Der Einfluss nicht-neuronaler Zellen auf das Wachstumsverhalten

Aus der Universitätsklinik
für Hals-, Nasen- Ohrenheilkunde und
Kopf- und Halschirurgie
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. St. Dazert
Der Einfluss nicht-neuronaler Zellen auf das Wachstumsverhalten von
Spiralganglienneuriten
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Christine Anna Elisabeth Wohl, geb. Grabosch
aus Selm
2009
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. S. Dazert
Korreferent: Priv. Doz. Dr. R. Keerl
Tag der Mündlichen Prüfung: 04.05.2010
2
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................6
1.1.
Das periphere auditive System...........................................................................6
1.2.
Klassifikation der Schwerhörigkeit....................................................................9
1.2.1.
1.3.
Therapien der sensorineuralen Schwerhörigkeit......................................10
Gliazellen .........................................................................................................11
1.3.1.
Allgemeine Funktionen der Gliazellen ....................................................11
1.3.2.
Funktionen der peripheren Gliazellen......................................................12
1.3.3.
Gliazellen im Innenohr.............................................................................16
1.3.4.
Glia-ähnliche Zellen im Innenohr ............................................................17
1.4.
Ziel der Arbeit ..................................................................................................18
1.4.1.
Verwendete gliale Antikörper ..................................................................19
2. Material und Methoden....................................................................20
2.1.
Beschichtung der Zellkulturplatten und Medium ............................................20
2.2.
Präparation der Spiralganglien-Explantate ......................................................20
2.3.
Fixierung und Färbung der Spiralganglien-Explantate ....................................22
2.3.1.
Immunhistochemische Färbung mit biotyniliertem Antikörper...............22
2.3.2.
Immunhistochemische Färbung mit Fluoreszenzantikörpern ..................23
2.3.3.
Immunhistochemische Doppelfärbung mit Fluoreszenzantikörpern .......24
2.4.
Auswertung ......................................................................................................25
3. Ergebnisse .........................................................................................26
3.1. Wachstumsverhalten der nicht-neuronalen Zellen bei der Färbung mit
biotinyliertem Antikörper.....................................................................................26
3.2. Wachstumsverhalten der nicht-neuronalen Zellen bei den Färbungen mit den
Fluoreszenzantikörpern ........................................................................................29
3.2.1.
Nicht-neuronale Zellen bei den immunhistochemischen Färbungen mit
GFAP oder Connexin29 ...........................................................................29
3
3.2.2.
Nicht-neuronale Zellen bei der immunhistochemischen Färbung mit
S100-Protein .............................................................................................29
4. Diskussion .........................................................................................37
4.1.
Einfluss der nicht-neuronalen Zellen auf die neuronalen Zellen .....................38
4.2.
Klinische Bedeutung der vorliegenden Ergebnisse..........................................40
4.2.1.
Klinische Bedeutung in Bezug auf das Cochlea-Implantat......................40
4.2.2.
Klinische Bedeutung in Bezug auf Erkrankungen durch Störungen der
Myelinisierung..........................................................................................42
5. Zusammenfassung ............................................................................45
6. Literaturverzeichnis .........................................................................46
4
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Übersicht über das periphere auditive System mit äußerem Ohr, Mittelohr
und Innenohr ..............................................................................................................6
Abbildung 2 Ductus cochlearis und Corti-Organ ...........................................................7
Abbildung 3
Zwei Arten der Myelinisierung im Peripheren Nervensystem (PNS)
durch Schwannzellen ...............................................................................................13
Abbildung 4
Spiralganglion-Explantat mit vergrößertem Ausschnitt (Färbung mit
biotyniliertem Antikörper) .......................................................................................27
Abbildung 5
Spiralganglion-Explantat mit nur wenigen Neuriten
(Färbung mit
biotyniliertem Antikörper) .......................................................................................28
Abbildung 6 Spiralganglion-Explantat mit S100-positiven Zellen...............................31
Abbildung 7
Spiralganglion-Explantat in Einzel- und Doppelfärbung mit ANF und
S100-Protein.............................................................................................................34
Abbildung 8 Spiralganglion-Explantat in Doppelfärbung mit S100-Protein und ANF .
..................................................................................................................................35
Abbildung 9
Zwei unterschiedliche vergrößerte Ausschnittes eines Spiralganglion-
Explantates in der Doppelfärbung mit S100-Protein und ANF ...............................36
5
1. Einleitung
1.1.
Das periphere auditive System
Das periphere Hör- und Gleichgewichtsorgan ist im Os temporale (Schläfenbein)
lokalisiert. Das Hörorgan kann in drei Abschnitte unterteilt werden: Das äußere Ohr, das
Mittelohr und das Innenohr (siehe Abbildung 1). Das äußere Ohr wird aus der
Ohrmuschel und dem Gehörgang gebildet. Es dient dem Auffangen des Schalls und ist
durch das Trommelfell vom Mittelohr abgegrenzt. Das Trommelfell überträgt die
Schallwellen auf die durch Gelenke miteinander verbundenen Gehörknöchelchen
(Hammer, Amboss, Steigbügel). Zugleich hat es eine Schutzfunktion des empfindlichen
Mittel- und Innenohres vor äußeren Einflüssen. Die Gehörknöchelchen grenzen mit dem
Steigbügel an das ovale Fenster, welches die Verbindung zum angrenzenden
flüssigkeitsgefüllten Innenohr bildet. Das Innenohr enthält das Hörorgan (Cochlea) und
das Vestibularorgan.
Abbildung 1 Übersicht über das periphere auditive System mit äußerem Ohr, Mittelohr und
Innenohr (aus Boenninghaus/Lenarz, HNO, 12. Auflage)
6
Der Modiolus (eine knöcherne Längsachse), der die Nerven und Gefäße enthält, und der
Canalis spiralis ossea bilden die Cochlea. Letzterer windet sich zweieinhalb Mal spiralig
um den Modiolus und enthält drei Kanäle, die Scala vestibuli, die Scala media (Ductus
cochlearis) und die Scala tympani, welche mit Flüssigkeit gefüllt sind (siehe Abbildung
2). Die Zusammensetzung dieser Flüssigkeiten differiert. Während Scala tympani und
Scala vestibuli Perilymphe enthalten, die als Ultrafiltrat des Blutplasmas in
ihrer Zusammensetzung mit viel Natrium und wenig Kalium extrazellulären
Flüssigkeiten ähnelt, enthält der Ductus cochlearis Endolymphe, welche von einem
stoffwechselaktiven Bereich an der seitlichen Schneckenwand, der Stria vascularis,
sezerniert wird. Endolymphe setzt sich zusammen aus einer hohen Kalium- und einer
niedrigen
Natrium-Konzentration
Flüssigkeiten.
und
korrespondiert
somit
zu
intrazellulären
Die perilymphatischen Scalen stehen an der Schneckenspitze, dem
Helicotrema, miteinander in Verbindung, wohingegen der Ductus cochlearis dort blind
endet.
Abbildung 2 Ductus cochlearis und Corti-Organ (aus Boenninghaus/Lenarz, HNO, 12. Auflage)
7
Im Querschnitt verfügt der Ductus cochlearis über eine dreieckige Form (siehe
Abbildung 2). Nach oben ist dieser über die für Ionen durchlässige Reissnermembran
von der Scala vestibuli getrennt. Die untere Wand wird von der Basilarmembran
gebildet und grenzt den Ductus cochlearis von der Scala tympani ab. Der
Basilarmembran sitzt das Corti-Organ auf. Man unterscheidet im Corti-Organ die
Stützzellen (von innen nach außen: innere und äußere Pfeilerzellen, Deiters-Zellen,
Hensen-Zellen, Claudius-Zellen) und die in das Stützgerüst eingelagerten Sinneszellen
(eine Reihe innere und drei Reihen äußere Haarzellen). An ihrer apikalen Membran
tragen die Haarzellen feine Härchen, die Stereovilli. Diese haften an der
Tektorialmembran an, welche das Corti-Organ abdeckt und vom Limbus spiralis osseae
der Basilarmembran ausgeht.
Nachdem die durch den äußeren Gehörgang ankommenden Schallwellen über das
Trommelfell auf die Gehörknöchelchenkette und weiter auf das ovale Fenster in das
Innenohr übertragen werden, führen sie zu einer wellenförmigen Volumenverschiebung
der Perilymphe. Das bewirkt zunächst eine Auslenkung der Basilarmembran aus der
Ruhelage an umschriebener Stelle. Diese Ausbauchung der Basilarmembran pflanzt sich
nun in Form einer Wanderwelle mit unterschiedlicher Geschwindigkeit und Reichweite
in Richtung auf das Helicotrema fort. Die zunehmende Breite der Basilarmembran, ihre
Elastizitätsverhältnisse und der abnehmende Durchmesser des knöchernen Kanals geben
der Wanderwelle besondere Charakteristika. Die Amplitude der Wanderwelle wächst in
Richtung auf das Helicotrema bis zu einer gewissen Stelle, an der sie ihre maximale
Auslenkung hat (Tonotopie), und bricht danach rasch zusammen. Die Stelle der
maximalen Auslenkung ist dabei von der Frequenz der ankommenden Schallwelle
abhängig. Schwingungen mit hoher Frequenz haben ihr Amplitudenmaximum nahe des
Stapes, solche mit niedriger Frequenz näher zum Helicotrema. Durch die Auslenkung
der Basilarmembran kommt es zu einer Verschiebung der Tektorialmembran und somit
auch zu einer Verschiebung der Stereovilli der äußeren Haarzelle. Dies bewirkt eine
passagere Öffnung der Ionenkanäle mit folgender Depolarisation. Dies stellt
den
adäquaten
Reiz
der
Sinneszelle
zu
deren
elektrischen
Erregung
dar
(mechanoelektrische Transduktion). Dabei fungieren die drei Reihen an äußeren
8
Haarzellen durch eine Auslenkung der Tektorialmembran als Signalverstärker. Damit ist
gewährleistet, dass auch leise Töne die inneren Haarzellen stimulieren können.
Die Haarzellen selbst bilden keine Nervenfortsätze aus (sekundäre Sinneszellen).
Stattdessen werden sie von den peripheren Dendriten des bipolaren Ganglion spirale
innerviert. Diese befinden sich in einem knöchernen Kanal, dem Rosenthalkanal, medial
des Cortischen Organs. Es werden zwei Typen von Spiralganglienzellen unterschieden
(Harada et al. 1989). Typ-I-Ganglienzellen (95 %) sind dicht myelinisiert und erreichen
mit ihren peripheren dendritischen Neuriten die inneren Haarzellen. Sie sind reich an
intrazellulären Organellen, wie Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum und
Golgi-Apparat. Die äußeren Haarzellen werden von unmyelinisierten Dendriten der
Typ-II-Ganglienzellen (5 %) versorgt. Diese sind vor allen Dingen in der peripheren
Region der Spiralganglien lokalisiert und sind reich an Mikrofilamenten und
Mikrotubulis. Die Axone der Zellen des Ganglion spirale bilden den Hörnerv und leiten
die akustischen Informationen zu den zentralen auditorischen Kerngebieten. Die
Cochlea wird auch von efferenten Fasern innerviert, wobei die meisten an den äußeren
Haarzellen enden.
1.2.
Klassifikation der Schwerhörigkeit
Bei der Schwerhörigkeit differenziert man je nach Entstehungsort in dem auditorischen
System eine Schallleitungs- von einer Schallempfindungsschwerhörigkeit.
Die Schallleitungsschwerhörigkeit beruht auf Veränderungen des äußeren und des
Mittelohres. Dabei dominieren Störungen der Gehörknöchelchenkette, meist auf
Grund einer Fixierung dieser. Dies bewirkt ein Nachlassen oder Verlust der
Schwingungsfähigkeit der Gehörknöchelchenkette und somit der Schallweiterleitung
ins Innenohr. Schallleitungsschwerhörigkeiten sind vielfach chirurgisch therapierbar.
Die Schallempfindungsschwerhörigkeiten beruhen auf einer Beeinträchtigung des
sensorischen Abschnittes der Hörbahn sowie weiter zentral gelegener neuronaler
Strukturen. Diese auch als sensorineural bezeichneten Hörstörungen haben ihren
Ursprung in einer Vielzahl der Fälle im Cortischen Organ des Innenohrs, das die
9
äußeren und inneren Haarzellen enthält. Das Corti-Organ reagiert sehr sensibel auf
äußere Einflüsse wie Medikamente, Durchblutungsstörungen, Stress oder Lärm
(Aran et al. 1999; Bohne, Harding 1992). Auch genetische Defekte können eine
Veränderung der Haarzellen bedingen. Nach heutigen wissenschaftlichen Erkenntnissen
können sich die Haarzellen der Säugetiere unter physiologischen Umständen nicht
regenerieren. Die Schädigungen der Haarzellen sind daher meist irreversibel und führen
zu einem Hörverlust des betroffenen Ohrs. Sekundär kann es zu einer Degeneration von
Spiralganglienneuriten kommen (Roehm, Hansen 2005; Shepherd et al. 2005; Shinohara
et al. 2002).
Weiterhin können sensorineuronale Schwerhörigkeiten durch eine defizitäre oder einen
Verlust der Myelinisierung der cochleären Neurone bedingt sein, z.B. bei der hereditären
sensorischen und motorischen Neuropathie (HSMN) (Stone et al. 1998; Kalaydjieva et
al. 1998). Das Periphere Myelinprotein-22 (PMP-22) ist ein Bestandteil des Myelins,
welches von Schwannzellen gebildet wird. Veränderungen des PMP-22 durch
Punktmutationen oder Duplikaturen des Genes für PMP-22 folgen Erkrankungen, die
mit funktionell beeinträchtigtem Myelin und konsekutiver neuronaler Degeneration
einhergehen. Als Exempel ist hier das Charcot-Marie-Tooth-Syndrom zu nennen,
welches auch mit Taubheit einhergehen kann (Kovach et al. 1999).
1.2.1.
Therapien der sensorineuralen Schwerhörigkeit
Die sensorineurale Schwerhörigkeit ist sehr selten kurativ therapierbar. Eine adäquate
Therapie der sensorineuralen Schwerhörigkeit mit mittel- bis hochgradigem Hörverlust
besteht in der Versorgung mit konventionellen Hörgeräten. Dabei unterscheidet man
zwischen Luftleitungs- und Knochenleitungshörgeräten. Luftleitungsgeräte können an
Hand der Lokalisation weiterhin differenziert werden. So werden hdO-Geräte hinter dem
Ohr und iO-Geräte im Ohr getragen. Wenn auf Grund anatomischer Gegebenheiten, wie
z.B. einer Gehörgangsatresie, oder rezidivierender Gehörgangsentzündungen diese
Geräte nicht benutzt werden können, sind voll- oder teilimplantierbare Hörgeräte eine
Alternative. Im Gegensatz zu konventionellen Hörgeräten geben sie keinen Schall ab,
10
sondern arbeiten mit einem elektromechanischen Aktor. Dieser wandelt den
aufgenommenen Schall in Vibrationen um, die so die Gehörknöchelchenkette direkt
stimulieren.
Bei höchstgradigen, sensorineuralen Schwerhörigkeiten ist die Schallverstärkung durch
konventionelle oder implantierbare Hörgeräte nicht mehr ausreichend. In diesen
Fällen kann das Cochlea-Implantat verwendet werden, welches gewissermaßen eine
künstliche, elektronische Hörschnecke darstellt. Es besteht aus einem extra- und einem
intrakorporal getragenen Element. Extern werden die Schallwellen mit einem
Mikrophon dem Sprachprozessor und weiter dem Audioprozessor zugeführt, welcher die
akustischen Signale in elektrische Impulse umwandelt und transkutan zum eigentlichen
Implantat weiterleitet. Dieses enthält eine Empfangsspule zur Aufnahme der
elektrischen Impulse des Sprachprozessors. Nach Dekodierung werden diese den
einzelnen Elektroden auf dem in die Schnecke eingeschobenen Elektrodenträger
zugeleitet. Da die Elektroden unterschiedlich weit in die Scala tympani hineinreichen,
werden entsprechend des physiologischen Hörens verschiedene Abschnitte
der
Basilarmembran gereizt. Somit werden der Nuclearis cochlearis und das Ganglion
spirale unter Umgehung des defekten Haarzellapparates stimuliert. Indiziert sind die
Cochlea-Implantate bei ausgeprägter Innenohrschwerhörigkeit und cochleärer Taubheit.
Taub geborene Kinder profitieren ebenfalls von einem Cochlea-Implantat. Die
Implantation sollte im frühen Kindesalter erfolgen, damit Sprachverständnis und
Spracherwerb möglich werden. Eine Voraussetzung für den Einsatz des CochleaImplantates ist der intakte Hörnerv.
1.3.
1.3.1.
Gliazellen
Allgemeine Funktionen der Gliazellen
Gliazelle ist ein Sammelbegriff für strukturell und funktionell von den Neuronen
abgrenzbare Zellen im Nervengewebe. Sie machen 90 % aller Zellen im Nervengewebe
aus. Die Gliazellen werden im zentralen Nervensystem nach anatomischen und
11
funktionellen Kriterien in Astrozyten, Oligodendrozyten, Ependymzellen und Mikroglia
gegliedert. Allen Arten ist gemein, dass sie zunächst als Stützgerüst für die Neurone und
auch als deren Schutz dienen. Des Weiteren haben sie dadurch auch eine Schutzfunktion
der Neurone, da diese in der großen Anzahl der Gliazellen eingebettet sind.
Die Astrozyten vermitteln den Stofftransport und regulieren den interstitiellen pH-Wert.
Insbesondere stabilisieren sie das Ruhemembranpotenzial der Neurone. Somit
verhindern sie eine unerwünschte Depolarisation der Neurone. Weiterhin üben sie
durch Aufnahme und Verarbeitung von Transmittermolekülen einen wichtigen
modulatorischen Effekt auf die neuronale Aktivität aus. Bei Verletzungen des
Zentralnervensystems fungieren sie zusammen mit der Mikroglia als Phagozyten und
bilden Narben aus. Des Weiteren stellen die Zellen der Mikroglia die wichtigen Antigenpräsentierenden Zellen des Zentralnervensystems dar. Die Ependymzellen kleiden die
inneren Liquorräume aus. Die Oligodendrozyten bilden die Myelinscheide um die
Axone des zentralen Nervensystems. Ein einziger Oligodendrozyt kann mehrere Axone
gleichzeitig umhüllen.
Den Oligodendrozyten vergleichbar sind die Schwannzellen. Sie sind die Gliazellen
des peripheren Nervensystems. Jedoch vermag eine einzelne Schwannzelle nur ein
Axon zu umscheiden. Die Myelinisierung dient der optimierten Erregungsweiterleitung
(Waxman 1997). Zum einen wird die Erregungsweiterleitung durch die Myelinisierung
schneller, zum anderen ist der Energieverbrauch geringer.
Bevor die Gliazellen ihre oben beschriebenen Funktionen ausüben können, spielen sie
eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des zentralen und des peripheren
Nervensystems. Sie dienen als Leitstruktur der Nervenzellen, entlang derer die
Nervenzellen zu ihrem Bestimmungsort gelangen. Im Gegensatz zu den neuronalen
Zellen bleiben die Gliazellen ihr ganzes Leben lang mitosefähig.
1.3.2.
Funktionen der peripheren Gliazellen
Schwannzellen sind, wie es oben erwähnt wurde, die Gliazellen des peripheren
Nervensystems.
Man
unterscheidet
zwischen
myelinbildenden
und
nicht-
12
myelinbildenden
Schwannzellen, die beide von
gemeinsamen
Vorläuferzellen
abstammen. Entweder umfließt eine Schwannzelle mehrere Axone und bildet keine
Myelinscheide oder sie umfließt nur ein Axon und wickelt einen flachen Zellausläufer
mehrmals um dieses Axon, so dass eine Myelinscheide entsteht (siehe Abbildung 3).
Also umwickeln myelinisierende Schwannzellen einen einzigen Axonbereich und stellen
dementsprechend nur zu einem Axon Kontakt her. Nichtmyelinisierende Schwannzellen
können mehrere Axone umfließen und haben demnach zu mehreren Axonen Kontakt.
Ob sich eine Schwannzelle in eine myelinbildende oder nichtmyelinbildende Zelle
differenziert, ist abhängig von den sie umgebenden Strukturen (Ndubaku, de Bellard
2008).
Abbildung 3 Myelinisierung im Peripheren Nervensystem (PNS) durch Schwannzellen
(aus Duale Reihe, Anatomie)
13
Für den nichtmyelinisierenden Schwannzelltyp wurde gezeigt, dass seine Funktion für
das Überleben der Neurone notwendig ist (Chen et al. 2003). Ungefähr die Hälfte aller
Schwannzellen myelinisiert Axone mit relativ großem Durchmesser, während die andere
Hälfte als nichtmyelinisierende Schwannzellen mit Axonen kleineren Durchmessers
assoziiert vorliegt (Jessen, Mirsky 2005). Die Myelinscheiden fungieren als elektrische
Isolatoren und verbessern somit die Erregungsweiterleitung (Waxman 1997).
Eine weitere Funktion der Schwannzellen stellt die Ernährung von Neuriten dar
(Fallon 1986). Weiterhin können Schwannzellen Neurotrophine wie Nerve Growth
Factor (NGF), Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Neurotrophin (NT)-3,
NT-4/5, NT4 und Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) produzieren, mit denen sie das
Nervenwachstum und die Reifung der neuronalen Zellen fördern (Altevogt et al. 2002;
Bampton, Taylor 2005; Pirvola et al. 1992; Zheng et al. 1995). Des Weiteren dienen
extrazelluläre Matrixmoleküle der Schwannzellen wie das Laminin der Stimulation des
Nervenwachstums (Aletsee et al. 2001; Clark et al. 1993).
Für die Entwicklung der neuronalen Strukturen sind jedoch nicht nur Neurotrophine
notwendig. Die Kombination von Neurotrophinen und neuronaler Aktivität ermöglicht
den Neuronen ihre Entwicklung und fortdauernde Erhaltung (Shepherd et al. 2005).
Ihre Fähigkeit als Leitstruktur zu dienen besitzen die Schwannzellen auf Grund ihres
Vermögens sich fortzubewegen. Das Ausmaß der Schwannzellmigration wird reguliert
durch Neuregulin-1 (Yamauchi et al. 2008). Neureguline sind eine Familie von
Wachstumsfaktoren, die von sich entwickelnden motorischen und peripheren Neuronen
sezerniert
werden
(Mahanthappa
et
al.
1996).
Neuregulin-1
steigert
die
Schwannzellproliferation, -migration und -motilität (Mahanthappa et al. 1996).
Neuregulin-1 (NRG-1) wird dementsprechend auch eine Schlüsselrolle bei der NeuronGliazell-Interaktion zugesprochen (Mahanthappa et al. 1996). Eine verbesserte
Schwannzellmigration wird auch in Anwesenheit von Laminin und Fibronectin
beobachtet (Yamauchi et al. 2008).
Die Fähigkeit als Leitstruktur zu dienen ist nicht nur bei der Entwicklung des
Nervensystems bedeutend. Es wird im peripheren Nervensystem auch nach
Verletzungen von Nervenfasern beobachtet (Evans 2001). Die Möglichkeit der
14
Schwannzellmigration erlaubt den Schwannzellen direkt zu der Region des verletzten
Nervens zu gelangen und dort die axonale Regeneration zu veranlassen (Han et al.
2007). Nach Verletzungen der Nervenfasern des peripheren Nervensystems sind intakte
Schwannzellen und deren Interaktionen mit den Neuronen unabdingbar für die
Rekonstruktion der Nervenfasern (Matsuoka et al. 1991; Bampton, Taylor 2005). Die
Regeneration der peripheren Nerven nach Verletzung wird durch Wachstumsfaktoren
gesteuert, die unter anderem von den Schwannzellen selber bereitgestellt werden (Meier
et al. 1999). Es wird auch angenommen, dass reife Schwannzellen im nicht verletzten
oder anderweitig beeinflussten Nervensystem ruhen und erst nach Verletzung aktiviert
werden (Evans 2001). Dafür spricht auch, dass der Nerve-growth-Factor (NGF), welcher
das Nervenwachstum stimuliert, im erwachsenen Nervensystem nicht sezerniert wird.
Jedoch wird die NGF-Synthese durch Schwannzellen und auch Fibroblasten im
beschädigten Nerven reaktiviert und auch durch diese Zellen reguliert (Matsuoka et al.
1991). Untersuchungen in vitro nach viraler Nervenschädigung haben gezeigt, dass
Schwannzellen neuroprotektiv waren. Schwannzellen, die in engem Kontakt zu dem
verletzten Axon standen, haben sich nicht an der retrograden Nervendegeneration
beteiligt (Höke 2006).
Die Eigenschaft des peripheren Nervensystems, sich nach einer Verletzung wieder zu
regenerieren, steht im Gegensatz zum zentralen Nervensystem. Das zentrale
Nervensystem ist nicht regenerierbar. Nach Verletzung eines zentralen Nervens bildet
sich eine gliale Narbe aus, welche von den Astrozyten gebildet wird (McKeon et al.
1991). Direkt nach der Nervenverletzung werden die Astrozyten hypertroph. Wenn man
die Gliazellhypertrophie reduzieren kann, kann man die Neuritenwachstumsblockade
aufheben, die normalerweise nach einer zentralen Nervenläsion beobachtet wird
(Lefrançois et al. 1997).
Während Schwannzellen in der embryonalen Phase in Abwesenheit von Neuronen
zu Grunde gehen, können sie im entwickelten Nervengewebe eigenständig überleben
(Porter et al. 1986; Meier et al. 1999; Ndubaku, de Bellard 2008). Die reifen
Schwannzellen besitzen nicht nur die Fähigkeit, in Abwesenheit von Neuronen zu
überleben, sie behalten auch weiterhin ihre funktionellen Leistungsfähigkeiten, z.B.
können sie charakteristische Schwannzell-Antigene produzieren und haben weiterhin die
15
Fähigkeit zur Myelinisierung (Porter et al. 1986). Auch dieser Mechanismus scheint
bedeutend zu sein für die Rekonstruktion der Nervenfaser nach Verletzung (Mirsky et al.
2001). Verantwortlich für das Überleben von reifen Schwannzellen in Abwesenheit von
Neuronen ist ein autokriner Kreislauf, bei dem die Schwannzellen selber Faktoren für ihr
Überleben sezernieren. Wichtig dafür sind vor allem Insulin Growth Factor (IGF), NT-3
und Platelet Derived Growth Factor (PDGF) (Meier et al. 1999; Mirsky et al. 2001).
Diese Faktoren bewirken, dass die reifen Schwannzellen im Gegensatz zu den unreifen
Schwannzellen ihre eigene Apoptose verhindern können (Ndubaku, de Bellard 2008).
1.3.3.
Gliazellen im Innenohr
Es ist allgemein bekannt, dass im peripheren Nervensystem der Wirbeltiere Axone
von Myelin umschlossen sind, welches von den Schwannzellen gebildet wird
(Rosenbluth, Palay 1961; Sun et al. 1997). Die meisten Nervenfasern im Hörnerv sind
myelinisiert, nur ein geringer Teil unmyelinisiert. Die Myelinumscheidungen lassen sich
in kompaktes und lockeres Myelin differenzieren (Rosenbluth, Palay 1961; Sun et al.
1997). Dabei können beide Arten von Myelin von derselben Schwannzelle produziert
werden (Rosenbluth, Palay 1961). Definitiv ist noch nicht geklärt, ob das lockere Myelin
in derselben isolatorischen Weise fungiert wie das kompakte Myelin.
In gewissen sensorischen Ganglienzellen ist der Nervenzellkörper selber von Myelin
umschlossen, zu diesen gehören die akustischen und vestibulären Ganglienzellen
des Innenohres von Ratten und Goldfischen (Rosenbluth, Palay 1961; Rosenbluth 1962).
Im Gegensatz zu den Spiralganglienzellen reifer Tiere enthalten die menschlichen
vestibulären und akustischen Spiralganglienzellen meistens keine Myelinumhüllung.
Stattdessen sind sie von einer einzelnen Schwannzellscheide umgeben, welche in dem
Ausmaß der Dicke variieren kann (Tylstedt et al. 1997). Da die Neurone des Innenohres
bipolare Ganglienzellen sind, würde ein unmyelinisierter Nervenzellkörper die
Erregungs-ausbreitung in dieser Region stark dezimieren.
Bei den
akustischen
Ganglienzellen
unterscheidet man
Typ-I-
und
Typ-II-
Ganglienzellen, welche sich auch durch ihre Myelinisierung differenzieren. Bei den
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Typ-I-Ganglienzellen der Goldfische wird eine dichtere Myelinumscheidung beobachtet
(Rosenbluth, Palay 1961). Allgemein jedoch ist der Umfang der Myelinisierung der
Nervenzellkörper geringer als der Umfang der Myelinisierung der dazu gehörigen
Neuriten. Die Myelinisierung der Zellkörper von sensorischen und autonomen
Ganglienzellen geschieht durch Satellitenzellen (Hibino et al. 1999), die man den
Gliazellen zuordnet. So haben die Myelinscheiden der Satellitenzellen auch die Funktion
der verbesserten Erregungsleitung.
Schwannzellen der Cochlea fungieren nicht nur als elektronischer Isolator, sie
sezernieren auch Neurotrophine wie NGF, NT-3 (Hossain et al. 2002), NT-4 (Bampton,
Taylor 2005), Fibroblast Growth Factors (FGF-1/2) (Hossain, Morest 2000). Diese
dienen dem Wachstum, der Reifung und dem Überleben von Spiralganglienzellen. So
sind zum Beispiel NT-3 und BDNF essenziell für die normale Entwicklung der
afferenten Innervation des Innenohres (Hossain et al. 2002; Fritzsch et al. 1997; Peng
et al. 2003). Neben neurotrophen Faktoren synthetisieren Schwannzellen auch
Komponenten der extrazellulären Matrix und Zelladhäsionsmoleküle (Matsuoka et al.
1991). Des Weiteren dienen Schwannzellen des Innenohres der Ernährung der
Spiralganglienzellen (Hansen et al. 2001) und damit auch der Erhaltung und des
Fortbestehens von Spiralganglienneuronen (Hossain, Morest 2000).
1.3.4.
Glia-ähnliche Zellen im Innenohr
Das Corti-Organ enthält neben den Sinneszellen, die aus einer Reihe innerer und drei
Reihen äußerer Haarzellen bestehen, auch Stützzellen. Von innen nach außen
unterscheidet man bei den Stützzellen die inneren und äußeren Pfeilerzellen, die
DEITERS-Zellen, die HENSEN-Zellen und die CLAUDIUS-Zellen. Diese Zellen haben
neben der Funktion als Stützgerüst noch weitere Aufgaben.
Stützzellen zeigen sowohl funktionell als auch immunhistochemisch Parallelen zu
Gliazellen (Stankovic et al. 2004). So wurde gezeigt, dass sie NT-3 produzieren können,
welches neuronales Überleben fördert und auch von Schwannzellen sezerniert wird.
Somit sind sie beteiligt an der Regulation des neuronalen Überlebens in dem Corti-
17
Organ (Sugawara et al. 2005). Weiterhin umscheiden sie die unmyelinisierten
peripheren Enden der afferenten und efferenten Neuronen innerhalb des Corti-Organs,
darunter auch die äußeren und inneren Haarzellen. Eine weitere Ähnlichkeit zu den
Gliazellen ist die Expression von verschiedenen glialen Markern (Rio et al. 2001).
Nach Verlust von Haarzellen lässt sich eine Proliferation von Stützzellen des CortiOrgans beobachten (Zheng et al. 1997).
1.4.
Ziel der Arbeit
Das Spiralganglien-Zellkulturmodell ist ein etabliertes Verfahren bei der Erforschung
des ersten Neurons der Hörbahn. Durch die Kultivierung von Spiralganglienzellen aus
der Cochlea von Ratten sind schon zahlreiche Fragen bezogen auf Entwicklung,
Wachstum oder Schädigungsmuster des ersten Hörneurons untersucht worden (Aletsee
et al. 2001; Brors et al. 2002). Auf Grund des Wachstumsverhaltens der Neuriten erlangt
man Erkenntnisse über die neuronalen Wachstumsbedingungen oder schädigende
Einflüsse. Für eine Reihe verschiedener neurotropher Substanzen oder Oberflächenbeschichtungen mit extrazellulären Matrixmolekülen konnten Effekte auf die
Neuritogenese und das Überleben von Spiralganglienzellen untersucht werden.
Weiterhin sind nicht-neuronale Zellen in enger Beziehung zu den Spiralganglienzellen
aufgefallen (Brors et al. 2002). Jedoch sind diese nicht-neuronalen Zellen bislang nicht
weiter klassifiziert worden. Dabei ist es wichtig, die Umgebungsstrukturen der aus den
Spiralganglien-Explantaten auswachsenden Neuriten detailliert zu kennen, da diese das
Wachstum des Neuriten durchaus beeinflussen können.
Andererseits ist es auch denkbar, durch Manipulationen dieser nicht-neuronalen Zellen
das Wachstum der Neuriten gezielt zu dirigieren und somit zu optimieren. Diese
Annahme könnte weiterhin zur Verbesserung des Cochlea-Implantates führen, wenn
man die Neuriten durch exaktes Wachstum an die Stimulationselektrode annähern
könnte.
18
In der vorliegenden Arbeit sollen die nicht-neuronalen Zellen in der erwähnten
Spiralganglien-Zellkultur beschrieben sowie ihr Wachstumsverhalten in Verbindung mit
auswachsenden Spiralganglien-Neuriten analysiert werden.
1.4.1.
Verwendete gliale Antikörper
Zur genaueren Untersuchung der nicht-neuronalen Zellen in der Spiralganglienzellkultur
dienten spezifische, immunhistochemische Antikörper, welche von Gliazellen produziert
werden. In dieser Arbeit wurden Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), Connexin29
und S-100-Protein verwendet.
Connexine sind einer Familie von Transmembranproteinen zugehörig. Sie bilden gap
junctions in Zellen aus, die den direkten Austausch von bis zu 1 Da großen Molekülen
zwischen zwei benachbarten Zellen ermöglichen. Connexin29 wird hauptsächlich von
myelinisierenden Gliazellen des zentralen und peripheren Nervensystems ausgeschüttet
(Altevogt et al. 2002; Li et al. 2002; Eiberger et al. 2006) und ist bedeutsam für die
normale und zeitgerechte Entwicklung der cochleären Funktion (Tang et al. 2006).
GFAP ist ein als Intermediärfilament im Cytoplasma von Gliazellen vorkommendes
Protein. Es wird vor allen von Astrozyten des Zentralnervensystems exprimiert, aber es
ist auch im peripheren Nervensystem vorhanden. Eine hohe GFAP-Expression wird in
Stützzellen der Cochlea und des Vestibularapparates gefunden, weiterhin wird es aber
auch in geringerem Maße von Satellitenzellen und Schwannzellen gebildet (Rio et al.
2001).
Die Proteine der Multigenfamilie S100 sind Calcium-bindende Proteine mit niedriger
Molekülmasse und einer Vielzahl von Funktionen (Nardin et al. 2007). Bei den S100Proteinen werden 19 Typen unterschieden, die in unterschiedlichen Zelltypen exprimiert
werden. Das hier verwendete S100B-Protein wird vor allen von Gliazellen gebildet
(Duobles et al.) und ist dementsprechend ein Marker für gliale Aktivitäten.
19
2. Material und Methoden
2.1.
Beschichtung der Zellkulturplatten und Medium
Unter sterilen Bedingungen wurden 48-well-Zellkulturplatten (Falcon, BD Bioscience,
USA) mit zwei verschiedenen Adhäsionsmolekülen beschichtet, dem synthetischen
Poly-D-Lysin (BD Bioscience, USA) in einer Konzentration von 10 mg/ml in
Dulbecco´s phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und dem extrazellulären
Matrixprotein Laminin (BD Bioscience, USA) in einer Konzentration von 1 mg/ml in DPBS. Diese dienten der besseren Anhaftung der Spiralganglien-Explantate auf der
Oberfläche. Zuerst wurden die Vertiefungen der Zellkulturplatten mit je 120 µl Poly-DLysin beschichtet und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Jedoch
wurde der äußere Rahmen der 48-well-Zellkulturplatte mit ca. 500 µl D-PBS befüllt, im
Sinne einer feuchten Kammer. Nach dem zweimaligen Spülen mit je 200 µl D-PBS
wurden die Zellkulturplatten mit je 120 µl Laminin beschichtet und über Nacht bei 37
°C, einer Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5% CO2 bebrütet.
Am nächsten Tag wurden die Kulturplatten erneut mit D-PBS gespült und daraufhin mit
je 75 µl Spiralganglien-Medium befüllt. Dieses bestand aus DMEM (Dulbecco´s
modified Eagles medium), 25 mM Hepes-Puffer, 1 µl/ml N2-Supplement, 10 µg/ml
Insulin, 6,15 g/l Glucose (30 % Glucose in D-PBS) sowie 30 U/ml Penicillin (Penicillin
„Grünenthal” 1 Mega in D-PBS). Anschließend wurde diesem Medium Neurotrophin-3
als humaner, rekombinanter Wachstumsfaktor in einer Konzentration von 25 ng/ml
zugefügt. Bis zum Einsetzen der Spiralganglien-Explantate wurden die Zellkulturplatten
bei 37 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5% CO2 aufbewahrt.
2.2.
Präparation der Spiralganglien-Explantate
Für die anatomische Mikropräparation wurden Ratten vom Typ Sprague-Dawley
(Charles River, Sulzfeld) im Alter von vier Tagen (P4) verwendet. Sie erfolgte nach den
20
Beschreibungen von van de Water und Ruben (van de Water, Ruben 1971) und
Sobkowicz et al. (Sobkowicz et al. 1993).
Die Haut über dem Operationsgebiet sowie die zur Präparation benötigten Instrumente
wurden mit Alkohol sterilisiert, um eine sterile Explantationstechnik sicherzustellen. Die
Dekapitation des Tieres erfolgte nach Anästhesie mit intraperitonealer Gabe von
0,4 ml pro 100 g Körpergewicht eines Gemisches aus Ketamin 12,5 mg/ml, Rompin
1,26 mg/ml und Acepromezin 0,25 mg/ml. Im Anschluss daran wurde die Haut über
dem Schädelknochen entfernt und der Schädel in zwei Hälften gespalten. Dies erfolgte
mit Ansatz im Foramen magnum in longitudinaler Richtung entlang der Mittellinie.
Nach dem stumpfen Ausschälen des Hirngewebes wurden die Schädelhälften in
Petrischalen mit D-PBS deponiert.
Die Weiterverarbeitung geschah von hier an unter Benutzung eines binokularen
Mikroskopes (Olympus, SZ61). Als Landmarke innerhalb des Schädels zum Auffinden
der Cochlea diente der Sinus petrosus, ein U-förmiges Venensystem. Dieses begrenzt
das Felsenbein. Von dem Sinus petrosus aus ließ sich mit der Spitze einer Pinzette
vorsichtig das Felsenbein vom übrigen Schädel lösen. Nun wurde die noch nicht
vollständig verknöcherte Kapsel der Cochlea entfernt. Es zeigte sich die komplette
Cochlea. Diese wurde in eine neue mit D-PBS gefüllte Petrischale gelagert.
Für die weiteren Präparationsschritte wurden neue Instrumente verwendet, um die
Kontamination der zu gewinnenden Spiralganglien-Explantate sehr gering zu halten.
Um an die Spiralganglienzellschicht mit dem Modiolus zu gelangen, wurde nun die
Stria vascularis und die Haarzellschicht von außen nach innen mit der Spitze einer
feinen Pinzette vorsichtig in Richtung Helicotrema abgezogen. Nachdem die
Spiralganglienschicht mit demselben Verfahren von dem Modiolus separiert worden
war, erfolgte das Schneiden der Spiralganglienzellschicht in gleich große Stücke von
etwa 200-300 µm mit Hilfe eines Skalpells in einer neuen mit D-PBS gefüllten
Petrischale. Die Stückchen wurden einzeln mit Hilfe einer feinen Pinzette in einem
Tropfen D-PBS in die Vertiefung der mit Medium vorbereiteten Zellkulturschale gelegt.
Die Explantate wurden möglichst zentral innerhalb der Vertiefung positioniert, um die
optimale Höhe des Flüssigkeitsspiegels auszunutzen. Nach Einsetzen des Explantates
streifte nun der Flüssigkeitsmeniskus gerade den oberen Rand des Explantates und
21
verhinderte so ein Aufschwemmen der Probe. Alle Proben wurden für 72 Stunden bei 37
°C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.
2.3.
2.3.1.
Fixierung und Färbung der Spiralganglien-Explantate
Immunhistochemische Färbung mit biotyniliertem Antikörper
Zur Neuofilamentmarkierung wurde das Vectastain Elite® ABC-Kit, Maus IgG (Vector
Laboratories, Kanada) verwendet. Nach der 72-stündigen Inkubation der SpiralganglienZellkulturen wurde zuerst das Medium vorsichtig unter Schonung der SpiralganglienExplantate abgesaugt. Die Fixierung erfolgte mit einem Gemisch aus Aceton (100%)
und Methanol (100 %) im Verhältnis 1:1 je Vertiefung 150 µl für etwa fünf Minuten.
Nach dem vorsichtigen Absaugen des Aceton-Methanol-Gemisches wurden die
Kulturschalen zweimal mit je 300 µl D-PBS gespült. Die so fixierten SpiralganglienExplantate können bei 4 °C in 300 µl D-PBS in der Zellkulturschale, wenn gewünscht
auch über einen längeren Zeitraum, aufbewahrt werden.
Nach dem Absaugen von D-PBS wurden 120 µl des monoklonalen Antikörpers
Antineurofilament (ANF; Linaris, Deutschland) für eine Stunde bei 37 °C aufgetragen.
ANF wurde im Verhältnis von 1:500 in Normalserum verwendet. Nach Spülen mit DPBS erfolgte die Inkubation mit dem zweiten, biotinylierten Antikörper in Normalserum
im Verhältnis 1:200 für dreißig Minuten bei Raumtemperatur. Wiederum wurde mit DPBS gespült und anschließend 150 µl Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (ABCKomplex) aufgetragen. Es erfolgte eine Inkubation mit dem ABC-Komplex für dreißig
Minuten bei Raumtemperatur.
Zur eigentlichen Färbung wurden 150 µl Diaminobenzidin (DAB KIT, Vector 4100) für
etwa zehn Minuten verwendet. Dieses wurde vorsichtig aus den Vertiefungen abgesaugt
und mit 300 µl D-PBS befüllt. Auf diese Art und Weise konnten die SpiralganglienExplantate problemlos über einen längeren Zeitraum gelagert werden.
22
2.3.2.
Immunhistochemische Färbung mit Fluoreszenzantikörpern
Nach dem Absaugen des Mediums erfolgte die Fixierung mit je 150 µl frisch
angesetztem 4 %igen Paraformaldehyd in D-PBS für dreißig Minuten bei
Raumtemperatur. Um die Zellmembran permeabler für die weitere Färbung zu bereiten,
wurde nach Entfernung des Fixans je Vertiefung 150 µl 0,1 %iges Triton-X (SigmaAldrich, Deutschland) auf die Zellkulturplatte für dreißig Minuten bei Raumtemperatur
gegeben. Zur Verhinderung unerwünschter, unspezifischer Bindungen an der Oberfläche
wurde daraufhin die Blocking Solution für zwei Stunden bei 4 °C aufgetragen. Diese
bestand aus 10 % Serum, welches sich an dem Ursprungstier des Zweitantikörpers
orientierte, 0,1 % Triton-X (Sigma-Aldrich, Deutschland) und 1 % Rinderserum
Albumin (BSA, bovine serum albumine). Nach Spülen mit D-PBS wurde der
Erstantikörper, der sich gegen bestimmte Moleküle der die Neuriten umgebenden
Zellen richten sollte, in Blocking Solution über Nacht bei 4 °C hinzugefügt. Die
Zellkulturplatten wurden vorsichtig drei Mal mit D-PBS für je fünf Minuten bei
Raumtemperatur gespült. Im Anschluss daran wurde der Zweitantikörper, TRITC oder
FITC, der mit einer fluoreszierenden Substanz gekoppelt war, für eine Stunde bei
Raumtemperatur
aufgetragen.
Ab
der
Verwendung
des
fluoreszierenden
Zweitantikörpers sollten die Zellkulturplatten so wenig Licht wie möglich ausgesetzt
werden, damit die fluoreszierende Substanz ihre Kraft behielt. Nach dreimaligem Spülen
der Zellkulturplatten mit D-PBS für je zwei Minuten bei Raumtemperatur erfolgte die
direkte Mikroskopie der Spiralganglien-Explantate.
In den folgenden Abschnitten werden die verwendeten Antikörper aufgelistet:
•
Mouse anti-Neurofilament (Linaris, 1:200); FITC rabbit anti-mouse
(DAKO, 1:50)
•
Rabbit anti-Connexin29 (Zymed Laboratories, 1:400); TRITC goat
anti-rabbit (Zymed Laboratories, 1:100)
•
Mouse Glial Fibrillary Acidic Protein (Molecular Probes, 1:100);
FITC rabbit anti-mouse (DAKO, 1:50)
23
•
Rabbit anti S100-Kuhprotein (Zymed Laboratories, 1:100); TRITC
goat anti-rabbit (Zymed Laboratories, 1:100)
2.3.3.
Immunhistochemische Doppelfärbung mit Fluoreszenzantikörpern
Die Vorbereitung der Spiralganglien-Explantate für die Fluoreszenzdoppelfärbung
geschah auf dieselbe Art und Weise wie bei der oben beschriebenen Einzelfärbung mit
Fluoreszenzantikörpern. Im Unterschied zu der Einzelfärbung wurden die Antikörper als
Gemisch in ihren entsprechenden Verdünnungen im Sinne einer parallelen
Doppelfärbung inkubiert.
Im folgenden Abschnitt werden die einzelnen Antikörper angegeben:
•
Rabbit anti-Connexin29 (Zymed Laboratories, 1:400) plus Mouse
anti-Neurofilament (Linaris, 1:200); FITC rabbit anti-mouse (DAKO,
1:50) plus TRITC goat anti-rabbit (Zymed Laboratories, 1:100)
•
Mouse Glial Fibrillary Acidic Protein (Molecular Probes, 1:100) plus
Mouse anti-Neurofilament (Linaris, 1:200); TRITC rabbit anti-mouse
(Zymed Laboratories, 1:100) plus FITC rabbit anti-mouse (DAKO,
1:50)
•
Rabbit Anti S100-Kuhprotein (Zymed Laboratories, 1:100) plus
Mouse anti-Neurofilament (Linaris, 1:200); TRITC goat anti-rabbit
(Zymed Laboratories, 1:100) plus FITC goat anti-mouse (DAKO,
1:100)
24
2.4.
Auswertung
Die
Auswertung
der
Spiralganglien-Zellkulturen
erfolgte
licht-
und
fluoreszensmikroskopisch (Olympus, IX71). Hierfür wurde der Puffer aus den
Kulturschalen
vollständig
abgesaugt,
um
Vergrößerungseffekte
und
optische
Verzerrungen durch Lichtbrechung am Flüssigkeitsmeniskus zu vermeiden. Jedes
Explantat wurde mit einer an einem Computer angeschlossenen Fotokamera
abfotografiert und in einer Bild- und Kamerasoftware (Cell D, Olympus Soft Imaging
Solutions GmbH, Münster) gespeichert.
Damit bei der lichtmikroskopischen Inspektion und Dokumentation der mit
fluoreszierenden Substraten angefärbten Spiralganglien-Explantaten die Fluoreszenzkraft länger erhalten blieb, wurde der Raum abgedunkelt. Je nach verwendetem
Zweitantikörper mussten verschiedene Farbfilter verwendet werden. Die Wahl des
Farbfilters richtete sich nach dem verwendeten Zweitantikörper: Bei TRITC U-MNG
mit einer Wellenlänge von 530-550 µm, bei FITC U-MNB mit einer Wellenlänge von
470-490 µm. Bei den Doppelfärbungen wurden die Spiralganglien-Explantate separat
mit dem jeweiligen Farbfilter dokumentiert und mit dem oben erwähnten Programm im
Nachhinein kombiniert und bearbeitet.
Es wurden das Wachstumsverhalten der Spiralganglienneuriten nach Verlauf, Länge und
Verzweigungen analysiert. In den verschiedenen Färbungen wurden das Vorhandensein
oder die Abwesenheit von nicht-neuronalen Zellen beschrieben. Wurden nicht-neuronale
Zellen nachgewiesen, wurde ihre Anordnung allgemein und in Bezug zu den
Spiralganglienneuriten erläutert.
25
3. Ergebnisse
3.1.
Wachstumsverhalten der nicht-neuronalen Zellen bei der Färbung
mit biotyniliertem Antikörper
Die mikroskopische Auswertung der Färbung mit biotyniliertem Antikörper zeigte, dass
die Neuriten radiär aus den Spiralganglien-Explantaten heraus wachsen. Das Wachstum
der Neuriten zeigte sich nicht immer gleichmäßig aus allen Seiten der SpiralganglienExplantate. Zum Teil wuchsen die Neuriten nur aus einer Seite des Explantates aus. Des
Weiteren ließen sich Neuriten ohne Anwesenheit eines Spiralganglien-Explantates
dokumentieren, wenn dieses bei den Spülungen ausgeschwemmt worden ist. Die
Neuriten zeigten einen höheren Widerstand gegen solche mechanische Kräfte. Weiterhin
überkreuzten sich die Neuriten in ihrem Verlauf und bildeten Aufzweigungen, vor allem
im letzten Drittel ihres Verlaufs. Des Weiteren imponierten im Verlauf der Neuriten
Verdickungen (siehe Abbildung 4), die am ehesten Zellkörpern nicht-neuronaler Zellen
entsprachen. Die Verdickungen ließen sich auch an Aufzweigungen von Neuriten
lokalisieren.
Das Auftreten der nicht-neuronalen Zellen hat direkt an den Spiralganglien-Explantaten
begonnen, wobei die maximale Dichte der nicht-neuronalen Zellen in nächster
Umgebung der Explantate am höchsten erschien. Die nicht-neuronalen Zellen waren
jedoch nicht nur in der Umgebung der Neuriten existent. Stellen, an denen keine
Neuriten aus den Spiralganglien-Explantaten ausgewachsen waren, wiesen dennoch das
Vorhandensein von nicht-neuronalen Zellen auf (siehe Abbildung 4).
Auch bei Spiralganglien-Explantaten, bei denen keine oder nur wenige Neuriten
ausgewachsen waren, konnten diese Zellen nachgewiesen werden (siehe Abbildung 5).
Das Maximum der nicht-neuronalen Zellen war auch hier im Bereich um die
Spiralganglien-Explantate am höchsten. Allgemein variierte die Anordnung und
Verteilung dieser Zellen bezogen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Neuriten
nicht.
26
Abbildung 4
Spiralganglion-Explantat mit vergrößertem Ausschnitt (Färbung mit biotyniliertem
Antikörper)
Im oberen Bild deuten die weißen Dreiecksspitzen auf Verdickungen im Verlauf der Neuriten. Die
dickeren weißen Pfeile weisen auf Überkreuzungen zwischen zwei Neuriten. Das untere Bild ist der
vergrößerte Ausschnitt des Rechtecks des oberen Bildes. Die roten Dreieckspitzen deuten auf Zellen, die
nicht in Verbindung zu einem Neuriten stehen. Die blaue Drachenform weist auf eine Aufzweigung eines
Neuriten. In der Aufzweigungsstelle ist eine Verdickung lokalisiert. Der schwarze Balken entspricht
500 µm.
27
Abbildung 5
Antikörper)
Spiralganglion-Explantat mit nur wenigen Neuriten (Färbung mit biotyniliertem
Es zeigen sich nur wenige Neuriten (dicke, weiße Pfeile) und nicht-neuronale Zellen (vereinzelt markiert
mit den schwarzen dünnen Pfeilen). Der schwarze Balken entspricht 500 µm.
28
3.2.
Wachstumsverhalten der nicht-neuronalen Zellen bei den Färbungen
mit den Fluoreszenzantikörpern
3.2.1.
Nicht-neuronale Zellen bei den immunhistochemischen Färbungen
mit GFAP oder Connexin29
Bei den immunhistochemischen Färbungen mit GFAP oder mit Connexin29 konnten
keine Zellen nachgewiesen werden. Trotz regulärem Wachstum von Neuriten, die
parallel mit ANF angefärbt wurden, wurden keine GFAP-positive oder Connexin29positive Zellen um die Neuriten sichtbar. Sowohl in den apikalen, mittleren als auch
basalen Abschnitten
der Spiralganglien-Windungen wurden
nur unspezifische
Anfärbungen beobachtet.
3.2.2.
Nicht-neuronale Zellen bei der immunhistochemischen Färbung
mit S100-Protein
Im Gegensatz zu den immunhistochemischen Färbungen mit den Antikörpern GFAP
und Connexin29 waren bei dieser Färbung mit dem S100-Protein positive Zellen um die
Neuriten sichtbar geworden. Die Verteilung der nicht-neuronalen Zellen entsprach der
Anordnung bei der Färbung mit biotinyliertem Antikörper. Ihr Auftreten begann
unmittelbar um den Spiralganglien-Explantaten und überschritt teilweise auch die
Endigungen der auswachsenden Neuriten, wobei die Dichte der Zellen ihr Maximum
direkt um das Explantat herum hatten. Morphologisch hatte der Großteil der Zellen im
Verlauf der Neuriten ein eher spindelförmiges Erscheinungsbild (siehe Abbildung 9).
Des Weiteren entsprangen den Zellen Zellausläufer, mit denen benachbarte Zellen
untereinander verbunden waren. Bei den Einzelfärbungen ließ sich jedoch nicht
abschließend
differenzieren,
ob
die
Zellausläufer
nicht
bloß
unspezifische
Neuritenanfärbungen waren. Eine spindelförmige Zelle wies in der Regel zwei
Zellausläufer auf, die an beiden Enden positioniert waren, und hatte demnach Kontakt
zu zwei weiteren Zellen. Bei weiterer Betrachtung fielen auch dreieckige Zellen auf, die
29
dementsprechend drei Zellausläufer aufwiesen und somit mit drei weiteren Zellen
kommunizierten (siehe Abbildung 6). Vereinzelt ließen sich auch Zellen mit mehr als
drei Zellausläufern beobachten. Eine nicht-neuronale Zelle hatte eine Größe von
ungefähr 20-30 µm. Der Abstand zwischen diesen Zellen variierte zwischen 15 bis 40
µm. Dementsprechend war auch das Ausmaß der Zellausläufer, mit denen die Zellen
untereinander in Verbindung standen, variabel.
30
Abbildung 6 Spiralganglion-Explantat mit S100-positiven Zellen
Die dicken Pfeile deuten auf nicht-neuronale Zellen, die jeweils mit zwei Zellausläufern untereinander in
Verbindung stehen und einer imaginären Linie folgen. Das Sternchen deutet auf eine Zelle mit drei
Zellausläufern. Das Kreuz zeigt eine Stelle, die einer Aufzweigung von Neuriten entsprechen könnte. Der
weiße Balken entspricht 200 µm.
31
Schon bei Betrachtung der Einzelfärbung mit S100-Protein konnte man die Anordnung
und den Verlauf der Neuriten erahnen. Die Doppelfärbung mit den Antikörpern ANF
und S100-Protein zeigte dementsprechend, dass die nicht-neuronalen Zellen den
Neuriten in seinem Verlauf begleiteten (siehe Abbildung 7). Dabei folgten sie auch den
Krümmungen des Neuriten. Die dreieckigen Zellen mit den drei Zellausläufern
kennzeichneten dabei überwiegend Positionen, an denen die Neuriten sich aufzweigten
(siehe Abbildung 8). Die Abzweigungen des Neuriten wurden auf dieselbe Art und
Weise von den nicht-neuronalen Zellen begleitet wie der Neuritenhauptstamm. Es ließ
sich auch beobachten, dass sich die aufteilenden Neuriten beidseits an die nichtneuronale Zelle anlagerten (siehe Abbildung 9).
Die nicht-neuronalen Zellen lagen dem Neuriten oftmals mit der gesamten Fläche ihres
Zellkörpers an. Des Weiteren stellte sich heraus, dass die Verbindungen zwischen den
nicht-neuronalen Zellen nicht nur unspezifische Anfärbungen des Neuriten waren
sondern Zellausläufer. Die Zellausläufer konnten neben den Neuriten beobachtet werden
(siehe Abbildung 9) oder aber auch in Abwesenheit von Neuriten.
Weiterhin fiel auf, dass keine Neuriten ohne nicht-neuronale Zelle erkennbar waren,
wohingegen nicht-neuronale Zellen auch ohne Neuriten zu existieren schienen. Dabei
hatten sie, wie oben erwähnt, weiterhin die Anordnung, als ob sie einem imaginären
Neuriten folgen würden.
32
7a) Einzelfärbung mit S100-Protein
7b) Einzelfärbung mit ANF
33
7c) Doppelfärbung mit S100-Protein und ANF
Abbildung 7 Spiralganglion-Explantat in Einzel- und Doppelfärbung mit ANF und S100-Protein
Die Bilder a-c stellen alle denselben Ausschnitt eines Spiralganglion-Explantates mit unterschiedlichen
Antikörpern dar. Das Bild c ist eine Kombination der Einzelfärbungen mit S100-Protein (a) und ANF (b). Die
dicken, weißen Pfeile zeigen denselben Verlauf eines Neuriten, der von den S100-positiven Zellen begleitet
wird. Der weiße Balken entspricht 200 µm.
34
Abbildung 8 Spiralganglion-Explantat in Doppelfärbung mit S100-Protein und ANF
Die Sternchen markieren Stellen, an denen sich die die Neuriten aufzweigen und nicht-neuronale Zellen
lokalisiert sind, die eine dreieckige Form aufweisen. Die dicken Pfeile zeigen die nicht-neuronalen Zellen
in enger Nachbarschaft zu den Neuriten. Der weiße Balken entspricht 200 µm.
35
Abbildung 9 Zwei unterschiedlich vergrößerte Ausschnitte eines Spiralganglion-Explantates in der
Doppelfärbung mit S100-Protein und ANF
Die beiden Bilder zeigen unterschiedliche Vergrößerungen desselben Ausschnittes eines SpiralganglionExplantates. Bei dem oberen Bild entspricht der weiße Balken 100 µm, beim unteren Bild 50 µm. Die
Sternchen weisen auf nicht-neuronale Zellen, die von einem sich aufteilenden Neuriten umrahmt werden.
Der dicke, weiße Pfeil zeigt einen Zellausläufer einer nicht-neuronalen Zelle in direkter Nachbarschaft zu
einem Neuriten. Die Dreieckspitze deutet auf eine nicht-neuronale Zelle, die mit ihrem Körper in ihrer
gesamten Länge dem Neuriten anliegt.
36
4. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden gliale Zellmarker an Hand eines etablierten
Spiralganglienkulturmodells der Ratte untersucht. Dazu dienten Ratten vom Typ
Sprague-Dawley (Charles River, Sulzfeld) im Alter von vier Tagen (P4). Das
Vorhandensein von nicht-neuronalen Zellen ließ sich bei der Färbung mit biotyniliertem
Antikörper nachweisen. Die Zellen waren in der Umgebung der Neuriten aber auch ohne
Neuriten nachweisbar, wie es schon in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt
werden konnte (Brors et al. 2002). Hier wurde jedoch nicht näher klassifiziert, um
welche Art von Zellen es sich handelt.
Zur weiteren Einordnung dieser nicht-neuronalen Zellen dienten immunhistochemische
Doppelfärbungen mit Fluoreszenzantikörpern. Als Antikörper dienten das Connexin29,
das GFAP und das S100-Protein. Bei jedem der drei genannten Antikörper wurde eine
Doppelfärbung mit ANF durchgeführt, um die nicht-neuronalen Zellen in Abhängigkeit
von den Neuriten beurteilen zu können. Allen drei Substanzen ist gemein, dass sie von
Gliazellen produziert werden (Altevogt et al. 2002). Dabei konnten bei den Färbungen
mit Connexin29 und GFAP keine spezifischen Zellen in der Gegend der Neuriten
festgestellt werden.
Dem hingegen fanden sich S100-positive Zellen in der Umgebung der Neuriten. Diese
begleiteten den Neuriten in seinem Verlauf, waren aber auch ohne Neuriten darstellbar.
Weiterhin fielen Zellausläufer der nicht-neuronalen Zellen auf, die zwei oder aber auch
drei nicht-neuronale Zellen miteinander verbunden haben.
Die Tatsache, dass die untersuchten Zellen S100-positv sind, lässt vermuten, dass sie
glialen Ursprungs sind, genauer definiert Schwannzellen. Dieses Ergebnis deckt sich
mit einer anderen Studie (Whitlon et al. 2009). Die Abwesenheit von GFAP- und
Connexin29-positiven Zellen könnte auf mehreren Gründen basieren. In einer anderen
Untersuchung wurde gezeigt, dass in der intakten Cochlea nur wenig GFAP
nachgewiesen werden konnte (Rio et al. 2001). Zum anderen exprimieren
myelinisierende Schwannzellen im normalen peripheren Nervengewebe kein GFAP,
währenddessen nichmyelinisierende Schwannzellen diese Funktion haben (Rio et al.
37
2001; Cheng, Zochodne 2002). Daher könnte man vermuten, dass die in dieser Arbeit
untersuchten glialen Zellen myelinisierende Eigenschaften besitzen.
In weiteren, histologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass Connexin29 in
Schwannzellen oder Satellitenzellen der Cochlea exprimiert wurde (Eiberger et al. 2006;
Tang et al. 2006; Li et al. 2002). Dieses konnten wir in unserer Studie nicht belegen. Ein
Erklärungsansatz dafür wäre die Migrationsfähigkeit der Schwannzellen (Ahmed,
Brown 1999; Han et al. 2007). Demnach sei auch nicht ausgeschlossen, dass nur S100positive Zellen aus den Spiralganglien-Explantaten ausgewandert sind. GFAP- und
Connexin29-positive Zellen könnten im Explantat lokalisiert und dort verblieben sein.
4.1.
Einfluss der nicht-neuronalen Zellen auf die neuronalen Zellen
Bisher gibt es nur wenige Daten über Schwannzellen im Bereich der Cochlea. Dabei ist
das Wissen über ihre exakte Struktur und Funktion von Bedeutung, z.B. in Hinblick auf
die Optimierung von Nervenregeneration bei gehörlosen Menschen.
Das Neuritenwachstum wird von einer Vielzahl von zellulären und extrazellulären
Faktoren beeinflusst. Bei der zellulären Beeinflussung muss man an die die
Nervenzellen umgebenden Zellen denken. Wichtig sind dabei die Zellen, die in der
direkten Umgebung von Nervenzellen in größerem Umfang wie z.B. Fibroblasten oder
Gliazellen und im peripheren Nervensystem speziell Schwannzellen vorkommen.
Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass das Nervenwachstum in glialer Umgebung
besser ist als in Umgebung von Fibroblasten (Fallon 1986; Seilheimer, Schachner 1988).
Es wird davon ausgegangen, dass Interaktionen zwischen glialen und neuronalen Zellen
existieren, die das bessere Nervenwachstum in Beziehung zu den Gliazellen erklären.
Die Gliazell-Nervenzell-Interaktionen scheinen durch Neureguline und Neurotrophine
abzulaufen (Hansen et al. 2001). Die Beobachtung, dass Gliazellen in Abwesenheit von
neuronalen Zellen registriert werden konnten, jedoch nicht der umgekehrte Fall, lässt
ebenfalls vermuten, dass es Interaktionen zwischen Glia- und Nervenzellen geben muss.
Allgemein
ist
bekannt,
dass
Schwannzellen
in
der
Entwicklungsphase
des
Nervensystems in vivo der Führung des wachsenden Nervens dienen. Dabei setzen
38
Schwannzellen Nervenwachstum stimulierende Faktoren frei (Bampton, Taylor 2005;
Altevogt et al. 2002) und haben auf ihrer Oberfläche extrazelluläre Matrixproteine, die
das Neuritenwachstum beeinflussen können. Wanner et al. konnten zeigen, dass
Schwannzellen und Wachstumskegel an der auswachsenden Nervenspitze gemeinsam
wandern und dass der größte Anteil der Wachstumskegel von Schwannzellen bedeckt
war. Das deutet darauf hin, dass Schwannzellen sich selber die Umgebung generieren,
die dann auch optimal für das Nervenwachstum ist. Eine Schlüsselrolle schreibt man
Laminin zu. Das extrazelluläre Matrixprotein Laminin kann auf der Oberfläche von
Schwannzellen lokalisiert werden (Fallon 1986), auf der es als Adhäsionsmolekül
fungiert. Laminin hat die Fähigkeit, das Wachstum von Spiralganglienneuriten zu
fördern (Seilheimer, Schachner 1988; Clark et al. 1993; Aletsee et al. 2001). Weiterhin
verbessert Laminin die initiale Zelladhäsion signifikant und hat eine Mitbestimmung bei
der Ausrichtung von Schwannzellen (Miller et al. 2001). Dieses legt die Vermutung
nahe, dass Schwannzellen die Richtung des Nervenwachstums bestimmen und durch
Interaktionen mit Neuriten diese in die angegebene Richtung führen. Somit stellen
Schwannzellen einen interessanten Angriffspunkt dar, um Nervenwachstum gezielt
steuern und fördern zu können.
Ungeklärt bleibt in dieser Arbeit die Frage, welche Zellart primär vorlag: Schwannzellen
oder neuronale Zellen. Für Schwannzellen als primäre Zellart sprechen die
Beobachtungen in vitro, dass nicht-neuronale Zellen ohne Neuriten dargestellt wurden,
aber keine Neuriten ohne umgebende nicht-neuronale Zellen (Brors et al. 2002). Des
Weiteren wurden gerade an der Neuritenspitze fast keine Neuriten ohne Kontakt zu
Schwannzellen festgestellt (Whitlon et al. 2009). Es wurde zwar Nervenwachstum bei
Axonen beobachtet, die keinen Kontakt zu Schwannzellen hatten (Chen et al. 2005),
jedoch waren die Distanzen kürzer als bei der Anwesenheit von Schwannzellen.
39
4.2.
4.2.1.
Klinische Bedeutung der vorliegenden Ergebnisse
Klinische Bedeutung in Bezug auf das Cochlea-Implantat
Schwannzellen spielen nicht nur in der Entwicklungsphase und bei der Erhaltung der
Neurone eine Rolle. Auch bei der Regeneration peripherer Nerven nach deren
Schädigung, ist eine enge Glia-Neuron-Interaktion wichtig (Chen et al. 2005; Duobles et
al.). Im normalen Nerven scheinen Schwannzellen zu ruhen, nach einer Verletzung
sezernieren sie bioaktive Moleküle zur Nervenregeneration (Evans 2001). Diesen Effekt
und auch die weiteren Funktionen von Schwannzellen, wie z.B. die Migrationsfähigkeit,
könnten zur Optimierung der Cochlea-Implantate ausgenutzt werden.
Die Elektrode der Cochlea-Implantate wird direkt in die Scala tympani der Cochlea
platziert. Dort gibt sie frequenzabhängig elektrische Impulse ab, welche auf den
unabdingbar intakten Hörnerven übertragen werden. Nach Schädigung der Haarzellen
der Cochlea z.B. durch Lärm, Arzneimittel wie Aminoglykosid-Antibiotika (Aran et al.
1999) erfolgt konsekutiv eine sekundäre Degeneration von afferenten Nervenfasern
(Nadol et al. 1989). Dabei wird jedoch davon ausgegangen, dass die sekundäre
Degeneration in der humanen Cochlea nach Haarzellschädigung langsamer fortschreitet
als in Tiermodellen (Shinohara et al. 2002). Einige cochleäre Nervenfasern entgehen der
sekundären Degeneration nach Haarzellschädigung (Spoendlin; Stankovic et al. 2004;
Teufert et al. 2006; Sugawara et al. 2005), die dann durch die Elektrode eines CochleaImplantates erregt werden können.
Das Überleben von einer großen Anzahl von Spiralganglienzellen hat einen positiven
Effekt auf die erfolgreiche elektrische Stimulation des Innenohres (Nadol et al. 1989).
Eine Voraussetzung für den Erfolg eines Cochlea-Implantates ist weiterhin, dass die
überlebenden Spiralganglienneuronen nicht nur anatomisch sondern auch funktionell
intakt sind. Darüber hinaus sollten die verbliebenen Spiralganglienneurone im Verlauf
der Schneckenwindungen mehr oder weniger gleichmäßig verteilt seien. Das Überleben
von Spiralganglienneuronen kann in vivo durch Neurotrophine gefördert werden
(Whitlon et al. 2006; Shinohara et al. 2002). Allerdings stellen Mikropumpen, die in die
Cochlea eingebracht werden und dort Neurotrophine freisetzen, eine potenzielle
40
Infektionsquelle dar. Untersuchungen in vitro haben gezeigt, dass genetisch veränderte
Schwannzellen, die zu einer Überexpression von BDNF und NT-3 angeregt worden
sind, das Überleben von Spiralganglionneuronen bei Taubheit verbessert haben
(Pettingill et al. 2008). Ferner konnte in Tierversuchen auch bewiesen werden, dass
elektrische Stimulation durch eine in die Cochlea implantierte Elektrode die
Degeneration der Spiralganglien vermindert hat (Roehm, Hansen 2005). Jedoch ist das
Einbringen von Elektroden in die Cochlea eine invasive Maßnahme.
Nicht nur die Erhaltung von Spiralganglienneuronen verbessert den Nutzen von
Cochlea-Implantaten. Eine weitere Optimierung des Cochlea-Implantates könnte durch
das Auswachsen von peripheren Nervenfasern in Richtung der Cochlea-ImplantatElektrode
ermöglicht
werden.
Eine
entscheidende
Rolle
könnten
dazu
die
Schwannzellen beitragen, die essenziell für die Regeneration von peripheren Nerven
sind. Schwannzellen haben die Fähigkeit, zu dem Ort der Schädigung zu wandern (Han
et al. 2007). Dabei ist die Schwannzellmigration oftmals der limitierende Faktor bei der
Wiederherstellung von Läsionen der peripheren Nerven (Ahmed, Brown 1999). Wenn es
möglich wäre, die Schwannzellmigration gezielt zu steuern und vor allem zu fördern,
wäre das ein wichtiger Schritt bei der Regeneration der peripheren Nerven und damit
auch beim Erfolg einer Cochlea-Implantation. Dadurch wäre es möglich, den
Energieverbrauch zu senken und die Frequenzselektivität des Implantates zu erhöhen
(Roehm, Hansen 2005). Obendrein wäre das ein Ansatz zur weiteren Verbesserung der
Sprachdiskrimination. Weiterhin könnte durch das gezielte Nervenwachstum auf Grund
gesteuerter Schwannzellmigration das Ergebnis der Cochlea-Implantation nach einer
länger zurück liegenden Ertaubung mit fortgeschrittener sekundärer Degeneration der
afferenten Innervation verbessert und die Indikation zur Nutzung eines CochleaImplantats könnte erweitert werden. Die Zeitdauer seit der Ertaubung ist ein
entscheidender prognostischer Faktor für den Erfolg des Cochlea-Implantates
(Marangos, Laszig 1998).
Unter diesen Aspekten wäre eine Optimierung der Wachstumsbedingungen für
Schwannzellen auch indirekt optimierend für das neuronale Wachstum. Es gibt Studien,
die gezeigt haben, dass Nervenwachstum im Innenohr nach Lärmschädigung möglich
ist. Obwohl sich die regenerierten Nervenfasern im Ausmaß der Myelinisation und
41
durch Bildung unüblicher Wege von normal entwickelten Nervenfasern unterscheiden,
geben die regenerierten Nervenfasern einen Hinweis darauf, dass das Innenohr in
Säugetieren das Potential zur Nervenregeneration besitzt (Bohne, Harding 1992).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass erstens migrationsfähige
Schwannzellen in vitro vorhanden sind. Zweitens finden Interaktionen zwischen
Neuriten und Schwannzellen statt. Drittens wird die Wachstumsrichtung der Neuriten
durch Schwannzellen beeinflusst. Weitere Untersuchungen dieser Ergebnisse sind
notwendig, um die gezielte Beeinflussung der Nervenregeneration von Spiralganglien in
vivo zu erwirken.
4.2.2.
Klinische Bedeutung in Bezug auf Erkrankungen durch Störungen
der Myelinisierung
Die Schwannzellen dienen der Myelinisierung peripherer Nerven. Dadurch werden die
Nerven elektronisch isoliert und so eine Optimierung der Reizfortleitung erreicht
(Waxman 1997). Die Myelinisation der peripheren und proximalen Teile des VIII.
Hirnnervs in Tiermodellen an Ratten am zweiten Tag nach der Geburt startet simultan.
Dabei wird der zentrale Anteil von Oligodendrozyten und der periphere Anteil von
Schwannzellen unter Kontrolle des Thyroidhormons myelinisiert, lange bevor die
Cochlea Aktivität zeigt (Knipper et al. 1998). Eine weitere Studie hat gezeigt, dass
bei
verminderter
Aktivität
der
Schilddrüsenhormone
auch
eine
verminderte
Myelinproduktion vorlag, welches eine verlängerte Reizweiterleitung bedingte (Knipper
et al. 2000).
Die Myelinisierung ist auch für die funktionelle Entwicklung des Hörnervens bedeutsam
So wird die Expression von Connexin29 stark und ausschließlich in Schwannzellen
gefunden, die den Hörnerv in der Cochlea myelinisieren (Tang et al. 2006). In
Tierversuchen, in denen das Gen für die Connexin29-Expression fehlt, zeigte sich eine
Hemmung der Entwicklung des Hörens, ein früher Hochtonverlust in der reifen Cochlea
und eine verzerrte Wellenform der Hirnstammpotenziale. Weiterhin hatten diese Tiere
ein erhöhtes Risiko für Lärmschäden (Tang et al. 2006). Die inneren und äußeren
42
Haarzellen stellten sich normal dar, jedoch zeigten sich schwere Demyelinisierungen der
Zellkörper der Spiralganglienneuronen. Mutationen des Connexin29 Genes sind die
am meisten
gefundenen
genetischen Defekte für nicht syndromal bedingte
Kindertaubheiten. Somit wäre eine Beeinflussung der cochleären Schwannzellen in
Bezug auf ihre Myelinisierungsfähigkeit von Bedeutung, um diese Art von Taubheit
kurativ behandeln zu können.
Die Wichtigkeit der Schwannzellen für die normgerechte neuronale Entwicklung wird
weiterhin dadurch unterstrichen, dass Neuropathien durch Mutationen in Schwannzelloder Myelin-Genen entstehen, die sich konsekutiv in einem sensorineuralen Hörverlust
darstellen. Ein Beispiel dafür ist die Mutation in dem peripheren Myelin Protein 22
(PMP22), welches einen sensorischen neuronalen Verlust bedingt (Ndubaku, de Bellard
2008; Stone et al. 1998).
Der Verlust von Myelin bei cochleären Neuronen, die üblicherweise myelinisiert
werden, erscheint als Vorbote für neuronale Degeneration. Jedoch ist der exakte
Zusammenhang zwischen dem Verlust des Myelins und der neuronalen Degeneration
noch nicht geklärt. Es gibt Hinweise, dass Schwannzellen zu nicht-myelinisierenden
Phänotypen als Antwort auf Ertaubung degradieren und damit auch höhere
Überlebensraten aufweisen als Spiralganglienneurone (Hurley et al. 2007).
Die Myelinisierung neuronaler Strukturen durch Schwannzellen ist abhängig von einer
Neuron-Gliazell-Interaktion. Eine wichtige Rolle wird dabei dem Neuregulin-erbBSignalweg zugeschrieben. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass eine
Überexpression von Neuregulin-1 eine Hypermyelinisierung bedingt (Michailov et al.
2004). Mit diesem Ergebnis kongruent wurde in einer anderen Studie beobachtet, dass
eine Reduktion des NRG-1-erbB-Signalweges in der Pathogenese von peripheren
Neuropathien auf Grund einer Hypomyelinisation und neuropathischen Schmerzen
involviert ist (Chen et al. 2006).
Die Abwesenheit GFAP-positiver Zellen in den in dieser Studie untersuchten
Spiralganglien-Explantaten könnte einen Hinweis darauf geben, dass es sich bei den hier
untersuchten Zellen um myelinisierende Schwannzellen handelt. Das weitere Erforschen
dieser Schwannzellen, insbesondere auch in Bezug auf deren Myelinisierungsfähigkeit,
43
ist erforderlich, um auch von dieser Seite Erkrankungen, die zur Ertaubung und
Gehörbeeinträchtigungen führen können, kurativ therapieren zu können.
44
5. Zusammenfassung
In dieser Studie wurde an Hand des Spiralganglien-Zellkulturmodelles das
Vorhandensein von nicht-neuronalen Zellen in der Umgebung von Neuriten untersucht.
Das Spiralganglienkulturmodell ist ein etabliertes Verfahren zur Untersuchung des
ersten Neurones in der Hörbahn in Hinblick auf Entwicklung, Wachstum und
schädigende Einflüsse. In dieser Zellkultur finden sich neben den Spiralganglien und
deren Neuriten nicht-neuronale Zellen, die bisher nicht untersucht worden sind.
Zur Charakterisierung der nicht-neuronalen Zellen wurden die Gliazell-Marker
Connexin29, Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) und S100-Protein verwendet. Die
genannten Antikörper sind dafür bekannt, dass sie von Gliazellen produziert werden.
Um die nicht-neuronalen Zellen in Abhängigkeit von den neuronalen Zellen beurteilen
zu können, wurden Doppelfärbungen mit Anti-Neurofilament (ANF) durchgeführt,
welches selektiv Neuriten anfärbt.
Die nicht-neuronalen Zellen waren positiv für das S100-Protein, jedoch negativ für
Connexin29 und GFAP. Die nicht-neuronalen Zellen hatten eine spindelförmige
Morphologie und wiesen Zellausläufer auf. Somit handelt es sich bei den nichtneuronalen Zellen um myelinisierende Schwannzellen. Des Weiteren hatten die nichtneuronalen Zellen ihr Maximum in der Nähe des Spiralganglion-Explantates. Bei der
Doppelfärbung mit ANF zeigte sich, dass die nicht-neuronalen Zellen den Neuriten in
seinem Verlauf begleiteten und engen Kontakt zu ihm aufnahmen. Nicht-neuronale
Zellen waren in Abwesenheit von Neuriten darstellbar, jedoch wurden keine Neuriten
ohne nicht-neuronale Zellen nachgewiesen.
Die Erkenntnisse über das Migrationsverhalten der nicht-neuronalen Zellen und die
Beziehung zu den auswachsenden Neuriten lassen Rückschlüsse für die Regeneration
von Spiralganglienneuriten zu. Die klinische Bedeutung ergibt sich durch die so
genannte Cochlea-Implantation, bei der ein intakter Hörnerv die Voraussetzung darstellt
und der limitierende Faktor bei der Indikationsstellung ist. Eine weitere klinische
Bedeutung liegt in den Krankheitsbildern, die auf Grund einer Störung der
Myelinisierung durch Schwannzellen beruhen.
45
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5087
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Lebenslauf
Name
Christine Anna Elisabeth Wohl
geb. Grabosch
Geburtsdatum
21.10.1982
Geburtsort
Münster
Familienstand
Verheiratet
Schulbildung
1989-1993 Ludgerigrundschule Selm
1993-2002 Städtisches Gymnasium Selm
2002 Abitur
Studium
2002 Beginn des Studiums der Humanmedizin an der
Ruhr Universität Bochum
2004 Physikum
2008 Staatsexamen
Berufsausübung
ab 2009 Assistenzärztin in der Abteilung für HalsNasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie im
Prosper Hospital Recklinghausen
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