VEGF-Rezeptor-spezifische Signaltransduktion über Ras und
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VEGF‐Rezeptor‐spezifische Signaltransduktion über Ras und Stickstoffmonoxid in Endothelzellen: Einfluß auf Tumorwachstum Dissertation Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie an der Ruhr‐Universität Bochum vorgelegt von Ina Radtke Bochum 2004 Danksagung
Herrn Prof. Dr. R. Heumann danke ich für die Überlassung des Themas, seine umfassende
und ständige Unterstützung und seine wissenschaftliche Diskussionsbereitschaft.
Herrn Prof. Dr. A. Wittinghofer bin ich dankbar für die hilfreichen Anregungen und die
Anfertigung des Zweitgutachtens.
Herrn Prof. Dr. W. Schuhmann danke ich für die Unterstützung des Projektes mit Ideen und
Mitteln, seine Diskussionsbereitschaft und die „Drittprüfer-Funktion“.
Frau PD Dr. A. Eggert und ihrem Team danke ich für die hervorragende Zusammenarbeit
bei der Durchführung der Tierversuche und ihre zahlreichen Anregungen. Herrn PD Dr. C.
Kuhnen bin ich dankbar für die wertvolle Unterstützung bei der Charakterisierung der
Tumore. Herrn Prof. Dr. K.-M. Müller, Herrn PD Dr. R. Ahmadian, Herrn Prof. Dr. M.
Clauss und meinen Kollegen Dr. C. Goemans, Dr. B. Feldhaus, T. Gronemeyer, T. Welzel,
V. Sokolova bin ich dankbar für hilfreiche Hinweise, Konstrukte und Materialien.
Aus dem ELAN-Team bedanke ich mich besonders bei S. Reiter, S. Isik, Dr. J. Oni,
Dr. N. Diab, Dr. T. Erichsen und bei dem ganzen Team für die fruchtbare und nette
Zusammenarbeit und ihre Hilfsbereitschaft.
Der exzellenten technischen Assistenz von H. Breuker verdanken die Zellen ihre gute Pflege
und ich wertvolle Unterstützung. Die Zusammenarbeit mit den studentischen Kollegen
U. Egbers, E. Jasny, C. Grote-Westrick, S. Karassek, A. Jain und U. Haußmann hat viel Spaß
gemacht. Allen Kollegen im Lehrstuhl danke ich für die gute Zusammenarbeit, ihre
hilfreichen Tipps und ihre Diskussionsbereitschaft.
Meinem Mann, meinen Eltern und meiner Familie danke ich für die unglaubliche
Unterstützung in allen Lebenslagen und ihre Geduld. Sie haben mir die Möglichkeit
gegeben, diesen Weg zu gehen.
Die vorliegende Arbeit wurde am Lehrstuhl für Molekulare Neurobiochemie der Fakultät für
Chemie (Leitung: Prof. Dr. R. Heumann) der Ruhr-Universität von November 2000 bis Juli
2004 durchgeführt.
Vorsitz :
Prof. Dr. Ch. Wöll
Referent:
Prof. Dr. R. Heumann
Koreferent:
Prof. Dr. A. Wittinghofer
Drittfachprüfer:
Prof. Dr. W. Schuhmann
Tag der Disputation :
6. Dezember 2004
Inhalt
Seite 1
Inhalt
INHALT .......................................................................................................... 1
ABKÜRZUNGEN ........................................................................................... 4
1
EINLEITUNG .......................................................................................... 7
1.1
Angiogenese und angiogene Faktoren ..................................................................................7
1.1.1
Vaskulogenese, Angiogenese, Arteriogenese, Angiogenese-Faktoren ................................7
1.1.2
Signaltransduktion von VEGF in Endothelzellen ................................................................8
1.1.3
Tumorangiogenese und VEGF ..........................................................................................13
1.2
Die Rolle von NO in Endothelzellen....................................................................................15
1.2.1
Funktion und Synthese von NO.........................................................................................15
1.2.2
Regulation der NO-Synthese und –Ausschüttung: ............................................................15
1.2.3
VEGF und Funktionen von NO in Endothelzellen ............................................................16
1.3
Anti-Angiogene Therapie.....................................................................................................17
1.3.1
Anti-angiogene Tumortherapie über den VEGF-Signalweg..............................................18
1.3.2
Anti-Angiogene Gen-Therapie ..........................................................................................19
1.4
Ras in Tumorzellen und bei der Tumorangiogenese .........................................................20
1.4.1
Struktur und Funktion von Ras ..........................................................................................20
1.4.2
Ras in Tumorzellen............................................................................................................22
1.4.3
Ras in der Interaktion Tumorzelle und Tumorendothel....................................................23
1.4.4
Therapeutische Inhibition von Ras bei Tumorerkrankungen.............................................25
1.5
Endothelzellen und Endothelzell-Modelle ..........................................................................28
1.6
Tumor-Modelle .....................................................................................................................31
1.7
Endothelzell-abgeleitete Tumore.........................................................................................32
1.7.1
Einteilung und Systematik .................................................................................................32
1.7.2
Die Rolle von Ras bei Endothelzell-abgeleiteten Tumoren ...............................................33
1.8
2
Zielsetzung der Arbeit..........................................................................................................35
METHODEN ......................................................................................... 36
2.1
Materialien ............................................................................................................................36
2.1.1
Verwendete Zellkulturlösungen/-antibiotika .....................................................................36
2.1.2
Verwendete Chemikalien...................................................................................................36
2.1.3
Verwendete Enzyme ..........................................................................................................37
2.1.4
Verwendete Geräte ............................................................................................................37
2.1.5
Verwendete Verbrauchsmaterialien und Kits ....................................................................37
2.1.6
Verwendete Antikörper und Detektionsenzyme ................................................................38
2.1.7
Verwendete Oligonucleotide: Primer und Sequenzierprimer ............................................38
2.1.8
Verwendete Bakterienstämme - genetische Typisierung ...................................................38
2.1.9
Verwendete Plasmide ........................................................................................................39
2.1.10
Verwendete Zellen/Zellinien und Versuchstiere...........................................................39
2.2
Molekularbiologische Methoden .........................................................................................40
2.2.1
Subklonierung von DNA-Fragmenten (Sambrook et al. 1989) .........................................40
2.2.2
Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ......................................................41
2.2.3
Analyse von Nukleinsäuren ...............................................................................................43
Seite 2
2.2.4
2.2.5
Inhalt
RNA-Isolierung................................................................................................................. 43
Reverse-Transkriptase-PCR .............................................................................................. 44
2.3
Zellkultur-Methoden............................................................................................................ 44
2.3.1
Kultivierung von primären HUVEC ................................................................................. 44
2.3.2
Passagieren von Sekundärzellinien .................................................................................. 45
2.3.3
Kryokonservierung und Auftauen von Zellen ................................................................... 45
2.3.4
Transfektion ...................................................................................................................... 46
2.3.5
Mikroskopische und spektrometrische Untersuchungen mit Zellen.................................. 48
2.4
Proteinbiochemische Methoden .......................................................................................... 50
2.4.1
Lyse der Zellen, Proteinbestimmung und Probenvorbereitung ......................................... 50
2.4.2
Immunpräzipitation ........................................................................................................... 51
2.4.3
Bestimmung der cdc42-Aktivität ...................................................................................... 51
2.4.4
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ...................................................... 52
2.4.5
Western-Blotting ............................................................................................................... 53
2.5
Experimente mit T-HUVEC................................................................................................ 54
2.5.1
Stimulation von T-HUVEC und T-HUVEC-anti-ras-scFv ............................................... 54
2.5.2
BrdU-Inkorporation........................................................................................................... 54
2.5.3
Überleben .......................................................................................................................... 55
2.5.4
Zellzahlvermehrung........................................................................................................... 55
2.5.5
In vitro Angiogenese ......................................................................................................... 55
2.5.6
Migration........................................................................................................................... 56
2.5.7
NO-Messung ..................................................................................................................... 56
2.5.8
ELISA-Bestimmung von VEGF und PlGF in Überständen .............................................. 58
2.6
Erzeugung von Tumoren in Nacktmäusen ........................................................................ 58
2.6.1
Durchführung des Tierversuches....................................................................................... 58
2.6.2
Injektion der T-HUVEC.................................................................................................... 58
2.6.3
Behandlungsschema und Beobachtung des Tumorwachstums.......................................... 59
2.6.4
Tumorentnahme und Anfertigung histologischer Schnitte................................................ 59
2.6.5
Immunhistochemische Färbungen von Schnitten.............................................................. 60
2.7
3
Statistische Auswertungen................................................................................................... 60
ERGEBNISSE....................................................................................... 61
3.1
Endothelzellmodell und Ras-inhibierender Antikörper ................................................... 61
3.1.1
Charakterisierung der T-HUVEC...................................................................................... 61
3.1.2
Herstellung stabiler anti-ras-scFv expremierender Zellinien............................................. 65
3.1.3
Ras-Bindung des anti-ras-scFv und kompartiment-spezifische Expression des anti-rasscFv in T-HUVEC ........................................................................................................................... 68
3.2
Signaltransduktion von VEGF in T-HUVEC .................................................................... 70
3.2.1
VEGF-Ausschüttung durch T-HUVEC............................................................................. 70
3.2.2
Freisetzung von NO........................................................................................................... 70
3.2.3
VEGF-abhängige Aktivierung von cdc42 ......................................................................... 74
3.2.4
VEGF-abhängige Aktivierung von Akt/PKB.................................................................... 75
3.3
Regulation der Endothelzellfunktionen.............................................................................. 76
3.3.1
Übersicht Endothelzellfunktionen ..................................................................................... 76
3.3.2
DNA-Synthese/Zellteilungsaktivität ................................................................................. 76
3.3.3
Zellüberleben..................................................................................................................... 77
3.3.4
Proliferation (Zellzahlvermehrung)................................................................................... 80
3.3.5
Vergleich mit primären HUVEC....................................................................................... 81
3.3.6
Migration........................................................................................................................... 82
3.3.7
Ausbildung tubulärer Strukturen auf extrazellulärer Matrix (in vitro-Angiogenese) ........ 84
3.3.8
Stimulationsabhängige und Ras-abhängige Sekretion von VEGF durch T-HUVEC........ 86
Inhalt
Seite 3
3.4
Wirkung der Ras-Inhibition auf das Wachstum von T-HUVEC abgeleiteten Tumoren
im Xenograft-Modell ..........................................................................................................................88
3.4.1
Wachstum von T-HUVEC abgeleiteten Tumoren in Nacktmäusen ..................................88
3.4.2
Ras-Inhibition in T-HUVEC-anti-ras-scFv (Zellinie 14-4) abgeleiteten Tumoren............89
3.4.3
Wachstumsverläufe der Tumoren mit Ras-Inhibition........................................................89
3.4.4
Histomorphologie der T-HUVEC abgeleiteten Tumore ....................................................94
4
DISKUSSION...................................................................................... 101
4.1
Signaltransduktion von VEGF in Endothelzellen............................................................101
4.1.1
Endothelzellmodell ..........................................................................................................101
4.1.2
Rezeptorspezifisch aktivierte Signalwege .......................................................................104
4.1.3
Endothelzellfunktionen und rezeptorspezifische Signalwege..........................................108
4.2
Ras-Inhibition in Endothelzell-abgeleiteten Tumoren ....................................................117
4.2.1
T-HUVEC abgeleitete Tumore = vaskuläre Tumore? .....................................................117
4.2.2
Effekte der Ras-Inhibition durch intrazelluläre Immunisierung ......................................118
4.3
Ausblick...............................................................................................................................120
5
ZUSAMMENFASSUNG...................................................................... 122
6
LITERATUR........................................................................................ 123
7
ANHANG ............................................................................................ 134
Anhang A: Übersichten/Einzelergebnisse für T-HUVEC-Tumore ..............................................134
Mittleres Tumorvolumen in den Gruppen mit allen Tieren ...........................................................134
Einzelergebnisse in den Gruppen...................................................................................................134
Anhang B: Sequenz des anti-ras-scFv-myc ....................................................................................139
8
LEBENSLAUF.................................................................................... 141
Seite 4
Abkürzungen
Abkürzungen
Abb.
Amp
AngII
AP-1
APS
ATCC
B2M
BAEC
BAPTA
BMEC
BOA
Bp
BrdU
BSA
CD
c-fms
CIAP
CMV
CSF-1(R)
C-terminal
DMEM
DMSO
DNA
dNTP
Dox
DsRed
E. coli
EC
ECL
EDRF
EDTA
EGF
EGFP
EGTA
ELISA
eNOS
ERK
Fab
Fc
FCS
FGF, (b)FGF
Flk-1
Flt-1/4
Fmt-1
FTI
G
GAP
GDP, GTP, cGMP
GEF
GST
HAEC
HBS
HDMVEC
HE
HEPES
HIF
HIV
HLEC
HMVEC
Abbildung
Ampicillin
Angiopoietin II
Activating protein-1 (Transkriptionsfaktor)
Ammoniumperoxidisulfat
american type cell culture collection
β-2-Mikroglobulin
Bovine aortic endothelial cells
1,2-bis(2-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraessigsäure
Human bone marrow endothelial cells
Best of all
Base pair = Basenpaare
5-Brom-2’-desoxy-uridin
bovines Serumalbumin
cluster of differentiation
CSF-1-Rezeptor
calf intestine alkaline phophatase
Cytomegalie-Virus
Colony-stimulating factor 1 (receptor) = M-CSF
Carboxyterminal
Dulbeccos modified Eagles medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonucleinsäure
Desoxy-NTP
Doxycyclin
Discostoma red fluorescent protein
Escherichia coli
Endothelial cell
Enhanced chemoluminescence
Endothelium derived relaxing factor
Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
Epidermal growth factor
enhanced green fluorescent protein
Ethylenbis(oxyethylen-nitrilo-)tetraessigsäure
Enzyme-linked immunosorbent assay
Endotheliale NOS
Extracellular-signal related kinase (=MAPK)
Fragment antigen-binding
Fragment crystallizable
Fetal calf serum
(Basic) fibroblast growth factor
Fetal liver kinase-1 (=KDR=VEGFR2)
c-Fms-like tyrosine kinase-1/4 (=VEGFR1)
schimärer Rezeptor mCSF1-R + VEGFR1
Farnesyltransferase-Inhibitor
Erdbeschleunigung
GTPase activating protein
Guanosindiphosphat, Guanosintriphosphat, Cyclo-Guanosinmonophosphat
Guanine nucleotide exchange factor
Glutathion-S-Transferase
Human aortic endothelial cells
Hanks buffered saline
humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen
Hämotoxylin-Eosin(-Färbung)
N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N’-2-ethansulfonsäure
Hypoxia-inducible factor
Human immune deficiency virus
human lung endothelial cells
Human microvascular endothelial cells
Abkürzungen
HPF
H-Ras
HRE
HRP
HSPG
hTert
HUVEC
IEC
IFL-Regime
IFN-γ
IgG
IL
iNOS
IP3
IPTG
kDa
KDR
K-Ras
LB
LDL
L-Name
L-NIO
L-NMMA
MAPK
MBEC
MCS
M-CSF
mCSF-1
MEK
MHCI
MMP
mRNA
MTT
MTV
Myc
N
NF-1
NFκB
NGR-Motiv
NiTmPyP
nNOS
NO
NOC-18=DetaNONOate
NOD/scid-Maus
NOS
N-Ras
Nrp-1
N-terminal
NTP
OD
Orf-Viren
P
P13K
PA, uPA, tPA, PAI
PAEC
PAGE
PAK1
PBMEC
PBS-T
Seite 5
high power field
Harvey-Ras
Hypoxie-responsives Element
Horseradish peroxidase
Heparansulfat-Proteoglykan
humane Telomerase
Human umbilical vein endothelial cells
intestinale Epithelzelle
Irinotecan-Fluorouracil-Folinsäure-Behandlung
Interferon-γ
Immunoglobulin Klasse G
Interleukin
induzierbare NOS
Inositol-1,4,5-triphosphat
Isopropylthiogalactosid
Kilodalton
Kinase insert domain-containing receptor
Kirsten-Ras
Luria Bertani
low density lipoprotein
NG-nitro-L-arginine methylester
L-N5-(1-iminoethyl)-ornithine
NG-methyl-L-arginine
Mitogen activated protein kinase (=ERK)
Mouse brain endothelial cells
Multiple cloning site
Macrophage Colony-stimulating factor
Maus-CSF
Mitogen activated extracellular signal regulated kinase (=ERK Kinase)
Major histocompatibility complex I
Matrix-Metalloproteinasen
messenger RNA
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid
maximales Tumorvolumen
Myc avian (MC29) myelocytomatosis virus
Anzahl
Neurofibromatosis Typ-1
Nuclear Factor κB
9. Typ III-Repeat von Fibronectin
Ni-(4-N-tetramethyl)-pyridyl-Porphyrin
Neuronale NOS
Stickstoffmonoxid
2,2’-(Hydroxynitrosohydrazino)bis-ethanoamin
Severe combined immune deficiency
Stickstoffmonoxid-Synthase
Neuroblastoma-Ras
Neuropilin-1
Aminoterminal
Nukleosid-5’-triphosphat
Optische Dichte
Open reading frame-Viren
Protein
Phosphatidylinositol-3-kinase
Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ (uPA) oder Gewebetyp (tPA),
PA-Inhibitor
Porcine aortic endothelial cells
Polyacrylamidgelelektrophorese
p21 activated protein kinase 1
Porcine microvascular brain endothelial cells = Schweine mikrovaskuläre
Gehirn-Endothelzellen
Phosphate buffered saline (mit Tween 20)
Seite 6
PCR
PDGF(R)
PECAM-1
PGK-1
PIL
PKB
PKC
PLCγ
PlGF
Pmin
PMSF
Ras
RBD
REM
RNA
Rpm
RT
RTK
RT-PCR
scFv
SDS
SECM
SE-Zellen
sFlt-1
SOE-PCR
Sos
S-Phase
Src
SV40
Tab.
TE(B)
TEMED
Tet
tetO
tetR
TGF-α/-β
T-HUVEC
TIMP
TM
TNF
TRE
Tris
tTA, (r)tTA
TV
U
UEA-1
UV
V
vVCAM-1
VE-Cadherin
VEGF(R)
VEGF-E
VE-Wasser
VP16
VPF
vWF
W
WT
Abkürzungen
Polymerase chain reaction
Platelet-derived growth factor (receptor)
platelet endothelial cell adhension molecule-1 (=P-CAM=CD31)
Phosphoglyzerat-Kinase 1
pankreatische intraduktale Läsion
Proteinkinase B (=Akt)
Proteinkinase C (CA2+/Phopholipid-abhängige Proteinkinase)
Phospholipase-Cγ
Placenta growth factor
Minimalpromotor
Phenylmethylsulfonylfluorid
Rat sarcoma
Ras binding domain
Raster-Elektronenmikroskopie
Ribonucleid acid = Ribonucleinsäure
Rounds per minute = Umdrehungen pro Minute
Raumtemperatur
Rezeptortyrosinkinase
Reverse Transkriptase-PCR
single chain fragment variable = Einzelkettenantikörper
Sodium dodecyl sulfate = Natriumdodecylsulfat
Scanning electrochemical microscopy
Sinusoidal endothelial-Zellen
Soluble Flt-1 (trunkierter Flt-1)
splicing by overlap extension-polymerase chain reaction
Son of sevenless
Synthese-Phase
Sarcoma
Simian virus 40
Tabelle
Tris-EDTA-(Borat)-Puffer
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
Tetracyclin
Tet-Operator
Tet-Repressor
transformierender Wachstumsfaktor
Transformed human umbilical vein endothelial-Zellen
tissue inhibitor of matrix metallproteinases
Transmembranbereich
Tumor necrosis factor
Tetracyclin responsive element
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
(reverser) Tetracyclin-kontrollierter Transkriptions-Transaktivator
Tumorvolumen
Unit
Ulex europaeus Agglutinin
Ultraviolett
Volume
Viral
Vascular cellular adhension molecule-1
Vascular endothelial cadherin = CD144
Vascular endothelial growth factor (receptor)
Orf-virus VEGF
entionisiertes Wasser
Proteindomäne aus Herpes-Simplex-Virus
Vascular permeability factor (=VEGF)
Van Willebrand Factor
Weight
Wildtyp
Einleitung
Seite 7
1 Einleitung
1.1 Angiogenese und angiogene Faktoren
1.1.1
Vaskulogenese, Angiogenese, Arteriogenese, Angiogenese-Faktoren
Der Vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) spielt eine wichtige und vielgestaltige Rolle bei der vaskulären Embryonalentwicklung (Vaskulogenese), dem Entstehen
neuer Blutgefäße aus bestehenden (Angiogenese) und bei der Ausbildung funktioneller Kollateralen aus vorgebildeten Kapillaren (Arteriogenese).
Angiogenese spielt eine wichtige Rolle bei physiologischen Vorgängen, wie Wundheilung und dem weiblichen Menstruationszyklus und bei pathologischen Vorgängen, wie
diabetischer Retinopathie, Arthritis, Tumorwachstum und –metastasierung (Übersicht in
Carmeliet 2003). Im adulten Organismus findet außer bei den o. g. Vorgängen physiologischerweise kaum Angiogenese statt. Bei den pathologischen Vorgängen muß eine überschießende bzw. fehlregulierte von einer fehlenden Angiogenese-Aktivität unterschieden
werden. Eine pathologisch vermehrte Angiogenese findet bei der Tumorangiogenese und bei
der diabetischen Retinopathie statt. hier ist die Hemmung der Angiogenese ein therapeutisch
interessantes Ziel, das schon seit 1970 verfolgt wird (Folkman 1971). Eine fehlende kompensatorische Angiogenese hingegen verschlechtert die Heilung bei ischämischen Situationen, z. B. bei Gefäßverschlüssen im Rahmen von Herzinfarkten oder Schlaganfällen. hier
könnte die Verabreichung von angiogenese-fördernden Faktoren therapeutisch sinnvoll sein
(Folkman 1998). Bei Revaskularisierungsvorgängen im erwachsenen Organismus spielt neben der Angiogenese die Arteriogenese eine wichtige Rolle. hier werden schon bestehende
Kollateralen funktionalisiert.
Die Bildung neuer Blutgefäße erfordert die geordnete Abfolge folgender Prozesse:
•
•
•
•
•
•
Produktion von Proteasen durch aktivierte Endothelzellen zur Unterbrechung der gefäßumgebenden Basalmembran und Sekretion von Plasminogen-Aktivatoren
die Bildung migrationsfördernder Faktoren und Migration der Endothelzellen zum Ort
der Gefäßneubildung
Rekrutierung von zirkulierenden Endothel-Vorläuferzellen, die dem Knochenmark entstammen.
Proliferation, Organisation und Differenzierung der Endothelzellen zur Ausbildung einer
neuen Gefäßstruktur
Ausschüttung von Faktoren wie PDGF und TGF-β zur Anlockung von Blutgefäßunterstützenden Zellen (Perizyten, glatte Muskelzellen)
Bildung einer neuen Basalmembran aus Kollagen IV, Lamininen, Fibronectin u. a.
Seite 8
Einleitung
Abbildung 1-1: Schematische Darstellung der beteiligten Vorgänge und Zellen bei der Blutgefäßbildung (aus Carmeliet 2003).
Die Angiogenese wird über die Balance von Angiogenese-Stimulatoren und Angiogenese-Inhibitoren reguliert. Angiogenese-induzierende Faktoren sind VEGF, FibroblastenWachstumsfaktor (FGF), Interleukin-8 (IL-8), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF-α,
TGF-β), Angiopoietine, Faktoren der Ephrin-Familie. Die beiden prominentesten Angiogenese-Inhibitoren sind Angiostatin und Endostatin (O’Reilly et al. 1994, 1997). Jede Veränderung der Balance kann das Gleichgewicht stören und zu überschießender oder mangelnder
Blutgefäßneubildung bzw. Remodellierung des Gefäßsystemes führen. Verschiedene Zelltypen tragen neben den Endothelzellen zur Angiogenese bei, darunter Blutzellen und Zellen
des Immunsystems (Abb. 1.1). Die Angiogenese-Faktoren regulieren die Vermehrung und
Funktion dieser Zellen.
1.1.2
Signaltransduktion von VEGF in Endothelzellen
1.1.2.1 Liganden der VEGF-Familie
Im adulten Organismus ist VEGF sowohl an der Bildung neuer Blutgefäße als auch
an der Erhaltung der bestehenden Gefäße beteiligt. VEGF wirkt direkt auf die Endothelzellen. Es wird von Zellen in der Nachbarschaft der Gefäße ausgeschüttet und wirkt vor allem
Einleitung
Seite 9
parakrin. Es fördert das Überleben, die Wanderung, das Wachstum und die Zellpermeabilität
der Endothelzellen (Übersicht in Ferrara 1999).
VEGF (auch VEGF-A) ist ein Polypeptid aus der VEGF-Familie, zu der neben
VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (orf-virus VEGF) auch der PlazentaWachstumsfaktor (PlGF oder PGF) gehören. Die Struktur von VEGF-A ähnelt der Struktur
von PDGF. VEGF besteht aus einem antiparallelen Homodimer, das intermolekular durch
Disulfidbrücken verbrückt ist (Muller et al. 1997, Siemeister et al. 1998). VEGF gehört zur
Familie der Wachstumsfaktoren mit charakteristischer Cystein-Knoten-Struktur aus 8 konservierten Cysteinen.
VEGF-A:
VEGF-A spielt eine wichtige Rolle bei der Vaskulogenese. Ferrara et al. (1996) zeigen, daß sogar die gezielte Ausschaltung von einem VEGF-Allel zur embryonalen Letalität
führt, und zwar aufgrund von gestörter Vaskulogenese mit abnormal kleiner dorsaler Aorta,
zu wenig Gefäßaussprossungen und abnormal großen Blutgefäßen in Dottersack und Plazenta sowie fehlerhafter Herzgefäßentwicklung. Die Ausschaltung beider VEGF-Allele führt zu
noch umfassenderen Blutgefäßfehlbildungen, was einen dosisabhängigen Effekt nahelegt.
Die verschiedenen Splice-Varianten von VEGF-A werden von einem Gen abgelesen,
das acht Exons beinhaltet. Beim Menschen sind fünf Splice-Varianten von Bedeutung:
VEGF121, VEGF143, VEGF165, VEGF189, VEGF206. Die kleineren Formen sind löslich,
während die größeren eher Heparin- und damit mit der extrazellulären Matrix und den Zellen
assoziert vorliegen. Die Heparin-Bindung wird über den Exon-7-codierten Bereich vermittelt, der neben Exon 6 beim VEGF121 fehlt. Bei den Heparin- und Extrazellularmatrixassoziierten Isoformen VEGF189 und VEGF206 sind polybasische Sequenzen, die die Assoziation ermöglichen, eingefügt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Splice-Varianten
von VEGF kann sich bei der tumorigenen Konversion von Zellen verändern, z. B. von
VEGF121 zugunsten VEGF165 in Maus-Tumorimplantationsmodellen von humanen Melanom-Zellen (Yu et al. 2002). Das Expressionsmuster der VEGF-Isoformen beeinflußt wiederum über die Angiogenese-Aktivität über die Tumorperfusion die Tumorwachstumsgeschwindigkeit.
Die Expression von VEGF wird durch Hypoxie induziert (Shweiki et al. 1992). Die
hypoxische Regulation der VEGF-Expression wird auf mehreren Ebenen reguliert: die
Transkription vom VEGF-Gen über die Familie der hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIF), die Translation von VEGF-mRNA über eine mRNA-Stabilisierung und auf
Proteinebene bei den größeren VEGF-Varianten durch proteolytische Freisetzung aus der
extrazellulären Matrix (Ikeda et al. 1995, Levy et al. 1995). Zur Regulations der Transkriptionsaktivität des VEGF-Gens sind vor und hinter der VEGF-Gensequenz hypoxie-responsive
Elemente (HRE) eingefügt, die für die Hypoxie-Empfindlichkeit verantwortlich sind. Die
mRNA-Stabilität wird u. a. durch den 3’-untranslatierten Bereich der VEGF-mRNA reguliert.
Seite 10
Einleitung
Weitere Komponenten in der Signaltransduktionskette, die zur Freisetzung von
VEGF aus Tumorzellen führen kann, sind Ras, Raf, NO und PKC. Konstitutiv aktivierende
Ras-Mutationen oder Ras-Überexpression kann bei der Hochregulation der
VEGF-Ausschüttung aus Tumorzellen mitwirken. In NIH3T3-Zellen kann durch v-Ha-Ras
und auch durch v-Raf die VEGF-Ausschüttung angeregt werden, vermutlich über c-Jun und
c-Fos-Aktivierung (Grugel et al. 1995). In der Promotorsequenz vom VEGF-Gen gibt es vier
AP-1-Bindestellen, die an der Hochregulation der Transkription des VEGF-Gens durch Ras/Raf-Aktivierung beteiligt sein können (Tischer et al. 1991). VEGF und NO scheinen sich
über die PKC gegenseitig zu regulieren (Dembinska-Kiec 1997).
VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D
VEGF-B und VEGF-C haben speziellere Funktionen als das allgegenwärtige VEGF.
VEGF-B ist besonders wichtig bei der Herzentwicklung während der Embryogenese, wird in
der späteren Embryonalentwicklung aber auch von anderen Geweben expremiert. VEGF-B
kann mit VEGF-A Heterodimere bilden und wird oft zusammen mit VEGF-A expremiert
(Olofsson et al. 1996). VEGF-C bindet an VEGFR3 und ist ein Wachstumsfaktor in lymphatischen Gewebe. VEGF-D ist dem VEGF-C sehr ähnlich, wirkt mitogen auf Endothelzellen
und bindet an VEGFR2 und VEGFR3 (Achen et al. 1998).
PlGF
PlGF wird, wie der Name sagt, besonders stark in der Plazenta expremiert. Die Expression ist dort während der gesamten Schwangerschaftszeit hoch. Einige Tumore expremieren ebenfalls PlGF, wie z. B. renale Karzinome. PlGF fördert die Chemotaxis von Monozyten und ist so beteiligt an der Arteriogenese, bei der es zunächst zur Einwanderung von
Monozyten kommt (Clauss et al. 1996; Barleon et al. 1996). PlGF bildet Heterodimere mit
VEGF. Die Feinabstimmung der Angiogenese scheint durch Regulation von VEGF, PlGF
und die VEGF-PlGF-Heterodimere zu erfolgen, die trotz Bindung an die gleichen Rezeptoren zur Aktivierung unterschiedlicher Signalwege führen (Autiero et al. 2003). PlGF spielt
eine besondere Rolle bei der Revaskularisierung ischämischer Gewebe, wie in PlGF-KnockOut-Mäusen und in bei Behandlung mit PlGFgezeigt wurde (Luttun et al. 2002a, 2002b) und
als Überlebensfaktor für Tumorendothelzellen (Adini et al. 2002). Beim Menschen gibt
es mindestens zwei unterschiedliche Splice-Varianten: PlGF-2 unterscheidet sich von PlGF-1
durch Einfügung einer 21 Aminosäuren langen Sequenz (vorwiegend basische Aminosäuren), die eine Heparin-Bindung ermöglicht. PlGF-2 bindet an Neuropiline und VEGFR1,
PlGF-1 an VEGFR1.
VEGF-E
Die Sequenz von VEGF-E wurde im Genom des Parapox-Virus Orf, der Epithelien
von Mensch, Schaf und Ziege befällt und dort zu einer massiven Kapillarproliferation und
Kapillardilatation führt, gefunden. Meyer et al. (1999) zeigten zum ersten Mal eine angiogene Aktivität des VEGF-Homologs. In HUVEC (humane umbilikale Venen-Endothelzellen)
und HDMVEC (humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen) wirkt VEGF-E proliferations-, migrationsfördernd und ist in-vitro-Angiogenese-aktiv, im wesentlichen genauso wie
Einleitung
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VEGF. Auch von anderen Viren ist bekannt, daß sie angiogen wirkende Liganden der
VEGF-Rezeptoren kodieren können, z. B. das Tat-Protein beim HIV (Albini et al. 1996).
VEGF-E bindet an VEGFR2 und auch an Neuropilin-1 (Meyer et al. 1999, Wise et al. 1999).
1.1.2.2 VEGF-Rezeptoren
Die angiogenen Faktoren der VEGF-Familie vermitteln ihre Wirkung über drei hochaffine Tyrosinkinase-Rezeptoren, an die jeweils folgende Liganden binden (Abb. 1.2):
VEGF-Rezeptor 1 (VEGFR1, Flt-1):
VEGF-A, VEGF-B, PlGF
VEGF-Rezeptor 2 (VEGFR2, KDR/Flk-1):
VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E
VEGF-Rezeptor 3 (VEGFR3, Flt-4):
VEGF-C, VEGF-D.
Den VEGF-Rezeptortyrosinkinasen gemeinsam sind extrazelluläre ImmunglobulinDomänen, eine Transmembran-Domäne und eine Tyrosinkinase-Domäne mit Kinase-Insert.
Von den beiden Rezeptoren für VEGF-A (VEGFR1 und VEGFR2) gibt es lösliche trunkierte
Varianten, die aus der Extrazellulärdomäne bestehen (Kendall et al. 1996). VEGF-A bindet
mit höherer Affinität an VEGFR1 als VEGFR2 (Waltenberger et al. 1994). Sie assozieren
mit den Bereichen von Exon 1 – 3 von VEGF.
Abbildung 1-2: Schematische Übersicht über VEGF-Rezeptoren und ihre Liganden in Endothelzellen (aus Matsumoto und Claesson-Welsh 2001).
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Einleitung
VEGF-Tyrosin-Kinase-Rezeptoren:
Die Rolle der beiden hochaffinen VEGF-Rezeptoren während der Vaskulogenese
wurde ebenfalls in Knockout-Mäusen untersucht. Beide Mausmodelle zeigten embryonale
Letalität um Tag 8,5 der Embryonalentwicklung. Die VEGFR2-defizienten Embryos zeigen
keine Angioblasten, hämatopoetischen Zellen und differenzierten Endothelzellen und weisen
keinerlei Blutgefäße auf (Shalaby et al. 1995). Die VEGFR1-defizienten Embryos weisen
Endothelzellen auf, die aber keine geordneten Blutgefäßstrukturen auszubilden imstande
sind (Fong et al. 1995). Dies weist auf eine Beteiligung des VEGFR1 an den komplexen
Organisationsvorgängen während der Blutgefäßbildung hin. Knockout der intrazellulären
Tyrosinkinase-Domäne hat in VEGFR1-TK-Knockout-Mäusen keine wesentlichen Auswirkungen auf die Vaskulogenese, die Tiere entwickeln sich normal, bis auf eine reduzierte
Migrationsfähigkeit der Makrophagen (Hiratsuka et al. 1998). Dies schien der Funktion der
intrazellulären Domäne mit der Tyrosinkinase von VEGFR1 keine besondere Bedeutung
zuzuordnen.
Untersuchungen zur Funktion der beiden VEGF-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2
werden mit verschiedenen Methoden durchgeführt (Übersicht Neufeld et al. 1999). Endothelzellen, die keinen von beiden Rezeptoren haben, können selektiv mit einem oder beiden
Rezeptoren transfiziert werden. Rezeptorspezische Liganden, natürlich vorkommende oder
durch Mutagenese erzeugte, werden häufig verwendet, wenn beide Rezeptoren im jeweiligen
Zellmodell vorhanden sind. Gegen beide Rezeptoren existieren funktionsblockierende monoklonale Antikörper, so daß trotz rezeptor-unspezifischer Liganden jeweils ein Rezeptor
ausgeschaltet werden kann. Außerdem werden verschiedene schimäre Rezeptoren verwendet, bei denen dann die Funktion der intrazellulären Domänen miteinander verglichen werden können, wenn mit dem heteroliganden stimuliert wird.
Im adulten Organismus vermittelt der VEGFR2 wachstums-, migrations- und differenzierungs-fördernde Signale in allen untersuchten Systemen (Übersicht in Matsumoto und
Claesson-Welsh 2001). Dem VEGFR1 werden sehr unterschiedliche Funktionen zugeordnet.
In Monozyten vermittelt er Migration (Barleon et al. 1996, Clauss et al. 1996). Er kann
inhibitorisch auf die VEGFR2-vermittelte pro-angiogene Signaltransduktion (Rahimi et al.
2000, Bussolati et al. 2001, Zeng et al. 2001, Zeng et al. 2002) wirken. Bei Stimulation mit
PlGF kann er jedoch auch Angiogenese-fördernde Signale übermitteln (Hiratsuka et al. 2001,
De Falco et al. 2002, Luttun et al. 2002a, 2002b). Die Rolle des VEGFR1 ist daher noch
immer unklar und scheint stark abhängig vom Kontext (Faktor, Zellsystem, Zellzustand) zu
sein. Eventuell über nimmt der VEGFR1 die Feinabstimmung des VEGF-PlGFSignalsystemes in unterschiedlichen Situationen bei physiologischer und pathologischer
Angiogenese.
Die unterschiedlichen Funktionen der Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 haben
auch Implikationen für eine mögliche VEGF-Rezeptor-gezielte Tumortherapie. In Astrozytomen (Grad I bis IV) ist der VEGFR1 im Tumor-Endothel hochreguliert, während er in
normalem Gehirn-Endothel nicht nachweisbar ist (Plate et al. 1992). Parallel dazu ist auch
die mRNA für den Liganden VEGF in Astrozytomen hochreguliert, was die Voraussetzung
für eine übermäßige Aktivierung des VEGF-Rezeptors schafft. Während das Tumorgewebe
Einleitung
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selbst häufig VEGFR2 expremiert, so finden sich im Tumorendothel beide VEGFRezeptoren. Im Kaposi-Sarkom, einem vaskulären bösartigen Weichteil-Tumor, wird in den
Tumorzellen nur VEGFR2 expremiert, in den Endothelzellen der Stroma-Blutgefäße des
Tumors und in Blutgefäßen in der Nachbarschaft des Tumors neben VEGFR2 auch
VEGFR1 (Brown et al. 1996).
Neuropiline
VEGF bindet weiterhin an Rezeptoren der Neuropilin-Rezeptor-Familie, Glykoproteine der Zelloberfläche ohne intrazelluläre Enzymaktivität. Im Unterschied zu den VEGFRezeptortyrosinkinasen binden sie VEGF im Bereich von Exon 7. Neuropiline sind schon
seit längerem bekannt als Semaphorin-Rezeptoren und spielen eine Rolle bei der AxonFührung in der Neuronalentwicklung. Bei der VEGF-Signaltransduktion ist eine Aufgabe der
Neuropiline Ko-Rezeptoren, vor allem für VEGFR2, zu sein (Soker et al. 1998). Ihre genaue
Funktion bei der Signaltransduktion ist noch weitgehend unklar.
VEGFR3/Flt-4
Der Tyrosinkinase-Rezeptor VEGFR3 (Flt-4) kommt vor allem auf lymphatischen
Endothelzellen vor. Während der Entwicklung wird er mit VEGFR1 und VEGFR2 auf Vorläufer-Endothelzellen expremiert, im reifen Blutgefäßsystem aber nur noch auf LymphEndothel. Liganden vom VEGFR3 sind VEGF-C und VEGF-D. Er vermittelt mitogene und
Differenzierungssignale für das Lymph-Endothel und spielt eine Rolle bei der Lymphangiogenese. Eine Ausschaltung des VEGFR3 wirkt sich nicht so sehr auf die frühe Vaskulogenese als vielmehr auf die Entwicklung von Herz und von primären Gefäßplexus aus (Dumont et al. 1998).
1.1.3
Tumorangiogenese und VEGF
Um eine ausreichende Nährstoff- und Sauerstoffversorgung zu erhalten, versucht der
Tumor Anschluß an das Blutgefäßsystem zu bekommen. Dazu reguliert der Tumor die Angiogenese-Stimulatoren hoch und die Angiogenese-Inhibitoren herunter, was auch als angiogenic switch bezeichnet wird (nach Hanahan und Folkman 1996). Viele Tumore schütten
VEGF in hohen Konzentrationen aus, darunter Tumore in Lunge, Brust, Urogenitaltrakt,
Gastrointestinaltrankt und Gehirntumoren (Übersicht in Ferrara 1999). Die neugebildeten
Blutgefäße im Tumor sind oft mangelhaft ausgebildet und zeigen eine erhöhte Permeabilität.
Teilweise fehlen auch weitere Gefäßbestandteile, wie die glatte Muskelschicht der GefäßMedia. Der wichtigste Stimulus für die VEGF-Sekretion durch den Tumor ist vermutlich die
Hypoxie (Abb. 1.3). In Glioblastomen wurde eine besonders hohe VEGF-Produktion in Tumorregionen um fokale Nekrosen und auch eine daraus resultierende Konzentration von
Kapillaren in diesen Arealen gefunden (Shweiki et al. 1992). Die VEGF-mRNA ist dort
deutlich hochreguliert, während sie in normaler weißer Gehirnmasse nicht nachweisbar ist
(Plate et al. 1992).
Seite 14
Einleitung
Abbildung 1-3: Schematische Darstellung der Vorgänge bei der Tumorangiogenese (Yancopoulos et al. 2000).
Obwohl Endothelzellen VEGF sekretieren können, wird das bei der Vaskularisierung des Tumors wirkende VEGF in der Regel hauptsächlich von den Tumorzellen oder vom
Tumor-Stroma sekretiert. Eine Überexpression von VEGF in Tumoren ist allgemein prognostisch ungünstig. Die Hochregulation der VEGF-Synthese in Tumoren erfolgt hypoxieabhängig (Shweiki et al. 1992), teilweise hormonabhängig (z. B. durch Geschlechtshormone
in Brust- und Prostata-Krebs) und durch Zytokine (EGF, TGF-β, PDGF). In einigen Fällen
gibt es autokrine Loops, bei denen sich Zellen selbst durch VEGF zu weiterer Ausschüttung
stimulieren. Dies wurde als Mechanismus der Überlebensförderung in hämatopoietischen
Stammzellen gezeigt (Gerber et al. 2002), findet aber wahrscheinlich auch bei anderen Zellen statt. An der intrazellulären Regulation solcher autokriner Loops können mehrere Faktoren beteiligt sein: Im Tumor produziertes Stickstoffmonoxid (NO) fördert die VEGFFreisetzung aus verschiedenen Zellen (Dulak und Jozkowicz 2003), während VEGF wiederum die NO-Freisetzung stimulieren kann (Dembinska-Kiec et al. 1997). Ähnlich werden Ras
und VEGF reziprok reguliert: VEGF führt in verschiedenen Zellen zur Ras-Aktivierung, die
wiederum die VEGF-Freisetzung hochregulieren kann.
Neben der Wirkung auf die Endothelzellen im Tumor stimuliert VEGF auch das
Wachstum der Tumorzellen selbst, wenn diese VEGF-Rezeptoren expremieren. Außerdem
fördert es die Metastasierung von Tumorzellen über eine Expression der Proteine, die als
Wegbereiter für die Zellwanderung von Endothelzellen dienen, z. B. Gewebe-PlasminogenAktivator, Urokinase-Plasminogen-Aktivator, Kollagenasen, Matrix-Metalloproteinasen.
Einleitung
Seite 15
1.2 Die Rolle von NO in Endothelzellen
1.2.1
Funktion und Synthese von NO
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiger Mediator in verschiedenen Systemen: im
Blutgefäßsystem, im Nervensystem und im Immunsystem. Seine Produktion und Ausschüttung wird unterschiedlich reguliert und seine Effekte hängen vom jeweiligen Zellsystem
(Zielzellen und Wirkmechanismus) ab. Das Endothel beeinflußt durch Freisetzung vasoaktiver Substanzen die Gefäßweite und Durchblutung. NO ist ein solcher vasodilatierender Faktor (früher auch EDRF = endothelium derived relaxing factor). Endotheldysfunktion als
Voraussetzung für krankhafte Veränderungen des Herz-Kreislaufsystemes wird charakterisiert durch ein Ungleichgewicht vasodilatierender (NO, Prostaglandin I2) und vasokonstriktorischer (Endothelin-1, Angiopoietin-II) Faktoren (Übersicht bei Cannon 1998). Wichtige
im Blut zirkulierende Faktoren, die die Endothelzellen anregen, NO auszuschütten, sind
Hormone (Acetylcholin, Histamin, Bradykinin), Sympathikus-Aktivierung (Katecholamine),
Thrombozyten-Produkte (Serotonin) und mechanische Stimulation (Scherstreß). Das ausgeschüttete NO wirkt in der Zielzelle, der glatten Muskelzellen der Gefäßmedia, auf die zytosolische Guanylatcyclase und führt so zum Anstieg der intrazellulären cGMP-Konzentration,
die über Aktivierung cGMP-abhängiger Proteinkinasen und Erniedrigung des intrazellulären
Calcium-Spiegels relaxierend wirkt.
NO wird in Gegenwart von Sauerstoff in einer 5-Elektronen-Oxidation eines der
Guanidino-Stickstoffe der Aminosäure Arginin, die dadurch zu Citrullin umgesetzt wird,
durch NO-Synthasen (NOS) gebildet. Von den Häm-haltigen NO-Synthasen gibt es konstitutive Formen, wie z. B. die neuronale und endotheliale NOS (nNOS=NOS1, eNOS=NOS3),
und induzierbare Formen, wie z. B. die induzierbare NOS (iNOS=NOS2). Um die Freisetzung von NO zu unterdrücken, können kompetitive Arginin-Analoga eingesetzt werden
(L-Name, L-NMMA, L-NIO etc.). Deren Effekte können durch Zugabe von Arginin aufgehoben werden.
1.2.2
Regulation der NO-Synthese und –Ausschüttung:
Die Regulation der endothelialen NO-Synthase eNOS kann Ca2+-Calmodulin abhängig erfolgen, durch Veränderung der zellulären Lokalisation (über Interaktion mit Scaffolding-Proteinen wie Caveolin) und über Phosphorylierung durch Proteinkinasen (Akt). Acetylcholin und Bradykinin bewirken rezeptorvermittelt über einen Anstieg der endothelialen
intrazellulären Calcium-konzentration eine Erhöhung der NO-Synthese. Das Calcium zur
Regulation der eNOS über Calmodulin scheint eher aus intrazellulären Speichern zu kommen (Faehling et al. 2002), während dann das extrazelluläre Calcium in vitro zur Auffüllung
dieser Speicher von Bedeutung ist. In vivo ist die Regulation des Ca-Spiegels im Zusammenspiel intravasal – intrazellulär sehr viel komplexer. Die eNOS kann auch über Serinbzw. Threonin-Phosphorylierung durch verschiedene Kinasen reguliert werden. Akt/PKB
(Fulton et al. 1999, Dimmeler et al. 1999) und Src (Davis et al. 2001) aktivieren die eNOS
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Einleitung
durch Serin-Phosphorylierung, während die PKC die eNOS durch ThreoninPhosphorylierung vermutlich inaktiviert (Fleming et al. 2001). Die Lokalisation der eNOS
beeinflußt über Nachbarschaft zu regulatorischen Proteinen ihre Aktivierung. Die Lokalisation innerhalb von Caveolae, spezialisierten Mikrodomänen der Zellmembran, inaktiviert die
NOS durch Komplexierung durch negativ regulatorisches Caveolin-1 (Feron 1996).
Die Messung von NO ist anspruchsvoll, daß das gasförmige Molekül eine sehr kurze
Halbwertszeit hat. Danach reagiert es u. a. mit Luftsauerstoff zu Nitrit oder anderen Produkten ab. Die NO-Freisetzung von Zellen bzw. in Zellkulturüberständen wird daher meist indirekt über Nitritmessung, NOS-Aktivitätsmessung über radioaktive Substrate, Fluoreszenzfarbstoffen oder durch nachfolgende cGMP-Bildung gezeigt. Zur zeitaufgelösten Messung
können elektroanalytische Methoden eingesetzt werden. Hier werden vor allem
Metallporphyrinen-beschichtete Mikrosensoren aus Platin- oder Kohlenstoff-Elektroden
eingesetzt. An ihnen wird NO in verschiedenen elektronanalytischen Meßverfahren (Differentialpuls-Voltammetrie, Amperometrie) zu NO+ oxidiert. Der resultierende Oxidationsstrom ist dabei proportional zur freigesetzten NO-Menge. Durch Beschichtung mit
verschiedene Porphyrinen und verschiedenen Elektrodenmodifikationen kann die Spezifität
der Messung verbessert werden. Mit Porphyrin-beschichteten Mikrosensoren wurden NOMessungen an verschiedenen Zellen (Malinski und Taha 1992, Diab et al. 2003) und auch
Gewebeschnitten (Groppe et al. 2003) durchgeführt. Die Kalibrierung der Elektroden kann
mit gas-förmigem NO oder NO-freisetzenden Substanzen (NO-Donoren) durchgeführt werden. Da gebildetes NO rasch mit Luftsauerstoff abreagiert, ist für die Quantifizierung des
Signals der Abstand zwischen Elektrode und Zelloberfläche ein entscheidender Parameter
(Isik et al. 2004).
1.2.3
VEGF und Funktionen von NO in Endothelzellen
Untersuchungen mit NOS-Knock-Out-Mäusen (eNOS-/-) zeigen, daß NO ein wichtiger Mediator der Angiogenese ist. Bei Knockout der NOS beobachten Murohara et al.
(1998) eine verschlechterte Angiogenese in Ischämie-Arealen, die durch Gabe von VEGF
nicht verbesssert werden konnte. Die durch VEGF ausgelöste Vasodilatation durch NO wurde bereits 1993 durch Ku et al. (1993) gezeigt und danach mehrfach bestätigt.
NO vermittelt verschiedene Effekte: In hohen Konzentrationen führt es zu Zelltod
bzw. Apoptose. Dies geschieht im Immunsystem nach Freisetzung von NO durch Makrophagen, die iNOS expremieren. Auch in Endothelzellen wurden proliferationsinhibitierende Wirkungen des NO beschrieben (Bussolati et al. 2001). Im Gegensatz dazu
gibt es viele Hinweise auf den angiogenen und überlebensfördernden Einfluß von NO. Erhöhte NO-Syntese durch eNOS und cGMP-abhängige Gen-Transkription führen in Kapillarendothelzellen zu Zellwachstum und Differenzierung (Morbidelli et al. 2003). Eine Erhöhung der NO-Synthese kann zu vermehrter Angiogenese und zu reduziertem Zellschaden
durch entzündliche Prozesse führen, eine Erniedrigung über NOS-Inhibitoren oder NOFänger kann Angiogenese z. B. als adjuvante Tumortherapie unterdrücken.
Einleitung
Seite 17
Der vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor VEGF führt auch zur NO-Ausschüttung,
die in Langzeitmessungen an primären HUVEC maximal nach einer Stunde und 24 Stunden
war. Zusätzlich wird durch Langzeitstimulation auch die Expression der eNOS dosis- und
zeitabhängig hochreguliert (maximal nach neun Stunden nach Stimulationsbeginn)
(Hood et al. 1998).
1.3 Anti-Angiogene Therapie
Die anti-angiogene Therapie zielt auf eine Blockade der Endothelfunktionen bis hin
zum Absterben des Endothels (Review Folkman 1998; Libutti und Feldman 2002; Keshet
und Ben-Sasson 1999). Generell lassen sich nach Folkman (1998) lokale und systemische
sowie direkte und indirekte antiangiogene Therapien unterscheiden. Die direkte antiangiogene Therapie greift an den Endothelzellen an, die indirekte greift in die Produktion der
angiogenen Faktoren durch den Tumor ein oder an den Rezeptoren für die angiogenen Faktoren an.
Vorteile der antiangiogenen Tumortherapie sind:
•
•
•
•
•
geringe oder fehlende Toxizität, keine schwerwiegenden Nebenwirkungen (ev. Wundheilungsstörungen, Ausbleiben der Menstruation, Embryonen-Entwicklungsstörungen)
keine Permeation in den Tumor, die Tumorzelle oder durch die Blut-Hirn-Schranke notwendig
Tumor-Heterogenität bedeutet keine Wirkungseinschränkung
Unabhängig von Histo- oder Genotyp des Tumors
Keine erworbenen Arzneimittel-Resistenzen bekannt (wahrscheinlich aufgrund des geringen Mutationspotentials der Endothelzellen) (Boehm et al. 1997)
Als Nachteile ergeben sich allgemein:
•
•
•
Chronische Behandlung notwendig, um Tumor dauerhaft zu unterdrücken
Substanzen häufig teuer, schwierig herzustellen, wenig haltbar, nicht für orale Anwendung geeignet
Verabreichung als Bolus eher ungünstig; idealerweise als Perfusion.
Die Nachteile können prinzipiell durch therapeutischen Gen-Transfer von rekombinanten antiangiogenen Substanzen, die dann im Patienten hergestellt werden und auch wirken, umgangen werden – mit allen Risiken des Gen-Transfers.
Denkbar ist der Einsatz von Angiogenese-Inhibitoren zur Vor- oder Nachbehandlung
zur chirurgischen Resektion des Tumors (neoadjuvant oder adjuvant), bei Metastasen auch
als Dauertherapie denkbar. Die anti-angiogene Therapie läßt sich in Kombination mit Chemo- oder Strahlentherapie einsetzen. Die Kombination von konventioneller Chemotherapie
mit Angiogenese-Inhibitoren ist wirksamer als jede der beiden Substanzengruppen alleine
(Teicher et al. 1994). Auch in Verbindung mit der Bestrahlung kann die zusätzliche antiangiogene Therapie den Behandlungserfolg verbessern. Die Regulation der Apoptose von
Endothelzellen in den kleinen tumorversorgenden Blutgefäßen spielt bei der Strahlensensitivität eine Rolle, wie in Fibrosarkom- und Melanom-Tumorimplantationsmodellen gezeigt
wurde (Garcia-Barros et. al. 2003). Der mikrovaskuläre Schaden, der durch Bestrahlung, vor
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Einleitung
allem im Niedrig-Dosis-Bereich (20 Gy) verursacht wird, könnte ein Schlüsselmechanismus
der Strahlenwirkung sein, neben der bisher allgemein als wesentlich angenommenen Wirkung auf Tumor-Stammzellen. Die wichtige Rolle des Endothels bei der Strahlenwirkung
wurde auch indrekt über eine Wirkungsverstärkung der Strahlentherapie durch zusätzliche
anti-VEGFR2-Antikörper in Tumormodellen für kleinzellige Lungentumore und Glioblastome gezeigt (Kozin et al. 2001).
1.3.1
Anti-angiogene Tumortherapie über den VEGF-Signalweg
Nach der Entdeckung (Senger et al. 1983) und der Klonierung von VEGF
(Leung et al. 1989) begann die Suche nach Therapie-Optionen gegen VEGF. Tabelle 1.1
zeigt eine Übersicht von vorgestellten Therapie-Ansätzen mit unterschiedlichen Zielen in der
VEGF-Signaltransduktionskette und unterschiedlichen Anwendungsformen. Neben VEGF
können die VEGF-Rezeptoren extrazellulär durch Antikörper oder kompetitiv durch zirkulierende lösliche Rezeptor-Ektodomänen blockiert werden. Weiterhin können TyrosinkinaseInhibitoren, die als kleine Moleküle oft auch oral anwendbar sind, zur Inhibition von einem
oder beiden VEGF-Rezeptoren eingesetzt werden.
Tabelle 1-1: Anti-angiogene Therapieansätze gegen VEGF oder die VEGF-vermittelte Signaltransduktion. In kursiv: Therapien, die Gen-Transfer benötigen.
Strategien der anti-angiogenen Therapie
Neutralisierende Antikörper gegen angiogene
Faktoren: VEGF (Avastin®)
Neutralisierende Antikörper gegen VEGFRezeptoren: gegen VEGFR2
Dominant negative Rezeptoren:
VEGFR2 ohne Kinase-Domäne
Lösliche VEGF-Rezeptoren:
Ektodomäne von VEGFR1 (sFlt-1)
Tyrosinkinase-Inhibitoren:
gegen VEGFR2
gegen VEGFR1 + VEGFR2
Anti-sense VEGF
Anwendungsform
i. v.
Referenz
Kim et al. 1993
i. p. (Xenograftmodell)
i. p. (Xenograftmodell)
Retrovirus
Prewett et al. 1999
Brekken et al. 2000
Millauer et al. 1996
In vitro transfection
Adenovirus
Oral
ZD4190
SU5416
PTK787/ZK222584
Adenovirus
Adeno-associated virus
Goldman et al. 1998
Kong et al. 1998
Wedge et al. 2000
Fiedler et al. 2003
Wood et al. 2000
Im et al. 2001
Nguyen et al. 1998
Bereits 1993 wurde ein monoklonaler Antikörper vorgestellt (Kim et al. 1993), der
in präklinischen Modellen wirksam Tumorangiogenese und –Wachstum unterdrückt. 1997
starteten klinische Studien mit einer humanisierten Form des anti-VEGF-Antikörpers (Bevacizumab, rhuMAb-VEGF, Avastin®, Genentech). 2003 lagen die Ergebnisse vom ersten
Endpunkt einer Multizenter-Studie Phase III mit Patienten mit metastasiertem kolorektalem
Karzinom vor (Dtsch Med Wochenschr 2004), die eine Verlängerung der medianen Überlebenszeit von ungefähr 5 Monaten auf 20 Monate bei zusätzlicher Bevacizumab-Gabe zeigten
(in Kombination mit Irinotecan + 5-Fluorouracil/Folinsäure als Bolus = IFL-Regime). Ebenso war das progressionsfreie Überleben ungefähr 4 Monate länger als bei der IFL-Gruppe
ohne Bevacizumab (6,2 Monate). Bemerkenswert ist die gute Verträglichkeit der Bevacizumab-Therapie, deren häufigste schwerwiegenste Nebenwirkung eine höhergradige, pharmakologisch beherrschbare Hypertonie ist. Erklären läßt sich diese durch eine verringerte NO-
Einleitung
Seite 19
Freisetzung infolge der VEGF-Blockade, da VEGF die NO-Freisetzung fördert. Weitere
klinische Studien mit Bevacizumab laufen mit metastasierten Brust-, Nierenzell-, nichtkleinzelligen Lungen-Karzinom-Patienten. Modifikationen von Bevcizumab in der Form von
Antikörper-Fragmenten (rhuFAB V2, Lucentis®, Genentech) werden außerdem bei NichtTumorerkrankungen, wie der altersabhängigen Macula-Degeneration getestet.
1.3.2
Anti-Angiogene Gen-Therapie
Ein Vorteil des gentherapeutischen Transfers von antiangiogenen Molekülen wäre
die eigenständige Produktion dieser Therapeutika im und durch den Patienten (Übersicht in
Libutti und Feldman 2002). Die Infektion von Zellen durch die viralen Vektoren, nackte
DNA oder liposomalen Gen-Transfer kann prinzipiell abseits vom Tumor in gut zugänglichen Geweben erfolgen oder auch im Tumor selbst. Optimale biologische Effekte erzielt
man durch zielgerichtete Expression im Endothel durch entsprechende Modifikationen der
Vektoren. Alle ausschließlich oder vorwiegend im Endothel oder Tumorendothel expremierten Gene mit ihren Promotor- und Enhancer-Sequenzen sind potentiell verwendbare Zielrichtungsinstrumente (Übersicht in StCroix et al. 2000). Für den Endothelzell-spezifischen
Gentransfer wurden bisher folgende eingesetzt: Liu et al. (2000) modifizierten die Hüllproteine der eingesetzten retroviralen Vektoren durch Einfügen des ngR-Motives (9. Typ IIIRepeat von Fibronectin), die dann bevorzugt das Endothel infizierten. Gordon et al. (2000)
fügten den Hüllen der retroviralen Vektoren das vWF-Kollagen-Bindungsmotiv hinzu, um
nach Portalveneninfusion ebenfalls hauptsächlich Endothel-, Stroma- und Tumorzellen in
Lebermetastasen zu infizieren. Auch durch Ersetzen von Enhancer-Sequenzen durch endothelspezifische Promotoren konnte die zielgerichtete Expression von transferierten Genen
erreicht werden, so durch Pepro-Endothelin-1-Promotoren (Mavria et al. 2000) oder durch
hypoxie-responsive Element der PGK-1 (Phosphoglyzerat-Kinase1) (Modlich et al. 2000),
der V-CAM (vascular cell adhesion molecule) NFκB-Bindungsequenz sowie des
VEGFR2/KDR-Promotors. Die Gruppe um Breier und Risau (Kappel et al. 1999) identifizierte auch den VEGFR2-Promotor- und Enhancer-Bereich als endothelspezifische Expressionskontrolle. Allerdings ist die Expression von VEGFR2 nicht streng auf Endothelzellen
begrenzt, sondern auch in Neuronen (Sondell et al. 1999) und hämatopoetischen Stammzellen möglich. Bisher erfolgreich eingesetzte Gene, die für die angiogene Therapie transferiert
werden, sind: Angiogenese-Inhibitoren (Angiostatin, Endostatin), Interleukine und Interferone, Matrixmetalloproteinase-Inhibitoren (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases
TIMP) und verschiedene Proteine oder Antisense-Sequenzen gegen VEGF oder seine Rezeptoren (s. unter 1.3.1).
Intrazellulär wirksame rekombinante anti-angiogene Substanzen können effizient
über virale Vektoren expremiert werden (Übersicht in Tab. 1.2). Eine weitere GentransferMöglichkeit stellt die Transfektion mit DNA-Calciumphosphat-Präzipitaten (Graham und
Van der Eb 1973) dar. Die Methode läßt sich einfach anwenden und wurde anfänglich auch
mit guten Erfolgen in vivo im Tiermodell angewendet (Dubensky et al. 1984; Bevenisty und
Reshef 1986). Aufgrund der größeren Transfer-Effizienz und der besseren Standardisierbar-
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Einleitung
keit von neueren Methoden (chemische Transfektionsreagenzien und virale Vektoren) wird
die DNA-Calciumphosphat-Präzipitation mittlerweile hauptsächlich für spezielle Anwendungen eingesetzt, z. B. zur direkten Tumorinjektion bei Melanomen in Mäusen (Vile und
Hart 1993).
Tabelle 1-2: Charakteristika von viralen Vektoren (modifiziert nach Kuo et al. 2002)
Virus Type
Retrovirus
Adenovirus
Adenovirus-assoz.
Viren
Lentiviren
Infektion
von ruhenden
Zellen
Nein
Ja
Ja
Genomische
Integration
Expressionsdauer
Expressionsniveau
Antivirale
Immunantwort
Ja
Nein
Ja/nein
Jahre
Wochen
Jahre
+
++++
+
Nein
Ja
Nein
Schwierigkeit der
Herstel-lung
des Vektors
+
+
+++
Ja
Ja
jahre
+
nein
+++
1.4 Ras in Tumorzellen und bei der Tumorangiogenese
1.4.1
Struktur und Funktion von Ras
Wachstumsfaktorrezeptor
Die Ras-Protoonkogene sind eine Familie von evolutionär konservierten
21 kDa kleinen GTP-bindenden Proteinen. Sie gehören zusammen mit Rap,
Rho/Rac, Rab, Ran und Arf in eine Superfamilie (Bourne et al. 1991). In Säugerzellen gibt es drei Ras-Isoformen:
Kirsten-/Ki-/K-Ras, Harvey-/Ha-/H-Ras,
Neuroblastoma-/N-Ras. H-Ras und K-
Ras wurden in Retroviren gefunden, die
Sarkome auslösen. Ras spielt eine zentrale Rolle bei der zellulären Signaltransduktion und vermittelt Proliferations- und Differenzierungssignale von
Abbildung 1-4: Schematische Darstellung des
Ras-Funktionszyklus
verschiedenen Wachstumsfaktoren. Ras
funktioniert als molekularer Schalter, indem seine Konformation zwischen der inaktiven
GDP-gebundenen Form und der aktiven GTP-gebundenen Form wechselt. Verschiedene
Proteine beeinflussen den Funktionszyklus zwischen GPD- und GTP-Form. GTPaseaktivierende Proteine (GAP) verkürzend die Dauer des aktiven GTP-Zustandes und beenden
das Signal. Ras hat eine intrinisische GTPase-Aktivität, deren Hydrolyse-Geschwindigkeit
ohne Beschleunigung durch ein GAP jedoch sehr gering ist. Als Ras-GAP wirken Neurofibromin und p120-GAP. Als aktivierende Proteine fungieren die GTP-Austausch-Faktoren
(guanine nucleotide exchange factor GEF), die die GDP-Dissoziation fördern, damit dann
Einleitung
Seite 21
durch GTP-Bindung Ras schneller in den aktiven Zustand überführt wird. mSos ist ein solches Ras-GEF.
Die strukturellen Grundlagen der Schalterfunktion mit den Konformationsänderung,
dem Hydrolysemechanismus und der Wirkung der GAP-Proteine wurden im Detail aufgeklärt (Pai et al. 1989, Pai et al. 1990, Wittinghofer et al. 1993, Scheffzek et al. 1997). Die für
GTP-Bindung und –Hydrolyse essentiellen Aminosäuren befinden sich innerhalb der ersten
86 Aminosäuren, die zwischen den Ras-Isoformen identisch sind. Dabei werden besondere
Regionen hervorgehoben, die an der Nukleotidbindung sowie an GAP- bzw. EffektorInteraktionen beteiligt sind (Wittinghofer und Pai 1991):
Aminosäure
Loop
Bezeichnung
10-15
26-36
L1
L2
59-64
L4
P-Schleife
Schalter I (switch I),
Effektorschleife
Schalter II (switch II)
Häufige Mutation
G12, G13
Q61
Im angeschalteten GTP-gebundenen Zustand kann Ras mit Effektoren interagieren
und seine Signale auf diese übertragen. Wichtige Ras-Effektoren sind Raf, RalGDS, PI3K.
Onkogene Mutationen führen über eine Verlängerung des GTP-gebundenen Zustandes zu
einer konstitutiven Aktivierung.
Eine wichtige Voraussetzung für die Ras-Funktion
ist seine Membranlokalisierung. Die Membranverankerung von allen Ras-Isoformen erfolgt im hypervariablen cterminalen Proteinanteil. Alle Ras-Isoformen werden
durch eine Farnesylierung modifiziert. Die am
C-Terminus vorhandene sog. CAAX-Box dient als Erkennungssequenz für die Farnesyltransferase. Nach Anhängen
des Farnesylrestes an das Cystein werden die drei
C-terminal gelegenen Aminosäuren abgespalten (Gelb
1997). Zur korrekten Plasmamembran-Verankerung ist
noch eine weitere Modifikation notwendig. Bei allen Ras-
Abbildung 1-5: Struktur von
Ras (Pai et al. 1989, 1990).
Isoformen außer Ki-Ras4B finden zusätzliche Palmitylierungen an c-terminalen Cysteinen statt. Bei KiRas4B erfolgt die Membranassoziation durch
einen basischen Polylysin-Teil in der c-terminalen Proteinsequenz. Die Lipidmodifikationen
und Membranlokalisierungs-Signale führen zu einer unterschiedlichen Regulation des intrazellulären Transportes der einzelnen Isoformen (Übersicht in Magee und Marshall 1999;
Hingorani und Tuveson 2003). Wichtige Unterschiede zwischen den Ras-Isoformen sind u.
a. die Passierung des Golgi-Apparates und die Zielrichtung in die Lipid Raft-Mikrodomänen.
Ras spielt auch eine Rolle bei der normalen Entwicklung des Blutgefäßsystemes, der
Vaskulogenese: p120GAP-Knockout-Mäuse, denen die Möglichkeit zur schnellen RasInaktivierung fehlt, können keine organisierten Gefäß-Netzwerke ausbilden (Henkemeyer et al. 1995). Sos1- und B-Raf-Knockout-Mutationen sind embryonal letal, es treten schwere kardiovaskuläre und Dottersack-Defekt auf (Wang et al. 1997, Wojnowski et al. 1997).
Seite 22
Einleitung
Mit Sos1 fehlt ein wichtiger GEF zur Aktivierung von Ras. B-Raf ist ein wichtiger Effektor
zur Weitervermittlung des Ras-Signales.
1.4.2
Ras in Tumorzellen
Zur Untersuchung der Rolle von Ras in Tumorzellen müssen zwei Situationen unterschieden werden, und zwar zum einen das Vorliegen von onkogenen Mutationen von Ras,
die zu einer kontinuierlichen Aktivierung führen, und zum anderen die Überexpression von
nicht-mutiertem Ras. Letzteres kann als Amplikation von normalen Ras-Genen in verschiedenen Tumoren vorkommen, z. B. bei Zervix-Karzinomen (Bos 1988).
Onkogene Mutationen von Ras kommen in humanen Tumoren relativ häufig vor,
nämlich bei etwa 20 – 30 % aller bösartigen Tumore (Übersicht in Hingorani und Tuveson
2003). Onkogene Mutationen von Ras betreffen spezifische Aminosäuren, vor allem Aminosäure 12, 13, 59, 61. Bei onkogenen Mutationen bleibt Ras in der aktiven Form. Die permanente Aktivierung des nachfolgenden Ras-Signalweges wird als frühes Ereignis bei der Initiierung eines neoplastischen Prozesses gesehen und tritt vermutlich ein, bevor der Prozess
maligne wird. Die Beteiligung von onkogenem Ras wurde bei kolorektalen und pankreatischen Adenokarzinomen, aber auch schon bei präkanzerosen Vorstufen von beiden Tumorformen, nämlich gutartigen Adenomen/Polypen sowie pankreatischen intraduktalen Läsionen (PIL) gefunden (Bos et al. 1987; Moskaluk et al. 1997). Bei Pankreas-Tumoren z. B.
tragen mehr als 90 % eine Ras-Mutation (Bos 1989). Neben den Adenokarzinomen von Kolorektum und Pankreas finden sich häufige Ras-Mutationen auch in Adenokarzinomen der
Lunge. Die mit Abstand häufigste Punktmutation ist die von Glycin12 in Asp (40 %), Val
(28 %), Cys (16 %), Ala (6 %), Arg/Ser (jeweils 5 %) (Abrams et al. 1996). Gerade bei den
Adenokarzinomen in Pankreas, Kolon/Rektum, Lunge, Endometrium und Schilddrüse ist die
Mutation in Glycin12 häufig.
Tabelle 1-3: Mutationshäufigkeit von Ras bei verschiedenen Tumor-Typen (nach Bos 1988, Bos
1989, Kiaris und Spandidos 1995, Abrams 2002). (*s. Referenzen in Bos 1988, Bos 1989)
Vorkommen von
Ras-Mutationen
Häufig:
Weniger häufig:
Selten:
Bei
Polypen/Adenomen von Kolorektum
intraduktalen Läsionen des Pankreas
Adenokarzinome in Pankreas
Adenokarzinome des Kolorektums
Adenokarzinome der Lunge
Papilläre/anaplastische Schilddrüsen-Karzinome
Melanome
hepatozelluläre Karzinome
Leukämien/Lymphome
[dabei ALL bzw. AML]
Harnblasen-Karzinome
Karzinome in Brust, Zervix, Ovar, Magen,
Esophagus; Glioblastome, Neuroblastome; Sarkome
Prozentzahl der Tumore mit
Ras-Mutation*
50 %
75 - 93 %
40 - 47 %
22 - 33 %
53 - 60 %
8 – 19 %
0 – 30 %
0 – 70 %
[0 – 18 % bzw. 11 – 70 %]
7 – 17 %
Die verschiedenen Tumortypen sind auch mit Mutationen von verschiedenen Isoformen assoziiert (Tab.1.4). Allgemein treten K-Ras-Mutationen häufig bei Tumoren epithe-
Einleitung
Seite 23
lialen Ursprungs (Adeno-Karzinom) auf, N-Ras-Mutationen eher bei Tumoren des hämatopoetischen Systems auf. H-Ras-Mutationen betreffen häufig Urothel-abgeleitete Tumorformen.
Tabelle 1-4: Mutierte Positionen und Isoformen (* prognosebestimmend nach Kiaris und Spandidos 1995)
Mutation in
(Ras-Isoform)
K-Ras
N-Ras
H-Ras
K-, H-, N-Ras
häufig/vorkommend bei
Adenokarzinome des Pankreas, Kolorektums*, der Lunge*, Endometrium*
Melanome, hepatozelluläre Karzinome, Leukämien*/Lymphome*
Karzinome der Niere, Harnblase, Magen*
Schilddrüsen-Karzinom (papillär/anaplastisch)
Komplizierter als bei den „spontan“ entstandenen Ras-Mutationen ist die Situation
bei chemisch induzierten Tumoren im Tiermodell. hier zeigt sich eine unterschiedliche Empfindlichkeit der verschiedenen Gene gegenüber den chemischen Karzinogenen bei primär
gleichem Tumortyp. Bei generell selten mit mutiertem Ras assoziierten Brust-Tumoren beim
Menschen (s. o.) treten bei 90 % der durch Methylnitrosylharnstoff, aber nur bei 20 % der
durch Dimethylbenz[a]anthracen induzierten Tumoren im Tiermodell H-Ras-Mutationen auf
(Sukumar et al. 1983, Zarbl et al. 1985). Die verwendeten experimentellen Tumormodelle
müssen daher sorgfältig auf die Übertragbarkeit der Aussagen auf natürlich vorkommende
Tumor überprüft werden. Häufig sind die auftretenden Mutationen charakteristisch für einen
direkten DNA-Schaden durch das einwirkende Agens. Die Mutationen sind daher auch oft
verschiedenen von den spontan entstandenen.
1.4.3
Ras in der Interaktion Tumorzelle und Tumorendothel
Hier sind besonders zwei Zusammenhänge interessant: Ras reguliert zum einen einen Prozesse in den Tumorzellen, die Auswirkungen auf das Tumorendothel haben. Zum
anderen wird Ras in den – zunächst noch normalen, später irregulären – Endothelzellen der
tumorversorgenden Blutgefäße durch Faktoren, die im Tumor vorhanden sind, aktiviert. Eine
gegen Ras gerichtete Therapie kann daher den Tumor oder das Tumorendothel betreffen.
Die kontinuierliche Ras-Überexpression oder Ras-Aktivierung in den Tumorzellen
hat Auswirkungen auf die Tumor-Wirt-Interaktionen. Ras reguliert das Expressionsniveau
von VEGF (Grugel et al. 1995, Rak et al. 2000, Rak und Kerbel 2001). Ras reguliert über die
Transkriptionsaktivität das Expressionsmuster der verschiedenen Isoformen mit (Tober et al.
1998) und kann so auch indirekt über das VEGF-Isoformen-Muster die Tumorangiogenese
und das Tumorwachstum beeinflussen (s. oben). Als Folge davon können sich die Vaskularisierung von Tumoren, die eine Ras-Transformation oder –Überexpression zeigen, und das
Ansprechen dieser Tumore auf Angiogenese-Inhibitoren von Tumoren ohne RasTransformation/-Überexpression unterscheiden. Einführung/Expression einer konstitutiv
aktiven Ha-Ras-Mutante in intestinalen Epithelzellen (IEC) führt zu einer Erhöhung der
VEGF-Sekretion und in vivo zur Befähigung der IEC zur Tumorbildung/Entwicklung der
Tumorigenizität der IEC im Tumorimplantationsmodell (Rak et al. 1995). Chin et al. (1999)
haben in einem Melanoma-Modell Hinweise darauf gewonnen, daß die kontinuierliche Ras-
Seite 24
Einleitung
Aktivierung (durch RasG12V) in Melanomzellen (also auf der Tumorzellseite) für diese
symbiotischen Interaktionen zwischen Tumorzellen und Wirts-Endothel benötigt wird, um
die Tumorblutgefäße stabil zu erhalten. Die Ras-Inhibition in Tumorzellen kann also Auswirkungen auf die Stabilität der Wirtsblutgefäße haben. Obwohl in vitro die
VEGF-Expression durch den Ras-Aktivitätszustand beeinflußt wird, konnten Chin et al. in
ihrem Melanom-Modell zeigen, daß die Tumorregression in vivo, die ohne kontinuierliche
Ras-Aktivierung erfolgt, nicht allein durch den Verlust der Ras-stimulierten
VEGF-Expression verursacht wird. So kann eine VEGF-Überexpression nicht die kontinuierliche Ras-Aktivierung hinsichtlich der Tumorerhaltung ersetzen. Dasselbe wurde von
Okada et al. (1998) in einem kolorektalen Tumormodell gezeigt. Obwohl die Regulation der
VEGF-Expression durch Ras klar belegt wurde, sowohl in vitro und in vivo (Arbiser et al.
1997, Rak et al. 1995), ist VEGF offensichtlich nicht der einzige Faktor, der zur Blutgefäßund Tumorerhaltung bei Ras-Überexpression/-Aktivierung führt. Die Ras-Transformation
reguliert nicht nur die Expression von VEGF, sondern allgemein das Verhältnis von Angiogenese-Inhibitoren und –Stimulatoren, was die Tumorangiogenese fördern kann.
In dem Melanom-Modell von Chin et al. (1999) wurden abhängig von der Induktion
der Ras-Expression auch eine Veränderung der Morphologie, von anaplastisch bis eher spindelzellig organisierten Melanomen, sowie eine Veränderung des Proliferationsindexes und
der Apoptose-Rate im Tumor beobachtet. Ähnliche Beobachtungen von Veränderungen der
Tumormorphologie und –malignität abhängig von Ras-Aktivierung/-Expression wurden bei
vaskulären Tumoren beobachtet (s. unter 1.7).
Die Ras-Aktivierung in den Endothelzellen des Wirts-Stromas spielt eine bedeutende
Rolle in der Antwort der Endothelzellen auf die angiogenen Stimuli durch den Tumor. Das
vom Tumor ausgeschüttete VEGF stimuliert in verschiedenen Endothelzellen die Aktivierung von Ras (Doanes et al. 1999, Yashima et al. 2001, Meadows et al. 2001). Dauerhaft
hohe VEGF-Konzentrationen, wie sie lokal im Tumor vorliegen, können daher auch in Endothelzellen zu einer konstitutiven Ras-Aktivierung durch ständige Stimulation der Wachstumsfaktor-Rezeptoren führen. Daß Ras dabei ein zentraler Regulator der Endothelfunktionen ist, wurde in verschiedenen Untersuchungen belegt: Ras-Aktivierung in kultivierten
Endothelzellen (HUVEC, HDMEC) kann Zellwachstum und Überleben ohne Zugabe von
Wachstumsfaktoren fördern (Rak und Kerbel 2001). Einbringen von konstitutiv aktivem Ras
in Endothelzellen verändert deren Phänotyp und führt ohne Wachstumfaktor-Stimulation
zum Ausbilden charakteristischer Strukturen auf Kollagen-Gelen (Meadows et al. 2004).
Damit die Tumorangiogenese initiiert wird, erfolgt eine Aktivierung des Endothels in der
Tumorumgebung (sog. angiogenic switch). An dieser Aktivierung ist Ras beteiligt. Umgekehrt blockiert eine Inhibition von Ras durch Expression von dominant negativem Ras (N17)
blockiert den proliferations- und migrations-fördernden Effekt von VEGF in HUVEC (Meadows et al. 2001).
Einleitung
1.4.4
Seite 25
Therapeutische Inhibition von Ras bei Tumorerkrankungen
1.4.4.1 Inhibitionsstrategien zur Ras-Inhibition in Tumoren
Ras ist ein interessantes Zielmolekül für eine mögliche Tumortherapie (Übersicht bei
Scharovsky et al. 1999). Für eine allgemeine oder mutationsspezifische Ras-Inhibition bei
vielen Tumortypen gibt es sehr viele potentielle Patienten, so z. B. geschätzt für die USA
allein mehr als 800.000 Krebskranke mit einer Mutation des Glycin12 (Abrams 2002). Eine
Übersicht von Inhibitionsmöglichkeiten gibt Tabelle 1.5. Viele Therapie-Optionen benötigen
Gen-Transfer.
Tabelle 1-5: Strategien und Angriffspunkte zur Inhibition von Ras
Ziel
Inhibition der korrekten
Lokalisation: Verankerung
in der Membran durch
Farnesylierung
Methoden
{mögliche Therapieformen}
Farnesyltransferase-Inhibitoren
{systemisch}
Rasspezifisch
ja
Isoformspezifisch
nein
Mutationsspezifisch
Nein
Inhibition der Expression
von Ras: Translation von
Ras-mRNA, Proteinbiosynthese
Ribozyme, anti-sense Nukleotide,
small interfering RNA
{Gentherapie; systemisch}
ja
ja
Ja
Inhibition der RasFunktion: GDP-/GTPAustausch, Effektorbindung
intrazelluläre Immunisierung
durch funktionsblockierende
rekombinante AntikörperFragmente
{Gentherapie; systemisch}
Auslösen der Immunantwort auf
körpereigene Zellen, die mutiertes
Ras expremieren
{aktive Immunisierung mit Peptiden, passive Immunisierung mit
Antikörpern; Gentherapie}
ja
bisher
nicht
bisher
nicht
?
?
Ja
Immunantwort auf TumorZellen
Eine Wirkstoffgruppe, die systemisch ohne Gen-Transfer gegeben werden kann, sind
die Farnesyltransferase-Inhibitoren, die die Membranverankerung von Ras unterbinden und
damit seine Funktion inhibieren. Die Farnesylierung kann über die Farnesyltransferase durch
Peptidomimetika (Goldstein et al. 1991) und Substratanaloga (alpha-Hydroxyfarnesylphosphonat ; Girgert et al. 1999) sowie über die Hemmung der Farnesylsynthese
durch Statine (HMG-CoA-Reduktase-Hemmer ; Girgert et al. 1994) gehemmt werden. Die
Wirkung von Farnesyltransferase-Inhibitoren (FTI) ist nicht auf Ras beschränkt, da viele
weitere
Proteine
(wie
z. B.
Rho,
nukleäre
Lamine)
FarnesyltransferaseErkennungssequenzen enthalten (Gibbs et al. 1997). Die verschiedenen Ras-Isoformen sind
unterschiedlich empfindlich in ihrer Funktion gegenüber Farnesyltransferase-Inhibitoren. In
Lungen- und Kolon-Karzinomen besonders häufig mutiertes K-Ras ist z. B. relativ unempfindlich gegen über FTI, trotzdem läßt sich das Wachstum von Lungen- und KolonKarzinomzellen durch FTI hemmen. Ein Vor- und Nachteil an FTI ist, dass neben Ras viele
weitere Proteine betroffen sind, die zur Malignität von Tumorzellen aber auch zur normalen
Funktion aller Zellen beitragen. Daher sind die Nebenwirkungen von FTI schwierig kalkulierbar, die Wirkungen gehen u. U. über die einer reinen Ras-Inhibition hinaus. Da die FTI
Seite 26
Einleitung
allgemein aber weniger Nebenwirkungen als die klassische Chemotherapie haben und nur in
hohen Dosen neuro- bzw. myelotoxisch sind, gibt es bereits PhaseI- und PhaseII-Studien
(Karp et al. 2001).
1.4.4.2 Rekombinante Anti-Ras-Antikörper
Viele der heute schon auf dem Markt oder in Entwicklung befindlichen rekombinanten Arzneimittel sind Antikörper, die Mehrheit von ihnen monoklonale oder auf monoklonalen Antikörpern basierende. Für die therapeutische Anwendung von rekombinanten Antikörpern im Menschen stellt die Maus-Herkunft der nach dem klassischen Verfahren hergestellten monoklonalen Antikörper ein immunologisches Abstoßungsrisiko dar. Daher werden
häufig schimäre Antikörper aus menschlichen und Maus-Immunglobulin-Domänen oder
humanisierte Antikörper, bei denen nur die antigen-bindenden Domänen aus dem Herkunftsantikörper in menschliche Immunglobulinsequenzen eingebaut wurden, hergestellt
(Abb. 1.6).
Abbildung 1-6: Rekombinante Antikörper und Einzelketten-Antikörper (scFv) in den verschiedenen Formen: monoklonaler Antikörper aus Maus, schimärer Antikörper mit Maus-/humanen
Sequenzen, humanisierter Antikörper mit Maus-CDR, humane Antikörper (rechte Abb. aus
Carter 2001). (CDR: Complementarity determining region, Fab: Fragment antigen-binding, FC:
fragment crystallizable).
Prinzipiell müssen zwei Wirkorte unterschieden werden, nämlich intrazellulär und
extrazellulär, die das Design des verwendeten Antikörpers mitbestimmen. Komplette Immunglobuline können gegen extrazelluläre Zielproteine eingesetzt werden. AntikörperFragmente können gegen extra- und intrazelluläre Zielproteine verwendet werden können.
Komplette Immunglobuline sind sekretorische Proteine und können extrazellulär an lösliche Faktoren und Extrazellulärdomänen von Rezeptoren und anderen Zelloberflächenproteinen binden und deren Funktion blockieren. Sie können auch die befallenen oder entarteten
Zellen spezifisch markieren, um ihre Zerstörung durch das körpereigene Immunsystem oder
über gekoppelte z. B. radioaktive oder zytotoxische Substanzen zu fördern (Review von
Carter 2001). Soll die Eliminierung von Antikörper-markierten Zellen durch das Immunsystem des Patienten erfolgen, so eignen sich komplette Immunglobuline besser, da die Zellen
des Immunsystems den Fc-Teil der Immunglobuline erkennen. Als Antikörper-Fragmente
Einleitung
Seite 27
werden antigen-bindende Fragmente (fragment antigen-binding Fab) und Einzelkettenantikörper (single chain fragment variable scFv) benutzt.
Für den therapeutischen Einsatz gegen extrazelluläre Zielmoleküle können Antikörper oder Antikörper-Fragmente nur intravasal über intravenöse Infusionen oder lokal durch
Injektion ins Zielgewebe verabreicht werden. Die Antikörperfragmente sind den kompletten
Antikörpern hinsichtlich der Extravasation überlegen, werden allerdings schneller renal ausgeschieden als die kompletten Immunglobuline. Bei intravasal gegebenen AntikörperFragmenten gegen extrazelluläre Zielmoleküle sind zwei Parameter wichtig: die Elimination
über die Niere und die Affinität des Antikörper-Fragments zum Zielmolekül. Bei intravasaler
Verabreichung muß die schnelle renale Ausscheidung durch zusätzliche Modifikation des
Antikörperfragmentes verzögert werden. Die Affinität des Antikörperfragmentes bestimmt
die Diffusion und Verteilung im Zielgewebe. Nach Adams et al. (2001) führt eine sehr hohe
Affinität (Grenze im nM-Bereich) zur eher ungünstigen Retention des therapeutischen Antikörperfragmentes im perivasalen Bindegewebe und zur unzureichenden Verteilung im Zielgewebe. Umgekehrt ist die schnelle renale Elimination bei einem gentherapeutischen Einsatz
von Antikörper-Fragmenten und der damit verbundenen Herstellung des Antikörpers im
Patienten ein Sicherheitsmoment, da eine Freisetzung des im Endothel oder im Tumor hergestellten Antikörperfragmentes in die Blutbahn ohne Effekt bleiben sollte, da das Fragment
rasch über die Niere ausgeschieden wird. Die klinische Einsetzbarkeit von rekombinant hergestellten und aufgereinigten Einzelkettenantikörpern wurde bereits gezeigt: Eine PhaseI/IIStudie zum klinischen Einsatz eines aus einer kombinatorischen Bibliothek ausgewählten
scFv wurde 1996 gegen den Tumormarker karcino-embryonales Antigen (CEA) veröffentlicht (Begent et al. 1996). Für die intrazelluläre Wirkung kann das Antikörperfragment in
den Zellen des Patienten nach Gentransfer der entsprechenden Sequenz hergestellt werden.
Dieses Konzept wird auch als intrazelluläre Immunisierung bezeichnet. In Experimenten mit
Zellkulturen können die Einzelkettenantikörper auch als Protein durch Mikroinjektion oder
Trituration appliziert werden.
Gegen Ras wurden verschiedene Antikörper entwickelt und erforscht. Zwei monoklonale anti-ras-Antikörper, von denen auch Einzelketten-Antikörper entwickelt wurden,
sind Y13-258 und Y13-259, von denen nur letzterer neutralisierend ist (Cochet et al. 1998).
Der monoklonale Antikörper Y13-259 (Furth et al. 1982) erkennt die Aminosäuren 63-73
(Sigal et al. 1986), die in der Switch II-Region (Aminosäure 60 -76) von Ras liegen. Er bindet an alle drei Ras-Formen. Y13-259 unterscheidet bei der Bindung an Ras nicht zwischen
mutiert - nicht-mutiertem und aktiviert – nicht aktiviert. Da der vollständige Antikörper Y13259 als sekretorisches Protein nicht intrazellulär wirkt, wurden für die intrazelluläre Expression aus den beiden antigen-bindenden Domänen VH und VL (Abb. 1.6) EinzelkettenAntikörper (scFv) konstruiert (Werge et al. 1990).
Bei Mikroinjektion des kompletten Y13-259 wurde die serum-stimulierte DNASynthese in NIH3T3 unterdrückt (Furth et al. 1982). Die Wirksamkeit von intrazellulär expremiertem anti-ras-scFv wurde in Zellkultur mit verschiedenen Tumorzellen und im Tumormodell mit Kolon-Karzinomzellen (Cochet et al. 1998) gezeigt. Zum Wirkmechanismus
des intrazellulär expremierbaren anti-ras-scFv, konstruiert aus dem Y13-259, können ver-
Seite 28
Einleitung
schiedene Faktoren beitragen, die teilweise aus experimentellen Daten und teilweise aus
molekulardynamischen Berechnungen
folgen: Y13-259 verhindert nicht die GDPAssoziation an Ras (Hattori et al. 1987), sondern vermutlich den GDP-GTP-Austauch und
die GTPase-Aktivität durch Einfrieren der Beweglichkeit der Switch II-Region. Über eine
sterische Behinderung kann auch eine Fixierung der ebenfalls an die NukleotidBindungstasche angrenzenden SwitchI-Region (Gallagher et al. 1996) durch den anti-rasscFv erfolgen und damit eine Behinderung der Interaktion mit Ras-Effektoren, gezeigt für
die Raf-Kinase (Lener et al. 2000). Außerdem erfolgt eine Dislokation des membrangebundenen Ras durch intrazelluläre Aggregation von Y13-259-scFv mit Ras (Lener et al. 2000,
Cardinale et al. 2001). Der anti-ras-scFv liegt bei intrazellulärer Expression bei 37 °C als
unlösliches Protein vor (Cochet et al. 1998).
Ziele von Optimierungsstrategien zum Einsatz des aus Y13-259 entwickelten Einzelketten-Antikörpers sind: die Entwicklung von scFv zur optimalen Erkennung des Epitops
Switch II über eine Phagen-Antikörper-Bibliothek (Persic et al. 1999), die bevorzugte Bindung nur der Konformation von aktivem Ras durch Selektion aus einer Phagen-Bibliothek
(Horn et al. 1999), der erhöhten Löslichkeit von anti-ras-scFv unter zellulären Bedingungen
durch molekulare Evolution (Cattaneo und Biocca 1999). Allgemein gilt, daß verschiedene
Einzelkettenantikörper für dasselbe Epitop sehr unterschiedliche, schwer vorhersagbare Eigenschaften aufweisen, z. B. die zelluläre Lokalisation und die lösliche Expremierbarkeit
unter zytoplasmatischen Bedingungen. Der nach Werge et al. (1990) hergestellte anti-rasscFv aus Y13-259 liegt vollständig in der unlöslichen Fraktion vor, während andere scFv
gegen dasselbe Epitop sowohl in der löslichen wie unlöslichen Fraktion von Zellextrakten
vorliegen (Lener et al. 2000). In dieser Arbeit wird auch gezeigt, daß die Affinität bei intrazellulärer Expression von anti-ras-scFv kein entscheidender Parameter für Inhibition der
Ras-Funktion ist. In dieser Arbeit wurden anti-ras-scFv mit einer Affinität von 4 bis
2000 nM getestet.
VH
VL
myc
Abbildung 1-7: Struktur von Ras (modifiziert aus Pai et al 1989, 1990). Zielsequenz des Y13259-abgeleiteten anti-ras-scFv ist rot markiert.
1.5 Endothelzellen und Endothelzell-Modelle
Untersuchungen der Endothelzellfunktion können an primären Endothelzellen verschiedener Herkunft durchgeführt werden. Häufig verwendete primäre Endothelzellen zeigt
Einleitung
Seite 29
Tabelle 1.6. Allen Zellen gemeinsam ist, dass die Zellen jeweils frisch präpariert und nur
wenige Passagen kultiviert werden können. Die jeweiligen Präparationen und Passagen zeigen teilweise deutliche Unterschiede zueinander. Wegen der kurzen Kultivierungszeit können in der Regel keine stabilen transgenen Zellinien hergestellt werden.
Tabelle 1-6: Typische primäre Endothelzellen zur Untersuchung von Endothelzellfunktionen.
Spezies
Rind
Zellherkunft
bovine Aorta-Endothelzellen
Abkürzung
BAEC
Mensch
Humane Aorten-Endothelzellen
Humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus Subkutan-Geweben:
Bauchfettgewebe
Brustgewebe
Humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus omentalem Bauchfettgewebe
Humane Lungen-Endothelzellen
Humane Nabelschnurvenenzellen
Humane Knochenmark-Endothelzellen
Maus Gehirn-Endothelzellen
porkine mikrovaskuläre Gehirn-Endothelzellen
porkine Aorta-Endothelzellen
HAEC
HMVEC
Maus
Schwein
HAMEC oder HuAMEC
HMMEC oder HuMMEC
HOMEC oder HuOMEC
HLEC oder HuLEC
HUVEC
BMEC
MBEC
PBMEC
PAEC
Endothelzellen stammen entwicklungsgeschichtlich aus dem Mesoderm ab (mesenchymale Herkunft). Die Stammzellen befinden sich auch im erwachsenen Organismus im
Knochenmark, können nachgebildet and an Orte des Bedarfs rekrutiert werden. Relativ weit
oben in der Differenzierungsreihe gehen Endothel- und Blutstammzellen auf eine gemeinsame Stammzelle, den Hämangioblasten, zurück. In den Geweben erfolgt eine starke Differenzierung und Spezialisierung der Zellen, je nach Größe, Art und Funktion des Gefäßes. So
unterscheiden sich die Zellen nach Herkunft aus arteriellen oder venösen, großen, kleinen
oder kapillären Gefäßen mit oder ohne Fenestrierung. Auf zellulärer Ebene unterscheiden
sich die verschiedenen primären Zellen auch in Faktoren, die für Signaltransduktionsuntersuchungen relevant sind: z. B. durch unterschiedliche Ausstattungen mit AngiogeneseFaktor-Rezeptoren (Hewett und Murray 1996) oder auch durch teilweise unterschiedliche
Signaltransduktionsprofile bei Stimulationsexperimenten mit dem gleichen AngiogeneseFaktor. Eine vergleichende Untersuchung der Aktivierung von MAPK und p38-Kinase in
humanen Endothelzellen aus drei verschiedenen Herkünften derselben Spezies (HUVEC,
HAEC, HMVEC) zeigt neben Gemeinsamkeiten auch Unterschiede zwischen den Zellen in
den Signalweg-Aktivierungen nach VEGF-Stimulation (Yashima et al. 2001). Daher sollten
für Untersuchungen in Zellkultur die verwendeten Modelle so nah wie möglich am ZielOrganismus und auch Ziel-Gewebe orientiert werden, da andernfalls die gefundenen Signalwege sich erheblich unterscheiden können.
Typische
immunzytologisch
bestimmbare
Endothelzell-Marker
sind
CD31
(PECAM-1), CD34, CD105, CD144 (VE-Cadherin), Integrin aVβ3 und der van-WillebrandFaktor. Außerdem können Endothelzellen spezifisch mit Ulex Europaeus Agglutinin I
(UEA-1) markiert werden, ein Lektin, das an alpha1-Fucosyl-Reste bindet (Hamid et al.
2003).
Seite 30
Einleitung
Um unabhängiger von der Präparation und den – je nach Spender – unterschiedlichen individuellen Eigenschaften der Zellkulturen zu sein, ist die Verwendung von humanen
immortalisierten Endothelzellen interessant, die experimentell aus einigen primären Zellen
z. B. durch Transfektion mit humaner Telomerase (hTert) immortalisiert werden können. Für
die Untersuchung der Tumorentstehung endothelzell-abgeleiteter Tumore (vaskuläre Tumorigenese) ist die Erzeugung transformierter humaner Endothelzellen interessant, Während
sich Maus-Zellen allgemein relativ einfach durch einen Transformationsschritt transformieren lassen (z. B. durch konstitutiv aktives Ras, Burns et al. 1991), ist die Transformation von
humanen Endothelzellen ist sehr schwierig, da mindestens drei Transformationsschritte notwendig sind, um die Zellen durch Transformation zu immortalisieren (Hamad et al. 2002).
MacKenzie et al. (2002) brachten schrittweise humane Telomerase (katalytische Untereinheit, hTERT), SV40 large T antigen und konstitutiv aktives N-Ras in humane KnochenmarkEndothelzellen (BMEC). Eine Transformation und Tumorigenizität im TumorImplantationsmodell zeigt sich nur nach Transduktion der Zellen mit allen drei Konstrukten.
Als vaskuläres Tumormodell sind diese Zellen auch problematisch, da sie infolge der Transformationsschritte die Expression von KDR, CD31 (P-CAM/PECAM) und van WillebrandFaktor verloren haben. Aus den genannten Gründen sind kaum erfolgreich experimentell
transformierte humane Endothelzellinien bekannt.
In dieser Arbeit wurden spontan transformierte humane NabelschnurvenenEndothelzellen verwendet (T-HUVEC oder nach dem Spender ECV-304). Die Zellen wurden 1984 von einer japanischen Arbeitsgruppe aus einer normalen HUVEC-Präparation
durch spontane Transformation innerhalb von drei bis vier Wochen nach Isolation erhalten
und weiter kultiviert (Takahashi et al. 1990). In Kultur zeigen sie lichtmikroskopisch eine
typische Pflasterstein-Morphologie. Sie expremieren an der Zelloberfläche endothelzelltypisch Angiotensin-Converting Enzyme (ACE). Takahashi et al. (1990) finden eine auf 32,9 h
verkürzte Verdopplungszeit in 10 % FCS – im Vergleich zu 89,3 h bei primären HUVEC in
20 % FCS. Primäre HUVEC zeigten im Gegensatz zu T-HUVEC Immunoreaktivität mit
Faktor VIII-Antikörpern in immunozytochemischen Färbungen. Zwei weitere im Endothel
vorkommende Marker (UEA-1, PHM5) werden sowohl bei HUVEC als auch bei T-HUVEC
gefunden. Im Rabbit-Cornea-Test, der die Freisetzung von angiogenen Faktoren zeigt, sind
die T-HUVEC leicht angiogen, während HUVEC nicht angiogen sind. Der Karyotyp von
T-HUVEC ist polyploid (73 – 84 Chromosomen). In bestrahlten athymischen Nacktmäusen
werden nach Subkutaninjektion Tumore erhalten (Takahashi et al. 1990), ebenso in
NOD/scid-Mäusen (Heath-Engel und Lingwood 2003).
Suda et al. (2001) weisen weitere endotheliale Marker in T-HUVEC nach: Expression von van-Willebrand-Faktor und Vimentin, Aufnahme von low-density-Lipoprotein
(LDL). Den T-HUVEC fehlt die Expression von endothelspezifischem VE-Cadherin und
PECAM-1 (CD31), die aber auch in PBMEC fehlen. Neben endothelialen Markern zeigen
T-HUVEC auch epitheliale Marker wie Cadherin, Cytokeratin 8 und 18 sowie Desmoglein.
In T-HUVEC wird der endothelzell-typische Plasminogen-Aktivator (PA) vom UrokinaseTyp (uPA) in sehr viel größerer Menge sekretiert als der vom Gewebe-Typ (tPA). Im Vergleich zeigten primäre HUVEC eine viel geringere Expression von beiden PA. Die Expressi-
Einleitung
Seite 31
on des ebenfalls endothelzell-typischen Plasminogen-Aktivator-Inhibitors (PAI-1) war sehr
viel stärker bei HUVEC als bei T-HUVEC (Takahashi und Sawasaki 1991). Eine Übersicht
über die Eigenschaften von T-HUVEC findet sich unter 4.1.1.
1.6 Tumor-Modelle
Zur Untersuchung bestimmter Tumor-Typen im Tiermodell gibt es mehrere Möglichkeiten. Zum einen können spontan entstandene Tumore untersucht werden, ähnlich wie
bei den menschlichen Tumoren. Dann können transgene Tier-Modelle mit genetischen Mutationen, die bestimmte Tumore begünstigen oder hervorrufen, untersucht werden. Hierbei ist
das verursachende Gen oder der betroffenen Signalweg aufgrund der vorhandenen Mutationen bekannt. Außerdem können Tumore durch Exposition der Tiere gegen chemische Agentien erzeugt werden. Die durch chemische Karzinogene erzeugten Tumore unterscheiden
sich häufig histomorphologisch, auf zellulärer Ebene (beteiligte Zellen, Differenzierung) und
auch auf molekularer Ebene (betroffene Gene, bestimmte Mutationen und Mutationsmuster).
Die dem Tumor zugrundeliegenden Zellen entstammen außerdem der Tiermodell-Spezies,
wobei wesentliche Unterschiede zu den Signalwegen in menschlichen Zellen während der
Tumorigenese bestehen können. Die Beteiligung von verschiedenen Ras-Mutationen an der
Transformation von Maus- und menschlichen Zellen scheint beispielsweise unterschiedlich
zu sein (Hamad et al. 2002). Die nach Implantation entstehenden Tumore können sich deutlich von natürlich entstandenen Tumoren aus denselben Ursprungszellen unterscheiden. Die
Tumorzellen aus den experimentell erzeugten Tumoren können aus dem Tumor wieder extrahiert und in Kultur genommen werden (Heumann et al. 1977).
Wegen der unterschiedlichen Faktoren bei der Tumorigenese von Zellen verschiedener Spezies kann es sinnvoll sein, Tumore aus humanen Zellen in vivo im Tiermodell zu
untersuchen. Dazu werden die Zellen in ein Tiermodell implantiert. Als Empfänger für Tumorimplantate (Xenograft) eignen sich nur immun-defiziente Tiere, wenn implantierten Zellen von einer anderen Spezies oder einem nicht immun-kompatiblen Spender stammen. Die
immundefizienten Tiere können die implantierten Tumorzellen nicht immunologisch abstoßen. Bei den Mäusen stehen verschiedene immundefiziente Stämme zur Verfügung: Nacktmäuse sind kongenital (nu/nu) athymische und haarlose Mäuse, die aufgrund der ThymusAplasie keine T-Lymphozyten und deshalb einen schweren kombinierten Immundefekt (ähnlich DiGeorge-Syndrom bei Menschen) haben. Die Nacktmäuse sind anfällig für bakterielle
und virale Infektionen und werden daher unter sterilen Bedingungen gehalten. Außerdem
können SCID-Mäuse, die einen kombinierten zellulären und humoralen Immundefekt haben,
für die Tumorimplantation verwendet werden, wie für die T-HUVEC von Heath-Engel und
Langwood (2003) gezeigt. Sie sind noch wesentlich empfindlicher und anfälliger als Nacktmäuse. Zusätzlich können die immundefizienten Tiere, die wie z. B. die Nacktmäuse noch
eine humorale Rest-Immunität aufweisen, noch bestrahlt werden.
Die Tumorzellen können zur subkutanen Injektion in Matrigel, einem Proteingel aus
extrazellulären Matrix-Proteinen, resuspendiert werden, um eine bessere Tumorangangsrate
Seite 32
Einleitung
und mit höherer Wahrscheinlichkeit eine Tumorbildung am Injektionsort zu erhalten. Die
Suspension in Matrigel trägt zur besseren Vaskularisierbarkeit der entstehenden soliden Tumore, vermutlich durch Vorbereitung eines Gefäßbettes bei (Bonfil et al. 1994). Außerdem
fördert das Matrigel eine Infiltration von mononukleären Zellen, was bei immundefizienten
Empfängertieren weniger von Bedeutung ist, sowie von Fibroblasten, die zur Organisation
der Tumormasse als Tumorstroma beitragen können. Beide Zellarten können wiederum die
Tumorangiogenese fördern, z. B. über bFGF oder TGF. In immunkompetenten Empfägertieren kann das Matrigel die Tumorzellen aber auch vor einer Immunabwehr schützen.
1.7 Endothelzell-abgeleitete Tumore
1.7.1
Einteilung und Systematik
Gefäßtumore gehören in die Gruppe der mesenchymalen bzw. Weichteil-Tumore.
Die bösartigen mesenchymalen Tumore werden allgemein als (Weichteil-)Sarkome bezeichnet, die je nach Differenzierung weiter unterteilt werden. Fehlt jede weitere Differenzierung
so liegt ein undifferenziertes Sarkom vor, das außer dem mesenchymalen Marker Vimentin
keine weiteren typischen Marker expremiert. Das undifferenzierte Sarkom wird nach der
Morphologie in Spindelzell-, Rundzell- und polymorphzelliges Sarkom unterteilt. Wichtige
Prognose-Parameter orientieren sich bei Sarkomen allgemein an dem Grad der histologischen Differenzierung, die Mitoserate sowie Vorkommen und Ausdehnung von Nekrosen,
wobei die Gewichtung der Parameter unterschiedlich erfolgt: Nach dem Trojani-Score (nach
Coindre (1993)) werden alle drei Parameter bewertet, nach der Graduierung nach Van Unnik
(1995) nur Mitosen und Nekrosen, nach Costa et al. (1984) sind die Nekrosen neben der
histologischen Gradierung besonders wichtig. In der Graduierung nach Coindre und van
Unnik werden die Parameter mit Punkten bewertet und die Grad-Einteilung anhand dieser
Punktbewertung vorgenommen (Grad I – III mit zunehmendem Malignitätsgrad). Makroskopisch zeigen Sarkome häufig einen „fischfleisch-artigen“ Aspekt.
Bei den Gefäßtumoren sind die gutartigen Tumore weit häufiger als die bösartigen.
Angiome, Hämangiome (sog. Blutschwamm) und Lympangiome, sind typische Beispiele
für gutartige Gefäßtumore (entgegen der Regel, daß –om einen gutartigen Tumor bezeichnet,
ist mit Hämangioendotheliom meist ein Tumor mit intermediärer Malignität gemeint, s. u.).
Die bösartigen Gefäß-Tumore (Angiosarkome) sind Häm-Angiosarkome, Lymphangiosarkome und Kaposi-Sarkome, die mit intermediärer Malignität Hämangioendotheliome. Hämangiosarkome sind seltene vaskuläre Tumore beim Menschen. Die entartete Zelle ist hier
die Endothelzelle selbst. Menschliche Angiosarkome werden vor allem in Leber, Herz, Muskel und Haut gefunden. Angiosarkome beim Menschen treten gehäuft nach Exposition mit
Thorotrast (radioaktives Angiographie-Kontrastmittel), Arsen bzw. Vinylchlorid auf (Latenzzeit 15 – 20 Jahre), dann vor allem in der Leber. Je nach vorherschender Histomorphologie wird das Angiosarkom als hochdifferenziertes oder epitheloides bezeichnet. Typische
Einleitung
Seite 33
Marker für Weichteilsarkome mit vaskulärer Differenzierung sind CD31 (PECAM-1), CD34
und Faktor VIII.
Bösartige Tumore
Mesechymale (Vimentin)
= Sarkom
Epitheliale (Keratin)
= Karzinom
Andere Zellherkunft bzw.
Differenzierung
undifferenziertes Sarkom
Sarkom mit vaskulärer Differenzierung
Andere Differenzierung
spindelzellig
Angiosarkom (CD31, CD34, Faktor VIII)
rundzellig
Kaposi-Sarkom
Polymorph-zellig
Hämangioendotheliom
Lymphangiosarkom
spindelzellig
Hämangiosarkom
Endovaskulär, papillär
(Dabska-Tumor)
epitheloid
Klassisch
hochdifferenziert
epitheloid
Abbildung 1-8: Schematische Übersicht der Einordnung von Weichteil-Sarkomen (modifiziert
nach WHO 1994, Leitlinien AMWF 2002).
1.7.2
Die Rolle von Ras bei Endothelzell-abgeleiteten Tumoren
Endothelzell-abgeleitete Tumoren wurden in menschlichen Tumoren und im Tiermodell auf die Häufigkeit von Ras-Mutationen untersucht. Die Histopathologie von menschlichen und von in Mäusen und Ratten erhaltenen Hämangiosarkomen (spontan und chemisch-induziert) ist vergleichbar.
Hämangiosarkome beim Menschen:
Bei durch Thorotrast und Vinylchlorid ausgelösten Hämangiosarkomen in der Leber
sind häufig Punktmutationen in K-Ras zu finden (Przydodzki et al 1997, Marion et al. 1991).
Mehr als 80 % der chemisch induzierten Tumore zeigen mindestens eine K-Ras-Mutation.
Bei den spontan entstandenen Hämangiosarkomen in der Leber wurden bei etwa 25 % der
Tumore eine Ras-Mutation gefunden.
Experimentelle Hämangiosarkome in Tiermodellen:
Transgene Mäuse (rasH2), die humanes c-Ha-Ras unter seinem eigenen Promotor
expremieren, weisen zu etwa 60 % Angiosarkome auf und in allen Angiosarkomen auch
Ras-Mutationen (G61L) auf (Saitoh et al. 1990). Die somatischen Punktmutationen des
Transgens (nur in den Tumoren nicht in den übrigen Geweben der Maus gefunden) übertreffen wahrscheinlich den tumorigenen Effekt der reinen Transgen-Expression. Nach Einbringen von humanem H-Ras-Onkogen in die Haut von Mäusen bilden sich dort lokal Lymphangiosarkome. Eine aus diesen Tumoren entwickelte Zellinie führt in Nacktmäuse zur Bildung
von aggressiven Angiosarkomen (Burns et al. 1991). In immortalisierten MausEndothelzellen (mit SV40 Large T) führt die zusätzliche Einführung von H-Ras-Onkogen
(Mutation in G12 und T59) zur Bildung von Hämangiosarkomen anstelle der wenig proliferativen Hämangiomen ohne H-Ras-Onkogen (Arbiser et al. 1997). Durch zusätzliches HRas-Onkogen werden die pro-angiogene Matrixmetalloproteinasen (MMP) hoch- und die
anti-angiogenen Gewebe-Matrixmetalloproteinase-Inhibitoren (tissue inhibitor of matrix
Seite 34
Einleitung
metalloproteinase TIMP) herunterreguliert. Ras amplifiziert dabei die hypoxie-induzierte
VEGF-Hochregulation im Tumor und ermöglicht den sog. angiogenic switch. Vermutlich
führt die Einführung eines einzelnen Onkogens, hier mutiertes H-Ras, zu einer Imbalance
von Angiogenese-Stimulatoren und –Inhibitoren, die zu einer angiogenen Aktivierung des
Tumors führt. Nach Chin et al. (1999) fördert das onkogene Ras danach auch die Erhaltung
des Tumors.
Spontane und durch Thiazolidinedion-Troglitazone (Insulin-Sensitizer zur DiabetesMellitus-Behandlung) ausgelöste Leber-Hämangiosarkome in B6C3F1-Mäusen zeigen weniger als 5 % Ras-Mutationen (Duddy et al. 1999), während durch Inhalation von 1,3Butadien-erzeugte Hämangiosarkome im Herzen von B6C3F1-Mäusen häufige RasMutationen aufweisen (82 % K-Ras, 46 % H-Ras, 56 % K- und H-Ras; Hong et al. 2000).
Die Autoren folgern, daß die Ras-Mutation einen frühen Schritt in der chemisch-induzierten
Karzinogenese darstellt und daß aus einem Vergleich mit spontanen Hämangiosarkomen
daraus Rückschlüsse auf die Entwicklung von Hämangiosarkomen gezogen werden können.
Bei Ratten durch Vinylchlorid-Exposition erzeugte Hämangiosarkome zeigen N-RasMutationen, im Unterschied zu den K-Ras-Mutationen bei menschlichen Vinylchloridinduzierten Hämangiosarkomen (Froment et al. 1994).
Aus dem Vergleich der spontanen und chemisch-induzierten sowie der Hämangiosarkome in Menschen und Mäusen ergibt sich, daß die vaskuläre Tumorigenese speziesspezifische Unterschiede zeigt und daher die experimentellen Hämangiosarkome im Tiermodell (bestehend aus Maus-Endothelzellen) nur begrenzte Aussagekraft für die humanen Hämangiosarkome haben. Innerhalb einer Spezies gibt es zudem einen deutlichen Unterschied
zwischen spontanen und chemisch-induzierten Hämangiosarkomen. Bei letzteren gibt es
auch noch Unterschiede zwischen den Agentien. Bei humanen Angiosarkomen kann eine
Beteiligung von Ras, vor allem von K-Ras, bei der Tumorigenese von Hämangiosarkomen
angenommen werden.
Einleitung
Seite 35
1.8 Zielsetzung der Arbeit
In der vorliegenden Arbeit sollten die Funktionen der beiden VEGFRezeptortyrosinkinasen VEGFR1 und VEGFR2 und der intrazellulären Signalüberträger Ras
und Stickstoffmonoxid (NO) in einem Endothelzellmodell näher untersucht werden. Die
verwendeten Endothelzellen, transformierte humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen
(T-HUVEC), wurden als Modell für normale Endothelzellen im Vergleich zu primären Zellen desselben Ursprungs (HUVEC) untersucht. Zur Aufklärung der Rezeptor-Spezifität von
Endothelzellfunktionen wurden Rezeptor-Schimären und rezeptor-spezifische Liganden
verwendet. Nachdem in einer früheren Doktorarbeit (Ehrhardt 1999) die Vermittlung der
Ras-Aktivierung über beide VEGF-Rezeptoren sowie die Ras-Abhängigkeit der VEGFstimulierten Zellteilung gezeigt wurde, sollte in dieser Arbeit die Bedeutung der RasAktivierung in verschiedenen Signalwegen und in verschiedenen Funktionen der Endothelzellen (Zellteilung, Überleben unter serumfreien Bedingungen, Migration bzw. Chemotaxis,
in vitro-Angiogenese) untersucht werden. Dazu wurden T-HUVEC-Zellinien generiert, die
einen rekombinanten anti-Ras-Einzelkettenantikörper (anti-ras-scFv) pharmakologisch induzierbar intrazellulär expremieren konnten. Als weiterer Signalüberträger in Endothelzellen
wurde Stickstoffmonoxid untersucht. In der Literatur wurden viele Daten über fördernde und
inhibierende Wirkungen von NO berichtet, wobei die Messung von NO aber in den meisten
Fällen nur indirekt über Abbauprodukte oder der NO-Synthese vor- oder nachgeschaltete
Signalüberträger erfolgte. In der vorliegenden Arbeit wurden die Regulation der NOFreisetzung sowie die biologischen Wirkungen von NO in Endothelzellen untersucht.
Die gleichen Zellen wurden aufgrund ihrer Transformation auch in einem Modell zur
Entstehung vaskulärer Tumore untersucht. T-HUVEC, die den rekombinanten EinzelkettenAntikörper zur Inhibition der Ras-Funktion induzierbar expremieren konnten, wurden in
Nacktmäuse implantiert. Abhängig von der Ras-Funktion (inhibiert versus nicht-inhibiert)
wurden Wachstum, Malignitätsgrad und Histomorphologie der nach Subkutaninjektion entstandenen Tumore untersucht, um die Bedeutung der Ras-Aktivierbarkeit in transformierten
Endothelzellen bei der vaskulären Tumorigenese abschätzen zu können.
Seite 36
Methoden
2 Methoden
2.1 Materialien
2.1.1
Verwendete Zellkulturlösungen/-antibiotika
Accutase
BM Cyclin 1 + 2
DMEM
Doxycyclin
ECGS
FCS
G418
Glutamin
HEPES
Hygromycin
MCDB131
PBS
Penicillin/Streptomycin
Quantum für Tumorzellen
RPMI1640
Trypsin
2.1.2
PAA
Roche
PAA
Sigma
PromoCell
PAA, Biochrom
Gibco BRL/Invitrogen
Gibco BRL/Invitrogen
Biomol
Gibco BRL/Invitrogen
Gibco BRL/Invitrogen
Biochrom
Gibco BRL/Invitrogen, PAA
PAA
PAA, Biochrom
Gibco BRL/Invitrogen
Verwendete Chemikalien
Sigma
β-Mercaptoethanol
Acrylamid-Fertiglösung
Roth
Agar
BD
Ampicillin
Biomol
APS
JT Baker
ATP
Sigma
BSA
Biomol, PAA
Dextrose
JT Baker
DMSO
JT Baker
EDTA
Merck
Ethanol
JT Baker
Ethidiumbromid
Serva
Glycerin
Riedel de Haen
Glycin
Biomol
Griess-Reagenz
Sigma
Hefe-Extrakt
Roth
Immuno Fluore Mounting Medium
ICN Biomedicals
Magermilchpulver
Biomol
Methanol
JT Baker
NP 40
Fluka
Pepton-Hydrolysat
Gibco BRL
Pyronin Y
Sigma
SDS
Biomol
Sucrose
JT Baker
TEMED
Fluka
Tween 20
Acros Organics
Alle übrigen Chemikalien wurden von Fluka, Riedel de Haen, Biomol, JT Baker, Roche, Acros Organics bezogen. Signaltransduktionsinhibitoren und Wachstumsfaktoren, s. unter 2.5.1.
Methoden
2.1.3
Seite 37
Verwendete Enzyme
DNAse I
Qiagen
RT-PCR-Enzymmix
Qiagen
Restriktionsenzyme
MBI Fermentas, New England Biolabs
Alle Enzyme wurden bei - 20 °C gelagert und mit den entsprechenden 10x-Puffern der Hersteller
unter den angegebenen Bedingungen eingesetzt.
2.1.4
Verwendete Geräte
Phosphoimager
Brutschränke
Elektroporator
ELISA-Reader
Filmkassetten
Fluorometer
Micro-Chemotaxis-Kammer 48 Well
Mikroskope
Photometer
Raster-Elektronenmikroskop
Sterilbänke
Thermomixer
Zentrifugen
2.1.5
Fuji
Heraeus
Eppendorf Multiporator
SLT-Labinstruments
Tecan Sunrise
Agfa Curix 400 und Fuji HR800
BIORAD Fluoromark
Neuroprobe
Olympus CK2
Olympus IX51
Zeiss Axioplan
Zeiss Axiovert 35
Shimadzu UV 1202
LEO Gemini 1530
Heraeus
Eppendorf
Eppendorf 5415C (Minifuge)
Heraeus Megafuge 1.0R
Verwendete Verbrauchsmaterialien und Kits
BioRad-DC-Proteinassay
BrdU Labeling and Detection Kit II
Cellagen-Disks Kollagen-Membrane
Cellocate Raster-Deckgläschen 55 µm
Chemotaxis-Membranen: Polycarbonat 12 µm
Cy5 Auto Read Sequencing Kit
Diff Quick-Färbeset
ECL- und Röntgenfilme
ECL-Western-Blot-Detektionslösungen
In vitro angiogenesis assay Kit
Matrigel
Nitrocellulose-Membranen
Nucleobond AX500 EF-DNA-Aufreinigungs-Kit
(Endotoxin-frei)
Nucleospin RNA-Isolations-Kit
Qiaex Nukleinsäure-Extraktions-Kit
Spritze 23G (Insulin U-40 8 mM)
SteadyGlo
Zellkulturplatten (96-, 24-, 6-Well)
ZK-Flaschen 75 cm2
ZK-Schälchen ∅ 3,5 cm, 6 cm, 10 cm
VEGF-, PlGF-ELISA-Kit
BioRad
Roche
ISN Biomedical
Eppendorf
Corning Costar
Amersham Pharmacia
Dade
Amersham Pharmacia und Fuji
Amersham Pharmacia
Chemicon
BD Biosciences
Schleicher & Schuell
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Qiagen
Becton Dickenson
Promega
Nunc, TPP, Sarstedt
Nunc, TPP
Nunc, TPP
R&D, PerBioScience
Seite 38
2.1.6
Methoden
Verwendete Antikörper und Detektionsenzyme
Antikörper, Kopplung, Herkunkft
Klon
/Bestellnr.
C-20/sc-1618
/C70820
/N30020
/18-0294
C-17/sc-316
/N32020
/A11034
Anti-Akt, monoklonal
Anti-cdc42, monoklonal
Anti-eNOS, monoklonal
Anti-hVEGF, polyklonal aus Ratte
Anti-hVEGFR1, polyklonal Kaninchen
Anti-iNOS, monoklonal
Anti-Kaninchen-IgG-Alexa Fluor 488 (grün),
Ziege
Anti-Maus (Link Antikörper) biotinyliert
Anti-Maus-IgG-Agarose
Anti-Maus-IgG-Alexa Fluor 488 (grün), Ziege
Anti-Maus-IgG-Alexa Fluor 594 (rot), Ziege
Anti-Maus-IgG-HRP (H+L)
Anti-mCD31 monoklonal aus Maus
Anti-mCSF-1-R, polyklonal Kaninchen
Anti-myc, monoklonal
Anti-nNOS, monoklonal
Anti-pan Ras, monoklonal
Anti-Ratte, aus Kaninchen biotinyliert
Anti-Vimentin, monoklonal
Phospho-Akt (Ser 473), polyklonal Kaninchen
Streptavidin-Alkalische Phosphatase (SAB)
2.1.7
/06-174
9E10/554205
/N31020
Ras10/OP-40
/E0468
/MAB3400
/9271
/U0674
Santa Cruz
Transduction Laboratories
BD Biosciences
Zymed
Santa Cruz Biotechnology
BD Biosciences
Molecular Probes
Dako
Sigma
Molecular Probes
Molecular Probes
Dianova
BD Pharmingen
Biomol
BD Biosciences
BD Biosciences
Calbiochem/Dianova
Dako
Chemicon
NEB
Dako
Verwendete Oligonucleotide: Primer und Sequenzierprimer
VEGFR1
VEGFR1
VEGFR2
VEGFR2
Fmt-1
Fmt-1
β-2-Mikroglobulin
β-2-Mikroglobulin
Nrp-1
Nrp-1
ptre2vor (bp 394-414)
ptre2rück (bp 586-605)
ptre2rück2 (bp 536-559)
2.1.8
/U0674
/A6531
/A-11029
/A11005
/115-035-046
Bezugsquelle
CCA
ATG
GTG
TAC
CTG
TTC
TGT
ACA
AAA
ATC
ACG
ATG
AAC
TAC
TGC
CAC
TAG
AGT
AGC
CTC
TGT
CTA
CAG
CTG
AAT
TCA
TGA
TTC
TGC
AAT
CAG
ATT
GCT
CTC
CAG
TTT
TTT
TTT
CCC
CAG
TAG
AGA
AAT
AAG
TTC
CCG
GAT
TGT
CTG
TGA
ACA
TGA
GAA
AAA
CAG
GAT
CCC
ACA
TGG
CCC
CTT
TCC
CCT
ATA
AGT
ATA
TAA
ATC
TTC
TTC
GCC
CCT
ACT
GCA
CCT
CCA
GCG
TCT
Verwendete Bakterienstämme - genetische Typisierung
C600: F-, supE44, thi-1 thr-1. leuB6, lacY1, tonA21, λ-hsdR-, hsdM+
GTG
GGC T
TA
CAA GTT
GA
ACA
TAA
GAG
TG
TAG
AA
CAG CTC
Methoden
2.1.9
Seite 39
Verwendete Plasmide
Plasmid
Eigenschaften
pBiEGFP
Bidirektionale Doxycyclin regulierbare
Expression von EGFP und von einem zweiten Gen, das in MCS eingefügt werden kann
Bidirektionale Doxycyclin-regulierbare
Expression von EGFP und von anti-rasscFv-myc, eingefügt in PvuII-Site
EGFP-Expression unter CMV-Promotor
Expression von PAK(Aminosäure 57-141)GST-Fusionsprotein in E. coli
Expression des Tet-Regulators tTA
pBiEGFP-anti-ras-scFvmyc
pcDNA3-EGPF
pGEX-PAK57-141
pTetOff
pTetOn
ptre2Luciferase
pTKHyg
ptre2-anti-ras-scFv-myc
Expression des Tet-Regulators rtTA
Expression von Firefly-Luciferase als Reportergen für die induzierbare Expression in
TetOn-/TetOff-Zellinien
Resistenz-Vektor gegen Hygromycin
Doxycyclin-regulierbare Expression des
anti-ras-scFv-myc
Bezogen/hergestellt aus/
von
BD Biosciences
Im Rahmen dieser Arbeit aus ptre2-anti-rasscFv-myc
E. Jasny
R. Ahmadian (MPI,
Dortmund)
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
C. Goemans
2.1.10 Verwendete Zellen/Zellinien und Versuchstiere
Primäre HUVEC wurden von Matthias Clauss (MPI, Bad Nauheim) zur Verfügung gestellt.
T-HUVEC (früher auch ATCC: ECV304) wurden von Gera Neufeld (Technion, Haifa/Israel) zur
Verfügung gestellt.
Nu/nu athymische Nacktmäuse, Quelle: Tierstall der Universitätsklinik Essen.
Seite 40
Methoden
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1
Subklonierung von DNA-Fragmenten (Sambrook et al. 1989)
2.2.1.1 Restriktion von DNA
Für die Restriktion von DNA zur Klonierung von bestimmten Fragmenten und zur
Untersuchung des Erfolgs einer Ligation wurden Restriktionsenzyme verwendet, wobei die
Reaktionsbedingungen gemäß den Angaben der Hersteller gewählt wurden (Reaktionsdauer,
Temperatur, Puffer, Hitzeinaktivierung). Die benötigte Menge Restriktionsenzym wurde
allgemein berechnet nach:
Units
µg DNA/h
=
Größe Referenz x
Größe DNA
Schnittstellen DNA
Schnittstellen Referenz
Als Referenz wurde der λ-Phage verwendet (48,5 kbp), die Schnittstellen der Enzyme
in der λ-Phagen-DNA waren aus Tabellen zu entnehmen. Der Restriktionsansatz wurde auf
10 oder 20 µl ausgelegt. DNA-Fragmente, die zur Ligation in einen Vektor vorgesehen waren, wurden auf einem präparativen Agarose-Gel (s. unter Agarose-Gelelektrophorese) aufgetrennt und aus diesem isoliert. Dazu wurde die gewünschte Bande wurde im energiearmen
UV-Licht möglichst knapp ausgeschnitten. Die DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen erfolgte
mit dem QuiaexII-Kit nach Anleitung (Qiagen).
2.2.1.2 Modifikation von geschnittener DNA: Klenov-Fragment, Dephosphorylierung
Nach einer Restriktion wurde bei Bedarf zur Auffüllung von 5’-überhängenden Enden
das Klenov-Fragment der DNA-Polymerase I (ohne 3’-Exonuklease) eingesetzt. Dazu wurde
zum Ansatz eine entsprechende Menge 10x-Klenov-Puffer, Klenov-Fragment (mind.
1 U/µg DNA) und dNTPs (Endkonzentration 40 µM pro dNTP) gegeben. Die Reaktion bei
RT wurde durch Auftragen auf ein Agarose-Gel oder durch Hitzeinaktivierung (10 min,
75 °C) abgestoppt.
Zur Vermeidung der Selbstligation eines restringierten Vektors wurden die 5’-Enden
durch Zugabe von 1 µl CIAP (Calf intestinale alkaline phosphatase) nach Beendigung der
Restriktion dephosphoryliert und der Ansatz weitere 30 min bei 37 °C inkubiert, bevor der
restringierte und dephosphorylierte Vektor über die Agarose-Gelelektrophorese und Extraktion aus dem Agarose-Gel aufgereinigt wurde.
2.2.1.3 Ligation von DNA
Zur Ligation wurden Fragment und Vektor mit 2 µl 10x-Ligase-Puffer und 1 µl Ligase
in einem 20 µl-Ansatz mindestens 3 h bei 4 bis 12 °C inkubiert. Das Fragment wurde im
Methoden
Seite 41
Überschuß eingesetzt. Zur Kontrolle wurde ein analoger Ansatz ohne Fragment inkubiert,
um die Selbstligationsrate des Vektors zu bestimmen.
2.2.2
Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen
Alle Arbeiten mit intakten Bakterien wurden unter semi-sterilen Bedingungen an der
Bunsenbrennerflamme mit ausgebackenen, autoklavierten oder sterilfiltrierten Geräten und
Lösungen durchgeführt (Sambrook et al. 1989).
2.2.2.1 Herstellung kompetenter Bakterien
Mit einer 5 ml-Vorkultur wurde eine 200 bis 500 ml-LB-Kultur angeimpft und bei
37 °C und Schütteln wachsen gelassen, bis die OD bei 578 nm 0,6 entsprach. Die Bakterien
wurden in sterilen 50 ml-Plastikröhrchen 15 min auf Eis gekühlt und dann abzentrifugiert
(Biofuge, 2400 rpm/1000*g, 4 °C, 15 min). Von den sedimentierten Bakterien wurde das
Medium vollständig abgenommen und die Bakterien in 1/3 des Ausgangskulturvolumens
Puffer RF1 resuspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden sie wie oben abzentrifugiert, der Überstand vollständig entfernt und die Bakteriensedimente in 1/12,5 des Ausgangskulturvolumens Puffer RF2 resuspendiert. Nach 15 min Inkubation auf Eis wurde die
Bakterienlösung in sterile Eppendorfgefäße aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert (Hanahan, 1983).
RF 1
10 mM CaCl2 *2H20
15 % (w/v) Glycerin
30 mM Natriumacetat
pH 5,92
50 mM MnCl2*4H20
100 mM RbCl
pH 5,8 (±0,02) mit Essigsäure
RF 2
10 mM Mops, pH 6,8
75 mM CaCl2*2H20
15 % (w/v) Glycerin
10 mM RbCl
pH 6,8 mit NaOH
LB (LB-Amp) (+ 100 µg/ml Ampicillin)
10 g/l Pepton-Hydrolysat
10 g/l NaCl
5 g/l Hefe-Extrakt
pH 7,4 mit NaOH
2.2.2.2 Transformation von Bakterien und Bakterien-Dauerkulturen
250 µl der kompetenten Bakterien wurden von -80 °C aufgetaut und auf Eis gestellt.
5 µl des Ligationsansatzes wurden dazugegeben und die Mischung etwa 30 min auf Eis inkubiert. Im Thermoblock wurde dann für 90 s ein Hitzeschock bei 42 °C durchgeführt, anschließend 1 ml LB-Medium dazugegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert, um eine Resistenzentwickung zu ermöglichen. Dann wurden die Bakterien abzentrifugiert (Minifuge,
3000 rpm, RT, 2 min) und auf LB-Amp-Platten ausgestrichen und etwa 12 h bis zum Erscheinen sichtbarer Bakterienkolonien bei 37 °C inkubiert (Hanahan 1983).
Dauerkulturen transformierter Bakterien wurden aus Übernachtkulturen entnommen,
mit 50 % Glycerin versetzt und bei -80 °C gelagert.
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Methoden
LB-Amp-Agar
LB-Amp
15 g/l Agar
2.2.2.3 Minipräparation von Plasmid-DNA
Von der Ligationsplatte wurden einzelne Kolonien in Kulturröhrchen mit 5 ml LBAmp überführt und bei 37 °C unter Schütteln (ca 180 rpm) für mindestens 6 h inkubiert, bis
eine deutliche Trübung erkennbar war. 1,5 ml der Bakteriensuspension wurden abgenommen
und im Eppendorfgefäß abzentrifugiert (Minifuge, 14000 rpm, 2 min, RT). Das Bakteriensediment wurden in 100 µl Lösung 1 (Resuspendierungslösung) resuspendiert, 200 µl Lösung 2 (Lysislösung) hinzugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 5 min wurden 200 µl
Lösung 3 (Fällungslösung) hinzugegeben, durch Invertieren des Gefäßes gemischt und
10 min auf Eis inkubiert. Der Bakteriendebris wurde abzentrifugiert (Minifuge, 14000 rpm,
4 °C, 10 min) und der plasmidhaltige Überstand in ein frisches Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt. Es wurden 2 µl RNAseA (100 mg/ml) zugegeben und der RNAseVerdau mindestens 15 min bei 56 °C durchgeführt, bei dieser Temperatur sind andere Enzyme, z. B. DNAsen, inaktiv. Danach wurde mit 400 µl DNA-Phenol extrahiert und nach der
Phasentrennung (Minifuge, 14000 rpm, RT, 2 min) die wäßrige Phase mit 400 µl DNAPhenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann zur
Entfernung von Phenolresten noch einmal mit 400 µl Chloroform extrahiert. Die wäßrige
Phase wurde nach Abdampfen von Chloroformresten bei 37 °C mit 1 ml absolutem Ethanol
versetzt und die DNA bei -20 °C gefällt und abzentrifugiert (Minifuge, 14000 rpm, 15 min,
4 °C). Das DNA-Präzipitat wurde mit 500 µl 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet, in Wasser oder TE aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Die DNA wurde entweder direkt auf ein
Agarose-Gel aufgetragen oder eine Restriktionsanalyse durchgeführt.
Lösung 1 – Resuspendierungslösung
10 mM EDTA
50 mM Glucose
25 mM Tris/HCl pH 8,0
Lösung 3 – Fällungslösung
3 M Kaliumacetat
pH 4,8 mit Essigsäure
Lösung 2 – Lysislösung
0,2 N NaOH
1 % (w/v) SDS
DNA-Phenol
Phenol, gesättigt mit TE pH 7,4
TE
1 mM EDTA
10 mM TrisHCl pH 7,9
2.2.2.4 Präparation von Plasmid-DNA für die Transfektion eukaryoter Zellen
Die Präparation von DNA für die Transfektion eukaryoter Zellen wurde mit dem Nucleobond Nucleobond AX 500 EF Kit (Macherey-Nagel, Düren) durchgeführt. Es wurden
dafür sterile Plastikwaren und ausgebackene Glasgeräte verwendet. 100 ml LB-AmpMedium wurden mit einer Bakterienkultur angeimpft und über Nacht unter Schütteln bei
37 °C inkubiert. Die Bakterien wurden in 50-ml-Tubes abzentrifugiert (Megafuge,
4000 rpm/3200*g, 15 min, 4 °C). Die Aufreinigung der Plasmid-DNA erfolgt nach Anleitung. Nach Fällung der DNA und Waschen des DNA-Präzipitates wurde die Plasmid-DNA
Methoden
Seite 43
in sterilem endotoxinfreiem Wasser aufgenommen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt
UV-photometrisch und die Lagerung der DNA bei -20 °C.
2.2.3
Analyse von Nukleinsäuren
2.2.3.1 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese mit 1,0 – 2,0 (w/v) % Agarose in TEB wurde in horizontalen Gelelektrophoresekammern durchgeführt. Die Proben wurden mit der entsprechenden Menge 5x-DNA-Probenpuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Als Größenmarker
standen λ-Marker (λ-DNA mit EcoRI, HindIII verdaut: Banden bei 21226, 5148, 4973,
4268, 3530, 2027, 1904, 1709, 1375, 947, 931, 586 bp) und BOA-Marker (Tth-730-DNA mit
EcoRI, HinfI verdaut: Banden bei 1409, 800, 516, 396, 261, 191, 88, 75, 65 bp) zur Verfügung. Es wurde eine Spannung von 60 – 90 V (je nach Gelgröße) angelegt. Zur Anfärbung
der DNA wurde dem Laufpuffer TEB Ethidiumbromid zugesetzt. Die Gel-Dokumentation
erfolgte unter UV-Licht.
DNA-Probenpuffer (5x)
0,25 % Bromphenolblau
100 mM EDTA
30 % (w/v) Glycerin
0,25 % Xylencyanol
TEB (+ Ethidiumbromid)
2 mM EDTA
89 mM Tris/Borat pH 8,0
(+ 0,04 g/l Ethidiumbromid)
2.2.3.2 DNA-Sequenzierung
Die DNA wurde von Annette Tolle mit dem Alf DNA-Sequencer (Pharmacia) nach
der Kettenterminationsmethode sequenziert.
2.2.3.3 UV-Photometrische Nukleinsäure-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen erfolgt durch photometrische
Bestimmung der OD bei 260 nm. Dabei entspricht eine OD260nm von 1,0 bei doppelsträngiger
DNA einer Konzentration von etwa 40 µg/ml und bei einzelsträngiger RNA von etwa
50 µg/ml. Zur Bestimmung der Verunreinigung der DNA-/RNA-Lösung mit Protein wurde
die Ratio OD260nm/OD280nm bestimmt. Bei reinen DNA-Lösungen beträgt die Ratio 1,8, bei
reinen RNA-Lösungen 2,0.
2.2.4
RNA-Isolierung
Die RNA von T-HUVEC, die für mindestens 48 h vor Isolierung in Zellkulturschalen
mit 3,5 cm Durchmesser kultiviert wurden, wurde mit dem Nucleospin RNA-Kit (MachereyNagel) nach Anleitung isoliert. Nach Elution wurde die RNA-Konzentration photometrisch
bestimmt (s. 2.2.3.3).
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2.2.5
Methoden
Reverse-Transkriptase-PCR
Für die RT-PCR mit dem One-Step-RT-PCR-Kit (Qiagen) wurden ca. 800 ng GesamtRNA je Ansatz eingesetzt, für die Ansätze für β-2-Mikroglobulin 80 ng. Für die 25 µl-PCRAnsätze wurde ein Mastermix angesetzt, der pro Ansatz enthielt:
RT-PCR-Ansatz:
5 µl
1 µl
1 µl
0,2 µl
0,3 µl
0,3 µl
ad
25 µl
5x-One-Step-RT-PCR-Puffer
dNTP 10 mM pro dNTP (Qiagen)
Enzym-Mix mit Reverse Transkriptase und Polymerase
RNAsin (MBI Fermentas, 25 u/µl)
Primer 1
Primer 2
RNAse-freies Wasser und RNA
Das PCR-Programm enthielt eine Sequenz für die RT-Reaktion und für die PCR, die
direkt nacheinander in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wurden:
RT-Reaktion
30 min
15 min
50 °C (RT-Reaktion)
95 °C (Stopp RT-Reaktion)
PCR
1 min
1 min
1 min
10 min
94 °C (Melting)
62 °C (Annealing)
72 °C (Extension)
Cyclen : 30
72 °C (Final Extension)
Die PCR-Ansätze wurden mit 5x-DNA-Probenpuffer versetzt, auf einem Agarose-Gel
aufgetrennt und analysiert.
2.3 Zellkultur-Methoden
Alle Zellkulturarbeiten wurden mit sterilen Lösungen und Geräten in der LaminarFlow-Werkbank durchgeführt. Bei Experimenten mit serumfreier Vorinkubation in den Kultur-Zellkulturflaschen wurde die Ablösung der Zellen mit Accutase® (PAA) anstelle von
Trypsin durchgeführt. Die Kulturmedium wurden zur Kultivierung mit Serum verwendet.
Für die Experimente wurde die gleiche Rezeptur jeweils ohne Serum verwendet, soweit nicht
anders angegeben.
2.3.1
Kultivierung von primären HUVEC
Die primären HUVEC wurden in MCDB131, supplementiert mit 8 % FCS und 2 %
humanem Serum, bei 37 °C und in wassergesättigter Atmosphäre mit 5 % CO2 in Gelatinebeschichteten Plastik-Zellkulturgefäßen kultiviert. Die Gefäße wurde jeweils 60 min vor
Aussaat der Zellen mit Gelatine-Lösung im Inkubator beschichtet und die Gelatine-Lösung
vor Aussaat abgesaugt. Zur Subkultivierung wurden die Zellen vorsichtig einmal mit serumfreiem Medium gespült, mit 0,25 % Trypsin abgelöst (maximal 2 min bei RT) und in serumhaltigem Medium aufgenommen. Nach Zentrifugation (Biofuge, 900 rpm/160*g, 5 min, RT)
wurden die Zellen in HUVEC-Kulturmedium aufgenommen, die Zelldichte mit der Neubau-
Methoden
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er-Zählkammer bestimmt und die Zellen in die Gelatine-beschichteten Zellkulturgefäße ausgesät.
HUVEC-Kulturmedium
MCDB131
8 % FCS
2 % humanes Serum
20 mM Glutamin
100 U/ml Penicillin
100 U/ml Streptomycin
10 µg/ml Heparin
1 U/ml Aprotinin
0,5 % ECGS
2.3.2
Gelatine-Lösung
1 % Gelatine in Wasser (autoklaviert)
PBS (pH 7,4)
2,7 mM KCl
1,47 mM KH2PO4
8,1 mM Na2HPO4
138 mM NaCl
Passagieren von Sekundärzellinien
Die T-HUVEC wurden in bikarbonatgepuffertem RPMI1640 mit 10 % FCS, 2 mM
Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin (Kulturmedium) bei 37 °C und in
wassergesättigter Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Die mit pTetOff oder pTetOn stabil
transfizierten T-HUVEC-TetOn/Off-Zellen wurden unter Zusatz von 50 µg/ml G418 und
nach der zweiten stabilen Transfektion mit den pBiEGFP-anti-ras-scFv-myc und pTKHygVektoren zusätzlich mit 50 µg/ml Hygromycin kultiviert. Zum Passagieren wurden die Zellen bei 70 – 100 %iger Konfluenz zweimal mit PBS gespült, dann mit Trypsin 0,25 % abgelöst und mit serumhaltigem Medium (zur Trypsin-Inhibition) in ein Falcon-Tube überführt.
Nach Abzentrifugation der Zellen (Biofuge, 900 rpm/160*g, 5 min, RT) wurde der trypsinhaltige Überstand abgesaugt, die Zellen in frischem Medium resuspendiert und in adäquater
Verdünnung in eine neue 75 cm2-Flasche ausgesät. Die Zelldichte der Suspension wurde
durch Auszählung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.
Die Zellen wurden regelmäßig mit BM Cyclin (Roche) behandelt, um MycoplasmenInfektionen zu verhindern bzw. zu behandeln. Dazu wurde jeweils ein dreiwöchiger Behandlungszyklus nach Anleitung durchgeführt.
T-HUVEC-Kulturmedium:
RPMI1640
10 % FCS
2 mM Glutamin
100 U/ml Penicillin
100 U/ml Streptomycin
Doxycyclin-Lösung
1 mg/ml Doxycyclin in 0,1 N HCl
Hygromycin-Lösung
50 mg/ml in PBS
G418-Lösung
50 mg/ml G418 in DMEM, pH > 7,0
2.3.3
Kryokonservierung und Auftauen von Zellen
Zum Einfrieren wurden die Zellen wie beim Passagieren mit PBS gewaschen, trypsiniert und abzentrifugiert. Dann wurden sie in 1 ml FCS mit 7,5 % DMSO resuspendiert und
in ein Kryoröhrchen überführt. Langsam wurden sie dann für über 24 h auf -80 °C abgekühlt
und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Beim Auftauen wurden sie möglichst schnell auf etwa 37 °C gebracht. Zur Vemeidung eines osmotischen Schocks wurde tropfenweise während 5 min etwa 5 ml FCS oder
Seite 46
Methoden
Medium (ohne Selektionsantibiotika) zugegeben, die Zellen abzentrifugiert (Biofuge,
900rpm/160*g, 5 min, RT), in frischem Zellkulturmedium (ohne Selektionsantibiotika) resuspendiert und in ein der Zellmenge angepaßtes Zellkultur-Gefäß ausgesät. Etwa 24 h später wurde das Medium zur Entfernung von DMSO-Resten gewechselt und bei Bedarf die
Selektionsantibiotika wieder zugesetzt.
2.3.4
Transfektion
Für die Transfektion von T-HUVEC wurden verschiedene Transfektionsprotokolle
etabliert. Da die T-HUVEC endotoxin-empfindlich sind, wurde endotoxin-frei aufgereinigte
DNA zur Transfektion verwendet. Alle Transfektionen, die mit adhärenten Zellen in Zellkulturschalen durchgeführt wurden, erfolgten 24 – 48 h nach Aussaat in der exponentiellen
Wachstumsphase der Zellen, die dazu in der Regel in Zelldichten von < 2*104 pro cm² Kulturfläche ausgesät wurden. Die Zellzahlen und DNA-Mengen abhängig von der Wachstumsfläche der Zellkulturschale wurden wie in Tabelle 2.1 angegeben gewählt.
Tabelle 2-1: Zellzahl, Zelldichte und transfizierte DNA-Menge in den verschiedenen
Zellkulturgefäßgrößen.
Zellkulturschale
Zellzahl
DNA in µg
Multiterplatte,
96 Vertiefungen
Zellkulturplatte, 24
Vertiefungen
Schale 3,5 cm ∅
Schale 6,0 cm ∅
Schale 9,0 cm ∅
0,5*104
0,4
Zelldichte in 104
/cm²
1,0
2,0*104
0,8
1,0
1,5*105
4,0*105
1,0*106
4,0
8,0
10,0
1,9
1,9
1,8
2.3.4.1 Elektroporation
Die Zellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und nach Zentrifugation (Biofuge, 900rpm/160*g, 5 min, RT) in RPMI1640 mit 1 % FCS resuspendiert. Nach
Bestimmung der Zelldichte wurden die Zellen wieder zentrifugiert (Biofuge, 900rpm/160*g,
5 min, RT) und in entsprechendem Volumen Elektroporationspuffer (200 mOsmol/kg) aufgenommen, so dass die resultierende Zelldichte 106 Zellen/ml betrug. 400 µl dieser Suspension wurden luftblasenfrei in die Elektroporationsküvette (2 mM Dicke) gefüllt. Die Elektroporation erfolgte im Multiporator durch einfachen Puls mit 670 V für 100 ms. Nach 10 min
Ruhezeit in der Küvette wurden die Zellen in eine mit RPMI1640/10 % FCS gefüllte Zellkulturschale mit 6 cm Durchmesser überführt.
2.3.4.2 Superfect-/Polyfect-Transfektion
Zur Transfektion mit Superfect (Quiagen) wurden die Zellen nach Anleitung in größerer Dichte ausgesät (2*105 T-HUVEC in 3,5 cm-Schalen). 2 µg DNA wurden in 100 µl serumfreiem Medium aufgenommen, 10 µl Superfect zugegeben und die Mischung 5 min bei
RT inkubiert. Dazu wurden 600 µl serumhaltiges Medium gegeben und die Mischung auf die
Zellen gegeben, denen vorher nach Absaugen des Mediums 1,5 ml frisches Kulturmedium
Methoden
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zugesetzt wurden. Die Transfektionsmischung wurde nach 2 – 3 h durch frisches Medium
ersetzt.
Zur Transfektion mit Polyfect wurden pro Zellkulturschale mit 3,5 cm Durchmesser
2 µg DNA wurden in 100 µl serumfreiem Medium mit 22 µl Superfect gemischt. Nach 5 min
Inkubation wurden zur Transfektionsmischung 600 µl Kulturmedium dazugegeben. Das
Kulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und 1,5 ml frisches Kulturmedium auf die
Zellen gegeben. Die Transfektionsmischung wurde dann in die Zellkulturschale pipettiert.
Das Polyfect verblieb bis zum Experimentende auf den Zellen.
2.3.4.3 Transfektion nach der Calciumphosphat-Methode
Die Transfektion nach der Calciumphosphat-Methode wurde mit folgender Transfektionsmischung durchgeführt. Pro ml Transfektionsmischung wurden 4 µg DNA mit 10 µl
2,5 M CaCl2–Lösung versetzt. Nach 5 min Inkubation wurde auf 100 µl mit Wasser aufgefüllt und 100 µl 2x-HBS zugegeben. Nach Vermischen wurde auf 1 ml mit Kultur-medium
aufgefüllt. Das auf den Zellen befindliche Kulturmedium wurde abgesaugt und die Transfektionsmischung auf die Zellen gegeben, z. B. 1 ml auf eine Zellkulturschale mit 3,5 cm
Durchmesser. Die Transfektionsmischung wurde nach 12 – 13 h durch frisches Kulturmedium ersetzt.
2 x HBS (auf pH=7.05±0.01 eingestellt)
280 mM NaCl
10 mM KCl
1.5 mM Na2HPO4
12 mM dextrose
50 mM HEPES
2.3.4.4 Transfektion mit Calciumphosphat-DNA-Nanopartikeln
Für die Transfektion mit Calciumphosphat-DNA-Nanopartikeln (hergestellt wie bei
Welzel et al. 2004 beschrieben, Abb.2.1) wurden einen Tag vor Transfektion 2*104 Zellen
(Dichte 104 Zellen pro cm²) einer Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen ausgesät. Die Transfektion erfolgte in Kulturmedium (mit 10 % FCS), in Quantum®-Medium mit fraktionierten
Serumbestandteilen sowie Hefe-Proteinextrakten (PAA) oder in serumfreiem Medium. Dazu
wurden 50 µl der Calciumphosphat-DNA-Nanopartikel, die 4 µg DNA enthalten, in 1 ml des
jeweiligen Mediums gründlich resuspendiert und nach Absaugen des Kulturmediums auf die
Zellen gegeben. Nach 12 – 13 h wurde das Medium ersetzt.
Seite 48
Methoden
Abbildung 2-1: Schematische Darstellung der rechner-gesteuerten Herstellung von Calciumphosphat-DNA-Nanopartikeln (Welzel et al. 2004).
2.3.4.5 Stabile Transfektionen und Selektion der Zellklone
Vor den Transfektionen wurde die notwendige Menge an Selektionsantibiotika ausgetestet (500 µg/ml G418, 500 µg/ml Hygromycin). Die stabilen Transfektionen wurden mit
Superfect mit 106 Zellen in Zellkulturschalen mit 9 cm Durchmesser oder durch Elektroporation durchgeführt. Einen Tag nach der Transfektion wurde die Behandlung mit dem Selektionsantibiotikum begonnen und so lange fortgesetzt, bis Einzelzellklone von etwa 100 Zellen
bzw. 1 mM Durchmesser erkennbar waren. Diese wurden unter dem Mikroskop durch
Einsaugen mit einer 200 µl-Pipettenspitze isoliert und in Zellkulturplatten mit 24 und später
6 Vertiefungen weiterkultiviert.
2.3.5
Mikroskopische und spektrometrische Untersuchungen mit Zellen
2.3.5.1 Fluoreszenzmikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie von EGFP expremierenden Zellen wurde mit einem inversen Mikroskop an unfixierten Zellen in Zellkulturgefäßen oder auf Deckgläschen mit
einem geeigneten Fluoreszenzfilter durchgeführt. Dazu wurden die Zellen von Medium, das
eine deutliche Eigenfluoreszenz zeigt, befreit und in PBS aufgenommen. Die Zellen auf den
Deckgläschen wurden nach dem Waschen mit PBS in 50 % Glycerin/PBS eingedeckt.
2.3.5.2 Fluoreszenzspektrometrische Bestimmung der induzierbaren Expression
von EGFP und DsRed in T-HUVEC-tetOff/-tetOn
Die Fluoreszenzintensitäten von EGFP und DsRed expremierenden Zellen nach transienter Transfektion mit pBiEGFP und pDsRed-N1 in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen
wurden in nicht lysierten Zellen in der Kulturplatte direkt mit dem Fluoromark gemessen.
Als Filter wurden für EGFP (Anregungsmaximum bei 488 nm) verwendet: Anregung
485 nm, Emission 520 nm, für DsRed (Anregungsmaximum 558 nm): Anregung 544 nm,
Emission 590 nm.
Methoden
Seite 49
2.3.5.3 Luminometrische Messung der Luciferase-Expression
Um die induzierbare Expression von Luciferase nach transienter Transfektion von
dem Response-Reporterplasmid ptre2Luciferase zu quantifizieren wurde in Zellkulturplatten
mit 96 Vertiefungen mit dem Steady-Glo-Assay-System (Promega) eine Messung der abgestrahlten Lichtintensität mit dem Phosphoimager durchgeführt. Dazu wurden 24 h nach
Transfektionsende das Medium abgesaugt, 100 µl Glo-Lysis-Puffer zugegeben und 5 min bei
RT inkubiert. Nach Zell-Lyse wurden dann 100 µl Steady-Glo-Reagenz (mit Luciferase)
zugegeben und die Lichtintensität für 2 h im Phophoimager aufgezeichnet. Die Auswertung
erfolgte densitometrisch für die einzelnen Vertiefungen.
2.3.5.4 Zellvitalitätsmessung mit MTT
Um die Stoffwechselaktivität von Zellen zu vergleichen, wurde die Verstoffwechselung von Methylthiazoltetrazolium (MTT, Sigma) in einem spektrophotometrischen Test
untersucht (Mosmann 1983). Durch die Aktivität der Reduktasen in Abhängigkeit von der
Gegenwart von Reduktionsäquivalenten wird das MTT in den Zellen zu dunkelrotem Formazansalz reduziert, das bei 570 nm photometrisch bestimmt werden kann. 2*104 Zellen
wurden in die Vertiefungen einer Multititerplatte (96-well) mindestens 24 h vor der MTTMessung ausgesät. Als Referenz wurden immer unbehandelten Zellen in normalem Kulturemdium in mindestens vier Vertiefungen verwendet, deren Extinktion als 100 % gesetzt
wurde. Zur Messsung wurden die Zellen 1 h in serumfreiem Medium, das 1:10 mit MTTLösung versetzt war, bei 37 °C inkubiert. Das lösliche Formazan konnte direkt photometrisch bei 540 nm oder bei 512 nm (falls nur dieser Filter vorhanden ist) gegen 1:10 MTT in
serumfreiem Medium als Leerwert gemessen werden. Zur weiteren Aufbewahrung der Proben oder zur Solubilisierung unlöslicher intrazellulärer Formazankomplexe, konnte 1:10 die
MTT-Lysis-Lösung zugegeben, durch Pipettieren die Zellen lysiert und die Formazankomplex solubilisiert werden.
MTT-Lösung
5 mg/ml Methylthiazoltetrazolium in PBS
MTT-Lysis-Lösung
10 % SDS
10 mM NaOH
2.3.5.5 Immunzytochemische Färbung
Die Zellen wurden auf unbeschichteten Deckgläschen in 24-Well-Platten ausgesät.
Nach zwei Tagen in Kultur wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 20 min bei RT in
Fixierlösung (enthält 4 % Paraformaldehyd) fixiert und zweimal mit PBS gewaschen. Zur
Blockierung von unspezifischen Antikörperbindungsstellen wurden sie 30 min mit Blocklösung (bei Oberflächenfärbung ohne permeabilisierendem NP40-Zusatz) bei RT inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen mit PBS-T wurden sie mit den Zellen nach unten in einer geschlossenen feuchten Kammer mit dem Erstantikörper inkubiert, der tropfenweise (je Deckgläschen 10 µl) auf Parafilm gegeben wurde. Durch dreimaliges Eintauchen in PBS-T wurde
überschüssiger Erstantikörper entfernt und die Deckgläschen danach 1 h mit dem fluorophorgekoppelten Zweitantikörper inkubiert (in geschlossener feuchter und dunkler Kammer).
Danach wurden die Deckgläschen dreimal in PBS-T und dreimal in bidestilliertes Wasser
getaucht und mit Immunofluor-Eindeckmedium auf dem Objektträger fixiert. Nach Festwer-
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Methoden
den des Immunofluor wurden sie unter dem Mikroskop mit einem geeignetem Fluoreszenzfilter betrachtet und fotografiert.
Blocklösung Immunhistochemie
(permeabilisierend) in PBS
40 mg/ml BSA
50 mg/ml Glycin
40 mg/ml Magermilchpulver
200 mg/ml Sucrose
(4,7 µl/ml NP 40)
Fixierlösung: in PBS
4 % (w/v) Paraformaldehyd pH 7,4
1 % (w/v) Sucrose
PBS-T
PBS
0,5 % (v/v) Tween-20
2.3.5.6 Rasterelektronenmikroskopie (REM)
Zur dreimensionalen Abbildung der Oberflächen wurden die Zellen mit REM untersucht. Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Zellen auf Kollagenmembranen
(CellagenDisks, ISN Biomedical) ausgesät und für einen Tag kultiviert. Nach Waschen mit
PBS wurden die Zellen in 3,7 % Glutaraldehyd (in PBS) 15 min fixiert. Nach zweimaligem
Waschen mit PBS (5 min) wurden die fixierten Zellen in einer aufsteigenden Alkoholreihe
entwässert: 40, 60, 80, 96 % Ethanol. Nach Abdampfen des Ethanols für länger als 24 h
wurde die Oberfläche mit einem leitfähigen Goldfilm bedampft. Zur Darstellung werden
durch Primärelektronen herausgeschlagene Sekundärelektronen detektiert und als Bild dargestellt.
2.4 Proteinbiochemische Methoden
2.4.1
Lyse der Zellen, Proteinbestimmung und Probenvorbereitung
Die induzierten und/oder stimulierten Zellen (s. unter 2.5.1) wurden mit 50 µl bei
3,5 cm-Schälchen oder 100 µl bei 6 cm-Schälchen Boehringer-Lysis-Puffer auf Eis nach
dreimaligem Waschen mit eiskaltem PBS lysiert, mit einem Zellschaber abgelöst und in ein
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Für die Ganzzell-Lysate wurde diese Lösung verwendet. Durch Zentrifugation (Tischzentrifuge, 14000 rpm, 5 min, 4 °C) wurde der Zelldebris
(mit Zelltrümmern, Membranresten und unlöslichen Bestandteilen) sedimentiert. Der zytoplasmatische Überstand wurde abgenommen und sein Proteingehalt bestimmt. Lysate wurde
bei -20 °C gelagert. Für die unlösliche Fraktion wurde das Präzipitat mit mindestens 100 µl
Boehringer-Lysis-Puffer versehen, durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Plastikspritze mit
23G-Kanüle resuspendiert und nach Proteinbestimmung bei -20 °C gelagert. Die Proteinbestimmung der Lysate (mit detergenzhaltigem Lyse-Puffer) wurde in 96-Well-Platten mit dem
BioRad-DC-Proteinbestimmungs-Kit (BioRad) durchgeführt. 5 µl der Probe bzw. einer
BSA-Stammlösung wurden vorgelegt, 20 µl Lösung A’ (1 ml Lösung A und 25 µl Reagenz
S) und 200 µl Lösung B hinzugegeben. Die Extinktion wurde nach 5 min bei 620 nm im
Elisa-Reader gemessen. Die enthaltene Proteinmenge wurde anhand der mit den BSALösungen erstellten Eichgerade ermittelt. Für die Auftrennung durch SDS-PAGE (s. 2.4.4)
wurden 15 µg pro Spur verwendet, mit 4x-Laemmli-Puffer versetzt und 5 min bei 95 °C
Methoden
Seite 51
erhitzt. Danach wurden die Proben sofort auf Eis gestellt, um durch die Schockkühlung eine
bessere Auffaltung des Proteins zu erhalten.
Boehringer Lysispuffer (+ 1 mM PMSF)
5 mM EDTA
5 mM EGTA
150 mM NaCl
0,1 % (w/v) Natriumdesoxycholat
40 mM NaF
1 mM Na3VO4 pH 10,0 (frisch zusetzen)
1 % (v/v) Nonidet P40
0,1 % (w/v) SDS
50 mM Tris-HCl pH 7,4
1 mM PMSF (frisch zusetzen)
2.4.2
PMSF 1000x
100 mM PMSF in Ethanol
Laemmli Probenpuffer 4 x (reduzierend)
40 % (w/v) Glycerin
0,04 % (w/v) Pyronin Y
8 % (w/v) SDS
250 mM TrisHCl pH 7,6
(70 µM β-Mercaptoethanol)
Immunpräzipitation
Zur Präzipitation des anti-ras-scFv mit seinen Bindungspartnern wurden in einem Eppendorf-Gefäß Ganzzell-Lysat mit 150 µg Protein, 20 µl IgG-Agarose und 2 µl anti-myc
9E10-Antikörper mindestens zwei Stunden bei 4 °C rotiert. Die Agarose wurde abzentrifugiert (Minifuge, 14000 rpm, 2 min, RT), einmal mit einer Lösung mit 100 mM TrisHCl pH
7,4 und 500 mM LiCl (high salt) sowie zweimal mit 10 mM TrisHCl pH 7,4 (low salt) gewaschen (Harlow und Lane 1988). Nach der letzten Zentrifugation wurde der Waschpuffer
sehr sorgfältig mit einer Plastikspritze mit 23GKanüle von der Agarose abgenommen, 30 µl
2xLaemmli-Puffer daraufgegeben und im Thermoblock 10 min bei 95 °C denaturiert. Dann
wurde die Agarose wieder abzentrifugiert, der Überstand in ein frisches Eppendorf-Gefäß
überführt und auf ein SDS-PA-Gel aufgetragen.
2.4.3
Bestimmung der cdc42-Aktivität
2.4.3.1 Aufreinigung PAK
Das PAK-GST-Fusionsprotein wurde aus Bakterien isoliert, die mit dem pGEX-PAKPlasmid transformiert wurden (von R. Ahmadian (MPI Dortmund) zur Verfügung gestellt).
Nach einer 5 ml-Vorkultur wurde 1 l LB mit dieser Vorkultur angeimpft und bei 37 °C unter
Schütteln (ca. 180 rpm) inkubiert, bis die OD bei 600 nm ca. 0,6 betrug. Dann wurde IPTG
(zur Induktion der Expression des PAK-GST) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM
zugegeben und weitere 4 h bei 37 °C unter Schütteln (ca. 180 rpm) inkubiert. Die Bakterien
wurden anschließend in 50 ml-Plastikröhrchen (Biofuge, 4000 rpm, 10 min, 4 °C) abzentrifugiert, in 100 ml Puffer (50 mM TrisHCl pH 7,4, 100 mM NaCl) resuspendiert und durch
Ultraschall auf Eis lysiert. Das Lysat wurde bei-80 °C gelagert.
2.4.3.2 Cdc42-Pull-down-Assay
Zur Bestimmung der cdc42-Aktivität wurden 2 bis 3 Tage vor Experimentbeginn
1,5*106 Zellen in Kulturschalen mit 10 cm Durchmesser ausgesät. Nach einmaligem Waschen mit serumfreiem Medium wurde das Kulturmedium 16 h vor Stimulationsbeginn
Seite 52
Methoden
durch serumfreies ersetzt, in dem dann die Stimulation erfolgte. Nach Stimulationsende wurden die Zellen auf Eis mit eiskaltem PBS dreimal gewaschen und in 0,5 ml FISH-Puffer
lysiert. Nach Proteinbestimmung wurden 800 µg Protein aus den Ganzzell-Lysaten mit Glutathion-Agarose, die zuvor mit GST-markiertem PAK beladen wurde, unter Rotation inkubiert (mind. 30 min, 4 °C). Zur Beladung der Glutathion-Agarose wurden pro Ansatz 60 µl
Glutathion-Agarose dreimalig mit IP-Puffer gewaschen und mit 60 µl GSTPAK-Lysat aus
E. coli mindestens 90 min bei 4 °C rotiert. Danach wurde die GSTPAK-gekoppelte Glutathion-Agarose dreimal mit IP-Puffer und einmal mit FISH-Puffer gewaschen. Nach der Rotation der GSTPAK-gekoppelten Glutathion-Agarose mit den Lysaten wurde die Agarose dreimal mit FISH-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Überstand mit
einer Spritze und 23 G-Kanüle vollständig von der Agarose entfernt. Diese wurde dann in
25 µl 2x Laemmli-Puffer (reduzierend) aufgenommen und 5 min bei 95 °C aufgekocht. Nach
Zentrifugation (Tischzentrifuge, 14000 rpm, 5 min, RT) wurde der Überstand auf einem
15 % SDS-PA-Gel aufgetrennt (s. 2.4.4). Alle Waschschritte wurden jeweils mit mindestens
300 µl Puffer durch Suspension und anschließende Zentrifugation (Tischzentrifuge,
11000 rpm, 2 min, 4 °C) durchgeführt. Als Kontrollen wurden Glutathion-Agarose ohne
GSTPAK mit Lysat inkubiert. Aus den selben Lysaten wurden parallel 15 µg Proben auf
einem 15 %igen SDS-PA-Gel aufgetrennt, um eine Beladungskontrolle zu haben. Die Proteine wurden nach der SDS-PAGE im Western-Blotting-Verfahren (s. 2.4.5) auf Nitrozellulose-Membrane übertragen und die Membranen mit anti-cdc42-Antikörpern detektiert.
FISH-Puffer
50 mM TrisHCl pH 7,4
100 mM NaCl
2 mM MgCl2
10 % (v/v) Glycerin
1 % (v/v) NP-40
Protease-Inhibitoren Complete mini, EDTA frei
(Roche, )
2.4.4
IP-Puffer
50 mM TrisHCl pH 7,4
100 mM NaCl
1 mM DTT
Protease-Inhibitoren Complete mini, EDTA frei
(Roche, )
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die SDS-PAGE wurde in einer mini-PROTEAN-SlabII-Apparatur nach dem Prinzip
der diskontinuierlichen Gelelektrophorese durchgeführt. Die Gelzusammensetzung wurde
wie folgt gewählt:
Wasser
Upper Tris
Lower Tris
Acrylamidlösung
10 % (w/v) APS
TEMED
X %iges Trenngel 15 ml
11,25 - 0,5 x X ml
0 ml
4 ml
0,5 x X ml
100 µl
15 µl
Y %iges Sammelgel 5 ml
3,75 x Y ml
1 ml
0 ml
0,4 x Y ml
40 µl
10 µl
Als Sammelgel wurde ein 5 %iges-PA-Gel und als Trenngel, soweit nicht anders angegeben, ein 15 %iges-PA-Gel verwendet (Gel-Dicke: 1,5 mM; 15 Auftrage-Taschen). Der
pH-Unterschied zwischen dem Sammel- und Trenngel betrug 2 pH-Einheiten. Die mit
Laemmli-Puffer versetzten Proben und der Marker wurden aufgetragen. Als Marker wurden
Low-Marker (Sigma) mit Banden bei 66, 45, 36, 29, 20 und 14 kDa, der High-Marker (Sig-
Methoden
Seite 53
ma) mit Banden bei 205, 116, 97, 66, 45 und 29 kDa und Prestained Marker (Roth) verwendet. Es wurde eine Spannung von 100 bis 180 V angelegt.
TG
192 mM Glycin
25 mM Tris
Laufpuffer SDS-PAGE
TG
0,1 % (w/v) SDS
Upper Tris
0,4 % (w/v) SDS
500 mM TrisHCl pH 6,8
Lower Tris
0,5 % (w/v) SDS
1,5 M TrisHCl pH 8,8
2.4.5
Western-Blotting
2.4.5.1 Blotting und Detektion
Das SDS-Gel wurde nach Abtrennung des Sammelgeles und nach 15 min Inkubation
in Blotpuffer auf drei in Blotpuffer inkubierte BlotPApiere gelegt. Darauf wurde luftblasenfrei eine Nitrocellulose-Membran (Porengröße 0,2 µm) und zwei weitere BlotPApiere sowie
ein Schwämmchen gelegt und mit dem Gel zur schwarzen Seite hin in das Blotsandwich
gespannt. Das Blotting erfolgte 2 h unter Eisblockkühlung bei 100 V oder über Nacht bei
30 V bei 4 °C.
Die auf der Nitrocellulosemembran fixierten Proteine wurde zunächst mit PonceauSLösung (2 g/l) reversibel angefärbt und durch Waschen mit VE-Wasser bis zum Erscheinen
der Banden entfärbt. Mit TBS-T wurde er anschließend vollständig entfärbt und für 30 min
in 5 % Magermilch in TBS-T inkubiert zur Blockierung der unbesetzten Proteinbindestellen
der Nitrozellulose-Membran. Die Inkubation mit dem Erstantikörper erfolgte 1 h bei RT oder
über Nacht bei 4 °C. Nach dreimaligem Waschen für je 10 min mit TBS-T wurde mit dem
Zweitantikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde wieder mindestens
dreimal für je 10 min mit TBS-T gewaschen und die Membran in einer 1:1-Mischung von
Lösung 1 und 2 des ECL-Western-Blot-Detektionssystemes (Amersham) für 60 s inkubiert.
Die Detektion erfolgte durch Auflegen eines ECL-Hyperfilms oder eines FujiHRRöntgenfilms auf die mit Klarsichtfolie eingeschlagenen Blottingmembran in einer mit Verstärkerfolie versehenen Röntgenfilmkassette. Die Entwicklung erfolgte manuell in Röntgenfilmentwickler, -entwicklungsabstopper und -fixierer.
Blotpuffer
TG
20 % Ethanol absolut
0,4 % (w/v) SDS
TBS-T
150 mM NaCl pH 7,5
25 mM TrisHCl
0,05 % (v/v) Tween 20
2.4.5.2 Redektion/Stripping eines Western-Blotes
Der detektierte Blot wurde für 30 min bei 50 °C in Stripping-Puffer inkubiert und danach zweimal 10 min in TBS-T gewaschen. Nach dem Blockieren mit 5 % Magermilchlösung in TBS-T wurde die Membran erneut detektiert (s. 2.4.5.1).
Stripping-Puffer
100 mM β-Mercaptoethanol
2 % (w/v) SDS
62,5 mM TrisHCl pH 6,8
Seite 54
Methoden
2.5 Experimente mit T-HUVEC
2.5.1
Stimulation von T-HUVEC und T-HUVEC-anti-ras-scFv
Die Stimulationen von T-HUVEC und T-HUVEC-anti-ras-scFv wurden, soweit nicht
anders angegeben, mit Wachstumsfaktor-Konzentrationen von 30 ng/ml durchgeführt (Bezugsquellen s. Tab. 2.2). Die Induktion der anti-ras-scFv-Expression wurde mindestens 48 h
vor Experimentbeginn durch mindestens dreifaches Ersetzen (im Abstand von mindestens 6
h) des Mediums durch doxycyclin-freies Medium begonnen.
Tabelle 2-2: Bezugsquellen für Wachstumsfaktoren
Faktor
Humanes VEGF-A(165)
Humanes PlGF-1, PlGF-2
Orf-Virus VEGF-E
Humanes CSF-1, Maus CSF-1
Bezugsquelle
Reliatech, Braunschweig
Reliatech, Braunschweig
Reliatech, Braunschweig
M. Clauss, MPI Bad Nauheim
R&D Systems
2.5.1.1 Behandlung mit Inhibitoren und NO-Donoren
Die Behandlung mit Inhibitoren bzw. NO-Donoren erfolgte wie in Tabelle 2.3 angegeben. Als Kontrolle wurde das jeweilige Lösungsmittel verwendet.
Tabelle 2-3: Endkonzentrationen und Bezugsquellen von Signaltransduktionsinhibitoren
Inhibitor (gelöst in)
PP1 (DMSO)
PP2 (DMSO)
PP3 (DMSO)
L-Name (PBS, H2O)
L-Nio (PBS, H2O)
L-NMMA (PBS)
UO126 (DMSO)
LY294002 (DMSO)
Manumycin A (DMSO)
Verapamil (PBS)
Nifedipin (EDTA)
EGTA (1 N NaOH)
EGTA-AM (DMSO)
BAPTA (0,1 N NaOH)
BAPTA-AM (DMSO)
Pravastatin (PBS)
Fluvastatin (DMSO)
Ramiprilat (0,1 N NaOH)
VEGFR-Inhibitor (DMSO)
NOC-18/DETA-NONOate (PBS)
2.5.2
Endkonzentration
100 nM
100 nM
100 nM
1 mM
1 mM
1 mM
10 µM
10 µM
15 µM
1 mg/l
10 nM
10 µM
10 µM
10 µM
10 µM
10 µM
10 µM
20 mM
10 µM
20 µM
Hersteller
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
Molecular Probes
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
A. G. Scientific, San Diego
Abbott
Bayer
Sigma
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
Sankyo
Novartis
Aventis
Calbiochem/Merck
Calbiochem/Merck
BrdU-Inkorporation
1,5*104 Zellen wurden auf Deckgläschen mit 12 mM Durchmesser in Medium mit
Doxycyclin (0,1 µg/ml) ausgesät. Nach 48 h wurde nach dreimaligem Waschen (mit serumfreiem Medium) serumfreies Medium mit und ohne Doxycyclin (0,1 µg/ml) für weitere 48 h
zur Synchronisation auf die Zellen gegeben. Dann wurde in serumfreiem Medium mit und
Methoden
Seite 55
ohne Doxycyclin (0,1 µg/ml) 24 h mit Faktoren stimuliert. Die Fixierung und Färbung von
BrdU in den Zellen erfolgte nach Anleitung mit dem BrdU Labeling and Detection Kit II
(Roche). Die Inkorporationsrate (Anteil BrdU-positiver Zellen an der Gesamtzahl der Zellen)
für jedes Experiment wurde durch Zählung von Zellen mit Kernfärbung und aller Zellen
in mindestens drei Gesichtsfeldern (bei 200facher Vergrößerung) bestimmt.
2.5.3
Überleben
Nach fünftägiger Vorinkubation in serumfreiem Medium in der Kulturflasche (Nunc,
75 cm² Kulturfläche) wurden die 2*104 Zellen nach vorsichtiger Ablösung in auf Deckgläschen mit eingearbeitetem Raster (Cellocate 50 µm, Eppendorf) in einer Zellkulturplatte mit
24 Vertiefungen in serumfreiem Medium ausgesät. Die entsprechenden Faktoren oder Inhibitoren wurden wie angegeben zugesetzt. Serumfreies Medium mit Faktoren/Inhibitoren wurde
täglich ersetzt. Die Zählung der Zellen in den definierten Arealen wurde arealweise an Tag 0
(mind. 12 h nach Aussaat) und an Tag 5 durchgeführt (Überlebensrate = Anzahl
(Tag 5)/Anzahl (Tag 0)).
2.5.4
Zellzahlvermehrung
Nach zweitägiger Vorinkubation in serumfreiem Medium in der Kulturflasche (Nunc,
75 cm² Kulturfläche) wurden 2*104 Zellen nach vorsichtiger Ablösung auf Deckgläschen mit
eingearbeitetem Raster (Cellocate 50 µm, Eppendorf) in einer Zellkulturplatte mit
24 Vertiefungen in serumfreiem Medium ausgesät. Nach weiteren zwei Tagen wurden die
entsprechenden Faktoren oder Inhibitoren wie angegeben zugesetzt (Tag 0). Serumfreies
Medium mit Faktoren/Inhibitoren wurde täglich ersetzt. Die Zählung der Zellen in den definierten Arealen wurde arealweise an Tag 0 und an Tag 2 durchgeführt (Zellzahl in % der
Ausgangszellzahl = Anzahl (Tag 2)/Anzahl (Tag 0)).
2.5.5
In vitro Angiogenese
Das extrazelluläre Matrix-Gel (In vitro Angiogenesis Kit, Chemicon) wurde auf Eis
aufgetaut und nach Verdünnung mit dazu vorgesehenem Puffer luftblasenfrei in die Vertiefungen einer Multititerplatte eingefüllt (50 µl pro Vertiefung). Zum Erstarren des Geles wurde die Multititerplatte dann 60 min im Inkubator bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden
nach fünftägiger Vorinkubation in serumfreiem Medium in der Kulturflasche (Nunc, 75 cm²
Kulturfläche) abgelöst und in serumfreiem Medium so resuspendiert, daß die Zelldichte
8*104 Zellen/ml betrug. 100 µl der Zellsuspension (mit 8*103 Zellen) wurden mit dem Wachstumsfaktor bzw. Inhibitor vermischt und dann vorsichtig auf das Gel in die Vertiefung der
Multititerplatte pipettiert. Nach 16 h wurden die Zellen auf die Ausbildung der charakteristischen organisierten Strukturen untersucht. Bei jedem Experiment wurden Zellen in serumfreiem Medium ohne Faktor/Inhibitor als Negativkontrolle und Zellen mit 0,1 % FCS
sowie Zellen mit 30 ng/ml VEGF als Positivkontrollen untersucht.
Seite 56
2.5.6
Methoden
Migration
Nach fünftägiger Vorinkubation in serumfreiem Medium in der Kulturflasche (Nunc,
75 cm² Kulturfläche) wurden nach vorsichtiger Ablösung in serumfreiem Medium resuspendiert. Die modifizierte Boyden-Chemotaxis-Kammer (Neuroprobe) mit 48 Vertiefungen
wurde nach Anleitung vorbereitet. Die Wachstumsfaktoren wurden in die untere Kammer
jeder Vertiefung in 25 µl serumfreiem Medium verdünnt vorgelegt, die Membran mit
12 µm-großen Poren luftblasenfrei darauf positioniert. In jede obere Kammer jeder Vertiefung wurden 5*103 Zellen in 50 µl serumfreiem Medium gegeben. Die Kammer wurde 4 h
im Inkubator (37 °C, 10 % CO2) inkubiert. Danach wurde die Kammer nach Anleitung auseinandergebaut, die nicht-migrierten Zellen auf der Oberseite der Membran mit einem Plastikschaber entfernt, die Zellen auf der Unterseite der Membran (migrierte Zellen) mit dem
Diff-Quick-Färbeset (Dade) nach Anleitung fixiert und gefärbt. Für jeden Ansatz wurden die
migrierten Zellen in drei Gesichtfeldern bei 100facher Vergrößerung ausgezählt. Als Nullkontrolle wurden immer serumfreie Zellen ohne Faktor/Inhibitor verwendet, als Positivkontrolle 0,1 % FCS.
2.5.7
NO-Messung
2.5.7.1 Kolorimetrische NO-Bestimmung
Die Konzentration an gebildetem NO in Zellkulturüberständen wurde über eine kolorimetrische Nitritbestimmung mit Hilfe des Griess-Reagenzes (Sigma) gemessen. 105 Zellen
wurden in einer Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen ausgesät und für 48 h kultiviert. Danach wurde das Medium abgesaugt und 250 µl Messpuffer (in der Regel mit Arginin und
Calcium) zugegeben (2 h vor Messung, um Scherstreß zu minimieren). Nach weiteren 2 h
Inkubation wurde dann der stimulierende Faktor zugegeben. Nach 10, 30 bzw. 60 min wurde
der Überstand in eine frische Platte abpipettiert und 60 min stehen gelassen (zur Abreaktion
des NO mit Luftsauerstoff zu Nitrit). Danach wurde in einer Multiter-Platte
(96 Vertiefungen) zu jeweils 100 µl von den Überständen sowie einer vorgelegten Standardreihe aus frisch angesetzter Nitrit-Lösung 100 µl Griess-Reagenz dazugegeben und nach
5 min Inkubation die Extinktion bei 512 nm gemessen. Der Meßpuffer wurde so konzipiert,
daß die Zellen mindestens 8 h in dem Puffer bei 37 °C inkubiert werden konnten, ohne daß
eine
relevante
Einschränkung
der
Zellvitalität
(überprüft
durch
MTTZellaktivitätsmessungen) eintrat. Zur Pufferung wurde HEPES eingesetzt. Bei Inhibition von
Calcium-Kanälen oder Calcium-Chelatisierung wurde Meßpuffer mit Arginin ohne Calcium
verwendet, bei Inhibition von NOS durch Arginin-Analoga wurde Meßpuffer mit Calcium
ohne Arginin verwendet.
2.5.7.2 Elektroanalytische NO-Bestimmung
Zur voltametrischen Messung der NO-Freisetzung von NO wurden modifizierte
50 µm Platin-Glaselektroden verwendet, die mit Ni-(4-N-tetramethyl)-pyridyl-Porphyrin
(NiTmPyP) in einem unlöslichen Polymerfilm durch differentielle Pulsamperometrie nach
Methoden
Seite 57
Isik et al. (2004) beschichtet worden. 2*105 Zellen wurden am Vortag der Messung auf
Deckgläschen mit 12 mM Durchmesser ausgesät. Vor der Messung wurde das Medium abgesaugt, das Deckgläschen unter der Elektrode positioniert und 100 µl Hank’s Puffer als
Tropfen darauf pipettiert. Als optimaler Elektroden-Zelloberflächenabstand wurde 5 – 15 µm
gewählt. An die Mikroelektrode wurde ein Oxidationspotential von 750 mV vs. Ag|AgCl
angelegt und nach Erreichen eines stabilen Hintergrundsignals wurden die Wachstumsfaktoren (5 µl) hinzupipettiert. Die resultierenden Ströme wurden aufgezeichnet.
Die differentialpulsamperometrischen Messungen wurden im Kombi-SECM (Scanning electrochemical microscopy) durchgeführt. Für die Messung in Multititerplatten (96
Vertiefungen) wurden jeweils 2*104 Zellen pro Vertiefung der Platte am Vortrag der Messung ausgesät, wobei nur jede zweite Spalte der Platte verwendet wurde. Die leeren Wells
zwischen den Spalten mit Zellen wurden als Wasch-Vertiefungen für die Elektrode zwischen
den Messungen verwendet. Als Elektroden wurden 250 µm Platin-Glaselektroden, beschichtet durch Elektroabscheidung von Nickel-Porphyrin. Um eine Oxidation von Nitrit an der
Elektrode zu verhindern, wurde sie durch Eintauchen in Nafion® (Sigma-Aldrich) zusätzlich
beschichtet.
Die
Elektrode
wurde
zusammen
mit
einer
Silber-Silberchlorid-
Referenzelektrode und einer Injektionskanüle zur Zugabe der Faktoren in das Gerät eingesetzt. Vor der Messung wurde das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt und durch
100 µl Meßpuffer pro Vertiefung ersetzt. Die jeweiligen Inhibitoren wurden dem Meßpuffer
zugesetzt. Bei den NOS-Inhibitoren wurde Meßpuffer ohne Arginin-Zusatz, bei den Calcium-Kanalinhibitoren oder –Chelatoren wurde Meßpuffer ohne Calcium-Zusatz verwendet.
Die Multititerplatte wurde in einer feuchten, durch ein Thermoelement auf 37 °C temperierten Kammer positioniert und mit einer Glasplatte mit Ausparungen für die Elektroden abgedeckt. Die Messung erfolgt Vertiefung für Vertiefung mit einem automatischen, rechnergesteuerten Meßprogramm (vergl. Reiter et al. 2001) Reihe für Reihe mit einem ElektrodenZelloberflächen-Abstand von 7 - 20 µm (Annäherung wie in Isik et al. 2004 beschrieben).
Die Meßzeiten in jeder Vertiefung wurden zwischen 10 und 120 min gewählt. Pro Platte
wurden mindestens vier Positivkontrollen (VEGF-E, kein Inhibitor), vier Inhibitionskontrollen (VEGF-E, kein Inhibitor) und vier Nullkontrollen (kein VEGF-E, kein Inhibitor) aufgezeichnet. Die Inhibitoren wurden jeweils spaltenweise zugegeben, so dass für jeden Inhibitor
verschiedene Wirkungsdauern gemessen wurden. Die Meßserie für eine Multititerplatte dauerte in der Regel circa 8 h.
Hank’s Puffer (pH 7,4)
75 mM NaCl
5 mM KCl
1,2 mM NaH2PO4
1,2 mM MgCl2
1 mM CaCl2
5 mM NaHCO3
10 mM Glucose
25 mM HEPES
Meßpuffer (pH 7,4) ohne Arg, Calcium
145 mM NaCl
10 mM Glucose
10 mM HEPES
4 mM KCl
2 mM MgCl2
Meßpuffer + 240 mg/l Arginin
Meßpuffer + 3 mM CaCl2
Meßpuffer + 240 mg/l Arg + 3 mM CaCl2
Seite 58
2.5.8
Methoden
ELISA-Bestimmung von VEGF und PlGF in Überständen
Die Zellen (105 bei T-HUVEC, 5*104 bei T-HUVEC-anti-ras-scFv) wurden in eine
Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen ausgesät. T-HUVEC-anti-ras-scFv wurden mindestens
48 h vor der Messung mit und ohne Doxycyclin vorinkubiert, T-HUVEC mindestens 24 h in
Kulturmedium. Das Medium auf den Zellen wurde 16 h vor Experimentbeginn durch serumfreies Medium ersetzt. Am Meßtag wurde das Medium abgesaugt und durch 500 µl frisches
serumfreies Medium ersetzt, dem dann die Faktoren zugesetzt wurden. Für jede Vertiefung
wurde parallel eine weitere Vertiefung ohne Zellen mit gleichen Medien-/FaktorBedingungen parallel angesetzt und inkubiert. Die dort gemessene Extinktion wurde jeweils
als Referenzwert verwendet. Die Bestimmung des freigesetzten VEGF (Quantikine VEGF,
R&D Systems, sowie PerBio) und PlGF (Quantikine PlGF, R&D Systems) wurde durch
einen Sandwich-ELISA nach Anleitung in 50 bzw. 100 µl Überstand gemessen. Eine Standardkurve wurde bei jeder Messung erstellt.
2.6 Erzeugung von Tumoren in Nacktmäusen
2.6.1
Durchführung des Tierversuches
Die Durchführung des Tierversuches erfolgte gemäß des genehmigten Tierversuchsantrages („Untersuchung der Rolle von p21ras für die Proliferation und Regression von Endothelzell-Tumoren“) unter Berücksichtigung der Bestimmungen des Tierschutzgesetz in der
Fassung der Bekanntmachung vom 29 Mai 1998 - BGBl I S. 1106. Der Tierversuch wurde
im Zentralen Tierlabor der Universität der GHS Essen durchgeführt.
Die Haltung der Tiere erfolgte gemäß Tierhaltungsverordnung und unter keimreduzierten Bedingungen (laminare Luftzufuhr, autoklaviertes Streu, Futter, Wasser, restriktive Zugangsbeschränkung, sterile Überkleidung, Mundschutz, Kopfbedeckung).
Sämtliche unerwartete Nebenwirkungen der Tumorzellinjektion wurden beobachtet,
protokolliert und die Tiere alle 2 Tage gewogen. Sobald die Tumoren der Kontrollgruppe
und der Behandlungsgruppen einen Durchmesser von 1 cm erreichten, wurden die Tiere
mittels Genickbruch getötet. Im Falle einer beobachtbaren Beeinträchtigung durch den subkutan wachsenden Tumorknoten sollten die Tiere auch umgehend durch Genickbruch getötet
werden.
2.6.2
Injektion der T-HUVEC
Die T-HUVEC bzw. die T-HUVEC-anti-ras-scFv (sofern nicht anders angegeben nur
Klon T-HUVEC-TetOff-anti-ras-scFv-myc Klon 14-4) wurden direkt nach einer dreiwöchigen prophylaktischen Mykoplasmenbehandlung (s. 2.3.2) bis zur 80 %igen Konfluenz in
Wachstumsmedium kultiviert und nach Trypsinierung die Zelldichte bestimmt. Die Zellen
mußten sicher frei von Mykoplasmen und von anderen Infektionen sein, da die immundefi-
Methoden
Seite 59
ziernten Nacktmäuse sonst an den Infektionen erkranken und versterben würden. Die angegebene Anzahl an T-HUVEC bzw. T-HUVEC-anti-ras wurde dann in Matrigel (BD Biosciences) resuspendiert. Dieses Resuspendat (je 200 µl pro Injektion) wurde mit einer 1 mlSpritze in das Subkutangewebe an der Flanke der Nacktmäuse injiziert (Tag 0). Die Injektion
der Zellen fand ohne Narkose statt, da keine wesentliche Beeinträchtigung des Tieres durch
die Subkutaninjektion zu erwarten war. Bei den T-HUVEC wurden folgende Zellzahlen
injiziert: 1*107, 5*107, 1*108, 5*108. Bei den T-HUVEC-anti-ras-scFv wurden jeweils
106 Zellen pro Maus injiziert. Die Mäuse wurden durch Markierung mit Marker-Stift an
Schwanz, Ohr etc. individuell gekennzeichnet.
2.6.3
Behandlungsschema und Beobachtung des Tumorwachstums
Alle Mäuse, denen T-HUVEC-anti-ras-scFv injiziert wurden, erhielten solange Doxycyclin-haltiges Trinkwasser (2 mg/ml) ad libitum, bis das Behandlungsschema (s. Tab. 2.4)
die Induktion des anti-ras-scFv vorsah.
Tabelle 2-4: Behandlungsschema der Tierversuchsgruppen
Kontrollgruppe
Interventionsgruppe
Präventionsgruppe
Behandlung
Ständig Doxcyclin-haltiges Trinkwasser
Tag 0 bis 18: doxycyclinhaltiges Wasser
Ab Tag 18 doxycyclin-freies Wasser
Ab Tag 0 doxycyclin-freies Wasser
Die Bestimmung des Tumorvolumens an der lebenden Maus erfolgte durch Messung
der drei Tumor-Dimensionen mit einer Schieblehre an den angegebenen Tagen (mindestens
zwei Mal wöchentlich). Vol. in cm³ = Höhe in cm * Breite in cm * Tiefe in cm * π/6 ≅ Höhe
in cm * Breite in cm * Tiefe in cm * 0,5236. Bei Erreichen von circa 1 cm³-Tumorvolumen
wurden die Tiere durch Genickbruch getötet.
2.6.4
Tumorentnahme und Anfertigung histologischer Schnitte
Nach Tötung der Tiere wurden die Tumore aus dem Subkutangewebe an der Injektionsstelle durch Exzision entnommen. Eine Tumorhälfte wurde in 5 %igem Formalin durch
Immersion fixiert und in Paraffin eingebettet. Die andere Tumorhälfte wurde schockgefroren
und dann im Cryoröhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert. Aus den Paraffin-eingebetteten
Tumorblöckchen wurden mit dem Mikrotom 5 µm oder dünnere Schnitte angefertigt und auf
Glas-Objektträger aufgezogen. Die Mitosezahl wurde in 5 Gesichtsfeldern bei hoher
Vergrößerung in HE-gefärbten Schnitten ausgezählt. Die Zuordnung der Punkte nach van
Unnik (1995) erfolgte nach folgendem Schema (Tab. 2.5).
Seite 60
Methoden
Tabelle 2-5: Graduierung der Weichteilsarkome nach Van Unnik (1995)
Parameter
Mitosen
Nekrosen
0 bis 2 pro 10 HPF
3 bis 20 pro 10 HPF
mehr als 20 pro 10
HPF
Fehlten
vorhanden
Punktzahl
0
1
2
Grad
I
Mitosen
0
0
Nekrosen
0
1
0
1
II
1
1
2
2
0
1
0
1
III
2.6.5
Immunhistochemische Färbungen von Schnitten
Die Schnitte wurden nach Trocknung (über Nacht 50°C) durch 30 min Inkubation mit
Xylol entparaffiniert und in absteigender Alkoholreihe, beginnend mit 95 % Ethanol bis zum
destillierten Wasser, rehydriert. Nach Aufnahme in Tris-Puffer (Dako S1968) wurde bei der
Anti-CD31-Färbung die Antigene mit Proteinase K-Lösung (Dako S3020) 10 min demaskiert und bei der Anti-VEGF-Färbung wurden die Schnitte zweimal 10 min in Target Retrieval Solution (Dako S1699) in der Mikrowelle vorbehandelt. Danach erfolgte die Markierung
mit Erstantikörper. Nach Waschen der Schnitte mit Tris-Puffer wurden die Schnitte 30 bis
60 min mit dem biotinylierten Zweitantikörper und nach erneutem Waschen 30 bis 60 min
mit Streptavidin-Alkalische Phosphatase (CSAB-Kit Dako U0674) inkubiert. Nach Abwaschen der nicht gebundenen Alkalischen Phosphatase erfolgte die Detektion für 20 min mit
dem Fast-Red-Substrate System (Dako U0699). Nach Spülung in destilliertem Wasser wurden die Schnitte durch Eintauchen in Hämalalaun- und Eosin-Lösung (H. E. nach Mayer)
gegengefärbt und mit Eindeckmedium eingedeckt.
Die Färbungen gegen humanes Vimentin, Keratin und CD31 wurden im histologischen Labor des Pathologischen Institutes am Bergmannsheil unter Leitung von PD Dr.
Kuhnen nach Routine-Verfahren durchgeführt.
2.7 Statistische Auswertungen
Von allen Zellkulturexperimenten wurden mindestens drei unabhängige Experimentreihen mit unterschiedich vielen Meß-/Zählergebnissen durchgeführt. Als Ergebnis wurde
der arithmetische Mittelwert sowie die Standardabweichung der gesamten Stichprobe (auf
der Grundlage aller Ergebnisse aus allen Experimentreihen) bestimmt. Bei den Vergleichen
zwischen zwei Stichproben wurde der zwei-seitige Student-T-Test angewendet, wenn beide
Stichproben die gleiche Varianz (homoskedastisch) aufwiesen. Der Unterschied wurde als
signifikant bewertet, wenn die berechnete Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 war. Die Berechnung der Mittelwerte, Standardabweichung und die T-Tests wurden mit Microsoft Excel
bzw. SigmaStat durchgeführt.
Ergebnisse
Seite 61
3 Ergebnisse
3.1 Endothelzellmodell und Ras-inhibierender Antikörper
3.1.1
Charakterisierung der T-HUVEC
3.1.1.1 Morphologie und Expression von Markern
Die in dieser Arbeit als Endothelzellmodell verwendeten transformierten Nabelschnur-Venen-Endothelzellen T-HUVEC zeigten lichtmikroskopisch eine PflastersteinMorphologie (Abb. 3.1A). Im Vergleich zu primären HUVEC (Abb. 3.1B) wuchsen die
T-HUVEC dichter und konnten längere Zeit (mindestens 5 Tage) in serumfreiem Medium
überleben. Beide Zellarten wuchsen adhärent als Monoschichten und zeigten Kontaktinhibition.
A
B
Abbildung 3-1: Lichtmikroskopische Aufnahmen von T-HUVEC (A) und HUVEC (B) in Kultur. Die Balken entsprechen 10 µm.
Zur Charakterisierung der T-HUVEC wurde die Expression von Markern in immunzytochemischen Färbungen überprüft (Tab. 3.1). In diesen Färbungen zeigten T-HUVEC Immunoreaktivität mit anti-Vimentin- und anti-Myc-Antikörpern. Eine VimentinImmunoreaktivität ist typisch für Zellen mesenchymalen Ursprungs, darunter auch Endothelzellen. Die Immunoreaktivität mit anti-c-Myc-Antikörpern (myc avian (MC29) myelocytomatosis virus) wurde überprüft, da das zur stabilen Transfektion in T-HUVEC vorgesehene
Genkonstrukt mit dem Myc-Epitop markiert war. Da die untransfizierten Zellen durch den
anti-Myc-Antikörper bereits markiert wurden, war der Nachweis der Expression des in die
Zellen transfizierten anti-ras-scFv-myc nicht durch immunzytochemische Färbungen möglich. c-Myc, das mit N-Myc zur Familie der Myc-Onkogene gehört, kommt in Tumoren, die
Myc-positiv sind, normalerweise in Zytoplasma und im Nukleus vor (Gosney et al. al. 1990).
Bei den T-HUVEC erschien die Markierung im Zellkern deutlicher als im Zytoplasma, war
aber in beiden Kompartimenten nachweisbar (s. auch 3.1.3). Die Zellen expremierten kein
CD31, was ein typischer endothelialer Marker ist. Die Färbungen mit antieNOS(endotheliale NO-Synthase)- und nNOS(neuronale NO-Synthase)-Antikörpern waren
ebenfalls positiv, während die mit anti-iNOS(induzierbare NO-Synthase)-Antikörpern nega-
Seite 62
Ergebnisse
tiv war. Die Expression von endogenem c-Myc wurde auch in Western-Blot-Analysen
(vergl. 3.1.3) bestätigt. Die Immunoreaktivität mit dem anti-Vimentin-Antikörpern war auch
in den T-HUVEC abgeleiteten Tumoren beobachtbar (vergl. 3.4.4.2).
Tabelle 3-1: Ergebnisübersicht der immunzytochemischen Färbungen von T-HUVEC.
Färbung gegen
c-Myc
Vimentin
CD31
eNOS
nNOS
iNOS
Positiv/negativ
Positiv
Positiv
Negativ
Positiv
Positiv
Negativ
Lokalisation
Nukleär, zytoplasmatisch
Zytoplasmatisch
Zytoplasmatisch
Nukleär > zytoplasmatisch
-
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von T-HUVEC auf Kollagenmembranen
zeigen die lichtmikroskopisch nicht so deutlich unterscheidbaren verschiedenen Wachstumsformen: Die Zellen wachsen teilweise sehr flach und sehr weit adhärent ausgebreitet
(Abb. 3.2B), was am ehesten der Morphologie in Blutgefäßen entspricht. Teilweise sind die
Zellen aber auch eher kugelig und liegen dichter beieinander. Die hohe Teilungsaktivität der
T-HUVEC spiegelt sich in einer relativ kurzen Zellverdopplungszeit 24 h wider (vergl. Ehrhardt 1999) und in einem deutlichen Anteil von Zellen im Teilungsvorgang (mit Pfeilen
markiert in Abb. 3.2A). Die T-HUVEC bilden vielfältige Zell-Zellkontakte und teilweise
lange Ausläufer, die sich auch zu fensterartigen Öffnungen formen (Abb. 3.2C/D).
Abbildung 3-2: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von T-HUVEC in Kultur auf
Kollagenmembranen. Der Balken entspricht 10 µm. A: Pfeile markieren sich teilende Zellen.
3.1.1.2 Expression von VEGF-Rezeptoren
Um die Signaltransduktion der beiden hochaffinen VEGF-Tyrosinkinase-Rezeptoren
vergleichend untersuchen zu können, wurde zunächst die Expression endogener VEGF-
Ergebnisse
Seite 63
Rezeptoren in T-HUVEC analysiert. Dazu wurde in einer RT-PCR mRNA für VEGFR1 und
VEGFR2 nachgewiesen (Abb 3.3A, V1 und V2). Als Kontrolle für den Einsatz gleicher
Mengen an DNA wurden Primer aus der β-2-Mikroglobulin-Sequenz verwendet.
β-2-Mikroglobulin kommt als Bestandteil des MHCI-Komplexes auf allen kernhaltigen Zellen vor und wird praktisch nicht reguliert (Lupberger et al. 2002). Zur spezifischen Untersuchung der Signaltransduktionskapazität der intrazellulären Domäne des VEGFR1 wurde
neben Wildtyp-T-HUVEC eine stabil transfizierte transgene T-HUVEC-Zellinie (im folgenden T-HUVEC-Fmt genannt) verwendet, die den chimären Rezeptor Fmt-1 expremiert (Ehrhardt 1999). Mit spezifischen Primern konnte auch die mRNA des schimären Rezeptors
Fmt-1 (Abb. 3.3A: F1) in T-HUVEC-Fmt detektiert werden, nicht aber in WildtypT-HUVEC. In der RT-PCR wurde auch das Vorhandensein von Neuropilin-1-mRNA
(Abb. 3.3A: Np1) gezeigt, was bei dem Vergleich der Effekte durch mCSF-1 (mouse Colony
stimulating factor)und PlGF-1 (Placenta growth factor) von Bedeutung sein kann, da
PlGF-1 neben VEGFR1 auch an Neuropilin-1 bindet. Die Expression von VEGFR1 und Fmt
in T-HUVEC bzw. T-HUVEC-Fmt wurde auf Protein-Ebene durch immunzytochemische
Färbungen bestätigt (Abb. 3.3B-E). Zur Detektion des schimären Rezeptors wurde ein antiCSF-1-Rezeptor-Antikörper verwendet, der die extrazelluläre Domäne des Maus-Rezeptors
erkennt, nicht aber die des humanen CSF-1-Rezeptors. Der VEGFR1 wurde mit Hilfe eines
Antikörpers, der gegen die intrazelluläre Domäne des VEGFR1 gerichtet ist, markiert.
T-HUVEC und T-HUVEC-Fmt zeigten Immunoreaktivität mit anti-VEGFR1-Antikörpern,
während nur T-HUVEC-Fmt durch den anti-CSF-1R-Antikörper markiert wurden.
A
T-HUVEC
T-HUVEC-Fmt-1
T-HUVEC
800 516 396 Bp
M
B2M F1 V1
V2 B2M F1
V1
V2
Np1
B2M
Abbildung 3-3: mRNA-Nachweis (A) und immunzytochemische Markierung von VEGFRezeptoren in T-HUVEC und T-HUVEC-Fmt (B-E).
B: Fehlende Immunoreaktivität mit anti-CSF-1R in T-HUVEC (Hintergrundfärbung). C: Markierung mit anti-VEGFR1 in T-HUVEC. D: Immunoreaktivität mit anti-CSF-1R in
T-HUVEC-Fmt aufgrund der Expression des schimären Rezeptors E: Markierung mit antiVEGFR1 in T-HUVEC-Fmt. (B2M: β-2-Mikroglobulin, F1: Fmt-1, V1: VEGFR1, V2:
VEGFR2, Np1: Neuropilin-1)
Abbildung 3.4 zeigt schematisch die auf T-HUVEC bzw. T-HUVEC-Fmt vorhandenen Rezeptoren und deren Aktivierbarkeit durch in dieser Arbeit verwendete Liganden der
VEGF-Familie. T-HUVEC expremierten VEGFR1, VEGFR2 und Neuropilin-1. Der Ligand
Seite 64
Ergebnisse
VEGF bindet an alle drei Rezeptoren. Bei Stimulation mit PlGF-1 wird neben VEGFR1
(=Flt-1) auch Nrp-1 aktiviert. VEGF-E bindet an VEGFR2 (=KDR=Flk-1). Die
T-HUVEC-Fmt expremieren zusätzlich den schimären Rezeptor Fmt-1, bei dem der heterologe Ligand mCSF-1 selektiv die intrazelluläre Domäne vom VEGFR1 aktiviert. Im Fmt-1Rezeptor wurden Extrazellulär- und Transmembran-Domäne des Maus-CSF-1-Rezeptors mit
dem intrazellulären Teil des humanen VEGF-Rezeptors verbunden (Ehrhardt 1999). Als
Kontrolle für die Effekte des schimären Fmt-Rezeptors wurden jeweils mit mCSF-1 stimulierte Wildtyp-T-HUVEC (im folgenden T-HUVEC) verwendet. Die Expression von humanen CSF-1-Rezeptoren (hCSF-1) in T-HUVEC wurde experimentell nicht ausgeschlossen,
da sie funktionell im verwendeten System ohne Bedeutung ist. Der verwendete heterologe
Ligand Maus-CSF-1 (mCSF-1) bindet nicht an den humanen Rezeptor. Zusätzlich wurden
Kontrollexperimente mit humanem CSF-1 durchgeführt, das in keinem der Experimente
einen Effekt zeigte.
Wildtyp-T-HUVEC
T-HUVEC-Fmt
Abbildung 3-4: Schematische Darstellung der rezeptorspezifischen Liganden der von T-HUVEC
bzw. T-HUVEC-Fmt expremierten Rezeptoren. Die Expression des humanen CSF-1R (gelb) in
T-HUVEC wurde nicht ausgeschlossen.
3.1.1.3 Transfektionsmethoden: Calciumphosphat-Nanopartikel für in vivo und
Elektroporation für in vitro
Endothelzellen sind im allgemeinen schwierig mit Transfektionsreagenzien zu transfizieren. Die sekundäre Zellinie T-HUVEC war leichter als primäre HUVEC zu transfizieren,
allerdings ließen sich mit chemischen Transfektionsreagenzien maximal 25 % Transfektionseffizienz erreichen (Tab. 3.2). Eine effizientere Methode zur Transfektion der T-HUVEC
stellte die Elektroporation dar, mit der bis zu 70 % Transfektionseffizienz erreicht werden
konnten. Elektroporation läßt sich für die Herstellung stabiler Zellinien und für Zellkulturexperimente einsetzen, nicht aber für einen in vivo-Gentransfer.
Ergebnisse
Seite 65
Das Ras-inhibierende DNA-Konstrukt anti-ras-scFv (s. unter 3.1.2) ist für gentherapeutische Experimente vorgesehen, um es spezifisch in die Wirts-Endothelzellen in Tumormodellen zu transportieren. Dazu wurde es in unserem Labor in einen Adenovirus (AdEasySystem, C. Goemans, unveröffentliche Ergebnisse) kloniert, dessen Infektionseffizienz bei
T-HUVEC noch nicht getestet wurde. Parallel dazu wurde eine alternative Möglichkeit des
in vivo-Gen-Transfers über ein chemisches Transfektionsverfahren untersucht, welches die
Testung im Tiermodell unter S1-Bedingungen ermöglichen würde. Dazu wurden unter kontrollierten und standardisierbaren Bedingungen Nanopartikel aus Calcium, Phosphat und
DNA hergestellt, mit denen sich reproduzierbare und experimentator-unabhängige Transfektionseffizienzen in T-HUVEC erzielen lassen. In Zellkultur konnten damit bessere Resultate
erzielt werden als mit der Standard-Calciumphosphat-Methode, allerdings lag die Transfektionseffizienz trotzdem weit unter der von anderen chemischen Transfektionsreagenzien
(Polyfect, Superfect, Rotifect) und sehr weit unter der bei der Elektroporation (Tab. 3.2). Die
mit chemischen Reagenzien erzielten Transfektionseffizienzen müssen für einen in vivoEinsatz noch verbessert werden, um einen effizienten Gen-Transfer zu erlauben. Vor allem
für den Transfer eines intrazellulär wirkenden therapeutischen Proteines oder Peptides sind
sehr hohe Effizienzen notwendig, damit auch möglichst viele Zellen den gewünschten Effekt
zeigen. Bei Transfektion von sekretierbaren Proteinen oder Peptiden, die auch parakrine
Wirkungen haben, reichen u. U. wenige Zellen, die das Therapeutikum produzieren.
Tabelle 3-2: Transfektionseffizienzen mit verschiedenen Transfektionsmethoden in T-HUVEC,
bestimmt durch fluoreszenzmikroskopische Zellzählung EGFP-expremierender Zellen nach
Transfektion des EGFP-codierenden Referenzvektors pcDNA3-EGFP mindestens 24 h nach
Transfektionsende.
Transfektionsmethode
Standard Calcium-Phosphat-Methode
Polyfect®
Calciumphosphat-DNA Nanopartikel
Superfect®
Rotifect®
Elektroporation
3.1.2
Transfektionseffizienz in %
3,1
10,4
5,2
21,1
25,8
70
Herstellung stabiler anti-ras-scFv expremierender Zellinien
3.1.2.1 Das Doxycyclin-regulierbare Expressionssystem TetOn/TetOff
Zur Herstellung stabiler Zellinien wurde der anti-ras-Einzelketten-Antikörper (anti-ras-scFv) in ein pharmakologisch durch Doxycyclin regulierbares Expressionssystem
subkloniert (TetOn/TetOff®). Das Tet-System ist ein induzierbares Expressionssystem für
eukaryote Zellen, das aus dem Tetracyclin-Resistenz-Operon (Tn10 Transposon) aus E. coli
von Gossen und Bujard (1992) entwickelt wurde. Durch Zugabe oder Wegnahme des wirksameren Tetracyclin-Derivates Doxycyclin wird die Expression des interessierenden Genes
angeschaltet. Dazu werden doppelt-stabile Zellinien benötigt, die mit dem Regulatorplasmid
pTetOn oder pTetOff und einem Responseplasmid ptre2, ptre2Hyg oder pBiEGFP (enthält
das interessierende Gen) transfiziert werden. Beide Regulatorplasmide tragen eine Neomycin-Resistenz unter einem SV40-Promotor, so daß zur Selektion von Transfektanden das
Seite 66
Ergebnisse
Neomycin-Analogon G418 eingesetzt werden kann. Auf dem Responseplasmid wird das
interessierende Gen direkt unter Kontrolle des TRE (Tetracycline responsive element) und
eines minimalen CMV-Promotors (PminCMV) expremiert. Das TRE besteht aus einer siebenfachen Wiederholung der 42 bp-umfassenden tet-Operator-Sequenz tetO. Ohne den an das
TRE gebundenen Transkriptions-Transaktivator wird das interessierende Gen nicht abgelesen.
Beim TetOff-System wird die Transkription des interessierenden Genes durch Entzug
von Doxycyclin aktiviert. Der vom Regulatorplasmid pTetOff unter Kontrolle eines CMVPromoters codierte Tetracyclin-kontrollierte Transaktivator tTA, ein Fusionsprotein aus dem
Tetracyclin-abhängigen Repressor tetR und der VP16-Transaktivierungsdomäne aus dem
Herpes-Simplex-Virus, bindet bei Vorhandensein von Doxycyclin nicht an das TRE auf dem
Responseplasmid. Bei Entzug von Doxycyclin kann der rTA an das TRE binden und das
interessierende Gen wird transkribiert.
Beim TetOn-System wird die Transkription durch einen reversen Transaktivator rtTA,
der sich in vier Aminosäuren von dem tTA unterscheidet, aktiviert. Der rtTA bindet bei Vorhandensein von Doxycyclin an das TRE und aktiviert die Transkription.
Abbildung 3-5: Funktionsweise des TetOff-Systems (BD Clontech). Dargestellt ist die Proteinexpression in Abhängigkeit vom Doxycyclin-Spiegel.
3.1.2.2 Funktionsblockierende anti-ras-Einzelkettenantikörper (anti-ras-scFv)
Der funktionsblockierende Einzelkettenantikörper anti-ras-scFv wurde von B. Feldhaus (Feldhaus 1999) aus dem monoklonalen Antikörper Y13-259 hergestellt (vergl. Bradbury et al. 1993 sowie Werge et al. 1990). Er liegt in der Form VH-(GGGS)4-VL vor, wobei
die beiden antigen-bindenden variablen Regionen durch den 16 Aminosäuren umfassenden
Linker verbunden sind. Um den anti-ras-scFv immunzytochemisch markieren und in Western-Blot-Analysen detektieren zu können, wurde ein C-terminal angehängtes Myc-Epitop
verwendet (Sequenz: EQKLISEEDL), das über PCR angefügt wurde (C. Goemans, unveröffentliche Ergebnisse). Die Gen- und Protein-Sequenz des verwendeten anti-ras-scFv findet
sich in Anhang B. Die immunzytochemische Markierung des myc-Epitopes in T-HUVEC
konnte nicht zum Nachweis verwendet werden, da die Zellen mit dem hier verwendeten monoklonalen anti-Myc-Antikörper (9E10) bereits vor Transfektion mit dem Myc-Epitopversehenen Konstrukt eine deutliche Immunreaktivität, vor allem im Zellkern, zeigten
Ergebnisse
Seite 67
(Tab. 3.1). In Western-Blot-Analysen lassen sich anti-ras-scFv-myc (ca. 29 kD) und das
endogene c-Myc-Protein (ca. 62 kDa) leicht durch die unterschiedliche Größe unterscheiden.
3.1.2.3 Herstellung stabiler T-HUVEC-TetOn-/TetOff-anti-ras-scFv
Es wurden verschiedene Plasmid-Vektoren zur Herstellung doppelt- bzw. dreifachtransfizierter Zellinien zur induzierbaren Expression des anti-ras-scFv verwendet (Abb. 3.6):
Für die Herstellung des Transkriptions-Regulators wurden die Plasmide pTetOff und pTetOn
transfiziert. Der anti-ras-scFv wurde in alle drei Responseplasmide subkloniert. Mit dem
ptre2Hyg-anti-ras-scFv ist eine Selektion zur Isolierung von stabil transfizierten Zellklonen
und eine Nachselektion zur Erhaltung der Expression des anti-ras-scFv möglich. Mit dem
letztendlich verwendeteten pBiEGFP-anti-ras-scFv wird mit zwei bidirektional angeordneten Tet-responsiven Elementen (TRE) die Expression von EGFP und von anti-ras-scFv parallel reguliert. Damit ist eine Verfolgung der An- und Abschaltung der Expression in Abhängigkeit vom Doxycyclin-Spiegel im Medium in den lebenden Zellen über fluoreszenzmikroskopischen Nachweis von parallel expremiertem EGFP möglich. So können Rückschlüsse auf das Expressionsniveau des anti-ras-scFv gezogen werden, ohne daß Zellen für immunzytochemische Färbungen fixiert oder für proteinchemische Analysen lysiert werden
müssen. Die Selektion der stabil transfizierten Klone erfolgt dabei durch das ko-transfizierte
Resistenzplasmid pTKHyg. hierbei kann eine Nachselektion nur indirekt zur Erhaltung der
Expression des anti-ras-scFv beitragen.
Anti-ras-scFv-myc
Abbildung 3-6: Verwendete Vektoren pTetOff, pTK-Hyg und pBiEGFP-anti-ras-scFv zur Herstellung der Zellinie T-HUVEC-anti-ras-scFv.
Zur Auswahl der Klone T-HUVEC-TetOff oder T-HUVEC-TetOn mit stabiler Expression des Tet-Regulators (1. Transfektion) wurden verschiedene Verfahren angewendet.
Nach transienter Transfektion mit einem Reporterplasmid ptre2Hyg-Luciferase wurde im 96Well-Format nach Luciferin-Zugabe eine luminometrische Messung (mit dem PhosphoImager) im Vergleich mit/ohne Doxycyclin mit allen Klonen durchgeführt, die densitometrisch ausgewertet wurde. Als Vergleichswert wurde die Expressionsinduktion durch Zugabe/Wegnahme von Doxycyclin als Expressionsteigerungsfaktor angegeben. Nach transienter
Ko-Transfektion mit den Plasmiden pBiEGFP und pDsRed-N1 im 96-Well-Format wurden
die Fluoreszenzintensitäten gemessen. Die Transfektionseffizienz bzw. Zellzahlschwankungen wurde durch Normalisierung der gemessenen EGFP-Intensitäten auf die DsRed-
Seite 68
Ergebnisse
Intensität herausgerechnet. Die normalisierte EGFP-Intensitätssteigerung durch Zugabe/Wegnahme von Doxycyclin wurde bestimmt.
Von den 86 Klonen wurden insgesamt 7 Klone, die nach diesen beiden Analyse eine
gute Expressionssteigerungsrate aufwiesen, für die 2. Transfektion ausgewählt (vergl.
Tab. 3.3). Von den aus diesen 7 Transfektionen mit pBiEGFP-anti-ras-scFv erhaltenen 52
Klonen wurden zunächst die ausgewählt, die fluoreszensspektrometrisch im 96-Well-Format
eine Intensitätssteigerung für EGFP nach Doxycyclin-Zugabe/-Wegnahme zeigten. Dies
wurde dann fluoreszenzmikroskopisch durch Abschätzung der Fluoreszenzintensität überprüft. Insgesamt fünf Klone, darunter drei TetOn- und zwei TetOff-Klone, wurde ausgewählt, da sie unter normalen Bedingungen keine oder nur schwache meß- oder sichtbare,
aber unter Induktionsbedingungen eine deutlich erhöhte EGFP-Fluoreszenz zeigten. Aufgrund eigener Vorerfahrung sowie von Erfahrungen aus anderen Arbeitsgruppen wurden die
TetOff-Klone für die weiteren Untersuchungen bevorzugt verwendet. Die TetOn-Klone zeigen häufiger eine schlechtere Unterdrückbarkeit der Expression unter NichtInduktionsbedingungen, was bei wachstumshemmenden transfizierten Genen zu einer Selektion von nicht mehr expremierenden Zellinien führt. Außerdem sind diese Zellen hinsichtlich
des FCS im Kulturmedium sehr viel anspruchsvoller, da bereits Spuren von Tetracyclin oder
seinen Derivaten zu einer Expressionsinduktion führen können. Sofern nicht anders angegeben, wurden in allen Experimenten die Zellinie T-HUVEC-TetOff-anti-ras-scFv-myc Klon
14-4 verwendet und kurz als T-HUVEC-anti-ras-scFv bezeichnet.
Tabelle 3-3: Verlauf der doppelt-stabilen Transfektion zur Herstellung von TetOn/TetOff-Antiras-scFv-Zellinien und Zahl der erhaltenen Zellinien.
TetOn
TetOff
3.1.3
Screening nach
1. Transfektion
38 Klone
48 Klone
Ausgewählt für 2.
Transfektion
3, 11, 16, 26
7, 14, 15
2. Transfektion
18 Klone
34 Klone
Ausgewählt
(Klon-Name)
11-0, 26-8, Mix
14-4, 14-10
Ras-Bindung des anti-ras-scFv und kompartiment-spezifische Expression
des anti-ras-scFv in T-HUVEC
Zum Nachweis der Expression eines funktionellen anti-ras-scFv wurde eine Koimmunopräzipitation von anti-ras-scFv mit Ras aus Ganz-Zell-Lysaten durchgeführt. Dazu wurde
nach Lyse der Zellen das Lysat mit anti-myc-Antikörper und anti-Maus-IgG-Agarose inkubiert. Nach Präzipitation der Immunkomplexe durch Abzentrifugation der Agarose und
stringentem Waschen des Präzipitates wurde dieses durch SDS-PAGE aufgetrennt. Im darauffolgenden Western-Blot wurde mit einem anti-pan-Ras-Antikörper detektiert (Abb. 3.7).
In der Höhe von 21 kDa wurde in den Präzipitaten nach Induktion der anti-ras-scFvExpression (durch Entzug von Doxycyclin) eine Doppelbande detektiert, die Ras entsprach.
Zur Kontrolle wurden von den beiden endgültig ausgewählten Klonen 14-4 und 14-10 nichtinduzierte Klone sowie Wildtypzellen untersucht, um auszuschließen, daß durch den antimyc-Antikörper Ras über endogenes Myc-Protein präzipitiert wurde. Bei diesen Kontrollen
konnte kein Ras im Western-Blot detektiert werden. Der in den Zellen nach Induktion der
Expression vorliegende anti-ras-scFv hatte an Ras gebunden, wobei die Interaktion direkt
Ergebnisse
Seite 69
oder indirekt erfolgen könnte. Bei den oberhalb von der leichten Antikörperkette vorliegenden Banden könnte es sich um unspezifische Banden (durch unspezifische Bindungen an den
anti-Myc-Antikörper) oder um mit-präzipitierte Ras- oder Myc-Interaktoren handeln. Bei der
Kontrolle ohne anti-Myc-Antikörper wurden kaum Banden außer dem IgG aus der IgGAgarose erkannt. Die Bande der schweren Kette der Antikörper (etwa 50 kDa) und des endogenen Myc-Proteins (etwa 66 kDa) ließen sich nicht trennen.
29 kDa 21 kDa 14-4 26-8
11-0 14-10 Mix-0
- doxycycline
+ anti-myc
+ IgG agarose
14-4 14-10 WT 14-4 14-10 WT
+ doxycycline
+ anti-myc
+ IgG agarose
+ doxycycline
- anti-myc
+ IgG agarose
Abbildung 3-7: Western-Blot-Analyse nach Ko-Immunopräzipitation von anti-ras-scFv mit Ras
aus Ganzzell-Lysaten von T-HUVEC-anti-ras-scFv und Wildtyp-T-HUVEC als Kontrolle. Kontrollen ohne anti-myc-Antikörper und mit Doxycyclin. Größenstandard s. Markerbanden.
Die Expression des anti-ras-scFv sollte auch direkt in den Lysaten gezeigt werden.
Zunächst wurden zytoplasmatische Überstände und Ganzzell-Lysate untersucht, in denen
aber keine Expression im Western Blot durch Detektion mit anti-Myc-Antikörpern gezeigt
werden konnte. Nur nach Abtrennung der unlöslichen Bestandteile des Lysate konnte in
diesen eine entsprechende schwache Bande in Höhe von etwa 29 kDa detektiert werden
(Abb. 3.8). Eine Zunahme der Expression nach Induktion (48 h) läßt sich zeigen, allerdings
keine komplette Unterdrückung der Expression bei fehlender Induktion. Unter NichtInduktionsbedingungen fand sich anti-ras-scFv in der löslichen und unlöslichen Fraktion,
während bei Induktion der Expression kein anti-ras-scFv in der löslichen Fraktion zu finden
war. Im Vergleich von mehreren Experimenten wurde eine maximale Expressionsinduktion
von 2fach bis 4fach beobachtet. Daneben band der Antikörper auch, wie nach der MycFärbung der T-HUVEC (Tab. 3.1) erwartet, an endogenes Myc-Protein, das in T-HUVEC
expremiert wird und etwa bei 62 kDa liegt. Endogenes Myc war in der löslichen und unlöslichen Fraktion vorhanden.
Seite 70
Ergebnisse
Lösliche Proteine
cytoplasmatischer
Überstand
-
+
Unlösliche Proteine
Membranteile
-
+
Induktion der Expression
des anti-ras-scFv myc
- 72 kDa
e
- 30 kDa
a
Abbildung 3-8: Western-Blot-Analyse der Expression des anti-ras-scFv mit und ohne Induktion
im löslichen, zytoplasmatischen Überstand und in der unlöslichen Fraktion mit Zellkernen/Membranresten. Die Membran wurde mit anti-myc-Antikörper detektiert. e→ markiert
das endogene Myc, a→ den anti-ras-scFv-myc. Größenstandard s. Markerbanden.
3.2 Signaltransduktion von VEGF in T-HUVEC
3.2.1
VEGF-Ausschüttung durch T-HUVEC
Da Tumorzellen und Endothelzellen die Fähigkeit haben, VEGF und PlGF zu synthetisieren und zu sekretieren, wurde überprüft, ob die Zellen kontinuierlich VEGF oder PlGF
freisetzen. Dazu wurde die Konzentrationen von VEGF und PlGF im Überstand von 2 * 105
Zellen mit einem ELISA bestimmt. Die Zellen wurden mindestens 24 h vor der Stimulation
ausgesät und 12 h serumfrei vorinkubiert. Das Medium, in dem die Konzentrationen von
VEGF und PlGF gemessen wurden, wurde frisch zugegeben und nach 3 h von den Zellen
abgesaugt (Sekretionsphase). In diesem von den Zellen abgenommenen serumfreiem Medium wurden eine Freisetzung von 15 pg/ml VEGF pro 3 h und 2 * 105 Zellen gemessen, wobei parallel in zell-freien Vertiefungen inkubiertes Medium als Referenzwert verwendet
wurde. PlGF konnte unter gleichen Experimentbedingungen in den Überständen nicht detektiert werden. Die PlGF-Konzentration lag damit unter der Nachweisgrenze des verwendeten
ELISA von 15 pg/ml.
3.2.2
Freisetzung von NO
3.2.2.1 Kolorimetrische Nitrit-Bestimmung
Die kolorimetrische Bestimmung der NO-Freisetzung erfolgt indirekt über den Nachweis von aus NO gebildetem Nitrit. Die Freisetzung wurde in Hepes-gepuffertem Meßpuffer
bestimmt, der zur Vermeidung von Scherstreß bei Stimulationsbeginn 2 h vor Stimulation
zugegeben wurde. 2*105 Zellen pro Vertiefung wurden in Meßpuffer mit Faktor stimuliert.
Nach Ende der Stimulationszeit wurde der Überstand abgenommen und für weitere 60 min
Ergebnisse
Seite 71
im offenen Gefäß bei RT inkubiert, damit das NO unter Luftsauerstoff zu Nitrit abreagieren
kann. Die Nitritbestimmung erfolgte dann über Zugabe des Griess-Reagenzes und Extinktionsmessung bei 512 nm. Eine Standardreihe mit frisch angesetzter Nitrit-Lösung wurde zur
Quantifizierung verwendet. Als basale Freisetzungsrate wurden 1,0±0,1 nmol pro h*2*105
Zellen in 300 µl bestimmt, was etwa 5 fmol pro h und pro Zelle entspricht. Nach 10 min
Stimulation mit 30 ng/ml VEGF-E wurden insgesamt 4,8±0,5 nmol pro 2*105 Zellen in
300 µl Meßpuffer gemessen, nach 60 min Stimulation 5,1±0,5 nmol pro 2*105 Zellen in
300 µl. Bei VEGF-E-Stimulation wurden also insgesamt pro Stunde etwa 26 fmol pro Zelle
freigesetzt (basale + stimulationsabhängige Freisetzung). Davon ist dann die basale Freisetzung abzuziehen, um die stimulationsabhängige Freisetzung zu ermitteln: VEGF-E erhöhte
stimulationsabhängig die stündliche Freisetzung um 4,1 nmol pro 2*105 Zellen in 300 µl
Meßpuffer, was pro Zelle 21 fmol pro h und Zellen bei VEGF-E-Stimulation entspricht. Der
größte Anteil des gebildeten NO wurde dabei innerhalb der ersten 10 min freigesetzt. Zum
Vergleich wurde als Freisetzung nach 60 min VEGF-Stimulation eine Freisetzungsrate von
5,2±0,6 nmol pro 2*105 Zellen ermittelt, was einem stimulationsabhängigen Anteil von
4,2 nmol pro h*2*105 Zellen in 300 µl entspricht. Die Experimente mit den Inhibitoren wurden mit VEGF-E durchgeführt, da entsprechend den elektroanalytischen Messungen (s. unter
3.2.2.2) nur der VEGFR2 die Freisetzung stimuliert und so nur die VEGFR2 vermittelte
Freisetzung gemessen wird. Effekte von VEGF auf andere Nicht-Tyrosinkinase-Rezeptoren,
wie die Neuropiline, oder Rezeptor-Heterodimerisierungen wurden so minimiert. Da die
absolute Quantifizierung aufgrund der vielen Einflußfaktoren (nitritfreies Wasser, Nitritstandard, Reaktionszeiten/-bedingungen) schwierig war, wurden die Inhibitionseffekte prozentual im Vergleich zu bei jeder Messung durchgeführten Inhibitionskontrolle (keine Inhibition,
nur VEGF-E) und Nullkontrollle (basale NO-Freisetzung, keine Inhibition, kein VEGF-E)
gemessen (Tab. 3.4). Die Zellen wurden vor der Messung 30 min mit den Inhibitoren in Kulturmedium vorbehandelt. Die Messung erfolgte in Meßpuffer mit Inhibitor bei 60 min Stimulation mit 30 ng/ml VEGF-E.
Um zu überprüfen, ob die verringerte NO-Freisetzung eine Relevanz für die zelluläre
Stoffwechselaktivität bzw. das Überleben hat wurde ein globaler Zellvitalitätstest mit den
gleichen Inhibitoren in serumhaltigem Kulturmedium durchgeführt. Der Überlebenstest
(s. 3.3.3), basierend auf Zellzählungen war zu aufwendig, um ihn mit allen Inhibitoren
durchzuführen. Die MTT-Aktivität wurde relativ zu Kontrollzellen, die in serumhaltigem
Kulturmedium ohne Inhibitor kultiviert wurden, bestimmt, die als 100 % gesetzt wurde. Bei
über 50 Messungen ergab sich eine mittlere MTT-Aktivität von 100±18 % für die Kontrolle.
Bei der MTT-Zellaktivitätsmessung ist die kolorimetrisch gemessene Farbreaktion proportional zur kumulativen metabolischen Aktivität der Zellen (Mosmann 1984). Die Inkubation
mit den Inhibitoren erfolgte 48 h lang. In der anschließenden Bestimmung wurde die MTTStoffwechsel-Aktivität als verringert angesehen, wenn die mittlere relative Aktivität in % der
Kontrolle unter 64 % lag (zweifache Standardabweichung unter 100 %). Eine verringerte
Stoffwechselaktivität wurde bei Inhibition von NOS durch L-Name, bei intrazellulärer Calcium-Chelatisierung durch EGTA-AM und BAPTA-AM, bei Inhibition von Src durch PP2
und bei VEGFR-Inhibition beobachtet (Tab. 3.4). Bei all diesen Inhibitoren war auch die
Seite 72
Ergebnisse
NO-Freisetzung verringert. Nur bei Inhibition von PI3K durch LY294002 war eine MTTAktivitätsreduktion zu beobachten, ohne daß die NO-Freisetzung verringert war. Bei den
Inhibitoren, die die NO-Freisetzung beeinflussen, könnte dies auch eine Relevanz für den
zellulären Zustand haben, ohne daß aus dem globalen MTT-Test eine Eingrenzung der betroffenen Phänomene möglich ist.
Tabelle 3-4: Kolorimetrische Nitrit-Bestimmung durch Griess-Reagenz. Die Extinktion von
Überständen von Zellen nach 60 min VEGF-E-Stimulation ohne Inhibition wurde als 100 %
gesetzt (*5,1±0,6 nmol pro 2*105 Zellen entspricht 100±12 % und †3,0±0,4 nmol pro h*2*105
Zellen basale Freisetzungsrate entspricht 59±13 %, beides in 300 µl Überstand). In der letzten
Spalte ist zum Vergleich die relative MTT-Aktivität nach 48 h Behandlung mit den Inhibitoren
(im Bezug auf Kontrolle von 100 %) angegeben: ↓ bedeutet relative MTT-Aktivität
≤64 %=100±2*STABW. → bedeutet relative MTT-Aktivität > 100±2*STABW=64 %.
Keine Inhibition
2 mM L-Name
10 µM BAPTA
10 µM BAPTA-AM
10 µM EGTA
10 µM EGTA-AM
1mg/l Verapamil
10 nM Nifedipin
100 nM PP2
100 nM PP3
10 µM Fluvastatin
20 mM Ramiprilat
10 µM UO126
10 µM LY294002
10 µM VEGF-TK-inhibitor
Ohne Inhibition, ohne VEGF-E
NOS-Inhibitor
Calcium-Chelator, extrazellulär
Calcium-Chelator, intrazellulär
Calcium-Chelator, extrazellulär
Calcium-Chelator, intrazellulär
Kationisch-amphiphiler Ca-KanalInhibitor
Ca-Kanal-Inhibitor (Dihydropyridin-Typ)
Src
Inaktives PP-Analogon
HMG-CoA-Reductase
ACE-Hemmer
MEK
PI3K
VEGFR
NO-Freisetzung
in %
100±12*
61
97
64
93
55
102
MTT
→
↓
→
↓
→
↓
→
100
73
103
102
98
95
89
65
→
↓
→
→
→
→
↓
↓
59±13†
3.2.2.2 Elektroanalytische NO-Bestimmung
Auf Deckgläschen ausgesäte T-HUVEC wurden in einer Hanks-Salzlösung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren stimuliert. Parallel dazu wurden jeweils mit mindestens 16 h
L-Name vorbehandelte Zellen mit Faktoren stimuliert. Die mit Nickelporphyrin-beschichtete
Diskus-Elektrode mit 50 µm Durchmesser wurde dazu im definierten Abstand über den Zellen positioniert. Das von den Zellen freigesetzte NO diffundiert zur Elektrode und wird als
Oxidationsstrom voltametrisch gemessen (Abb. 3.9). Vor Zugabe der Wachstumsfaktoren
wurde abgewartet, bis sich ein konstanter Basisstrom eingestellt hat. Dieser wurde für die
Darstellung abgezogen, so daß die Stimulation bei 0 nA Stromfluß begonnen wurde. Nach
VEGF-E-Stimulation wurde ein deutliches Signal von maximal 0,45 nA aufgezeichnet. Der
resultierende Strom zeigte zwei Maxima nach etwa 2 min und 5 min. Eine Rückkehr zum
Basisstrom wurde nach jeweils etwa 10 min beobachtet. Nach Stimulation mit VEGF wurde
ein deutlich kleineres Stromsignal mit maximal circa 0,12 nA beobachet, das ein Maximum
zwischen 2,5 und 5 min zeigte. Eine Rückkehr zum Basisstrom trat nach etwa 8 min auf. Bei
Ergebnisse
Seite 73
24 h L-Name Vorinkubation in Kulturmedium und L-Name Zugabe zur Hanks-Meßlösung
wurde kein Stromsignal nach VEGF- und VEGF-E-Stimulation aufgezeichnet. Stimulation
von T-HUVEC-Fmt mit mCSF-1 und von T-HUVEC mit PlGF-1 unter denselben Meßbedingungen zeigte auch keine Veränderung des Stromsignals im Vergleich zum Basisstrom,
was nahelegt, daß Aktivierung des VEGFR1 nicht an der Freisetzung von NO beteiligt ist.
Um Scherstreß durch die Faktorzugabe auszuschließen, wurde in einem Kontrollexperiment
nur Puffer in den Tropfen pipettiert. Scherstreß ist ein bekannter Stimulus NO-Freisetzung
von Endothelzellen. Beim Zupipettieren wurde keine Stromsignalveränderung ausgehend
vom Basisstrom beobachtet (nicht gezeigt). Abbildung 3.9 zeigt exemplarische Kurven. Für
jede Messung wurden mindestens drei Ableitungen gemacht. Die Zeit bis zur Rückkehr zum
Basisstrom betrug dabei immer zwischen 5 und 15 min nach Stimulationsbeginn, der Strom
am Maximum der Kurve war bei VEGF-E-Stimulation zwischen zwei- und vierfach höher
als beim Maximum der Kurve bei VEGF-Stimulation. Im Unterschied dazu wurde bei der
indirekten kolorimetrischen Nitrit-Bestimmung kein signifikanter Unterschied bei der Freisetzungsrate nach VEGF- und VEGF-E-Stimulation beobachtet (s. 3.2.2.1).
0.4
0.4
0.2
0.2
I/nA
0.6
I/nA
0.6
VEGF
0.0
0.0
LNAME+VEGF
-0.2
-0.2
0
100
200
300
400
0
500
t/s
0.6
100
200
0.2
0.2
400
500
600
I/nA
0.4
I/nA
0.4
300
t/s
0.6
0.0
0.0
LNAME+VEGF-E
VEGF-E
-0.2
-0.2
0
200
400
600
800
1000
0
t/s
0.6
100
200
0.4
0.2
0.2
400
500
600
I/nA
I/nA
0.4
300
t/s
0.6
0.0
mCSF-1
0.0
PlGF-1
-0.2
-0.2
0
100
200
300
t/s
400
500
600
0
100
200
300
400
500
600
t/s
Abbildung 3-9: Amperometrische, abstandskontrollierte Messung der NO-Freisetzung als Oxidationstrom in Abhängigkeit von der Zeit nach Stimulation mit je 30 ng/ml Wachstumsfaktor,
teilweise mit 24 h Vorinkubation mit 2 mM L-Name. Messung in Hanks Salzlösung. In Zusammenarbeit mit S. Isik.
Eine vielfache Wiederholung der NO-Freisetzung mit einem automatisierten Messungssystem in Multititerplatten (Reiter et al. 2004) in kontrolliertem Abstand zur Zelloberfläche zeigte bei VEGF-E-Stimulation ähnliche Kurvenverläufe mit Maximum und Rückkehr zum Basisstrom wurde allgemein nach 5 bis 15 min beobachtet. Der zweigipfelige Ver-
Seite 74
Ergebnisse
lauf wurde nicht bei jeder Messung gesehen. Exemplarische Kurven für VEGF-EStimulation mit und ohne L-Name-Inhibition zeigt Abbildung 3.10.
VEGF-E
VEGF-E
VEGF-E
L-Name
ohne Zellen
100 pA
-200
0
200
400
600
800
Abbildung 3-10:
Abstandskontrolliert
differential-pulsamperometrische Messung der NO-Freisetzung in Multititerplatte im Kombi-SECM als Oxidationsstrom in Abhängigkeit von der Zeit.
Messung in Meßpuffer. Höhe des Stromsignales s. Balken. Stimulation mit ca.
30 ng/ml VEGF-E und maximal 8 h
Vorinkubation mit 2 mM L-Name in
Meßpuffer. In Zusammenarbeit mit S.
Reiter.
1000
t [s]
3.2.3
VEGF-abhängige Aktivierung von cdc42
Es sollte untersucht werden, ob und mit welchem zeitlichen Verlauf durch VEGF und
die beiden VEGF-Rezeptoren das GTP-bindende Protein cdc42 aus der Rho-GTPase-Familie
aktiviert wird. Zur Bestimmung der stimulationsabhängigen Aktivierung von cdc42 nutzt
man die Bindung von aktiviertem cdc42 an seinen Effektor PAK aus. So kann man mit
PAK-GST aktiviertes cdc42 aus Lysaten von stimulierten T-HUVEC präzipitieren und in
Western-Blot-Analyse untersuchen. Dazu wurde mit GST-markiertem PAK und GlutathionSepharose ein Pulldown-Experiment aus Ganzzell-Lysaten mit standardisierten Proteinmengen durchgeführt. Das Präzipitat wurde durch eine SDS-PAGE aufgetrennt und in einer Western-Blot-Analyse cdc42 mit einem spezifischen Antikörper detektiert. Das detektierte
cdc42 ist aktiviertes cdc42. Als Kontrollen wurden parallel Proben ohne Pulldown mit 15 µg
Protein aus den Lysaten auf gleichen Gehalt an cdc42 (Gesamt-cdc42) untersucht. Nur Experimentserien mit vergleichbarem Gehalt an cdc42 in allen Proben einer Stimulationsserie
wurden verwertet. Weiterhin wurden Kontrollen ohne Zugabe von PAK-GST untersucht, um
eine unspezifische Bindung von cdc42 an Glutathion-Sepharose zu zeigen, was nicht der Fall
war (nicht gezeigt).
Eine Langzeit-Stimulation mit VEGF über 8 h zeigte eine maximale cdc42Aktivierung nach 4 h (Abb. 3.11A). Mit den rezeptorspezifischen Liganden PlGF und
VEGF-E wurden in kürzeren Stimulationsexperimenten ähnliche zeitliche Aktivierungsmuster beobachtet Abb. 3.11B/C). Stimulation mit beiden Faktoren führte zur Aktivierung von
cdc42, die demzufolge von beiden VEGF-Rezeptoren vermittelt werden kann. Bei beiden
Ergebnisse
Seite 75
Faktoren nahm die Aktivierung bis 3 bzw. 4 h zu, wobei das Maximum bei PlGFStimulation mit 3 h etwas früher als bei VEGF-E mit 4 h lag.
A
0
2
4
6
8
Stunden VEGF
- 25,4 kDa
B
C
VEGF-E
0
30
60
120
180
240 min
PlGF
0
30
60
120
180
240 min
- 25,4 kDa
Abbildung 3-11: VEGF-abhängige Aktivierung von cdc42 nach Pulldown-Präzipitation und
Western-Blot-Analyse von aktiviertem cdc42 aus T-HUVEC-Lysaten. Die Serien zeigen ein
representatives Ergebnis aus drei Analysen. A: Langzeitstimulation mit 30 ng/ml VEGF. B:
Stimulation mit 30 ng/ml VEGF-E. C: Stimulation mit 30 ng/ml PlGF-1. Größenstandard
s. Markerbande.
3.2.4
VEGF-abhängige Aktivierung von Akt/PKB
Die Aktivierung von Akt/PKB wurde in Stimulationsexperimenten untersucht
(Abb. 3.12). Dazu wurden verschieden lang mit den Wachstumsfaktoren stimulierte
T-HUVEC oder T-HUVEC-Fmt lysiert und die Lysate mit SDS-PAGE aufgetrennt. Im
nachfolgenden Western-Blot wurde phosphorylierte Akt mit einem spezifischen Antikörper
detektiert. Zur Kontrolle auf gleichen Gehalt an Akt (phosphoryliert und nicht phosphoryliert) wurde der Blot nach dem Experiment mit einem anti-Akt-Antikörper, der Akt unabhängig vom Phosphorylierungszustand erkennt, redetektiert (nicht gezeigt). Zur Kontrolle
wurde bei den Stimulationen je eine Probe mit LY294002, einem PI3K-Inhibitor, 30 min
vorinkubiert. Nach LY294002-Vorinkubation wurde keine Akt-Phosphorylierung beobachtet. Nach Stimulation mit allen Faktoren wurde eine Akt-Phosphorylierung nach 10 bis
30 min beobachtet, bei mCSF-1- und PlGF-1-Stimulation eine schwächere als bei VEGF und
VEGF-E. Bei VEGF, mCSF-1, PlGF-1 war die Akt-Phosphorylierung nach 10 und 30 min in
etwa gleich, während sie bei VEGF-E-Stimulation nach 10 min maximal und bis 30 min
schon wieder deutlich abgefallen war.
0
10
30
+
10
LY294002
min stimuliert mit
VEGF
mCSF-1
PlGF-1
VEGF-E
Abbildung 3-12: Western-Blot-Analyse der
AKT-Phosphorylierung in T-HUVEC-Fmt
nach Stimulation mit je 30 ng/ml der angegebenen Wachstumsfaktoren ohne oder mit
30 min Vorinkubation mit 10 µM PI3KInhibitor LY294002. Representatives Ergebnis aus drei Experimentserien.
Seite 76
Ergebnisse
3.3 Regulation der Endothelzellfunktionen
3.3.1
Übersicht Endothelzellfunktionen
Die Rolle der einzelnen VEGF-Rezeptoren und von Signaltransduktionsmediatoren
wie Ras, NO und Src wurde in verschiedenen Funktions-Untersuchungen analysiert, die
Rückschlüsse auf typische Endothelzellfunktionen erlauben, darunter Teilungsaktivität, Proliferation, Überleben und Wanderung der Endothelzellen. Vorgänge wie die Bildung organisierter Strukturen auf Extrazellularmatrix-Gelen, Zellwanderung und Zellteilung spiegeln
eher den Zustand des aktiven Endothels wider, wie er bei der Bildung neuer Blutgefäße vorliegt. Das Zellüberleben hingegen ist für jede Endothelzelle von Bedeutung, da der Ruhezustand der Blutgefäße im Körper der Normalzustand ist. Abbildung 3.13 zeigt eine schematische Übersicht der untersuchten Eigenschaften und Funktionen der Endothelzellen.
Endothelium
aktiv
ruhend
Zellteilung
Migration
Differenzierung
Überleben
BrdU-Inkorporation
Boyden-Chemotaxis
In vitro Angiogenese
Überlebens-Assay
Abbildung 3-13: Schematische Übersicht über die untersuchten Endothelzellfunktionen mit
lichtmikroskopischen Bildern der jeweiligen Untersuchungsmethode.
3.3.2
DNA-Synthese/Zellteilungsaktivität
Um die Zellteilungsaktivität der T-HUVEC nach Stimulation mit den verschiedenen
Wachstumsfaktoren zu bestimmen, wurde die BrdU-Inkorporationsrate ausgezählt. Dazu
wurden die Zellen durch vorherigen 48-stündigen Serumentzug teilweise synchronisiert und
anschließend für 24 h mit Wachstumsfaktoren stimuliert. Zellen, die sich während der abschließenden einstündigen BrdU-Inkubationsphase, in der S-Phase befinden, bauen das angebotene BrdU in die neusynthesierte DNA ein. Die BrdU-markierte DNA kann nach einer
Nuklease-Reaktion und Fixierung mit saurem Ethanol-Fixans durch anti-BrdU-Antikörpern
immunzytochemisch detektiert werden. Die BrdU-Inkorporationsrate wurde in dabei als
Anteil BrdU-positiver Zellen an der Gesamtzahl der Zellen durch Auszählen bestimmt und
in Abbildung 3 .14 dargestellt.
Zunächst wurden T-HUVEC-Fmt mit VEGF und den rezeptorspezifischen Liganden
stimuliert und die BrdU-Inkorporationsraten bestimmt (Abb. 3.14). Ohne Stimulation unter
serumfreien Bedingungen zeigten die T-HUVEC-Fmt eine basale BrdU-Inkorporationsrate
Ergebnisse
Seite 77
von 9,2±2,2 %. Die Stimulation von T-HUVEC-Fmt mit allen verwendeten Faktoren VEGF,
mCSF-1, PlGF und VEGF-E (je 30 ng/ml) führte zu einer signifikanten Erhöhung der BrdUInkorporationsrate um das 2,7 bis 3,1fache im Vergleich zur serumfreien Kontrolle.
T-HUVEC-anti-ras
T-HUVEC-Fmt
40
30
% BrdU positive Zellen
% BrdU positive Zellen
35
30
25
20
15
10
25
20
15
10
5
5
VEGF
CSF-1
PlGF
VEGF-E
VE
an
t
-
i-r
as
-s cF
G
F
v
an
ti- VE
r a GF
VE
sG
sc
FFv
E
V
an
E
ti- GF
ra
Pl
s- E
G
sc
FF
1
an Pl v
G
t ira F-1
ssc
Fv
0
0
Abbildung 3-14: BrdU-Inkorporationsrate in T-HUVEC-Fmt und in T-HUVEC-anti-ras-scFv
mit/ohne Induktion der anti-ras-scFv-Expression nach 24-stündiger Stimulation mit den angegebenen Faktoren (30 ng/ml). p < 0,05 vs. serumfreie Kontrolle.
Um die Effekte der Ras-Inhibition zu untersuchen, wurde die BrdU-Inkorporationsrate
auch in T-HUVEC-anti-ras überprüft (Abb. 3.14), die eine niedrigere basale BrdUInkorporationsrate von 3,3±5,8 % als die T-HUVEC-Fmt zeigten. Die Inhibition von Ras
durch Induktion der anti-ras-scFv-Expression in T-HUVEC-anti-ras führte zu keiner Veränderung der basalen BrdU-Inkorporationsrate (ohne Stimulation unter serumfreien Bedingungen). Ohne Ras-Inhibition führten VEGF, PlGF und VEGF-E zu einer Erhöhung der BrdUInkorporationsrate um das 5,6 bis 6,4-fache im Vergleich zur basalen Inkorporationsrate
unter serumfreien Bedingungen. Die Ras-Inhibition unterdrückte den durch alle Wachstumsfaktoren stimulierten Effekt auf die BrdU-Inkorporationsrate, so daß bei vorhandener RasInhibition trotz Stimulation nur eine basale BrdU-Inkorporationsrate beobachtet werden
konnte. Die Anregung der Zellteilungsaktivität durch VEGF, PlGF und VEGF-E war Rasabhängig und wurde daher durch Inhibition der Ras-Funktion durch den anti-ras-scFv vollständig unterdrückt.
3.3.3
Zellüberleben
Zunächst wurden Experimentbedingungen entwickelt, unter denen unter serumfreien
Bedingungen mehr als 70 % der Zellen über fünf Tage abstarben. Dies war bei fünftägiger
serumfreier Vorinkubation und bei fünf Experimenttagen mit täglichem Mediumwechsel
(ebenfalls serumfreies Medium) der Fall. Die Überlebensrate in % wurde durch Zählung der
Seite 78
Ergebnisse
Zellen an Tag 5 im Vergleich zur Zahl der Zellen an Tag 0 in definierten Feldern auf dem
Deckgläschen mit Raster bestimmt.
Abbildung 3.15 zeigt die Überlebensraten in T-HUVEC-Fmt. VEGF (Überlebensrate
74,3±3,8 %) und VEGF-E (61,4±3,9 %) hatten einen deutlichen Überlebenseffekt im Vergleich zu serumfreien Kontrollen (23,6±0,9 %), während mCSF-1 (23,5±2,4 %) keinen und
PlGF-1 (34,5±1,5 %) nur einen geringen Überlebenseffekt zeigten. Der Überlebenseffekt
von VEGF wurde daher vermutlich über den VEGFR2 vermittelt. Der Unterschied zwischen
nicht überlebensförderndem mCSF-1, das den intrazellulären Teil des VEGFR1 im schimären Fmt-Rezeptor selektiv aktiviert, und dem wenig überlebensfördernden PlGF, das
VEGFR1 und Nrp-1 aktiviert, beruhte wahrscheinlich auf der zusätzlichen Nrp-1Aktivierung. Durch VEGF wurde der maximale Überlebenseffekt erreicht, durch VEGF-E
ein signifikant schwächerer. Dies widerspricht auf jeden Fall der Hypothese, daß zusätzlich
zum VEGFR2 aktivierte Rezeptoren (z. B. VEGFR1) die Signaltransduktion vom VEGFR2
inhibieren. In diesem Fall sollte der Überlebenseffekt von VEGF-E selektiv über VEGFR2
maximal sein und nicht der von VEGF, wie es hier der Fall war.
T-HUVEC-anti-ras
100
Überlebende Zellen an Tag 5 in % von Tag 0
Überlebende Zellen an Tag 5 in % von Tag 0
T-HUVEC-Fmt
50
0
-
VEGF
CSF-1
PlGF
VEGF-E
100
80
60
40
20
0
-
Fv
sc
-E
Fv
Fv
sc
sc
GF
,
,
E
-E
V
GF
GF
VE
VE
GF
VE
Abbildung 3-15: Überlebensrate in % (Zahl überlebender Zellen in % von Tag 0) in
T-HUVEC-Fmt und in T-HUVEC-anti-ras mit und ohne Induktion der anti-ras-scFvExpression sowie bei Behandlung mit jeweils 30 ng/ml Wachstumsfaktor. p < 0,05 vs. serumfreie Kontrolle.
Als nächstes wurde der Effekt der Ras-Inhibition auf den VEGF-Überlebenseffekt untersucht (Abb. 3.15). Die T-HUVEC-anti-ras hatten eine ähnliche basale Überlebensrate wie
die T-HUVEC-Fmt von 25,8±4,2 % unter serumfreien Bedingungen. Die basale Überlebensrate veränderte sich auch bei Induktion der anti-ras-scFv-Expression nicht (28,0±8,3). Bei
Stimulation mit VEGF (81,5±8,1 % vs. 84,2±6,9% mit Ras-Inhibition) und VEGF-E
(85,5±6,2 % vs. 74,1±16,0 % mit Ras-Inhibition) war die Überlebensrate mit und ohne Ras-
Ergebnisse
Seite 79
Inhibition gleich Daraus folgt, daß Ras hier keine essentielle Rolle spielte. Da PlGF nur einen geringen Überlebenseffekt hatte, wurde der Effekt der Ras-Inhibition nicht untersucht.
Ein Signaltransduktionsmediator, der selektiv nach Stimulation von VEGFR2 freigesetzt wird und an der Vermittlung des Überlebenssignales beteiligt sein kann, ist NO
(s. 3.2.2). Daher wurde der Effekt der NOS-Inhibition auf den VEGF- und VEGF-EÜberlebenseffekt in T-HUVEC-Fmt untersucht (Abb. 3.16). Zur kompetitiven Inhibition der
NO-Synthase wurde während der fünf Experimenttage das Arginin-Analogon L-Name zusätzlich zugegeben und die Überlebensraten bestimmt. Bei Stimulation mit VEGF und
VEGF-E führte die NOS-Inhibition durch L-Name zu einer kompletten Unterdrückung des
Überlebenseffektes, der durch beide Faktoren vermittelt wurde. Zusätzlich zu den Wachstumsfaktoren zugegebenes L-Name reduzierte die Überlebensraten jeweils auf das basale
Niveau, wie es unter serumfreien Bedingungen erhalten wurde (Überlebensrate 23,6±0,9).
Die Überlebensraten lagen bei 20,8±2,5 % für VEGF + L-Name und 13,6±4,8 % für
VEGF-E + L-Name.
Ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren kann deren Effekt durch Zugabe eines NODonors imitiert und sogar übertroffen werden. Durch tägliche Zugabe von 20 µM NOC-18
an den fünf Experimenttagen wurde ohne weiteren Wachstumsfaktor eine Überlebensrate
von 105,2±16,7 % erreicht, die signifikant höher lag als die Überlebensraten bei Stimulation
mit allen untersuchten Wachstumsfaktoren. Zur Kontrolle wurde NOC-18 auch zu Zellen
gegeben, die entweder mit VEGF + L-Name oder VEGF-E + L-Name behandelt wurden, um
auszuprobieren, ob die NOS-Inhibition durch Zugabe von NOC-18 ausgeglichen oder übertroffen werden kann. Bei VEGF + L-Name + NOC-18 lag die Überlebensrate bei 126 % und
bei VEGF-E + L-Name + NOC-18 bei 135 % und entsprach damit den Ergebnisse bei alleiniger Zugabe von NOC-18.
140
120
Abbildung 3-16: Überlebensraten in T-HUVEC-Fmt bei
zusätzlicher NOS-Inhibition
(2 mM L-Name) bzw. 20 µM
NO-Donor NOC-18 (ohne
zusätzlichen Faktor) nach
Stimulation mit verschiedenen Wachstumsfaktoren (je
30 ng/ml).
100
80
60
40
20
p < 0,05 vs. serumfreie
Kontrolle.
E
C
-1
8
N
O
M
-N
A
FE
FE,
L
VE
G
VE
G
VE
G
F,
L
-N
A
M
VE
G
F
E
0
-
Überlebende Zellen an Tag 5 in % von Tag 0
T-HUVEC-Fmt
Seite 80
Ergebnisse
Als NO-Donor wurde bei den Überlebensexperimenten NOC-18 oder DETANONOate eingesetzt. Die Halbwertszeit von NOC-18 in PBS bei 22 °C beträgt 3400 min (=
ca. 57 h), bei 37 °C entsprechend kürzer. In der Literatur wird eine Freisetzung von weniger
als 100 nM bei 20 µM NOC-18 in Zellkulturexperimenten angegeben (Estevez et al. 1998).
Die Freisetzung wurde mit der kolorimetrischen Nitritbestimmung unter Zellkulturbedingungen in serumfreiem Medium überprüft (37 °C, 10 % CO2, wassergesättigte Atmosphäre).
Unter den Bedingungen der Zellüberlebensbestimmung wurden direkt nach Zugabe von
20 µM NOC-18 pro Stunde 4,6 µM Nitrit gemessen, was der gleichen Konzentration an freigesetztem NO entspricht. Aufgrund der stetigen Freisetzung sinkt die freigesetzte NOMenge danach kontinuierlich. In den 0,3 ml Medium wurden damit anfänglich 1,39 nmol pro
Stunde freigesetzt, die auf 2*104 Zellen wirkten, was pro Zelle 70 fmol/h entspricht und
damit, zumindestens anfänglich, über der basalen Freisetzungsrate von T-HUVEC von
5 fmol pro h und Zelle und der bei bei VEGF-E-Stimulation von T-HUVEC bestimmten
Freisetzungsrate von 26 fmol pro h und Zelle liegt. Die basale Freisetzungsrate der
T-HUVEC wurde allerdings nicht unter vergleichbaren Bedingungen (sehr viel kürzere Inkubationszeit in serumfreiem Medium) bestimmt und ließ sich daher nicht direkt vergleichen. Da der NO-Donor nur alle 24 h frisch zugegeben wurde, schwankt die NOFreisetzungsrate über die Zeit relativ stark.
3.3.4
Proliferation (Zellzahlvermehrung)
Die DNA-Synthese-Aktivität, die häufig über H³-Thymidin- oder BrdU-Einbau-Raten
bestimmt wird, ist ein Element der Proliferation neben u. a. dem Zellüberleben. Die Gleichsetzung von DNA-Synthese-Aktivität mit Proliferation berücksichtigt nicht die weiteren
Komponenten, wie das Zellüberleben. Hier wurde daher der Begriff Proliferation für die
Zellzahlvermehrung verwendet. Da die Veränderung der Zellzahl ein Misch-Phänomen aus
Zellteilungsaktivität und Zellüberleben ist, wurden hierbei keine einzelnen Signalwege untersucht, sondern nur die Beiträge der VEGF-Rezeptoren zum Gesamtphänomen abgeschätzt. Zur Bestimmung der Proliferationsaktivität wurde die Zellzahlveränderung nach
48 h Stimulation mit den Wachstumsfaktoren untersucht. Dabei wurden die Experimentbedingungen so gewählt, daß in den serumfreien Kontrollen die Zellzahl über die 48 h in etwa
gleich blieb. Die Zellzahl wurde durch Zählung der Zellen in definierten Arealen auf Deckgläschen mit Raster durchgeführt. Als Ergebnis wurde jeweils die Zellzahl an Tag 2 in % der
Zellzahl an Tag 0 (Proliferationsindex) angegeben. Unter serumfreien Bedingungen lag die
Zellzahl von T-HUVEC-Fmt an Tag 2 bei 104,7±0,6 % (Abb. 3.17).
Alle verwendeten Faktoren hatten einen proliferationsfördernden Effekt in
T-HUVEC-Fmt, wobei der Effekt von VEGF (207,4±11,6 %) am größten war und dann abnehmend in der folgenden Reihenfolge: VEGF-E (167,6±6,4 %) > PlGF (131,6±3,0 %) >
mCSF-1 (120,4±2,4 %). Der kleine, aber signifikante Unterschied zwischen mCSF-1 und
PlGF-1 könnte auf den folgenden Faktoren beruhen: Zum einen auf der Aktivierung von
Neuropilin-1 durch PlGF-1 oder zum anderen auf einem zusätzlichen Effekt durch den extrazellulären Teil des VEGFR1. Beide Rezeptoren, VEGFR1 und VEGFR2, waren an der
Ergebnisse
Seite 81
Proliferationsförderung beteiligt, wobei die Bedeutung des VEGFR2 größer war, vermutlich
durch Erhöhung der Zellteilungsaktivität und des Zellüberlebens, während VEGFR1 nur die
Zellteilung anregte.
T-HUVEC-Fmt
Zellzahl an Tag 2 in % von Tag 0
300
Abbildung 3-17: Zellzahlveränderung nach 48 h Stimulation mit
verschiedenen Wachstumsfaktorkonzentrationen in % der Zellzahl
an Tag 0 (Proliferationsindex).
T-HUVEC-Fmt wurden mit je
30 ng/ml der angegebenen Wachstumsfaktoren stimuliert.
200
100
0
-
3.3.5
VEGF
CSF-1
PlGF
VEGF-E
p < 0,05 vs. serumfreie Kontrolle.
Vergleich mit primären HUVEC
Allgemein zeigten die primären HUVEC größere Inhomogenität innerhalb einer Präparationspopulation und noch mehr zwischen Präparationen. Es waren bei den
Zählexperimenten in definierten Felder (Überleben, Zellzahl-Vermehrung, BrdU) teilweise
sehr viel größere Schwankungen und größere Empfindlichkeit gegenüber
Wachstumsfaktorstimulation zu beobachten als bei den T-HUVEC. Alle Experimente mit
primären HUVEC wurden innerhalb der Passagen 2 und 3 durchgeführt. Anstatt serumfreien
Mediums wurde bei allen Experimenten Medium mit 0,1 % FCS verwendet, außer bei
Zellzahl-Vermehrung (dort 1 % FCS). Die Experimentbedingungen wurden teilweise leicht
modifiziert (s. Kap. 2). Tabelle 3.5 zeigt eine Übersicht der Ergebnisse mit primären
HUVEC im Vergleich zu den mit T-HUVEC erhaltenen Ergebnissen.
Tabelle 3-5: Ergebnisse der Überlebens-, BrdU-Inkorporations-Raten und ZellzahlVermehrung bei HUVEC nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren (jeweils 30 ng/ml) im Vergleich zu T-HUVEC. *p < 0,05 vs serumfreie Kontrolle.
Faktor
VEGF
CSF-1
PlGF-1
VEGF-E
BrdU-Inkorp. in %
HUVEC
T-HUVEC
1,3±2,3
9,2±2,2
29,0±8,3*
25,1±6,9*
26,7±2,5*
26,1±3,3*
24,7±3,1*
20,6±7,3*
28,7±6,3*
Überlebensrate in %
HUVEC
T-HUVEC
33±9
23,6±0,9
107±32*
74,3±3,8*
23,5±2,4
38±17
34,5±1,5*
166±68*
61,4±3,9*
Proliferationsrate in %
HUVEC
T-HUVEC
107±20
104,7±0,6
389±88*
207,4±11,6*
120,4±2,4*
143±40
131±3,0*
303±42*
167,6±6,4*
Die Mitogenizität von HUVEC wurde wie bei den T-HUVEC über die BrdUInkorporationsrate quantifiziert. Ohne Wachstumsfaktor haben die HUVEC eine sehr geringe basale DNA-Synthese-Aktivität (1,3±2,3 %), die geringer als bei den T-HUVEC war
(9,2±2,2 %). Durch alle getesteten Faktoren wurde die BrdU-Inkorporationsrate signifikant
Seite 82
Ergebnisse
erhöht, wobei die Unterschiede zwischen den Faktoren VEGF, PlGF-1 und VEGF- E nicht
signifikant waren. In primären HUVEC wurde das mitogene Signal ebenso wie in T-HUVEC
über VEGFR1 und VEGFR2 gleichermaßen vermittelt, was aus gleichen Effekten von PlGF
und VEGF-E folgt.
Die basale Überlebensrate, angegeben als Zahl überlebender Zellen (in 0,1 % FCS) an
Tag 2 in % der Zellzahl von Tag 0, von HUVEC lag bei 33±9 %. Das Überleben der HUVEC wurde nur durch VEGF und VEGF-E mit Überlebensraten von 107±32 %und
166±68 % gleichermaßen gefördert. Obwohl VEGF-E einen stärkeren Effekt zu haben
schien, war der Unterschied zwischen VEGF und VEGF-E nicht signifikant. PlGF hatte keinen überlebensfördernden Effekt. Im Unterschied dazu hatte PlGF-1 in T-HUVEC einen
leichten Überlebenseffekt, mCSF-1 jedoch keinen. Ob die primären HUVEC Nrp-1 expremieren, wurde nicht überprüft. Der VEGFR1 war an der Vermittlung des Überlebenseffektes
bei HUVEC und T-HUVEC wahrscheinlich nicht beteiligt, während der VEGFR2 sicher
einen Überlebenseffekt vermittelte.
Die Proliferation von HUVEC, gemessen als Zellzahlveränderung (Proliferationsindex) nach 48 h Stimulation mit den Wachstumsfaktoren, wurde durch VEGF und VEGF-E
deutlich stimuliert, resultierend in einer Zellzahlsteigerung auf 389±88 % und 303±42 %.
PlGF führte zu keiner signifikanten Zellzahlvermehrung (143±40 %), verglichen mit der
basalen Vermehrungsrate ohne Wachstumsfaktorzusatz (107±20 %). hier wurde der
VEGF-Effekt ausschließlich durch VEGFR2 vermittelt. Bei T-HUVEC hingegen wirkten
alle Faktoren (auch PlGF und mCSF-1), wenn auch in unterschiedlichem Umfang, signifikant proliferationsfördernd. Am wirksamsten waren auch bei T-HUVEC VEGF und
VEGF-E.
3.3.6
Migration
Die Beteiligung der einzelnen Liganden der VEGF-Familie, der VEGF-Rezeptoren
und von Ras, NO und Src wurde in einem Chemotaxis-Experiment untersucht. Dazu wurde
eine modifizierte Boyden-Chemotaxis-Kammer mit 48 Wanderungskammern verwendet.
Dabei migrierten die Zellen aus einem Reservoir durch eine Membran mit Poren definierter
Größe (hier 12 µm) in eine Kammer, in der der Faktor vorgelegt wurde. Durch das Vorlegen
des Faktores auf der zellfreien Gegenseite entstand über die Membran hinweg ein FaktorGradient, der die Zellen auf die andere Membranseite führte. Bei der Auswertung wurden
nur die Zellen auf der Gegenseite, die also die Membranporen passiert haben, ausgezählt.
Damit die Zellen auf einen Wanderungsreiz reagieren, wurden sie 5 Tage in serumfreiem
Medium vorinkubiert. Die optimale Zahl der ausgesäten Zellen wurde zuvor ausgetestet, um
einen dosis-abhängigen linearen Effekt bei Vorlage verschiedener Konzentrationen an FCS,
das chemotaxis-förderund ist, zu erhalten (C. Grote-Westrick, unveröffentliche Ergebnisse).
Bei zu großer Zellzahl ist die Zahl der Poren limitierend, bei zu kleiner Zellzahl sind pro
Gesichtsfeld zu wenige migrierte Zellen auszählbar. Die Zahl der Zellen auf der Gegenseite
nach Anfärbung der Zellen wurde in mehreren Gesichtsfeldern gezählt und ist bei jeweils
Ergebnisse
Seite 83
gleicher Anzahl eingesetzter Zellen ein Maß für den Migrationseffekt durch den jeweiligen
Faktor.
Migrationsexperimente wurden mit Wildtyp-T-HUVEC, T-HUVEC-Fmt und
T-HUVEC-anti-ras durchgeführt. Tabelle 3.6 und Tabelle 3.7 zeigen eine Übersicht der Ergebnisse mit den verschiedenen Faktoren und Signaltransduktionsinhibitoren in den verschiedenen Zellinien.
Tabelle 3-6: Zahl der migrierenden T-HUVEC-anti-ras bei Vorlage von je 30 ng/ml des Wachstumsfaktors in Spalte 1. Mittelwerte±Standardabweichung aus drei Experimenten. * p < 0,05
vs. serumfreier Kontrolle in derselben Spalte. † p < 0,05 vs. Stimulation mit demselben Faktor
ohne Inhibition.
Inhibition
ohne
Ras
NO- Synthese
Src
Ras+ NO +Src
VEGF
10,8 ± 6,4
24,0 ± 4,8*
9,8 ± 9,5
13,4 ± 4,9†
1,4 ± 0,2†
14,4 ± 1,3†
3,2 ± 1,2†
10,0 ± 1,5†
0,3±0,3†
3,0±1,2†
PlGF
19,9 ± 4,2*
10,2 ± 3,6†
17,7 ± 2,5*
18,0 ± 1,3*
7,9±1,6†
VEGF-E
36,5 ± 18,0*
23,7 ± 12,9†
9,7 ± 1,8†
10,1 ± 2,1†
4,8±2,0†
Die Zahl migrierender Zellen (T-HUVEC-anti-ras, Tab. 3.6) ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren oder/und Inhibitoren (Basalniveau) lag bei 10,8±6,4. Zum Vergleich wurden
für T-HUVEC-Wildtyp-Zellen als Basalniveau 3,4±0,8 und für T-HUVEC-Fmt 6,3±3,6 ermittelt (Tab. 3.6). Alle getesteten Faktoren der VEGF-Familie, VEGF, PlGF und VEGF-E
waren migrationsfördernd in T-HUVEC-anti-ras, was für eine Beteiligung beider VEGFRezeptoren bei der Vermittlung der Migrationsstimuli spricht. Die Migrationsaktivität von
VEGF und VEGF-E lag signifikant höher als die von PlGF. Zur genaueren Eingrenzung der
Rolle von VEGFR1 wurden die Experimente mit T-HUVEC-Fmt wiederholt (Tab. 3.7). Hier
ergaben sich ähnliche Verhältnisse wie bei T-HUVEC-anti-ras: Alle Faktoren, VEGF, PlGF,
mCSF-1, VEGF-E, stimulierten die Migrationsaktivität signifikant. Auch hier war die Migrationsaktivitätssteigerung bei VEGF und VEGF-E deutlich höher als bei PlGF und mCSF-1.
Die gleiche Migrationsaktivität bei PlGF und mCSF-1 wies auf eine Vermittlung über
VEGFR1 und nicht über Neuropilin-1 hin.
Eine Inhibition von Ras durch Induktion der Expression des anti-ras-scFv führte bei
Stimulation mit allen Faktoren zu einer signifikanten Verringerung der Zahl migrierender
Zellen auf das Basalniveau. Die Zahl migrierender Zellen ohne Faktorstimulation mit und
ohne Ras-Inhibition war gleich, was eine Beteiligung von Ras bei Aufrechterhaltung der
basalen Migrationsaktivität unwahrscheinlich macht.
Eine Inhibition der NO-Synthase durch L-Name führte zu einer signifikanten Reduktion der basalen Zahl von migrierenden Zellen (ohne Faktor-Stimulation). Bei Stimulation mit
VEGF und VEGF-E reduzierte NOS-Inhibition die Zahl der wandernden Zellen auf das Niveau ohne Stimulation und Inhibition (Basalniveau). Bei Stimulation mit PlGF hat die NOSInhibition keine Auswirkungen und die Zahl der wandernden Zellen war wie ohne Inhibition.
Da Stimulation der T-HUVEC mit PlGF auch keine stimulationsabhängige NO-Freisetzung
verursachte (s. unter 3.2.2), war es kongruent, daß die NOS-Inhibition den PlGF-Effekt bei
der Migration nicht unterdrücken konnte. VEGF und VEGF-E führten in T-HUVEC zur NO-
Seite 84
Ergebnisse
Freisetzung und auch zur Steigerung der Migrationsaktivität. Umgekehrt konnte die Vorlage
steigender Konzentrationen des NO-Donors NOC-18 ohne weitere Faktorzugabe die Zahl
migrierender T-HUVEC-Wildtypzellen dosisabhängig steigern (Tab. 3.7). Der Dosiseffekt
führte nicht zur linearen Steigerung der Migrationsaktivität. Bereits relativ geringe Konzentrationen NOC-18, die zu geringerer Freisetzung von NO im Vergleich der zu von den Zellen
freigesetzten Menge führen, stimulierten die Migrationsaktivität sehr deutlich. Bei Vorlage
von 2,0 µM NOC-18, einer 10fach niedrigeren Konzentration als z. B. bei den Überlebensmessungen (vergl. 3.3.3), migrierten etwa doppelt so viele Zellen wie bei VEGFStimulation.
Die Inhibition von Src durch PP2 hat exakt gleichsinnige Effekte wie die NOSInhibition, was nahelegte, daß die Src-Aktivierung bei der basalen stimulationsunabhängigen
Migrationsaktivität und bei dem stimulationsabhängigen Migrationseffekt durch VEGF und
VEGF-E beteiligt war (Tab. 3.6).
Eine gleichzeitige Inhibition von Ras durch intrazelluläre Expression von anti-rasscFv, der NOS durch L-Name und von Src durch PP2 führte erwartungsgemäß zur kompletten Unterdrückung des Migrationseffektes, des stimulationsabhängigen wie des stimulationsunabhängigen.
Tabelle 3-7: Zahl der migrierenden T-HUVEC bei Vorlage von verschiedenen Konzentrationen
von NOC-18 und Zahl der migrierenden T-HUVEC-Fmt bei Stimulation mit Wachstumsfaktor
(30 ng/ml). Mittelwerte±Standardabweichungen, * p < 0,05 vs. serumfreie Kontrolle.
T-HUVEC-WT
Keine
0,1 µM NOC-18
0,2 µM NOC-18
2,0 µM NOC-18
Zahl migrierender
Zellen
3,4±0,8
18,9±3,5*
39,7±5,1*
54,6±2,8*
T-HUVEC-Fmt
VEGF-A
CSF-1
PlGF
VEGF-E
Zahl migrierender
Zellen
6,2±3,6
30,5±9,0*
19,4±3,3*
19,8±6,3*
32,1±6,3*
Zusammengefaßt ergab sich, daß beide VEGF-Rezeptoren migrationsfördernde Effekte vermitteln konnten. Die basale stimulationsunabhängige Migrationsaktivität wurde durch
Ras-Inhibition nicht verändert, aber die durch beide VEGF-Rezeptoren vermittelte. NO
spielte eine Rolle bei der basalen stimulationsunabhängigen Migrationsaktivität und bei der
VEGFR2-vermittelten, nicht aber bei der VEGFR1-vermittelten. Die Effekte der SrcInhibition waren direkt parallel zur NOS-Inhibition, was nahelegte, daß Src im selben Signalweg wie NO vorkommen könnte. Inhibition aller drei Signalmediatoren Ras, NO und
Src unterdrückte die Migration stimulationsabhängig und –unabhängig vollständig.
3.3.7
Ausbildung tubulärer Strukturen auf extrazellulärer Matrix (in vitroAngiogenese)
Als Modell für wichtige Vorgänge bei der Angiogenese, nämlich dem Aussprossen
aus dem Muttergefäß, gefolgt von Migration, Proliferation, Ausbildung von ZellZellkontakten und Adhäsion, sind verschiedene Untersuchungsmethoden in vitro und in vivo
möglich. Die zweidimensionale Organisation und Anordnung von Endothelzellen auf Gelen
Ergebnisse
Seite 85
aus extrazellulärem Matrix-Protein wird als in vitro-Angiogenese-Modell verwendet. Das
Protein-Gel wird aus Engelbreth Holm-Swarm Mäuse-Tumoren gewonnen und dient als
in vitro Basalmembran, die den Untergrund für die Ausbildung der organisierten Strukturen
von Endothelzellen dient. Ohne Zugabe eine Angiogenese-förderndern Faktors bildeten
T-HUVEC nach 5 d serumfreier Vorinkubation keine Strukturen, die an Gefäßquerschnitte
erinnern aus (Abb. 3.18). Die Zellen wurden auf dem durch Wärme erstarrten Proteingel
ausgesät und nach 16 h Inkubation untersucht. Durch Zugabe von VEGF, mCSF-1, PlGF-1
und VEGF-E konnten solche Strukturen erhalten werden (Abb. 3.18). Durch Inhibition von
Ras durch Induktion der Expression von anti-ras-scFv (in T-HUVEC-anti-ras-scFv durch
Entzug von Doxycyclin) konnte diese Anordnung unterdrückt werden. T-HUVEC-anti-rasscFv zeigten bei Kultivierung und Aussaat in Doxycyclin-haltigem Medium (0,1 µg/ml) bei
Stimulation mit allen Faktoren die Ausbildung der charakteristischen Strukturen (nicht gezeigt), die bei Doxycyclin-Entzug unter denselben Bedingungen unterdrückt wurden.
Abbildung 3-18: Ausbildung tubulärer Strukturen auf extrazellulärem Matrix-Gel bei Stimulation mit verschiedenen Faktoren (s. Beschriftung; bei Doxycyclin-Entzug wird anti-ras-scFv
expremiert).
Die Ausbildung der Strukturen erfordert die Stimulation verschiedener Vorgänge, wie
Migration, Differenzierung und Zelladhäsion. Da außerdem beide VEGF-Rezeptoren daran
beteiligt sind, werden vermutlich mehrere Signalwege und intrazelluläre Mediatoren an der
Signalvermittlung beteiligt sein. Durch Zugabe von Inhibitoren wurde untersucht, ob einer
der Signalwege eine so zentrale Rolle spielt, um den komplexen Vorgang zu unterbinden
(Tab. 3.8). Da alle Faktoren die in vitro Angiogenese fördern, wurden alle Versuche mit
allen Faktoren durchgeführt. Als Negativ-Kontrolle wurde zusätzlich bei VEGF-Stimulation
Seite 86
Ergebnisse
ein VEGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor zugegeben, der den VEGF-Effekt auch wirksam unterdrückte. Als Kontrolle für die Src-Kinase-Inhibitoren wurde das inaktive Analogon
PP3 verwendet. Die Inhibitoren wurden jeweils 30 min vor Aussaat auf dem Matrix-Gel
zugegeben. Keiner der Inhibitoren UO126, LY294002, PP1 und PP2 konnte die Ausbildung
der tubulären Strukturen bei Stimulation mit VEGF, PlGF oder VEGF-E verhindern. Ausschließlich die Zugabe von Manumycin, das im Unterschied zu den übrigen Inhibitoren 24 h
vor Aussaat zugegeben wurde, und die intrazelluläre Expression des anti-ras-scFv konnten
die Ausbildung der geordneten Strukturen unterdrücken. Dies war bei allen verwendeten
Faktoren der Fall (VEGF, PlGF und VEGF-E). Da Manumycin Ras indirekt über die Hemmung seiner Farnesylierung und Membranverankerung hemmt, wurde die längere Vorinkubation durchgeführt.
Tabelle 3-8: Abhängigkeit der Ausbildung tubulärer Strukturen auf extrazellulärem Matrix-Gel
nach Stimulation mit VEGF, PlGF, mCSF-1, VEGF-E und bei Inhibition folgender Signalwege.
3.3.8
Inhibitor
Inhibition von
10 µM UO126
10 µM LY294002
100 nM PP1, PP2
15 µM Manumycin
Expression von anti-rasscFv
MEK
PI3K
Src
Ras-Farnesylierung
Ras-Aktivierung
Ausbildung von geordneten Strukturen
Ja
Ja
Ja
Nein
Nein
Stimulationsabhängige und Ras-abhängige Sekretion von VEGF durch THUVEC
Die stimulationsabhängige VEGF-Sekretion durch T-HUVEC und T-HUVEC-anti-ras
wurde analog zu 3.2.1 bestimmt. Dadurch sollte ermittelt werden, ob die Bildung von Heterodimeren nach Zugabe eines Faktors durch stimulierte Sekretion des anderen Faktors durch
die Zellen möglich ist. Dann wären die untersuchten Effekte auch nach Zugabe eines rezeptor-spezifischen Liganden eventuell doch Mischeffekte von Rezeptor-Heterodimeren. Die
Stimulation mit den Wachstumsfaktoren erfolgte während der 3-stündigen Sekretionsphase.
Als Referenzwerte wurden jeweils nur Medium mit den Faktoren ohne Zellen im ELISA
gemessen und von den mit Zellen gemessenen Werten abgezogen, so daß nur die NettoFreisetzung (ohne den Faktorzusatz) bestimmt wurde. Abweichend von den übrigen Zellkulturexperimenten wurde die Stimulation mit je 3 ng/ml Wachstumsfaktor durchgeführt, um
nicht durch zu hohe Konzentration eine unspezifische Reaktion beim ELISA zu verursachen.
Die Ergebnisse des ELISA zeigt Tabelle 3.9. Durch Stimulation mit 3 ng/ml VEGF führte
zur Netto-Freisetzung von 3,8 ng/ml VEGF. Der Zusatz von FCS führte dosis-abhängig
ebenfalls zur Freisetzung von 1,1 ng/ml bei 0,1 % FCS und 2,3 ng/ml bei 5 % FCS. Überraschenderweise konnte weder durch PlGF noch VEGF-E eine VEGF-Sekretion stimuliert
werden, obwohl VEGF einen sehr deutlichen Effekt zeigt. Die Stimulation von entweder
VEGFR1 oder VEGFR2 war nicht ausreichend, um den Effekt beider Rezeptoren oder zusätzlicher Rezeptoren zu erzeugen. PlGF konnte in keinem der Überstände von stimulierten
oder unstimulierten Zellen detektiert werden, d. h. eine eventuelle Netto-Freisetzung lag
Ergebnisse
Seite 87
unter der Nachweisgrenze von 15 pg/ml. Zusammengefaßt ergab sich, daß die Sekretion von
VEGF nur durch VEGF gefördert werden konnte, nicht aber durch rezeptor-spezifische Liganden und damit selektive Aktivierung von jeweils VEGFR1 oder VEGFR2. PlGF konnte
in keinem Überstand nachgewiesen werden, unabhängig von der Stimulation der Zellen.
Tabelle 3-9: VEGF-Konzentration in pg/ml im Zellkulturüberstand von 2*105 T-HUVEC nach
3 h bei Stimulation mit FCS oder Wachstumsfaktoren (3 ng/ml). nd: nicht detektierbar, *
p < 0,05 versus serumfreie Kontrolle.
Serumfrei
VEGF
PlGF
VEGF-E
0,1 % FCS
5 % FCS
VEGF in pg/ml
15 ± 13
3779 ± 1262*
9±5
5±3
1060 ± 820*
2347 ± 524*
PlGF in pg/ml
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Da die VEGF-Synthese und –Sekretion Ras-abhängig reguliert sein kann, wurde die
VEGF-Ausschüttung unter denselben Bedingungen mit und ohne Ras-Inhibition in
T-HUVEC-anti-ras bestimmt (Tab. 3.10). Die anti-ras-scFv-Expression wurde länger als
48 h vor der VEGF-Bestimmung induziert und dann die Stimulation mit den verschiedenen
Wachstumsfaktoren (je 3 ng/ml) für drei Stunden während der Sekretionsphase durchgeführt.
Die Ras-Inhibition führte zu keiner signifikanten Reduktion der basalen, unstimulierten
VEGF-Freisetzung. Ein signifikanter Stimulationseffekt der Netto-Freisetzung von VEGF
wurde wie bei T-HUVEC nur durch VEGF-Stimulation erreicht. Bei der VEGF-Stimulation
hatte jedoch die Ras-Inhibition keine Auswirkungen auf die freigesetzte VEGF-Menge. Die
Sekretion von VEGF war damit nicht Ras-abhängig. Stimulation mit PlGF und VEGF-E
führte wie bei den Wildtyp-T-HUVEC zu keiner Steigerung der VEGF-Sekretion, die mit
und ohne Ras-Inhibition in etwa gleich niedrig war.
Tabelle 3-10: VEGF-Konzentration in pg/ml im Zellkulturüberstand von 2*105 T-HUVEC-antiras (Klon 14-4) nach 3 h bei Stimulation mit FCS oder Wachstumsfaktoren (3 ng/ml) und vorheriger mindestens 48 h Induktion der anti-ras-scFv-Expression. * p < 0,05 versus serumfreie
Kontrolle.
VEGF-Konzentration in
pg/ml
Serumfrei
VEGF
PlGF
VEGF-E
T-HUVEC-anti-ras-scFv keine
anti-ras-scFv-Expression
63 ± 52
2957 ± 319*
130 ± 73
73 ± 40
T-HUVEC-anti-ras-scFv
anti-ras-scFv-Expression
24 ± 5
3012 ± 44*
79 ± 44
102 ± 32
Seite 88
Ergebnisse
3.4 Wirkung der Ras-Inhibition auf das Wachstum von T-HUVEC
abgeleiteten Tumoren im Xenograft-Modell
3.4.1
Wachstum von T-HUVEC abgeleiteten Tumoren in Nacktmäusen
Um die Rolle von Ras beim Wachstum der T-HUVEC abgeleiteten Tumore im Tiermodell zu untersuchen, wurden die T-HUVEC-anti-ras-scFv in Nacktmäuse injiziert. Zunächst wurde ausgetestet, ob die Zellen in athymischen Nacktmäusen ohne vorherige Bestrahlung der Mäuse Tumore bilden. Wenn die Tumore nicht angegangen wären, wäre eine
zusätzliche Bestrahlung von 4,5 Gy durchgeführt worden. Verschiedene Zellzahlen zwischen
105 und 3*107 wurden in Matrigel resuspendiert und subkutan in die Flankenregion der Mäuse injiziert. Der Tumor bildete sich als Knoten, der subkutan palpierbar war (Abb. 3.19). Die
Tumorgröße wurde bei den lebenden Mäusen über eine Messung der Höhe, Tiefe und Breite
mit einer Schieblehre verfolgt und das Tumorvolumen als Ellipsoid bestimmt (≅ Höhe x
Breite x Tiefe x 0,5236).
B
A
C
Abbildung 3-19: Nacktmaus mit subkutan lokalisiertem Tumorknoten nach Injektion THUVEC ohne Hautveränderung oder durchscheinende Färbung (A). B: Entnahme des schwach
vaskularisierten Tumors. C: Entnommener Tumor.
Die Ergebnisse dieser Vorversuche sind in Tabelle 3.11 dargestellt, die Wachstumskurven für die einzelnen Mäuse finden sich im Anhang A. Bei den niedrigen Zellzahlen (105
und 5*105) haben sich keine Tumore entwickelt. Ein Tumorwachstum in allen Fällen konnte
bei Injektion von 106 und 5*106 Zellen pro Maus beobachtet werden. Bei höheren Zellzahlen
(107und 3*107) waren die Tumore nicht bei allen Mäusen angegegangen. Bei 107 implantierten Zellen wurden entweder sehr schnell wachsende Tumore (bis Tag 25) oder kein Tumor
beobachtet. Für die Experimente mit der Ras-Inhibition wurde 106 als die optimale Zellzahl
zur Injektion ausgewählt.
Ergebnisse
Seite 89
Tabelle 3-11: Ergebnisse der Vorversuche zur Tumorimplantation. Tumorvolumen ist angegeben als Mittelwert bei n≥2, sonst Einzelwert. In Klammern ist der Endpunkt der Reihe angegeben (Tag, an dem das letzte Versuchstier aus der jeweiligen Reihe getötet wurde).
Implantierte
Zellzahl
Zahl der
Mäuse (n)
Zahl der
Tumore (n’)
Tumorvolumen (am
Endpunkt)
105
5*105
106
5*106
107
3*107
1
1
3
3
3
3
0
0
3
3
2
1
0
0
1,9080 cm³ (Tag 37)
1,8682 cm³ (Tag 37)
2,8492 cm³ (Tag 25)
1,4661 cm³ (Tag 37)
3.4.2
Mittlerer
Tag mit
Tumorvolumen >
0,5 cm³
Mitosen pro 5
HPF
23
21
14
14
11,7±4,5
16,0±11,5
10,0
6,0
Ras-Inhibition in T-HUVEC-anti-ras-scFv (Zellinie 14-4) abgeleiteten Tumoren
Die T-HUVEC-anti-ras-scFv (Klon 14-4) wurden ebenfalls subkutan in individuell
markierte Mäuse injiziert und die Mäuse in folgende Gruppen aufgeteilt:
•
•
•
Kontrollgruppe: normale Ras-Funktion/ohne Ras-Inhibition durch ständige Versorgung
mit Doxycyclin-haltigem Trinkwasser (2 mg/ml). Behandlung: keine. Zahl der Tiere: 6
Präventionsgruppe: Ras-Inhibition von Tag 0 (Injektion) an durch Verabreichung doxycyclin-freien Wassers. Behandlung: Ras-Inhibition. Behandlungsbeginn: Tag 0. Zahl der
Tiere: 6.
Interventionsgruppe: Ras-Inhibition ab Manifestation eines Tumorknötchens (um Tag
18) durch Doxycyclin-freies Trinkwasser. Bis Tag 18 Doxcyclin-haltiges Trinkwasser
(2 mg/ml). Behandlung: Ras-Inhibition. Behandlungsbeginn: Tag 18. Zahl der Tiere: 6.
Das Experiment wurde gemäß tierschutzrechtlichen Erwägungen durch Tötung des
Tieres abgebrochen, sobald das Tumorvolumen ca. 1 cm³ überschritt oder andere Beeinträchtigungen durch den subkutanen Tumorknoten anzunehmen waren. Die Tiere zeigten normales Bewegungs- und Ernährungsverhalten. Eine zweite Experimentreihe wurde mit einem
weiteren Klon (14-10) durchgeführt, um unabhängig von der Integrationsstelle der stabil
transfizierten Gensequenz in der jeweiligen Zellinie zu sein. Die Ergebnisse wurden verworfen, da dieser Klon sich nachträglich auch in Zellkulturexperimenten als genetisch instabil
gezeigt hat. Vermutlich war es in den Zellen zu einem Verlust des Konstruktes gekommen.
3.4.3
Wachstumsverläufe der Tumoren mit Ras-Inhibition
Bei den Mäusen aus allen drei Gruppen (Kontroll-, Interventions-, Präventionsgruppe)
wurden die Tumorvolumina (TV) über die Zeit verfolgt. Als Endpunkt für den Vergleich der
Gruppen wurde Tag 60 angegeben, da zu diesem Zeitpunkt die letzten Kontrolltiere getötet
werden mußten. In Interventions- und Präventionsgruppe wurden die Tiere teilweise bis Tag
96 weiterbeobachtet. Die Verlaufskurven der Tumorvolumina für die einzelnen Mäuse finden sich im Anhang A. Der Verlauf des Wachstums der einzelnen Mäuse bis zum Experiment-Endpunkt Tag 60 wurde nach folgenden Kriterien eingeordnet:
Seite 90
•
•
•
•
Ergebnisse
Kein Tumor ausgebildet: Zu keiner Zeit war ein Tumor subkutan palpierbar.
Remission (komplett/partiell) bzw. Regression: Der Tumor schrumpft um mehr als 25 %
des maximalen Tumorvolumens (MTV). Komplette Remission: Der Tumor verschwindet vollkommen für mindestens 28 Tage. Partielle Remission: Der Tumor schrumpt um
mehr als 50 % des MTV. Regression: Der Tumor schrumpft um mehr als 25 % des
MTV.
Tumor-Stabilisierung (stable disease, no change): Der Tumor schrumpft oder nimmt zu
um weniger als 25 % des MTV.
Progression: Das Tumorvolumen steigt stetig an. Als verzögert wurde das Wachstum beschrieben, wenn die Tumorwachstumsverzögerung (s. u.) größer als 14 Tage war.
Als Wachstumsverzögerung wurde die Zeitspanne (Zahl der Tage) bezeichnet, die der
Tumor länger als in der Kontrollgruppe (Mittelwert) benötigte, um 0,5 cm³ Tumorvolumen
zu erreichen (vergl. Teicher et al. 1994).
3.4.3.1 Wachstumsverlauf der Tumore in den Gruppen
Für den Vergleich zwischen den Gruppen wurde Tag 60 als Endpunkt verwendet, da
bis Tag 60 alle Mäuse der Kontrollgruppe getötet werden mußten. Da in der Kontrollgruppe
nur 3 Tiere den Endpunkt Tag 60 erreicht haben, wurde als weiterer Endpunkt Tod bis
Tag 60 verwendet, um alle Tiere einschließen zu können. In der Interventions- und Präventionsgruppe wurden einzelne Tiere bis zum Tag 96 weiterbeobachtet. Tabelle 3.12 zeigt die
Übersicht über die ausgewerteten Tiere, die Eingruppierung des jeweiligen Wachstumsverlaufes und die Wachstumsverzögerung für die einzelnen Versuchstiere. Die Kontrollgruppe
erreichte 0,5 cm³ Tumorvolumen nach im Mittel 26,7 Tagen. Wenn der Tumor an Tag 96
(Tötung der letzten Versuchstiere) noch keine 0,5 cm³ TV erreicht hatte, wurde > 69 Tage
als Wachstumsverzögerung festgehalten.
Tabelle 3-12: Zahl der Tiere mit genanntem Wachstumsverlauf (maximal bis Tag 60) und Bezeichnung der einzelnen Versuchstiere. In Klammern hinter der Bezeichnung des Versuchstiers
findet sich die Wachstumsverzögerung (in Tagen). Römische Zahl bezeichnet den Malignitätsgrad nach Unnik et al. 1995. *markiert die bei der Berechnung der Mittelwerte für TherapieResponder herausgenommenen Tiere
Gruppe
Kein Tumor
Remission/
Regression
Stabilisierung
des TV
Kontrollgruppe
0
0
0
Präventionsgruppe
2
PT1-6 (> 69) PT1-1 (> 69) 0
1
PT1-4 (> 69) II
1
PT1-5 (58) II
2
TT1-5 (> 69) II
TT1-6 (> 69) III
0
Interventionsgruppe
Progression:
Verzögertes
Wachstum
0
2
PT1-2 (30)*III
PT1-3 (33) III
3
TT1-2 (33) III
TT1-3 (58) III
TT1-4 (19) II
Progression
6
KOT1-1 (0) III
KOT1-2 (0)*II
KOT1-3 (0) III
KOT2-1 (-7) III
KOT2-2 (2) III
KOT2-3 (6) I
0
1
TT1-1 (13)* III
Ergebnisse
Seite 91
Kontrollgruppe: Alle Tiere zeigten eine Progression des Tumors. Zwei Mäuse zeigten
extrem schnelles Anwachsen der Tumore (KOT1-1 und KOT1-2). KOT1-1 UND KOT1-2
mußten wegen Überschreiten eines Tumorvolumens von 1 cm³ bereits nach 26 Tagen getötet werden, KOT2-2 wegen Überschreiten eines Tumorvolumens von 1 cm³ bereits nach 36
Tagen.
Präventionsgruppe: Die Expression des anti-ras-Einzelkettenantikörpers von der Injektion an verhinderte bei zwei Mäusen (PT1-1, PT1-6) in der Präventionsgruppe die Ausbildung eines Tumors und führte bei einer Maus (PT1-4) zur Rückbildung eines anfänglich
vorhandenen kleinen Tumorknotens. Eine weitere Maus zeigte eine Stabilisierung des Tumorvolumens (PT1-5). Zwei Mäuse (PT1-2 und PT1-3) wiesen verzögert bzw. später einsetzend wachsende Tumore auf. Ein Tier (PT1-2) erreichte nach anfänglich langsamem Wachstum und dann stark zunehmendem Wachstum nach 57 Tagen ein Tumorvolumen, das innerhalb einer Standardabweichung vom mittleren Tumorvolumen der Kontrollgruppe lag
(Wachstumsverzögerung von PT1-2 30 Tage). PT1-2 wurde zur Berechnung der mittleren
Tumorvolumina in der Gruppe der Therapie-Responder am Endpunkt Tag 60 wegen des
großen Tumorvolumens ausgeschlossen.
Interventionsgruppe: Bei Expression des anti-ras-Einzelkettenantikörpers nach Ausbildung eines manifesten Tumorknötchens etwa um Tag 18 nach Injektion an konnte bei
zwei Mäusen eine Reduktion des Tumors beobachtet werden (partielle Remissionen bei
TT1-5, TT1-6). Drei Mäuse zeigen eine Progression mit verzögertem Wachstum (TT1-2,
TT1-3 und TT1-4). TT1-1 wurde mit derselben Begründung wie PT1-2 (s. o.) aus der Berechnung der mittleren Tumorvolumina der Therapie-Responder ausgeschlossen.
3.4.3.2 Verlauf der mittleren Tumorvolumina
Der Verlauf des mittleren Tumorvolumens wurde zwischen den Gruppen verglichen.
Bei Berücksichtigung aller Tiere außer KOT1-2, TT1-1, PT1-2 (zur Begründung s. 3.4.3.1)
wurde der in Abbildung 3.20 gezeigte Verlauf erhalten. Ab Tag 30 etwa wuchs das mittlere
Tumorvolumen der Kontrollgruppe deutlich über die mittleren Tumorvolumina der Präventions- und Interventionsgruppe an. Der Verlauf des mittleren TV bei der Kontrollgruppe entsprach näherungsweise einer exponentiellen Wachstumskurve. Die Kurve für die Präventionsgruppe lag unter derjenigen der Interventionsgruppe, der Unterschied war aber zu keinem
Zeitpunkt signifikant.
Seite 92
Ergebnisse
Mittleres Tumorvolumen in cm³
1,5
1
Kontrollgruppe ohne
KOT1-2 (n=5)
Präventionsgruppe
ohne PT1-2 (n=5)
0,5
Interventionsgruppe
ohne TT1-1 (n=5)
0
0
20
40
60
Abbildung 3-20: Wachstumsverlauf der T-HUVEC-anti-rasscFv in Nacktmäusen. Das mittlere Tumorvolumen (± Standardabweichung) der einzelnen
Gruppen wurde in Abhängigkeit der Zeit nach der Injektion
von 106 Zellen angegeben. In
der Kontrollgruppe wurde
Maus KOT1-2 wegen des extrem schnellen Tumorwachstums aufgeschlossen, in der
Interventions- und Präventionsgruppe jeweils ein Tier als NonResponder (PT1-2, TT1-1).
Tage nach Zellinjektion
3.4.3.3 Vergleich der mittleren Tumorvolumina am Endpunkt und Wachstumsverzögerung
Zum Experimentende an Tag 60 wurden die verschiedenen mittleren Tumorvolumina
ermittelt, die in Tabelle 3.13 angegeben sind. Die mittleren Tumorvolumina wurden zum
einen für die Therapie-Responder (ohne PT1-2 und TT1-1) berechnet sowie für alle Mäuse
(Volumen zum Endpunkt Tag 60 oder bei Tod bis Tag 60). Zum Vergleich sind in Tabelle 3.13 die Daten von der Wildtypgruppe (gleiche Zellzahl zur Injektion, vergl. Tab. 3.11)
angegeben.
Die mittleren Tumorvolumina der Interventions- und Präventionsgruppe zeigten ein
signifikant kleineres Volumen als das mittlere Volumen der Kontrolltiere, sowohl bei Berücksichtigung aller Tiere als auch bei den Tumor-Respondern, also bei Ausschluß der beiden Tiere PT1-2 und TT1-1. Zwischen den mittleren Tumorvolumina der Interventions- und
Präventionsgruppe ließ sich kein signifikanter Unterschied feststellen. Das berechnete mittlere Tumorvolumen der Kontrollgruppe am Endpunkt (Tag 60) lag künstlich zu niedrig, weil
nur 3 Tiere aus Tierschutzerwägungen den Endpunkt erreicht haben. Die Tiere (3 von 6) mit
den sehr schnell wachsenden Tumore wurden hierbei nicht berücksichtigt, da sie bereits vorher (Tag 26, 26, 36) getötet werden mußten. Diese Tiere hätten vermutlich zum Endpunkt
sehr viel höhere Tumorvolumina aufgewiesen. Dadurch dass die Tiere mit einem Volumen
von etwa 1 cm³ getötet werden sollten, ergab die Berechnung des mittleren Tumorvolumens
unabhängig vom Zeitpunkt (Tod bis Tag 60 mit allen Tieren) einen Mittelwert in der gleichen Größenordnung wie derjenige am Endpunkt (Tod am Tag 60), den nur 3 von 6 Kontrolltieren erreichten.
Ergebnisse
Seite 93
Tabelle 3-13: Mittelwerte±Standardabweichung der Tumorvolumina (TV) und der Wachstumsverzögerung. Vergleich gegen Kontrollgruppe: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
† Endpunkt bei Wildtypgruppe abweichend bei Tag 37. {Mittlerer Tag bei Erreichen von
0,5 cm³ TV}
Gruppe
Kontrollgruppe
Präventionsgruppe
Interventionsgruppe
Wildtypgruppe
TV am Endpunkt
„Tag 60“ in cm³
- Responder 1,34 ± 0,32
(n=3)
0,12 ± 0,16***
(n=5, ohne PT1-2)
0,35 ± 0,29**
(n=5, ohne TT1-1)
1,91 ± 0,636
(n=2)†
TV am Endpunkt „Tod
bis Tag 60“ in cm³
- alle Tiere 1,17 ± 0,30 (n=6)
Wachstumsverzögerung in Tagen
- alle Tiere 0,0±4,2 {26,7}
0,34 ± 0,55* (n=6)
54,7±25,1***
0,51 ± 0,49* (n=6)
43,5±18,5**
1,57 ± 0,73 (n=3)
{23,3}
Als weiterer Parameter zur Beschreibung des Wachstumsverlaufes wurde die Wachstumsverzögerung bestimmt. Als Grundlage wurde jeweils der Tag ermittelt, an dem zum
ersten Mal ein Tumorvolumen größer 0,5 cm³ bestimmt wurde. Davon wurden 26,7 Tage
(mittlerer Tag, an dem Kontrollgruppe 0,5 cm³ erreichte) subtrahiert, um die Wachstumsverzögerung (in Tagen) zu erhalten. Der Mittelwert daraus ist in Tabelle 3.13 angegeben. Die
unter Berücksichtigung aller Tiere berechnete Wachstumsverzögerung von 56,0 Tagen bei
der Präventionsgruppe und von 43,8 Tagen bei der Interventionsgruppe war signifikant größer als bei der Kontrollgruppe, was einer relevanten Verzögerung der Wachstumsgeschwindigkeit der Tumore in der Präventions- und Interventionsgruppe entspricht. Der Unterschied
zwischen Präventions- und Interventionsgruppe war nicht signifikant.
Der Vergleich der Kontrollgruppe, bei der T-HUVEC-anti-ras (Klon 14-4) injiziert
wurden, mit der Wildtypgruppe, bei der untransfizierte T-HUVEC injiziert wurden, zeigte
ein tendenzmäßig höheres Tumorvolumen und schnelleres Tumorwachstum bei den Wildtyp-T-HUVEC, jedoch keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe.
3.4.3.4 Mitosehäufigkeit
Als Maß für die mitotische Aktivität der T-HUVEC in den Tumore wurden die Mitoseraten bestimmt. Dazu wurden in den histologischen Schnitten (s. unter 3.4.4) die Mitosen
in 5 Felder bei hoher Vergrößerung (high power field HPF) ausgezählt und zur besseren
Vergleichbarkeit auf 10 HPF hochgerechnet (Tab. 3.14). Bei nicht ausgebildetem Tumor
wurde eine Mitosenzahl von 0 eingesetzt. In menschlichen, natürlich vorkommenden Tumoren wird die mitotische Aktivität von Weichteil-Sarkomen anhand der Mitosezahl pro 10
HPF beurteilt. Allgemein liegt die höchste mitotische Aktivität von humanen Weichteilsarkomen bei mehr als 20 Mitosen pro 10 HPF vor. Die Zahl ist neben dem Vorliegen von Nekrosen einer der wichtigsten Parameter zur Bestimmung des Malignitätsgrads (Costa et al.
1984, Coindre 1993, Van Unnik 1995). Die mittlere Zahl der Mitosen in Kontrollgruppenbzw. Wildtypgruppen-Tumoren lag bei 53,4±32,0 bzw. 23,4±9,0 Mitosen pro 10 HPF. Die
experimentell in den Nacktmäusen erzeugten Tumoren wiesen damit ohne Ras-Inhibition
eine enorm hohe Mitoseaktivität auf. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der ausge-
Seite 94
Ergebnisse
zählten Mitosezahlen und der daraus folgenden großen Standardabweichung, war die Mitosezahl nur bei der Präventivgruppe (16,0±15,2 pro 10 HPF) signifikant geringer als bei der
Kontrollgruppe. Durch die Inhibition von Ras wurde eine mittlere Zahl der Mitosen von
16,0±15,2 Mitosen pro 10 HPF erhalten. Die Mitosezahl der Interventionsgruppe war nicht
signifikant verschieden von der Präventions- und Kontrollgruppe. Betrachtet man die einzelnen Tumore, so ergaben sich unterschiedliche Mitosehäufigkeiten (s. Anhang A). Die Präventivgruppe beinhaltete vier Tumore mit weniger als 20 Mitosen pro 10 HPF, die Interventionsgruppe zwei und die Kontrollgruppe nur einen. Zusammengefaßt ergab sich im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Verringerung der mittleren mitotischen Aktivität
der Tumore in der Präventivgruppe, nicht jedoch in der Interventionsgruppe. Insgesamt zeigten die experimentellen Tumore eine extrem hohe mitotische Aktivität im Vergleich zu humanen, natürlich vorkommenden Tumoren.
Tabelle 3-14: Mittelwerte±Standardabweichung der Zahl der Mitosen (n) pro 5 HPF und hochgerechnet auf Zahl der Mitosen pro 10 HPF (Gesichtsfelder bei hohe Vergrößerung) sowie Zahl
der Tiere mit Zahl der Mitosen < 20 Mitosen pro 10 HPF. Vergleich gegen Kontrollgruppe: *
p < 0,05. † bei Injektion von 106 Zellen.
Gruppe
Kontrollgruppe, n=6
Präventionsgruppe, n=6
Interventionsgruppe, n=6
Wildtypgruppe†, n=3
3.4.4
Mitosen pro
5 HPF
26,7±16,0
8,0±7,6*
16,3±9,9
11,7±4,5
Mitosen pro
10 HPF
53,4±32,0
16,0±15,2*
32,6±19,8
23,4±9,0
Anzahl Tiere mit
n<20 pro 10 HPF
1
4
2
1
Histomorphologie der T-HUVEC abgeleiteten Tumore
3.4.4.1 Histomorphologische Beschreibung der Tumore
Aufgrund der Endothelzell-Herkunft der T-HUVEC wurden die experimentell in den
Nacktmäusen erzeugten Tumore auf Merkmale von Gefäßtumoren untersucht, insbesondere
von Angiosarkomen. Durch die Haut der Mäuse waren keine Anzeichen für besonderen
Blutreichtum der solide erscheinenden Tumore erkennbar. Der Tumor schien durch die Haut
farblos und die Haut zeigte keine Veränderungen (Abb. 3.19A). Makroskopisch waren die
herausoperierten Tumor weich, relativ schwach vaskularisiert und zeigten ein helles, fischfleisch-artiges Aussehen (Abb. 3.19B/C), das auf ein Sarkom hinweisen kann. Die Tumore
wurden in Paraffin eingebettet und ihre Histologie in Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitten
untersucht. Die Tumore zeigten mikroskopisch überwiegend solide Wachstumsmuster mit
einem kompakten Aufbau mit verschieden dicht gepackten Arealen und eine Septierung
durch Bindegewebe. Es handelte sich um teils spindelzellige, teils epitheloid erscheinende
Neoplasien. In 8 der 27 Tumoren waren eindeutig Strukturmuster des Tumors zu erkennen,
die vasoformativ (d. h. gefäßbildend) erschienen und damit Ähnlichkeiten zu insbesondere
epitheloiden Angiosarkomen aufwiesen.
Ergebnisse
A
Seite 95
B
Abbildung 3-21: Histologische Schnitte (HE-gefärbt) von Wildtyp-T-HUVEC abgeleiteten Tumoren (Maus 9). Maßstab s. Balken.
A: epitheloide Muster, die auch einem Karzinom entsprechen könnten. B: rosettenartige Zellanordnung, teils wie abortive Gefäßmuster, markiert durch Pfeil.
Beispiele für die vasoformativen Strukturen sind in Abb. 3.21B (Wildtyp-Gruppe),
3.22B (Kontrollgruppe), 3.23C/E (Interventionsgruppe) und 3.24A/B (Präventionsgruppe)
gezeigt. Die Tumorzellen bildeten hierbei schlitzförmige Strukturen, teils auch rosettenartige
Strukturen, die an Gefäßmuster erinnerten.
A
B
Abbildung 3-22: Histologische Schnitte (HEgefärbt) von T-HUVEC-anti-ras-scFV abgeleiteten Tumoren von Tieren aus der Kontrollgruppe (keine Ras-Inhibition). Maßstab s.
Balken.
C
A: ähnlich zum epitheloiden Angiosarkom
(KOT2-1); vergleiche mit C. Der Pfeil markiert exemplarisch eine epitheloide Zelle. B:
vasoformative Struktur (KOT2-2), markiert
durch Pfeile. C: Vergleichsbild eines humanen
epitheloiden Angiosarkoms. Der Pfeil markiert
eine typische epitheloide Zelle.
Exemplarische Bereiche mit epitheloiden Zellen finden sich in Abbildung 3.21A
(Wildtyp-Gruppe), 3.22A (Kontrollgruppe), 3.23B/D (Interventionsgruppe) und 3.24B/D
(Präventionsgruppe. Epitheloidzellen sind epithelähnliche Zellen, die wie Histiozyten bzw.
Retikulumzellen erscheinen, mit großem Zellkern und plumper Gestalt. Ein Areal mit eher
spindeligen Zellen zeigt Abbildung 3.24D (Präventionsgruppe).
Seite 96
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abbildung 3-23: Histologische Schnitte (HEgefärbt) von T-HUVEC-anti-ras-scFV abgeleiteten Tumoren aus der Interventionsgruppe
(Ras-Inhibition ab Tumormanifestation um
Tag 18). Maßstab s. Balken.
G
A: Nekrose (TT1-1), durch Stern markiert. B:
polygonal-epitheloide Tumorzellen; Mitosen,
(s. Pfeil). C: gefäßartige Strukturen (s. Pfeil)
(TT1-3). D: epitheloide Zellen; Mitosen (s.
Pfeil)(TT1-4). E: vasoformative Strukturen
(Pfeil) aus TT1-6. F: Vergleichsbild eines humanen hochdifferenzierten Angiosarkoms. G:
weiterer Ausschnitt (TT1-6).
Ergebnisse
Seite 97
Überwiegend ließen sich Nekrosen in wechselndem Ausmaß in den Tumoren belegen
(s. Anhang A), teils auch Ödem. In Abbildung 3.23A ist ein nekrotisches Areal aus dem
rasch progredienten Tumor TT1-1 aus der Interventionsgruppe (als Non-Responder eingeordnet, s. unter 3.4.3.1) gezeigt. Die Nekrose-Areale waren durch amorphes Material gekennzeichnet und zellarm, bis auf einige eingewanderte B-Lymphozyten (T-Lymphozyten
fehlen in Nacktmäusen).
Die Tumorzellen zeigten überwiegend deutlich vergrößerte, vesikuläre Kerne mit
teils prominenten Nukleolen. Überwiegend war eine deutliche mitotische Aktivtät zu belegen
(s. Abb. 3.23B/D). Die Mitosen wurden für alle Tumoren in 5 Gesichtsfeldern bei großer
Vergrößerung (high power field HPF) ausgezählt (Ergebnisse für Einzeltumore s. Anhang A). Die mittlere Zahl der Mitosen in 5 HPF ist in Tabelle 3.14 angegeben (Beurteilung
s. dort).
A
B
C
D
Abbildung 3-24: Histologische Schnitte (HE-gefärbt) von T-HUVEC-anti-ras-scFv abgeleiteten
Tumoren von Tieren aus der Präventionsgruppe (Ras-Inhibition ab Implantation), teilweise
immunhistochemisch markiert. Maßstab s. Balken.
A: vasoformative Strukturen (PT1-5). B: stärkere Vergrößerung aus A. Der graue Pfeil markiert typische epitheloide Zellen, die schwarzen Pfeile vasoformative Strukturen. C: spindelige
und epitheloide Tumorzellen (PT1-5). D: stärkere Vergrößerung aus C. Die grauen Pfeile markieren epitheloide Zellen, die schwarzen Pfeile spindelige Zellen.
Seite 98
Ergebnisse
3.4.4.2 Histomorphologische Einordnung und Vergleich der Tumore in den
Gruppen
In einer Vielzahl der Tumore ließ sich nach phänotypischem Muster das Bild wie bei
einem Sarkom mit Endothelzelldifferenzierung (Angiosarkom) belegen. Zum Vergleich sind
in Abbildung 3.22C ein Bild eines humanen epitheloiden Angiosarkoms und in Abbildung 3.23F ein Bild eines humanen hochdifferenzierten Angiosarkom gezeigt.
Um die endotheliale Differenzierung der Sarkome neben morphologischen Gesichtspunkten auch durch immunhistochemische Markierung von Markern zu untermauern bzw.
einzugrenzen, wurden folgende Färbungen durchgeführt: gegen CD31 (endothelialer Marker) und Keratin (epithelialer Marker). Die Färbung gegen beide Marker war negativ. Das
Vorliegen eines Karzinoms wurde wegen der negativen Färbung gegen Keratin ausgeschlossen. Die Färbung mit Vimentin-Antikörpern war positiv (Abb. 3.25), was das Vorliegen von
Sarkomen belegt. Vimentin gehört zu den Intermediärfilamenten, die als Marker für mesenchymale Zellherkunft verwendet werden. Unter Berücksichtigung dieser immunhistochemischen Ergebnisse handelt es sich um hochmaligne mesenchymale Tumoren, d. h. um hochmaligne Sarkome, da eine anderweitige Differenzierungsrichtung mit den bisherigen Markern nicht zu belegen war. Morphologisch zeigten die Tumore Merkmale, die auf die speziellere Differenzierung als Angiosarkom bzw. epitheloides Angiosarkom hinwiesen. Diese
Differenzierungsform ließ sich wegen der fehlenden Anfärbbarkeit mit anti-CD31Antikörpern, immunhistochemisch jedoch nicht belegen. Die Zellen in Zellkulturen waren
ebenfalls CD31-negativ (s. 3.1.1.1).
Der Vergleich der Tumore aus den Gruppen (Abb. 3.22 bis 3.24) zeigte in der Übersicht, daß kein prinzipieller histomorphologischer Unterschied zwischen den Gruppen besteht. Die beschriebenen Strukturelemente, z. B. die vasoformativen Strukturen, epitheloide
oder spindelige Zellen, ließen sich bei Tumoren in allen Gruppen finden. Es gab damit keine
Hinweise auf eine prinzipielle Morphologie-Veränderung durch die Ras-Inhibition in
T-HUVEC-abgeleiteten Tumoren. Die Bestimmung des Tumorgrades (I bis III mit zunehmender Malignität) ergab ebenfalls keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Tumoren
aus den einzelnen Gruppen.
A
B
Abbildung 3-25: Immunhistochemische Markierung von Vimentin in histologischen Schnitten
von PT1-2 (A, B). Maßstab s. Balken.
Ergebnisse
Seite 99
3.4.4.3 Vaskularisierung und VEGF-Sekretion der T-HUVEC-abgeleiteten Tumore
Die Vaskularisierung der Tumore durch das Wirtstier wurde durch Färbung mit mausspezifischen anti-CD31-Antikörpern untersucht, die das endothelspezifische Molekül
PECAM-1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule-1) erkennen. Da der Antikörper nur
Maus-CD31 erkennt und die T-HUVEC keine CD31-Expression zeigen, wurden spezifisch
Wirtsblutgefäße, die den Tumor versorgen, immunzytochemisch markiert. Zum Nachweis
der spezifischen Blutgefäßfärbung zeigt Abbildung 3.26C eine Anfärbung von Blutgefäßen
im normalen Muskelgewebe der Maus bei hoher Vergrößerung. Die Tumore waren relativ
schwach vaskularisiert (Abb. 3.26A/B): schwächer als wegen der VEGF-Sekretion durch
T-HUVEC erwartet (s. unter unter 3.2.1 und 3.3.8) und schwächer als zum Beispiel im gleichen Modell erzeugte Neuroblastom-Zell-abgeleitete Tumore (A. Eggert, persönliche Mitteilung). Die Wirtsblutgefäße konzentrierten sich in den bindegewebigen Septen. Große Bereiche der dichten Tumormasse scheinen in der CD-31-Färbung avaskulär.
A
B
C
D
100 µm
PT1-5
100 µm
Abbildung 3-26: Immunhistochemische Markierung von Wirtsblutgefäßen durch anti-MausCD31-Antikörper und von VEGF in T-HUVEC-Wildtyp-abgeleiteten Tumoren. Maßstab s.
Balken.
A: Markierung von Blutgefäßen (CD31) (Maus 4). B: Markierung von Blutgefäßen (CD31)
(Maus 9). C: Vergleichsbild für spezifischen Nachweis von Maus-Blutgefäßzellen im Muskelgewebe (Maus 7) durch Markierung mit anti-Maus-CD31-Antikörper.D: Markierung von VEGF
im Tumorgewebe (Maus 9).
Seite 100
Ergebnisse
Eine Färbung von humanem VEGF wurde ebenfalls durchgeführt (Abb. 3.26D). hierbei war aufgrund des Färbungsmusters allerdings fraglich, ob die Färbung spezifisch war.
Bei den Tumoren zeigte sich eine ungleichmäßige Färbung mit stärker und weniger stark
gefärbten Arealen. Da häufiger die zelldichteren und aktiver erscheinenden Areale stärker
gefärbt waren, könnte es sein, daß hier die VEGF-Aussschüttung durch die T-HUVEC größer ist als in den zellärmeren Arealen.
Diskussion
Seite 101
4 Diskussion
4.1 Signaltransduktion von VEGF in Endothelzellen
Der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor VEGF ist einer der wichtigsten Wachstumsfaktoren, der mitogen und differenzierend auf Endothelzellen wirken kann und die Angiogenese in vitro und in vivo fördern kann. Da er seine Signale über verschiedene Rezeptorsysteme vermittelt, kann VEGF in verschiedenen Situationen, z. B. physiologischen versus
pathologischen, eine große Bandbreite von zellulären Phänomenen fördern oder steuern.
Dazu aktiviert er die beiden hochaffinen VEGF-Tyrosin-Kinase-Rezeptoren, die Neuropiline
und bindet an extrazelluläres Heparansulfat-Proteoglykan (vergl. Abb. 1.2). Zusammen mit
verschiedenen weiteren Liganden aus der VEGF-Familie, die jeweils an eine Auswahl der
genannten Rezeptoren binden, kann VEGF außerdem über Ligandenheterodimere, z. B.
VEGF-PlGF auch über Rezeptorheterodimere, z. B. VEGFR1-VE2GFR2 Signale übermitteln und auf diesem Wege eine Feinregulation seiner Signaltransduktion erreichen.
4.1.1
Endothelzellmodell
Untersuchungen der VEGF-Signaltransduktion in Endothelzellen können an verschiedenen Endothelzellmodellen (Übersicht s. 1.5) durchgeführt werden. Von Interesse sind dabei primäre Endothelzellen zur Untersuchung der physiologischen VEGF-Signaltransduktion
und transformierte Endothelzellen zur Untersuchung der VEGF-Signaltransduktion unter
pathologischen Bedingungen. Natürlich überlappen beide Bereich, da z. B. in den Blutgefäßen in einem Tumor die Blutgefäßzellen zunächst noch normale Endothelzellen sind und
aber durch die pathologischen Einflüsse der Umgebung auch in ihrer Signaltransduktion
verändert werden. In dieser Arbeit wurden primäre Nabelschnurvenen-Endothelzellen
(HUVEC) und deren transformierte Gegenstücke T-HUVEC verwendet. Verschiedene weitere Untersuchungen (s. Tab. 4.1) in der Literatur und in dieser Arbeit bestätigten die spontane Transformation, die u. a. zur Tumorigenizität der Zellen im Nacktmausmodell und zur
Entwicklung einer angiogenen Aktivität der Zellen im Kaninchen-Kornea-AngiogeneseModell führte.
Eine zusammenfassende Auswertung der Expression der charakteristischen Marker
bzw. der Eigenschaften von T-HUVEC aus der Literatur und aus Ergebnissen dieser Arbeit
zeigt Tabelle 4.1. Typische endotheliale Marker sind vorhanden, wenn auch nicht alle untersuchten. Viele Endothelzellmarker und für Endothelzellen typische Proteine werden expremiert, während allerdings zwei klassische Endothelzellmarker, CD31 (PECAM-1) und VECadherin (CD144) nicht nachweisbar waren. Der Vergleich mit experimentell transformierten humanen Endothelzellen (MacKenzie et al. 2002) zeigt auch in diesen einen Verlust der
Marker VEGFR2/KDR, CD31/PECAM-1 und van Willebrand-Faktor, obwohl die primären
Ausgangszellen (BMEC) diese Marker expremierten. Der Verlust einiger endothelialer Mar-
Seite 102
Diskussion
ker bei T-HUVEC kann also Folge der Transformation sein. Daneben wurden epitheliale
Marker und Merkmale von Tumorzellen gefunden.
Tabelle 4-1: Charakteristische Eigenschaften von T-HUVEC und deren Bedeutung. Mit * markierte Ergebnisse wurden in dieser Arbeit bestätigt/gezeigt. + kennzeichnet nachgewiesene Eigenschaften, - die Nichtnachweisbarkeit der Eigenschaft. Auswahl von Eigenschaften von
HUVEC im Vergleich.
Eigenschaft
PECAM-1 (CD31)
Bedeutung
Endothelialer Marker
T-HUVEC
-*
HUVEC
Plasminogen-Aktivator (PA)
PA-Inhibitor (PAI)
Van-Willebrand-Faktor
VE-Cadherin, CD144
UEA-1
PHM5
Integrin aVβ3
Endothelialer Marker
+
+
Endothelialer Marker
Endothelialer Marker
Endothelialer Marker
Endothelialer Marker
Endothelialer Marker
+
+
+
+
+
+
Faktor VIII related antigen
VEGFR2/KDR
VEGFR1/Flt-1
MMP-2
ACE-Aktivität
Aufnahme von ac-LDL
Ausbildung tubulärer Strukturen (Matrigel)
Weibel-Palade-Körperchen
eNOS
Keratin
Endothelzell-Marker
Endothelzell-typisch
Endothelzell-typisch
Endothelzell-typisch
Endothelzell-typisch
Endothelzell-typisch
Endothelzell-typisch
+*
+*
+
+
+
+*
+
+
+
Endothelzell-typisch
Endothelzell-typisch
Epithelialer Marker
Desmoglein
E-Cadherin
LCA
Epithelialer Marker
Epithelialer Marker
hämatopoietische
Stammzellen
Mesenchymaler Marker
Tumorzell- und Endothelzell-typisch
Tumorzell-typisch
+
+*
+
-*
+
+
-*
Vimentin
Globotriaosylceramid Gb3
Tumorigen in Balb/c nu/nu (+
450 rad x-Ray) + in NOD/Scid
Ausschüttung von VEGF
Sekretion Gamma GT
Myc
Cornea Test
Tumorzell-typisch?
Tumorzell-typisch
Tumorzell-typisch
VEGF-Expression
Referenz T-HUVEC
Suda et al. 2001
Takahashi und
Sawasaki 1991
Suda et al. 2001
Suda et al. 2001
+
+
+
Takahashi et al. 2003
Shin et al. 1999
Takahashi et al. 1990
Takahashi et al. 2003
Takahashi et al. 1990
Suda et al. 2001
Hughes et al. 1996
Shin et al. 1999
Takahashi et al. 1990
Brown et al. 2000
Suda et al. 2001
Takahashi et al. 1990
Suda et al. 2001
Suda et al. 2001
+*
Suda et al. 2001
+
Heath-Engel und
Lingwood 2003
Takahashi et al. 1990
Heath-Engel und
Lingwood 2003
+*
+*
+
+*
Neovaskular
isierung
-
Suda et al. 2001
-
Takahashi et al. 1990
Einige Jahre nach Erstveröffentlichung der Zellinie und jahrelangem Vertrieb über renommierte Zellkultur-Banken gab es kontroverse Veröffentlichungen, die eine genetische
Identität der über die amerikanische Zellkulturbank (ATCC) vertriebenen ECV304 mit der
Blasenkarzinom-Zellinie T24 gefunden haben (Drexler et al. 2002). Diese könnte auf eine
Kreuzkontaminierung der Zellinien zurückzuführen sein (Tanabe et al. 1999). Im direkten
Vergleich konnten Suda et al. 2001 in der untersuchten ECV304-Kultur jedoch eindeutige
phänotypische Unterschiede zu den T24-Zellen sowie die Expression klassischer endothelialer Marker zeigen. Auch die aus ECV304 erzeugten Tumore in SCID-Mäusen (Heath-Engel
und Lingwood 2003) zeigten deutliche Unterschiede beim Markierungsmuster mit anti-vWFund anti-Verotoxin-Antikörpern (Vasotoxin) zu T24-abgeleiteten Tumoren. Auch in dieser
Arbeit zeigten die von G. Neufeld erhaltenen T-HUVEC aus einer frühen Charge der
ECV304 die Expression der Marker und auch typischer Eigenschaften (z. B. Ausbildung
Diskussion
Seite 103
tubulärer Strukturen auf ECM-Gel) von Endothelzellen, teilweise im direkten Vergleich zu
primären HUVEC. Daher wurden die T-HUVEC als geeignetes phänotypisches Modell für
transformierte Endothelzellen verwendet, unter Berücksichtigung der Unterschiede die sich
durch den transformierten Zustand ergeben (u. a. Verlust spezifischer Marker). Beim Vergleich mit Untersuchungen mit ECV304 in der Literatur ist allerdings wegen des Problems
der über ATCC vertriebenen T24-identischen Zellen Vorsicht geboten. Daher müssen, auch
wenn die Zellen aus zuverlässiger Quelle erhalten wurden, die Ergebnisse kritisch mit Ergebnissen mit primären Endothelzellen verglichen werden.
4.1.1.1 Rezeptorexpression, Ligandenheterodimere in T-HUVEC
Um die VEGF-Rezeptoren im Vergleich untersuchen zu können, wurde die RezeptorAusstattung von T-HUVEC überprüft, da in der Literatur mehrere Hinweise auf deutliche
Unterschiede bei der Rezeptorausstattung vorhanden sind: MacKenzie et al. (2002) zeigten
nach experimenteller Transformation von humanen Endothelzellen einen Verlust von
VEGFR2, für humane primäre Zellen verschiedener Herkunft gibt es Hinweise auf unterschiedliche Expressionsverhältnisse VEGFR2 zu VEGFR1, die ebenfalls die Signaltransduktion beeinflussen können (Hewett und Murray 1996; Yashima et al. 2001). In T-HUVEC
wurden mit konventioneller RT-PCR beide VEGF-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 sowie Neuropilin-1 (Nrp-1) gefunden. Da die PCR nicht quantitativ erfolgte, lassen sich keine
Aussagen über das exakte Verhältnis zwischen beiden Rezeptor-mRNAs machen. Das Vorhandensein beider Rezeptoren sowie das des schimären in den T-HUVEC-Fmt-Zellinien
ermöglichte den Vergleich der Effekte beider Rezeptoren. Bei Stimulation mit PlGF bzw.
VEGF-E mußte allerdings die Bindung an Neuropilin-1 mitberücksichtigt werden. Selektive
Stimulation der intrazellulären Domäne von VEGFR1 erfolgte über den heterologen Liganden mCSF-1 in T-HUVEC-Fmt-Zellinien.
Die Möglichkeit der eigenen Signaltransduktion durch Liganden- und RezeptorHeterodimere kompliziert und moduliert die ohnehin komplexe Signaltransduktion von
VEGF über seine zahlreichen Rezeptoren (Autiero et al. 2003). Im Unterschied zu vielen
primären Endothelzellen schütteten T-HUVEC nach Stimulation mit VEGF oder FCS erhebliche Mengen an VEGF aus. Diese VEGF-Ausschüttung kann ein Element der Transformation der Zellen sein, ähnlich wie es z. B. für Mäuse-Fibroblasten beschrieben ist (Sugihara et al. 1994). Aus den Experimenten zu Faktor-Freisetzung durch T-HUVEC ergab sich,
daß die Bildung von Heterodimeren VEGF-PlGF nach Stimulation mit VEGF und PlGF sehr
unwahrscheinlich ist. Bei Stimulation mit 3 ng/ml VEGF, unter Experimentbedingungen mit
10fach höherer Konzentration als hier, wurden weniger als 15 pg/ml PlGF freigesetzt, was
allenfalls zu sehr geringen Konzentrationen an VEGF-PlGF-Heterodimeren führen könnte,
wenn T-HUVEC überhaupt PlGF sekretieren. Bei Stimulation mit PlGF wurde nur die basale
Menge VEGF freigesetzt, was zu einem Verhältnis von 3 ng/ml zugesetztem PlGF (unter
normalen Stimulationsbedingungen 30 ng/ml) zu wenigen pg/ml sekretiertem VEGF führen
könnte. Auch hier sind nur etwa 1000fach geringere Konzentrationen an Heterodimeren
möglich. Die Sekretion von VEGF wurde nur durch VEGF gefördert, aber nicht durch rezeptor-spezifische Liganden und damit selektive Aktivierung von jeweils VEGFR1 oder
Seite 104
Diskussion
VEGFR2. Entweder scheint die Aktivierung beider Rezeptoren zusammen oder eines nicht
durch PlGF und VEGF-E stimulierten weiteren VEGF-Rezeptors notwendig zu sein.
4.1.1.2 Ras-Inhibition durch anti-ras-Einzelkettenantikörper in T-HUVEC
Die Inhibition von Ras durch intrazelluläre Expression von rekombinanten Einzelketen-Antikörpern, die aus dem neutralisierenden anti-ras-Antikörper Y13-259 entwickelt wurden, ist eine bekannte Strategie, die in Zellkultur und in in vivo-Experimenten verwendet
wurde (s. unter 1.4.4). Die intrazelluläre Expression von Antikörperfragmenten wird auch als
intrazelluläre Immunisierung bezeichnet. Der in dieser Arbeit verwendete anti-ras-scFv wurde mit der Sequenz von Werge et al. (1990) aus den Hybridoma-Zellen unter Einfügung
eines (GGGS)4-Linkers (Bradbury et al. 1993) kloniert (Feldhaus 1999). Für diesen anti-rasscFv aus Y13-259 wurde eine Affinität von 0,4 nM bestimmt (T. Gronemeyer und J. Kuhlmann, unveröffentlichte Ergebnisse). Die Herstellung von T-HUVEC-Zellinien, die den
rekombinanten Einzelkettenantikörper anti-ras-scFv pharmakologisch induzierbar intrazellulär expremieren, war aufgrund der relativ großen Anzahl zu untersuchender Einzel-Zellklone
aufwendig, aber dennoch erfolgreich. Wie von der Gruppe um Cattaneo (Cardinale et al.
1998; Lener et al. 2000) wurde der anti-ras-scFv in der unlöslichen Fraktion aus Zellextrakten gefunden. Durch die Induktion über Doxycyclin-Entzug wurde die Konzentration maximal um das 2- bis 4-fache reguliert, wobei der Konzentrationsunterschied zu einer RasKopräzipitation und zu deutlichen Effekten bei den verschiedenen Funktionsuntersuchungen
nur nach Induktion führte. Dies legt nahe, daß die Inhibition nur in einem kleinen Konzentrationsfenster wirksam ist bzw. eine leichte basale Expression des anti-ras-scFv keine wesentlichen Effekte hat (Vergleich nicht-induziert – Wildtyp-Zellen). Offensichtlich benötigen die
Zellen eine bestimmte Beladung mit anti-ras-scFv, damit dieser aggregiert und dabei auch
die funktionelle Ras-Inhibition erreicht. Unterhalb dieses Beladungsgrades (nicht-induzierte
Expression) ist der anti-ras-scFv auch in der löslichen Fraktion der Zellextrakte zu finden,
während er oberhalb (induzierte Expression) nicht in der löslichen Fraktion gefunden wurde.
Da unter Nicht-Induktionsbedingungen (anti-ras-scFv auch in löslicher Fraktion) keine funktionelle Inhibition beobachtet wurde, beruht die Wirkung auch in dem hier verwendeten System eher auf der Aggregation des anti-ras-scFv mit seinem Zielmolekül Ras, ähnlich wie
von Lener et al. (2000) gezeigt. Die Lokalisation von Ras in den induziert und nicht induzierten T-HUVEC-anti-ras könnte noch analog zur Lokalisation des anti-ras-scFv in den
Fraktionen überprüft werden. Mit den erzeugten T-HUVEC-TetOff-anti-ras-scFv-myc Klon
14-4 (T-HUVEC-anti-ras) stand ein Modellsystem für die Untersuchung der Effekte der RasInhibition zur Verfügung, das über den Untersuchungszeitraum von 3 Jahren stabile Eigenschaften zeigte. Die Ras-Inhibition hatte keine Auswirkungen auf die durch VEGFstimulierte Freisetzung von VEGF bei T-HUVEC.
4.1.2
Rezeptorspezifisch aktivierte Signalwege
Verschiedene Signalwege in T-HUVEC nach Stimulation mit rezeptorspezifischen Liganden bzw. des schimären Rezeptors Fmt wurden untersucht, um herauszufinden, welcher
Diskussion
Seite 105
Rezeptor welche nachfolgenden Signalwege aktiviert. Tabelle 4.2 zeigt eine Übersicht der
bisher mit T-HUVEC erhaltenen Ergebnisse.
Tabelle 4-2: Übersicht über die rezeptor-spezifisch aktivierten Signalwege in T-HUVEC (Ergebnisse dieser Arbeit oder in angegeben Referenzen). + bedeutet Aktivierung, - bedeutet keine
Aktivierung. *in dieser Arbeit gezeigt
VEGFR2
Ras, MAPK
PI3K
VEGFR1
PlGF
+
+
n.d.
+
Effekt von
VEGF
+
+
Akt
NO
Cdc42
+
+
+
+
+
+
+
+
Referenz
Ehrhardt 1999
C. Goemans, unveröffentlichte Resultate
*
*
*
4.1.2.1 Ras
Ras wird als direkter Regulator der Endothelzellfunktion und als wesentlicher Signalüberträger von VEGF-Signalen betrachtet. Von Ehrhardt (1999) wurde gezeigt, daß VEGF
und mCSF-1 in T-HUVEC-Fmt Ras aktivieren und auch nachfolgend die MAPK. Diese
Befunde sind in Übereinstimmung mit der Ras-Aktivierung durch VEGF in HUVEC (Doanes et al. 1999), während Takahashi et al. (1999) keine Ras-Aktivierung durch VEGF in
Ratten-Sinus-Endothelzellen finden. Yashima et al. (2001) fanden in VEGF-stimulierten
primären HUVEC eine Ras- und MAPK-Aktivierung in demselben zeitlichen Verlauf wie
von Ehrhardt (1999) in T-HUVEC gefunden. Die Aktivierbarkeit von Ras durch den Heteroliganden mCSF-1 in T-HUVEC-Fmt zeigt, daß die intrazelluläre Domäne vom VEGFR1
daran beteiligt ist. Die Aktivierung der nachgeschalteten MAPK ist in PAEC allein vom
VEGFR2 abhängig (Gille et al. 2001), ebenso in HUVEC (Kanno et al. 2000). Shin et al.
(1999) zeigen eine konstitutive, kaum durch bFGF stimulierbare MAPK-Aktivierung in
T-HUVEC, die von Ehrhardt (1999) nicht gesehen wurde.
4.1.2.2 PI3K/Akt:
Der PI3K-Akt-Signalweg ist häufig an der Übermittlung von überlebensfördernden
Signalen beteiligt (Marte und Downward 1997). Die PI3K kann dabei direkt von dem Wachstumsfaktor-Rezeptor oder über dazwischengeschaltetes Ras aktiviert werden. Über Proteinkinase D (PKD) wird dann die Akt-Kinase aktiviert und phosphoryliert. Die Akt-Kinase
kann über verschiedene Signalwege (NFκB, 14-3-3/Bad) zur Überlebensförderung führen
(Khwaja 1999). Außerdem kann die Akt-Kinase über Phosphorylierung der endothelialen
NO-Synthase (eNOS) die NO-Freisetzung aus Endothelzellen fördern (Fulton et al. 1999;
Dimmeler et al. 1999). Sowohl PI3K (C. Goemans, unveröffentlichte Ergebnisse) als auch
Akt wurden in T-HUVEC über beide VEGF-Rezeptoren vermittelt.
4.1.2.3 Cdc42:
cdc42 aus der Familie der Rho-GTPasen induziert über seinen Effektor WiskottAldrich-Syndrom-Protein (WASP) die Bildung von Filopodien (Giancotti 1997, Hall 1998).
Über die Beeinflussung des Aktinzytoskeletts reguliert cdc42 so die Zellpolarität und die
Seite 106
Diskussion
Migration von Zellen. Nachgeschaltet aktiviert cdc42 auch über die c-Jun N-terminale Kinase (JNK) die ebenfalls für die Zellmotilität wichtige p38-Kinase. Für die p38-Kinase ist bekannt, daß sie in HUVEC durch VEGF (Yashima et al. 2001) und durch PlGF über den
VEGFR1/Flt-1 aktiviert wird (Kanno et al. 2000; s. auch Migration). In dieser Arbeit wurde
gezeigt, daß VEGF zu einer cdc42-Aktivierung führte, die maximal nach 4 h Stimulation mit
30 ng/ml VEGF war. PlGF und VEGF-E führten ebenfalls zu einer Aktivierung von cdc42,
die demzufolge über beide VEGF-Rezeptoren möglich ist. Die nachfolgende p38-Kinase
wurde nicht untersucht, so daß ein direkter Vergleich mit den Ergebnissen in HUVEC von
Kanno et al. (2000) nicht möglich ist.
4.1.2.4 Stickstoffmonoxid (NO):
In immunhistochemischen Färbungen wurde gezeigt, daß die T-HUVEC die endotheliale (eNOS) und neuronale (nNOS) NO-Synthase expremieren, nicht aber die induzierbare
Form (iNOS). Während man früher die einzelnen NOS-Isoenzyme den Ursprungsgeweben
(nNOS: neuronal, eNOS: endothelial, iNOS: in Macrophagen) zuordnete, so haben genauere
Untersuchungsmethoden gezeigt, daß oft einige NOS-Isoenzyme im gleichen Gewebe gebildet werden, z. B. nNOS auch im Endothel (Morishita et al. 2002), was hier bestätigt wurde.
Die NO-Freisetzung wurde kolorimetrisch gemessen und eine vergleichbare Freisetzungsrate von etwa 20 – 25 fmol pro Zelle und Stunde nach Stimulation mit VEGF und
VEGF-E, nicht aber mit PlGF oder mCSF-1 gefunden. Die basale Freisetzung ohne Stimulation lag bei etwa 5 fmol pro Zelle und Stunde. Die freigesetzte Menge entspricht in der Größenordnung der bei Hood et al. (1998) bestimmten von etwa 1 fmol pro Zelle und Stunde
nach Stimulation von HUVEC mit 10 ng/ml VEGF (gemessen über Chemoluminiszenz von
aus Nitrit und Nitrat rückgewonnenem NO). Auch bei Messung der NO-Synthase-Aktivität
über radioaktiv markierte Substrate wurde ein Stimulationseffekt von VEGF in HUVEC
beobachtet (Ziche et al. 1997). In beiden Arbeiten war die NO-Freisetzung nach VEGFStimulation Calcium-abhängig. Bei Messung der nachgeschalteten cGMP-Bildung zeigte
sich in PAEC, daß die NO-Freisetzung nur über VEGFR2 vermittelt wurde (Kroll und Waltenberger 1999), was in dieser Doktorarbeit in direkten Messungen bestätigt wurde. Labrecque et al (2003) zeigen weitere Hinweise darauf, daß der VEGFR2 und die eNOS in direktem Signalzusammenhang stehen. Sowohl in T-HUVEC (dort ECV304) als auch in bovinen
Aortenzellen (BAEC) finden sich VEGFR2 und die eNOS gemeinsam in den Caveolae, und
zusätzlich noch eNOS-regulatorisches Caveolin-1.
Elektroanalytische zeitlich aufgelöste Messungen mit zwei verschiedenen Verfahren
an wenigen T-HUVEC bestätigten, daß nur VEGF und VEGF-E, nicht aber PlGF und
mCSF-1 in T-HUVEC-Fmt zur NO-Freisetzung führt. Allerdings war im Unterschied zu den
kolorimetrischen Messungen eine deutlich höhere Freisetzung nach VEGF-E-Stimulation zu
beobachten. Die NO-Spezifität der Messung wurde zum einen über Kontrollmessungen mit
gasförmigem NO und NO-Donoren als auch über die Abhängigkeit der NO-Freisetzung von
der NO-Synthase-Inhibition in Zellen bestätigt. Übereinstimmend wurde in kolorimetrischen
und elektroanalytischen Messungen eine rasche Stimulation der NO-Freisetzung mit einer
maximalen Freisetzung in den ersten 15 min der Stimulation gefunden. Bei kolorimetrischen
Diskussion
Seite 107
Nitrit-bestimmungen in minutenabstand nach Stimulation mit VEGF wurde in HUVEC eine
maximale NO-Bildung nach 5 – 8 min gefunden (Van der Zee 1997). Außerhalb des hier
untersuchten Zeitraumes fanden Hood et al. (1998) ein weiteres Maximum nach Langzeitstimulation bei etwa 24 h. Zeitaufgelöste Messungen mit Porphyrin-beschichteten Mikrosensoren an einzelnen Endothelzellen mit Bradykinin-Stimulation zeigen einen ähnlichen Verlauf (Malinksi und Taha 1992) wie bei VEGF-Stimulation, ebenso bei an T-HUVEC durchgeführten Messungen (Diab et al. 2003, Oni et al. 2003, Isik et al. 2004).
Regulation der NO-Freisetzung durch Calcium-Mobilisation:
In den in dieser Arbeit durchgeführten kolorimetrischen NO-Messungen bei Einsatz
verschiedener Inhibitoren potentiell der NO-Freisetzung vorgeschalteter Signalwege bestätigte sich die Abhängigkeit der NO-Freisetzung von der Verfügbarkeit intrazellulären Calciums (blockiert durch intrazelluläre Calcium-Chelatoren). Die zeitlich aufgelöste Untersuchung der intrazellulären Calcium-Freisetzung zeigte ein biphasisches Calcium-Signal in
HUVEC mit einem ersten Maximum bei etwa 5 min (Faehling et al. 2002), was vom zeitlichen Verlauf her zu einer direkten Beteiligung von Calcium an der NO-Freisetzung paßt. Die
Calcium-Mobilisierung in HUVEC geht eindeutig auf die Aktivierung des VEGFR2 zurück,
weder PlGF noch VEGF-PlGF-Heterodimere sind beteiligt (Cunningham et al. 1999). Die
Calcium-Mobilisierung erfolgt rasch nach 1 bis 3 min. He et al. (1999) finden bei VEGFinduziertem cGMP-Anstieg auch keinen Effekt von EGTA und Verapamil, die auch in
T-HUVEC zu keiner Reduktion der NO-Freisetzung führten, wie hier gezeigt.
Regulation der NO-Freisetzung über Akt- und Src-Aktivierung
Mit verschiedenen Methoden wurde bestätigt, daß die NO-Freisetzung exklusiv durch
VEGFR2 vermittelt wird. Da die Akt-Phosphorylierung über beide VEGF-Rezeptoren vermittelt wird, scheint Akt nicht der wesentliche Aktivierungsweg in T-HUVEC zu sein, da
dann auch eine Vermittlung über VEGFR1 möglich sein sollte. Dasselbe gilt für die PI3K,
deren Beteiligung über den spezifischen Inhibitor LY294002 ausgeschlossen wurde.
Neben intrazellulärem Calcium war die Src-Kinase notwendig zur Aktivierung der
NOS in T-HUVEC nach VEGF-Stimulation. Die Src-Kinase ist eine bekannte Komponente
in der Scher-Streß-vermittelten eNOS-Aktivierung (Davis et al. 2001), während bei VEGFStimulation bisher die PI3K/Akt-vermittelte eNOS-Phosphorylierung beschrieben wurde
(Fulton et al. 1999; Dimmeler et al. 1999). In Untersuchungen mit BAEC finden He et al.
(1999) nach VEGF-Stimulation über VEGFR2 eine Aktivierung von Src, einen Anstieg von
intrazellulärem IP3 und cGMP. Sie messen allerdings nicht direkt NO. Nach ihrer Hypothese,
aktiviert der VEGFR2 direkt die Src-Kinase, die nachfolgend die PLCγ aktiviert. Die PLCγ
führt über IP3 zur Calcium-Mobilisation und darüber zur Aktivierung der eNOS. Über Diacylglycerin wird die PKC aktiviert, die zur Phosphorylierung der MAPK und der eNOS beitragen kann. Übereinstimmend wurde in dieser Arbeit die Beteiligung von Calcium und Src
an der NO-Freisetzung gefunden.
Der in den T-HUVEC gefundene Weg der NOS-Aktivierung nach selektiver
VEGFR2-Stimulation über intrazelluläres Calcium und Src unterscheidet sich durch die Src-
Seite 108
Diskussion
Aktivierung und die fehlende Abhängigkeit von PI3K/Akt von den bisher veröffentlichten
Arbeiten. NO wurde auch als Inhibitor der VEGFR2-Signaltransduktion diskutiert, der nach
VEGFR1-Stimulation von HUVEC ausgeschüttet wird und so die VEGFR2-Effekte moduliert (Bussolati et al. 2001). Hinweise auf eine NO-Freisetzung nach VEGFR1-Aktivierung
konnten in dieser Arbeit bei T-HUVEC nicht gefunden werden, ebensowenig wie eine inhibitorische Funktion des VEGFR1.
4.1.3
Endothelzellfunktionen und rezeptorspezifische Signalwege
Bei dem Vergleich der Endothelzellfunktion nach selektiver Aktivierung einzelner
VEGF-Rezeptoren ergab sich für beide untersuchten VEGF-Rezeptoren ein Signalprofil. Bei
keiner der untersuchten Endothelzellfunktionen wurde ein Anhalt für eine negative,
VEGFR2 inhibierende Funktion von VEGFR1 gefunden, wie von mehreren Arbeitsgruppen
postuliert (Zeng et al. 2001, Rahimi et al. 2000). In diesem Fall hätte der Effekt der
VEGF-E-Stimulation den der VEGF-Stimulation überwiegen müssen. Tabelle 4.3 zeigt eine
Übersicht der unterschiedlichen Rezeptorfunktionen und eine Verknüpfung mit den aktivierten Signalwegen (vergl. Abb. 4.1 und 4.2). Eine Beteiligung oder Abhängigkeit von einem
bestimmten Signalweg wurde angenommen, wenn die Inhibition dieses Weges bei gleichen
Stimulationsbedingungen einen signifikanten Effekt hatte.
Tabelle 4-3: Übersicht der Ergebnisse mit T-HUVEC
Proliferation:
allg.
Zellteilung
(∈Proliferation)
Zellüberleben
(∈Proliferation)
Migration
In vitroAngiogenese
VEGFR1
PlGF mCSF-1
++
+
VEGFR2
VEGF-E
++
Beteiligte Signalüberträger
?
Effekt von
VEGF
+++
+++
+++
+++
Ras
+++
+
Ο
++
NO
+++
++
++
+++
+
+
+
Ras, NO, Src,
Calcium
Ras
++/+++
Nicht abhängig von
?
Ras
PI3K
PI3K, MEK,
Src
4.1.3.1 Proliferation
Die Proliferationsrate von Zellen, die im eigentlichen Sinne die Zellzahlvermehrung
meint, wird von der Zellteilungsaktivität (Mitogenizität) und von der Überlebensrate der
Zellen bestimmt. Beide Phänomene wurden unabhängig voneinander untersucht: die Zellteilungsaktivität über Messung der DNA-Synthese-Rate durch BrdU-Inkorporation und das
Zellüberleben durch Überlebensratenzählung unter serumfreien Bedingungen.
Zellteilungsaktivität (DNA-Synthese, BrdU-Inkorporation):
Während die Rolle des VEGFR2 als zellteilungsfördernd klar beschrieben war, gibt es
zur Vermittlung von mitogenen Signalen durch den VEGFR1 verschiedene Hypothesen. In
den hier durchgeführten Experimenten waren beide Rezeptoren gleichermaßen in der Lage,
die Zellteilungsaktivität zu fördern, was die autonome mitogene Signaltransduktionskapazi-
Diskussion
Seite 109
tät des VEGFR1 bestätigt. Die Stimulation der intrazellulären Domäne des VEGFR1 (stimuliert durch mCSF-1 im schimären Rezeptor Fmt-1) war dabei ausreichend, den Effekt zu
vermitteln. In dem vorliegenden zellulären Kontext kommt der intrazellulären Domäne des
VEGFR1 eine größere Bedeutung zu, als von den Knock-out-Experimenten von (Hiratsuka et al. 1998) zu erwarten gewesen wäre, nach denen diese Domäne keine wesentliche
Funktion zu haben scheint.
Im Unterschied zu unseren Experimenten finden Zeng et al. (2001) in EGF-VEGFRezeptor-Schimären keine Steigerung der H3-Thymidin-Inkorporation in HUVEC nach Stimulation des intrazellulären VEGFR1. Die erhöhte Zellteilungsaktivität nach Stimulation
vom intrazellulären VEGFR2 ist dort abhängig von der PI3K-Aktivierung. Darüberhinaus
gehend wird sogar eine negative Modulation des mitogenen Signals von VEGFR2 durch den
VEGR1 angenommen. Rahimi et al. (2000) verwenden zur Untersuchung der spezifischen
Funktionen der VEGF-Rezeptoren zwei dem Fmt (hier verwendet) ähnliche schimären Rezeptoren mit intrazellulären Anteilen der VEGF-Rezeptoren. In PAE-Zellen wird nicht nur
keine mitogene Stimulation durch Aktivierung des intrazellulären VEGFR2 gefunden, sondern sogar eine Inhibition des mitogenen Effektes, der durch VEGFR2 klar vermittelt wird.
Die Unfähigkeit zur Übermittlung mitogener Signale in PAEC durch hineintransfizierten
VEGFR1 und Stimulation mit VEGF wurde bereits früher gezeigt (Waltenberger et al.
1994). PlGF und auch PlGF-VEGF-Heterodimere wirken in PAEC und in vivo Angiogenese-Untersuchungen (Kornea-Test) ebenfalls angiogenese-inhibierend (Eriksson et al. 2002).
Darüber hinaus zeigen Landgren et al. (1998) im gleichen System allerdings, daß PlGFStimulation von denselben VEGFR1-transfizierten Zellen einen mitogenen Effekt über eine
MAPK-Aktivierung zeigt, was auf eine unterschiedliche Wirkung je nach Stimulationsweise
mit PlGF und VEGF hinweist. Im Gegensatz dazu fanden Kanno et al. (2000) in HUVEC
keinen mitogenen Effekt von PlGF. Allgemein ist der Vergleich von Effekten von hineintransfizierten Rezeptoren mit denen von endogenen Rezeptoren problematisch, ebenso der
Vergleich von Endothelzellen verschiedener Herkunft, so daß eine Integration der z. T. widersprüchlichen Befunde schwierig ist. Genauere Untersuchungen an VEGFR1Tyrosinkinase-Knockout-Mäusen (Hiratsuka et al. 2001), in PlGF-Knockout-Mäusen (Luttun et al. 2002a, 2002b) und –Zellen (Autiero et al. 2003) zeigen, daß ein wesentlicher Unterschied zwischen der Stimulation des VEGFR1 durch VEGF und PlGF besteht und dadurch der VEGFR1 in physiologischen und pathologischen Situationen eine unterschiedliche
Rolle spielt. Nach Stimulation mit PlGF wird der VEGFR1 phophoryliert, nach Stimulation
mit VEGF nicht (Autiero et al. 2003). Daraus erklären sich allerdings die unterschiedlichen
Ergebnisse mit ähnlichen schimären Rezeptoren nicht. Wie dort die Phosphorylierung der
intrazellulären VEGFR1-Domäne erfolgt, ist schwierig zu steuern. In den schimären Rezeptoren aus humanem CSF-1-R+VEGFR1 (Rahimi et al. 2000) und aus EGF-R+VEGFR1 wird
eine Phosphorylierung des VEGFR1-Teiles gefunden. Daher sollten ähnliche Ergebnisse wie
mit PlGF-stimuliertem VEGFR1, der dann ebenfalls phosphoryliert vorliegt, möglich sein,
was speziell bei den vorgestellten schimären Rezeptoren nicht der Fall war. Hiratsuka et al.
(2001) sieht eine Beteiligung des VEGFR1 in pathologischen Situationen eher bei vielschrittigen Prozessen (wie z. B. der Organisation und dem Remodelling von Endothelzellen während der Angiogenese) als bei direkten Phänomenen wie Zellteilung. hier könnte die Trans-
Seite 110
Diskussion
formation der T-HUVEC eine Erklärung sein, wieso dem VEGFR1 eine größere Bedeutung
zu kommt als in anderen Untersuchungen.
Die Vermittlung des mitogenen Signals von VEGF über beide Rezeptoren erfolgte
Ras-abhängig und ließ sich durch intrazelluläre Expression des anti-ras-scFv vollständig
unterdrücken. Dies ist konsistent zur Ras-Aktivierung durch beide Rezeptoren (s. o.). Den
gleichen Effekt auf VEGF- und mCSF-1-induzierte DNA-Synthese fand S. Ehrhardt (1999)
bei Trituration von antigen-bindenden Fragmenten (Fab) des Y13-259. Wie bei Cardinale et al. (1998) wurde durch intrazelluläre Expression von einem anti-ras-scFv (ebenfalls aus
Y13-259) der Anteil BrdU-incorporierender Zellen (3T3, transfiziert mit K-Ras) im Vergleich zu Zellen ohne anti-ras-scFv-Expression deutlich verringert. In Ratten-SinusEndothelzellen ist die mitogene Antwort auf VEGF-Stimulation Ras-unabhängig (Takahashi et al. 1999). Die Aktivierung des Raf-MEK-MAPK-Weges erfolgt dort durch PKC. Konstitutiv aktives Ras führt in HUVEC hingegen zu einer deutlichen mitogenen Antwort, die
mit VEGF vergleichbar ist. In T-HUVEC wird die DNA-Synthese auch MAPK-abhängig
reguliert, wie mit PD98059 gezeigt wird (Shin et al. 1999).
Nicht untersucht wurde in dieser Arbeit die Regulation der DNA-Synthese über NO,
Calcium oder Src-Kinase. In verschiedenen Endothelzellen wurde eine Förderung der DNASynthese nach Behandlung mit NO-Donoren gefunden (Ziche et al. 1993; Ziche et al. 1997)
bzw. eine Calcium-Abhängigkeit der VEGF-stimulierten DNA-Synthese (Faehling et al.
2002).
Überleben unter serumfreien Bedingungen (Zählung der Überlebensrate)
Da aus Vorarbeiten von S. Ehrhardt (1999) bekannt war, daß selektive Aktivierung der
intrazellulären Domäne von VEGFR1 kein Überleben unter serum-freien Bedingungen fördert, während VEGF beides stimuliert, wurde in dieser Arbeit zunächst überprüft, ob der
VEGFR2 Überleben fördern kann. Außerdem wurden die Effekte des vollständigen
VEGFR1 (durch PlGF-Stimulation) im Vergleich zu denen seiner intrazellulären Domäne,
wie sie durch mCSF-1 in dem chimären Rezeptor stimuliert wird, verglichen, um auszuschließen, daß die extrazelluläre Domäne vom VEGFR1 Auswirkungen in dem untersuchten
System hat. Der Überlebenseffekt war in folgender Abstufung beobachtbar: VEGF >
VEGF-E > PlGF. mCSF-1 hatte in Übereinstimmung mit S. Ehrhardts Ergebnissen keinen
Überlebenseffekt. Auf jeden Fall wurde das Überlebenssignal in T-HUVEC über VEGFR2
vermittelt, was auch für HUVEC bestätigt wird (Gerber et al. 1998). Da PlGF einen kleinen
Effekt hatte, konnte dies entweder auf eine besondere Funktion der extrazellulären Domäne
Hinweisen oder auf der Stimulation des ebenfalls vorhandenen Neuropilin-1 beruhen, wobei
letzteres wahrscheinlicher ist. Der Überlebenseffekt durch VEGF und VEGF-E war nicht
Ras-abhängig, obwohl Ras in vielen Systemen an der Übertragung von Überlebenseffekten
beteiligt ist. Auch in der Literatur gibt es jedoch Fälle, in denen die Ras-Aktivierung in dem
einen Zelltyp Überleben macht und in einem anderen nicht, wie von Borasio et al. (1993) für
sensorische bzw. sympathische Neuronen gezeigt. Dieser Befund war allerdings konsistent
im Hinblick auf die Aktivierung von Ras über VEGFR1, der kein Überleben fördert. Obwohl
beide VEGF-Rezeptoren Ras-aktivieren müßte bei Beteiligung von Ras an Überlebenssignal-
Diskussion
Seite 111
Übermittlung nur das von VEGFR2 ausgehende weitergeleitet werden. Dieselben Überlegungen gelten für die Beteiligung der PI3K und Akt, deren Beteiligung ebenfalls vermutet
wurde, aber unwahrscheinlich erscheint. Die Beteiligung von PI3K und Akt wurde experimentell nicht untersucht. In humanen Endothelzellen (HUVEC, HDMEC) kann ein Weg der
VEGFR2-vermittelten Überlebensförderung auf jeden Fall über PI3K/Akt-Aktivierung verlaufen (Gerber et al. 1998).
Einen Hinweis auf eine mögliche differentielle Aktivierung von Signalwegen zum
Überleben trotz gemeinsamer Knotenpunkte ergibt sich aus Untersuchungen zur RafAktivierung nach VEGF- und bFGF-Stimulation (Alavi et al. 2003) in HUVEC. Die Aktivierung von Raf-1 (=c-Raf) kann durch PAK1 (p21-activated protein kinase-1) und durch Src
erfolgen, wobei unterschiedliche Stellen in Raf-1 je nach Kinase phosphoryliert werden. Der
Vergleich zeigt, daß obwohl beide Faktoren VEGF und bFGF ERK-Phosphorylierung fördern, dies durch unterschiedliche Raf-1-Aktivierungsweisen erfolgt. VEGF aktiviert Raf-1
Src-abhängig, während bFGF Raf-1 PAK-1-abhängig aktiviert. Nachgeschaltet erfolgt dann
in beiden Fällen die ERK-Phosphorylierung. Der für unsere Überlegungen wichtigste Punkt
ist, daß trotz ERK-Phosphorylierung in beiden Fällen unterschiedliche Funktionen von
VEGF und bFGF vermittelt werden. VEGF scheint wichtiger für die Inhibition der extrinsischen Apoptose (durch Behandlung mit TNF-α/IFN-γ) zu sein, während bFGF vor dem intrinischen Apoptose-Weg schützt (durch Serumentzug). Als Hypothese werden daher mehrere, verschiedene Mechanismen, die der Überlebensförderung durch verschiedenen Faktoren,
zugrunde liegen vorgeschlagen. Dies zeigt, daß eine genauere Untersuchung notwendig ist,
um die Beteiligung der VEGF-Rezeptoren und des Ras-Raf-MAPK-Weges bei der Überlebensförderung in T-HUVEC aufzuklären. In dieser Arbeit wurde nur das Überleben unter
serumfreien Bedingungen untersucht, das hier nicht von der Ras-Aktivierung abhing. Dies
könnte Rückschlüsse auf die intrinsische Apoptose liefern, klärt aber nicht die Bedeutung
des Ras-MAPK-Kinases-Weges für das VEGF-vermittelte Überleben vollständig auf.
Als wesentlicher Signalübermittler wurde NO gefunden, dessen Gabe überlebenssteigernd und dessen Inhibition überlebenshemmend in T-HUVEC war. In Übereinstimmung
mit dem Befund, daß exklusiv der VEGFR2 die NO-Freisetzung vermittelt, förderte nur der
VEGFR2 das Überleben. Wie NO das Überleben fördert und in Kombination mit welchen
weiteren Signalwegen, ist noch unklar. Verschiedene Hypothesen dazu sind bei T-HUVEC
wahrscheinlich nicht zutreffend: 1. NO fördert VEGF-Expression (Dulak und Joskowicz
2003). Dies ist hier unwahrscheinlich, da bei den Experimenten mit VEGF und L-Name das
zugefügt VEGF trotzdem zum Überleben führen sollte, was nicht der Fall war. 2. NO aktiviert Ras oder die MAPK (Lander et al. 1995, Lander et al. 1996). Da auch mCSF-1 in
T-HUVEC-Fmt Ras und MAPK aktiviert, sollte der Aktivierung des VEGFR1 auch überlebensfördernd sein.
Denkbar ist stattdessen, daß ein kooperativer Effekt notwendig ist. Da der VEGFR2
neben der NO-Freisetzung auch die Aktivierung von PI3K/Akt und Ras/MAPK vermittelt,
könnte ein solcher kooperativer Effekt von NO und einer oder mehrerer weiterer Komponenten aus den genannten Signalwegen notwendig sein, um das Überlebenssignal zu übermit-
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Diskussion
teln. Ohne VEGFR2-Aktivierung könnte der kooperative Effekt wegen fehlender NOFreisetzung nicht eintreten. Zusätzlich könnten die Src-Kinase oder der erhöhte CalciumSpiegel, ob vorgeschaltet im NO-Signalweg oder aufgrund eigenständiger Wirkung, auch
eine zusätzliche Rolle bei VEGFR2-Aktivierung spielen.
Migration (Boyden-Chamber Chemotaxis)
Die Migration von T-HUVEC wurde über beide VEGF-Rezeptoren vermittelt, wobei
Stimulation des VEGFR2 die Migration besser förderte als VEGFR1. Beteiligte Signalwege
waren Ras, NO und Src, wobei Src vermutlich im NO-Signalweg beteiligt war. Aus den
Ergebnissen der Migrationsexperimente konnte geschlossen werden, daß die Src-Kinase an
dem VEGFR2-vermittelten Effekt beteiligt ist (bei Aktivierung von VEGFR1 hatte SrcInhibition keine Auswirkungen). Die Beteiligung von Ras (in T-HUVEC aktiviert über beide
VEGF-Rezeptoren) war erwartet, da die Förderung der Zellmotilität über Ras bekannt ist
(Fox et al. 1994). An der Aufrechterhaltung der basalen Migrationsaktivität (ohne stimulierenden Wachstumsfaktor) war Ras nicht beteiligt, sondern nur NO und Src-Kinase. Eine
mögliche Beteiligung von Calcium kann ebenfalls angenommen werden, da Calcium essentiell für die NO-Freisetzung in T-HUVEC war. Yashima et al. (2001) beobachteten, daß Ras
für die VEGF-stimulierte p38-Kinase-Aktivierung, die wesentliche Wanderungssignale
übermittelt, in HUVEC weniger wichtig als in HMVEC war. Da nicht bekannt ist, ob die
verschiedenen Zellen sich in ihrer Fähigkeit zur NO-Freisetzung unterscheiden, ist nicht klar,
ob eine unterschiedliche NO-Freisetzung den Unterschied erklären könnte.
Im Unterschied zu den hier mit T-HUVEC erhaltenen Ergebnissen, wird die Aktivierung von PI3K wird von Gille et al. (2001) in PAEC ausschließlich dem VEGFR2 zugeordnet, ebenso die PLCγ-Aktivierung, die beide an der Migration mitwirken. Die gleiche Arbeitsgruppe identifiziert im VEGFR1 eine Repressor-Sequenz im Juxtamembranbereich als
verantwortlich für die Unfähigkeit des VEGFR1 die PI3K und nachfolgende Migration zu
aktivieren. Bei Austausch dieser Repressorsequenz durch den Juxtamembranbereich des
VEGFR2 kann auch der VEGFR1 beides aktivieren (Gille et al. 2000). Ebenfalls in PAEC
zeigen Waltenberger et al. (1994), daß Chemotaxis und Mitogenizität ausschließlich durch
hineintransfizierten VEGFR2 und nicht durch VEGFR1 vermittelt werden. Wegen der Signalweg-Unterschiede zwischen Endothelzellen verschiedener Herkunft sind solche Unterschiede nicht unerwartet. Nach Zeng et al. (2001) ist die Migration in HUVEC zwar auch
ausschließlich VEGFR2-abhängig, wird aber nicht durch PI3K vermittelt. Die Abhängigkeit
von VEGFR2 wurde mit schimären Rezeptoren aus EGF-Rezeptor und den intrazellulären
Anteilen des VEGFR1 bzw. VEGFR2 gezeigt (Zeng et al. 2001). Im Gegensatz dazu gibt es
auch Befunden von Untersuchungen mit rezeptor-spezifischer Antikörperblockade, bei der
der VEGFR1 auch an der Migration von HUVEC beteiligt ist (Kanno et al. 2000). Im Gegensatz dazu wurde in dieser Arbeit in T-HUVEC eine Beteiligung des VEGFR1 an der
Vermittlung des Migrationssignales gefunden. Lange bekannt ist die Förderung der
VEGFR1-vermittelten Migration in Monozyten, die ausschließlich diesen VEGF-Rezeptor
expremieren (Barleon et al. 1996; Clauss et al. 1996)
Diskussion
Seite 113
Zur Beteiligung von NO bei der Migration gibt es widersprüchliche Befunden: Lau
und Ma (1996) fanden nach Behandlung von HUVEC mit NO-Donoren eine Inhibition der
Migrationsaktivität von HUVEC im Razor-Wound-Assay. Ein häufig vorgebrachtes Argument für die stark unterschiedlichen Effekte von NO in den Zellen ist die DosisAbhängigkeit. Lau und Ma setzten S-Nitroso-Penicillamine (SNAP) als NO-Donor in einer
Konzentration von 0,3 mM ein, was nach ihren Messungen in 8,1±0,15 µM Nitrit in 6 h resultierte (im Vergleich zu 4,6 µM Nitrit pro Stunde bei 20 mM NOC-18 in den hier durchgeführten Experimenten). Die NO-Konzentration ist daher vermutlich nicht der Grund für die
widersprüchlichen Befunde. Ziche et al. (1993; 1997) fand in verschiedenen Endothelzellen
eine Förderung der Migration über NO, vermutlich nachgeschaltet durch cGMP-Bildung
vermittelt (gemessen in Chemotaxis-Experiment, identisch zu dem in dieser Arbeit verwendeten). Neben der wirkenden NO-Dosis spielen also weitere Parameter eine Rolle bei der
Regulation der Migration.
Die Abhängigkeit der Migration von der Cdc42-Aktivierung wurde in T-HUVEC
nicht untersucht. Aufgrund des zeitlichen Verlaufes könnte cdc42, das durch beide VEGFRezeptoren aktiviert wird, an der Vermittlung des Migrationssignales beteiligt sein (Dauer
des Migrationsexperimentes 4 h, maximale cdc42-Aktivierung nach 3 – 4 h).
Differenzierung (In vitro Angiogenese)
Der komplexe Vorgang bei der Ausbildung charakteristischer organisierter Strukturen
auf extrazellulärem Matrixgel wurde in T-HUVEC durch beide VEGF-Rezeptoren vermittelt
und war unter den untersuchten Wegen (PI3K, Src, Ras, MEK) ausschließlich von der RasAktivierung abhängig. Dies wurde durch den intrazellulären anti-ras-scFv-Antikörper und
über einen Farnesyltransferase-Inhibitor (Manumycin A) gezeigt. Folglich kann Ras als zentraler Regulator der komplexen Vorgänge angenommen werden, die nicht nur über den RafMEK-MAPK-Weg vermittelt werden. Die Src-Kinase war nicht essentiell für den untersuchten in vitro-Angiogenese-Vorgang, obwohl Inhibition der Src-Kinase die Migration von
T-HUVEC wirksam inhibierte. Im Unterschied dazu finden Eliceiri et al (1999) im in vivoAngiogenese (im Hühnchen-Chorion-Allantoin-Membran-Experiment CAM) eine deutliche
Src-Abhängigkeit der Angiogenese. Die Untersuchung von bovinen Lungen-Endothelzellen
in drei dimensionalen Kollagengelen zeigt ebenfalls eine zentrale Rolle von Ras bei der
in vitro-Angiogenese (Meadows et al. 2004), die allein nach Einführung von konstitutiv aktivem Ras ohne Wachstumsfaktor-Stimulation die charakteristischen Strukturen in den Protein-Gelen ausbilden. Daß Aktivierung des VEGFR1 und auch seiner intrazelluären Domäne
ausreichten, um diesen komplexen Prozeß zu steuern, unterstreicht die besondere Bedeutung
bei der pathologischen Angiogenese, wie sie dem VEGFR1 u. a. durch Hiratsuka et al.
(2001) zugewiesen wird. Die Tyrosinkinase-Domäne des VEGFR1 ist nach ihren Untersuchungen u. a. verantwortlich für die Aktivierung der Matrixmetalloproteinase-2, die durch
proteolytischen Verdau der Matrix die Wanderung und Anordnung der Zellen ermöglicht. Es
gibt Hinweise darauf, daß die Ausbildung der Strukturen von mehreren oder anderen nachgeschalteten Ras-Signalwegen als dem MAPK-Weg abhängt. In T-HUVEC inhibiert der
MEK-Inhibitor PD98059 die Ausbildung der Strukturen nicht (Shin et al. 1999).
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Diskussion
4.1.3.2 Vergleich zu primären HUVEC
Aus Abbildung 4.1 ergeben sich die Signalweg-Aktivierungen und Abhängigkeiten
der verschiedenen Funktionen in T-HUVEC. Die Effekte von Inhibitionsstrategien lassen
sich anhand der gefundenen Zusammenhänge abschätzen. Aufgrund der dargestellten Veränderungen (s. 4.1.1) der T-HUVEC im Vergleich zu primären HUVEC ergibt sich, daß die
T-HUVEC eher ein Modell für einen pathologischen Endothelzustand darstellen. Zur Überprüfung der Aussagekraft der Ergebnisse für normale Endothelzellen (im physiologischen
Zustand) wurde einige Experimente mit primären HUVEC wiederholt (Tab. 4.4). Die Abhängigkeiten der Endothelzellfunktionen von den jeweiligen Rezeptoren war vergleichbar
mit den T-HUVEC. Die primären HUVEC zeigten nach Stimulation beider VEGFRezeptoren eine Steigerung der Zellteilungsrate. Der Überlebenseffekt von VEGF beruhte
wie bei den HUVEC auf einer Aktivierung des VEGFR2 durch VEGF-E, während der
VEGFR1 (stimuliert durch PlGF) keinen Überlebenseffekt vermittelte. Einzig bei der Proliferation, d. h. der globalen Zellzahlveränderung nach 48 h Behandlung mit dem Faktor ergab
sich im Unterschied zu den T-HUVEC kein Effekt für PlGF (in T-HUVEC-Fmt hatten PlGF
und mCSF-1 einen leichten Effekt). Für die beiden Funktionen, Zellteilung und Zellüberleben, ergab sich eine direkte Übertragbarkeit der Ergebnisse von den T-HUVEC auf die Ergebnisse mit den primären HUVEC. Das legte nahe, daß die T-HUVEC als Modelle für
normale nicht-transformierte humane Endothelzellen bei Untersuchung der VEGFSignaltransduktion verwendet werden können. Unterschiede, wie die unterschiedliche Rolle
von VEGFR1 bei der Zellzahlvermehrung, bestehen auch zwischen primären Zellen. Die
eigenständige Signaltransduktionskapazität vom VEGFR1 bei der Übermittlung der mitogenen VEGF-Signale wurde in T-HUVEC und HUVEC bestätigt, während das Überleben in
beiden Zellarten nur vom VEGFR2 abhing.
Tabelle 4-4: Übersicht der Ergebnisse mit primären HUVEC im Vergleich zu T-HUVEC
Proliferation:
allg.
Zellteilung
(∈Proliferation)
Zellüberleben
(∈Proliferation)
HUVEC
VEGFR1
PlGF
Ο
HUVEC
VEGFR2
HUVEC
VEGF
T-HUVEC
VEGFR1
PlGF mCSF-1
++
+
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Ο
++
+++
Ο
T-HUVEC
VEGFR2
VEGF-E
++
T-HUVEC
VEGF
+++
+++
+++
Ο
++
+++
+++
4.1.3.3 VEGF-Rezeptorspezische Signalwege: T-HUVEC als modell für Endothelzellen oder pathologische Angiogenese?
Unter der Annahme, daß die T-HUVEC aufgrund ihrer Transformation ein Modell für
die pathologische Angiogenese und nur eingeschränkt für normale Angiogenese darstellen,
konnte in dieser Arbeit die Bedeutung des VEGFR1 bestätigt werden. Aus den Untersuchungen mit primären Endothelzellen oder unter physiologischen Angiogenese-Bedingungen
Diskussion
Seite 115
scheint der VEGFR1, zumindestens bei Stimulation mit VEGF, dort nur von untergeordneter
Bedeutung im Vergleich zu VEGFR2 zu sein. Während der embryonalen Blutgefäßentwicklung und in Einzelfälle kann vielleicht sogar von einem inhibierenden Effekt des VEGFR1
auf die positive Signaltransduktion des VEGFR2 ausgegangen werden. Bei Stimulation mit
PlGF und in der pathologischen Angiogenese hingegen wird die Bedeutung der VEGFR1Aktivierung in vielen Untersuchungen gezeigt (Carmeliet et al. 2001; Luttun et al. 2002a,
2002b; Autiero et al. 2003). Daher ist der VEGFR1 in den letzten Jahren auch in den Fokus
der therapeutischen Bestrebungen zur Anti-Angiogenese getreten.
Die Abhängigkeit von in vitro Angiogenese, Zellteilung und Migration der T-HUVEC
von Ras wird in primären HUVEC ergänzt durch die Befunde von Meadows et al. (2004). In
HUVEC stimuliert das Einbringen von konstitutiv aktivem Ras (G12V) DNA-Synthese,
Migration und die Ausbildung charakteristischer (dort branching morphogenesis genannt)
Strukturen auf dreidimensionalen Kollagen-Gelen. Die Aktivierung von Ras stellt nach dieser Hypothese den wesentlichen Schritt zur aktiven Vaskularisierung, d. h. zur Angiogenese,
dar. Die Ras-Aktivierung ist daher als eigentlicher Initiator der Angiogenese auch am angiogenic switch des Tumors beteiligt und ist die Voraussetzung für den pro-angiogenenen
Phänotyp der Endothelzellen. Die zentrale Rolle von Ras bei Zellteilung, Migration und
in vitro Angiogenese wurde hier in dieser Arbeit in transformierten Endothelzellen bestätigt,
mit der wesentlichen Ausnahme Zellüberleben, das nicht Ras-abhängig war. Da Zellüberleben aber den ruhenden Zustand des Endothels widerspiegelt, berührt dies nicht die Rolle von
Ras als aktiver Initiator der Vorgänge, die die Angiogenese ausmachen. Diesen Befunden in
HUVEC und T-HUVEC widersprechende Ergebnisse zur Unabhängigkeit der Zellteilung
von Ras wurden in anderen Endothelzell-Systemen gewonnen, z. B. in Ratten-Leber-SinusEndothelzellen (Takahashi et al. 1999). Daher können diese Unterschiede spezies- oder Herkunftsgewebe-spezifisch sein. Bei den Funktionen des aktiven Endothels (Wanderung, Zellteilung, In vitro-Angiogenese) war Ras ein zentraler Regulator in T-HUVEC.
Als Überlebensfaktor für Endothelzellen wurde in dieser Arbeit NO in der VEGFR2selektiven Signaltransduktion identifiziert. Die Literatur zeigt viele Facetten einer Wirkung
von NO auf Endothelzellen, von Apoptose-Induktion bis zum Überlebensfaktor. In dieser
Arbeit konnten keine Hinweise auf einen negativen Effekt von NO auf die T-HUVEC gefunden werden, wobei diese außerhalb des verwendeten NO-Konzentrationsbereiches auftreten können. Bei der Wanderung der Endothelzellen war NO ebenfalls deutlich stimulierend.
Aus den NO-Freisetzungs- und Migrationsexperimenten folgt eine mögliche Beteiligung der
Src-Kinase an der Stimulation der NO-Freisetzung, vermutlich über PLCγ und intrazelluläre
Calcium-Mobilisation. Inhibition der NO-Synthese griff in die Funktionen des aktiven
(Wanderung) und des ruhenden (Zellüberleben) Endothels ein.
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Diskussion
Endothelium
aktiv
ruhend
Zellteilung
Migration
Differenzierung
Überleben
BrdU-Inkorporation
Boyden-Chemotaxis
In vitro Angiogenese
Überlebens-Assay
Zellteilung
Überleben
In vitro
angiogenesis
Abbildung 4-1: Schematische Übersicht der beteiligten Signalwege bei den untersuchten Endothelzellfunktionen. Die unter der Funktion angegebenen Rezeptoren/Signalwege waren jeweils
beteiligt (vergl. Tab. 4.3).
VEGFR1
VEGFR2
Schimärer
Rezeptor
Fmt-1
src
P
scFv
O
+
=
In vitroAngiogenese
Abbildung 4-2: Schematische Darstellung der Signalwege, die die dargestellten Endothelzellfunktion von T-HUVEC regulieren.
Diskussion
Seite 117
4.2 Ras-Inhibition in Endothelzell-abgeleiteten Tumoren
4.2.1
T-HUVEC abgeleitete Tumore = vaskuläre Tumore?
Die in bestrahlten Nacktmäusen durch Subkutaninjektion von T-HUVEC in die Achselhöhle erzeugten Tumore bei Takahashi et al. (1990) zeigen folgende Charakteristika: Innerhalb von einem Monat wird das Wachstum eines soliden Tumors von 1 cm Durchmesser
beobachtet. Die Tumorzellen sind nest-artig in mesenchymalem Stroma vom Wirt angeordnet. Tumor-versorgende Blutgefäße sind besonders im Stroma zu finden. Es finden sich zellausgekleidete lumen-artige Räume ohne Blutzellen, eventuell durch Nekrosen entstanden.
Auch Heath-Engel und Lingwood (2003) finden in SCID-Mäusen wenig vaskularisierte,
kompakte Tumore mit vereinzelten atypischen vaskulären Strukturen in der Tumormasse.
Sie finden deutliche Unterschiede zu Tumoren aus Blasenkarzinom-Zellen (T24), mit denen
einige Chargen der über ATCC vertriebenen ECV304 genetisch identisch waren (s. 4.1.1).
Eine histomorphologische Einordnung der Tumore fand in der Literatur bisher nicht statt.
In den in dieser Arbeit erzeugten T-HUVEC-Tumoren in Nacktmäusen wurden folgende Strukturelemente der T-HUVEC-abgeleiteten Tumore in histologischen Schnitten
gefunden: Viele Tumore zeigten die beschrieben Hohlräume, die hier als vasoformative
Strukturen beschrieben wurden. Im Unterschied zu vaskulären Vergleichstumoren beim
Menschen, z. B. dem epitheloiden Angiosarkom, sind diese Hohlräume wahrscheinlich nicht
funktionell als Blutgefäße. Wären sie in vivo blutgefüllt, wäre eine blutreichere Tumormasse
erwartet worden. Der Tumor in vivo erschien aber in großen Teilen der Tumormasse eher
schwach vaskularisiert. Daneben zeigten sich in den Tumoren auch Areale mit überwiegend
epitheloiden und spindeligen Tumorzellen in Aggregaten. Aufgrund der Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen (Tab. 4.5) in Verbindung mit dem histomorphologischen
Aussehen der Tumore und der Mitosehäufigkeit (im Mittel > 20 Mitosen pro 10 HPF) ergab
sich die abschließende Diagnose eines hoch-malignen Sarkoms (bösartiger Weichteiltumor)
ohne weitere Differenzierung. Aus dem histomorphologischen Aussehen und dem Vergleich
zu natürlich vorkommenden humanen Tumoren waren auch epitheloide oder hochdifferenzierte Angiosarkome, also die endotheliale Differenzierung eines Sarkoms möglich, ließen
sich aber wegen der fehlenden CD31-Färbung, die ein wesentliches Diagnosekriterium darstellt, immunhistochemisch nicht belegen.
Es handelt sich bei den T-HUVEC-Tumoren um vaskuläre Tumore (zur Systematik
s. 1.7) auf der Grundlage transformierter Endothelzellen. In Übereinstimmung mit HeathEngel und Langwood (2003) wurde aus den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen gefolgert, daß die T-HUVEC abgeleiteten Tumore kein Modell für Tumorangiogenese, sondern
für vaskuläre Tumoren sind. Modelle für Tumorangiogenese untersuchen das Verhalten von
zunächst normalen Endothelzellen des Wirtes und deren Veränderungen in Wechselwirkung
mit der Tumorumgebung, z. B. in einem soliden Tumor aus beliebigen Tumorzellen (Kolonkarzinom, Blasenkarzinom o. ä.). In T-HUVEC abgeleiteten Tumoren hingegen können Faktoren, die zur Entartung und Transformation von Endothelzellen selbst führen, studiert wer-
Seite 118
Diskussion
den. Dies gibt Hinweise auf die Entstehung vaskulärer Tumore, darunter Hämangiosarkome.
Die Beteiligung von konstitutiv aktivierenden Ras-Mutationen ist sowohl für spontane als
auch für chemisch induzierte Hämangiosarkome beim Menschen (Prydodzki et al. 1997,
Marion et al. 1994) belegt. Bei spontanen Hämangiosarkomen werden in 25 % der Tumore
Ras-Mutationen gefunden, vor allem in K-Ras.
Tabelle 4-5: Immunhistochemische bzw. –zytochemische Marker von T-HUVEC oder THUVEC-abgeleiteten Tumoren. (n. u., nicht untersucht).
4.2.2
Marker
Für
Vimentin
CD31/PECAM-1
Keratin
LCA
Myc
Mesenchymale Zellen
Endothelzellen
Epitheliale Zellen
Hämatopoietische Zellen
?
Zytochemisch
Zellen
+
n. u.
n. u.
+
Histochemisch
Tumor
+
n. u.
Effekte der Ras-Inhibition durch intrazelluläre Immunisierung
Die Auswirkungen der Ras-Inhibition auf die DNA-Synthese, die Wanderung und
die in vitro-Angiogenese-Aktivität wurde in Zellkultur gezeigt. Da die Ras-Inhibition die
Zellteilung in Zellkultur wirksam unterdrückte, wurde die Auswirkungen der Ras-Inhibition
auf das T-HUVEC-induzierte Tumorwachstum im Nacktmaus-Modell in vivo untersucht.
Dazu wurde die T-HUVEC-Zellinie TetOff-anti-ras-scFv, die induzierbar anti-ras-scFv expremierte, subkutan in die Nacktmäuse injiziert. Die tumorbildenden Zellen brachten das
therapeutische Konstrukt direkt mit, so daß kein in vivo-Gentransfer notwendig war. Die
Ras-Inhibition wurde von Injektion der Zellen an durchgeführt (Präventionsgruppe) bzw.
von Manifestation eines kleinen Tumorknotens an (Interventionsgruppe), in beiden Fällen
durch doxycyclin-freies Trinkwasser. In der Kontrollgruppe, die als Referenz für normales
Tumorwachstum verwendet wurde, war die Expression des anti-ras-scFv durch doxycyclinhaltiges Trinkwasser ständig unterdrückt. In jeder Gruppe wurden 6 Tiere behandelt.
Die Ras-Inhibition führte zu einer signifikanten Reduktion des mittleren Tumorvolumens in der Präventionsgruppe und Interventionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe
(am Endpunkt Tod oder Tag 60). Bei Ausschluß von je einem Tier pro Gruppe wegen offensichtlichen Nicht-Ansprechens (vermutlich durch Verlust des anti-ras-scFv bzw. Selektion
von nicht-expremierenden Zellen) verbesserte sich das Signifikanzniveau. Die Tumore der
Präventions- und Interventionsgruppe waren nicht nur kleiner, sondern wuchsen auch sehr
viel langsamer. Sie benötigten im Mittel mehr als 55 bzw. 44 Tage länger als die Kontrollgruppe, um ein bestimmtes Tumorvolumen zu erreichen (0,5 cm³), was einer signifikanten
Wachstumsverzögerung des Tumors entspricht. Zwischen Präventions- und Interventionsgruppe gab es keine signifikanten Unterschiede. Bei Ras-Inhibition war die Mitosehäufigkeit
in der Präventionsgruppe im Mittel reduziert. Dies stand in Einklang mit den Ergebnissen
aus den Zellkultur-DNA-Synthese-Experimenten, bei denen Ras wesentlich an der Stimulation der Zellteilung durch VEGF beteiligt war. Die Parameter zur Beschreibung der Wachstumsgeschwindigkeit/Mitose-Aktivität und des Tumorvolumens zeigten einen Effekt der
Ras-Inhibition. Die Ras-Inhibition durch intrazelluläre Immunisierung mit dem anti-ras-scFv
Diskussion
Seite 119
war eine erfolgreiche Strategie zur Wachstumsinhibition von T-HUVEC, die als Modell für
vaskuläre Tumorigenese verwendet wurden. Cochet et al. (1998) finden nach adenoviralem
Gentransfer eines anti-ras-scFv durch Injektion in den Tumor eine Reduktion der Tumorgröße bei Kolonkarzinom-Tumorimplantaten in Nacktmäusen. In Kolonkarzinom-Zellen liegen
ebenfalls häufig Ras-Mutationen vor, so daß die Ras-Inhibition hier besonders erfolgsversprechend erscheint. Eine Regression des mittleren Tumorvolumens wurde in T-HUVEC
nach Ras-Inhibition nicht beobachtet (wohl in einzelnen Tumoren). Aufgrund der Unabhängigkeit des Überlebens von T-HUVEC von der Ras-Aktivierung, war dies aus den Zellkulturexperimenten auch nicht unbedingt erwartet worden. Für das Überleben wurde nur NO als
wesentlicher Faktor in Zellkultur identifiziert, dessen Bildung in den T-HUVEC-Tumoren
nicht inhibiert wurde.
Anhand der Histomorphologie der Tumore aus den einzelnen Gruppen wurde kein
wesentlicher Unterschied zwischen den Gruppen gefunden. Eine vergleichende Untersuchung zeigte, daß die histomorphologischen Kennzeichen, wie epitheloide, spindelige Zellen, vasoformative Strukturen, Nekrosen in allen drei Gruppen gleichverteilt zu finden waren. Eine Einordnung der histologischen Befunde der Tumoren anhand der Nekrosen und
Mitosehäufigkeiten (nach van Unnik 1995) zeigte ebenfalls keine wesentlichen Unterschiede
zwischen den Gruppen. Daraus folgt, daß die Ras-Inhibition durch intrazelluläre Immunisierung keine Auswirkungen auf die Malignität des Tumors hat. Allein die Mitosehäufigkeit,
als ein Element der Malignität, war nur in der Präventionsgruppe reduziert. Endothelzellen,
die mit konstititutiv aktivem Ras transformiert sind, zeigen eine Malignitätserhöhung im
Vergleich zu den untransformierten Ausgangszellen (Arbiser et al. 1997). Daher war zunächst erwartet worden, daß durch Inhibition von Ras eine Malignitätsverringerung erreicht
werden konnte. Diese Malignitätsverringerung wurde jedoch in der vergleichenden Untersuchung der Tumore nicht gefunden.
Da Ras die VEGF-Sekretion reguliert (Grugel et al. 1995; Rak et al. 2000 ; Rak und
Kerbel 2001), könnte Ras über die VEGF-Sekretion den Vaskularisierungsgrad des Tumors
und damit sein Wachstum regulieren. Für unsere Experimente mußte überprüft werden, ob
die TetOffscFv-Zellinien ebensoviel VEGF wie die Wildtypzellen sekretieren, da VEGF
direkte Einflüsse auf das Tumorwachstum und die Tumor-Vaskularisierung hat. Das Tumorwachstum hängt wesentlich von der VEGF-Sekretion der transplantierten Zellen ab. In
Zellkulturexperimenten hatte die Ras-Inhibition keine Auswirkungen auf die
VEGF-Ausschüttung. Daher ist unwahrscheinlich, daß die unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten auf einer unterschiedlichen VEGF-Ausschüttung und damit Tumorangiogenese durch Wirtsblutgefäße beruhen. Dies bestätigte die Hypothese, daß die Ras-Aktivierung
im Tumor die Tumorangiogenese über die Hochregulation von VEGF hinaus fördert (Okada et al. 1998).
Ausgehend von den hier erzielten Ergebnissen mit humanen transformierten Endothelzellen sollte Ras als ein Zielmolekül bei der Therapie von Hämangiosarkomen in Erwägung gezogen werden. Ras-Inhibition beeinflußt im hier verwendeten Tiermodell das Wachstum, nicht aber die Malignität des Sarkoms.
Seite 120
Diskussion
4.3 Ausblick
Weitere Untersuchungen sind notwendig, um herauszufinden, welcher Mechanismus
der selektiven Förderung von Zellteilung, nicht aber von Überleben der T-HUVEC durch
Ras zugrunde liegt. Dazu sollte die Regulation der Apoptose von Endothelzellen mit und
ohne Ras-Inhibition verglichen werden. Dies kann in den Zellinien T-HUVEC-anti-ras-scFv
erfolgen. Um über die Ras-Inhibition hinausgehende Effekte der intrazellulären Immunisierung mit anti-ras-scFv zu kennen, ist es sinnvoll, andere Wege der Ras-Inhibition (z. B. Farnesyltransferase-Inhibitoren oder interferierende RNA-Oligonukleotide) zu verwenden und
die Effekte mit denen des anti-ras-scFv zu vergleichen. Eine weitere Optimierungsmöglichkeit ergibt sich aus dem schmalen Konzentrationsfenster, in dem die Wirkung des anti-rasscFv bei intrazellulärer Expression erreicht wird. Offensichtlich muß die Zelle mit einer bestimmten Menge anti-ras-scFv beladen werden, um den Ras-Inhibitionseffekt zu erreichen.
Daher ist es sinnvoll, den anti-ras-scFv auch in einer membran-lokalisierten Form zu untersuchen. Versieht man den anti-ras-scFv mit der Membran-Lokalisierungssequenz von seinem Zielmolekül Ras könnte dies die Wirkung bei intrazellulärer Expression verbessern.
Dadurch wäre auch über Anfügung der unterschiedlichen Sequenzen der Ras-Isoformen eine
gewisse Isoformen-Spezifität des Antikörpers zu erhalten. Bei Tumorzellen, die Ras überexpremieren läßt sich die Expression des funktionsblockierenden anti-ras-scFv auch unter die
Kontrolle der regulierenden Sequenzen des Ras-Genes stellen. Dann könnte die Expression
des inhibierenden anti-ras-scFv zusammen mit der Überexpression vom Zielmolekül Ras
erfolgen (R. Ahmadian, persönliche Mitteilung). Außerdem kann die Expression des antiras-scFv, die in dieser Arbeit durch eine pharmakologischen Induktor erfolgte, unter die
Kontrolle gewebespezifischer oder tumorspezifischer Promotoren (z. B. VEGFR2, CD31,
CEA etc.) gestellt werden. Die in Zellkulturexperimenten erfolgreichste RasInhibitionsstrategie könnte in verschiedenen Tumormodellen weiteruntersucht werden.
Die antiangiogene Therapie läßt sich konzeptionell für alle soliden Tumore anwenden. Tumore zeigen allgemein wenig Resistenzen gegen anti-angiogene Therapie, vermutlich
wegen des geringen Mutationspotentials in Endothelzellen. Zur Inhibition von VEGFrezeptorspezifischer Signaltransduktion ergeben sich verschiedene Überlegungen. Unter
Berücksichtigung der veröffentlichten und hier vorgestellten Ergebnisse könnte eine selektive VEGFR1-Inhibition in Endothelzellen therapeutisch sinnvoll sein, da eher sich teilende,
wandernde und differenzierende Endothelzellen betroffen wären, während ruhende Endothelzellen nicht beeinträchtigt werden sollten. So trifft man allerdings nur sich bildende
Blutgefäße, erreicht aber keine Rückbildung von schon gebildeten Gefäßen. Vermutlich muß
diese Therapie, z. B. bei der Tumorbehandlung, dauerhaft fortgesetzt werden. Im Vergleich
zur allgemeineren anti-VEGF-Therapie durch Antikörper würden bestimmte Nebenwirkungen durch Inhibition von VEGFR2 minimiert, z. B. die Hypertension, die aufgrund der reduzierten NO-Freisetzung entsteht. Will man hingegen nicht nur das Blutgefäß-Wachstum inhibieren, sondern auch schon gebildete Blutgefäße zurückbilden, so kann es sinnvoller sein,
beide Rezeptoren kombiniert zu inhibieren, wie es auch schon verfolgt wird (Wood et al.
2000).
Diskussion
Seite 121
Sind intrazelluläre Signaltransduktionsmediatoren von VEGF-Signalen das Ziel der
Inhibitionstrategie, so wurden in dieser Arbeit besonders Ras und Src/NO als interessante
Ziele identifiziert. Ras-Inhibition trifft eher die aktive Endothelzelle, während Src/NO auch
die ruhende Endothelzelle über die Regulation des Überlebens treffen. Ausgehend von unseren Ergebnissen aus Zellkultur-Experimenten und im Tierversuch, ist nur die Kombination
beider Inhibitionsstrategien geeignet, die tumorversorgenden Blutgefäße vollständig zu
hemmen und zum Absterben zu bringen. In T-HUVEC als Modell für vaskuläre Tumorigenese können folgende Untersuchungen durchgeführt werden: Zur Wachstumsinhibition und
Tumorregression sollte die Ras-Inhibition, die durch intrazelluläre Immunsierung erfolgen
kann, mit einer Src- oder NOS-Inhibition kombiniert werden. Damit kann überprüft werden,
ob eine vollständige Regression des vaskulären T-HUVEC-abgeleiteten Tumors erreicht
wird.
In einem Modell zur Tumorangiogenese kann der Effekt der Ras-, Src- und NOInhibition in Endothelzellen getestet werden. Dazu sollte im NacktmausTumorimplantationsmodell ein solider Tumor erzeugt werden (z. B. mit Kolonkarzinomzellen) und der anti-ras-scFv in Endothelzellen, die den Tumor versorgen, expremiert werden.
Zusätzlich könnte eine systemische Therapie mit NOS-Inhibitoren (L-Name) und/oder SrcKinase-Inhibitoren durchgeführt werden. Bei Tumoren mit onkogen mutiertem Src und allgemein bei metastasierenden Tumoren kann die Src-Inhibition zusätzliche anti-TumorEffekte zeigen. Src kann die Zell-Zell-Adhäsion und die Zellwanderung von Tumorzellen
regulieren und so deren Metastase-Aktivität steuern. Die in-vivo-Einsetzbarkeit von SrcInhibitoren (PP2) zur Reduktion von Metastasen wurde bereits gezeigt (Nam et al. 2002),
nicht aber die Unterdrückung der Tumorangiogenese durch Src-Inhibition. Alternativ könnte
auch eine Src-Inhibition in einem analogen Verfahren zur Ras-Inhibition erreicht werden,
indem inhibitorische Src-Mutanten ebenfalls über Gen-Transfer eingeführt werden. Durch
die Anwendungsweise von PP2 (lokal und in Zyklen) wird das normale Endothel außerhalb
des Tumors geschützt. Die Ras-Inhibition alleine sollte unseren Zellkulturstudien zufolge das
ruhende Endothel, auch außerhalb des Tumors, nicht schädigen und eignet sich daher voraussichtlich für eine chronische Behandlung. Mit dem hier vorgeschlagenen dualen Konzept
der Blockade aller Endothelzellfunktionen durch Inhibition der endogenen Ras- und SrcAktivitäten erhoffen wir uns eine Unterdrückung der Tumorangiogenese. Darüberhinaus
könnte die vorgeschlagene duale Therapie in Kombination mit weiteren Therapien optimiert
werden, z. B. in Kombination mit Bestrahlung, Chemotherapie und adjuvant/neoadjuvant bei
Resektion. Damit der rekombinante anti-ras-scFv nur in Endothelzellen expremiert wird,
kann seine Expression unter die Kontrolle eines Endothel-spezifischen Promotors gestellt
werden (CD31/PECAM-1 oder VEGFR1). Um eine effiziente Transfermöglichkeit zu haben,
kann das Konstrukt mit endothelspezifischem Promotor in virale Vektoren gebracht werden,
von denen besonders Adeno- und Lentiviren interessant erscheinen (zu den Eigenschaften s.
1.3.2).
Seite 122
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Der vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor VEGF fördert Zellteilung, Überleben, Migration und Differenzierung von Endothelzellen. Zur Feinabstimmung seiner Effekte vermittelt er seine Effekte über die beiden VEGF-Tyrosinkinase-Rezeptoren VEGFR1 und
VEGFR2. In der vorliegenden Arbeit wurde die eigenständige Signalfunktion des VEGFR1
durch Untersuchungen mit rezeptor-spezifischen Liganden und Rezeptor-Schimären in primären (HUVEC) und spontan transformierten humanen Nabelschnurvenenendothelzellen (THUVEC) bestätigt. Bei Zellteilung, Migration und beim komplexen Vorgang der in vitroAngiogenese wurde das VEGF-Signal durch beide VEGF-Rezeptoren vermittelt. Selektive
Stimulation des VEGFR1 bzw. seiner intrazellulären Tyrosinkinase-Domäne war in allen
Fällen ausreichend, um diese Effekte in T-HUVEC auszulösen. Diese Endothelzellfunktionen waren in allen Fällen Ras-abhängig. Bei intrazellulärer Expression des funktionsblockierenden rekombinanten anti-ras-Einzelketten-Antikörpers (anti-ras-scFv) wurde die VEGFstimulierten Effekte blockiert. Diese Untersuchungen wurden in stabil transfizierten Zellinien, die den anti-ras-scFv durch Doxycyclin-Entzug induzierbar expremieren, durchgeführt.
Selektiv über VEGFR2 vermittelt wurde der VEGF-Überlebenseffekt in HUVEC und THUVEC und die Freisetzung von Stickstoffmonoxid in T-HUVEC. Ras war für das Zellüberleben in T-HUVEC nicht essentiell. Der zeitliche Verlauf der Freisetzung von Stickstoffmonoxid nach VEGF-Stimulation wurde in elektroanalytischen Messungen an wenigen
T-HUVE-Zellen gezeigt. Stickstoffmonoxid wurde durch Stickstoffmonoxid-SyntheseInhibition als wesentlicher Regulator des Endothelzellüberlebens gefunden. Die VEGFstimulierte Migration war neben Ras auch von Stickstoffmonoxid abhängig. Untersuchung
dieser Funktionen mit Src-spezifischen Inhibitoren gab Hinweise auf eine Regulation der
NO-Synthese durch Src. Ras und Stickstoffmonoxid. Die GTPase cdc42 aus der Rho-Familie
wurde durch VEGFR1 und VEGFR2 aktiviert und könnte vom zeitlichen Verlauf der Aktivierung bei der Migration beteiligt sein. Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, daß Ras
und Stickstoffmonoxid zentrale intrazelluläre Signalüberträger von VEGF-Signalen in transformierten Endothelzellen sind.
In Nacktmäusen führte die subkutane Implantation von T-HUVEC zur Bildung von
hoch-malignen Sarkomen, die durch sehr hohe mitotische Aktivität und VimentinExpression gekennzeichnet waren. Histomorphologisch zeigten sich Mermale von epitheloiden bzw. hochdifferenzierten Angiosarkomen, den Zellen fehlten jedoch in Zellkultur und im
Tumor typische Endothelzellmarker für den immunhistochemischen Beleg dieser Differenzierungsrichtung. In Korrelation zur Ras-Abhängigkeit der Zellteilung von T-HUVEC in
Zellkultur wurden die mitotische Aktivität, die Wachstumsgeschwindigkeit und das EndVolumen der T-HUVEC-Tumore durch intrazelluläre Expression des anti-ras-EinzelkettenAntikörpers signifikant reduziert. Die Ras-Inhibition von der Implantation an war dabei
wirksamer als die Ras-Inhibition nach Manifestation eines Tumorknötchens. Eine grundsätzliche Reduktion des Malignitätsgrades nach Ras-Inhibition wurde nicht beobachtet. Die Reduktion von Wachstumsgeschwindigkeit und Tumorvolumen durch Ras-Inhibition beruhte
nicht auf einer durch Ras-regulierten VEGF-Freisetzung durch T-HUVEC.
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Seite 134
Anhang
7 Anhang
Anhang A: Übersichten/Einzelergebnisse für T-HUVEC-Tumore
Mittleres Tumorvolumen in den Gruppen mit allen Tieren
1,8
Mittleres Tumorvolumen in cm³
1,6
1,4
1,2
Kontrollgruppe
1
Präventionsgruppe
0,8
Interventionsgruppe
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
Tage nach Zellinjektion
Einzelergebnisse in den Gruppen
In den folgenden Tabellen sind die Tumorvolumina an den Tage nach Injektion der
Zellen (Tag 0) in cm³ angegeben. Die Berechnung der Tumorvolumina aus den drei Dimensionen des Tumors erfolgte wie in Kap. 2 beschrieben. Die letzten beiden Spalten jeder Tabelle zeigen den arithmetischen Mittelwert und die Standardabweichung (Stabw). Fettgedruckt ist in jeder Spalte jeweils das erste Volumen, das 0,5 cm³ überschreitet (für die Berechnung der Wachstumsverzögerung). Die Bestimmung der Wachstumsverzögerung und
die Zuordnung des Wachstumsverlaufes wurden gemäß 3.4.3 vorgenommen. Die Zahl der
Mitosen wurde in 5 Gesichtsfeldern bei hoher Vergrößerung (HPF) bestimmt (vergleiche
3.4.3.4) gezählt. Die Tumorvolumina der einzelnen Mäuse sind in den Abbildungen jeweils
gegen die Zeit aufgetragen. Die Graduierung erfolgte nach van Unnik (1995) (s. 2.6.4).
Anhang
Seite 135
Kontrollgruppe: Wachstumsverhalten
Tag
KOT1-1
KOT1-2
0
KOT1-3
KOT2-1
0
0
0
0
18
0,0082
0,1414
20
0,1173
0,1414
26
0,8042
0,8796
KOT2-2
KOT2-3
Mittelwert
Stabw
0
0
0
0
0,0754
0,0082
0,0583
0,0638
0,0754
0,0082
0,2444
0,3587
0,5040
0,2346
0,2094
0,5993
0,4335
29
0,5040
0,6786
0,2094
0,4640
0,2371
33
0,5184
0,6786
0,5027
0,5665
0,0974
36
0,5760
0,9802
0,6336
0,7299
0,2187
40
0,5760
0,6336
0,6048
0,0407
42
0,5760
0,6336
0,6048
0,0407
0,0407
1,2441
46
0,6336
0,6912
0,6624
50
0,7603
0,7603
0,7603
-
54
0,8985
1,2902
0,8236
1,0041
0,2505
57
0,9676
1,8378
0,8063
1,2039
0,5549
60
1,2064
1,6965
1,1058
1,3362
0,3160
64
68
82
85
89
92
96
0
0
0
-7
2
6
0
4,2
26
23
29
51
30
1
26,7
16,0
ja
nein
ja
ja
ja
Ja
Punkte
Mitosen/
Nekrose
Grad
2/1
2/0
2/1
2/1
2/1
0/1
III
II
III
III
III
I
Wachstumsverlauf
Progression
Progression
Progression
Progression
Progression
Progression
N=6
N=6
Wachstumsverzögerung
Mitosen pro
5 HPF
Nekrosen
Kontrollgruppen 1 und 2
Tumorvolumen in cm³
2
KOT1-2
1,5
KOT1-2
KOT1-3
1
KOT2-1
KOT2-2
0,5
KOT2-3
0
0
20
40
60
80
Tage nach Zellinjektion
100
120
Seite 136
Anhang
Präventionsgruppe: Wachstumsverhalten
PT1-1
PT1-2
PT1-3
PT1-4
PT1-5
PT1-6
Mittelwert
Stabw
Tag 0
0
0
0,0000
0
0
0
0
0
18
0
0,0082
0,0082
0,0754
0
0
0,0153
0,0297
20
0
0,0082
0,0082
0,1026*
0
0
0,0198
0,0408
26
0
0,1283
0,0785
0,0082
0
0
0,0358
0,0547
29
0
0,1539
0,0785
0,0082
0
0
0,0401
0,0637
33
0
0,2346
0,1100
0,0082
0,0082
0
0,0601
0,0954
36
0
0,3393
0,1759
0,0082
0,0082
0
0,0886
0,1408
40
0
0,3393
0,1759
0,0503*
0,0005
0
0,0943
0,1380
42
0
0,3393
0,1759
0,0754
0,0005
0
0,0985
0,1368
46
0
0,3351
0,2309
0,0942
0,0082
0
0,1114
0,1415
50
0
0,3351
0,2932
0,0942
0,0082
0
0,1218
0,1538
54
0
0,4032
0,4608*
0,0942
0,0082
0
0,1611
0,2136
57
0
0,6912
0,3770*
0,0655
0,1508
0
0,2141
0,2727
60
0
1,4255
0,3770
0,0785
0,1508
0
0,3386
0,5505
64
0
0,1131
0,3770
0
0,1634
0,1935
68
0
0,1539*
0,3393
0
0,1644
0,1699
82
0
0,1283
0,4189
0
0,1824
0,2146
85
0
0,1283
0,6126
0
0,2470
0,3231
89
0
0,0082*
0,8168
0
0,4125
0,5718
92
0
0,0082
1,0482
0
0,5282
0,7354
96
0
0,0082
1,5394
0
0,7738
1,0827
Wachstumsverzögerung
Mitosen pro
5 HPF
Nekrosen
> 69
30
33
> 69
58
> 69
54,7
25,1
0
12
20
7
9
0
8,0
7,6
-
ja
ja
nein
ja
-
Punkte
Mitosen/
Nekrose
Grad
0/0
2/1
2/1
1/0
1/1
0/0
-
III
III
II
II
Wachstumsverlauf
Kein
Tumor
Progression:
verzögertes
Wachstum
(NonResponder)
TumorStabilisierung
Partielle
Remission
Stabilisierung
des Tumorvolumens
N=6
N=6
Kein Tumor
Tumorvolumen in cm³
Präventionsgruppe 1
2
PT1-1
1,5
PT1-2
PT1-3
1
PT1-4
PT1-5
0,5
PT1-6
0
0
20
40
60
80
Tage nach Zellinjektion
100
120
Anhang
Seite 137
Interventionsgruppe: Wachstumsverhalten
TT1-1
TT1-2
TT1-3
TT1-4
TT1-5
TT1-6
Mittelwert
Stabw
Tag 0
0
0
0
0
0
0
0
0
18
0,1131
0,1257
0,1414
0,1026
0,0440
0,0754
0,1004
0,0355
20
0,1131
0,0082
0,1414
0,1026
0,0440
0,1100*
0,0865
0,0499
26
0,1696
0,0082
0,1759
0,1759
0,0628
0,0942
0,1145
0,0707
29
0,1696
0,0082
0,2545
0,1759
0,0754
0,0942
0,1296
0,0875
33
0,4147
0,0082
0,2053
0,2639
0,0942
0,0655
0,1753
0,1501
36
0,4021
0,0082
0,2053
0,0942
0,0754
0,0655
0,1418
0,1429
40
0,5760
0,0082
0,1796
0,2639
0,1131
0,0082*
0,1915
0,2129
42
0,5760
0,0082
0,2681
0,3393
0,1131*
0,0082
0,2188
0,2211
46
0,6807
0,0082
0,3393
0,5184
0,0655
0,0082
0,2700
0,2878
50
0,7330
0,1796
0,3393
0,5184
0,0655
0,0082
0,3073
0,2797
54
0,7680
0,1539
0,3393
0,5184
0,0524*
0,0082
0,3067
0,2952
57
1,0367
0,4665
0,3686
0,5184
0,0655
0,0082
0,4106
0,3714
60
1,3069
0,7854
0,3686
0,5184
0,0655
0,0082
0,5088
0,4859
64
0,4712
0,3770
0,0655
0,0082
0,2305
0,2281
68
0,4712
0,4189
0,0942
0,0082
0,2481
0,2311
82
0,4712
0,7540
0,0942
0,0082
0,3319
0,3459
85
0,5760
1,0263
0,0942
0,0082
0,4262
0,4717
89
0,5760
1,2315
0,0942
0,0082
0,4775
0,5614
92
0,5655
0,9530
0,0942
0,0082
0,4052
0,4397
96
0,6220
0,9530
0,0942
0,0082
0,4194
0,4474
Wachstumsverzögerung
Mitosen pro
5 HPF
Nekrosen
13
33
58
19
> 69
> 69
43,5
18,5
29
24
21
9
3
12
16,3
9,9
ja
ja
ja
ja
ja
ja
Punkte
Mitosen/
Nekrosen
Grad
2/1
2/1
2/1
1/1
1/1
2/1
III
III
III
II
II
III
Wachstumsverlauf
Progression
(NonResponder)
Progression:
Verzögertes
Wachstum
Progression:
Verzögertes
Wachstum
Progression:
Verzögertes
Wachstum
Partielle
Remiission
Partielle
Remission
N=6
N=6
Interventionsgruppe
Tumorvolumen in cm³
1,4
1,2
TT1-1
1
TT1-2
0,8
TT1-3
0,6
TT1-4
0,4
TT1-5
0,2
TT1-6
0
0
20
40
60
80
Tage nach Zellinjektion
100
120
Seite 138
Anhang
Übersicht der Tumorvolumina einzelner Mäuse der Wildtyp-Gruppe
WT2
106 Zellen
WT1
106 Zellen
WT3
106 Zellen
WT4
5*106 Zellen
WT5
5*106 Zellen
WT6
5*106 Zellen
Tag 0
0,1696
7
12
0,3110
14
0,4189
0,2199
0,2513
0,4032
16
0,3519
0,4608
0,1382
18
0,4021
0,2199
0,1676
0,4395
20
0,6597
0,3958
0,3159
0,5529
23
0,9048
0,4189
25/26
1,0053
27
1,0210
1,0210
0,3770
0,4105
0,9257
0,4948
1,3928
0,7959
1,7593
1,0891
30
0,5027
0,5027
0,6126
33/34
1,3928
1,3195
0,7959
2,2431
0,8168
37
2,3499
1,4661
1,2566
2,7772
1,5708
Mitosen pro 5 HPF
7
12
16
28
5
15
Wachstums-verlauf
Progression
Progression
Progression
Progression
Progression
Progression
WT7
107 Zellen
WT8
107 Zellen
WT9
107 Zellen
WT10
3*107 Zellen
WT11
3*107 Zellen
WT12
3*107 Zellen
0
0
0,3519
Tag 0
7
0
12
0
1,0053
0
0
0,3958
14
0
1,1729
0
0
0,5445
16
0
2,0358
0
0
0,5864
2,8903
0
0
0,5864
0,5864
0,5969
1,0776
18
20
1,8431
23
2,0735
25/26
0
2,2808
27
30
0
0
0
33/34
0
0
0
0,7372
37
0
0
0
1,4661
Mitosen pro 5
HPF
Wachstumsverlauf
Kein Tumor
10
10
Progression
Progression
6
Kein Tumor
Kein Tumor
Progression
Anhang
Seite 139
Anhang B: Sequenz des anti-ras-scFv-myc
658
706
754
802
START VH→
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1378
CDR (Complementarity determining region): direkt an der Interaktion zu Ras beteiligte Aminosäuren (nach Gallagher und Grant 1996). Die Sequenz (außerhalb des
Linkers und des angefügten Myc-Epitopes) ist identisch mit der von Werge et al.
1990. Die Klonierung von VH-Linker-VL ohne Myc-Epitop erfolgte gemäß Feldhaus
1999.
Das Protein anti-ras-scFv-myc in der dargestellten Form umfaßt 254 Aminosäuren
und hat ein Molekulargewicht von 27,3 kDa.
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Lebenslauf
Lebenslauf
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8 Lebenslauf
Name:
Geboren:
Ina Radtke
20.10.1975 in Hagen
Schulausbildung:
1982-1986
1986-1995
1995
Funcke-Park-Grundschule in Hagen
Albrecht-Dürer-Gymnasium in Hagen
Abitur/allgemeine Hochschulreife
Studium/Hochschulausbildung
1995-2000
Studium der Biochemie, Ruhr-Universität Bochum
Diplomarbeit über „Mutationsanalyse potentiell funktioneller Domänen des p75LNTR“ am Lehrstuhl für molekulare Neurobiochemie, AG PD Dr. Blöchl, Fakultät für Chemie, Ruhr-Universität Bochum
Nov. 2000
Diplom in Biochemie
Aug. 2003
1. Staatsexamen Humanmedizin
2000-2004
Anfertigung der Dissertation am Lehrstuhl für Molekulare Neurobiochemie unter Anleitung von Prof. Dr. R. Heumann
Publikationen:
Welzel T, Radtke I, Meyer-Zaika W, Heumann R, Epple M (2004): Transfection of cells
with custom-made calcium phosphate nanoparticles coated with DNA. J Mater
Chem 14, 2213-2217.
Oni J, Pailleret A, Isik S, Diab N, Radtke I, Blöchl A, Jackson M, Bedioui F, Schuhmann W
(2004): Functionalised electrode array for the detection of nitric oxide released by
endothelial cells using different NO-sensing chemistries. Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, 1594-1600.
Oni J, Diab N, Radtke I, Schuhmann W (2003): Detection of NO release from endothelial
cells using Pt micro electrodes modified with a pyrrole-functionalized Mn(II) porphyrin. Electrochimica Acta 48, 3349-3354.
Diab N, Oni J, Schulte A, Radtke I, Blöchl A, Schuhmann W (2003): Pyrrole functionalized
öetalloporphyrins as electrocatalysts for the oxidation of nitric oxide. Talanta 61, 4351.
Reiter S, Radtke I, Schuhmann W, Heumann R: „Sag NO zum Überleben – Robotersystem
sucht Stickstoffmonoxid-Antagonisten“, Chemie-RUBIN Sonderheft 2003, S. 38-43
Radtke I, Ehrhardt S, Reiter S, Goemans C, Gronemeyer T, Kuhlmann J, Isik S, Schuhmann
W, Neufeld G, Heumann R: Selective signaling of VEGF receptors via Ras, NO and
src for proliferation, differentiation and migration of transformed human endothelial
cells. In Vorbereitung.
Radtke I, Kuhnen C, Eggert A, Heumann R: Intracellular immunization against Ras inhibits
tumor growth of T-HUVEC-derived sarcomas in nude mice. In Vorbereitung.
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Lebenslauf
Kongreßbeiträge: Poster bei internationalen Kongressen (Auswahl):
I. Radtke, S. Ehrhardt, G. Neufeld, R. Heumann: “Heterologous ligand-activated VEGFR-1
tyrosine kinase stimulates proliferation and angiogenesis but does not promote survival in transformed human endothelial cells”, Annual Meeting of the German Society for Biochemistry and Molecular Biology (GBM), September 9th – 12th, 2001, Bochum, Germany
S. Reiter, I. Radtke, T. Erichsen, R. Heumann, W. Schuhmann: „Combinatorial Microelectrochemistry – Automated Detection of Released Nitric Oxide from Endothelial
Cells in the Microtiter-Plate Format”, Meeting of the Society of Free Radical Research – European Section, June 26th -29th, 2003, Ioaninna, Greece.
I. Radtke, S. Ehrhardt, S. Isik, S. Reiter, W. Schuhmann, R. Heumann: „Mechanisms of
VEGF mediated survival and proliferation in endothelial cells“, Annual Meeting of
the European Life Science Organisation (ELSO) and the German Society for Biochemistry and Molecular Biology (GBM), September 20th – 24th, 2003, Dresden,
Germany
I. Radtke, S. Ehrhardt, C. Goemans, B. Feldhaus, T. Gronemeyer, C. Grote-Westrick, J.
Kuhlmann, A. Eggert, R. Heumann: “Conditional intracellular immunization against
Ras inhibits proliferation of transformed human endothelial cells”, 7th International
Symposium on Predictive Oncology & Intervention Strategies (ISPO), February 7th –
10th, 2004, Nice, France
E. Jasny, R. Heumann, I. Radtke: „Isolation, characterization and proliferation of murine
bone marrow stroma cells (BMSC): lack of transdifferentiation to neurons?”, 2nd
International Meeting Stem Cell Network North Rhine Westphalia, April 1st - 2nd,
2004, Bonn, Germany
I. Radtke, S. Reiter, S. Ehrhardt, C. Grote-Westrick, W. Schuhmann, R. Heumann: „Differential effects of vascular endothelial growth factor, nitric oxide and Ras in survival,
cell division and migration of endothelial cells”, 4th Forum of European Neuroscience, July 10th – 14th, 2004, Lisbon, Portugal
I. Radtke, T. Gronemeyer, J. Kuhlmann, C. Kuhnen, A. Eggert, R. Heumann: Conditional
intracellular immunization against Ras inhibits growth of endothelial cell derived
tumors, Meeting of European Life Science Organisation (ELSO), September 4th –
8th, 2004, Nice, France
Kongreßbeiträge: Vorträge
“VEGF-receptor specific activation of Ras and production of nitric oxide in endothelial cells
(T-HUVEC)”, 1. Xantener Meeting Medizinische und biologische Chemie – Molecular Interactions in higher organized systems, December 13th – 14th, 2002, Xanten,
Germany
“Mechanisms of NO Release and Survival Promoting Effects of NO in endothelial cells”,
Meeting of the Society for Free Radical Research (SFRR) – European Section, June
26th – 29th, 2003, Ioannina, Greece
“Conditional intracellular immunization against Ras inhibits proliferation of transformed
human endothelial cells”, 7th International Symposium on Predictive Oncology & Intervention Strategies (ISPO), February 7th – 10th, 2004, Nice, France
“Dural arteriovenous fistulas and sinus vein thrombosis correlate to elevated serum levels of
angiogenic factors”, XIV. Meeting of the Society for Neuroradiology (ESNR), September 8th – 11th, 2004
