vts_9803_14914 - oparu

InstitutfürPathologiederUniversitätUlm
Direktor:Prof.Dr.PeterMöller
UntersuchungenzumGleason-ScoremitMethodenderräumlichen
Statistik
DissertationzurErlangungdesDoktorgradesderMedizin
Herbst
derMedizinischenFakultätderUniversitätUlm
vonPaulGrahovac,geboreninAalen
-2014-
08
AmtierenderDekan:
Prof.Dr.ThomasWirth
1.Berichterstatter:
Prof.Dr.TorstenMattfeldt
2.Berichterstatter:
Prof.Dr.VolkerSchmidt
TagderPromotion:
29.10.2015
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1.Einleitung................................................................................................................................................1
1.1Entwicklung,AnatomieundFunktionderProstata...............................................................................1
1.1.1Entwicklung...............................................................................................................................................1
1.1.2Anatomie.....................................................................................................................................................1
1.1.3FunktionderProstata...........................................................................................................................3
1.2Prostatakarzinom..................................................................................................................................................4
1.2.1InzidenzundepidemiologischeBedeutung.................................................................................4
1.2.1.1Altersverteilung...................................................................................................................................5
1.2.2Ätiologie......................................................................................................................................................6
1.2.3Lokalisation...............................................................................................................................................7
1.2.4Diagnostik...................................................................................................................................................8
1.2.5Therapie......................................................................................................................................................9
1.2.6EinteilungdesProstatakarzinomsnachLokalisationundArtderDiagnostik..........10
1.3PathologischeBegutachtungdesProstatakarzinoms........................................................................11
1.3.1Untersuchungsmaterial.....................................................................................................................11
1.3.2Grading......................................................................................................................................................11
1.3.2.1ReproduzierbarkeitdesGleason-Gradings.......................................................................................14
1.3.3DasStagingdesProstatakarzinoms.............................................................................................16
1.4Fragestellung........................................................................................................................................................18
2.MaterialundMethodik....................................................................................................................19
2.1Patientenkollektiv...............................................................................................................................................19
2.2TexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen...................................................................23
2.3ExplorativeräumlicheStatistikdesPunktprozessesderTumorzellkerneimSchnitt..........25
2.4TexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen...................................................................28
2.5ExplorativeräumlicheStatistikdesPunktprozessesderTumorzellkerneimSchnitt..........30
2.6ParametrischeModellierungdesPunktprozessesderTumorzellenimSchnitt......................37
2.7OrdinalelogistischeRegressionsanalyse..................................................................................................39
2.8PrädiktiondesGleason-Scores.....................................................................................................................41
2.9ValidierungderPrädiktionmittelsLeave-one-outMethode...........................................................42
3.Ergebnisse............................................................................................................................................43
3.1TexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen...................................................................43
3.1.1LineareKorrelationsanalyse...........................................................................................................43
3.1.2Prädiktion................................................................................................................................................45
3.2ErgebnissederräumlichenStatistikdesPunktprozessesderTumorzellkerneimSchnitt.52
4.Diskussion...........................................................................................................................................53
I
Inhaltsverzeichnis
4.1VergleichbareArbeitenzumGleason-Score............................................................................................53
4.2ÄnderungendesGewebesin3DmitansteigendemGleasonScore................................................55
4.3MustererkennungundPrädiktion...............................................................................................................59
4.4PotenzielleAnwendunginderPraxis.........................................................................................................61
4.5MethodologischeAspekte................................................................................................................................62
4.5.1WeitereMethodenzurPrädiktion................................................................................................62
4.5.2RäumlicheStatistik..............................................................................................................................63
4.6DieMethodikderPunktprozess-Statistik.................................................................................................63
4.7Schlussfolgerung..................................................................................................................................................65
5.Zusammenfassung............................................................................................................................66
6.Literaturverzeichnis.........................................................................................................................68
Anhang.......................................................................................................................................................83
Danksagung..................................................................................................................................................................83
Lebenslauf......................................................................................................................................................................84
II
Abkürzungsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ANN artificialneuralnetwork
ASR(W)
age-standardisedrate(World)
BPH benigneProstatahyperplasie
CAG Cytosin-Adenin-Guanin
CSR
completespatialrandomness
DHT Dihydrotestosteron
glea Geason-Score
HE
Hämatoxylin-Eosin
IGF
Insulin-likegrowthfactor
LVQ learningvectorquantization
OP
radikaleProstatektomie
PAP saurePhosphatase
PSA
Prostata-spezifischesAntigen
pzahl AbsoluteAnzahlderPunkteproBild
SRD5A2
5-alpha-ReduktaseTypII
SD
Standardabweichung
SVM supportvectormachines
TNM T=Tumor,N=Nodes(Lymphknoten),M=Metastasen
TRUS transrektalerUltraschall
TUR transurethraleResektionderProstata
TURP
transurethraleResektionderProstata
UICC Unioninternationalecontrelecancer
III
1.Einleitung
1.EINLEITUNG
1.1ENTWICKLUNG,ANATOMIEUNDFUNKTIONDERPROSTATA
1.1.1ENTWICKLUNG
Im Verlauf der menschlichen Entwicklung beginnt Ende des dritten Monats die
Proliferation des Epithels des kranialen Urethraabschnittes, und es bildet sich eine
Anzahl von Aussprossungen, welche in das umgebende Mesenchym eindringen. Bei
derFraubildensichausdiesenAussprossungendieUrethral-undParurethraldrüsen,
beimManndieProstata(Sadler2003).
1.1.2ANATOMIE
Die Prostata des Neugeborenen hat ein Gewicht von ca. 1g. In der ersten
LebensdekadeistkaumeinWachstumzubeobachten.InderzweitenDekadebeginnt
ein starkes Wachstum, wonach die Prostata ihre normale Größe mit ungefähr
zwanzigJahrenerreichthat.DieProstatadeserwachsenenManneshatdieFormund
Größe einer Kastanie. Sie umkleidet die Harnröhre zwischen Blasenhals und
Diaphragma urogenitale und liegt unterhalb der Symphyse (Eickenberg 1998). Sie
liegt extraperitoneal und ist durch das Ligamentum puboprostaticum fest mit dem
Schambein verbunden (Arnold et al. 1995). Wie in Abbildung 1 dargestellt ist die
Prostata mitdemBoden der Harnblase verwachsen.Nahe der Kontaktstelle mit der
Blase liegen von dorsal die paarigen Samenblasen und die Samenleiterampullen
beiden Organen an. Sie gehen im weiteren Verlauf in die Ductus ejaculatorii über.
DiesedurchsetzendieProstatavonhintenobennachschräguntenundmündenauf
demColliculusseminalisderParsprostaticaurethrae(Aumülleretal.1998).Ander
posterioren Seite der Prostata und der Samenblasen liegt die Denonvilliers-Faszie,
welche die Prostata vom Rektum abgrenzt. Sie besteht aus elastischen, kollagenen
und muskulären Fasern. Hier stehen neurovaskuläre Bündel in Verbindung mit
Faszie,ProstataundSamenblasen(Helpap1998b).
Die Prostata besteht aus epithelialen Drüsenschläuchen, welche von glatten
Muskelzellen und Fibroblasten umgeben werden, die man gemeinsam als
1
1.Einleitung
fibromuskuläres Stroma bezeichnet (Eickenberg 1998). Sie ist bei erwachsenen
jungen Männern kastaniengroß und kann einen sagittalen Durchmesser von ca. 2,5
cm erreichen. Ausdifferenziert besteht sie aus 30-50 Drüsenläppchen mit ungefähr
15-30 Ausführungsgängen, welche seitlich in die Furchen des Colliculus seminalis
münden(Helpap1998b).
Abb.1:
SchematischeDarstellungderProstata.Aus:RobbbinsBasicPathology,
8. Auflage, Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Mitchell R, S. 663, Copyright
Elsevier(2007)(Kumaretal.2007)
Die Prostata lässt sich anatomisch in vier Zonen unterteilen. Die zentrale Zone liegt
dorsokranial, besitzt weitlumige Drüsen und ein aufgelockertes Stroma. Die
TransitionszoneunddieperiurethraleZoneumschließennachmedialundlateraldie
prostatische Harnröhre und besitzt englumige Drüsen und ein straffes Stroma. Die
zentrale Zone wird von der peripheren Zone umgeben, welche vom Aufbau her der
Transitionszone entspricht. Die aglanduläre Stromazone mit ihrer anterioren Lage,
diedenBlasenhalsumschließt,bestehtausfibromuskuläremStroma(Helpap1998b).
Die tubuloalveolären Drüsen bestehen z.T. aus einschichtigem, z.T. aus zwei-und
mehrreihigem Epithel. Die Form des Epithels ist abhängig von der sekretorischen
Aktivität.DieseistwiederumabhängigvonderhormonellenSituationunddemAlter
desMannes.DasEpithelkannsomitFormenvonflach-überiso-bishochprismatisch
2
1.Einleitung
annehmen. Zwischen dem ausdifferenzierten Drüsenepithel und der Basalmembran
liegendieBasalzellen(Kühnel2002).
1.1.3FUNKTIONDERPROSTATA
Das Prostatasekret macht einen Anteil von 15% bis 30% des Ejakulates aus. Das
Sekret hat eine Oberflächenschutzfunktion für die Urethra und ist für die
Verflüssigung des Spermas wichtig. Es ist eine seröse Flüssigkeit. Das milchige
AussehenistbedingtdurchCholesterinundKephalin.DerpHliegtbei6,5,infolgedes
Gehaltes an Zitronensäure. Das Prostatasekret enthält zusätzlich eine hohe
Ionenkonzentration an Natrium, Kalium, Zink, Kalzium und Magnesium, jedoch
enthält es einen geringeren Proteinanteil als die übrige Samenflüssigkeit. Zu den
ProteinenderProstatagehören:saurePhosphatase(PAP)undProstata-spezifisches
Antigen (PSA), mit der Unterteilung: γ-Seminoprotein und β-Mikroseminoprotein
(auchβ-Inhibin).DieseProteinehabenalsTumormarkerbeimProstatakarzinomz.T.
klinischeBedeutung.DasPSAscheinteinehöhereSensitivitätundSpezifitätbeider
DiagnoseeinesProstatakarzinomszubesitzenalsdiesaurePhosphatase.Ausdiesem
Grund sollte die saure Phosphatase nicht mehr als Routinemarker für das
Prostatakarzinomverwendetwerden(Powelletal.1989).Dasγ-Seminoproteinund
das β-Mikroseminoprotein dienen auch der Bestimmung des Ursprungs einer
Tumormetastase(Haraetal.1989).ZusätzlichbefindensichimProstatasekretnoch
weitere Enzyme, wie Laktatdehydrogenase, α-Amylase, Esterasen, Aminopeptidasen
undProteasenvomTypderPlasminogenaktivatoren.ProteineausdemGefäßsystem
werden, wahrscheinlich durch Transsudation, auch noch dem Prostatasekret
beigefügt, wie Ig-A und Transferrin (Aumüller et al. 1998). Die Synthese des PSA
erfolgtvorwiegendindenEpithelzellenderProstatadrüsen.DieStrukturinformation
ist auf einem 6kb großen Gen auf dem Chromosom 19 gespeichert (Hilz 1995). Das
PSAisteineSerinproteasemiteinemMolekulargewichtvon33kDaundgehörtindie
GruppederKallikreine.DieKonzentrationinderProstataflüssigkeitbeträgtca.3g/l.
Das PSA hat zwei wesentliche Aufgaben, die Koagulation der Samenflüssigkeit zu
verhindernunddieMotilitätderSpermienzuunterstützen.
3
1.Einleitung
1.2PROSTATAKARZINOM
Die weitaus meisten Karzinome der Prostata sind Adenokarzinome, obwohl selten
auch Transitionalzell- und squamöse Karzinome, sowie völlig undifferenzierte
Karzinomebeschriebenwerden.
1.2.1INZIDENZUNDEPIDEMIOLOGISCHEBEDEUTUNG
Das Prostatakarzinom ist heutzutage das sechsthäufigste Karzinom der Welt
(InzidenzenproJahr)(Parkin2001).ImJahr2002gabesweltweitgeschätzt679.000
Fälle, welche 9,7% aller Karzinomerkrankungen im Mann ausmachen. (15,3% in
Industrieländernund4,3%inEntwicklungsländern).DieMortalitätistimVergleichzu
anderen Karzinomen relativ gering mit weltweit 308.000 Todesfällen im Jahr 2012
(6,6%derKazinomtodesfällebeiMännernund3,7%allerKarzinomtodesfälle).Durch
die geringe Sterblichkeit werden viele Männer mit einem Prostatakarzinom
diagnostiziert,geschätzte3,9Millionenin5Jahren(Stand2012)(Ferlayetal.2013).
Dadurch
hat
das
Prostatakarzinom
die
höchste
Prävalenz
aller
Karzinomerkrankungen beim Mann. Abbildung 2 zeigt die Inzidenz und Mortalität
desProstatakarzinomsinDeutschlandimJahre2012beiMännern.
Abb.2:
InzidenzundMortälitätpro100.000MännerinDeutschland.(Ferleyet
al.2013).ASR(W)=age-standardisedrate(World)
4
1.Einleitung
InLändern,indenendasScreeningweitverbreitetist,istdiedokumentierteInzidenz
sehr hoch, wie z.B. ist in den USA, wo das Prostatakarzinom das am meisten
diagnostizierte Karzinom ist. Ähnlich ist die Situation in Australien und in den
skandinavischen Ländern. In Europa sind die Inzidenzen recht unterschiedlich, in
Nord-undWesteuropasindsiehöheralsinSüd-undOsteuropa(Brawley1997).In
AsienistdasProstatakarzinomrelativselten.InDeutschlandlagdiealtersspezifische
InzidenzimJahr2012bei77,3pro100.000Einwohner,dieMortalitätliegtbei10,4
pro100.000(Ferlayetal.2013).Abbildung3zeigtdieMortalitätweltweit.
Abb.3:
Mortalität des Prostatakarzinoms pro 100.000 Männer (Ferley et al.
2013)
1.2.1.1ALTERSVERTEILUNG
Das Risiko, an einem Prostatakarzinom zu erkranken, wächst mit dem Alter. Die
InzidenzeinesklinischmanifestenProstatakarzinomsistbiszumAltervon50Jahren
gering.MitdemAlterwächstdieInzidenzbiszum9-bis10fachenan,verglichenzu
5
1.Einleitung
dem5-bis6fachenWertandererKarzinome(Cooketal.1969).Weltweittreten2/3
allerFällebeiMännernüber65auf.
1.2.2ÄTIOLOGIE
Die epidemiologischen Daten zeigen, dass genetische Faktoren für einige
Unterschiede unter ethnischen Gruppen verantwortlich sind. Zudem deuten
Inzidenzänderungen
mit
der
Zeit
und
durch
Migration
an,
dass
Umgebungsunterscheide und der Lebensstil auch von Bedeutung sind. Trotz
intensiverForschungistüberUmweltrisiken,welchedasProstatakarzinomauslösen
können,immernochwenigbekannt.EsgibtAnzeichenausFall-Kontroll-Studienund
Kohortenstudien, dass übermäßige Fettzufuhr eine Rolle in der Ätiologie des
Prostatakarzinoms spielen könnte. Allerdings berichtigten einige Studien ihre
Ergebnisse und bezogen sich auf die Kalorienzufuhr, und kein bestimmter
Fettbestandteil konnte aus allen Studien als schädlich erkannt werden. Es gibt aber
eine stark positive Korrelation mit der Zufuhr von tierischen Lebensmitteln,
besonders rotem Fleisch. Die Evidenz dieser Studien bezüglich des protektiven
Effekts von Obst und Gemüse ist im Gegensatz zu anderen Karzinomen nicht
überzeugend. Es besteht ein geringer Zusammenhang mit der höheren
Androgenausschüttung bei starkem Übergewicht und der Entstehung von
Prostatakarzinomen (Kolonel 1996). Eine Kohortenstudie unter medizinischem
PersonalindenUSAzeigte,dassdashöhereRisikoderschwarzenBevölkerung(RR
1,81) im Gegensatz zu der weißen Bevölkerung nicht aus der unterschiedlichen
Verteilung der möglichen Risikofaktoren wie Ernährung und Lebensstil erklärt
werden konnte (Platz et al. 2000). Daraus kann man schließen, dass genetische
FaktorenbeidenunterschiedlichenInzidenzenunterdenverschiedenenRasseneine
Rolle spielen. Dies wird durch den 5-11 fachen Risikoanstieg bei Männern, in deren
FamilieVerwandteerstenoderzweitenGradeserkranktsind,bekräftigt(Steinberget
al. 1990). Es ist bekannt, dass männliche Sexualhormone eine große Rolle in der
Entwicklung des Prostatakarzinoms spielen. Testosteron diffundiert in die Drüse, in
deresdurchdie5-alpha-ReduktaseTypII(SRD5A2)indiemetabolischaktiveForm
Dihydrotestosteron (DHT) umgewandelt wird. DHT und Testosteron binden sich an
den Androgenrezeptor. Der Rezeptor/Liganden-Komplex wird in den Zellkern
6
1.Einleitung
transloziert,umsichdortandieDNAzubinden.DadurchwerdenGeneaktiviert,die
androgene Effekte verursachen, auch solche, die die Zellteilung beeinflussen. Ein
Anliegen der Forschung war es, sich mit den Polymorphismen dieser Gene zu
beschäftigen, um zu verstehen, ob die inter-ethnischen Variationen dieser
Polymorphismen die Erklärung für das höhere Risiko unter den Schwarzen
afrikanischenUrsprungsaneinemProstatakarzinomzuerkranken,seien(Rossetal.
1998).PolymorphismenandemSRD5A2Genkönntendazubeitragen(Shibataetal.
1997). Das Interesse hat sich dem Androgenrezeptor-Gen zugewandt, welches auf
dem langen Arm des X Chromosoms lokalisiert ist. Das Androgenrezeptor-Gen
beinhaltet eine höchst polymorphe Region, welche CAG Wiederholungen in Exon 1
beinhaltet;dienormaleAnzahlist9-36Wiederholungen.MehrereStudienbehaupten,
dass Männer mit geringeren Wiederholungen der CAG Region ein höheres Risiko
haben,aneinemProstatakarzinomzuerkranken(Chanetal.1998).Schwarzeinder
VereinigtenStaatenhabenwenigerCAGWiederholungenalsWeiße,wasihrehöhere
Anfälligkeit, an einem Prostatakarzinom zu erkranken, teilweise erklären könnte
(Platz et al. 2000) (Ross et al. 1998). Andere genetische Mechanismen, welche
möglicherweise bei der Entstehung des Prostatakarzinoms eine Rolle spielen, sind
Polymorphismen im Vitamin-D-Rezeptor-Gen (Ingles et al. 1997; Ingles et al. 1998),
oder Polymorphismen in den Genen der Signalwege des Insulin-like growth factor
(IGF) (Chan et al. 1998). Es gibt jedoch in diesen Systemen keine Hinweise für
signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen ethnischen Gruppen.
Exposition im Beruf und der Einfluss des Sexualverhaltens haben wohl keinen
größerenEffektaufdieErkrankung(Ebleetal.2004).
1.2.3LOKALISATION
Die meisten palpablen Prostatakarzinome, welche mit einer Nadelbiopsie
diagnostiziertwurden,befandensichposteriorbzw.posterior-lateral(McNeal1969;
Byaretal.1972).InseltenenFällenkönnensichgroßeTransitionszonenkarzinomein
die periphere Zone ausweiten, und so palpabel werden. Karzinome, die durch eine
transurethrale Protataresektion diagnostiziert werden, sind meistens in der
Transitionszonelokalisiert.NichtpalpableKarzinome,welchedurcheineStanzbiopsie
diagnostiziert werden, stammen überwiegend aus der peripheren Zone,
nichtsdestotrotz entstehen ca. 15-25% aller Prostatakarzinome aus der
7
1.Einleitung
Transitionszone(Epsteinetal.1994).GroßeTumorenkönnensichindieZentralzone
ausbreiten, doch sie entspringen selten aus dieser Zone. In 85% aller
Prostatakarzinome handelt es sich um multifokale Adenokarzinome (Byar et al.
1972).
1.2.4DIAGNOSTIK
Da das Prostatakarzinom nur selten, und dann meist im fortgeschrittenen Stadium,
SymptomeimSinneeinerHarnobstruktionhervorruft,kommtderfrühenDiagnostik
eine entscheidende Rolle zu. Die einfachste Methode, die am Anfang einer
urologischen Abklärung steht, ist die digital-rektale Untersuchung. Suspekte Areale
werdenimnächstenSchritteinertransrektalenSonographiezugeführt.Dochhatsich
gezeigt, dass die Sonographie eine eingeschränkte Spezifität bei der Diagnose des
Prostatakarzinoms und bei der Beurteilung einer extraglandulären Ausbreitung hat.
DiemeistenfrühenProstatakarzinomezeigensichinderSonographiealsechoarme
Läsionen,wasnichtsehrspezifischist,weilnichtalleKarzinomeechoarmsind,und
nicht alle echoarmen Läsionen maligne sind (Hamper et al. 1991). Sonographischpathologische Korrelationsstudien haben gezeigt, dass circa 70-75% der Karzinome
echoarm sind und 25-30% der Karzinome das gleiche Echo besitzen wie das
umgebende Gewebe (Dahnert et al. 1986; Salo et al. 1987). Zur Sicherung eines
suspektenBefundeswirdeinesonographischgesteuerteStanzbiopsieverwendet.Die
Computertomographie
kann
nur
eine
ungenaue
Abschätzung
des
Ausbreitungsstadiums vornehmen und nur recht massiv vergrößerte Lymphknoten
darstellen(größerals1,5cm)(Huland2006).DieMagnetresonanztomographiewird
oft für das Staging des Patienten nach einer durch Biopsie gesicherten Diagnose
verwendet(Theodorescu2001).DieKnochenszintigraphiehathingegenihrenfesten
Platz in der Diagnostik, da sie die wichtigste Methode darstellt, Knochenmetastasen
aufzudecken, welche die häufigsten Fernmetastasen sind (Huland 2006). Der
Laborparameter in der Diagnostik und Verlaufskontrolle des Prostatakarzinoms
schlechthin ist das Prostata-spezifische Antigen, welches von den Epithelzellen der
Prostataproduziertwird(Robel1994;Takayamaetal.1994).DerPSAWertliegtbei
derMehrzahlderProstatakarzinompatientenüberdemWertvon4,0ng/ml.Erkann
aber auch bei benignen Erkrankungen über 4,0 ng/ml steigen, so auch bei der
benignen Prostatahyperplasie (BPH). Ein Prostatakarzinom kann auch bei Männern
vorliegen, in denen das PSA nicht über 4,0 ng/ml steigt. Dies ist insbesondere bei
Männern mit einem erhöhten Risiko der Fall, z.B. bei pos. Familienanamnese und
8
1.Einleitung
Afroamerikanern.AusdiesemGrundistdieSensitivitätundSpezifitätdesPSAWertes
nicht optimal. Dieses Problem wurde teilweise behoben, in dem man verschiedene
mitPSAverwandteIndicesund/oderandereMarkerverwendet(Mazzucchellietal.
2000; Montironi et al. 2000). Der PSA Wert ist auch bei der Rezidivkontrolle nach
Therapienützlich(Ebleetal.2004).
1.2.5THERAPIE
Prinzipiell stehen zur Therapie die radikale Prostatektomie, eine medikamentöse
oder operative antiandrogene Therapie, eine zytostatische Therapie und die
Bestrahlung zur Verfügung. Bei der heute meist retropubisch durchgeführten
radikalen Prostatektomie wird das Organ komplett entfernt, und anschließend
werden Blasenauslass und Harnröhrenstumpf anastomosiert. Auch obturatorische
Lymphknoten
werden
entfernt,
um
sie
einer
pathologischen
Schnellschnittuntersuchung zuzuführen. Zeigt diese positive Befunde, wird die
Operation meist beendet, da ihre Radikalität aufgrund der Ausbreitung nicht
gewährleistetist(Huland2006).
AlsunerwünschteFolgenderOperationsindinersterLiniedieerektileDysfunktion,
die Harninkontinenz und Urethrastrikturen zu nennen. Da ca. 80% der Karzinome
der Prostata hormonsensitiv sind, liegt eine Hormonentzugstherapie nahe. Hierbei
unterscheiden sich die Orchiektomie, Androgenrezeptoren-Blocker und LH-RHAgonistenbezüglichihrerWirksamkeitnicht(Huland2006).
Die zytostatische Chemotherapie eignet sich nur eingeschränkt zur Behandlung des
Prostatakarzinoms, einerseits wegen der niedrigen Proliferation des Karzinoms,
andererseitsaufgrunddesrelativhohenAltersdesPatientenkollektivs.Daherkommt
sie allenfalls in Kombination mit Analgetika als palliative Option in Frage. Auch die
externeHochvolt-RadiotherapieistalspalliativeMaßnahmezubetrachten,dainbis
zu 70% der Fälle Tumorzellen eine Radiatio überleben und zu Rezidiven führen.
Allerdings spielt die Bestrahlung bei der Behandlung von Knochenmetastasen eine
wichtige Rolle (Roach 1999; Huland 2006). Manche Patienten können von neueren
interstitiellenstrahlentherapeutischenAnsätzenprofitieren(Weißbachetal.2000).
DieTherapiedesProstatakarzinomshängtwesentlichvomAusbreitungsstadiumab.
Liegt ein Karzinom des Stadiums T1a (Siehe 1.3.3) vor, wird lediglich bei jüngeren
PatienteneineradikaleProstatektomieinErwägunggezogen,danurbeietwa20%
9
1.Einleitung
derPatientennachzehnJahreneinTumorprogresszubeobachtenist.Allerdingsist
eine engmaschige Beobachtung notwendig. Fälle mit einem Staging von T1a bis T3,
jeweils mit N0/M0, fasst man als lokalisiertes Prostatakarzinom zusammen.
Patienten mit einem Tumor des Stagings T1b, T2 und T3 sollten sich dann einer
radikalenoperativenTherapieunterziehen,wennsieeinemittlereLebenserwartung
vonmindestenszehnJahrenhaben,daein70jährigerMannbeispielsweiseeinRisiko
von10%aufweist,indennächstenzehnLebensjahrenandemTumorzuversterben,
abereinRisikovon50%,einemanderenLeidenzuerliegen(Steiner1995).Manchen
Patienten mit niedrigen Stadien kann eine nerverhaltende Operation der Prostata
angeboten werden. Bis zu 70 % der Patienten bleibt so eventuell die erektile
Dysfunktion,einesehrhäufigeNebenwirkungderradikalenProstatektomie,erspart.
Allerdings ist die Radikalität des Eingriffs dann eingeschränkt (Steiner 1995). Liegt
einStadiumT4,N1oderM1vor,sogilteinPatientalsnichtmehrkurativoperabel.
Die Therapie der Wahl ist hier die antiandrogene Behandlung. Bei starker
ProgredienzkanneineniedrigdosierteChemotherapieinErwägunggezogenwerden,
wobei die subjektive Beschwerdearmut des Patienten im Vordergrund steht. Bei
Knochenmetastasen kann, wie erwähnt, eine umschriebene Bestrahlung angewandt
werden(Huland2006).
1.2.6 EINTEILUNG
DIAGNOSTIK
DES
PROSTATAKARZINOMS
NACH
LOKALISATION
UND
ART
DER
DasProstatakarzinomkannwiefolgteingeteiltwerden:
-
Das manifeste periphere Prostatakarzinom, von manchen als Kapselkarzinom
bezeichnet, kann durch digital rektale Palpation diagnostiziert werden.
Sonographisch kann es durch TRUS lokalisiert werden. Die histologische
BestätigungerfolgtdurchStanzbiopsie.
-
Das inzidentelle Karzinom ist primär klinisch unbekannt und wird meist bei
Prostatahyperplasie im Rahmen einer operativen Therapie durch TUR bzw. im
Adenomektomiepräparat zufällig diagnostiziert. Das inzidentelle Karzinom ist
meistens in der Übergangszone lokalisiert. Als Zufallsbefund und auch als
inzidentelles Prostatakarzinom ist jenes Karzinom anzusehen, welches im
Cystoprostatektomiepräparat bei Urothelkarzinom gefunden wird. Dieses wird
auchalssimultanesProstatakarzinombezeichnet.
10
1.Einleitung
-
Das okkulte Karzinom wird durch Metastasen auffällig. Der Primärtumor ist
klinischunentdecktgeblieben.
-
DaslatenteKarzinomwirderstpostmortembeiderObduktionentdeckt.Eswar
zuLebzeitendesPatientenmitklinischenMethodennichtnachweisbargewesen
(Helpap1998c).
1.3PATHOLOGISCHEBEGUTACHTUNGDESPROSTATAKARZINOMS
Um Karzinome vergleichbar zu machen, ist eine Klassifikation unerlässlich. Die
Beschreibung des histologischen Bildes (Grading) und der Ausbreitung des Tumors
(Staging) ist von hohem prognostischem Wert, wenn es ihr gelingt, zwischen
TumorenmithohemundniedrigemRezidivpotentialzudifferenzieren(Silverberget
al1988).
1.3.1UNTERSUCHUNGSMATERIAL
Zur histologischen Abklärung klinisch suspekter Befunde wird, wie oben erwähnt,
eine Stanzbiopsie durchgeführt. Diese ermöglicht bereits die Begutachtung der
Gewebsarchitektur sowie zytologischer Aspekte, und damit ein Grading. Neben der
Begutachtung dieser Biopsate obliegt dem Pathologen auch die histologische
Untersuchung des Operationspräparates. Dieses wird routinemäßig nach der
Operation inklusive Samenblasen und entnommener Lymphknoten eingesandt. Die
meistenBPH-Patienten,diemedikamentösnichtsuffizienttherapiertwerdenkönnen,
werden einer transurethralen Resektion der Prostata (TURP) unterzogen. Mittels
dieserTechnikreseziertesGewebewirdebenfallsdemPathologenzugesandt,umein
malignesGeschehenauszuschließen(Murphyetal.1997).
1.3.2GRADING
GradingbeschreibtdieEinordnungdesMalignitätsgradesvonTumorgewebeanhand
seiner mikrostrukturellen Abweichung vom nicht-entartetem Gewebe desselben
11
1.Einleitung
Organs.HierbeiwerdendieArchitekturvonZellverbändenunddieStruktureinzelner
Zellen bewertet. Der dabei erhobene Grad der Differenzierung beschreibt die
Ähnlichkeit mit dem Muttergewebe. Je grösser die Ähnlichkeit, desto besser und
höher die Differenzierung. Eine Vielzahl verschiedener Gradingsysteme wurde
entwickelt, um die Histopathologie des Prostatakarzinoms beurteilen zu können.
Diskutiertwurde,obsichdasGradingalleinaufdieglanduläreArchitekturoderauf
eine Kombination mit den Kernveränderungen beziehen solle, und ob das
Prostatakarzinom nach seinem am wenigsten differenzierten oder nach dem
dominanten Muster klassifiziert werden solle. Bis vor einigen Jahren waren zwei
Gradingsysteme populär, das Grading nach Mostofi, welches dem früheren WHOGradingentsprach,unddemheutealsStandardgesetztenGradingnachGleason.Das
Grading nach Mostofi berücksichtigt sowohl strukturelle Aspekte des Gewebes als
auchZellveränderungen.
GradingnachMostofi(Haradaetal.1977)
AusArchitekturundKernbildkombiniertesGrading
I:HochdifferenziertesAdenokarzinom,leichtenukleäreAnaplasie
II:AdenokarzinommitmäßigernukleärerAnaplasie
III: Adenokarzinome mit ausgeprägter nukleärer Anaplasie oder undifferenzierte,
diffuseKarzinomeohneerkennbareDrüsenbildung
Das Gleason-Grading beschränkt sich auf architektonische Gesichtspunkte, ohne das
Kernbild zu beachten (Gleason 1966; Gleason 1977). Es ist nach Donald F. Gleason
benannt. Seitdem die World Health Organization Classification (WHO 2003) es zum
Standardverfahren erklärt hat, ist es heute das wichtigste und meistverbreitete
histologischeGradingSystemdesProstatakarzinoms.
12
1.Einleitung
Aus Gleason DF, Hum. Pathol. 23: Seite 274 (1992) Differenzierungsmuster beim Prostatakarzinom: 1=hochdifferenziert;
5=entdifferenziert
Abb.4:
HistologischesGradingnachGleason
DasProstatakarzinombesitzteineausgeprägtemorphologischeHeterogenität,daher
sind meistens mehrere histologische Muster zu erkennen. Die Gradingwerte des
primärenunddessekundärenMusters,indiesemFalldasamhäufigstenauftretende
Muster und das Zweithäufigste, werden addiert, um so zu einem Gleason-Score zu
gelangen. Es wird empfohlen, das primäre und das sekundäre Muster, und
gleichzeitig die Summe zu dokumentieren, z.B. Gleason-Score 3+4=7. Wenn der
Tumor nur ein Muster besitzt, wird der Gleason-Score dadurch ermittelt, dass man
den Grad des Musters verdoppelt, z.B. Gleason-Score 3+3=6. Die Gleason-Scores 2
und 3 kommen nur vereinzelt vor, da das Gleason Muster 1 sehr selten ist. Der
Gleason-Score4istauchrelativselten,dadasMuster2meistensmiteinemMuster3
vermischtistundsoderScore5häufigerist.GleasonScore2-4Tumorensindoftim
Material einer TURP in der Transitionalzone zu finden. Für Nadelbiopsate wurde
vorgeschlagen, die Werte 2-4 nicht zu vergeben (Sakr et al. 1996; Epstein 2000).
Gleason Score 6 und 7 sind die häufigsten Werte und machen die Mehrheit der
TumoreninStudienaus.
13
1.Einleitung
GradingnachGleason(Gleasonetal.1974):
1:Dichtgepackte,monomorpheEinzeldrüsen,guteAbgrenzung,wenigStroma.
2: Lockerer angeordnete, überwiegend abgerundete Einzeldrüsen, leichte
Polymorphie,
schlechtereAbgrenzung,mehrStroma.
3:Größere,unregelmäßigangeordneteEinzeldrüsen,stärkerePolymorphie,klar
InfiltrierendesWachstum.AußerdemkleinecribriformeVerbändeohneNekrosen
undSchwärmekleinerEinzeldrüsen.
4:MassiveFusionvonEinzeldrüsenmitKettenbildungodergrößereninfiltrierenden
Drüsenverbänden,sowiehellzelliges(hypernephromatoides)Prostatakarzinom.
5:AnaplastischesAdenokarzinomohneerkennbareDrüsenbildungodergroße
cribriformeoderpapilläreVerbändemitNekrosen.
Nun werden die beiden quantitativ vorherrschenden Komponenten bewertet. Aus
der Summe dieser beiden Werte ergibt sich, wie oben beschrieben, ein Wert
zwischen2und10.
1.3.2.1REPRODUZIERBARKEITDESGLEASON-GRADINGS
Reproduzierbarkeit kann als „das Ausmaß, in welchem konstante Ergebnisse bei
wiederholter Erhebung erhalten werden“ definiert werden (Brown 1993). Viele
Studien haben die intraobserver- und interobserver-Reproduzierbarkeit untersucht.
Insgesamt wurden brauchbare Ergebnisse hinsichtlich der intraobserver
Reproduzierbarkeit erreicht, aber die Übereinstimmung zwischen verschiedenen
Untersuchernwardeutlichgeringer.(Haradaetal.1977;Bainetal.1982;Guileyardo
et al. 1982; Babain et al. 1985; Svanholm et al. 1985; Ten Kate et al. 1986; De la
Morenasetal.1988;Humphreyetal.1988;Cintraetal.1991;DiLoretoetal.1991;
Grignon et al. 1996; Özdamar et al. 1996; Lessels et al. 1997; McLean et al. 1997;
Steinberg et al. 1997; Iczkowski et al. 1998; Kronz et al. 2000; Kronz et al. 2000;
Allsbrook et al. 2001; Allsbrook et al. 2001; Egevad 2001; Freeman et al. 2001; van
Lieshout 2002). Aus den 20 Studien zusammengefasst ergeben sich eine exakte
14
1.Einleitung
intraobserver Übereinstimmung von 42-78% und einer Übereinstimmung von ±
einerGleasonScoreEinheit,wasalsnochtolerabelgilt,von:72-87%(Gleason1992;
Allsbrooketal.2001;Allsbrooketal.2001). DieexakteÜbereinstimmungzwischen
zwei verschiedenen Untersuchern belief sich auf 36-81%. Die Übereinstimmung ±
einem Gleason Score zwischen zwei verschiedenen Untersuchern war 69-86%. Alle
histologischen Grading Systeme, das Gleason-Grading eingeschlossen, sind
subjektiverNatur.Daheristesbeachtlich,dassderGleason-Scoretrotzdemeinerder
stärksten prädiktiven Faktoren für Patienten mit Prostatakarzinom ist (Amin et al.
2004).
15
1.Einleitung
1.3.3DASSTAGINGDESPROSTATAKARZINOMS
Während das Grading ausschließlich Aufgabe des Pathologen ist, wird das Staging
auch in der Klinik bestimmt, da gewisse Ausbreitungsstadien radiologisch und
sonographisch, in einigen Fällen sogar im Rahmen der klinisch-manuellen
Untersuchung,zuerfassensind.DasStagingerfolgtnachdemUICC-Schema.
Tabelle1:
DieTNM-StadieneinteilungdesProstatakarzinoms(Sobinetal.2009)
TNM:T=Tumor,N=Nodes(Lymphknoten),M=Metastasen
Stadi
Beschreibung
um
Tx
EskannkeineAussagezurAusdehnungdesPrimärtumorsgetroffenwerden.
T0
KeinPrimärtumor
T1a
Wenigeralsoder5%reseziertenGewebesbefallen,zufälligerBefund.
T1b
Mehrals5%befallen,zufälligerBefund
T1c
TumordurchStanzbiopsiegesichert
T2
DerTumorliegtnochinnerhalbderProstatakapsel.
T2a
DerTumorbefälltwenigerals50%einesSeitenlappens.
T2b
DerTumorbefälltmehrals50%einesSeitenlappens.
T2c
DerTumorbefälltbeideSeitenlappen.
T3
DerTumorhatsichüberdieProstatakapselhinausausgebreitet.
T3a
Der Tumor hat sich über die Prostatakapsel ausgebreitet ohne die Samenblasen zu
befallen.
T3b
DerTumorhatsichüberdieProstatakapselausgebreitetundbefälltdieSamenblasen.
T4
DerTumorhatNachbarstruktureninfiltriertoderistfixiert(d.h.nichtverschieblich).
Nx
EskannkeineAussagezuregionärenLymphknotenmetastasengetroffenwerden.
N0
KeineMetastasenindenregionärenLymphknoten.
N1
MetastasenindenregionärenLymphknoten.
Mx
EskannkeineAussagezuFernmetastasengetroffenwerden.
M0
KeineFernmetastasennachweisbar.
M1
DerTumorhatFernmetastasengebildet.
M1a MetastaseninanderenLymphknoten(nichtregionäreLymphknoten).
M1b MetastasenindenKnochen.
M1c
MetastaseninanderenOrganenund/oderStrukturen.
16
1.Einleitung
Bei dem UICC-Schema können nun T-, N- und M-Stadien miteinander kombiniert
werden, so dass eine komplette Aussage über das Tumorstadium des Patienten
möglich ist. Auch lässt sich daraus erkennen, wie das Stadium erhoben wurde. So
stehteinvorangestelltes„p“füreinepathologischeBegutachtungundein„c“füreine
klinische Befunderhebung. Zufällig diagnostizierte Tumoren, die noch keinen
klinischen Verdacht verursachen, findet man im Rahmen einer transurethralen
Prostataresektion (TURP). Das Resektat wird histopathologisch untersucht, um ein
Karzinom auszuschließen. Diese Art von Karzinomen ist als inzidentelles Karzinom
bekannt(T1a,T1b).NachderUICC-KlassifikationexistiertkeinStadiumpT1.
GeradebeimProstatakarzinomzeigensichstarkeZusammenhängezwischenGrading
und Staging: Das schlecht differenzierte Karzinom ist im Allgemeinen bei
Diagnosestellungweiterfortgeschritten.Grobvereinfachtkönntemansagen,dassdas
Staging die momentane Situation des Tumors wiedergibt, während das Grading die
Potenz des Tumors einzuschätzen vermag (van Lieshout 2002). Jedoch findet man
deutlicheHinweisedarauf,dassProstatakarzinomeimLaufeihresWachstumsmehr
undmehrihreDifferenzierungverlieren.
Die Einteilung des Tumorstadiums differenziert zwar zwischen dem Verlassen der
Organgrenze (T3) und dem Eindringen in benachbarte Organe (T4), aber sie
beschreibt nicht, ob der chirurgische Absetzungsrand, meist aus Fett- und
Bindegewebe bestehend, von den Tumorformationen erreicht oder sogar
überschrittenwurde.WenndasderFallist,wäredaseinHinweisaufnichtentfernte
Tumorzellen und damit auf eine eingeschränkte Radikalität der Operation (R1).
Daher definiert man den Begriff des positiven Absetzungsrandes oder „positive
margin“, um diesem Sachverhalt gerecht zu werden (Wieder et al. 1998). Nach der
Entnahme der Prostata werden daher die Absetzungsflächen vom Pathologen mit
Tusche markiert, wonach die markierten Schnittflächen im histologischen Schnitt
sichtbarbleiben.
17
1.Einleitung
1.4FRAGESTELLUNG
Ist es möglich, den Gleason Score durch Methoden der räumlichen Statistik aus
quantifiziertenBilddatenzuprädizieren?
WelcheVariablensindambestenzurPrädiktiongeeignet?
WelcheParameterhabendiestärksteKorrelationzumGleason-Score?
18
2.MaterialundMethodik
2.MATERIALUNDMETHODIK
2.1PATIENTENKOLLEKTIV
DieUntersuchungenumfasseneinKollektivvoninsgesamt103Patienten,25Patienten
mitderDiagnoseeinesinzidentellenProstatakarzinoms(T1),50Patientenmiteinem
pT2Tumorund28PatientenmiteinempT3Tumor.DiesewurdeninderUrologischen
KlinikanderUniversitätUlmzwischen1985und2000behandelt.DerjüngstePatient
war49Jahrealt,derälteste87,dasDurchschnittsalterlagbei65Jahren.DerGleason
Score lag zwischen 3 und 9, der Durchschnitt lag bei 6. Der Gleason Score wurde
zeitnahnachEntnahmedesGewebesvonProf.Dr.TorstenMattfeldt,Pathologeander
UniversitätUlm,bestimmt.
Tabelle2:
T1FälleausdemPatientenkollektiv
spatstat:SoftwarezurErmittlungderPunktprozessStatistik.
Geostoch:SoftwarezurTexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen
TUR:transurethraleResektionderProstata
OP:radikaleProstatektomie
spatstat
Geostoch
Fall
Alter
Nr.
Gewebe
Staging
Art
prim.
sek.
Gleason
Gleason
Gleason
Score
Grad
Grad
x
x
2
81
TUR
T1a
1
1
2
x
x
4
82
TUR
T1b
3
3
6
x
x
7
67
TUR
T1b
2
3
5
x
x
13
82
TUR
T1a
2
3
5
x
x
15
66
OP
T1b
2
3
5
x
x
18
73
TUR
T1b
2
3
5
x
x
20
66
TUR
T1b
3
2
5
x
x
26
87
TUR
T1a
3
3
6
x
x
27
73
TUR
T1b
3
3
6
x
x
30
70
TUR
T1b
2
3
5
x
x
32
84
TUR
T1a
2
3
5
x
x
38
81
TUR
T1a
1
2
3
x
x
39
72
TUR
T1a
1
2
3
x
x
46
65
TUR
T1a
1
2
3
x
x
49
75
OP
T1a
1
2
3
x
x
51
69
TUR
T1a
1
2
3
x
x
52
67
TUR
T1a
1
2
3
19
2.MaterialundMethodik
x
x
53
59
TUR
T1a
1
2
3
x
x
55
76
TUR
T1a
1
2
3
x
x
56
60
TUR
T1b
2
3
5
x
x
57
58
TUR
T1b
3
3
6
x
x
58
57
OP
T1a
2
1
3
x
x
60
75
TUR
T1a
1
2
3
x
x
61
78
TUR
T1a
1
2
3
x
x
64
61
OP
T1b
2
3
5
25
25
Tabelle3:pT2Fälle
spatstat:SoftwarezurErmittlungderPunktprozessStatistik.
Geostoch:SoftwarezurTexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen
OP:radikaleProstatektomie
spatstat
Geostoch
Fall
Alter
Nr.
Biopsie
Staging
Art
prim.
sek.
Gleason
Gleaso
Gleaso
Score
nGrad
nGrad
x
1
76
OP
pT2cpN0
3
3
6
x
x
2
75
OP
pT2cpN0
3
3
6
x
3
71
OP
pT2cpN0
4
4
8
x
4
77
OP
pT2cpN0
4
3
7
x
x
5
67
OP
pT2cpN0
2
3
5
x
x
6
63
OP
pT2cpN0
2
3
5
x
x
10
58
OP
pT2cpN0
2
3
5
x
11
75
OP
pT2b
2
3
5
x
x
14
55
OP
pT2cpN0
3
3
6
x
15
72
OP
pT2cpN0
4
3
7
x
16
58
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
17
66
OP
pT2cpN0
2
3
5
x
18
67
OP
pT2cpN0
3
3
6
x
x
19
57
OP
pT2cpN0
3
3
6
x
x
20
73
OP
pT2pN0
3
3
6
x
21
63
OP
pT2apN0
3
3
6
x
22
56
OP
pT2cpN0
3
3
6
x
x
23
70
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
24
56
OP
pT2c
3
3
6
x
25
71
OP
pT2apN0
2
3
5
x
26
62
OP
pT2cpN0
4
3
7
20
2.MaterialundMethodik
x
x
27
68
OP
pT2bpN0
4
4
8
x
28
62
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
29
54
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
x
30
57
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
31
73
OP
pT2bpN0
2
2
4
x
32
49
OP
pT2bpN0
2
3
5
x
x
33
70
OP
pT2bpN0
2
3
5
x
x
34
61
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
35
66
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
x
36
77
OP
pT2apN0
3
3
6
x
37
66
OP
pT2bpN0
5
4
9
x
x
38
72
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
x
39
67
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
x
40
62
OP
pT2bpN0
2
3
5
x
41
57
OP
pT2apN0
3
3
6
x
42
64
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
43
59
OP
pT2b
4
3
7
x
x
44
58
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
x
45
63
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
x
46
59
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
x
47
76
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
x
48
60
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
x
49
63
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
x
50
66
OP
pT2bpN0
3
3
6
x
x
52
60
OP
pT2b
3
3
6
x
x
53
61
OP
pT2bpN0
4
3
7
x
x
54
55
OP
pT2apN0
3
3
6
x
x
55
70
OP
pT2apN0
3
3
6
x
x
58
69
OP
pT2bpN0
4
3
7
28
50
21
2.MaterialundMethodik
Tabelle4:pT3Fälle
spatstat:SoftwarezurErmittlungderPunktprozessStatistik.
Geostoch:SoftwarezurTexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen
OP:radikaleProstatektomie
spatstat Geostoch
Fall
Alter
Nr.
Biopsie
Staging
Art
prim.
sek.
Gleason
Gleaso
Gleaso
Score
nGrad
n
Grad
x
x
1
73
OP
pT3apN0pMx
3
3
6
x
x
2
55
OP
pT3bpN0pMx
4
3
7
x
x
3
54
OP
pT3bpN0pMx
4
3
7
x
x
4
53
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
5
71
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
6
73
OP
pT3apN0pMx
4
4
8
x
x
7
66
OP
pT3bpN0pMx
5
4
9
x
x
8
66
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
9
59
OP
pT3bpN0pMx
3
3
6
x
x
10
74
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
11
69
OP
pT3apN0pMx
5
4
9
x
x
12
53
OP
pT3apN0pMx
3
3
6
x
x
13
63
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
14
60
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
15
67
OP
pT3apN0pMx
4
4
8
x
x
16
75
OP
pT3apN0pMx
3
3
6
x
x
17
58
OP
pT3apN0pMx
3
3
6
x
x
18
73
OP
pT3bpN0pMx
4
4
8
x
x
19
57
OP
pT3apN0pMx
4
4
8
x
x
20
72
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
21
56
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
22
61
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
23
54
OP
pT3apN0pMx
4
3
7
x
x
24
62
OP
pT3apN0pMx
2
3
5
x
x
25
67
OP
pT3apN0pMx
3
3
6
x
x
26
73
OP
pT3bpN0pMx
4
4
8
x
x
27
62
OP
pT3bpN0pMx
4
3
7
x
x
28
60
OP
pT3bpN0pMx
5
4
9
28
28
22
2.MaterialundMethodik
2.2TEXTURANALYSEVONZUFÄLLIGENABGESCHLOSSENENMENGEN
ImRahmenderDiagnostikwurdenaustransurethraleProstataresektionen,radikalen
Adenomektomien und radikalen Prostatektomien Hämatoxylin-Eosin(HE)-Schnitte
angefertigt. Um Epithel, Lumen und Stroma abzugrenzen, wurden die Schnitte mit
einem Kontron IBAS 2000 Bildanalysesystem von Herrn Rolf Kunft (Abteilung
Pathologie) interaktiv segmentiert. Mit dieser Anlage konnten die Bilder durch ein
Lichtmikroskop mit einem 10er Objektiv und einer Farb-Einchip-CCD-Kamera an
einem Monitor angezeigt werden. Weiter wurden dann die Abschnitte von Lumen,
Epithelzellen und Stroma mit einer Maus auf einem Digitalisierungstablett umfahren
und in verschiedenen Farben dargesellt. In unserem Fall weiß (Helligkeitsstufe 255)
für das Epithel, grau (Helligkeitsstufe 127) für das Lumen und schwarz
(Helligkeitsstufe 0) für das Stroma. Die Endvergrößerung betrug: Objektiv 10fach x
Optovar 1,25fach x Vergrößerungsfaktor der Kamera 156,25 fach. Daraus ergab sich
ein Gesichtsfeld von 0,4 x 0,4 mm². So entstanden 5-10 triphasische segmentierte
Bilder pro Fall. Insgesamt waren es 103 Fälle, aufgeteilt in 25 T1 Fälle, 50 pT2 Fälle
und 28 pT3 Fälle. Die Bilder hatten eine Größe von 512x512 Pixel (510x510 Pixel
informativer Bildinhalt, umgeben von einem schwarzen Rand von der Breite eines
Pixels),welcheimtif-Formatgespeichertwurden.
Abb.5:TriphasischsegmentiertesBild:
weiß=Epithelzellen,grau=Lumen,schwarz=Stroma
23
2.MaterialundMethodik
Um weitere Berechnungen durchzuführen, mussten die Bilder am PC in pgm-ASCII
Dateien umgewandelt werden. Diese Bilder können im pgm-ASCII Format in einem
Texteditor Zeile für Zeile angezeigt werden. Dies wurde mit einem Freeware
Programm namens IrfanView 4.00 durchgeführt. Die Bilder konnten als Batch
eingelesen werden. Dies bedeutet in der Praxis, dass man den Pfad der tif-Bilder
angibt, das Programm öffnet die Bilder und wandelt sie um. Danach werden die
umgewandeltenBilderineinemvomBenutzerangegebenenPfadgespeichert.
ZurBerechnungderMinkowski-Funktionale(sieheunten)wurdejedespgm-Bildin3
binäreBilderumgewandelt,indemjeweils2Phasenzusammengefügtwerden.Dieser
Arbeitsschritt verläuft automatisch vor der Berechnung der Minkowski Funktionale.
Binäre Bilder sind Bilder, in denen für jedes Pixel der Helligkeitswert nur 2 Stufen
annehmenkann(z.B.0und1oder0und255,usw.).MitderGeostochSoftware,welche
von dem Institut für Stochastik der Universität Ulm entwickelt wurde, konnten dann
die Minkowski Funktionale der 3 Phasen geschätzt werden (Mayer et al. 2004). Die
GeostochSoftwareisteineProgrammbibliothekaufderBasisderProgrammiersprache
JAVA die Berechnungen durchführen. Aus diesem Softwarepaket wurde die Routine
„Measure2D“ verwendet welche auf der Basis von etablierten Algorithmen die
SchätzungderneunParameterderzufälligenabgeschlossenenMengendurchführt.Um
dies zu tun, braucht man eine JAVA Programmier Plattform, welche die Dateien als
JAVA Quelltext erkennt und diese dann ausführt. Verwendet wurde das Programm
NetBeans 3.6, welche eine gängige JAVA Programmier Plattform ist. Mit dieser
Plattform wurde ein JAVA Programm geschrieben, welches bis zu 10 pgm-Bilder pro
Falleinliest,dasGeostochProgrammzurErmittlungderdreiMinkowskiFunktionale
(sieheAbschnitt2.4)öffnet,danndieBerechnungallerdreiFunktionalefüralleder3
Phasen (Epithelzellen, Lumen, Vereinigung von Lumen und Epithelzellen) durchführt
und die Ergebnisse in Textdateien speichert. Dies wurde dann für jeden Fall
durchgeführt.SoentstandenproFall9DateiendiejenachAnzahlderBilderproFall
biszu10Wertebeinhalten.DanachwurdendieWertemitHilfevonSAS-Programmen
statistischausgewertet.
24
2.MaterialundMethodik
2.3EXPLORATIVERÄUMLICHESTATISTIKDESPUNKTPROZESSESDERTUMORZELLKERNE
IMSCHNITT
Die fertigen Hämatoxylin-Eosin (HE) Schnitte, welche im Rahmen der Diagnostik
angefertigt wurden, wurden von Prof. Mattfeldt (Abteilung Pathologie) unter einem
LichtmikroskopdesTypsLeitzAxiophotmitangeschlossenerCCD-Kamerabetrachtet.
Es wurden 7 Bilder pro Fall an den per Firewire verbundenen PC mit der Software
DISKUS 4.50 unter Windows 2000 übertragen und als tif Datei gespeichert. Zur
Kalibrierung wurde zunächst eine Aufnahme einer Strecke standardisierter Länge
aufgenommen, um so die tatsächlich metrische Größe des danach zu bearbeitenden
Bildeserfassenzukönnen.DieGrößederBilderwar1240x1000Pixel,waseinerGröße
von 454x366 µm² entspricht. Diese Bilder wurden auf CD gebrannt, um so an einem
weiteren PC bearbeitet werden zu können. Vor der weiteren Bearbeitung der Fälle,
wurden von Prof. Mattfeldt die 2 technisch besten Bilder pro Fall ausgesucht. So
ergabensich80Fälleà2Bilder,unterteiltinT125Fälle,T227FälleundT328Fälle.
Danach konnte mit der Detektion der Zentren der Kernprofile des Drüsenepithels
begonnenwerden.DieswurdemitAdobePhotoshop5.5unterWindowsverwirklicht.
Unter Adobe Photoshop wurde zunächst ein Layer gelegt. Dies bedeutet, dass man
virtuelleinedurchsichtigeFolieaufdasBildlegt,unddannmitdemPinselTooleinen
anfangs schwarzen, dann, wegen des besseren Kontrastes, grünen Punkt von 9 Pixel
Durchmesser auf jeden Kern einer Tumorzelle legt. So entstanden pro Bild ca. 8001100 Punkte. Weiter wurden pro Bild 3 verschiedene Bilder generiert und im tifFormat gespeichert. Erstens, das native Bild ohne Punkte, zweitens, das Bild mit den
Punkten zusammen und drittens, nur die durchsichtige Folie mit den Punkten. Die
Folie wurde vor dem Speichern weiß angefärbt, so dass sich die Punkte gut vom
Hintergrund abhoben. Abbildung 6, 7 und 8 zeigen ein auf diese Weise bearbeitetes
Bild.
25
2.MaterialundMethodik
Abb.6:NativesBildohnePunkte
Abb.7:ObigesBild,nachDetektionderSchnittprofilederTumorzellkerneunterAdobe
Photoshop5.5
26
2.MaterialundMethodik
Abb.8:ReinesPunktmusterzurweiterenAuswertung
Mit der freien Software Image Tool 3 unter Windows 2000 wurden die reinen
Punktmustereinzelnbearbeitet.ZuerstmusstendieBilderinGrauwerteumgewandelt
werden, danach konnten die einzelnen Punkte automatisch detektiert werden. Das
Programm zählte die Punkte und schrieb die Koordinaten jedes Mittelpunktes des
Punktes in eine Textdatei. Dabei enthielt jede Zeile die x und y Koordinate eines
Punktes. Zur Auswertung der Punktkoordinaten wurde die freie Software namens
„spatstat“unterderfreienStatistikSoftwareR2.2.0unterLinuxverwendet.Indiesem
Programm wurden die Punktkoordinaten eingelesen, und dann die Funktionen g( r) ,
L( r) und K ( r) (siehe Abschnitt 3.2) für jedes Bild berechnet und in einer Textdatei
€
ausgegeben. Weiter wurde eine parametrische Modellierung auch mit diesem
€
Programmdurchgeführt(sieheAbschnitt3.3).UmdieStatistik M zuerhalten,(siehe
€
Abschnitt 3.2) musste von jedem Bild die g -Funktion unter Excel 2003 graphisch
dargestellt werden und die Koordinaten des ersten Minimums
und die Koordinaten
€
deserstenMaximumsmanuellermitteltwerden.DiesewurdenineineExcelTabelle
€
eingefügt, um so die Statistik M zu berechnen. Abbildung 9 zeigt ein Beispiel der g Funktion.
€
€
27
2.MaterialundMethodik
3,0
2,5
2,0
g(r)
1,5
1,0
0,5
-0,5
1
36
71
106
141
176
211
246
281
316
351
386
421
456
491
526
561
596
631
666
701
736
771
806
841
876
911
946
981
1016
0,0
r
Abb.9: g -FunktionmitdenWerten g( r) alsy-AchseunddieWerte r alsx-Achse
€
€
€
2.4TEXTURANALYSEVONZUFÄLLIGENABGESCHLOSSENENMENGEN
Betrachtet man Schnittpräparate von normalem exokrinem Drüsengewebe (Mamma,
Prostata, Pankreas, usw.) oder von drüsenbildenden Karzinomen dieser
Ausgangsgewebe (Adenokarzinome), so drängt sich eine natürliche Gliederung des
Gewebes in jeweils drei Komponenten auf. Diese Komponenten ergänzen sich
zusammengenommen
zu
100%
des
Gesamtgewebes.
Drüsengewebe
und
Adenokarzinomgewebe kann als eine Struktur mit den drei Komponenten
Epithelzellen,StromaundDrüsenluminabetrachtetwerden.DiesedreiKomponenten
werden als zufällige abgeschlossene Mengen betrachtet, die jeweils potentiell eine
positive Volumenfraktion besitzen (Volumenprozesse). Diese sind gegen zufällige
abgeschlosseneMengenohnepositivesVolumenwiez.B.zufälligeFaserprozesseoder
zufällige Oberflächenprozesse abzugrenzen. (Chiu et al. 2013) Als mathematisches
Modell
gehen
wir
Prostatakarzinomgewebe
von
Stationarität
realistisch
ist
und
(siehe
Isotropie
Abschnitt
aus,
3.2).
was
für
Weitere
Modellannahmen wurden nicht gemacht. Die in diesem Kapitel beschriebenen
Methodensinddaheralsexplorativeinzuordnen.
28
2.MaterialundMethodik
In der diagnostischen Histopathologie arbeitet man mit Schnittpräparaten, d. h.
dünnenSchnitten,aufwelcherechteckigeoderquadratischeFensterausgelegtwerden
und unter dem Mikroskop betrachtet werden. Als unmittelbares Betrachtungsobjekt
liegen uns daher zufällige abgeschlossene Mengen im zweidimensionalen Raum vor.
Diese können durch die drei Minkowski-Funktionale quantifiziert werden: AA , der
FlächenanteilderinteressierendenPhaseproEinheitReferenzfläche; BA ,diemittlere
RandlängederinteressierendenPhaseproEinheitReferenzfläche;und χA ,diemittlere
€
Eulerzahl der interessierenden Phase pro Einheit Referenzfläche (Ohser et al. 2000;
€
Mattfeldtetal.2007).DiesedreiWertehabenimdreidimensionalenRaumeineklare
€
Bedeutung. Sie können zur Schätzung stereologischer Modellparameter benutzt
werden:
VV = AA SV =
€
4
B π A
MV = 2πχA €
wobei VV dieVolumenfraktionbedeutet,derParameter SV istdiemittlereOberfläche
derinteressierendenPhaseproEinheitReferenzvolumen(Oberflächendichte)und MV €
€
istdiemittlereKrümmungproVolumeneinheit(Krümmungsdichte)(Chiuetal.2013;
€
Ohseretal.2000).DieGleichungen1-3sindfundamentalestereologischeGleichungen
€
und gelten für zufällige abgeschlossene Mengen, wenn die Minimalbedingungen der
IsotropieundStationaritäterfülltsind.
Hierzu ist prinzipiell anzumerken, dass die Schätzung von VV und SV auch mit
einfachen stereologischen Methoden manuell möglich ist Die Bestimmung der
Krümmungsdichte MV ist jedoch wesentlich komplexer und setzt auf jeden Fall den
€
€
EinsatzeinesComputerszurBildauswertungvoraus.ZurBestimmungderMinkowskiFunktionalewurdedasStandardverfahrennachOhserundMücklichverwendet(Ohser
€
et al. 2000). Die Bestimmung der mittleren Eulerzahl pro Flächeneinheit (bzw. der
mittleren Krümmung pro Volumeneinheit) erschien gerade für das Grading des
Prostatakarzinoms
wichtig,
da
dieser
Parameter
sehr
gut
Adenokarzinomdifferenzierungen widerspiegeln sollte. Vereinfacht kann man
aussagen:dieEulerzahleinerStrukturineinemabgeschlossenenGebietergibtsichals
DifferenzausderAnzahlderStrukturenderabgeschlossenenMengeminusderAnzahl
der Löcher in diesen Strukturen. Daraus ergibt sich im Idealfall für eine solide
29
2.MaterialundMethodik
TumorarchitektureinWertχ>0,füreinereintubuläreDrüsenarchitekturχ=0undfür
eine cribriforme Drüsenarchitektur χ<0, da hierbei die Zahl der Löcher größer ist als
dieZahlderEpithelformationen.Abb.10zeigteinesolideDrüsenarchitektur,Abb.11
zeigt eine tubuläre Drüsenarchitektur und Abb. 12 zeigt eine cribriforme
Drüsenarchitektur.
Abb.10:Eulerzahl=3-0=3Abb.11:Eulerzahl=3-3=0Abb.12:Eulerzahl=1-4=-3
Die praktische Bestimmung der drei Minkowski-Funktionale AA , BA , und χA erfolgte
mit Hilfe der Geostoch-Software des Institutes für Stochastik, die im Rahmen einer
Kooperation benutzt werden durfte (Mayer et al. 2004). Aus dem Geostoch Software
€ €
€
PaketwurdedieRoutine„Measure2D“angewandt,welchedenOhser-Algorithmuszur
Berechnung der Minkowski-Funktionale verwendet (Ohser et al. 2000). Als
Ausgangsmaterial dienten interaktiv segmentierte Bilder von Prostatakarzinomen.
Hierdurch lagen die Bilder bereits segmentiert mit den drei Komponenten
Epithelzellen,LumenundStromavor.MitHilfederGeostoch-Softwarewurdennundie
Minkowski-FunktionalefürdieKomponentenEpithel,LumenundVereinigungsmenge
von Lumen und Epithel geschätzt. Hierdurch liegen die Schätzungen der MinkowskiFunktionalefürdieepithelialeKomponenteunddasLumendirektvor.DieMinkowskiFunktionale der Stromakomponente ergeben sich rechnerisch aus den MinkowskiFunktionalenderKomponente(EpithelzellenvereinigtmitLumen).
2.5EXPLORATIVERÄUMLICHESTATISTIKDESPUNKTPROZESSESDERTUMORZELLKERNE
IMSCHNITT
In diesem Abschnitt geht es um die explorative Charakterisierung von planaren
Punktprozessen.ZunächstmussgrundsätzlichzwischenplanarenPunktprozessenund
planaren Punktmustern unterschieden werden. Ein Punktprozess ist im eigentlichen
Sinne nicht direkt beobachtbar. Der Punktprozess ist das verborgene mathematische
Gesetz,dasdieVerteilungderPunkteinderEbenebeherrscht.ImGegensatzdazusind
Punktmuster beobachtete Positionen von Punkten in der Ebene. Diese sind
30
2.MaterialundMethodik
normalerweise in einem Beobachtungsfenster gegeben. In der Praxis heißt das: ein
PunktmusteristdurchInformationenüberdasBeobachtungsfensterundeineendliche
AnzahlvonPunktkoordinatenindiesemFenstergegeben.Wennmansichmitplanaren
Punkmustern beschäftigt, ist es zuerst wichtig, sich Klarheit über zwei fundamentale
Eigenschaften des zugrundeliegenden Punktprozesses zu verschaffen. Diese
Eigenschaften sind Isotropie und Stationarität. Isotropie bedeutet im Zusammenhang
mit Punktprozessen, dass die Verteilung der Punkte drehungsinvariant
(rotationsinvariant) ist. Wenn dies nicht der Fall ist, handelt es sich um einen
anisotropen Punktprozess. Stationarität bedeutet, dass die Verteilung der Punkte
gegenüber Verschiebungen invariant ist (translationsinvariant). Ist diese Eigenschaft
nicht gegeben, handelt es sich um einen nichtstationären Punktprozess. Bei
Stationarität folgt, dass die Intensität, das heißt, die mittlere Anzahl der Punkte pro
Flächeneinheit bei einem planaren Punktprozess, konstant ist. Die Intensität des
Punktprozesses ist überall gleich. Handelt es sich dagegen um einen nichtstationären
Punktprozess, liegen deterministische lokale Veränderungen der Intensität in der
Ebenevor.Z.B.könnenGradientenauftreten,diebewirken,dassdiemeistenoderalle
Punkte in bestimmten Regionen konzentriert sind, während andere Regionen nur
wenigPunkteenthalten.
MitetwasErfahrungistesmöglich,anhandeinervisuellenInspektionderPunktmuster
eine qualifizierte Entscheidung zu treffen, ob diese isotrop und stationär sind. Es
spricht für Anisotropie, wenn die Punkte sich vornehmlich entlang bestimmter
Richtungen anordnen, während andere Richtungen systematisch unterrepräsentiert
sind. Ebenso ist Nichtstationarität in Folge starker Gradienten in drastischen Fällen
sofort
evident.
Bei
Mittelpunktskoordinaten
unseren
der
Punktmustern
Schnittprofile
handelte
der
es
sich
um
Tumorzellkerne
die
von
Prostatakarzinomen. Die visuelle Inspektion der Bilder sprach für Isotropie und
Stationarität. Es gab keine erkennbaren Vorzugsrichtungen der Zellkerne in den
Bildern. Dazu passt auch die allgemeine Auffassung, dass es sich bei Drüsengewebe
(Mamma, Prostata, Schilddrüse usw.) um isotrope Gewebe handelt, während
Anisotropie in Organen mit einer makroskopisch erkennbaren Vorzugsrichtung zu
erwarten ist (Herzmuskel, Skelettmuskulatur, Nerven usw.). Ebenso erschienen die
beobachteten Punktkoordinaten in erster Näherung gleichförmig über die
Beobachtungsfelderverteilt,ohnedasssystematischeGradientenzuerkennenwaren.
Aus diesem Grund erschien es angemessen, explorative Methoden und Modelle für
isotropeundstationärePunktprozessezubenutzen.Stationaritätimpliziertauch,dass
31
2.MaterialundMethodik
alle Bereiche des Referenzraums potentiell Punkte enthalten können. Wertet man
Bilder im Hinblick auf stationäre Punktprozesse aus, so dürfen keine „schwarzen
Löcher“ durch Artefakte vorliegen, die dazu führen, dass hier keine Punkte vorliegen
können. Dies wurde in unserer Untersuchung dadurch gewährleistet, dass nur
technisch gute Areale für die Auswertung berücksichtigt wurden, in denen keine
Artefaktevorlagen.
IndenmeistenAnwendungenderMikroskopieinderMedizinistesvölligausreichend,
ein Gewebe durch deskriptive Begriffe zu klassifizieren. Diese Klassifikation
histologischer Biopsien und Präparate auf der Basis der Erfahrung durch den
Pathologen ist schnell und effizient. Die Anwendung quantitativer Methoden in der
Histologie ist im Allgemeinen wesentlich arbeitsaufwendiger und erfordert viel mehr
ZeitalsderebenbeschriebenedeskriptiveZugangimRahmenderRoutinediagnostik.
InbestimmtenSituationenistesjedochwünschenswert,zueinerQuantifizierungder
Informationzugelangen,dieindenBildernenthaltenist.EinwichtigesBeispielistdas
MalignitätsgradingbeihäufigauftretendenmalignenTumorendesMenschenwiedem
Mammakarzinom, dem Dickdarmkarzinom und dem Prostatakarzinom. Es gibt einen
sehrhohenGradderReproduzierbarkeitinderEinstufungeinesGewebesalsgutartig
versus bösartig. Bei dieser elementaren Frage werden mehrere Fachärzte der
PathologiepraktischimmerzudemselbenSchlusskommen.DerdeskriptiveZugangist
jedochbeimMalignitätsgradingwenigerverlässlich,wievieleUntersuchungengezeigt
haben. Es ist also keinesfalls klar, ob mehrere Pathologen bei Vorlage derselben
Schnitte, etwa eines Prostatakarzinoms, zum selben Grading gelangen. Die
Unterschiede sind wesentlich subtiler und Untersuchungen haben sogar gezeigt, dass
ein und derselbe Untersucher bei wiederholter Vorlage derselben Schnitte zu
unterschiedlichen Graduierungen gelangen kann. Hier könnten also objektive und
quantitative Methoden doch von Vorteil sein. Darüber hinaus können quantitative
histologische Methoden immer da erforderlich sein, wo es darauf ankommt, kleine,
aber doch signifikante Strukturabweichungen in Zellen in der Zellkultur oder in
LabortierennacheinerexperimentellenBehandlungnachzuweisen.Auchhierkönnen
die Unterschiede so gering sein, dass sie bei einfacher Durchmusterung der
Gewebsproben nicht auffallen. Ferner kann es in der Zoologie und in der normalen
Anatomie von Interesse sein, die Struktur normaler Gewebe zwischen verschiedenen
Regionenzuvergleichen,ebensogeweblicheVeränderungeninAbhängigkeitvonAlter
zu studieren oder verschiedene Spezies miteinander zu vergleichen. Auch in diesen
FällensinddieUnterschiedeoftnurgeringundkönnendurchsubjektiveAuswertung
32
2.MaterialundMethodik
nicht verlässlich erfasst werden. Aus diesem Grund sind die drei genannten
Anwendungsbereiche (Malignitätsgrading, experimentelle Pathologie, regionale
Vergleiche,
Alterspathologie
und
Speziesvergleich)
von
jeher
klassische
Anwendungsbereiche quantitativer Methoden in der Histologie. Dies gilt
gleichermaßenfürlichtmikroskopischeundelektronenmikroskopischeMethoden.
Wenn eine Quantifizierung von mikroskopischen Bildern angestrebt wird, so bedient
man sich dabei in der Regel der Methoden der räumlichen Statistik und Stereologie
(sieheunten).IndiesemAbschnittbetrachtenwirdieAnordnungvonPunkteninder
Ebene. Der Bereich der räumlichen Statistik, der sich mit solchen Punktmustern
beschäftigt, wird als Statistik planarer Punktprozesse bezeichnet. Als Datenmaterial
gehen gemessene Koordinaten von Punkten in der xy− Ebene ein, die aus
lichtmikroskopischen
oder
transmissionselektronenmikroskopischen
Bildern
stammen. Solche Datensätze werden auch als kartierte Punktmuster bezeichnet
€
(mapped point patterns). Die Extraktion der Koordinaten aus den primären Bildern
kann interaktiv oder automatisch durchgeführt werden. In der vorliegenden
Untersuchung erfolgte eine interaktive Detektion von Zellkernschnittprofilen anhand
gespeicherterlichtmikroskopischerBilder.
Wie oben erwähnt, betrachten wir Punktmuster von isotropen und stationären
planarenPunktprozessen.BeiderAuswertungsolcherPunktmustersindzweiEbenen
der Forschung zu unterscheiden. Ein primärer Zugang besteht in der Regel in einer
erstenexplorativenDatenanalyse,beiderkeinspezifischesparametrischesModellfür
die Punktmuster vorausgesetzt wird. Nach Abschluss einer solchen explorativen
Datenanalysegeht mandazuüber,einparametrischesmathematischesModellandie
beobachteten Punktmuster anzupassen (siehe unten). Betrachten wir zunächst die
explorativeEbene.WelcheInformationenkönnenauseinerexplorativenDatenanalyse
vonPunktmusternerwartetwerden?AlsersteInformationergibtsicheinSchätzwert
der Intensität λ des Punktprozesses, das heißt, die mittlere Anzahl der Punkte pro
Einheit Referenzfläche. Normalerweise reicht es aus, λ einfach aus der Anzahl der
Punkte pro Beobachtungsfenster zu schätzen. Darüber hinaus liefern explorative
MethodenderPunktprozessstatistikSchätzwertevonStatistikenzweiterOrdnung,die
unsdarüberinformieren,inwelcherWeisediePunkterelativzueinanderinderEbene
verteilt sind. Während die Intensität nur eine einzelne Quantität darstellt, handelt es
sichbeidenStatistikenzweiterOrdnungumFunktionen.BeidiesenFunktionenerhält
man eine Reihe von Werten als Funktion des Abstandes zwischen den Punkten, r .
33
€
2.MaterialundMethodik
DieseFunktionswertezeigen,vonwelcherArtdieInteraktionzwischendenPunktenin
Abhängigkeit von der Entfernung r ist. Die Interaktion kann in einer Anziehung
(Clustering) zwischen den Punkten bestehen, es kann eine Abstoßung (Repulsion)
vorliegen, oder bei bestimmten Distanzen kann eine Interaktion völlig fehlen. Die
€
beliebtesten Statistiken zweiter Ordnung sind die K− Funktion, die L− Funktion und
diePaarkorrelationsfunktion( g− Funktion),dieimFolgendenkurzvorgestelltwerden
sollen. All diese Funktionen setzen lediglich
€ Stationarität und
€ Isotropie voraus und
machen keine weiteren parametrischen Modellannahmen. Wenn man Gruppen von
€
Tumoren anhand solcher Statistiken miteinander vergleicht, gehen auch keine
stereologischen Modellannahmen, wie z.B. Kugelmodelle für die Kerne ein, da die
Funktionen hier lediglich zur Charakterisierung der planaren Punktmuster benutzt
werden.
Eine der beliebtesten Funktionen der explorativen Analyse planarer Punktmuster ist
Ripleys K− Funktion K(r) . Die Funktion K(r) ist definiert als die mittlere Anzahl
(= E = Erwartungswert) anderer Punkte des Punktprozesses, die in einem Kreis mit
dessen Mittelpunkt in einem typischen Punkt (x, y) des
€Radius r liegen,
€
€
€
Punktprozessesliegt,geteiltdurchdieIntensitätλdesPunktprozesses:
€
€
E ( Anzahl der anderen Punkte von X mit der Distanz ≤ r X Punkt bei (x, y))
K(r) =
λ
Hierbei bezeichnet das Symbol „|“ „unter der Bedingung, dass“. Der Begriff eines
€
typischenPunktesdesPunktprozessesbedeutet,dasseinPunktausallenPunktendes
Prozesses mit gleichförmiger Wahrscheinlichkeit ausgewählt wird. Er ist gegen den
Begriff eines zufälligen Punktes der xy− Ebene abzugrenzen, wobei alle Punkte (nicht
nurdiejenigendesPunktprozesses)betrachtetwerden.BeiderBerechnungvon K(r)
wirddertypischePunktselbst,d.h.derMittelpunktdesKreises,vondemausdieZahl
€
derPunktgezähltwird,selbstnichtmitgezählt.AusdiesemGrundsprichtmaninder
€
Definition K(r) vonderAnzahl„andererPunkte“.
Eine erste Anwendung der K− Funktion besteht darin, zu überprüfen, ob ein
€
beobachtetes
Punktmuster überhaupt Interaktionseffekte aufweist. Liegt keinerlei
Interaktion zwischen€
den Punkten in der Ebene vor, so sind die Punkte isotrop und
homogen in der Ebene verteilt, was auch als vollständige räumliche Zufälligkeit der
Punkte in der Ebene bezeichnen wird (CSR: complete spatial randomness). Diese
VerteilungentsprichteinemstationärenPoissonprozessderPunkteinderEbene.Man
34
2.MaterialundMethodik
kannzeigen,dassunterdieserBedingungeinKreismitRadius r umeinentypischen
2
Punkt des Prozesses im Mittel λπr Punkte enthält, nämlich das Produkt der
Kreisfläche und der Intensität. Dividiert man diesen €
Wert durch λ, erhält man die
besonderseinfache K− FunktionfürdenstationärenPoissonprozessinderEbene:
€
K Poi (r) = πr 2 €
Die grafische Auswertung wird dadurch vereinfacht, dass man sie durch
€
Transformationindie L− Funktionüberführt:
L(r) =
K(r)
π €
FürvollständigeräumlicheZufälligkeit(CSR)ergibtsich:
€
L(r) = r unabhängigvonderIntensität.
€
EineBetrachtungderVerläufevon K(r) und L(r) isthilfreich,wennesdarumgeht,die
AbweichungdesPunktprozessesvoneinemPoissonprozessnäherzucharakterisieren.
Ein anfängliches Kurvensegment mit K(r) = 0 und L(r) = 0 zeigt, dass die Abstände
€
€
zwischendenPunkteneinenbestimmtenMinimalwertnichtunterschreiten.Diesesist
fürbiologischesMaterialsehrplausibel.BiologischeZellen,Gefäße,Zellkerneusw.sind
€
€
körperliche Gebilde mit endlicher Ausdehnung, die sich im Allgemeinen nicht
gegenseitigüberlappenkönnen.Daheristklar,dassz.B.MittelpunktevonZellenoder
ZellkerneneinenminimalenAbstandnichtunterschreitenkönnen.EinsolcherAbstand
wirdinderPunktprozessstatistikalshard-core-Distanzbezeichnet.Derniedrigste r −
Wert, für den die K− Funktion oder L− Funktion eines empirischen Punktmusters
einen positiven Wert erreicht, kann als Schätzwert der hard-core-Distanz
benutzt
€
werden. €
€
Eine weitere wichtige Funktion der Statistik planarer Punktprozesse ist die
Paarkorrelationsfunktion g(r) . Sie kann durch Differenzierung der K− Funktion
erhaltenwerden:
g(r) =
€
1 dK(r) €
2πr dr
€
35
2.MaterialundMethodik
Darüber hinaus kann sie als Produktdichte des Punktprozesses definiert werden,
dividiertdurchdasQuadratderIntensität,waszumselbenResultatführt(Stoyanetal.
1994;Chiuetal.2013).FüreinenstationärenplanarenPoissonprozessergibtsich
g(r) = 1
füralleWertevon r .WertederPaarkorrelationsfunktionunter1zeigenAbstoßungan,
€
Wertevon g(r) über1weisenaufClusterunghin.Einhard-core-Effektführtzueinem
initialen €
Kurvensegment der Paarkorrelationsfunktion, wo g(r) = 0 gilt. Für hohe
Werte von r ergibt sich eine asymptotische Annäherung gegen 1, weil hier keine
€
räumliche Interaktion mehr besteht. Berge und Täler der g− Funktion über 1 bzw.
€
unter
€ 1 zeigen Bereiche mit Tendenz zur Clusterung und zur Abstoßung. Dieses
VerhaltenkannmitHilfeder g− Funktionoftübersichtlicherdargestelltwerdenalsmit
€
K(r) odermit L(r) DieBerechnungderFunktionen
K(r) , L(r) und g(r) führtbereitszueinererheblichen
€
€
€
Vereinfachung
der Daten, da ein komplexes Punktmuster jeweils auf eine einzige
Funktionreduziertwird.Trotzdemisteswünschenswert,dieInformationsmengenoch
€
€
€
weiter zu reduzieren. Dies ist für den Fall der g− Funktion planarer Punktprozesse
möglich, da sich hier Kurvenverläufe ergeben, bei denen die Koordinaten
charakteristischer Punkte festgestellt werden können (Stoyan et al. 1990). Es ist
€
nämlichmöglich,beiempirischgeschätzten g− FunktionendasersteMaximummitden
Koordinaten (rmax ,gmax ) und das erste Minimum mit den Koordinaten (rmin ,gmin ) zu
identifizieren.Ausdiesen4WertenkönnenjetztweitereStatistikenberechnetwerden,
€
die immer noch explorativ und modellunabhängig bleiben. Von Stoyan und Schnabel
€
€
wurdedieStatistikvorgeschlagen(Stoyanetal.1990;Stoyanetal.1994;Mattfeldtet
al.2006):
M=
gmax − gmin
rmin − rmax
Die Statistik M charakterisiert global den Grad der Ordnung eines räumlichen
€
Punktmusters. Hohe Werte von M deuten auf einen hohen Ordnungsgrad des
Punktmustershin.NocheinfacheristdieDifferenz:
€
€
Δg = gmax − gmin dieinähnlicherWeiseinterpretiertwerdenkann.DiesebeidenStatistikenerlaubenes,
€ eines Punktmusters durch eine einzige Quantität zu
die gegebene g− Funktion
36
€
2.MaterialundMethodik
charakterisieren, wodurch die Dimensionalität des Datensatzes sehr stark reduziert
wird.
EsexistiertüberdieStatistikplanarerPunktprozessesehrumfangreichemethodische
Literatur (Chiu et al. 2013; Illian et al. 2008). Jedoch gibt es nur vereinzelte
Anwendungen der Methoden der planaren Punktprozessstatistik im Bereich der
Histopathologie. Auf jeden Fall liegen bislang noch keine Untersuchungen vor, bei
denen Methoden der Statistik planarer Punktprozesse auf Punktmuster bei
Prostatakarzinomenangewandtwurden.InVorarbeitenwurdediehierfürnotwendige
MethodikinZusammenarbeitmitdemInstitutfürStochastikderUniversitätUlmund
derAbteilungfürPathologieetabliert(Mattfeldtetal.2006;Mattfeldtetal.2007).Bei
diesen Vorarbeiten wurden die Punktmuster von Kapillaren im Prostatakarzinom an
immunhistochemisch
gefärbten
Präparaten
ausgewertet.
Die
vorliegende
Untersuchung stellt nach unserem Wissen die erste Studie an Tumorzellkernen beim
ProstatakarzinommitHilfederStatistikplanarerPunktprozessedar.
2.6 PARAMETRISCHE MODELLIERUNG DES PUNKTPROZESSES DER TUMORZELLEN IM
SCHNITT
Im vorigen Abschnitt haben wir Methoden beschrieben, mit denen eine explorative
Analyse zweidimensionaler Punktmuster durchgeführt werden kann. In diesen
Abschnitten geht es um die parametrische Modellierung solcher Datensätze. Bei der
parametrischen Modellierung geht es darum, ein realistisches Punktprozessmodell
auszuwählenunddurchgeeigneteParametrisierungandieDatenanzupassen.
In erster Instanz erscheint es plausibel, einen stationären zweidimensionalen
Poissonprozess als stochastisches Modell zu wählen. Jedoch zeigen die Daten sofort,
dassdiesesModellfürunserePunktmusternichtzutrifft:dieexplorativeDatenanalyse
zeigteineklareHardcore-Eigenschaft,diedaraufberuht,dassdieKerneeineendliche
Ausdehnunghabenundnichtüberlappenkönnen.EinPoissonprozesshatkeinesolche
hard-core Distanz und nur einen einzigen Modellparameter, die Intensität, und ist
deswegensehrwenigflexibel.DieseÜberlegungenführendazu,zurModellierungeine
flexiblere Klasse von Punktprozessen einzusetzen, die Gibbs-Prozesse (MarkovProzesse). Gibbs-Prozesse sind Modelle für Punktprozesse mit wechselseitiger
Interaktion der Punkte. Unter dem Begriff Gibbs-Prozesse wird eine Vielzahl von
37
2.MaterialundMethodik
Modellen zusammengefasst, aber nur solche Punktprozessmodelle kommen bei
unserer Untersuchung in Betracht, bei denen auch eine hard-core-Eigenschaft
implementiert ist. Aus diesem Grund entschieden wir uns, den stationären Strauss
hard-coreProzessalsKandidatenmodellzubenutzen(vanLieshout2002;Diggle2003;
Moller et al. 2003; Baddeley et al. 2005; Baddeley et al. 2006; Mattfeldt et al. 2007;
Illian et al. 2008). Dieser Prozess erlaubt eine hard-core Eigenschaft. Für längere
DistanzensindsowohlAbstoßungalsauchClusterbildungmöglich,jenachdem,wiedie
Modellparameter gewählt werden. Trotz dieser vielfältigen Anpassungsmöglichkeiten
bleibenaberdieErgebnisseüberschaubar,derProzesswirddurchnurvierParameter
charakterisiert,unddiesevierParameterhabeneineanschaulicheBedeutung.
Ein Strauss hard-core Prozess ist vollständig durch seine vier Modellparameter
definiert: r0 , R ,λundγ.Dabeiist r0 diehard-coreDistanz, R istderInteraktionsradius,
λ ist die Intensität und γ ist die Stärke der Interaktion (der Interaktionsparameter).
Eine€Interaktion der Punkte ist nur für Abstände
€ r zwischen r0 und R möglich. Für
€
€
denFallγ>1liegteinAnziehungseffektvor,istγ<1,deutetdiesaufAbstoßung,fürden
Fallγ=1liegteinklassischerhard-coreProzessohneInteraktionvor.InjedemFallliegt
€
€
€
fürPunktdistanzen r > R keineInteraktionmehrvor.
Zur praktischen Durchführung der Modellierung benutzten wir das Software Paket
€ R 2.2.0 unter Linux. Dasselbe Software Paket wurde auch für die
spatstat mit
explorative Datenanalyse benutzt. Die Mittelpunktkoordinaten der Schnittprofile der
Tumorzellkernealler160BilderwurdenindenComputereingelesen.DieAnpassung
der vier Modellparameter erfolgte individuell für jedes einzelne Bild. Das spatstat
Paket erlaubt prinzipiell die Modellierung eines gegebenen planaren Punktmusters,
sowohl in der Anwesenheit von Trend (nichtstationärer Fall) als auch für den
stationärenFall:wieobenerwähnt,sindwirvonderModellannahmeeinesstationären
Strauss hard-core Prozesses ausgegangen. Die hard-core Distanz r0 wurde für jedes
Gesichtsfeld als Minimalwert der beobachteten Distanzen zwischen den Punkten
einzeln bestimmt. Der Interaktionsradius R wurde nach der Profile pseudolikelihood
€
Methodebestimmt(Baddeleyetal.2000;Baddeleyetal.2005;Baddeleyetal.2006).
Durch dieses Verfahren wurde für
€ jedes Bild der Wert von R ermittelt, bei dem die
pseudolikelihoodmaximiertwurde.HierbeiwurdediepseudolikelihoodfüralleWerte
von R zwischen 20 und 100 Pixeln in Schritten€von einem Pixel berechnet. Die
Randkorrektur erfolgte durch Translation. Abschließend erfolgte dann auf der Basis
€
38
2.MaterialundMethodik
der Parameter r0 , R und λ die Modellanpassung durch die ppm-Prozedur innerhalb
vonspatstat,welchedenInteraktonsparameterγlieferte.
€
€
2.7ORDINALELOGISTISCHE
REGRESSIONSANALYSE
Die logistische Regressionsanalyse stellt eine Methode dar, mit welcher man die
Beziehung unabhängiger Variablen zu einer abhängigen Variable f (z) beschreibt,
wobei die abhängige Variabe als Funktion der logarithmisch transformierten
unabhängigen Variablen betrachtet wird (logistisches Regressionsmodell) (Lee 1992;
€
Anathetal.1997;Benderetal.1997;Kleinbaumetal.2010).IndieserArbeitwardie
abhängigeVariablederGleason-ScoremitseinenmöglichenWertenvonzweibiszehn,
inunserenDatenkamennurWertevon2bis9vor.Diesbedeutet,dassderGleasonScore in dieser Arbeit acht Werte annahm. Die binäre logistische Regressionsanalyse
wird unter der Voraussetzung dass die abhängige Variable nur zwei Werte (0,1 oder
true und false) annehmen kann, angewendet. In unserem Fall ist die abhängige
Variable aber der Gleason-Score, welcher 9 verschiedene Ordinalwerte annehmen
kann, vom geringsten Gleason Score 2 bis zum höchsten Gleason Score 10. Daher
mussteeineordinalelogistischeRegressionsanalysedurchgeführtwerden.(Lee1992;
Anathetal.1997;Benderetal.1997).
39
2.MaterialundMethodik
AlsunabhängigeVariablenbetrachtenwir:
AA (epi) :
Mittelwert der Fläche der epithelialen Zellphase pro Einheit
Referenzfläche(Flächenanteil)
€
€
€
AA (lumen) :
Mittelwert der Fläche der Lumina pro Einheit Referenzfläche
(Flächenanteil)
AA (stroma) :
Mittelwert der Fläche des Stromas pro Einheit Referenzfläche
(Flächenanteil)
BA (epi) [ mm /mm 2 ] :
Mittelwert des Umfangs der epithelialen Zellphase pro
EinheitReferenzfläche(Längendichte)
€
BA (lumen) [ mm /mm 2 ] :
Mittelwert des Umfangs der Lumina pro Einheit
Referenzfläche(Längendichte)
€
BA (stroma) [ mm /mm 2 ] :
Mittelwert des Umfangs des Stromas pro Einheit
Referenzfläche(Längendichte)
€
χA (epi) [mm −2 ] :
Mittelwert der Eulerzahl der epithelialen Zellphase pro Einheit
Referenzfläche
€
χA (lumen) [mm −2 ] : MittelwertderEulerzahlderLuminaproEinheitReferenzfläche
χA (stroma) [ mm −2 ] : MittelwertderEulerzahldesStromasproEinheitReferenzfläche
€
€
DieBeziehungzwischenderabhängigenundderunabhängigenVariablenwerdennach
demPrinzipderMaximum-likelihood-ausdenDatengeschätzt.(Kleinbaum1994)
In dieser Arbeit benutzten wir dazu das Verfahren der ordinalen logistischen
Regression, wie sie in dem statistischen Softwarepaket von SAS/STAT (proc logistic),
mit einer schrittweisen Zuordnung (option stepwise) ausgeführt wird. In diesem Fall
werdendieunabhängigenVariablenindieBewertungeinbezogenundwiederineiner
Weise eliminiert, dass jeder vorangehende Auswahlschritt von einem oder mehreren
rückwärtigen Aussonderungen begleitet wird. Dieser schrittweise Auswahlprozess
endet, wenn keine weitere Variable mehr hinzugefügt werden kann da dadurch die
voreingestellteSignifikanzvon0,05nichtmehrgegebenwäre.Vereinfachtbetrachtet,
kann man dadurch prädiktive Faktoren entdecken. Alle anderen Variablen werden
eliminiertundnurdieprädiktivsignifikantenVariablenwerdenbeibehalten.
40
2.MaterialundMethodik
2.8 PRÄDIKTIONDESGLEASON-SCORES
Unser Ziel war es, den Gleason-Score für jeden individuellen Fall aus den Daten der
räumlichen Statistik zu prädizieren. Dieser Ansatz kann als ein Beispiel von
statistischem Lernen unter der Aufsicht von Lernregeln aufgefasst werden. Der
Computer lernt aus voreingestuften Fällen, bei denen die input Variablen und die
output Variable (in unserem Fall der Gleason-Score) schon bekannt sind.
Kombinationen aus Variablen der räumlichen Statistik, welche die besten linearen
RegressionsmodellefürfixeZahlenderinputVariablenvon1bis9zeigten,wurdenals
input Daten verwendet. Alle input Variablen wurden auf das Intervall [0,1] normiert
(Troyanskaya et al. 2001; Mattfeldt et al. 2003). Der Gleason-Score ist die output
Variable, das heißt, eine ganze Zahl aus dem Intervall [2,10] . Daher befassen wir uns
€
mitdemProblemder„multiclasspatternrecognition“.
In der Praxis wurde das statistische Lernen€
in einer deterministischen Form durch
multivariatelineareRegressionderjeweilsbesten1-9unabhängigenVariablenaufden
Gleason-Score erreicht. Die Werte der unabhängigen Variablen wurden in die
angepasste Regressionsgleichung eingefügt. Dies ergab zur ersten Annäherung einen
SchätzwertdesGleason-ScoresalsDezimalzahl.DanachwurdederausderDezimalzahl
zurnächstenganzenZahlgerundeteWertalsSchätzerdesGleason-Scoresgenommen.
41
2.MaterialundMethodik
2.9VALIDIERUNGDERPRÄDIKTIONMITTELSLEAVE-ONE-OUTMETHODE
Die Genauigkeit der Prädiktion der output Werten aus den input Werten in der
Testphase, wurde mittels der Leave-one-out Methode untersucht. Dieses Konzept
bedeutet, dass der gesamte Satz von n− Fällen in eine Untergruppe von ( n − k ) Fällen
(dieTrainingsfälle)unddieübrigenFälleineineUntergruppevon k− Fällen,eingeteilt
werden.InderTrainingsphase„lernt“dasNetzwerk,dieoutputVariableausdenInput
€
€
VariablenderTrainingsfällezuprädizieren.InderdarauffolgendenTestphasewirddie
€
output Variable der Testfälle aus den input Variablen geschätzt, indem die zuvor
erlerntenInformationenausdenTrainingsfällenhinzugezogenwerden.DieseStrategie
simuliert eine Konfrontation des Netzwerks mit einem neuen Fall, wodurch die
FähigkeitzurVerallgemeinerunggetestetwird.BestehteinegroßeAnzahlvonFällen,
istesmöglich,z.B.25-33%derFällealsTestfällezuverwenden.IstdieAnzahlderFälle
relativgering(z.B. n ≈100),wirdempfohlen, k = 1 zuwählen.Diesbedeutet,dieLeaveone-out Methode anzuwenden (synonyme: jackknife, round-robin) (Tourassi et al.
1997; Vapnik 1998). Die Prädiktion wird für jeden Patienten als Testfall mit den
€
€
komplementärenFällenalsTrainingsfällezyklischwiederholt.
42
3.Ergebnisse
3.ERGEBNISSE
3.1TEXTURANALYSEVONZUFÄLLIGENABGESCHLOSSENENMENGEN
3.1.1LINEAREKORRELATIONSANALYSE
Die lineare Korrelationsanalyse zeigte eine hoch signifikante positive Korrelation des
Gleason-ScoresmitdemFlächenanteilderepithelialenZellphase(r=0,4380,p<0,0001).
Weiter zeigte die lineare Korrelationsanalyse eine hoch signifikante negative
Korrelation mit dem Flächenanteil der stromalen Phase (r=-0,4078, p<0,0001). Der
Gleason-Score korrelierte positiv mit der Längendichte der Lumina (r=0,3798,
p<0,0001). Es bestanden keine signifikanten Korrelationen zwischen dem GleasonScoreunddemFlächenanteildesLumens,derLängendichtederepithelialenZellphase
undderLängendichtederstromalenPhase.
EsfandsicheinehochsignifikantenegativeKorrelationzwischendemGleason-Score
und der Eulerzahl der epithelialen Zellphase pro Einheit Referenzfläche (r =-0,5284,
p<0,0001). Weiter fand sich eine signifikante positive Korrelation zwischen dem
Gleason-Score und der mittleren Eulerzahl des Lumens pro Einheit Referenzfläche
(r=0,4390, p<0,0001). Es fand sich keine Korrelation des Gleason-Scores mit der
EulerzahldesStromasproEinheitReferenzfläche.
43
3.Ergebnisse
TabelleNr.5:LineareKorrelationsanalysezwischendenParameternder
TexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengenunddemmanuellbestimmten
Gleason-ScoredesPatientenkollektivs,n=103Fälle.
Parameter
glea
AA (epi) €
**0,43802
AA (lumen) 0,07119
AA (stroma) **-0,40783
0,15264
€
BA (epi) [ mm /mm 2 ] €
BA (lumen) [ mm /mm 2 ] **0,37983
€
BA (stroma) [ mm /mm 2 ] -0,08356
€
χA (epi) [mm −2 ] €
χA (lumen) [mm −2 ] **0,43901
€
χA (stroma) [ mm −2 ] 0,14886
**-0,52840
Signifikanzen:**p<0,0001;KorrelationskoeffizientnachPearson;DieKorrelationenundSignifikanzenwurdenzwischen
MittelwertenfolgenderVariablenberechnet:
glea:Gleason-Score;
Parameter:ParameterderTexturanalysevonzufälligenabgeschlossenenMengen
€
€
AA (epi) :
MittelwertderFlächederepithelialenZellphaseproEinheitReferenzfläche(Flächenanteil) AA (lumen) :
MittelwertderFlächederLuminaproEinheitReferenzfläche(Flächenanteil)
AA (stroma) :
MittelwertderFlächedesStromasproEinheitReferenzfläche(Flächenanteil)
BA (epi) [ mm / mm 2 ] :
MittelwertdesUmfangsderepithelialenZellphaseproEinheitReferenzfläche(Längendichte)
€
BA (lumen) [ mm /mm 2 ] :
MittelwertdesUmfangsderLuminaproEinheitReferenzfläche(Längendichte)
€
BA (stroma) [ mm /mm 2 ] :
MittelwertdesUmfangsdesStromasproEinheitReferenzfläche(Längendichte)
€
χA (epi) [ mm −2 ] : MittelwertderEulerzahlderepithelialenZellphaseproEinheitReferenzfläche
€
χA (lumen) [ mm −2 ] :
MittelwertderEulerzahlderLuminaproEinheitReferenzfläche
€
χA (stroma) [ mm −2 ] :
MittelwertderEulerzahldesStromasproEinheitReferenzfläche
€
€
€
€
44
3.Ergebnisse
3.1.2PRÄDIKTION
In unserer Kreuzvalidierungsstudie wurde der Gleason-Score jedes einzelnen Falles
durch die lineare Regression prädiziert und danach, wie oben schon beschrieben,
durch die Leave-One–Out Methode validiert. Normalerweise wird in Studien, welche
sichmitderVariabilitätdesGleason-ScoreszwischenUntersuchernbeschäftigen,eine
DifferenzvoneinemPunktdesgleichenFallesalsakzeptabelangesehen.Unterdiesem
Kriteriumfandenwir,dass79der103FälleausnureinemParameter(derEulerzahl
der epithelialen Zell Phase) akzeptabel prädiziert wurden. Die höchste
Prädiktionsgenauigkeit wurde erzielt, als die folgenden 7 Variablen in das
Regressionsmodell mit einbezogen wurden: Die Eulerzahl, der Flächenanteil und die
Längendichte der epithelialen Zellphase; die Eulerzahl und die Längendichte des
Lumens; und die Eulerzahl und die Längendichte des Stromas. Bei einer, wie oben
schon beschriebenen suffizienten Genauigkeit von ± 1, wurden bei diesem
Regressionsmodell 84/103 Prädiktionen (81,5%) als akzeptabel angesehen. Mit 8
prädiktivenVariablenverringertesichdieGenauigkeitleichtauf81/103=78,6%.Eine
Prädiktionmitallen9berücksichtigtenVariablenergabeineakzeptableKlassifikation
von82/103=79,6%.Esmussallerdingseingeräumtwerdendassauchfürdasbeste
Modell nur in 32 Fällen (31%) der Gleason-Score mit der manuellen Klassifikation
identisch war. Der Korrelationskoeffizient zwischen dem vom besten Modell
prädizierten Gleason-Score und dem manuell vorklassifizierten Gleason-Score betrug
r=0,6058(p<0,0001).
45
3.Ergebnisse
TabelleNr.6:DeskriptiveStatistik
Gruppe
1(Gleason-Score2-4)
2(Gleason-Score5-7)
3(Gleason-Score810)
Variabeln
Mittelwert
AnzahlderFälle
€
€
€
€
€
€
€
€
SD
Mittelwert
13
SD
Mittelwert
79
SD
11
AA (epi) 0,3452
0,0921
0,4282
0,0756
0,5405
0,1161
AA (lumen) 0,0876
0,0485
0,1132
0,0443
0,0917
0,0638
AA (stroma) 0,5670
0,1130
0,4584
0,0902
0,3676
0,1413
BA (epi) [ mm /mm 2 ] 36,9211
7,9281
48,8251
7,4582
39,9074
10,0248
BA (lumen) [ mm /mm 2 ] 11,439
2,5549
17,4614
4,3937
18,1943
8,4128
BA (stroma) [ mm /mm 2 ] 25,4924
6,4175
31,3801
5,3623
21,7252
11,0343
χA (epi) [mm −2 ] -13,7379
27,5399
-77,8718
61,9519
-186,0369 140,6322
χA (lumen) [mm −2 ] 109,0144 41,1674 167,5646
52,3744
221,7329 117,2564
χA (stroma) [ mm −2 ] -109,4831 42,0575 -128,9811
44,2810
-69,7869
DeskriptiveStatistikunterteiltin3Gruppen:1GleasonScore2-4,2GleasonScore5-7,3GleasonScore8-10
SD:Standardabweichung
€
46
94,8673
3.Ergebnisse
AA ( epi)
€
Abb. 13: Abhängigkeit des Mittelwerts der Flächenanteils der epithelialen Zellphase
vomGleason-Score.DasPatientenkollektivwurdein3Gruppeneingeteilt:1:GleasonScore2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score8-10(n=11).
Abb. 14: Abhängigkeit des Mittelwerts des Umfangs der epithelialen Zellphase pro
EinheitReferenzflächevomGleason-Score.DasPatientenkollektivwurdein3Gruppen
eingeteilt:1:Gleason-Score2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score
8-10(n=11).
47
3.Ergebnisse
Abb. 15: Abhängigkeit des Mittelwerts des Umfangs der Lumina pro Einheit
Referenzfläche vom Gleason-Score. Das Patientenkollektiv wurde in 3 Gruppen
eingeteilt:1:Gleason-Score2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score
8-10(n=11).
Abb. 16: Abhängigkeit des Mittelwerts des Umfangs der stromalen Phase pro Einheit
Referenzfläche vom Gleason-Score. Das Patientenkollektiv wurde in 3 Gruppen
eingeteilt:1:Gleason-Score2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score
8-10(n=11).
48
3.Ergebnisse
Abb. 17: Abhängigkeit des Mittelwerts der Eulerzahl der epithelialen Zellphase pro
EinheitReferenzflächevomGleason-Score.DasPatientenkollektivwurdein3Gruppen
eingeteilt:1:Gleason-Score2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score
8-10(n=11).
Abb. 18: Abhängigkeit des Mittelwerts der Eulerzahl des Lumens pro Einheit
Referenzfläche vom Gleason-Score. Das Patientenkollektiv wurde in 3 Gruppen
eingeteilt:1:Gleason-Score2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score
8-10(n=11).
49
3.Ergebnisse
Abb. 19: Abhängigkeit des Mittelwerts der Eulerzahl des Stromas pro Einheit
Referenzfläche vom Gleason-Score. Das Patientenkollektiv wurde in 3 Gruppen
eingeteilt:1:Gleason-Score2-4(n=11),2:Gleason-Score5-7(n=79),3:Gleason-Score
8-10(n=11).
10
Gleason-Score
9
8
7
6
5
4
3
2
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
101
Falln=103
Gleason-Score
prädizierterGleason-Score
Abb. 20: Beide Gleason-Scores im Vergleich des untersuchten Patientenkollektivs.
FälleansteigendangeordnetvonGleasonScore2bisGleasonScore9.
GleasonScore:ManuellbetimmterGleason-ScoredurchdenPathologenamMikroskop.
Gleason Score prädiziert: Prädizierter Gleason-Score mit Hilfe der multivariaten
linearen Regression aus den Variablen der Texturanalyse von zufälligen
abgeschlossenenMengen.
50
3.Ergebnisse
AnteildesGleason-Scoreszum
Patientenkollektiv
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
23456789
Gleason-Score
n=103
GleasonScore
GleasonScoreprädiziert
Abb.21.VerteilungderGleasonScoresimverwendetenPatientenkollektiv.
DieobigeGraphikzeigtdieVerteilungderprädiziertenGleason-Scoresunddiemanuell
bestimmtenGleason-ScoresimPatientenkollektiv.
GleasonScore:ManuellbetimmterGleason-ScoredurchdenPathologenamMikroskop.
Gleason Score prädiziert: Prädizierter Gleason-Score mit Hilfe der multivariaten
linearen Regression aus den Variablen der Texturanalyse von zufälligen
abgeschlossenenMengen.
51
3.2 ERGEBNISSE DER RÄUMLICHEN STATISTIK
TUMORZELLKERNEIMSCHNITT
3.Ergebnisse
DES
PUNKTPROZESSES
DER
DieAuswertungderPunktmusterderTumorzellkernezeigte,einesignifikantepositive
KorrelationdesGleason-ScoresmitderabsolutenAnzahlderPunkteproBild(r=0,22,
p<0,05)undmitderInteraktionsdistanz R zwischendenPunkten(r=0,26,p<0,05).Es
fanden sich keine signifikanten Korrelationen zwischen dem Gleason-Score und der
g -Funktion rmax
hard-coreDistanz r0 zwischendenPunkten,demerstenMaximumder
€
,demerstenMinimumder g -Funktion gmin undderStatistik M .
€
€
EsfandsicheinenegativeKorrelationzwischendemGleason-ScoreundderStärkeder
€
€
γ )(r=-0,26,p<0,05),demerstenMaximumder
Interaktion(derInteraktionsparameter
€
€
g -Funktion gmax (r=-0,22,p<0,05),demerstenMinimumder g -Funktion rmin (r=-0,26,
p<0,05)undderDifferenzzwischen
gmax und gmin ( Δg )(r=-0,26,p<0,05).
€
€
€ Nr. 7: Lineare Korrelationsanalyse zwischen
€
Tabelle
der räumlichen
€ den Parametern
Statistik des Punktprozesses und des€manuell bestimmten Gleason-Scores des
€
€
Patientenkollektivs,n=80Fälle.
Parameter
glea
pzahl
γ
€
€
€
€
€
€
€
€
€
R
*0,22
*-0,26
*0,26
r0 0,16
rmax 0,19
gmax *-0,22
rmin *-0,26
gmin -0,08
Δg *-0,26
M
0,06
Signifikanzen*:p<0,05;KorrelationskoeffizientnachPearson;DieKorrelationenundSignifikanzenwurdenzwischenMittelwerten
folgenderVariablenberechnet:
glea:GleasonScore;
Parameter:ParameterderräumlichenStatistikdesPunktprozesses
pzahl:AbsoluteAnzahlderPunkteproBild;
γ :StärkederInteraktion(derInteraktionsparameter);
R :InteraktionsdistanzzwischendenPunkten;
€
€
€
€ €
€ €
€ €
€ €
€
€
r0 ;hard-coreDistanzzwischendenPunkten;
rmax : r -WertdeserstenMaximumsder g -Funktion;
gmax : g -WertdeserstenMaximumsder g -Funktion;
rmin : r -WertdeserstenMinimumsder g -Funktion;
gmin : g -WertdeserstenMinmumsder g -Funktion;
Δg :Differenzzwischen g€
max und gmin :
M :DieStatistik M .
€
€
€
€
€
€
52
4.Diskussion
4.DISKUSSION
4.1VERGLEICHBAREARBEITENZUMGLEASON-SCORE
DerGleason-ScoreisttrotzseinersubjektivenNatureinprognostischsehrwertvoller
Indikator bei Männern mit Prostatakarzinom (Amin et al. 2004). Es bestehen einige
Studien,welchehistologischeBilderderProstataverwendeten,umdieKlassifikation
durchbildanalytischeMethodenzuautomatisieren.
Wetzeletal.errechnetengeometrischeStrukturen,wiedieDelaunayTriangulationen
unddie„spanningtrees“,welchedieeinzelnenZellkernedesTumorgewebesineinem
segmentierten Bild verbinden. Zur Prädiktion wurden bestimmte Eigenschaften
dieser Strukturen, wie die gewogene Länge der Baumstrukturen, verwendet. Sie
untersuchten 500 Bilder von 54 verschiedenen Patienten mit Prostatakarzinomen.
Jedes Bild beinhaltete nur einen Gleason Grad. Zur Klassifikation wurden 5
verschiedene Kategorien verwendet, eine Kategorie für jeden Gleason Grad. In 80%
derFällestimmtedieKlassifikationmitdemGradingdesPathologenüberein(Wetzel
1997;Wetzeletal.1999).
Stotzkaetal.verwendeteneinHybridausneuronalerundstatistischerKlassifikation,
umzwischenmäßigundgeringdifferenziertemProstatakarzinomzuunterscheiden.
Das „Training set“ jeder Klasse beinhaltete 250 Bilder. In dieser Arbeit wurden
strukturelle Eigenschaften (z.B. die Anzahl der Zellkerne, Lumen und lineare
Aggregationen) und Eigenschaften, welche die Textur und Statistik beschreiben,
errechnet(z.B.lokaleVerteilungderDichte,BasisfunktionennachWalshundfraktale
Dimensionen). Diese Funktionen wurden aus binären Bildern berechnet, welche die
Position des Zellkerns zeigten. Es zeigte sich eine 77,3%ige Übereinstimmung des
„Testset“mitderBlickdiagnose(Stotzkaetal.1995).
Eine weitere Forschungsgruppe untersuchte die Eigenschaften der Energie und
Entropie, welche aus multiwavelet Transformationen extrahiert wurden. Durch den
k-nächsten-Nachbarn-Algorithmus wurde jedes der 100 Bilder klassifiziert. Die
Kategorien waren die Grade 2-5. Jedes Bild beinhaltete das Muster eines Grades.
Unter verschiedenen multiwavelet Methoden konnten 97% der Bilder korrekt
klassifiziertwerden(Jafari-Khouzanietal.2003).
53
4.Diskussion
Durch multispektrale Bildbearbeitung konnte die Arbeitsgruppe unter Roula et al.
592 Bilder von 10 radikalen Prostatektomien als Stroma, benigne Prostatahyperplasie, intraepitheliale Neoplasie oder Prostatakarzinom klassifizieren. Diese
Methodegelangin94%derBilder(Roulaetal.2002).
Pitts et al. untersuchten die Grauwertematrix von Schnitten aus radikalen Prostatektomien.
Eine
Texturanalyse
wurde
durchgeführt,
um
benigne
und
Karzinomregionenzuunterscheiden.VielversprechendeErgebnissewurdengeliefert
(Pitts et al. 1993). Veltri et al. konnten durch die Analyse von histologischen
Prostatakarzinombildern zeigen, dass es signifikante Unterschiede zwischen den
Gleason Graden 3, 4 und 5 in der Zellkernstruktur gibt. Sie kamen zu dem Schluss,
dass die Einbeziehung eines quantitativen Zellkerngradings die Genauigkeit der
Prognoseverbessernkann(Veltrietal.2007).
Ein weiterer Versuch, ein objektives Grading zu entwickeln, bestand darin, die
Rundheit der Zellkerne zu bestimmen (Clark et al. 1998) und die Progression des
Prostatakarzinoms mit den üblichen Grading Systemen zu vergleichen (Gleason,
1966;(Brawnetal.1982;Diamondetal.1982;Epsteinetal.1984;Clarketal.1998).
EineweitereGruppeunterHuangetal.verwendetefraktaleDimensionen,umindem
relevanten Bereich des histologischen Bildes die Variation von Textureigenschaften
zu unterscheiden. Jedem Bild wurde ein bestimmter Grad zugeteilt und die Grade
wurden in 4 Klassen eingeteilt. Es wurden 205 Bilder verwendet. Eine korrekte
Klassifikation wurde durch die Leave-one-out Methode und die k-fache
Kreuzvalidierung geschätzt und konnte in bis zu 93,7% der Fälle erreicht werden
(Huangetal.2009).
Tabesh et al. stellten ein 2-Stufensystem für das Gleason-Grading und die
Prostatakarzimondiagnosevor.DieFarbe,morphologischeEigenschaftenundTextur
wurdenaushistologischenBildernmitihremSystemextrahiert.Danachwurdendie
Bilder in Tumor und Nicht-Tumor eingeteilt. Während das System zwischen hohen
und niedrigen Graden in 81% unterscheiden konnte, konnte es nicht zwischen
GleasonGrad2und3bzw.Grad4und5unterscheiden(Tabeshetal.2007).
Wittke et al. verwendeten eine ähnliche Methodik wie die unsere. Sie verwendeten
780Bilderaus78Fällen,diein2Gruppeneingeteiltwurden,einem„trainingset“und
einem„testset“.WeiterwurdenzweiMethoden entwickelt,dieaufCharakteristiken
wiedemFlächenanteil,derRandlängeundderEulerzahlbasierten,umdieKategorien
54
4.Diskussion
Gleason-Score ≥ 7und<7zuunterscheiden.DieÜbereinstimmungmitdervisuellen
KontrollewarfürdiebeidenMethoden87,18%und92,31%fürdas„trainingset“und
66,67% und 64,10% für das „test set“ (Wittke et al. 2007). Ein Unterschied unserer
Arbeit zu dieser Studie besteht darin, dass wir mehr Fälle betrachtet haben, in
unserem Fall sind es 103 zu 78 in der Arbeit von Wittke; dabei beinhaltete unsere
Arbeit auch T1 Fälle, welche von Wittke et al. nicht berücksichtigt wurden. Ein
weiterer Unterschied war, dass wir zwei in ihrem Ansatz sehr unterschiedliche
Methoden verwendeten und sie miteinander verglichen. Die eine war die Methodik
der Punktprozess-Statistik, die andere, ähnlich der Wittke-Arbeit, die Statistik
zufälliger abgeschlossener Mengen. Ferner ist zu sagen, dass wir den einzelnen
Gleason-Score prädiziert haben, und so nicht nur 2 Zustände unterschieden haben,
wie in Wittkes Arbeit. Diese Vorgehensweise ist klinisch eher relevant und für den
Alltag nützlicher. Die Methode, die Bilder in 8 Klassen oder Scores einzuteilen,
unterschiedsichdamitvonderobigenArbeit,inderbinärklassifiziertwurde.
Die Texturanalyse von zufällig abgeschlossenen Mengen mittels der Geostoch-
Software wurde zuvor schon bei histologischen Fragestellungen beim
Mammakarzinomverwendet.InderDiplomarbeitvonDanielMeschenmoser,Institut
für Stochastik an der Universität Ulm, wurden die Minkowski-Funktionale für
normalesMammagewebeundfürMammakarzinomgewebeberechnet.Eszeigtensich
signifikante Unterschiede zwischen dem normalen und dem karzinomatösem
Gewebe,z.B.indemMittelwertdesFlächenanteilsdesEpithelsundindemMittelwert
der Eulerzahl des Epithels pro Einheit Referenzfläche (Mattfeldt et al. 2007)
(Mattfeldt et al. 2013). So konnte anhand von Minkowski-Funktionalen zwischen
karzinomatösemundgesundemGewebeunterschiedenwerden.
4.2ÄNDERUNGENDESGEWEBESIN3DMITANSTEIGENDEMGLEASONSCORE
VieleStudienhabengezeigt,dassderGleason-ScoreeinhochrelevanterIndikatorfür
den Grad der Malignität eines Prostatakarzinoms ist. Der Gleason-Score wird
normalerweise, entsprechend dem histologischen Schnitt, als Indikator für
mikroskopischeVeränderungeninderEbene(implanarenBild)betrachtet.Eswird
selten berücksichtigt, dass das Bild ein 2D Artefakt ist, welches durch histologische
Schnittdarstellungen entstand, und das Gewebe an sich eine 3D Struktur ist. Daher
werden die Änderungen im 3D Karzinomgewebe während der Progression von
55
4.Diskussion
niedrigeren zu höheren Graden wenig verstanden. Quantitative stereologische
Methoden können durch das Sammeln objektiver Daten aus Schnittbildern, welche
mit mathematischen Methoden auf den dreidimensionalen Raum extrapoliert
werden,zudiesemVerständnisbeitragen.SpezifischeintrinsischeVolumina,welche
stereologisch auf 3D Modellparameter extrapoliert werden, sind ein Denkansatz in
dieseRichtung.Hierzudienenkonkretdie3inAbschnitt2.2.erwähntenGleichungen
der klassischen Stereologie für die Schätzung der Volumenfraktion, der
Oberflächendichte und der Krümmungsdichte aus dem Flächenanteil, der
LängendichteunddermittlerenEulerzahlproEinheitReferenzfläche.(Mattfeldtetal.
2013)
Betrachten wir zunächst die elementaren stereologischen Parameter: die
Volumenfraktion und die Oberflächendichte. Die Volumenfraktion der epithelialen
ZellphasestiegmithöheremGleasonScore.DieVolumenfraktionderluminalenPhase
blieb mit höherem Gleason Score fast konstant. Das bedeutet, dass bei höheren
GleasonScoreseinhöhererAnteildesGewebesvonTumorzellenbefallenistalsbei
niedrigeren Gleason Scores, was mit einer relativen Verminderung des Stroma
einhergeht.Dasistplausibel,wennmanbedenkt,dassgroßeepithelialeFlächenbei
hohenGleasonScoresfreivonStromasind.
Die Oberflächendichte der epithelialen Zellphase zeigte ein etwas komplexeres
Verhalten, für das eine lineare Korrelation zum Gleason-Score nicht aufgezeigt
werdenkonnte. Diesistdadurch zuerklären,dassder Wert nichtmonotonansteigt
oderabfällt,sondernzunächstansteigtunddannbeihöherenGleasonScoreswieder
abfällt(Abb.14).BetrachtetmandenAnstiegderOberflächendichtevonniedrigenzu
mittleren Gleason Scores, so ist dies noch durch einen Anstieg der Volumenfraktion
derepithelialenZellphasezuerklären(Abb.19).JedochistdiesbeimÜbergangvon
mittlerenScoreszuhöherenScoresnichtderFall,wobeiman,trotzeinesAnstiegsder
Volumenfraktion der epithelialen Zellphase, einen signifikanten Abfall der
Oberflächendichte der epithelialen Zellphase beobachten kann (Abb. 14, Abb. 19).
Wenn die Oberflächendichte einer Phase sich verringert und die Volumenfraktion
sich nicht ändert oder sogar noch zunimmt, dann weist dies auf grundlegende
geometrische Änderungen dieser Phase hin. Aus den Daten folgt nämlich, dass sich
die Oberflächen–Volumen-Relation SVrel = SV / VV ( SV Relation) der Phase verringert.
FürdieseQuantitätgiltnundiestereologischeGleichung L 3 = 4 / SVrel ,dabeiist L3 die
mittlere Länge der Schnittsehnen durch€die „Partikel“ (strukturelle Einheiten) der
56
€
4.Diskussion
Phase in 3D (Underwood 1970). Der Größenparameter L3 ist dabei komplett von
Formannahmenunabhängig(Underwood1970).Darausfolgt,dassdieindividuellen
epithelialen Partikel mit zunehmendem Gleason-Score größer werden. Bei
€
cribriformen oder soliden Aggregaten von Tumorzellen, also hohem Gleason Grad,
liegendemnachsehrgroßeEpithelblöckevor,wasplausibelerscheint.
Des weiteren hat die Volumenfraktion die Eigenschaft, dass sie unabhängig vom
Vergrößerungsgrad des histologischen Bildes ist. Dies ist nützlich, wenn Bilder
ausgewertet werden sollen, bei denen die Vergrößerung nicht bekannt ist. Wie z.B.
die immer populärer werdenden Bilder aus dem Internet, die aus Übungszwecken,
Lernzwecken oder aus anderen Gründen im Netz veröffentlicht wurden. So wird
empfohlen, das Gleason-Grading an histologischen Bildern von vorklassifizierten
Fällen zu erlernen, welche z.B. in Büchern (Amin et al. 2004) oder im Internet
(http://217.8.156.155/norcyt/prostata/PROST.htm)veröffentlichtstehen.
Einer der wichtigsten Befunde dieser Studie war die relativ starke negative
Korrelation (r=-0,5284, p<0,0001) zwischen der Krümmungsdichte der epithelialen
Zellphase und dem Gleason Score. Dieses Maß erfasst die komplexe Oberfläche der
epithelialen Zellphase, welche im Wesentlichen aus zwei getrennten Bereichen
besteht:eineräußerenKomponente,welchesichinRichtungdesStromasanordnet,
und einer inneren Komponente, welche sich in Richtung des Lumens anordnet. Die
Krümmungsdichte MV ist dabei das Integral der mittleren Krümmung pro
Volumeneinheit,dahererfasst MV beideKomponenten.Esistdabeizubeachten,dass
die Krümmungsdichte der äußeren Schicht der epithelialen Zellphase identisch mit
€
der Krümmungsdichte der totalen epithelialen Phase ist, wogegen die
€
Krümmungsdichte der inneren Schicht der epithelialen Zellphase gleich dem
negativenWertderKrümmungsdichtederluminalenPhaseist.DieseRelationwird
am besten in 2D verstanden: die Eulerzahl der epithelialen Zellphase pro
Flächeneinheit ist die Anzahl der epithelialen Blöcke minus der Anzahl der Lumina
proFlächeneinheit.(DieberechnetenWertezeigendiesnurungefähr,daessichbei
den berechneten Werten nur um Schätzwerte handelt und nicht um wahre
Modellparameter.) Zusammenfassend ist die starke negative Korrelation der
EulerzahlderepithelialenZellphasezumGleasonScoresowohlaufeineAbnahmeder
Anzahl der epithelialen Zellkomplexe pro Einheit Referenzfläche als auch auf die
ansteigende Anzahl an konkaven Formationen auf der luminalen Oberfläche
zurückzuführen.
57
4.Diskussion
ObwohleinehochnegativsignifikanteKorrelationzwischendemGleasonScoreund
der Krümmungsdichte der epithelialen Zellphase gefunden wurde (r=-0,5284), war
derabsoluteWertdesKorrelationskoeffizientendeutlichunterdemMaximalwert1.
Viele Gründe können für dieses Ergebnis diskutiert werden. Zum einen muss ein
StichprobenfehlerinBetrachtgezogenwerden.FürdasstatistischeLernenwurden510 visuelle Felder ausgesucht, während die Entscheidung über den Gleason Score
durch den Pathologen sich auf den ganzen Schnitt bezieht. Zum anderen sollte man
die zwangsweise subjektive Natur des Gleason Gradings in Betracht ziehen. Ein
weitererAspektwirdeinemsichtbar,wennmandieschematischenZeichnungendes
Gleason-Scores 1-5 betrachtet, welches von D.F. Gleason mit Tusche per Hand
gezeichnetwurde(vgl.Abb.4).
Wie man in der Abbildung erkennen kann, dominiert die tubuläre Textur die
ArchitekturdeserstenGrades.FürdieGrade2-4giltdann:JehöherderGrad,desto
höher wird der Anteil an cribriformen Strukturen. Mit dem Anstieg des Gleason
Gradesauf5steigtdannderAnteildersolidenStrukturen,diessindunstrukturierte
epithelialeBlocksohneLumen.DerGleasonGrad5bestehtauscribriformenundvor
allem aus soliden Anteilen. Eine solide Architektur ergibt idealerweise χ > 0, eine
tubuläre Architektur im Idealfall χ = 0 und eine cribriforme Architektur ergibt im
Idealfall χ < 0 (Abb. 10-12). Dies bedeutet, dass die Eulerzahl bis zum Grad 4
negativer wird, um ab Grad 5 wieder etwas anzusteigen. Auch unter idealen
Bedingungen, auch wenn Stichprobenfehler und subjektive Fehler auf ein Minimum
reduziert werden, kann es daher keine perfekte lineare Korrelation zwischen der
Eulerzahl der epithelialen Zellphase und dem Gleason Score geben, sobald Grad 5
Muster
auftreten.
Glücklicherweise
ist
dieser
Effekt
in
der
Praxis
höchstwahrscheinlichnichtsehrrelevant.EinGrad5Musterkommtnormalerweise
nurindenGleasonScores9oder10vor.LiegtderGleasonScorebei9,sobedeutet
dies, dass Grade 4 und 5 dominieren. Daher ist beim Score 9 eine cribriforme
KomponentedurchdasGrad4Musterzuerwarten.SogarbeimGleason-Score10,d.h
bei Arealen ausschließlich vom Gleason-Grad 5, geht der cribriforme Anteil meist
nicht komplett verloren, wie es das Originalbild von Gleason zeigt (Abb. 20).
Außerdem sind Fälle mit dem Gleason Score ≥ 9 insgesamt selten. In unserem
Kollektivgabesnur4FällemitdemGleasonScore9undkeinenFallmitdemGleason
Score 10. Diese Daten stimmen gut mit größeren Serien von Prostatakarzinomen
€
überein, bei denen nur 2,8% und 0,05% der Fälle die Gleason Scores 9 und 10
gefunden wurden (Amin et al. 2004). Diese Fakten zeigen, dass die negative
58
4.Diskussion
Korrelation des Gleason Scores mit der Eulerzahl der epithelialen Zellphase pro
FlächeneinheitmitguterNäherungfürandasganzeSpektrumderFällegilt.
Cribriforme Texturen können in vielen verschiedenen Adenokarzinomen auftreten.
EinecribriformeTexturkannz.B.manchmalimMammakarzinomgefundenwerden.
InderPraxisistdasAuffindendieserTexturkomponentegeradeimProstatakarzinom
besonders wichtig, weil bekannt ist, dass dieses Merkmal mit einer schlechteren
Prognose,imVergleichzueinertubulärenDifferenzierung,einhergeht(sieheAbb.4,
10,11,12).
4.3MUSTERERKENNUNGUNDPRÄDIKTION
EinHauptergebnisdieserStudiewar,dassin84der103Fälle(81,5%)derGleasonScore des Prostatakarzinoms erfolgreich aus 7 verschiedenen Texturvariablen
prädiziert werden konnte. Das Kriterium für eine erfolgreiche Prädiktion war, dass
die automatisch prädizierten Fälle und die menschliche Klassifikation sich um nicht
mehr als um einen Gleason Grad voneinander unterschieden. Es wurde auch
kontrolliert, ob die Fälle systematisch übergradet oder untergradet wurden.
Übergradetwurden9Fälle,untergradetwurden10der19Fälle.Wirkommenzuder
Erkenntnis,dassdiestatistischeLernmethodezukeinemsystematischenÜbergraden
oderUntergradenführt.
59
4.Diskussion
Die Überanpassung ist ein bekanntes Problem in „pattern recognition“ Studien. Sie
kann auftreten, wenn zu viele Inputvariablen verwendet werden. Diese machen das
Modellzukomplex.IndiesemFallkönnenoftguteResultatebeiderTrainingsphase
erzieltwerden,dochistdasSystemnichtinderLage,aufneueFällezugeneralisieren.
Eine geringfügige Verschlechterung der Prädiktion im Sinne einer Überanpassung
konnte z.B. beobachtet werden, als die Anzahl der Inputvariablen von 1 auf 2
Variabeln,undvon7auf8Variablenerhöhtwurde.DieGenauigkeitsankleicht,trotz
dergrößerenAnzahlanInformationen.
Im weiteren sei darauf hingewiesen, dass die Art der Kreuzvalidierung, die Leaveone-out
Methode,
welche
wir
verwendeten,
besonders
geeignet
für
histopathologische Fragestellungen zu sein scheint. Sie simuliert im Rechner die
Situation, dass ein Beobachter seine Erfahrung durch eine gewisse Anzahl an Fällen
erlangt und weiter auf der Basis dieses Lernprozesses mit einem neuen Fall
konfrontiert wird, den er klassifizieren soll. Diese Art von Lernen ist der
histopathologischen Diagnostik analog, in welcher der Pathologe sein Wissen aus
vielengleichenFällenaufeinenneuenFallübertragenmuss.Sowirdz.B.empfohlen,
dasGleasonGradinganvorklassifiziertenBildernzuerlernen,welcheinBüchernund
inzwischen auch im Internet zur Verfügung stehen (Amin et al. 2004)
(http://217.8.156.155/norcyt/prostata/PROST.htm). Ein weiterer Aspekt, welcher
EinflussaufdieErgebnissehat,istdiesubjektiveErfassungdesGleasonScores.Hätte
ein anderer Pathologe die Präparate untersucht, hätten die Ergebnisse aus
Erfahrungen
der
Interobserverstudien
unterschiedlich
sein
können.
Ein
interessanterAspektkönnteindiesemZusammenhangdieUntersuchungvonBildern
aus verschiedenen Onlinekursen mittels räumlicher Statistik sein. In diesen Kursen
wurdendiehistologischenSchnittevonExpertenteamsmehrfachbeurteilt.Dabeiist
allerdings zu bedenken, dass bei Onlinekursen der Vergrößerungsgrad der
histologischenBildermeistensnichtbekanntist.Daherwäreesnötig,fürdieseeine
Methoden zu entwickeln, unabhängig vom Vergrößerungsfaktor, um histologische
Bilder unterschiedlicher Vergrößerungen miteinander vergleichen zu lassen. Dafür
kommenaufjedenFallohneweitereModifikationdieFlächenanteileder3Phasenin
Betracht, wogegen für die Schätzung von Längendichte und Eulerzahl pro Einheit
ReferenzflächederVergrößerungsfaktorbekanntseinmuss.
60
4.Diskussion
4.4POTENZIELLEANWENDUNGINDERPRAXIS
Der Vorteil des Gleason Gradings ist seine praktische Effizienz und seine
AnwendbarkeitinjedemFallohnezusätzlicheKostenoderzusätzlichemtechnischen
Equipment. Der Nachteil, wegen seiner subjektiven Natur, ist, dass seine
Reproduzierbarkeit im Allgemeinen nicht garantiert werden kann. Die Stereologie
hingegenbietetobjektiveundreproduzierbareDaten,dochmusssichdieseTechnik
wegen ihres großen Arbeitsaufwandes auf wissenschaftliche Studien beschränken.
DieinteraktiveSegmentationderBilderzurweiterenstereologischenBerechung,wie
esindieserStudiedurchgeführtwurde,istfürdieRoutinezuaufwendig.ImPrinzip
könnteesinZukunftmöglichseineineobjektiveundquantitativeTexturanalysemit
HilfevonBildanalysenacheinerautomatischenSegmentationwährenddertäglichen
Routine durchzuführen. Heutzutage kann vollautomatisch eine Immunhistochemie
mit einem epithelialen Antikörper durchgeführt werden, um einen starken Kontrast
zwischen der epithelialen Phase und dem übrigen Gewebe zu erreichen. Wenn die
epitheliale Zellphase reproduzierbar segmentiert werden könnte wäre es möglich
den gesamten oben beschriebenen Prozess vollautomatisch durchzuführen. Obwohl
solch eine automatische Texturanalyse mit jedem Karzinom durchzuführen möglich
ist,eignetsichdasProstatakarzinombesonders,dadasGleasonGradingsichnurauf
den Tumoraufbau aus Epithel, Stroma und Lumen, welcher schon bei geringer
Vergrößerungzuerkennenist,beschränkt.DasMalignitätsgradingandererTumoren
(z.B Mammakarzinom) ist komplexer, da andere Faktoren (Häufigkeit der Mitosen,
Eigenschaften der Zellkerne, .....) mit einbezogen werden müssen. Dies erfordert die
Untersuchung bei einer höheren Vergrößerung. Unsere Untersuchung wurde
postoperativ mit Prostatektomieproben durchgeführt, doch kann die Methode
(Grading,Stereologie)auchpräoperativanBiopsiendurchgeführtwerden.
61
4.Diskussion
4.5METHODOLOGISCHEASPEKTE
4.5.1WEITEREMETHODENZURPRÄDIKTION
Die lineare Regression ist sicherlich nicht der einzige Weg, eine „multiclass pattern
recognition“desGleason-ScoresausräumlichenDatendurchzuführen.AlsAlternative
könnte man robuste nichtparametrische Methoden zur Prädiktion verwenden,
welche keine lineare Modellannahme zwischen der Einflussvariablen und der
abhängigenVariablenvoraussetzen.IndiesemZusammenhangerscheinenkünstliche
neuronale Netzwerke als eine gute Alternative, wie zum Beispiel „multilayer
feedforward networks“ mit Rückwärtspropagierung, „learning vector quantization“
(LVQ) oder „ support vector machines“ (SVM). Künstliche neuronale Netzwerke
(kurz: KNN, engl. „artificial neural network“ – ANN) sind Netze aus künstlichen
Neuronen. Sie sind ein Zweig der künstlichen Intelligenz und prinzipieller
Forschungsgegenstand der Neuroinformatik. Der Ursprung der künstlichen
neuronalen Netze liegt, ebenso wie bei den künstlichen Neuronen, in der Biologie.
Man stellt sie den natürlichen neuronalen Netzen gegenüber, welche
Nervenzellvernetzungen im Gehirn und im Rückenmark bilden. Insgesamt geht es
aber vorrangig um Paradigmen zur Informationsverarbeitung und weniger um das
Nachbilden biologischer neuronaler Netze (Kohonen et al. 1996; Burges 1998;
Saundersetal.1998).DerartigeneuronaleParadigmenwurdenvonunsererGruppe
verwendet, um mehrere Eigenschaften des Prostatakarzinoms aus Inputdaten zu
prädizieren. (Mattfeldt et al. 1999; Mattfeldt et al. 2001; Mattfeldt et al. 2003) Zum
Beispiel wurde versucht aus einem Satz Inputvariablen zu prädizieren, ob
Prostatakarzinom noch in der Prostata eingeschlossen ist (pT2), oder ob es sich
schonüberdieOrgangrenzenentwickelthat( ≥pT3).(Mattfeldtetal.2001;Mattfeldt
etal.2003)IndiesemFallwareine„binarypatternrecognition“notwendig.Dieswar
auch der Fall, als versucht wurde ein Tumorrezidiv aus primären Tumordaten zu
€
prädizieren.(Mattfeldtetal.1999).InderobengenanntenStudievonWittkeet.al.,
wurde,wiebeschrieben,derGleason-Score<7und≥7prädiziert,eineweiterebinäre
Prädiktion. Soweit uns bekannt, wurde eine „multiclass“ Prädiktion des GleasonScoresaufderBasisvonDatenderräumlichenStatistikbishernochniedurchgeführt.
In unserer Studie hätte man künstliche neuronale Netzwerke zur Prädiktion
verwenden können, um vielleicht bessere Ergebnisse zu erreichen. Es gibt viele
62
4.Diskussion
verschiedene KNN, in unserem Fall wären, wie in der Arbeit von Mattfeldt 2004
(Mattfeldt et al. 2004) verwendet, LVQ (Learning vector quantization) oder SVM
(SupportVectorMachine)möglicheAlternativen.MitLeichtigkeitlassensichdieoben
genannten Algorithmen LVQ und SVM so einstellen dass sie auf der Basis einer
ordinalen abhängigen Variablen das Klassifizieren von Objekten erlernen (Kohonen
etal.1996;Burges1998;Saundersetal.1998).ZumBeispielistdieseOptionbeider
„support vector machine“ als „multiclass pattern recognition mode“ verfügbar. Es
bedarf weiterer Studien, zu erfahren ob dies zu einer Verbesserung der
Prädiktionsgenauigkeitführt.
4.5.2RÄUMLICHESTATISTIK
In dieser Studie verwendeten wir die gut etablierte Standardmethode um die
spezifischen intrinsischen Volumina zu schätzen (Ohser et al. 2000) Kürzlich wurde
ein alternativer Ansatz entwickelt, welcher es ermöglicht, eine gemeinsame
Schätzung aller 3 spezifischen intrinsischen Volumina einer Phase des gegebenen
Bildesdurchzuführen(Schmidtetal.2005;Spodarevetal.2005;Klenketal.2006;
Pantle et al. 2010). Die erste Anwendung an histologischen Bildern war die oben
schonbeschriebeneStudieüberMammakarzinomgewebeimVergleichzunormalem
Mammagewebe (Mattfeldt et al. 2006; Mattfeldt et al. 2007). Dieser Ansatz könnte
auch an Prostatakarzinomgewebe angewendet werden. Ein methodischer Vergleich
beiderAnsätzeüberschreitetdenRahmendieserArbeit.
4.6DIEMETHODIKDERPUNKTPROZESS-STATISTIK
Die Punktprozessmethode war sehr aufwändig. Die Erkennung jedes Kernes der
Epithelzellen bei 81 Fällen à 2 Bildern bedeutete eine nicht unerhebliche
Zeitinvestition. Die Untersuchung zeigte uns, dass eine Anpassung eines
parametrischen mathematischen Modells an histologische Schnittbilder des
Prostatakarzinoms möglich ist. Solch eine Untersuchung wurde nach unserer
Kenntnis, an histologischen Schnittbildern des Prostatakarzinoms noch nicht
63
4.Diskussion
durchgeführt. Doch konnten wir mit dieser Methodik nicht den Gleason Score
prädizieren. Aus anderen Publikationen, in der auch Punktprozesse verwendet
wurden, wie in der Publikation von (Mattfeldt et al. 2006), wurde die PaarKorrelations-Funktion verwendet, um die Kapillarisierung von gesundem
Prostatagewebe und karzinomatösem Prostatagewebe zu vergleichen. Es zeigte sich
einesignifikanteKorrelationdeserstenMaximumsder g -Funktion.
€
Es zeigte sich einige signifikante Korrelationen des Gleason-Scores mit Parametern
der Punktprozess-Statistik, jedoch konnten wir mit dieser Methodik nicht den
Gleason Score prädizieren. Es gibt nun einige Ansätze zur Verbesserung der
Punktprozess-StatistikinhistopathologischenAnwendungen,diemöglicherweisedie
Prädiktion des Gleason-Scores verbessern könnten. Die jetzige Methode bezieht das
kompletteBetrachtungsfensteralsReferenzraumindieBerechnungenein,obwohles
Arealegibt,indenendieWahrscheinlichkeitNullist,dasssichdortEpithelzellkerne
befinden,dassindinunseremFalldieDrüsenluminaunddasStroma.Beiderneuen
Methode werden die Kerne der Epithelzellen die bisher manuell detektiert und
zusätzlich die epitheliale Phase umfahren, um so die Drüsenlumina und das Stroma
aus dem Betrachtungsfenster rechnerisch zu entfernen. Das bedeutet, die
Punktmuster der Tumorzellkerne als Realisierung eines unterbrochenen
Punktprozesseszubetrachten(interruptedpointprocesses)(Stoyan1979).Indiesem
Fall besteht die Referenzfläche nur aus einer Teilmenge des Fensters, hier der
zellulären epithelialen Phase. Diese Methode wurde inzwischen mit Hilfe eines
Algorithmus, der uns von Prof. Baddeley, dem Initiator des spatstat-paketes, als
Quelltext zur Verfügung gestellt wurde, in unserer Arbeitsgruppe aufgebaut und an
einigenFällenverschiedenerTumorenbereitspraktischangewandt.Esmusssichnun
in einer Studie an Prostatakarzinomen zeigen, ob diese modifizierte Methode zu
besserenErgebnissenhinsichtlichderPrädiktiondesGleason-Scoresführt.
64
4.Diskussion
4.7SCHLUSSFOLGERUNG
Eine Texturanalyse von Prostatakarzinomen mittels Methoden der räumlichen
Statistik erlaubt es, diese Tumoren individuell durch eine Reihe von MinkowskiFunktionalenzucharakterisieren:Flächenanteil,LängendichteundmittlereEulerzahl
vonLumen,epithelialerZellphaseundStromaproEinheitReferenzfläche.Fürdiese
Funktionale zeigten sich viele signifikante Korrelationen mit dem Gleason-Score,
wobei als Hauptergebnis eine hochsignifikante negative Korrelation des GleasonScores mit der Eulerzahl der epithelialen Zellphase zu betrachten ist. Durch
GleichungenderklassischenStereologiekönnendieErgebnissevomplanarenSchnitt
auf das Gewebe in 3D extrapoliert werden. Durch multivariate lineare Regression
wurdenModellemitbiszu9signifikantenInput-Variablengetestet,umausdiesen
Daten den Gleason-Score zu prädizieren. Es zeigte sich, dass eine akzeptable
Prädiktion des Gleason Scores in ca. 80% der Fälle mit Methoden der räumlichen
Statistikrealisierbarist,wasinetwaderInterobserver-Variabilitätentspricht.
DurchMethodenderPunktprozess-Statistiksahenwir,dassesdurchausmöglichist,
PunktmustervonTumorzellkernenexplorativzucharakterisierenundmathematisch
zumodellieren.JedochwareinePrädiktiondesGleason-ScoresmitdieserMethodik
bishernichtdurchführbar.DerGrunddürftevorallemdarinzusehensein,dassdas
Gleason-GradingaufTexturparameternberuht,welchedieAnordnungderZellkerne
im Epithel nicht berücksichtigten. Jedoch erscheint eine methodische Verbesserung
dieses Ansatzes möglich, indem die Analyse der Punktmuster auf das Epithel als
Referenzflächebezogenwird,stattwiebisheraufdasGesamtgewebe.
65
5.ZUSAMMENFASSUNG
EINLEITUNG: Der Gleason-Score ist aktuell der prädiktivste Score welcher zum
Grading des Prostatakarzinoms verwendet wird. Er wird anhand histologischer
SchnittevoneinemPathologenmanuellbetimmt.
FRAGESTELLUNG: Wir untersuchten histologische Schnitte von 103 Patienten mit
Prostatakarzinomen, um zu sehen, ob der Gleason-Score mit Parametern der
räumlichen Statistik korreliert und ob eine Prädiktion des Gleason Scores mit
Methoden der räumlichen Statistik möglich ist. Wir verwendeten zwei verschieden
Methoden.
MATERIALUNDMETHODEN:DertexturanalytischeAnsatz(BetrachtungvonEpithel,
Lumen und Stroma als zufällige abgeschlossene Mengen mit positivem
Volumenanteil)erforderteeineEinteilungderhistologischenSchnitteindreiPhasen.
Das Stroma wurde schwarz eingefärbt, das Epithel grau und das Lumen weiß. Aus
diesen 3-phasigen Bildern wurden die 3 Minkowski Funktionale jeder Phase nach
demOhser-Algorithmusgeschätzt.
Die Methode der Punktprozess-Statistik erforderte die Detektion der Kerne der
Epithelzellen.SoentstandenPunktmuster,ausgelegtineinemKoordinatensystem.An
dieseKoordinatenderSchnittbilderpasstenwireinparametrischesmathematisches
Modell an, wir verwendeten den Strauss Hard-core Prozess, welcher von einer
Stationarität und Isotropie der Punkte ausgeht und die hard-core Distanz
berücksichtigt. So wurde eine räumlich-statistische Charakterisierung der
histologischen Schnittbilder eines Tumors durch nur 4 Parameter ermöglicht:
Intensität,Interaktionsparameter,hard-coreDistanz,Interaktionsradius..
ERGEBNISSE: Der texturanalytische Ansatz zeigte mit Hilfe der 3 Minkowski
Funktionale viele signifikante Korrelationen mit dem Gleason-Score, wobei als
HauptergebniseinehochsignifikantenegativeKorrelationdesGleason-Scoresmitder
Eulerzahl der epithelialen Zellphase pro Einheit Referenzfläche zu betrachten ist.
Durch multivariate lineare Regression wurden Modelle mit bis zu 9 signifikanten
räumlich-statistischen Input-Variablen getestet, um aus diesen Daten den GleasonScore zu prädizieren. In ca. 80% der Fälle konnte der Gleason-Score korrekt
prädiziertwerden.
66
5.Zusammenfassung
Die Untersuchung mit der Methode der Punktprozess-Statistik zeigte, dass eine
parametrische
mathematische
Modellanpassung
an
histologische
Prostatakarzinombilder möglich ist Der Gleason-Score ließ sich mit dieser Methode
allerdingsnichtmithinreichenderGenauigkeitprädizieren.
DISKUSSION: Es bestehen einige Studien, welche histologische Bilder der Prostata
verwendeten, um die Klassifikation durch bildanalytische Methoden zu
automatisieren.
Der texturanalytische Ansatz konnte durch Gleichungen der klassischen Stereologie
dieErgebnissevomplanarenSchnittaufdasGewebein3Dextrapoliertwerden.
Zur praktischen Anwendung zur automatischen Detektion des Gleason-Scores, ist
einevollautomatischeSegmemtierungderdreiPhasennotwendig.
WeitereMethodenzurPrädiktiondesGleason-Scoreswärenmöglich,unterAnderem
dieVerwendungvonkünstlicheneuronaleNetzwerke.
Der Grund für eine unzureichende prädiktive Genauigkeit der Methode der
Punktprozess-Statistikdürftevorallemdarinzusehensein,dassdasGleason-Grading
auf Texturparametern beruht, welche die Anordnung der Zellkerne im Epithel nicht
berücksichtigen. Das Gleason-Grading erfolgt in der Übersichtsvergrößerung, wobei
Kerneigenschaftenbewusstausgeblendetwerden.
SCHLUSSFOLGERUNG: Es zeigte sich, dass eine korrekte Prädiktion des GleasonScores in ca. 80% der Fälle mit Methoden der räumlichen Statistik realisierbar ist,
wasinetwaderInterobserver-Variabilitätentspricht.
DurchMethodenderPunktprozess-Statistiksahenwir,dassesdurchausmöglichist,
PunktmustervonTumorzellkernenexplorativzucharakterisierenundmathematisch
zumodellieren.JedochwareinePrädiktiondesGleason-ScoresmitdieserMethodik
bishernichtdurchführbar.
67
6.LITERATURVERZEICHNIS
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gradingofprostaticcarcinoma:Urologicpathologists.HumPathol32:74-80(2001)
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82
Anhang
ANHANG
DANKSAGUNG
IchmöchterechtherzlichHerrnProf.Dr.TorstenMattfeldtfürseinegroßzügigeund
geduldigeFörderungundstetsprompteundsehrguteHilfebeidieserArbeitdanken,
dieohneihnnichtzustandegekommenwäre.
Auch danke ich besonders Prof. Dr. Volker Schmidt, Dr. Sebastian Lück, Dr. Daniel
Meschenmoser und Dr. Stefanie Eckel für die Unterstützung in technischen und
fachlichenFragen.
MeinDankseiauchausgesprochenHerrnRolfKunftfürseinetechnischeMithilfe.
Des weiteren Danke ich meiner Frau Regine, die meine Arbeit seit Jahren mitträgt
undmeinenEltern,welchemichimmerunterstützthaben.
83
LEBENSLAUF
Anhang
PaulGrahovac,geb.am11.04.1979inAalen
•
BesuchderMittelhofGrundschule1985-89
•
BesuchderEugen-Bolz-Realschule1989-95
•
BesuchdesTechnischenGymnasiums,Aalen1995-98
•
ZivildienstalsRettungssanitäterbeimDeutschenRotenKreuz,Aalen20002001
•
StudiumderErnährungswissenschaftenanderJustus-Liebig-Universität
Gießen04.2002-08.2002
•
ImmatrikulationanderUniversitätUlm,FakultätfürMedizin09.2002
•
ÄrztlicheVorprüfung04.2005
•
PraktischesJahramBundeswehrkrankenhausUlm04.2008-03.2009
•
StaatsexameninMedizin05.2009
•
AssistenzarztderAbteilungfürOnkologieamKatharinenhospital,Stuttgart
08.2009-10.2009
•
AssistenzarztderAbteilungfürAnästhesieamRobert-Bosch-Krankenhaus,
Stuttgart10.2009-Heute
•
ErlangungderZusatzbezeichnungNotfallmedizin01.2012
•
BerufsbegleitenderMasterstudiengang„BetriebswirtschaftfürÄrzte“ander
HochschuleNeu-Ulm03.2013-03.2015
•
FacharztanerkennungderAnästhesie07.2015
84