Design and engineering of synthetic gene networks for the treatment

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DISS. ETH NO. 23521
Design and engineering of synthetic gene networks for the
treatment of immunologic endocrine disorders
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
PRATIK SAXENA
Master of Science
Molecular, Cellular and Developmental Biology,
The University of Michigan, Ann Arbor, USA
born on 05.01.1986
citizen of
India
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Martin Fussenegger, examiner
Prof. Dr. Mustafa Khammash, co-examiner
Prof. Dr. Joerg Stelling, co-examiner
2016
SUMMARY
Summary
Synthetic biology aims to revolutionize the field of biotechnology by
engineering sophisticated circuits in living cells for diverse practical applications.
Trigger-controlled gene switches are the key building blocks of synthetic gene circuits
that can precisely modulate cellular behavior. Engineering of artificial circuits in
mammalian cells has led to the development of molecular theranostics (an integration
of diagnostics and therapy) for metabolic diseases. In this work, we have specifically
focused on the design and implementation of synthetic gene networks for the
treatment of prominent autoimmune endocrine diseases - namely Graves' disease and
Type I Diabetes.
Graves’ disease is the most common cause of hyperthyroidism and triggered
by thyroid stimulating antibodies (TSAb). These antibodies bind to thyroid
stimulating hormone receptor (TSHR) in the thyroid gland and constitutively activate
the production and secretion of thyroid hormones (T3 and T4). Current treatments
involve the destruction of thyroid gland, leading to life-long thyroid hormone
replacement. In order to maintain thyroid hormone homeostasis, we engineered a
synthetic gene network consisting of a synthetic thyroid hormone sensing receptor
(TSR), a fusion of yeast Gal4 protein and human thyroid hormone receptor alpha
(TRα) that reversibly triggers gene expression from TSR-dependent promoters. By
coupling of TSR sensor to the production and secretion of TSHR antagonist
(TSHAntag), we engineered a synthetic signaling circuit in mammalian cells. When
implanted in a mouse model of experimental Graves’ disease, the circuit-engineered
cells were able to sense hyperthyroid hormone levels and prevent TSAb-mediated
activation of thyroid gland to restore euthyroid hormone levels. Thus, a synthetic gene
network could help maintain thyroid hormone homeostasis in Grave’s disease without
the need for thyroid gland destruction.
Type I Diabetes is an immunologic endocrine disorder triggered by antibodies
that destroy pancreatic beta cells and leading to hyperglycaemia. Islet transplantation
with immunosuppression has been successfully used to treat patients with Type I
Diabetes but shortage of donor islets remains a significant hurdle to overcome.
Therefore, the differentiation of patient-derived pluripotent stem cells to beta cells has
enormous potential. In order to overcome the variability and heterogeneity caused by
growth-factor/chemical-based differentiation procedures, we designed a synthetic
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SUMMARY
lineage-control network that mediates efficient differentiation of human induced
pluripotent stem cells (hIPSC)-derived pancreatic progenitor cells to glucose-sensitive
insulin-secreting beta-like cells in a vanillic acid-controlled manner. This designer
network unites different band-pass filter, time-delay and feed-forward topologies that
interface with endogenous positive-feedback loops to orchestrate the timely
expression and repression of transcription factors - Neurogenin-3 (Ngn3; OFF-ONOFF), Pancreatic And Duodenal Homeobox 1 (Pdx1; ON-OFF-ON) and
Musculoaponeurotic Fibrosarcoma Oncogene Homolog A (MafA; OFF-ON). The
network-engineered beta-like cells were highly enriched for insulin compared with
the other islet hormones. Additionally, the dynamics of insulin release in response to
glucose stimulation was comparable with the human islets. Therefore, the synthetic
lineage-control network was able to guide the fate of pancreatic progenitor cells
specifically towards glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells.
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ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Die synthetische Biologie hat es sich zum Ziel gesetzt, den Horizont der
Biotechnologie zu erweitern, indem sie lebenden Zellen mittels eigens dafür
konstruierten biochemischen Schaltkreisen neue Eigenschaften und Funktionen
verleiht. In diesen Netzwerken sind exogen kontrollierbare, genetische Schalter von
zentraler Bedeutung, da sie präzise Kontrolle über das Netzwerk und somit über das
Verhalten der Zelle erlauben. Das bioingenieurswissenschaftliche Interesse an
molekularen Schaltkreisen in Säugerzellen hat zur Entwicklung sogenannter
Theranostika geführt – einer Verschmelzung von Diagnostik und Therapie.
Erfolgreiche
Systeme
dieser
Art
existieren
gegen
eine
Reihe
von
Stoffwechselerkrankungen, darunter Diabetes Mellitus Typ I und Morbus Basedow.
Morbus Basedow ist die häufigste Ursache von Schilddrüsenüberfunktion und
wird durch stimulative Antikörper (TSAb) ausgelöst. Diese Antikörper binden und
aktivieren den TSH-Rezeptor der Schilddrüse, was dauerhafte Produktion und
Sekretion der Schilddrüsenhormone T3 und T4 nach sich zieht. Die Therapie der
Wahl ist daher die Zerstörung intakten Drüsengewebes und anschließende
lebenslange Substitution der Schilddrüsenhormone. Im Rahmen dieser Arbeit wurde
ein synthetisches Gennetzwerk konstruiert, das es erlaubt die hormonelle Homöostase
der Schilddrüsenachse ohne Ablation des Organs wiederherzustellen. Das Netzwerk
basiert hierbei auf einem künstlichen Schilddrüsenhormonrezeptor (TSR), einem
Fusionsprotein
aus
dem
Hefefaktor
Gal4
und
dem
humanen
Schilddrüsenhormonrezeptor alpha (TRα), der TSR-sensitive Promotoren reversibel
zu aktivieren vermag. Dieser Rezeptor kontrollierte im Folgenden die Expression
eines TSH-Rezeptorantagonisten (TSHAntag) durch Zellen einer Säugerzelllinie.
Wurden diese Zellen in ein Mausmodell von Morbus Basedow implantiert, so waren
sie
in
der
Lage
unphysiologisch
hohe
Schilddrüsenhormonkonzentrationen
wahrzunehmen und diese über die Sekretion des Antagonisten auf ein Normalmaß zu
reduzieren. Somit ist das hier vorgestellte synthetische Gennetzwerk in der Lage der
hormonellen Dysregulation bei Morbus Basedow entgegenzuwirken, ohne dass das
Schilddrüsengewebe zerstört werden muss.
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ZUSAMMENFASSUNG
Diabetes des Typs I ist eine immunologisch bedingte, hormonelle Störung, die
durch die antikörperinduzierte Zerstörung des Pankreas, insbesondere der Betazellen,
verursacht
wird
und
mit
Hyperglycämie
einhergeht.
Die
Transplantation
Langerhansscher Inseln unter Immunsuppression ist als Therpieform in der klinischen
Anwendung angelangt, jedoch sind passende Gewebespenden rar. Hier können aus
pluripotenten Stammzellen des Patienten differenzierte Betazellen Abhilfe schaffen.
Aktuelle Differenzierungsprotokolle auf Basis von Wachstumsfaktoren und
chemischen Zusätzen liefern allerdings niedrige Ausbeuten und phänotypisch
heterogene Zielzellpopulationen, weswegen wir in dieser Arbeit ein synthetisches
Gennetzwerk zur Differenzierungssteuerung präsentieren. Dieses Kontrollnetzwerk
erlaubt es pankreatische Progenitorzellen aus humanen induzierten pluripotenten
Stammzellen (hIPSCs) mit großer Effizienz in insulinsekretierende, glukosesensitive
Betazellanaloge zu überführen. Dadurch wird die Vielzahl an Faktoren, die in
herkömmlichen
Differenzierungsstrategien
vonnöten
ist,
auf
das
Molekül
Vanillinsäure reduziert. Das Differenzierungsnetzwerk umfasst systemtheoretisch
gesehen
eine
Reihe
von
Interaktionstopologien,
darunter
Bandpassfilter,
Zeitverzögerer und Vorsteuerungen, die im Wechselspiel mit endogenen, positiv
rückkoppelnden Signalwegen die zeitlich korrekte Abfolge von Expression und
Repression relevanter Transkriptionsfaktoren choreographieren. Reguliert werden hier
die Proteine Neurogenin-3 (Ngn3; OFF-ON-OFF), Pancreatic And Duodenal
Homeobox 1 (Pdx1; ON-OFF-ON) und Musculoaponeurotic Fibrosarcoma Oncogene
Homolog A (MafA; OFF-ON). Die mit dem Netzwerk versehenen, beta-ähnlichen
Zellen exprimierten Insulin stark präferentiell gegenüber anderen insulären Hormonen.
Darüberhinaus war die Dynamik der Insulinfreisetzung nach Stimulation mit Glukose
vergleichbar
mit
nativen
Langerhansschen
Inseln.
Das
synthetische
Regulationsnetzwerk ist somit in der Lage pankreatische Progenitoren mit hoher
Spezifität in einen glukosesensitiven, beta-artigen Phänotyp zu differenzieren.
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