S RNA:
5'
3'
-bindet an EF-G und 70 S Ribosom
-bindet an Ffh
Typ I, II, III, IV und V Proteinsekretion
Die Sekretionssysteme kann man in 2 Gruppen eiteilen:
a) die Sec-abhängigen und
b) die Sec-unabhängingen
A) Sec-abhängige Sekretionssysteme sind der Typ II und Typ V
Mechanismus:
Typ II (ca 12 unterschiedliche Proteine sind beteiligt):
1. Proteine werden an die Cytoplasmamembran hingeführt und
2. mittels der Sec-Maschinerie transloziert, prozessiert und schließlich sekretiert
Beispiele für Typ II – Sekretion sind: Maltose-Bindeprotein, ß-Lactamase,
Phosphatase und viele mehr werden in das Periplasma transloziert;
Pullulanase bei Klebsiella wird über eine Pore der äusseren Membran
weiter in das Medium sekretiert.
Typ V: Autotransporter mit selbstprozessierender Protease (bei Gramnegativen Bakterien)
Der erste Schritt, die Translokation durch die Cytoplasmamembran in das
Periplasma erfolgt Sec-abhängig;
9
Der zweite Schritt, die Translokation durch die äussere Membran, erfolgt
autokatalytisch unter Beteiligung der im Protein enthaltenen
Proteaseaktivität.
Beispiel: IgA-Protease bei Neisserien
B) Sec-unabhängige Sekretionssysteme sind der Typ I, III (Mischfunktion)
und Typ IV Mechanismus:
Typ I:
Sind ABC-Transporter, bei denen das Protein in einem Schritt durch die
cytoplasmatische- und äussere Membran transportier werden
Beispiel: Hemolysinsekretion bei E. coli und Serratia
Typ III:
Kontakt-abhängige Sekretion am Beispiel der Yop Sekretion bei Yersinien: Ein
Teil der Sekretion erfordert TypII Sekretionskomponenten die eigentliche
Translokation erfolgt über die Ausbildung eines Pilus-ähnlichen
Sekretionsapparates der sowohl cytoplasmatische- und äussere Membran
durchspannt und letztlich auch die Membran der Wirtszelle. Die Sekretion
erfordert den Kontakt mit der Wirtszelle, wodurch die äussere Membranpore für
den Proteintransport in die Wirtszelle geöffnet wird.
Typ IV
Hier handelt es sich um die Ausbildung eines Konjugations-ähnlichen
Pilusapparates der die Bakterienzelle mit der Wirtszelle verbindet. Durch diese
Konjugationsbrücke kann sowohl einzelsträngige DNA (wie z.B. Ti-Plasmid bei
Agrobakterium tumefaciens) oder Proteine (z.B. Bordetella pertussis Toxin)
vom Bakterium in die Wirtszelle übertragen werden.
Table. Bacterial secretion systems and associated surface appendages
Secretion
system
Prototype
Type I
a-Hemolysin
Type II
Type III
Species
Surface appendage
Prototype
Species
E. coli
–b
-
Pullulanase
Klebsiella
oxytoca
Type IV pili
Pseudomonas
aeruginosa
Yersinia outer
proteins (Yops)
Yersinia spp.
Flagella
Salmonella
typhimurium
Needle complex Salmonella
typhimurium
Type IV
Pertussis toxin
Bordetella
pertussis
Hrp pili
Pseudomonas
syringae
T pilus
Agrobacterium
tumefaciens
F pilus
Escherichia coli
10
Type V a
IgA1 protease
Neisseria
gonorrhoeae
-
-
Chaperone/
P pili
Escherichia coli P pili
Escherichia coli
usher pathway
a
Type V system includes the autotransporter family and a similar pathway that requires a
single accessory factor (e.g. Serratia marcescens hemolysin ShlB).
b
indicates that no appendage has been identified in this system.
From: The role of bacterial pili in protein and DNA translocation
Ralf Koebnik. Trends in Microbiology 2001, 9:586-590
Typ I Proteinsekretion (am Beispiel von E. coli α -Hämolysin)
N
TolC
OM
HlyD
CM
HlyB
N
ADP
ATP
Das α-Hämolysin wird über einen sog. ABC-Transporter unter ATP-spaltung
durch die beiden Membranen von E. coli und Serratia in das Medium
sekretiert. Der Sec-Sekretionsapparat ist nicht beteiligt.
Typ II Sekretionsapparat
11
PulD
S
Lsp
PulC
SecD-F, V
E-O
SecA
ADP
N
ATP
SecB
C
Die Pullunase von Klebsiella wird über das Sec-System in das Periplasma
tranloziert und dann über eine äussere Membranpore (PulD) und unter
Mitwirkung weiteren Pul-Proteine in das umgebende Medium sekretiert.
Typ III Sekretionssystem
12
YscC
YscD,F
I-L
O-U
LcrD
VirG
YscN
ADP
ATP
N
Syc
C
Beim Typ III
Bei diesem Sekretionssystem am Beispiel von Yersinia werden die Yop Proteine
über einen Porenapparat der sich über die beiden bakteriellen Membranen und
schließlich über die Wirtsmembran erstreckt in die Wirtszelle eingeschleust.
Yop proteine und ihre Funktionen
Alle 3 Yersinia Arten sind gegen die primären Immunabwehrsysteme resistent.
Sie hemmen über das Typ III Sekretionssystem ihre eigene Phagozytoxe durch
professionelle Phagozyten. Aus diesem Grund sind diese Pathogene
während einer Infektion vorzugsweise extrazellulär.
Typ III Sekretionssystem wird durch Kontakt mit einer eukaryotischen Zelle
induziert.
YopH
YopE
YpkA
YopM
Tyrosin phosphatase; ist für die Antiphagozytose verantwortlich
Cytotoxin; Zerstörung von F-Aktin
Ser-Thr-Kinase; wirkt zu einem späteren Stadium der Infektion
Thrombin-Bindeprotein
13
YopK
YopB
YopJ/P
Erhöht Translokation
Porenbildende Translokase
Induktion der Apoptose
Weitere Typ III Sekretionssysteme:
Pseudomonas aeruginosa
ExoS und ExoT: ADP-Ribosyltransferase
Shigella flexneri
IpaA: bindet an Vinculin
IpaB-D: binden an a5ß1-Integrin
Pflanzenpathogene:
Pseudomonas syringiae:
Auslösung von Wirtsanworten (Elizitoren)
Erwinia amylovora:
Auslösung von Wirtsanworten (Elizitoren)
Typ IV
Am Beispiel des VirB-Systems von Agrobacterium tumefaciens
VirB-System
von Agrobacterium tumefaciens
Bakterielle Kolonisierung
Induktion der vir-Gene
Bildung des T-DNA-TransferKomplexes
T-DNA-Transport in Pfl.Zellen
Integration in Pflanzengenom
Expression von Onkogenen
Folge: „crown gall“ Tumore
14
Das VirB-System
Wird von 11 Genen codiert
10 davon substantiell für T-DNA-Transfer (VirB2-virB11).
Substrat nicht nur ssDNA, sondern Proteine
Drei funktionelle Gruppen von VirB Proteinen:
Proteine die exozelluläre adhäsive Strukturen bilden
Paarungskanalkomponenten
CM-ATPasen
VirB5
Chaperon?
Piluskomponente?
VirB1
Peptidoglycanlyse
VirB1*
Interaktion mit Wirt?
15
Mechanismus des DNA-Transfers
1. Kotransportierte Proteine Prozessieren die DNA am OriT
2. Transesterase initiiert und wird dann am 5' Ende der ssDNA
gebunden
3. VirD2 Transesterase + DNA wird in Wirtszelle geschleust
4. VirD2 besitzt eine nukleäre Lokalisationssequenz
² Transport der DNA in den Kern (z.B. KKRKK motif)
Typ VI DNA-Transfersystem ist also:
Proteinsekretionsmaschinerie, die an einen "Piloten" gebundene
ssDNA durch den Translokastionskanal schleust.
Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium
Talya Kunik* et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, 1871-1876, 2001
http://www.pnas.org/cgi/reprint/98/4/1871
Agrobacterium tumefaciens is a soil phytopathogen that elicits neoplastic
growths on the host plant species. In nature, however, Agrobacterium also may
encounter organisms belonging to other kingdoms such as insects and
animals that feed on the infected plants. Can Agrobacterium, then, also infect
animal cells? Here, we report that Agrobacterium attaches to and genetically
transforms several types of human cells. In stably transformed HeLa cells, the
integration event occurred at the right border of the tumor-inducing plasmid's
transferred-DNA (T-DNA), suggesting bona fide T-DNA transfer and lending
support to the notion that Agrobacterium transforms human cells by a
mechanism similar to that which it uses for transformation of plants cells.
Collectively, our results suggest that Agrobacterium can transport its T-DNA to
human cells and integrate it into their genome.
Typ V
The autotransporters, a family of secreted proteins from Gram-negative bacteria,
possess an overall unifying structure comprising three functional domains: the
amino-terminal leader sequence, the secreted mature protein (passenger domain)
and a carboxy-terminal (-) domain that forms a -barrel pore to allow secretion of
the passenger protein. Members of this family have been implicated as important
or putative virulence factors in many Gram-negative pathogens.
See review:
The great escape: structure and function of the autotransporter proteins
16
Ian R. Hendersona, Fernando Navarro-Garciab and James P. NataroaA. Trends in
Microbiology 1998, 6:370-378
The autotransporter secretion mechanism
The autotransporter secretion system, as distinct from the mechanisms detailed
above, was first described for the IgA1 proteases of Neisseria gonorrhoeae by
Pohlner et al.16, who elegantly elucidated the fundamental mechanism. (The
term `type IV secretion' has been proposed for the autotransporter proteins4. We
favor the use of this term; however, autotransporter is a more descriptive
designation and will be used throughout this review.) During secretion, the Iga
polyprotein precursor is processed at both the amino- and carboxy-terminal
ends. Export of this precursor through the inner membrane occurs via the Sec
pathway and is coupled to the cleavage of a 27-amino-acid signal peptide at its
amino terminus. Passage of the protein through the outer membrane is mediated
by its carboxy-terminal domain; no energy coupling or accessory factors are
known to be required for the translocation process. Pohlner et al. were the first
to suggest that the carboxy-terminal portion of the Iga precursor could form an
integral membrane structure similar to that of the general porins, comprising
antiparallel -sheets arranged in a hypothetical -barrel conformation (see below).
It is assumed that the signal-cleaved amino-terminal domain is then translocated
through the -barrel pore to the bacterial cell surface, where the IgA1 protease
uses its autocatalytic activity to cleave and release itself from the -barrel
structure.
17
Autotransporter secretion. The autotransporter polyprotein is synthesized and
exported through the cytoplasmic membrane via what is thought to be a Secdependent mechanism (depicted by gray ovals). The three domains of the
polyprotein are shown: the leader sequence, the amino-terminal passenger
domain and the carboxy-terminal ß-barrel-forming domain (-domain). The leader
sequence is cleaved at the membrane by a signal peptidase, releasing the mature
polyprotein into the periplasm. Once in the periplasm, the -domain of the protein
inserts into the outer membrane to form a ß-barrel structure. After formation of
the -barrel pore, the passenger domain is translocated to the cell surface through
the pore. Once at the cell surface, several possibilities may occur: (1) the protein
remains intact as a large polyprotein that has a carboxy-terminal membranebound domain and an amino-terminal domain extending into the environment;
(2) the protein either gains autoproteolytic activity and cleaves itself or it is
cleaved by an outer membrane protease, but in this case the passenger domain
remains in contact with the cell surface via noncovalent interactions with the ßdomain; or (3) the passenger domain gains its autoproteolytic activity or is
cleaved by an outer membrane protease and is released into the environment.
18
Topology of an autotransporter. The polyprotein precursors of the
autotransporters share some similarities. In most cases, the polyprotein possesses
a signal sequence that could target the protein to the Sec inner membrane
secretion system. The passenger domains possess functional motifs, including
the serine protease sites, Arg–Gly–Asp (RGD) motifs and P-loop motifs, which
are assumed to play roles in the phenotypes and/or the biogenesis of these
proteins. The -domain possesses an amphipathic -sheet structure, which is
thought to allow formation of a 14-stranded ß-barrel structure within the outer
membrane. The hydrophobic residues of these strands are projected into the
hydrophobic lipid bilayer, while the hydrophilic side chains project into an
aqueous environment in the center of the barrel, forming a pore. The strand
shown is from TcfA of Bordetella pertussis. The carboxy-terminal stretches of
the -domains possess a common motif and all end with three residues
conforming to the motif (Y/V/I/F/W)-X-(F/W). The most common three-residue
motif (YSF) is indicated.
Verankerung von Proteinen in der Bakteriellen Membran (Lipoprotein)
Lipoprotein
19
a) in der äusseren Membran (Braun'sches Lipoprotein)
The structure of the lipid modification in the case of major outer membrane
protein of E. coli was elucidated chemically in 1973. It was shown that
Sulphydryl group of N-terminal Cysteine was modified with a diacylglyceryl
group attached through a thioether linkage and the amino group was acylated
with a fatty acid [1] (shown in figure). The acyl group composition was found to
be same as that of membrane phospholipids [1] and therefore membrane
phospholipids were suspected to be the lipid donors for the modification.
In another important finding it was shown that the precursor for this outer
membrane lipoprotein was actually a pre-protein with an N-terminal extension of
20 amino acids possessing the characteristics of a typical signal peptide [2].
Naturally, the interest in the biosynthesis of this lipoprotein started immediately.
Firstly the origin of the lipid in the molecule was traced to phospholipids as
suspected earlier [3]. Phosphatidylglycerol was shown to be specifically
required for the initial modification of Cys of the lipoproteins with
diacylglycerol, catalyzed by the enzyme phosphatidylglycerol-prolipoprotein
diacylglyceryl transferase[4,5]. N-acylation was shown to be achieved with any
of the phospholipids [4]. Discovery of Globomycin, a cyclic pentapeptide
20
antibiotic that specifically inhibited the maturation of lipoproteins led to the
identification of a signal peptidase specific for lipoproteins [6].
This signal peptidase called signal peptidase II required diacylglyceryl
modification prior to cleavage [7,8]. This meant that diacylglyceryl modification
preceded cleavage of the signal peptide. The final modification i.e. after the
cleavage of the signal peptide, fatty acylation of the amino group of the Nterminal diacylglyceryl modified Cys to form N-acyl diacylglyceryl Cysteine was
subsequently identified [9,10]. The pathway [5] is shown in the figure below.
The genes for these enzymes have been identified by Wu et. al. in a variety of
bacteria and they are found to be highly conserved [11, 12].
Hantke, K. and Braun, V., Covalent binding of lipid to protein. Diglyceride and
amide-linked fatty acid at the N-terminal end of the murein lipoprotein of
the Eschericia coli outer membrane, Eur. J. Biochem., 34, 284, 1973.
21
Sankaran, K. and Wu, H. C. Lipid Modification of Bacterial Prolipoproteins, J.
Biol. Chem., 269, 19701, 1994
Inukai, M., Takeuchi, M., Shimizu, K., and Arai, M., Mechanism of action of
globomycin, J. Antibiot. (Tokyo), 31, 1203, 1978.
Hussain, M., Ichihara, S., and Mizushima, S., Accumlation of glyceride containing
precursor of the outer membrane lipoprotein in the cytoplasmic membrane
of E.coli treated with globomycin, J. Biol. Chem., 255, 3707, 1980.
Dev, I. K. and Ray, P. H., Rapid assay and purification of a unique signal
peptidase that processes the prolipoprotein from E.coli, J. Biol. Chem.,
259, 11114, 1984.
Sankaran, K., Gupta, S. D. and Wu, H. C., Modification of Bacterial Lipoproteins,
Methods in Enzymol. 250, 683, 1995.
Qi, H-Y., Sankaran, K., Gan, K., and Wu, H. C., Structure-Function relationship of
Bacterial Prolipoprotein Diacylglyceryl Transferase: Functionally
significant Conserved Regions, J. Bacteriol, 177, 6820, 1995.
Covalente Verknüpfung des Lipoproteins an das Peptidoglycan
22
Proteinsekretion Teil II
Integrale Cytoplasmamembranproteine
Integrale Membranproteine (IMP) weisen mehrere hochhydrophobe
Sequenzbereiche auf, die mit 20 Aminosäurenresten lang genug sind, um die
Cytoplasmamembran zu durchspannen. Diese Transmembransegmente
verankern das Protein innerhalb des Lipidbilayers der Membran. Die
Topographie des jeweiligen IMPs wird durch die Zahl der
Transmembransegmente festgelegt. Bezüglich der Orientierung des Amino- und
C-Terminus unterscheidet man Transorientierung und Cisorientierung. Bei der
Transorientierung (Klasse I-IMP) ragt der Aminoterminus in das Cytoplasma und
der C-Terminus in das Periplasma. Bei der Cisorientierung (Klasse II-IMP) ragen
beide Enden in das Cytoplasma. Mechanistische Untersuchungen zur
Integration von IMPs in die Cytoplasmamembran sind im allgemein sehr
schwierig, da ein direkter Nachweis der korrekten Integration von IMPs in die
bakterielle Cytoplasmamembran experimentell sehr aufwendig ist.
Methodische Strategien, um die Topographie bakterieller IMPs zu
untersuchen
Ein integrales Membranprotein ist normalerweise geschützt durch
proteindenaturierende Agentien wie z.B. NA2CO3 bei alkalischem pH oder
gegenüber 0,1 NAOH. Die das Protein umgebende Phospholipide schützen das
Protein vor diesen Agentien.
5- bis 6M-Harnstoff setzt peripher assoziierte Membranproteine frei.
Lipideingebettete Proteine werden jedoch nicht freigesetzt. Um diese
freizusetzen, muß man die Harnstoffkonzentration auf 9M erhöhen, dann
werden sogar lipidverankerte Proteine herausgelöst. (Tatros et al., 1989) Die
entsprechende Konzentration an Harnstoff muß allerdings für jedes individuelle
Protein bestimmt werden.
Bereiche, die aus der Membran herausragen, sind proteolytischem Abbau
zugänglich. Auf diese Weise kann man auch feststellen, welche Bereiche nicht
integral in der Membran verankert sind. (Werner et al., 1992). Den
proteolytischen Ansatz kann man in vitro von beiden Seiten der
Cytoplasmamembran durchführen, entweder mit "Right-side-out"Membranvesikeln oder "Inside-out"-Plasmamembranvesikeln.
Topogene Sequenzen, die die Integration der Proteine in die
Cytoplasmamembran festlegen
Die Signale, die verantwortlich sind für die Insertion von IMPs werden als
"topogene Sequenzen" bezeichnet. Sie liegen innerhalb und um die
Transmembransegmente des Membranproteins. (Saier et al., 1989; Boyd und
Beckwith, 1990; Dalbey, 1990) Es handelt sich um bestimmte Regionen, die die
Initiation (Signalsequenzen) und die Termination (Stop-Transfersequenzen)
einer translozierenden Polypeptidkette bestimmen. Eine Stop-Transfersequenz
führt immer zu Verankerung der Polypeptidkette in die Lipidbilayerschicht. Eine
Signalsequenz führt nur zur Verankerung, wenn sie nicht abgespalten wird
(z.B. durch die Signalpeptidase I beim gleichzeitigen Fehlen einer
23
Prozessierungsstelle Ala-X-Ala). Die endgültige Topographie eines IMPs,
dasdie Membran verschieden Male durchspannt, ergibt sich aus der Lage der
alternierenden Sequenzen, die Signalanker- und Stop-Transfersequenzen
darstellen. Die Signalankersequenz führt zum Einsetzen der Translokation und
die Stop-Transferesequenz führt zum Anhalten des Translokationsprozesses. Die
Sequenzen, die dazwischen liegen, ragen entweder in das cytoplasmatische
Lumen oder in den periplasmatischen Raum. Die Funktionalität der topogenen
Sequenzen bei integralen Membranproteinen kann man untersuchen, indem man
bestimmte Reporterproteine an entsprechende Sequenzen fusioniert.
Die Orientierung einer topogenen Sequenz innerhalb der Membran ist
normalerweise dergestalt, dass positiv geladene Reste auf der Cis-Seite sind (der
cytoplasmatischen Seite der Membran). Dies haben statistische Analysen der
Verteilung geladener Aminosäuren innerhalb der Cis- und Trans-Schleifen von
IMPs ergeben (sogenannte positive-inside Regel, von von Heijne 1986
aufgestellt). Dies wird vor allem auch durch die spaltbaren Signalsequenzen
offensichtlich, wo der positiv geladene Aminoterminus im cytoplasmatischen
Bereich verbleibt. (Puziss et al., 1989, Summers et al. 1989, Summers und
Knowles 1989)
Im allgemeinen kann man sagen, dass die Verteilung positiv geladener Gruppen
um die Transmembransegmente die Orientierung festlegen. Vorausgehende
positive Ladungen machen das anschließende Transmembransegment zu einer
Signalsequenz, die entweder spaltbar oder integral sein kann. Anschließende
Cluster von basischen Aminosäuren vermitteln eine Stop-Transferinformation an
das vorausgehende Transmembransegment. Dies wurde experimentell festgelegt,
indem man positiv geladene Aminosäuren vor und nach den
Transmembransegmenten prokaryontischer Proteine einbaute. (Nilsson und von
Heijne 1990L; Yamane et al. 1990) Besitzt ein Transmembransegment auf beiden
Seiten positiv geladene Aminosäuren, dann bestimmt die am positivsten
geladene Seite die Orientierung. Jene Seite, die die höhere positive Nettoladung
aufweist, und die mehr Arginin- als Lysinreste enthält, ist auf der
cytoplasmatischen Seite. Dies beinhaltet die sog. "Ladungs-Differenzregel", die
von Hartmann et al. 1989, Nilsson und von Heijne 1990 und McGovern et al.
1991 experimentell untermauert wurde.
Die Distanz zwischen dem Hydrophobenbereich und den basischen
Aminosäuren beeinflußt die Stärke des topogenen Signals. Je weiter die
basischen Aminosäuren entfernt sind, um so schwächer ist das topogene Signal.
(Boyd und Beckwith 1990) Allerdings sollte erwähnt werden, dass es von dieser
Regel Ausnahmen gibt. (Andrews et al., 1992) C-terminal gelegene
Transmembransegmente besitzen topogene Informationen, die anders abgelesen
werden als die vorausgehenden topogenen Sequenzen. Starke topogene
Sequenzen am C-terminalen Ende können vorausgehende topogene Sequenzen
umkehren.
Long proteins self-insertion
The set of proteins which can self-insert into the membrane which are longer
than normal self-insertion proteins segments exhibit other characteristic which
are vital to their translocation. This set includes a long 180 residue stretch of
MalF and 100 amino acid N-terminus of ProW. These proteins have the special
ability to insert themselves into the membrane in spite of their length.
Proton-motive force aids in the translocation of negatively charged amino acids,
and hinders positively charged amino acids. This could be one way the extra
24
long loop of ProW translocates itself across the membrane. A mechanism of selfinsertion of Sec-independent proteins is suggested which is dependent on aid
from neighbouring hydrophobic, transmembrane regions.
ProW has a 100-residue Nterminus periplasmic segment
which exhibits Sec independence.
It follows the positive-inside rule,
but also has an abnormally large
number of negatively charged
amino acids on the periplasmic
loop. Inserting positively charged
amino acids into the periplasmic
segment of the protein inhibits
translocation.
Inserting positively charged
amino acids into the periplasmic
segment of the protein inhibits
translocation.
Ist die Integration von Proteinen in die cytoplasmatische Membran bei E.
coli von den Sec-Proteinen abhängig?
In secAts-Mutanten ist die Integrationsgeschwindigkeit neusynthetisierter
Proteine in die äußere und innere Membranfraktion um ungefähr 70 %
verringert. Eine Sec-abhängige Integration wurde untersucht für authentische
IMPs von E. coli: a) SPase I, b) Laktosepermease (LacY), Maltosepermease
(MalF), Mannitolpermease (MtlA) und SecY zu Signalpeptidase I.
Der N-Terminus von SPase I ragt in das Periplasma. Dann folgt eine hydrophobe
Transmembranregion, eine 25-aminosäurelange cytoplasmatische Schleife, eine
zweite Transmembranregion und eine große periplasmatische Domäne, die etwa
zwei Drittel des Proteins ausmacht. (San Millan et al., 1989) Die
Membraninsertion ist SecA- und SecY-abhängig. Interessanterweise wird die
Insertion von SPase I Sec-unabhängig, wenn die Orientation des Proteins
umgekehrt ist. (von Heijne 1990) Die Umkehrung kann erreicht werden, wenn
man die positive Nettoladung der cytoplasmatischen Schleife des Proteins
erniedrigt. (Nilsson und von Heijne, 1990) In diesem Fall bleibt die große
periplasmatische Domäne im Cytoplasma. Solche Konstrukte mit umgekehrter
Topographie können wiederum Sec-abhängig gemacht werden, wenn der jetzt
periplasmatisch lokalisierte Abschnitt zwischen den beiden
Transmembransegmenten in seiner Größe erhöht wird. Dies SecA- und SecYAbhängigkeit nimmt linear zu mit der Länge dieses Abschnitts in einem Bereich
von 25-55 Aminosäuren. (Andersson und von Heijne, 1993) Aus diesen
Untersuchungen kann man ableiten, dass die Sec-Abhängigkeit der Integration
von IMPs in die Cytoplasmamembran und der Länge der Extramembrandomäne
abhängig ist. Bei kurzen Extramembrandomänen (< 25 Aminosäuren) ist die
Integration Sec-unabhängig. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die IMPs
von LacY, MalF, Mannitolpermease und SecY berichtet. Zusammenfassend
kann man sagen, dass die Integration von vor allem sehr hydrophoben IMPs in
25
der E. coli Cytoplasmamembran SecA unabhängig ist. Die Abhängigkeit von
SecY variiert von Protein zu Protein. Die Translokation von großen hydrophilen
Domänen scheint jedoch immer Sec-Funktionen zu erfordern.
Das kleine Haupthüllprotein des bakteriophagen M13 inseriert in die
Cythoplasmamembran von E. coli unabhängig von SecA SecY. Das Protein ist
73 Amonisäuren lang und inseriert in die Membran in folgender Topographie:
Die N-termionale Region bleibt im Cytoplasma, dann folgt ein hydrogphobes
Kernstück der Signalsequenz, das die Membran durchspannt, dann ein 20
Aminosäuren langer periplasmatischer Abschnitt oder Schleife, eine StopTransfersequenz und ein kurzes positiv geladenes C-terminales Peptid, das in
das Cytoplasma ragt. Es konnte gezeigt werden, dass die Insertion dieses
Precurserproteins Sec-abhängig wird, wenn die periplasmatische Schleife durch
173 Aminosäuren verlängert wird. (Kuhn, 1988) Man nimmt an, dass dieses
kleine Hüllprotein spontan in die Cytoplasmamembran inseriert, ohne dass
andere Proteine diese Integration vermitteln. (Wickner, 1988)
Das erste Transmembransegment der SPase 1 und die anschließend positiv
geladenen Cluster vermitteln ein Sec-unabhängiges Insertionssignal. (Lee et al.,
1992) Der anschließende Anteil der SPase1-Proteins erfordert jedoch SecA und
SecY für seine Faltung. Bei dem SecA und SecY unabhängigen
Translokationsvorgang wird die Beteiligung von Translokatoren (poren- oder
kanalbildende Membranstrukturen) diskutiert. Beim ER hat man solche
Porenproteine, solche Translokatoren offensichtlich nachgewiesen. (Simon und
Blobel, 1991). Ähnliche Poren wurden kürzlich auch bei der E. coli
Cytoplasmamembran entdeckt. (Simon und Blobel, 1992)
Äußere Membranproteine bei E. coli
Die äußere Membran von drei negativen Bakterien besitzt nur eine geringe Zahl
an integralen Membranproteinen, meist handelt es sich dabei um Proteine, deren
Funktion die Aufnahme von Nährstoffen ist (siehe review von Nikaido, 1992)
Mit Ausnahme des Murein-Lipoproteins, das das Murein mit der äußeren
Membran verknüpft, sind die äußeren Membranproteine polytope
Transmembranproteine, die in der Regel als Trimer vorliegen. Jedes Monomer
durchspannt die Membran mehrfach durch antiparallele ß-Strecken. Dabei
kommt es zur Ausbildung von amphiphilen ß-Faltblattstrukturen, die eine
strukturelle Grundlage für die Porenfunktion darstellen.
Topogene Sequenzen äußerer Membranproteine
Die Translokation wurde bei folgenden äußeren Membranproteinen untersucht:
PhoE, OmpA, TonA, OmpF, LamB. Obwohl diese äußeren Membranproteine
konservierte Amoinosäuresequenzen aufweisen, hat man bislang doch kein
richtiges Sortierungssignal ausmachen können.Durch Fusionstudien weiß man
bei OmpA, dass der C-terminale
ß-Strang eine wichtige Rolle für die Zusammenlagerung dieses Proteins in der
äußeren Membran spielt. (Klose et al, 1989) Bei LamA und PhoE hat man eine
ganze Reihe verschiedener Aminosäuren durch andere ersetzt, die meisten
Aminosäureaustausche hatten jedoch meist keinen wesentlichen Einfluß aud die
Membranintegration. Führt man jedoch ein strang-brechendes Prolin in den Cterminalen ß-Strang von OmbA ein, wird die Memnbraninkorporation gehemmt.
Das Gleiche hat man festgestellt, wenn man ein turn-bildendes Glycin in PhoE
integriert. (de Cock et al. 1991). Dieser Glycinrest ist die einzige strikt
konservierte Aminosäure innerhalb eines Segments hoher Homologie
verschiedener äußerer Membranproteine. Neben Glycin spielt auch bei vielen
26
Membranproteinen auch noch ein Phenylargininrest am C-terminalen Ende eine
wichtige Rolle, der wenn er ausgetauscht wird zu einer Abnahme der
Membranintegration führt. (Stryvé et al.,1991).
Zusammenlagerung der äußeren Membranproteine
Die äußeren Membranproteine werden zunächst als lösliche periplasmatische
Intermediäre gebildet bevor sie ihre richtige Konfirmation innerhalb der äußeren
Membran einehmen. Der Übergang vom löslichen Intermediär zu dem in die
äußere Membran eingebetteten PhoE erfolgt über die Ausbildung eines Dimers
und Trimers. Während dieser Weg durch PhoE beschritten wird, lagert sich
LamB zuerst in der Cytoplasmamembran bei E. coli ein und von hier erreicht es
die äußere Membran vermutlich durch laterale Diffusion über die Kontaktstellen.
Lipoproteine
Das Braun'sche Lipoprotein in E. coli, ein Prototyp von lipid-modifizierten
Proteinen der Bakterienzellhülle wird Sec-abhängig durch die
Cytoplasmamembran transloziert. Von der Spaltstelle der Signalsequenz wird
das Precursorprotein an einem konservierten Cysteinrest modifiziert. Die
Prozessierung erfolgt durch die Signal Peptidase II (Müller.1992), welche durch
Globomycin gehemmt wird. (Hayashi und Wu, 1990) Interessanterweise sind
Proteinvorstufen, die in verschiedenen Sec-Mutanten akkumulieren nicht mit
Glycerid modifiziert, was darauf schließen läßt, dass Sec-abhängige Schritte den
Modifikations Reaktionen vorausgehen (Sugai und Wu, 1992).