Proteinproduktion und Vermehrung zwecks Bildung eines

Proteinproduktion und Vermehrung zwecks
Bildung eines proteinbasierten Sensors.
Abgabedatum: 22.03.2015
Erarbeitet von:
Celina Bernasconi (Theresianum Ingenbohl)
Jan Bitterli (Alte Kantonsschule Aarau)
Betreut durch:
Dr. Julien Hibblot (EPFL)
Prof Kai Johnsson (EPFL)
Und deren Team (EPFL)
Fragestellung:
Diese Arbeit befasst sich mit der Frage, wie Proteine gezielt erzeugt und vermehrt werden
können, konkret möchte man aus mehreren Proteinen einen Sensor bauen, welcher in der
Lage ist, uns Informationen über das Vorhandensein bestimmter Stoffe (z.B im Blut) zu
geben. Um dieses Problem anzugehen ging man wie folgt vor:
Man wollte gezüchtete Bakterien dazu bringen, ein gewünschtes Protein zu synthetisieren.
Dazu hat man durch Kombination der PCR Produkte zweier anderer Plasmiden eine
bestimmte DNA Sequenz in Form von Plasmiden erzeugt und in das Bakterium eingeschleust.
Nachdem die Bakterien eine ausreichende optische Dichte aufwiesen, wurde die Produktion
der Proteine durch IPTG induziert. Durch Methoden wie IMAC und STREP-Aufreinigung
konnte ein hoher Reinheitsgrad an Proteinen erzeugt werden. Am Ende sollten die fünf
Proteine, deren Bildung man mit spezifisch ausgewählten Genen induziert hat, klar durch ihre
u.a Fluoreszenz zu differenzieren sein, sie stellen einzelne Bausteine eines Sensors bzw. einen
Sensor selbs dar.
Methodik:
Erst mussten mehrere Bakterienstämme mit der Gewünschten Gensequenz erstellt werden,
damit diese das Protein of interest produzieren konnten. Dies tat man mit Hilfe von PetPlasmiden, deren Gencode künstlich durch ausnutzen der PCR erzeugt wurde. Von Interesse
waren fünf Gensequenzen, welche für unterschiedliche Lumineszenzen verantwortlich sind.
In einem Zwischenschritt bereitete man fünf Flüssignährlösungen LB-Medium (20g LB à
1Liter) für die später präparierten Bakterien vor. Diese Nährlösungen wurden autoklaviert.
Im folgenden Schritt mussten die Bakterien mit dem Plasmid transformiert werden. Dazu
bediente man sich der Elektropolation, die Bakterienstämme wurden im Elektroporatot einer
hohen Spannung von 1900V ausgesetzt, dabei öffnete sich die Zellmembran kurz, damit die
Plasmide in das Bakterium hinein diffundieren konnten. Die transformierten Bakterien
wurden in eine 50ml Nährlösung gegeben, welche man mit 10.1 mg/l Ampicilin und 0.1
Chloroamphenicol (1:1000) anreicherte. Da im erwünschten Gen eine Ampicilinresistenz
enthalten war, wurde sichergestellt, dass die nur die erwünschten Bakterien in wachsen, da
Fremdbakterien von den beiden Antibiotika abgetötet wurden.
Die erhaltenen Bakterien wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, bis sie die gewünschte
optische Dichte (OD = 0,6) erreichten (Ende der Exponentiellen Phase). Diese Bakterien
wurden in die vorbereiteten 5x1 Liter-Nährlösungen gegeben und für vier Stunden bei 37°C
inkubiert. Vorgängig gab man 1 ml MgSO4(aq) (um die Produktionskapazität zu erhöhen) und
1 ml Ampicilin hinzu. Als diese Bakterien wiederum die gewünschte OD von 0,4-0,6
erreichten wurde IPTG beigegeben, um die Proteinherstellung im Bakterium zu induzieren.
Dies geschieht in der Theorie wie folgt:
Das Plasmid selbst beinhaltet nebst der Ampicilinresistenz und dem Gen of Interest (GOI) ein
Lac-Operon. Dieses verhindert das Anheften der RNA Polymerase. Nun wird das Lac I von
dem beigegebenen IPTG verdrängt, woraufhin die RNA Polymerase (Protein) an Stelle des
Lac I treten konnte und somit die Vermehrung des GOIs (von der DNA des Plasmids) in RNA
induzieren konnte (transcription). Die produzierte RNA wird von Ribosomen des Wirts zu
den POIs (Poteins of interest) umgebaut (translation).
Dafür stellte man das Gemisch wieder bei 17°C in den Inkubator, damit die Produktion des
Proteins langsam genug war, um Fehler bei der intrazellulären Herstellung zu vermeiden.
Nun bereitete man die Aufreinigung vor, dafür wurde erst die IMAC (Ausschreiben) Methode
angewendet. Die Idee basiert auf der Tatsache, dass am Protein ein HIS-TAG angefügt ist, der
eine Nickel-affinität besitzt. Um diese Gegebenheit zur Aufreinigung auszunutzen wurde
Nickel-NTA in Tropftrichter gefüllt, wobei das Ethanol im Nickelgemisch durch einen
proteinfreundlichen Buffer ersetzt wurde. Währenddessen zentrifugierte man die
Bakterienstämme welche die unterschiedlichen Proteine produzierten. Es entstanden zwei
Phasen, eine Feste und eine Flüssige. Bei der festen Phase handelte es sich um unsere
Bakterien. Diese wurden mit jeweils 0.25 mg/ml Lysozym (Um die Zellmembran aufzulösen
bzw. zu öffnen) und 0.1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) (um Beschädigungen am
Protein durch Proteasen zu verhindern) vermengt um die Auflösung der Zellmembran
einzuleiten. Die neue Mischung wurde in Eppendorftubes gefüllt und mithilfe eines
Sonicators, welcher über eine Sonde kleine Blasen in das Gemisch führte und somit
Reibungswärme erzeugte, konnte die Zellmembran aufgelöst werden. Nach einer 15minütigen Zentrifugation befand sich am Boden der Tubes ein Pellet- es handelte sich um die
Reste der Zellmembran. Die Proteine waren in gelöster Form ebenfalls enthalten und wurden
zur IMAC (Immobilized metal ion affinity chromatography)Aufreinigung in die mit NickelNTA(Nitrilotriessigsäure) bestückten Tropftrichter gegeben. Aufgrund der oben erläuterten
Affinität des HIS-TAGS blieben die erwünschten Proteine in der Säule, während der unaffine
Rest ausfloss. Anschliessend wurde mit Elutionspuffer, welcher 500 mM Imidazol enthielt,
eluiert. Dadurch konkurriert Imidazol um die Bindung des HIS TAGS mit dem Nickel. Auf
diese Weise konnte man Phasenweise die nun IMAC purifizierten Proteine auffangen. Im
Folgenden wurde die STREP-TAG Purifikation eingeleitet. Die immer noch gelösten Proteine
wurden in mit STREPtavidin befüllten Tropftrichter gegeben. Nachdem die gewünschten
Proteine im Tropftrichter gesammelt waren, wurde wiederum ein Elutionsmittel beigegeben
(BIOTIN), welches die STREP-TAG Bindung wieder Rückgängig machte. Wie bei der IMAC
Aufreinigung wurde das nun sehr reine Protein aufgefangen. Dies wurde in Filterküvetten
aufkonzentriert, um später mit 87%-igem Glycerin bei -20°C aufbewahrt werden zu können.
Um die Aufreinigung zu überprüfen, Wurde eine SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis) verwendet. Weiter wurde eine Flüssigkeit beigegeben,
welche das Protein zur Entfaltung anregten. Dies gewährleistete ein einheitliches Volumen
derselben Proteine, was für diese Art der Analyse von essentieller Bedeutung ist.
Bevor man die Proteine in das vorbereitete Gel gab, wurden sie noch bei 95°C erwärmt und es
wurde ein Mittel zur Einfärbung beigegeben, ersteres, damit sich die Proteine besser entfalten
liessen und somit alle identischen über das gleiche Volumenverfügten, letzteres um sie besser
in der Matrix sehen zu können.
Man installierte eine Anode und eine Kathode welche einen Stromfluss durch das Gel
erzeugten. Diese Art der Elektrophorese basiert auf der Tatsache, dass sich im (SDS-Gel)
Hydrophobe, elektrisch geladene Teilchen befinden, welche sich an Hydrophobe Sequenzen
unseres Proteins heften. Damit wird gewährleistet, dass die Proteine durch das SDS-Gel
gezogen werden. Dieses wirkt wie ein Netz mit immer kleiner werdenden Maschen. Dies hat
zur Folge, das wir anhand der letztendlichen Position unseres Proteins in der Matrix und über
den Vergleich mit dem Proteinmarker Rückschlüsse über das Gewicht bzw. die Grösse der
Protein of interest ziehen konnten. Denn es wurden parallel nebeneinander gelöste Proteine
aus verschiedenen Stadien der Aufreinigung laufen gelassen – unlösliche Phase, lösliche
Phase, nach Nickel-Aufreinigung, nach Streptavidin-Aufreinigung. Dies ermöglichte eine
Bestätigung bezüglich Reinheit und Grösse des Proteins.
Resultate:
Nach dem lambert beer`schen Gesetz wurde die Proteinkonzentration bestimmt:
𝐸
Protein X: [c] = (𝜀∗𝑑)
𝑙
Protein (2)= 𝜀 = 64065 𝑚𝑜𝑙∗𝑐𝑚
C=195,1 µM
𝑙
Protein 3= 𝜀 = 36565 𝑚𝑜𝑙∗𝑐𝑚
C=2147 µM
𝑙
Protein (1)= 𝜀 = 108220 𝑚𝑜𝑙∗𝑐𝑚
C=126.3µM
𝑙
Protein(4)= 𝜀 = 108220 𝑚𝑜𝑙∗𝑐𝑚
C=126.3µM
Diskussion:
Die konstruierten Proteine können vielseitige Funktionen übernehmen. In unserem Fall war es
u.a. die Fluoreszenz. Der hergestellte Sensor könnte also auch andere messbare Signale von
sich geben.
Was allgemein von grosser Bedeutung ist, ist die Tatsache dass die gebildeten Sensoren
komplexe Analyseverfahren ersetzen. So kann z.B die Konzentration eines Metaboliten (unter
anderem das Methotrexat im Blut) mit unserem Sensor gemessen werden. Bis anhin sind
komplexe Verfahren dafür die Regel.
Schlussfolgerung:
Alle Produktionsschritte scheinen erfolgreich gewesen zu sein, denn die Analyse schien mit
den Erwartungen übereingestimmt zu haben.
Dank:
Wir danken Der EPFL und insbesondere Dr. Julien Hiblot und Prof. Kai Johnsson für das
Bereitstellen ihres Rates und der Technischen Mittel. Wir danken Ihnen auch für die
Betreuung während der Woche.
Wir danken dem gesamten Team der Abteilung, hierbei vorallem Ireen Kulish, welche uns
immer wieder mit Rat zu Seite standen und uns auch vom Projekt unabhängige Sachen näher
brachten.
Weiter danken wir der Institution SJF welche uns diese Studienwoche und dieses Projekt als
ganzes ermöglicht hat.