Design and engineering of synthetic gene networks for the treatment
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DISS. ETH NO. 23521 Design and engineering of synthetic gene networks for the treatment of immunologic endocrine disorders A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by PRATIK SAXENA Master of Science Molecular, Cellular and Developmental Biology, The University of Michigan, Ann Arbor, USA born on 05.01.1986 citizen of India accepted on the recommendation of Prof. Dr. Martin Fussenegger, examiner Prof. Dr. Mustafa Khammash, co-examiner Prof. Dr. Joerg Stelling, co-examiner 2016 SUMMARY Summary Synthetic biology aims to revolutionize the field of biotechnology by engineering sophisticated circuits in living cells for diverse practical applications. Trigger-controlled gene switches are the key building blocks of synthetic gene circuits that can precisely modulate cellular behavior. Engineering of artificial circuits in mammalian cells has led to the development of molecular theranostics (an integration of diagnostics and therapy) for metabolic diseases. In this work, we have specifically focused on the design and implementation of synthetic gene networks for the treatment of prominent autoimmune endocrine diseases - namely Graves' disease and Type I Diabetes. Graves’ disease is the most common cause of hyperthyroidism and triggered by thyroid stimulating antibodies (TSAb). These antibodies bind to thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) in the thyroid gland and constitutively activate the production and secretion of thyroid hormones (T3 and T4). Current treatments involve the destruction of thyroid gland, leading to life-long thyroid hormone replacement. In order to maintain thyroid hormone homeostasis, we engineered a synthetic gene network consisting of a synthetic thyroid hormone sensing receptor (TSR), a fusion of yeast Gal4 protein and human thyroid hormone receptor alpha (TRα) that reversibly triggers gene expression from TSR-dependent promoters. By coupling of TSR sensor to the production and secretion of TSHR antagonist (TSHAntag), we engineered a synthetic signaling circuit in mammalian cells. When implanted in a mouse model of experimental Graves’ disease, the circuit-engineered cells were able to sense hyperthyroid hormone levels and prevent TSAb-mediated activation of thyroid gland to restore euthyroid hormone levels. Thus, a synthetic gene network could help maintain thyroid hormone homeostasis in Grave’s disease without the need for thyroid gland destruction. Type I Diabetes is an immunologic endocrine disorder triggered by antibodies that destroy pancreatic beta cells and leading to hyperglycaemia. Islet transplantation with immunosuppression has been successfully used to treat patients with Type I Diabetes but shortage of donor islets remains a significant hurdle to overcome. Therefore, the differentiation of patient-derived pluripotent stem cells to beta cells has enormous potential. In order to overcome the variability and heterogeneity caused by growth-factor/chemical-based differentiation procedures, we designed a synthetic 4 SUMMARY lineage-control network that mediates efficient differentiation of human induced pluripotent stem cells (hIPSC)-derived pancreatic progenitor cells to glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells in a vanillic acid-controlled manner. This designer network unites different band-pass filter, time-delay and feed-forward topologies that interface with endogenous positive-feedback loops to orchestrate the timely expression and repression of transcription factors - Neurogenin-3 (Ngn3; OFF-ONOFF), Pancreatic And Duodenal Homeobox 1 (Pdx1; ON-OFF-ON) and Musculoaponeurotic Fibrosarcoma Oncogene Homolog A (MafA; OFF-ON). The network-engineered beta-like cells were highly enriched for insulin compared with the other islet hormones. Additionally, the dynamics of insulin release in response to glucose stimulation was comparable with the human islets. Therefore, the synthetic lineage-control network was able to guide the fate of pancreatic progenitor cells specifically towards glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. 5 ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassung Die synthetische Biologie hat es sich zum Ziel gesetzt, den Horizont der Biotechnologie zu erweitern, indem sie lebenden Zellen mittels eigens dafür konstruierten biochemischen Schaltkreisen neue Eigenschaften und Funktionen verleiht. In diesen Netzwerken sind exogen kontrollierbare, genetische Schalter von zentraler Bedeutung, da sie präzise Kontrolle über das Netzwerk und somit über das Verhalten der Zelle erlauben. Das bioingenieurswissenschaftliche Interesse an molekularen Schaltkreisen in Säugerzellen hat zur Entwicklung sogenannter Theranostika geführt – einer Verschmelzung von Diagnostik und Therapie. Erfolgreiche Systeme dieser Art existieren gegen eine Reihe von Stoffwechselerkrankungen, darunter Diabetes Mellitus Typ I und Morbus Basedow. Morbus Basedow ist die häufigste Ursache von Schilddrüsenüberfunktion und wird durch stimulative Antikörper (TSAb) ausgelöst. Diese Antikörper binden und aktivieren den TSH-Rezeptor der Schilddrüse, was dauerhafte Produktion und Sekretion der Schilddrüsenhormone T3 und T4 nach sich zieht. Die Therapie der Wahl ist daher die Zerstörung intakten Drüsengewebes und anschließende lebenslange Substitution der Schilddrüsenhormone. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein synthetisches Gennetzwerk konstruiert, das es erlaubt die hormonelle Homöostase der Schilddrüsenachse ohne Ablation des Organs wiederherzustellen. Das Netzwerk basiert hierbei auf einem künstlichen Schilddrüsenhormonrezeptor (TSR), einem Fusionsprotein aus dem Hefefaktor Gal4 und dem humanen Schilddrüsenhormonrezeptor alpha (TRα), der TSR-sensitive Promotoren reversibel zu aktivieren vermag. Dieser Rezeptor kontrollierte im Folgenden die Expression eines TSH-Rezeptorantagonisten (TSHAntag) durch Zellen einer Säugerzelllinie. Wurden diese Zellen in ein Mausmodell von Morbus Basedow implantiert, so waren sie in der Lage unphysiologisch hohe Schilddrüsenhormonkonzentrationen wahrzunehmen und diese über die Sekretion des Antagonisten auf ein Normalmaß zu reduzieren. Somit ist das hier vorgestellte synthetische Gennetzwerk in der Lage der hormonellen Dysregulation bei Morbus Basedow entgegenzuwirken, ohne dass das Schilddrüsengewebe zerstört werden muss. 6 ZUSAMMENFASSUNG Diabetes des Typs I ist eine immunologisch bedingte, hormonelle Störung, die durch die antikörperinduzierte Zerstörung des Pankreas, insbesondere der Betazellen, verursacht wird und mit Hyperglycämie einhergeht. Die Transplantation Langerhansscher Inseln unter Immunsuppression ist als Therpieform in der klinischen Anwendung angelangt, jedoch sind passende Gewebespenden rar. Hier können aus pluripotenten Stammzellen des Patienten differenzierte Betazellen Abhilfe schaffen. Aktuelle Differenzierungsprotokolle auf Basis von Wachstumsfaktoren und chemischen Zusätzen liefern allerdings niedrige Ausbeuten und phänotypisch heterogene Zielzellpopulationen, weswegen wir in dieser Arbeit ein synthetisches Gennetzwerk zur Differenzierungssteuerung präsentieren. Dieses Kontrollnetzwerk erlaubt es pankreatische Progenitorzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSCs) mit großer Effizienz in insulinsekretierende, glukosesensitive Betazellanaloge zu überführen. Dadurch wird die Vielzahl an Faktoren, die in herkömmlichen Differenzierungsstrategien vonnöten ist, auf das Molekül Vanillinsäure reduziert. Das Differenzierungsnetzwerk umfasst systemtheoretisch gesehen eine Reihe von Interaktionstopologien, darunter Bandpassfilter, Zeitverzögerer und Vorsteuerungen, die im Wechselspiel mit endogenen, positiv rückkoppelnden Signalwegen die zeitlich korrekte Abfolge von Expression und Repression relevanter Transkriptionsfaktoren choreographieren. Reguliert werden hier die Proteine Neurogenin-3 (Ngn3; OFF-ON-OFF), Pancreatic And Duodenal Homeobox 1 (Pdx1; ON-OFF-ON) und Musculoaponeurotic Fibrosarcoma Oncogene Homolog A (MafA; OFF-ON). Die mit dem Netzwerk versehenen, beta-ähnlichen Zellen exprimierten Insulin stark präferentiell gegenüber anderen insulären Hormonen. Darüberhinaus war die Dynamik der Insulinfreisetzung nach Stimulation mit Glukose vergleichbar mit nativen Langerhansschen Inseln. Das synthetische Regulationsnetzwerk ist somit in der Lage pankreatische Progenitoren mit hoher Spezifität in einen glukosesensitiven, beta-artigen Phänotyp zu differenzieren. 7
