Autoradiografische Untersuchungen der

1160
W. F. KRÜSMANN, H. KASEMIR, W. AX UND H. FISCHER
Immunologische Studien am Omentum V
Autoradiografische Untersuchungen der Mesothelproliferation
an ductus thoracicus drainierten oder mit Antithymozytenserum
behandelten NMRI-Mäusen
Experimental Lymphopenia causes reduced mesothelial Proliferation following antigenic Stimulation
W. F. K r ü s m a n n , H. K a s e m i r , W. A x und H. F i s c h e r
Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Medizinische Universitätsklinik, Freiburg i. Br.
(Z. Naturforsch. 25 b, 1160— 1163 [1970] ; eingegangen am 30. Mai 1970)
Neonatally thymectomized mice show a markedly reduced mesothelial proliferation following an
antigenic stimulus. As thymectomy causes a drastic reduction of circulating lymphocytes, lympho­
penia may be the cause of the reduced mitotic rate of mesothelial cells. In order to prove this
hypothesis, lymphopenia was caused by a) drainage of the thoracic duct and b) by injection of
anti-thymocyte serum. In both types of experiments a drastic reduction of mesothelial proliferation
was observed showing good correlation with the degree of lymphopenia. These results indicate that
lymphocytes of thymic origin release mitosis promoting factors and thereby contribute to an im­
mune response.
Bei früheren immunologischen Studien am Omen­
tum majus der Maus konnten wir zeigen, daß einem
intraperitonealen Antigenstimulus eine Prolifera­
tionswelle der Mesothelzellen folgt1-2. Diese Mesothelzellproliferation ist bei neonatal thymektomierten Mäusen signifikant erniedrigt2’ 3.
Neonatal thymektomierte Mäuse zeigen eine Lymphopenie 4~7. Es lag daher nahe zu prüfen, ob auch
bei Lymphopenien, die durch Antihymozytenserum
oder durch Lymphdrainage des ductus thoracicus
hervorgerufen werden, die einem Antigenstimulus
folgende Mesothelzellproliferation erniedrigt ist.
Material und M ethodik
Thymektomie oder Scheinoperation: Schwangere
SPF Mäuse (NMRI) wurden vom Zentralinstitut für
Versuchstierzucht, Hannover, bezogen und bis zum Ende
der Schwangerschaft unter sauberen konventionellen
jedoch nicht SPF Bedingungen gehalten. Die Thymekto­
mie oder Scheinoperation der Tiere jeden Wurfes er­
folgte innerhalb von 24 Stdn. nach der Geburt8. Zum
Schutz vor Infektionen erhielten die Muttertiere und
die operierten Tiere Achromycin im Trinkwasser
(30 mg//). 40 Tage nach der Operation wurden aus
der Schwanzvene der thymektomierten oder scheinopeSonderdruckanforderungen an Dr. W. F . K r ü s m a n n , M P I
f. Immunbiologie u. Medizinische Universitätsklinik,
D-7800 Freiburg i. Brsg.
1 H. M a l c h o w . W. Ax u. H.
F is c h e r , Z. Naturforsch. 24
b.
61 [1969],
2 W.
F. K r ü s m a n n , H. K a s e m ir . W. Ax u. H. F is c h e r . Z.
Naturforsch. 24 b. 1419 [1969].
F . K r ü s m a n n . H. K a s e m ir u. H. F i s c h e r . Nature
[London] 222, 1195 [1969].
3 W.
rierten Tiere Blut für die Leukozytenzählung und
einen Blutausstrich entnommen. Zu diesem Zeit­
punkt unterschieden sich die operierten Tiere nicht in
Größe, Gewicht oder Aussehen von nicht operierten
gleichaltrigen Kontrolltieren. Die operierten Tiere wur­
den getötet und bei den thymektomierten Mäusen das
Mediastinum histologisch wie früher beschrieben2 auf
Thymusreste geprüft.
Antithymozytenserum: Das Antithymozytenserum
(ATS) wurde nach mehrfacher Immunisierung von
einem 2500 g schweren Kaninchen (schwarze Alaska)
gewonnen. Zur Erstimmunisierung wurden 250 • 106
NMRI-Thymozyten in komplettem Freundschen Adju­
vans i.m. injiziert. Am 28. Tag und am 49. Tag nach
der Erstimmunisierung wurden 500-IO6 NMRI-Thy­
mozyten i.v. injiziert. Am 56. Tag nach der Erstimmuni­
sierung wurde durch Herzpunktion Blut entnommen.
Das Serum wurde 30 min bei 56 cC dekomplementiert.
Der Hämagglutinationstiter betrug 1 : 80 und wurde
durch Absorption mit NMRI-Erythrozyten auf 1 : 4 ge­
senkt. Der Zytotoxizitätstiter des absorbierten ATS be­
trug im Trypanblautest 1 : 5000 9.
Als Kontrollserum (KS) wurde das dekomplementierte Serum eines unbehandelten Kaninchens benutzt,
das einen Zytotoxizitätstiter von 1 : 10 aufwies. Die
Sera wurden vor dem Gebrauch durch Millipore-Filter
(Porenweite 0.2 jum) steril filtriert. 8 weibliche ca.
25 g schwere NMRI-Mäuse (Zentralinstitut für Ver­
suchstierzucht, Hannover) erhielten 1 ml ATS und 8 wei4 D . M e t c a l f , Brit. J. Haemat. 6, 324 [1960].
5 J. F. A . P. M i l l e r , Lancet 2, 748 [1961].
6 R . A . G o o d . A . P . D a lm a s s o . C . M a r t i n e z ,
O. K.
A r c h e r . J . C. P ie r c e u. B. W . P a p e r m a s t e r . J. exp. Me­
dicine 116, 773 [1962].
7 V. P a r r o t u . J. E a s t , Nature [London] 195. 347 [1962].
8 J. F. A . M i l l e r , Brit. J. Cancer 14. 93 [I960].
9 P. A . G o r e r u . P. O ' G o r m a n , Transplantation Bull. 3,
142 [1956].
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1161
IMMUNOLOGISCHE STUDIEN AM OMENTUM V
tere Tiere 1 ml KS subeutan unter die Rückenhaut in­
jiziert. Nach 12 Stdn. wurden aus dem Schwanzblut
Leukozyten gezählt und ein Blutausstrich angefertigt,
anschließend wurden den Tieren zur Auslösung der
Mesothelprolifieration 0,5 ml einer 10-proz. Schaferythrozyten-Suspension 2 intraperitoneal injiziert. 24 Stdn.
nach der intraperitonealen Stimulierung wurden die
Tiere getötet und die Omenten präpariert.
Als weitere Kontrollen erhielten 5 Mäuse 1 ml ATS
s.c., diese Tiere wurden unstimuliert nach 36 Stdn. ge­
tötet und die Omenten präpariert. Der Einbau von 3HThymidin, die Autoradiografie und die Auswertung er­
folgte nach der bereits ausführlich angegebenen Me­
thode2. Die Expositionszeit betrug 7 Tage.
Lymphdrainage des ductus thoracicus: Die Lymph­
drainage des ductus thoracicus wurde an 6 und die
Scheindrainage an 9 weiblichen ca. 25 g schweren
NMRI-Mäusen nach der Methode von B o a k und
W o o d r u f f 10 durchgeführt. Alle Tiere wurden für 27
bis 40 Stdn. auf einer Lauftrommel aufgesetzt, sie er­
hielten Haferflocken und im Trinkwasser einen Zusatz
an 0,9-proz. NaCl-Lösung. Bei den drainierten Tieren
wurden 2.9 bis 5 ml ductus thoracicus Lymphe aufge­
fangen. Nach Abnahme von der Lauftrommel wurde
aus der Schwanzvene Blut für die Leukozytenzählung
und einen Blutausstrich entnommen. Anschließend er­
hielten die Tiere zur Auslösung der Mesothelproliferation eine intraperitoneale Injektion von 0,5 ml einer
10-proz. Schaferythrozyten-Suspension 2. 24 Stdn. nach
der intraperitonealen Injektion wurden die Tiere getö­
tet und die Omenten präpariert. Der Einbau von 3HThymidin, die Autoradiografie und die Auswertung
erfolgten nach der kürzlich angegebenen Methode 2. Die
Expositionszeit betrug 7 Tage.
Alle Blutausstriche wurden nach P a p p e n h e i m
gefärbt, jeweils 100 Leukozyten differenziert und an­
hand der Leukozytenzahl/mm3 die Anzahl der Lympho­
zyten, Granulozyten und Monozyten pro mm3 errech­
net. Die statistischen Berechnungen erfolgten nach dem
S t u d e n t - Test.
Versuch
neonatale Thvmektomie
Kaninchen-anti-Maus-Thvmozvtenserum
Kaninchen-Normalserum
Lym phdrainage des ductus thoracicus
Scheindrainage
Der Einfluß der Thymektomie, der ATS-Injektion
und der Lymphdrainage des ductus thoracicus auf
die Leukozyten im Blut
ln Tab. 1 sind von den Versuchs- und Kontrollgruppen die Mittelwerte der Leukozyten sowie der
Granulozyten und Lymphozyten im Blut, ihre
Standardabweichungen und Signifikanzen aufge­
führt. Die Werte für die Monozyten sind nicht an­
gegeben, da bei keinem Versuch signifikante Unter­
schiede für die Monozyten zwischen Versuchs- und
Kontrollgruppe bestanden.
Bei den neonatal komplett thymektomierten Mäu­
sen war 40 Tage nach der Operation die Leukozyten­
zahl auf im Mittel 4060/mm3 im Vergleich zu
5900/mm3 bei den scheinoperierten Tieren signi­
fikant erniedrigt. Bei der Ausdifferenzierung der
Blutbilder zeigte es sich, daß diese Verminderung
der Leukozyten im peripheren Blut ausschließlich
durch die hoch signifikante Verminderung der Lym­
phozyten auf im Mittel 2820/mm3 bei den komplett
thymektomierten Tieren im Vergleich zu 4540 Lym­
phozyten/mm3 bei den scheinoperierten Tieren zu­
stande kommt.
Bei den mit ATS behandelten Mäusen lag 12 Stdn.
nach der Injektion mit im Mittel 2340 Leukozyten/
mm 3 eine signifikante Leukopenie im Vergleich zu
11630/mm3 bei den mit KS behandelten Tieren vor.
Es fällt dabei auf, daß ganz besonders stark die
Lymphozyten auf im Mittel 1160/mm3 nach der
ATS-Injektion im Vergleich zu 9340/mm3 bei den
mit KS behandelten Tieren reduziert waren, wäh­
rend die Granulozytenwerte der mit ATS behandel-
n
Leukozyten
pro m m 3
9
10
4060 ± 1640
5900 ± 1080
8
8
2340 ± 970
11630 ± 2950
6
8
2820 ± 1200
Kontrolle
neonatale Scheinoperation
Ergebnisse
4510 ± 1790
2 P
0,01
Granulozyten
pro m m 3
1100 ± 1010
2 P
0,8
1240 ±
800
0,001
1100 ±
2010 ±
530
980
0,05
0,1
1050 i
790 ±
570
500
0,3
Lym phozyten
pro m m 3
2820 ± 1000
4540 ±
760
1160 ± 630
9340 ± 1990
1590 ±
950
3530 ± 1610
2P
0,001
0.001
0.025
Tab. 1. Mittelwerte, Standardabweichungen und Signifikanzen (2 P, t-Test) für Leukozyten, Granulozyten und Lymphozyten
im Blut bei den Versuchstiergruppen im Vergleich zu den Kontrolltiergruppen.
10 J. L.
B o a k u.
M. F. A.
W o o d ru ff,
Nature [London] 203,396 [1965].
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1162
W. F. KRÜSMANN, H. KASEMIR, W. AX UND H. FISCHER
ten Tiere nur gering im Vergleich zu den mit KS
behandelten Tieren vermindert waren.
Nach Lymphdrainage des ductus thoracicus be­
stand nur bei den Lymphozytenwerten der drainierten Mäuse mit im Mittel 1590/mm3 im Vergleich zu
3530 Lymphozyten/mm3 bei den scheindrainierten
Tieren ein signifikanter Unterschied. Für die Gra­
nulozytenzahl und für die Gesamtleukozytenzahl er­
gab sich kein Unterschied zwischen Versuchs- und
Kontrollgruppe.
Der Einfluß der ATS-Injektion und der Lym ph­
drainage des ductus thoracicus auf die Mesothel­
proliferation nach i.p. Stimulation
die Zahl markierter Mesothelzellkerne bei den mit
ATS behandelten Tieren auf 3,1% im Vergleich zu
16,4% bei den mit KS behandelten Tieren signifi­
kant vermindert (Abb. 1). An unstimulierten Tieren
waren 36 Stdn. nach s.c. Injektion von 1 ml ATS
1,3% Mesothelzellkerne im Mittel markiert.
Bei den ductus thoracicus drainierten Mäusen
war 24 Stdn. nach intraperitonealer Stimulierung
mit einer Schaferythrozyten-Suspension mit 2 P
<0,01 die Zahl markierter Mesothelzellkerne auf
7,5% im Vergleich zu 21,6% bei den scheindrainier­
ten Tieren signifikant erniedrigt (Abb. 2).
Diskussion
36 Stdn. nach s.c. Injektion von ATS oder KS
und 24 Stdn. nach intraperitonealer Injektion einer
Schaferythrozyten-Suspension war mit 2 P <0,001
unstimuliert
24h nach
S. E. i.p.
24h nach
S.Ei.p.
Abb. 1. % 3H-Thymidin markierter Mesothelzellkerne bei unstimulierten oder intraperitoneal mit Schaferythrozyten (S.E.)
stimulierten NMRI-Mäusen 36 h nach s.c. Injektion von 1 ml
Antithymozytenserum (A.T.S.) oder von 1 ml Kaninchen­
Normalserum (K .S .).
S.D.
25
L D.
24h nach
S. E. i.p.
24h nach
S. E. i.p.
Abb. 2. % 3H-Thymidin markierter Mesothelzellkerne nach
i.p. Injektion von Schaferythrozyten (S.E.) in NMRI-Mäuse
nach Lymphdrainage des ductus thoracicus (L.D.) oder
Scheindrainage (S.D.).
Die Minderung der Mesothelproliferation nach
einem Antigenstimulus bei thymektomierten Mäu­
sen, die wir in früheren Arbeiten beschrieben2’ 3,
warf ein interessantes Problem auf: ist der Einfluß
des Thymus auf die Mesothelproliferation über
einen noch unbekannten hormonalen Faktor als
Fernwirkung zu deuten oder liegt hier eine durch
thymusabhängige Lymphozyten ausgelöste N ahw ir­
kung vor.
Die Beobachtung, daß thymektomierte Mäuse eine
hochsignifikante Lymphopenie aufweisen4-7, regte
zu den vorliegenden Untersuchungen an, bei denen
auf andere Weise eine Lymphopenie hervorgerufen
wurde. Hierbei sahen wir ebenfalls eine Minderung
der Mesothelproliferation nach Antigenstimulus.
Ziehen wir zum Vergleich auch unsere früheren Be­
funde 2 heran, so ergibt sich, daß die neonatale
Thvmektomie, die Anwendung von ATS und die
Lymphdrainage des ductus thoracicus gleichermaßen
sowohl eine Lymphopenie als auch eine Verminde­
rung der Mesothelproliferation nach Antigenstimulation zur Folge haben (Tab. 2). Hieraus ist auf
eine entscheidende Beeinflussung der antigenstimulierten Proliferation des Mesothels durch Lympho­
zyten zu schließen. Ein direkter Einfluß von hormo­
nalen Thymusfaktoren auf die Mesothelproliferation
ohne eine Vermittlung seitens thymusabhängiger
Lymphozyten liegt dagegen nicht vor, da mögliche
endokrine Funktionen des Thymus bei Lymphdrai­
nage des ductus thoracicus nicht gestört sein dürf­
ten.
Untersuchungen am Baumwollgranulom haben zu
ähnlichen Resultaten geführt mit Verminderung der
proliferativen Entzündungsreaktion gleichermaßen
nach neonataler Thvmektomie, nach Lymphdrainage
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IMMUNOLOGISCHE STUDIEN AM OMENTUM V
G ranulo­ L y m p ho ­ Mesothel­
zellmar­
zyten
zyten
kierung
Versuch
Kontrolle
neonatale Thymektomie
neonatale Scheinoperation
Kaninchen-anti-MausThymozytenserum
Kaninchen-Normalserum
Lym phdrainage des
ductus thoracicus
Scheindrainage
0,8
0,001
0,001
0,05
0,001
0,001
0,3
0,025
0,01
Tab. 2. Signifikanzen (2 P, t-Test) für die Abnahme der Gra­
nulozyten, Lymphozyten und Mesothelzellmarkierung bei der
Versuchstiergruppe im Vergleich zur Kontrolltiergruppe.
11 L.
H e ilm e y e r ,
H . K a s e m ir
u.
L.
K erp,
GMM
13
L. K e r p , in: Endocrine
Aspects of Disease Processes, ed. by G. J a s m i n et al.,
Warren H . Green Inc. Publisher, St. Louis, Missouri 1 9 6 8 .
H . K a s e m i r , L. K e r p , M. S t r o e b e u . L. H e i l m e y e r , Vor­
trag 1. Tagung Gesellschaft für Immunologie, Freiburg,
1 6 . 1 0. 1 9 6 9 . Veröffentlichung in Vorbereitung.
H e ilm e y e r ,
H . K a s e m ir
u.
des ductus thoracicus oder während einer Behand­
lung mit heterologem ATS 11_13.
Die Proliferation von Mesothelzellen und von
Bindegewebszellen des Granuloms wird also durch
Lymphozyten gefördert.
In weiteren Untersuchungen am Omentum soll
geprüft werden, ob der am Mesothel nachgewiese­
nen proliferationsfördernden Wirkung von Lympho­
zyten nur eine trophische Lymphozytenfunktion 14
zugrunde liegt oder ob hier von stimulierten Lym­
phozyten gebildete Faktoren wirksam werden, welche
die Mesothelproliferation fördern. Daß stimulierte
Lymphozyten proliferationsfördernde Faktoren bil­
den können, ist bereits aus in vitro Versuchen be­
kannt und durch Proliferationsförderung von Lym­
phozytenkulturen nachgewiesen worden 15_17.
1 3 , 4 41
[1968].
12 L.
1163
Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemein­
schaft durchgeführt.
14 J . F. L o u t i t , L a n c e t 2 , 1106 [1962].
15 R. N.
M a i n i, A. D . M . B r y c e s o n , R. A. W o l s t e n c r o f t
u. D . C. D u m o n d e , Nature [L ondon] 224, 43 [1969].
16 M . J a n is u . F. H. B a c h , Nature [L ondon] 225, 238
[1970],
17 L . E. S p i t l e r u . H. S. L a w r e n c e , J . Im m u n o lo g y 103, 1072
[1969].
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