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Jahrbuch 2008/2009 | Stemmler, Marc | Die Funktion der Cadherine bei der Musterbildung des
Säugetierembryos
Die Funktion der Cadherine bei der Musterbildung des
Säugetierembryos
The role of cadherins during patterning of the mammalian embryo
Stemmler, Marc
Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik, Freiburg
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Cadherin-vermittelte Zelladhäsion spielt bei der Musterbildung multizellulärer Organismen eine zentrale Rolle.
Dabei übernehmen insbesondere E- und N-Cadherin eine w ichtige Funktion, deren Expression sich im
Organismus häufig gegenseitig ausschließt. W ährend bedeutender morphogenetischer Prozesse w ird die
Expression von E- auf N-Cadherin umgeschaltet. Dies w ird bei normaler Entw icklung, aber auch bei
Metastasenbildung von Tumoren beobachtet und geht mit veränderten Eigenschaften der Zellen einher.
W issenschaftler am Max-Planck-Institut für Immunbiologie untersuchen die molekularen Unterschiede und die
Genregulation von E- und N-Cadherin.
Summary
Cadherin-mediated cell-cell adhesion plays a pivotal role in patterning of multicellular organisms. In particular
E- and N-cadherin have an important function during development and their expression is usually mutually
exclusive. During important morphogenetic events expression is sw itched from E- to N-cadherin. This cadherin
sw itch is observed during normal development, but also during tumorigenesis and metastasis and is
accompanied by changes in cell morphology and their molecular properties. Scientists at the MPI of
Immunobiology have focused on the molecular differences betw een and the gene regulation of E- and Ncadherin.
Cadherine errichten Zell-Zellkontakte und erhalten diese aufrecht
Cadherin
ist
der
Oberbegriff
einer
Proteinüberfamilie
von
transmembranen,
kalziumabhängigen
Adhäsionsmolekülen. Die am besten untersuchten Vertreter sind in der Unterfamilie der klassischen bzw . TypI-Cadherine zusammengefasst. Zu ihnen zählen E- und N-Cadherin (E - embryonales/epitheliales bzw . N neuronales Cadherin, benannt nach dem Gew ebe, in dem sie erstmals isoliert w urden). Die prozessierten
klassischen Cadherine sind im extrazellulären Teil aus fünf sich w iederholenden Motiven, den so genannten
Cadherin-Domänen, aufgebaut, die tandemartig angeordnet sind und paarw eise eine Bindungsstelle für
Kalziumionen bilden. Die intrazelluläre Domäne ist u. a. an beta-Catenin gekoppelt, w odurch über die Bindung
an alpha-Catenin eine Verankerung des Adhäsionskomplexes an das Aktin-Zytoskelett erfolgt [1]. Die Funktion
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der
Cadherine
in
der
Zelle
lässt
sich
am
besten
am
Prototyp-Molekül
E-Cadherin
in
Epithelien
veranschaulichen. Die Expression von E-Cadherin führt zur spezifischen Lokalisation an der basolateralen
Membran, w as maßgeblich zur Zellpolarisierung beiträgt. Konzentriert finden sich die Moleküle in den adherens
junctions, die im Elektronenmikroskop von den apikal liegenden tight junctions und den basal formierenden
Desmosomen unterschieden w erden können (Abb. 1).
Zelluläre Cadherin-Lokalisation am Beispiel von E-Cadherin In
e inschichtige n Epithe lie n wie im Da rm tra k t sa m m e lt sich EC a dhe rin a n de r ba sola te ra le n Me m bra n und ist in de n
adherens junctions (AJ) be sonde rs k onze ntrie rt vorha nde n, die
sich e le k trone nm ik rosk opisch von de n tight junctions (TJ) und
de n De sm osom e n (De s) unte rsche ide n la sse n. De r
m ole k ula re Aufba u de s C a dhe rin-C a te nin-Kom ple x e s ist im
re chte n Te il de r Abbildung da rge ste llt. Mole k üle e ine r Ze lle
ge he n übe r Inte ra k tione n be na chba rte r C a dhe rin-Dom ä ne n
(EC 1-EC 2) la te ra le Bindung e in. Die se r m ultim e re Kom ple x
inte ra gie rt m it gle iche n Kom ple x e n de r be na chba rte n Ze lle
(EC 1-EC 1).
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Streng kontrollierte zeitliche und räumliche Expression der Cadherine ist bei Säugetieren essentiell für eine
korrekte Embryonalentw icklung . Das Fehlen von E-Cadherin führt bereits zum Absterben des Embryos
w ährend der Präimplantationsphase, da sich keine Blastozyste mit funktionsfähigem Trophektoderm bildet,
das normalerw eise die innere Zellmasse und Blastocoelhöhle umschließt [2]. Obw ohl N-Cadherin-defiziente
Embryonen erst am Tag 9.5 der Embryonalentw icklung aufgrund eines Herzdefekts absterben, ist bereits der
korrekte Wechsel der Cadherin-Expression w ährend der Gastrulation ab dem Tag E6.0 für den reibungslosen
Ablauf
der
w eiteren
Entw icklung
entscheidend
[3].
W ährend
dieses
Vorgangs
schalten Ecadherin
exprimierende Zellen aus dem Ektoderm, die durch den so genannten Primitivstreifen w andern und Mesoderm
bilden, das Gen ab und stattdessen das Ncadherin-Gen an. Dieses Umschalten in der Genexpression führt
dazu, dass die Zellen ihre epitheliale Polarität im Verband verlieren und die Fähigkeit zur Zellw anderung
gew innen. Dieser Vorgang des Wechsels der Cadherin-Expression korreliert häufig mit bedeutenden
morphogenetischen
Ereignissen
w ährend
der
Embryonalentw icklung,
w ird
allerdings
auch
oft
beim
Voranschreiten der Krebsentstehung beobachtet. Bei der Tumorentw icklung findet sich dieser Wechsel an der
Schw elle zw ischen gutartigem Adenom und bösartigem Karzinom, da durch den Wegfall von E-Cadherin der
Gew ebeverband aufgelöst w ird und durch die Neusynthese von N-Cadherin die Möglichkeit zur Zellw anderung
und Metastasierung gew onnen w ird. Aufgrund der Bedeutung der Cadherine für die Embryogenese und
aufgrund der Beobachtungen, die aus Analysen von Tumoren erhalten w urden, ist es w ichtig zu verstehen,
w elche molekularen Unterschiede zw ischen E- und N-Cadherin für die entgegengesetzten Eigenschaften
verantw ortlich sind. Ebenso dient die Aufklärung der molekularen Mechanismen der transkriptionellen
Regulation der zugehörigen Gene dem Verständnis von embryonaler Musterbildung und Krebsentstehung
(Abb. 2).
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Phänotyp nach A ustausch des Ecadherin-Gens durch
Ncadherin W ird Ncadherin-Ex pre ssion durch da s Einfüge n de r
k odie re nde n R e gion in da s Ecadherin-Ge n in de r EcadherinEx pre ssionsdom ä ne fe hle x prim ie rt, ste rbe n die Em bryone n
be re its in de r P rä im pla nta tionspha se . Ncadherin k a nn Ecadherin
zwa r in de r Funk tion be i de m Vorga ng de r Morula -Kom pa k tion
e rse tze n, ist a be r nicht in de r La ge , die Bildung e ine s
funk tionsfä hige n Trophe k tode rm s zu ge wä hrle iste n.
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Fehlexpression von Ncadherin in der Ecadherin-Expressionsdomäne
Die
Hausmaus
(Mus
musculus) stellt einen
idealen
Modellorganismus
zum Verständnis
embryonaler
Musterbildung bei W irbeltieren dar und w ird darüber hinaus zur Erforschung molekularer Mechanismen der
Tumorentw icklung
herangezogen.
In
der
Arbeitsgruppe
um
Marc
Stemmler
w ird
die
Präimplantationsentw icklung im Hinblick auf die Beteiligung der Cadherine an diesen Vorgängen untersucht.
Die beiden Mitglieder der Superfamilie E- und N-Cadherin w eisen sehr hohe Übereinstimmung in der
Peptidsequenz
auf
und
binden
an
gemeinsame
intrazelluläre
Interaktionspartner
[1].
Besonders
bemerkensw ert ist aber, dass beide Moleküle fast ohne Ausnahme in einem sich gegenseitig ausschließenden
Muster im Embryo sow ie im adulten Organismus exprimiert w erden.
In der Arbeitsgruppe w ird untersucht, w elche molekularen Unterschiede zw ischen beiden Vertretern der
Cadherine bestehen. Ein zentraler Punkt dieser Analyse ist die Frage, ob N-Cadherin die Funktion von ECadherin bei der Bildung einer Blastozyste ersetzen kann. Durch das Einfügen der kodierenden Sequenz des
Ncadherin-Gens
in
den Ecadherin-Locus
kann
experimentell
die
Genexpression
bereits
in
der
Präimplantationsentw icklung umgeschaltet w erden [4]. Der Vorgang der Morula-Kompaktion, der nach dem 8-
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Zellstadium einsetzt, benötigt die Funktion von E-Cadherin. W ird stattdessen ausschließlich Ncadherin
exprimiert, ist dieser Vorgang nicht beeinträchtigt. Jedoch ist die anschließende Bildung des Trophektoderms
und die Formierung der Blastozyste in diesen Embryonen nicht mehr möglich [4]. Zw ar w ird das epitheliale
Differenzierungsprogramm korrekt initiiert, w as sich aus Untersuchungen von molekularen Markern ergeben
hat, kann aber nicht abgeschlossen w erden. Die Zellen runden sich ab, verlieren die charakteristische Polarität
und sterben ab. Die Ergebnisse zeigen, dass N-Cadherin die Funktion von E-Cadherin bei der MorulaKompaktion ersetzen kann, nicht aber bei der Bildung der Blastozyste. Dies streicht eine einzigartige Rolle von
E-Cadherin w ährend dieser Vorgänge heraus.
Was nun der Grund für das Scheitern von N-Cadherin als Ersatz ist und w elche Eigenschaft diesem Molekül
fehlt, bleibt noch zu klären. Denkbar sind Abw eichungen in der Adhäsionskraft, die bei N-Cadherin
unzureichend
ist,
bisher
unentdeckte
Unterschiede
von
intrazellulären
Interaktionspartnern
oder
Veränderungen von Signaltransduktionskaskaden, die zu einer Abw eichung des epithelialen Programms
führen.
Um diesen Möglichkeiten auf den Grund zu gehen, w erden entsprechend des Ncadherin-knock-in-Allels w eitere
Gensubstitutionen vorgenommen. Dabei entstehen synthetische Cadherin-Gene, die ein Molekül exprimieren,
das aus dem extrazellulären Teil von E-Cadherin und dem intrazellulären Teil von N-Cadherin besteht (und
umgekehrt). Diese sollen dabei helfen aufzudecken, w elcher Teil des E-Cadherinmoleküls für die korrekte
Bildung des Torphektoderms entscheidend ist (Abb. 3).
Vergleich von E- und N-Cadherin O bwohl E- und N-C a dhe rin im
e ntwick e lnde n Em bryo in e ine m sich ge ge nse itig
a usschlie ße nde n Muste r e x prim ie rt we rde n, be sitze n be ide
Mole k üle große Hom ologie in de r Am inosä ure se que nz (64%
e x tra ze llulä r, 70% intra ze llulä r) und sind übe r gle iche
Inte ra k tionspa rtne r m it de m Zytosk e le tt ve rbunde n. Um die
e inziga rtige Funk tion von E-C a dhe rin be i de r Bildung de s
Trophe k tode rm -Epithe ls zu unte rsuche n, wurde n in de r
Arbe itsgruppe um Ma rc Ste m m le r Ge ne k onstruie rt, die zu
e ine r Ex pre ssion von chim ä re n C a dhe rinm ole k üle n a us E- und
N-C a dhe rin führe n. Durch die re gula torische n Ele m e nte ist
ge wä hrle iste t, da ss die se wä hre nd de r Em bryona le ntwick lung
a usschlie ßlich in Ze lle n de r Ecadherin-Ex pre ssionsdom ä ne
synthe tisie rt we rde n.
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Transkriptionelle Regulation der Ecadherin-Expression
Um die Aufgabe im Säugetierembryo w ahrzunehmen und damit der Wechsel von einem zum anderen Mitglied
der Superfamilie korrekt abläuft, müssen die Cadherine und ihre Expression streng kontrolliert w erden. Da
eine Fehlexpression zur Tumorentw icklung beiträgt und Metastasen begünstigt, ist eine Kontrolle auch in
differenzierten Gew eben im adulten Organismus unerlässlich. Es gilt insbesondere, eine Abschaltung des
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Ecadherin-Gens zu verhindern. In der Arbeitsgruppe um Marc Stemmler w ird daher die transkriptionelle
Regulation von Ecadherin untersucht. Dabei steht im Vordergrund, w elche cis-regulatorischen Elemente und
Transkriptionsfaktoren den Locus aktivieren und seine Expression aufrechterhalten.
Neben den 16 Exons ist das für die klassischen Cadherine charakteristische große Intron 2 auffällig, das im Fall
vo n Ecadherin 50% des Locus umfasst. Interessanterw eise finden sich in diesem Intron eine Vielzahl von
DNaseI-hypersensitiven Stellen (DHS), die Hinw eise auf die Anw esenheit von cis-regulatorischen Elementen
geben. Hingegen ist in der Promoterregion nur eine einzige DHS am Transkriptionsstart vorhanden. Darüber
hinaus w urden hauptsächlich Repressoren identifiziert, die alle an eine spezielle DNA-Sequenz (E-box) am
Promoter binden und das Gen w ährend der Gastrulation oder in malignen Tumoren abschalten. Um Aufschluss
über
die
biologische
Bedeutung
der
vermuteten
cis-regulatorischen
Elemente
zu
erhalten, können
experimentell Fragmente des Promoters mit Sequenzen aus Intron 2, die DHS beinhalten, isoliert und
kombiniert w erden [5]. Die Aktivität eines Reportergens (lacZ), das hinzugefügt w ird, kann in einem zeitlichen
und räumlichen Rahmen w ährend der Embryonalentw icklung in transgenen Mäusen untersucht w erden
(transgene Mäuse w erden durch zufällige Integration heterologer DNA-Sequenzen ins Genom erhalten). Diese
Analysen konnten eindeutig zeigen, dass der Promoter alleine unzureichend ist, um eine Ecadherin-spezifische
Expression zu gew ährleisten. Hingegen ist für die Aktivierung des Locus im korrekten räumlichen und zeitlichen
Fenster die Anw esenheit der Intron 2-DNA-Sequenzen unbedingt erforderlich [5]. Bestätigt w urden diese
Ergebnisse durch Manipulationen direkt am Ecadherin-Gen (gerichtete Integration). W ird das gesamte Intron 2
aus dem Locus herausgeschnitten, kann keine Expression eines Reportergens w ährend der frühen
Embryonalentw icklung (E7.5) mehr nachgew iesen w erden und ist in späteren Stadien, ab E11.5, nur auf sehr
niedrigem Niveau vorhanden [6]. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der cis-regulatorischen
Elemente in Intron 2 für die Aktivierung aber auch für die Aufrechterhaltung der Ecadherin-Expression (Abb. 4).
Einfluss von regulatorischen Elementen in Intron 2 des
Ecadherin-Gens auf die Expression lacZ-R e porte rge nEx pre ssion gibt durch Bla ufä rbung Hinwe ise a uf die EcadherinGe na k tivitä t (Eca d-In2flox ). W ird da s Intron 2 e ntfe rnt,
ve rschwinde t Ecadherin-spe zifische Ex pre ssion vollstä ndig im
Sta dium E7.5 und ist k a um de te k tie rba r be i E11.5 (Eca dIn2flox ). Die se Erge bnisse unte rstre iche n die Be de utung
die se r Se que nze n be i de r Ge ne x pre ssion.
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Ausblick
Die klassischen Cadherine spielen w ährend der Embryonalentw icklung und Organogenese eine entscheidende
Rolle. Der Wechsel der Expression zw ischen E- und N-Cadherin korreliert häufig mit einschneidenden
morphogenetischen Ereignissen. Dieser so genannte cadherin switch führt dazu, dass sich die Morphologie der
Zellen und ihre Eigenschaften verändern. Dieser epithelial-mesenchymale Übergang w ird w ährend der
Embryonalentw icklung (Gastrulation), aber erstaunlicherw eise auch bei der Tumorentw icklung beobachtet.
Welche unterschiedlichen molekularen Funktionen besitzen E- und N-Cadherin, durch die diese drastische
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Veränderung der Zellmorphologie und der Wechsel der Zelleigenschaften zu erklären sind? Führt bereits der
Wechsel der Cadherinexpression zur vollständigen Aktivierung des epithelial-mesenchymalen Programms?
Obw ohl die klassischen Cadherine ausgiebig untersucht w urden, fehlt dennoch ein detailliertes Verständnis
über die molekulare Basis, die die strukturellen und funktionellen Unterschiede zw ischen E- und N-Cadherin in
physiologischer und pathologischer Situation erklären könnten. Darüber hinaus ist eine sorgfältige Analyse der
Genregulation notw endig, um die Funktion der Cadherine und ihrer Gene w ährend der Embryogenese sow ie
bei der Entstehung von Krebs aufzudecken und zu verstehen.
Originalveröffentlichungen
Nach
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Editor)Personenerw eiterungPublikationserw eiterungTeaser
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[1] M.P. Stemmler:
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Gene replacement reveals a specific role for E-cadherin in the formation of a functional trophectoderm.
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[5] M. P. Stemmler, A. Hecht, B. Kinzel, R. Kemler:
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Developmental Dynamics 227, 238-245 (2008).
[6] M.P. Stemmler, A. Hecht, R. Kemler:
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Development 132, 965-976 (2005).
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