Eingrenzung der Kandidatengenregion für das Branchio
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Universitätsklinikum Ulm Institut für Humangenetik Leiter: Prof. Dr. Walther Vogel Eingrenzung der Kandidatengenregion für das Branchio-Okulo-Faziale-Syndrom mittels erweiterter Segregationsanalyse Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Judith Reiber Geburtsort: Ulm 2009 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. W. Just 2. Berichterstatter: Prof. Dr. H. v. Baum Tag der Promotion: 16.12.2010 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis III 1. Einleitung 1 1.1. Das Branchio-okulo-faziale Syndrom 1 1.2. Mit dem BOF-Syndrom verwandte Krankheitsbilder 3 1.2.1. Das Branchio-oto-renale Syndrom 3 1.2.2. Das Branchio-otische Syndrom 4 1.2.3. Das Townes-Brocks Syndrom 5 1.3. Mögliche Kandidatengene 1.3.1. Kandidatengenregionen, welche bereits ausgeschlossen wurden 5 6 1.3.1.1. BORS-Genregionen 6 1.3.1.2. Andere SIX-Gene 12 1.3.1.3. Ausschluss der TBS-Genregion: SALL1 13 1.3.1.4. Andere SALL-Gene 14 1.3.2. Andere mögliche oder ausgeschlossene Genregionen 14 1.3.2.1. Ausgeschlossene PAX-Gene 14 1.3.2.2. Nicht ausgeschlossene PAX-Gene 17 1.3.2.3. Ausgeschlossene HOX-Gene 18 1.3.2.4. Andere HOX-Gene 20 1.3.2.5. FOX-Gene 20 1.3.2.6. FGF-Gene 22 1.3.2.7. POU-Gene 24 1.3.2.8. Andere Transkriptionsfaktoren 25 1.4. Fragestellung 26 2. Material und Methoden 27 2.1. Material 2.1.1. BOFS-Familie und DNA 2.1.1.1. Patientenbeschreibungen 27 27 28 2.1.2. Extraktion von DNA 34 2.1.3. PCR 34 2.1.3.1. Primer 34 2.1.3.2. Chemikalien und Lösungen 37 2.1.4. Komponenten für die Agarose-Gelelektrophorese 37 2.1.5. Komponenten für die Kapillarelektrophorese 38 Inhaltsverzeichnis II 2.1.6. Komponenten für die Sequenzierung 38 2.1.7. Kits 38 2.1.8. Geräte 39 2.1.9. Computerprogramme 40 2.1.10. Datenbanken 40 2.2. Methoden 2.2.1. DNA-Extraktion aus EDTA-Blut (NaCl-Methode) 40 40 2.2.2. Messung der DNA-Konzentration mittels Absorptionsspektrometrie 41 2.2.3. DNA-Amplifikation mittels GenomiPhi™ 42 2.2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) 43 2.2.4.1. PCR für die Fragmentanalyse 43 2.2.4.2. PCR für die Sequenzierung 48 2.2.5. Agarose-Gelelektrophorese 50 2.2.6. DNA-Fragmentanalyse mittels Kapillarelektrophorese 50 2.2.7. Auswertung der Fragmentanalyse mit Hilfe von Computerprogrammen 51 2.2.8. Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese 52 2.2.9. Auswertung der Sequenzierung mittels Computerprogrammen 54 3. Ergebnisse 56 3.1. DNA-Extraktion, -Konzentrationsbestimmung und Amplifizierung 56 3.2. PCR und Fragmentanalyse 57 3.3. Auswertung an Computerprogrammen 58 3.4. Sequenzierung 77 3.5. Auswertung der Sequenzierung/Gefundene Mutationen 77 4. Diskussion 4.1. Vergleich mit ähnlichen Krankheitsbildern 83 104 5. Zusammenfassung 107 6. Literaturverzeichnis 109 Anhang 140 Danksagung 141 Abkürzungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis 3’ DNA-Ende mit OH-Gruppe 5’ DNA-Ende mit Phosphatrest A (Aminosäure) Alanin A Adenin AD Autosomal Dominant Aqua bidest. Bidestilliertes Wasser ARE Na+/K+-ATPase alpha1 Untereinheit regulatorisches Element Arg Arginin BDT BigDye™ Terminator BLAST Basic local alignement search tool BMP Bone morphogenetic protein BO Syndrom Branchio-otisches Syndrom BOF Syndrom Branchio-okulo-faziales Syndrom BOFS Branchio-okulo-faziales Syndrom BOR Syndrom Branchio-oto-renales Syndrom BORS Branchio-oto-renales Syndrom BOS Branchio-otisches Syndrom Bp Basenpaare BPES Blepharophimosis-Ptosis-Epicanthus inversus Syndrom C Cytosin CBP CREB binding protein Cds Coding sequence Chr Chromosom cM CentiMorgan CRE Causes recombination (Rekombinase Phagen P1) C-Terminus Carboxyterminus dac Dachshund Dach Dachshund ddNTP Didesoxynukelosid-Triphosphat des Abkürzungsverzeichnis IV DFN3 Deafness 3 DFNA15 deafness, autosomal dominant nonsyndromic sensorineural 15 DNA Desoxyribonucleic acid dNTP Desoxynukleosid-Triphosphat Dor Doarad dpp Decapentaplegic DRRS Duane-Radial Ray Syndrom E Glutaminsäure ECGF Endothelial cell growth factor EDTA Ethylendiamintetraacetat ENU Ethylnitrosoharnstoff EOC Epithelial ovarian cancer EtOH Ethanol ey eyeless EYA eyes absent FGF Fibroblast growth factor FGFR Fibroblast growth factor receptor Fkhl Forkhead drosophila homolog like FOX Forkhead box G (Aminosäure) Glycin G Guanin GDB Genome data base GDNF Glial cell derived neurotrophic factor Gln Glutamin Glu Glutamat Gly Glycin H Histidin HD Homöodomäne oder High density HFGS Hand-Fuss-Genital Syndrom hGH Human growth hormon HIDI HighDye HMX Homöobox HOX Homöobox Abkürzungsverzeichnis V HPE Holoprosenzephalie HR Hochkonservierte Region HSH Helix-Span-Helix HTH Helix-Turn-Helix Inst. Institut J Junior K Kolobom kB Kilobasen L Leucin Leu Leucin LW Leerwert Lys Lysin M Molar m Männlich MAPK-Kaskade Mitogen-activated protein Kinase Kaskade Mbp Megabasenpaare MFH Mesenchym forkhead mM Millimolar N. Nervus NaAc Natriumacetat NCBI National Center for Biotechnology Information NEEO Niedrige Elektroendoosmose N-Terminus Amino-Terminus OD Optische Dichte OFCS Oto-fazio-cervikales Syndrom OMIM Online Mendelian Inheritance in Man Optx Optic homeobox Orig. Original OTX Orthodenticle homeobox p Kurzer Arm eines Chromosoms P (Aminosäure) Prolin PAX Paired-box PCR Polymerase chain reaction = Polymerase Kettenreaktion Abkürzungsverzeichnis VI PITX Paired-like homeodomain, pituitary homeobox POU Pituitary octamer binding unc prä-mRNA Präkursor-messenger-RNA Pro Prolin q Langer Arm eines Chromosoms R Purin r Rückwärts RNA Ribonucleic acid Rpm Rotationen pro Minute S Senior s Sporadisch SALL Sal-like SD Six-Domäne SDS Sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat) SE Sodium-(Natrium)-EDTA SIX Sine oculis homeobox SNP Single-Nukleotid-Polymorphismus so Sine oculis SOX SRY-Box SSW Schwangerschaftswoche STR Short tandem repeats T Thymin Taq Thermus aquaticus TB Syndrom Townes-Brocks Syndrom TBE Tris-Borat-EDTA TBS Townes-Brocks Syndrom TE Tris-EDTA TFAP2A Transcriptionfactor AP2 alpha TGF Transforming growth factor toy Twin of eyeless Tris 2 Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol tRNA Transfer-RNA TTF Thyroid transcription factor UTR Untranslated region Abkürzungsverzeichnis VII UV Ultraviolett V Valin v Vorwärts VR Variable Region w Weiblich WT Wilms Tumor XLAAD X-linked Autoimmunität-allergisches Dysregulations Syndrom Y Pyrimidin Y (Aminosäure) Tyrosin ΦX PhiX174 DNA / Hae III Längenstandard 1. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1. Das Branchio-okulo-faziale Syndrom Bei dem Branchio-okulo-fazialen Syndrom (BOFS, BOF-Syndrom, OMIM 113620) handelt es sich um ein sehr seltenes, monogenes, autosomal-dominant vererbtes Krankheitsbild [58], welches sich durch ein breites Spektrum an Symptomen bzw. Fehlbildungen im Kopf- und Halsbereich sowie in anderen Organsystemen auszeichnet. Die Ausprägung der Symptome ist äußerst variabel, was auf unvollständige Penetranz und variable Expression zurückzuführen ist [99, 117]. Zu den Symptomen zählen unter anderem bilaterale Pseudo- und Lippenspalten, ein breiter, ausgedehnter Nasenrücken, eine flache Nasenspitze, Tränen- nasengangobstruktionen, Fehlbildungen der Ohren, intrauterine (47%) und postnatale (38%) Wachstumsstörungen [112]. Neben den bereits genannten Symptomen und Fehlbildungen zeigen die Erkrankten fast immer sichtbare zervikale/infraaurikuläre, seltener supraaurikuläre (isolierte oder mit zervikalen Defekten kombinierte) Hautdefekte [58,112] mit möglicherweise pathognomischem Charakter [117]. Diese Läsionen zeichnen sich durch aplastische, „hemangiomatöse“ oder anderweitig abnorme Deckhaut aus und können in Kombination mit drainierenden Sinusfisteln vorkommen. Normalerweise finden sich diese Defekte entlang des oberen Kopfes des Musculus sternocleidomastoideus. [117] In manchen Fällen traten diese Branchialdefekte in Kombination mit Thymusüberresten auf, was auch als dermaler Thymus beschrieben wird. Nach der Pubertät wird dieses Gewebe meist in eine hypertrophe Narbe umgewandelt. Dieses anomale Thymusgewebe kann auf eine defekte Migration oder Involution der Thymusvorläufer während der Embryogenese zurückgeführt werden. Meist findet sich dieses Gewebe subkutan und an den unteren Regionen des Halses oder im Mediastinum. Eine Assoziation mit dem BOFS könnte darauf zurückzuführen sein, dass beides durch eine Fehlentwicklung der Branchialbögen entsteht. [46, 49, 117] Für das äußere Erscheinungsbild sind außerdem typisch: Dolichozephalie, spärliche Behaarung, eine hohe Stirn, Malarhypoplasie, ein schmales Kinn, Hypertelorismus, Lippen-, Gaumen-, Alveolarspalten [117] oder eine lymphangiomatöse Oberlippe [128] sowie hypertrophe laterale Philtrumwülste 1. Einleitung 2 [117], die verschmolzenen [73], schlecht reparierten Lippenspalten [58] oder Narben [78] ähneln, und daher auch als Pseudospalten (54% der Fälle) bezeichnet werden. Auch ophthalmologische Anomalien wie Kolobome der Retina, der Iris bzw. des Sehnervs, Stenosen, Atresien oder Obstruktionen des Tränennasenganges (bei 78% der Fälle) [128] - was eine rezidivierende Dakryozystitis zur Folge hat - Mikrophthalmie oder sogar Anophthalmie, Myopie, Katarakte, Strabismus, schräg verlaufende Lidspalten sowie Hypertelorismus treten auf. [204] Neben den Augenanomalien sind auch häufig Veränderungen an den Zähnen beobachtet worden. Hierbei handelt es sich meist um kleine, weit auseinander stehende Zähne. Teilweise fehlen einzelne Zähne. [58] Des weiteren wurden ektodermale Abnormalitäten wie schütteres Haar, frühzeitiges Ergrauen der Haare (bei 24% der Fälle) und hypoplastische Fingernägel sowie skeletale Fehler wie Klinodaktylie des fünften Fingers, Brachydaktylie oder Polydaktylie beschrieben [58]. In seltenen Fällen hatten die Patienten weißes Haar [129 , 132]. Die Ohren sitzen tief, sind nach posterior gedreht und geschröpft, haben eine dünne Helix, eine prominente Antihelix und nach oben gewandte Läppchen [117, 167]. Extrafaziale Fehlbildungen sind selten. Fehlbildungen der Nieren - wie völliges Fehlen, Zysten oder Hydronephrosen - sind die am häufigsten (37% der Fälle) auftretenden nicht-kraniofazialen Fehlbildungen [116]. Seltener treten kongenitale Herzdefekte oder Defekte des zentralen Nervensystems auf [117]. Die psychomotorische Leistungsfähigkeit ist meist normal, allerdings treten Entwicklungsverzögerungen, Hypotonie, Seh-, Gehör- und Sprachdefizite auf [117]. In einzelnen Fällen wurde auch über einen sehr kurzen Abstand zwischen Bauchnabel und Penis oder über eine erhöhte Anzahl an Brustwarzen berichtet [128]. Wie bei den vielen anderen Syndromen mit kraniofazialen Fehlbildungen, wird auch beim BOFS vermutet, dass diese Defekte auf Entwicklungsstörungen der Branchialbögen zurückzuführen sind [117]. Allerdings ist die Pathogenese des BOFS bisher noch nicht aufgeklärt. 1. Einleitung 3 Abbildung 1: ein typisches Beispiel einer am Branchio-Okulo-Fazialen-Syndrom erkrankten Person. 1.2. Mit dem BOF-Syndrom verwandte Krankheitsbilder Neben dem BOF-Syndrom gibt es weitere Krankheitsbilder, die ähnliche Symptome und Ausprägungen zeigen. Zu den mit dem BOFS verwandten Krankheitsbildern zählen das Branchio-oto-renale Syndrom (BORS, OMIM 113650), die Branchio-otischen Syndrome 1-3 (BOS, OMIM 602588, 120502, 608389) sowie das Townes-Brocks Syndrom (TBS, OMIM 107480). Die Differentialdiagnostik gestaltet sich nicht immer ganz einfach. 1.2.1. Das Branchio-oto-renale Syndrom Das Branchio-oto-renale Syndrom (BORS, BOR-Syndrom, OMIM 113650, 610896) ist ein autosomal-dominant vererbtes Krankheitsbild mit einer Prävalenz von 1:40.000 [55, 56]. Kennzeichen dieses Syndromes sind: sensorineurale (21%), Schallleitungs- (30%) oder gemischte (48%) Schwerhörigkeit [56], präaurikuläre Vertiefungen, strukturelle Defekte des Außen-, Mittel- oder Innenohrs, Branchialfisteln, Nierenanomalien [133, 134], Tränengangstenosen, renale Agenesie oder Aplasie sowie ureterale Abnormalitäten [56]. Die Lokalisation des BORS-Kandidatengenes wurde 1992 auf Chromosom 8q12-q13 identifiziert [100, 196], welches als EYA1 bezeichnet wird (“eyes absent-like 1”, Humanes Ortholog des Drosophila eyes absent Gen, auf Chromosom 8q13.3) [2, 58 , 101, 102]. Mutationen befinden sich in der hoch konservierten Region (eyaHR), auch Eya box genannt [2, 235]. Später wurde veröffentlicht, dass 1. Einleitung 4 Veränderungen im SIX1-Gen (sine oculis homeobox), wie Missense-Mutationen, In-Frame-Deletionen und Punktmutationen (alle im Bereich der Homöodomäne oder des Tetrapeptids, das ebenfalls essentiell für die DNA-Bindung ist) zum BORS und BOS führen. Durch diese drei Mutationstypen kommt es zu einer Unterbrechung der Interaktion von SIX1 mit EYA1 [174]. Eine weitere Region (BOS2) für das BOR Syndrom wurde auf Chromosom 1q31.3-q32.1 identifiziert [105]. Mittlerweile ist ein weiteres Gen identifiziert worden, welches das Branchiooto-renale Syndrom verursacht. Hierbei handelt es sich um verschiedene heterozygote Missense-Mutationen im SIX5-Gen, welches ebenfalls mit EYA1 interagiert. Durch die Mutation wird auch hier diese Interaktion zwischen den beiden Proteinen unterbrochen. [79] 1.2.2. Das Branchio-otische Syndrom Ein weiteres Syndrom, das sehr viele Ähnlichkeiten zum BOF-Syndrom aufweist, ist das Branchio-otische Syndrom (BOS, BO-Syndrom, OMIM 602588, 120502, 608389). Hierbei handelt es sich um eine autosomal dominante Erbkrankheit, welche durch Branchial-Anomalien, präaurikuläre Vertiefungen sowie Schwerhörigkeit gekennzeichnet ist. Allerdings wurde noch keine Nierendysplasie beschrieben. Ende der 90er Jahre wurde bekannt, dass das BO-Gen nicht an der selben Stelle lokalisiert ist wie das BOR-Gen (Chromosom 8q13) [103]. Hingegen wurden Mutationen im EYA1-Gen für das BOR- und BO-Syndrom nachgewiesen [1, 60, 220]. Weiterhin wurden für das BOS ein zweiter Genlokus (BOS2) auf Chromosom 1q31 [104] und ein dritter Genlokus (BOS3) auf Chromosom 14q21.3q24.3 identifiziert [173]. In diesem Bereich ist auch das SIX1-Gen lokalisiert. Dort konnten Mutationen nachgewiesen und somit gezeigt werden, dass das BOS durch diese verursacht werden kann [174]. Tabelle 1 zeigt typische Symptome des BOFS, BORS und BOS im Vergleich. 1. Einleitung 5 Tabelle 1: Vergleich häufiger Symptome des Branchio-Okulo-Fazialen Syndroms (=BOF) mit dem Branchio-Oto-Renalen Syndrom (=BOR) und dem Branchio-Otischen Syndrom (=BO). [214] AD=Autosomal dominant, + = Symptom vorhanden, - = Symptom nicht vorhanden. Symptome BOF BOR BO Vererbungsmodus Postaurikuläre Gruben/Fisteln Lippen- mit/ohne Gaumenspalten Pseudospaltbildung der Oberlippe Oberlippengruben Bilaterale postaurikuläre zervikale Branchialbögendefekte Spalten/Sinus/Zysten der Branchialbögen Zervikale/supraaurikuläre Defekte mit aplastischer Haut Hämangiomatöse, vernarbte Haut Tiefsitzende Ohren mit Rotation nach posterior Gehörlosigkeit (sensorineural, Schallleitungsschwerhörigkeit, gemischt) Fehlgebildete, asymmetrische Nase, mit breiter Basis und flacher Spitze Mikrophthalmie Tränen-Nasengang-Stenose Vorzeitiges Ergrauen der Haare Nierenagenesie Nierenaplasie, -hypoplasie oder -dysplasie AD + + + + + + AD + - AD + + + + + + + + - - + + + + + + +/+ + + + + + - - - 1.2.3. Das Townes-Brocks Syndrom Auch das Townes-Brocks Syndrom (TBS, TB-Syndrom, OMIM 107480) ist eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung mit multiplen Fehlbildungen und variabler Expression und wurde zum ersten Mal von Townes und Brocks 1972 beschrieben [212]. Symptome dieses Krankheitsbildes sind unter anderem: Außenohranomalien, sensorineurale Schwerhörigkeit, Daumenanomalien, urogenitale, kardiale und anorektale Atresien. Die Intelligenz ist meist normal, allerdings wurde schon über milde mentale Retardierung berichtet [27, 84]. Das Gen für das TBS wurde auf Chromosom 16q21.1 identifiziert (=SALL1 = sal-like 1) [136, 165]. Außer den Mutationen im SALL1-Gen [96] wurden weiterhin eine perizentrische Inversion des Chromosoms 16 [57] und eine balancierte Translokation (46, XX, t(5;16)(p15.3;q12.1)) [194] beschrieben. 1.3. Mögliche Kandidatengene Dass es sich beim BOFS um einen autosomal dominanten Erbgang handelt, wurde nach der Beschreibung eines Falles deutlich, bei dem die Übertragung vom 1. Einleitung 6 Vater auf den Sohn stattfand. Außerdem sind Männer und Frauen ungefähr gleich häufig betroffen [58]. Somit können die Geschlechtschromosomen als Kandidatenträger ausgeschlossen werden. 1.3.1. Kandidatengenregionen, welche bereits ausgeschlossen wurden Aufgrund der Ähnlichkeit der phänotypischen Ausprägung des BOFS zu den anderen Syndromen (BORS, BOS, TBS), wäre es durchaus denkbar, dass auch die Mutationen in den gleichen Genregionen liegen. Dies konnte allerdings bereits widerlegt werden. Nachfolgend sind die Regionen der Kandidatengene dieser Syndrome aufgeführt. 1.3.1.1. BORS-Genregionen 1.3.1.1.1. Ausschluss des EYA1-Gens Aufgrund des ähnlichen Krankheitsbildes wurden die BORS-Genregionen, deren Lokalisationen auf Chromosom 8q12-q13 [100, 196] (EYA1-Gen (eyes absent Gen, 8q13.3)) [1 , 101, 102] sowie auf Chromosom 1q31.3-q32.1 [105] bekannt sind, als BOFS-Kandidaten definiert. Daher wurde die EYA1-Genregion bei BOFSPatienten auf Mutationen untersucht. Die Drosophila eyes absent (eya) Gene sind essentiell für die normale Augenentwicklung bei Drosophila. Bei einem Funktionsverlust kommt es bereits früh im Differenzierungsprozess zum Zelluntergang der Augen-Progenitorzellen durch programmierten Zelltod, was zu augenlosen Fliegen führt [10]. Außerdem tragen bei Drosophila die Gene eyeless (ey), twin of eyeless (toy), sine oculis (so) und dachshund (dac) zur Augenentwicklung bei. Die Gene regulieren sich gegenseitig, wobei eya, dac sowie ey synergistisch agieren. Somit wird die Augenentwicklung durch ein interaktives Netzwerk von Genen reguliert (s. Abbildung 2) [11, 31, 72, 162]. Bei der Maus findet eine direkte Interaktion zwischen Eya und Six statt, hingegen wird die Interaktion zwischen Eya und Dach durch das CREB binding protein (CBP) moduliert [83]. Alle diese Gene können auch zur Bildung ektoper Augen führen [10]. Bei Mäusen mit defektem Eya1-Gen konnte gezeigt werden, dass das Six-Eya-Dach-Netzwerk auch in die Entwicklung von Ohren und Nieren involviert ist [236]. 1. Einleitung 7 Abbildung 2: Genetische Signalwege kontrollieren die Augenentwicklung bei Drosophila und bei Vertebraten. A. Modell bei Drosophila: toy (twin of eyeless) induziert die Expression von ey (eyeless). Ey und dpp (decapentaplegic) induzieren synergistisch die Expression von eya und so (sine oculis), welche sich gegenseitig regulieren und upstream von dac (dachshund) agieren. Über Rückkopplungsschleifen sind eya (eyes absent), so und dac in der Lage ey zu regulieren, nicht jedoch toy. Eya hat zusätzlich Einfluss auf die dpp-Expression. B. Analoges Modell bei der Augenentwicklung bei Vertebraten: Pax6 (paired-box-containing gene), BMP4 und ~7 (bone morphogenic protein) führen zur Induktion der Linsenplakode. Downstream dieser Gene greifen auch Eya, Six3 (sine oculis homeobox) und Dach (dachshund) in die Augenentwicklung mit ein. [224] Gene der Eya-Familie besitzen Proteinphosphatasefunktion und regulieren das Six1-Eya-Dach-Netzwerk [115]. Mutationen in EYA-Gene können zu Entwicklungsdefekten führen [1, 14]. EYA1 wird während der Embryogenese in den Branchialbögen sowie den Somiten, während der Gliedmaßenentwicklung in Bindegewebsvorstufen sowie in Gehirn-, Lungen- und Herzgewebe exprimiert [1, 234]. Während der Nierenentwicklung wird EYA1 in Zellen des Metanephros exprimiert [1]. Beim Zebrafisch konnte die Expression auf kraniale Plakodenvorläufer und auf anteriore hypophysäre, olfaktorische und otische Plakoden eingeschränkt werden [176]. Bei Mäusen wurde zudem über die Bedeutung von Eya1 zur Induktion der Thymus-, Schilddrüsen- und Nebenschilddrüsenentwicklung berichtet [237]. Beim Menschen besteht das EYA1-Gen aus einer N-terminalen variablen und einer C-terminalen konservierten Region (s. Abbildung 3). Die hoch konservierte C-terminale Region (eyaHR) ist 271 Aminosäuren groß, interagiert mit anderen konservierten Bereichen von Proteinen (wie So (Six-Domäne) und Dach), was durch Subdomänen ermöglicht wird [24], und wird auch als eya homologe Region, Eya-Domäne oder Eya homologe Domäne bezeichnet. Die Prolin-Serin- 1. Einleitung 8 Threonin(PST)-reiche variable Region (eyaVR) befindet sich am N-terminalen Ende und agiert als Transkription aktivierender Bereich. [1, 31, 162, 234, 235, 243] Abbildung 3: Schematische Darstellung der Struktur des Eya-Proteins (eyes absent) mit potenziellen Subdomänen der Eya-Domäne. [24] Neben dem bereits genannten BORS, dem eine Mutation im EYA1-Gen zugrunde liegt, wurde das Oto-fazio-zervikale Syndrom (OFCS, OMIM 166780) als ein dem BORS allelisches Krankheitsbild beschrieben [169]. Bei diesem Krankheitsbild handelt es sich um eine autosomal dominante Erbkrankheit, die sich durch Gehörlosigkeit, Branchialfisteln, Ohrgruben, faziale Anomalien, Hypoplasie der Halsmuskulatur, mentale Retardierung und Kleinwuchs auszeichnet [37]. Eine Einzel-Nukleotidsubstitution an der Spleißseite konnte bei OFCS-Patienten gezeigt werden. Durch Punktmutationen kommt es beim OFCS zu einer Veränderung des Leserasters im EYA1-Gen [53]. Außerdem führen EYA1Mutationen zur kongenitalen Katarakt und anderen Augenanomalien [5]. Durch Sequenzanalysen konnten bei Patienten mit BOFS keine Mutationen im EYA1-Gen nachgewiesen werden. Somit konnte diese Genregion als mögliches Kandidatengen für dieses Syndrom ausgeschlossen werden [118]. Außerdem zeigt dies, dass BORS und BOFS nicht allelisch sind. Neben dem bereits genannten EYA1-Gen gibt es noch weitere drei Gene dieser Familie (EYA2, EYA3 und EYA4) [14]. Diese sind zwar nicht in die Pathogenese des BORS involviert, werden aber aufgrund der Ähnlichkeit zu EYA1 an dieser Stelle besprochen. Die EYA-Gene sind folgendermaßen lokalisiert: EYA1 befindet sich auf Chromosom 8q13.3 [1 , 101, 102], EYA2 ist auf Chromosom 20q13.1 [243], EYA3 auf Chromosom 1p36.2-p36.1 [243] und EYA4 auf Chromosom 1. Einleitung 9 6q23.2 lokalisiert. Die räumliche Expression der EYA-Genfamilienmitglieder (EYA2 und EYA3) ist der von EYA1 sehr ähnlich [139, 176, 234]. Alle drei sind während der Augenentwicklung exprimiert [235]. EYA1 - EYA3 werden in den ersten neun Wochen der humanen Entwicklung exprimiert [1]. Daher können auch EYA2 und EYA3 als Kandidatengene für das BOFS angesehen werden. Die EYA4Expression ist beim Mensch auf die Dermamyotome und die Gliedmaßen beschränkt. Im Gegensatz zu den anderen EYA-Genen wird Eya4 bei der Maus während der frühen Entwicklung des Augenbläschens, der Branchialbögen-Region und des kraniofazialen Mesenchyms exprimiert [14]. Bei Mutationen im EYA4-Gen kommt es zu Kardiomyopathie, Herzinsuffizienz und sensorineuraler Schwerhörigkeit [186]. Durch EYA4-Mutationen entsteht auch eine Form von spätauftretender (late-onset) Gehörlosigkeit [225]. Aufgrund der Rolle der EYA1 - EYA4 Gene während der Embryogenese und den Entwicklungsdefekten beim Kandidatengene BOFS-Patienten bei BOFS wurden diese untersucht. Gene Hierbei als mögliche konnte durch Segregationsanalysen keine Cosegregation der Krankheit mit den Genen EYA2, EYA3 und EYA4 nachgewiesen und diese somit als mögliche Kandidatengene für das BOFS ausgeschlossen werden [34]. Eya- und Pax-Gene sind häufig coexprimiert. Bei Mäusen konnte eine räumliche Coexpression von Eya1, Pax6 und Six3 während der Embryonalentwicklung in der Linsenplakode und von Eya1, Eya2 und Pax6 in der Nasenplakode gezeigt werden. Wobei Pax6 erforderlich ist für die Eya-Expression [149, 235]. Eine Coexpression von Eya1 und Eya2 mit Six-Genen findet sich im Gehirn, in Somiten, in Nieren, in Sehnen und in Mesenchymgeweben [235]. Außerdem werden Pax1 und Eya1 in den Schlundtaschen, Pax2 und Eya2 im Sehnerv (N. opticus), dem Ohrenbläschen sowie den Nieren, Pax3, Eya1 und Eya2 in den Somiten und Pax6, Eya2 und Six3 in Progenitorzellen der Retina exprimiert [66, 146, 235]. 1.3.1.1.2. Ausschluss der BORS-Loci BOS2 und BOS3 sowie des SIX5-Gens Der zweite Genlokus BOS2 (BOR2, 1q31.3.-q32.1) [105] des genetisch heterogenen BORS wurde mittels Segregationsanalyse ausgeschlossen [214]. 1. Einleitung 10 Das SIX1-Gen (BOS3) spielt bei der Pathogenese des BORS eine wichtige Rolle. Es gehört in eine Familie von sechs verwandten Genen (Six1-Six6/Six9). Die Six-Gene (Sine oculis homeobox) der Maus wurden anhand ihrer Nukleotidsequenzhomologie zu so identifiziert. Six-Gene besitzen eine 60 Aminosäuren große Homöodomäne vom Six-Typ (HD) und eine weitere, Richtung N-Terminus gelegene konservierte Region, die Six-Domäne (SD), welche 110-115 Aminosäuren groß ist. Beide Regionen sind dabei wichtig für die DNA-Bindung [193]. Für Six4, Six2 und Six5 konnte gezeigt werden, dass diese an einem Transkription-regulierenden Element der Na+-K+-ATPase α1-Untereinheit (Atp1a1) in Myozyten, dem sogenannten ARE (Na+-K+-ATPase alpha1 Untereinheit Gen regulatorisches Element), binden [92]. Beim Menschen sind SIX4, SIX1 und SIX6 (=OPTX2 =optic homeobox) auf Chromosom 14 lokalisiert [18, 61], SIX3 und SIX2 hingegen auf Chromosom 2 [19, 149, 221] und SIX5 auf Chromosom 19 [17]. Die Expression der Gene der verschiedenen Untergruppen konnte jeweils in begrenzten Arealen der Kopfregion gezeigt werden [193]. Tabelle 2 zeigt einen Überblick über die Expression der verschiedenen Six-Gene. Tabelle 2 : Expressionsmuster von Six-Genen (Sine oculis homeobox) bei Maus und Mensch, modifiziert nach [93]. Gene Hauptexpressionsgebiete Maus Six3[149]/ Augenbläschen und -stiel, ventrales Six6/9[120] Nasenplakode, Rathketasche Six1[150]/ Augenbläschen, Six4[147] Ganglienwurzel, Somiten, nephrogenes Gewebe, Extremitätenmesenchym Six2[150] Kopfmesoderm, Branchialbögen, Nasenplakode, Extremitätenmesenchym, Vorderhirn, Branchialbögen, Chiasma Rathketasche, opticum, dorsale Darmrohr und Mitteldarm, Nephrotome, Rathketasche, Augenbläschenepithel, Nasenhöhlenepithel Mensch SIX1[115] Augen-, Nieren-, Innenohrentwicklung SIX2 [19] Skelettmuskulatur, Pankreas, Herz, Ovar, Sklera und Retina, Augenentwicklung, beim Fetus außerdem: Mittelohr und Niere SIX3 [221] Mittleres Vorderhirn, Augenentwicklung SIX5 [183] Adultes Korneaepithel und –endothel, Ziliarkörperepithel, Linsenepithel und Zellschichten der Retina und Sklera SIX6/9 [61] Sich entwickelnde und adulte Retina, Hypothalamus, Hypophyse 1. Einleitung 11 Six1 spielt eine Rolle in der Entwicklung von Niere, Muskulatur und Innenohr [76, 115]. Zudem interagiert das Genprodukt von Six1 direkt mit Eya1 [27, 162, 242]. Dies konnte auch an Six1-defizienten Mäusen anhand der Muskelentwicklung, der Nierenentwicklung und der Entwicklung des auditorischen Systems gezeigt werden. Six1-/- Embryonen charakteristischen Phänotyp. sterben bei der Geburt und haben einen Es zeigen sich Skelettfehlbildungen wie Rippen- und Sternumveränderungen, sowie Muskelhypoplasie v.a. in distalen Regionen, was auf eine veränderte primäre Myogenese zurückzuführen ist [108, 109]. Außerdem fehlen diesen Six1-/- Mutanten, aufgrund fehlender metanephrogener Induktion, die Nieren [238]. Neben der Myo- und Nephrogenese ist bei den Six1-/Mutanten auch die Entwicklung des auditorischen Systems gestört. Dies äußert sich durch Fehlbildungen aller Anteile des auditorischen Systems (Außen-, Mittelund Innenohr). Six1+/- Mutanten hingegen zeigen lediglich eine Schwerhörigkeit aufgrund mangelnder Transmission durch das Mittelohr [155, 243]. Auch der Thymus fehlt bei diesen Mäusen und sie zeigen verschiedene kraniofaziale Fehlbildungen wie: Veränderungen der Nasenhöhlen, des kraniofazialen Skeletts sowie der Tränen- und Speicheldrüsen [109]. Trotzdem sind nicht alle Organsysteme betroffen, in denen Six1 exprimiert wird. Dies ist womöglich auf funktionelle Redundanz mit anderen Six-Genen zurückzuführen, welche eine normale Entwicklung dieser Organe (z.B. Schilddrüse) gewährleisten [109]. Dadurch, dass beispielsweise im metanephrogenen Mesenchym bei Six1Mutanten zwar die Expression von Pax2, Six2 und Sall1 vermindert ist, nicht aber die Eya1-Expression, muss Eya1 upstream von Six1 arbeiten. Pax2 hingegen fungiert downstream von Six2, Six1 und Eya1, was mit Hilfe von Pax2-/Embryonen gezeigt wurde [238]. Im otischen Epithel ist die Six1 Expression erforderlich für die Expression von Fgf3 (Fibroblast growth factor) und Fgf10, jedoch nicht für die Eya1-, Pax2- und Pax8-Expression. Eine Interaktion zwischen Eya1 und Six1 ist also auch bei der Innenohrentwicklung vorhanden. [242] Durch direkte Sequenzanalyse konnten das SIX1- und SIX5-Gen jedoch als Kandidaten für das BOFS ausgeschlossen werden [89]. Dies zeigt, dass das BOFS und BOR/BOS verschiedene Krankheitsbilder sind [214]. 1. Einleitung 12 1.3.1.2. Andere SIX-Gene Six- und Pax-Gene stehen in einem engen Zusammenhang. Beispielsweise wird im Tiermodell die Pax6- und Pax2-Expression durch Six3-Überexpression induziert [119]. Coexpression von Six-, Eya- und Pax-Genen wurden im Metanephros (Six1, Six2, Six4, Eya1, Pax2) [147, 150], in den Somiten (Pax3, Six1, Six4, Eya1, Eya2) [147, 235], im Augenbläschen (Pax2, Six2, Six4, Eya1) [146, 147, 235], in der Linsenplakode (Pax6, Six3, Eya1) [149, 235] und im Thymus festgestellt. Hierbei zeigt sich zusätzlich, dass die Expression von Six1 im Augenbläschen und von Six2 im metanephrogenen Mesenchym Eya1-abhängig sind [236]. SIX3-Mutationen wurden bei Patienten mit Holoprosenzephalie Typ 2 (HPE2, assoziiert mit Gehirnfehlbildungen, Hypotelorismus, Mikrozephalie und anderen kraniofazialen Anomalien [93], OMIM 157170) gefunden [149, 168, 221]. Six6 (auch Optx2 = Optic homeobox 2 oder Six9) ist ein weiteres Mitglied der SixFamilie und wird im Augenbläschen, im Augenstiel, in der olfaktorischen Plakode sowie im Hypothalamus und der Hypophyse exprimiert [120]. Das humane SIX6 ist eng verwandt mit SIX3 und wird sowohl in der sich entwickelnden als auch in der adulten Retina sowie in hypothalamischen und hypophysären Regionen exprimiert. Es befindet sich in der Nähe von SIX1 und SIX4 auf Chromosom 14q22.3-q23. Interstitielle Chromosomendeletionen der SIX6/OPTX2-enthaltenden Region führen zu bilateraler Anophthalmie und Hypophysenanomalien. Außerdem fehlen das Chiasma opticum und der Sehnerv. [61, 62] Das Expressionsmuster von Six4 lässt vermuten, dass dieses Gen in die Neuround Myogenese sowie die Ohrenentwicklung integriert ist. An Six4-Knockout- Mäusen konnte allerdings gezeigt werden, dass Six4 nicht essentiell für die Entwicklung ist. Ein Defekt des Six4-Gens wird durch Six1, Six2 und Six5 kompensiert, ohne dass diese jedoch überexprimiert werden müssen. Daher zeigen Six4-Mutanten keine phänotypischen Veränderungen. [154] Eine bedeutende Rolle bei der Nierenentwicklung kommt dem Gen Six2 zu. Inaktivierung des Six2-Gens führt zu vorzeitiger sowie ektoper Mesenchymzelldifferenzierung und Depletion der Progenitorzellpopulation im metanephrogenen Mesenchym. Nierenhypoplasie. [191] Daraus resultiert eine schwerwiegende 1. Einleitung 13 Funktioneller Synergismus zwischen Six- und Eya-Proteinen wird durch kooperative Aktivierung von Zielgenen vermittelt, beispielsweise über den Myogenin-Promotor. Diese synergistische Aktivierung führt zur Translokation von Eya-Transkriptions-Coaktivatoren in den Zellkern. Die Translokation von Eya1, Eya2 und Eya3 wird durch Coexpression von Six2, Six4 oder Six5 induziert, allerdings nicht durch Six3. [148] Wie SIX1 konnten allerdings auch SIX4 und SIX6 mittels Sequenzanalysen als BOFS-Kandidatengene ausgeschlossen werden. Zudem wurden SIX2 und SIX3 anhand von Segregationsanalysen ausgeschlossen. [70, 88, 89] 1.3.1.3. Ausschluss der TBS-Genregion: SALL1 Sall1 ist das Säugerhomolog des regionspezifischen homöotischen DrosophilaGens spalt (sal), welches bei der Entwicklung von Drosophila eine Rolle spielt. SALL1 (sal-like 1) besteht aus vier Doppel-Zinkfinger-Domänen, agiert als Transkriptionsfaktor, wobei bisher nur wenig Zielgene bekannt sind, und heterozygote Mutationen führen zum TB Syndrom, welches wie oben aufgeführt phänotypische Ähnlichkeiten zum BOF Syndrom zeigt [96]. SALL1 ist auf Chromosom 16q12.1 lokalisiert und wird im metanephrogenen Mesenchym exprimiert [95]. Sall1-/- Mäuse sterben perinatal und zeigen eine fehlerhafte Tubulusbildung aufgrund unvollständigen Auswachsens der Ureterknospe, was zu renaler Agenesie oder Dysgenesie führt [145]. Die Sall1-Expression ist abhängig von Six1 und Eya1, was mittels Six1-/- und Eya1-/- Knockout-Mäusen gezeigt wurde [238]. Somit wird klar, dass auch Sall1 im molekularen Netzwerk mit Eya1, Six1, Six2 und Pax2 während der Nierenentwicklung interagiert [145, 238]. Weiterhin wird SALL1 auch während der Gehirn- und Extremitätenentwicklung exprimiert [23, 95]. Zudem besteht die Möglichkeit, dass SALL1 auch bei der Entwicklung von Innen-, Mittel- und Außenohr benötigt wird [96]. Auch eine Expression in sich entwickelnden Nasen und Augen wurde gezeigt [23, 145]. Das SALL1-Gen wurde als mögliches Kandidatengen für das BOFS benannt [214]. Diese Hypothese konnte allerdings 2003 mittels Segregationsanalyse widerlegt werden [87]. Dies zeigt, dass das BOFS und TBS weder allelisch sind noch eine gleiche Genregion besitzen, obwohl es phänotypische Ähnlichkeiten zwischen den Syndromen gibt [87]. 1. Einleitung 14 1.3.1.4. Andere SALL-Gene Neben SALL1 gibt es auch noch die humanen SALL2-, SALL3- und SALL4-Gene. Die Expression dieser SALL-Gene unterscheidet sich teilweise von der SALL1Expression. SALL3 wird während der Gaumen- und Hirnnervenentwicklung sowie in adultem Gewebe (Herz, Gehirn, Leber, Pankreas, Niere, Skelettmuskulatur und Plazenta) [97] exprimiert und fehlt möglicherweise beim 18q-Deletion-Syndrom (OMIM 601808). Bei diesem Syndrom treten Entwicklungsdefekte wie mentale Retardierung, Gehörschädigung und Fingeranomalien auf [97]. SALL4 spielt eine Rolle bei der Ohrenentwicklung [205]. 1.3.2. Andere mögliche oder ausgeschlossene Genregionen Die folgenden Gene gehören zu Krankheitsbildern, die dem BOFS unähnlich sind, aber anhand der Expressionsmuster und der Funktion während der Embryonalentwicklung für das BOFS in Betracht kommen. Durch eine genomweite Suche konnten bereits 83% der Gene ausgeschlossen werden. Die Menge an Kandidatengenen wurde daher erheblich eingegrenzt. Trotzdem kommen noch 651 BOFS-verdächtige Gene in Betracht. [70] 1.3.2.1. Ausgeschlossene PAX-Gene Eine weitere Genfamilie, die während der Embryonalentwicklung eine Rolle spielt, ist die PAX-Familie (paired-box-containing gene), welche für Transkriptionsregulatoren kodieren. Sie stellen das Ortholog des Drosophila Gens eyeless dar. Alle PAX-Gene besitzen eine Paired-box-Domäne (ein konserviertes Sequenz-Motiv). Diese kodiert für eine DNA-Bindungsdomäne und wurde in Genprodukten von Segmentationsgenen (gooseberry-proximal, gooseberry-distal und paired, pox meso, pox neuro) von Drosophila identifiziert [12, 13]. Die humanen PAX-Gene sind Homologe der Segmentationsgene paired von Drosophila und ihre DNA-Bindungsdomäne befindet sich am N-Terminus [68]. Anhand des Homologiegrades der Aminosäuren dieser Domäne können die Paired-Box-Domänen in sechs Klassen unterteilt werden, wobei die Pax-Gene in fünf verschiedenen Gruppen zu finden sind [161, 223]. Es ist eine Unterteilung der Paired-Box-Domäne in eine hoch konservierte amino-terminale Region und eine mehr abweichende carboxy-terminale Region möglich [223]. Alle Paired-Domänen 1. Einleitung 15 enthalten eine α-Helix und ein Helix-Turn-Helix (HTH)- Motiv [13]. Neben der Paired-box-Domäne besitzen Pax3, Pax6 und Pax7 eine zweite konservierte Homöodomäne. Diese liegt teilweise auch nur partiell vor (Pax2, Pax8) oder fehlt ganz (Pax1). Eine andere konservierte Sequenz, welche auch noch bei den PaxGenen vorkommt, ist das sogenannte Oktapeptid, dessen Funktion nicht bekannt ist [26, 223]. Mutationen können sowohl in der Paired-Domäne, als auch in der Homöodomäne und im Oktapeptid auftreten. Pax-Gene werden entlang der anteroposterioren Achse des Neuralrohres oder in vom Mesoderm abgeleiteten Strukturen wie der Wirbelsäule exprimiert [42]. Eine wichtige Rolle nehmen Pax-Gene bei der Nierenentwicklung ein. Die Entwicklung der Niere bei Säugetieren verläuft in drei Stadien (Pronephros, Mesonephros, Metanephros), welche durch eine mesenchymal-epitheliale- Transformation von Zellen, die vom intermediären Mesoderm abstammen, charakterisiert sind [21]. Das Auswachsen der Ureterknospe aus dem posterioren Nierengangepithel und die nachfolgende Invasion der Knospe in das metanephrogene Mesenchym initiiert die Entwicklung der adulten Niere. Essentiell für das Wachsen der Ureterknospe und die Morphogenese des Ureterknospenepithels sind der Tyrosinkinase Rezeptor (c-RET) und der Glial-cellline-derived neurotrophic factor (GDNF) [22]. Fehlt das metanephrogene Mesenchym, wächst die Ureterknospe nicht aus. Fehlt die Ureterknospe, geht das Mesenchymgewebe in Apoptose. Hierbei spielt Pax2 eine Rolle, welches im Wolff-Gang, der Ureterknospe und in metanephrogenen Mesenchym exprimiert wird [66]. Die Expression von Pax2 im metanephrogenen Mesenchym ist unabhängig von der Induktion durch die Ureterknospe. Pax2-Mutanten haben Defizite im Auswachsen der Ureterknospen und exprimieren kein GDNF im nicht-induzierten metanephrogenen Mesenchym. Hierdurch wurde gezeigt, dass Pax2 nötig ist für die Expression von GDNF, dass GDNF eine Pax2-Bindungsstelle hat und durch Pax2 transaktiviert wird [22]. Neben Pax2 ist auch Pax8 wichtig für die Nierenentwicklung. Pax2 und Pax8 besitzen redundante Funktionen während der Nephrogenese. Beide Gene sind erforderlich für die Bildung von Pro- und Mesonephros und kontrollieren somit zusammenwirkend die Entwicklung des Urogenitalsystems. Allerdings werden Pax2 und Pax8 unabhängig voneinander während der frühen Nierenentwicklung reguliert. Beide Gene werden durch Signale aus dem paraxialen Mesoderm 1. Einleitung 16 aktiviert [127]. Bei Pax2-Pax8-Doppelmutanten kommt es zur Apoptose, da die initiale Transformation nicht stattfinden kann [16]. Bei alleiniger Mutation von Pax8 verläuft die Nierenentwicklung hingegen normal [125]. Allerdings wird die Nierenentwicklung nicht nur durch diese beiden Gene, sondern auch durch ein komplexes Netzwerk von Wechselbeziehungen und positiven sowie negativen Rückkopplungsschleifen einer Vielzahl von Genen (Pax2, Pax8, Eya1, Six1, Six2, Sall1, Foxc1, Wt1 und Hoxl1) kontrolliert, welche alle zur GDNF-Regulation führen. [21] Auch während der Neurogenese ist Pax2 im Rückenmark und in der Medulla oblongata zu finden [146]. Eine Expression von Pax2 ist auch im Augenbläschen bekannt. Neben Pax2 werden auch Eya1 und Pax8 in der otischen Plakode exprimiert [244]. Interaktionen von Pax2 mit Eya1 wurden während der Entwicklung des Innenohrs entdeckt [244]. Beim Menschen ist PAX2 auf Chromosom 10q24-q25 lokalisiert [200] und wird wie bei der Maus in der Ureterknospe und in diese umgebenden Mesenchymgewebe exprimiert [47]. Mutationen führen zu Nierenanomalien, vesikouretralem Reflux und Kolobome des Nervus opticus (Renal-Colobom-Syndrom = Papillorenales Sandrom, OMIM 120330) [182]. Die Expression von Pax8 ist bei Maus und Mensch sehr ähnlich: es wird in der Schilddrüsenanlage, dem vierten Schlundbogen, den Ultimobranchialkörpern, dem Ohrenbläschen sowie Myelenzephalon) und während der ZNS- (Rückenmark, Nierenentwicklung (Ureterknospe Cerebellum, und Metanephros) exprimiert [125, 163, 213, 236]. Bei Mutationen des humanen PAX8-Gens, welches auf Chromosom 2q12-q14 lokalisiert ist [200], kommt es zu kongenitalem Hypothyreoidismus, welcher durch Schilddrüsenveränderungen (Hypoplasie) verursacht wird [121, 219]. Pax3 wird in den Somiten sowie dem paraxialen Mesoderm exprimiert und induziert zusammen mit Dach2, Eya2 und Six1 die Muskeldifferenzierung [76]. Hierbei ist die Pax3-Aktivität der essentielle Faktor zur Induktion der Myogenese und somit zur Entstehung der Skelettmuskulatur. Außerdem ist Pax3 wichtig für die Expression von Six1 und Eya2 und auch für die Regulation der eigenen Expression. Dies zeigt, dass eine Kaskade transkriptioneller Ereignisse, kontrolliert durch Pax3, erforderlich und ausreichend ist, für die skelettale Myogenese. Allerdings hat Pax3 keinen Einfluss auf die Herzmuskelentwicklung, 1. Einleitung 17 sondern ist auf die Skelettmuskulatur beschränkt [170]. Somit spielt das Pax/Eya/Six-Netzwerk sowohl bei der Augenentwicklung als auch bei der Somitogenese eine wichtige Rolle. Pax3-Mutationen gelten als Ursache für splotch-Mutanten (assoziiert mit Spina bifida und Exenzephalie) [51]. Als humanes Homolog wird das Waardenburg Syndrom Typ I (OMIM 193500) diskutiert [54, 206]. Es wurden auch Fälle von Waardenburg Syndrom Typ II (OMIM 193510) beschrieben, bei denen PAX3-Mutationen vorlagen [207]. Zudem wurde PAX3 mit alveolären Rhabdomyosarkomen in Zusammenhang gebracht [7]. Von den PAX-Genen konnten zunächst nur PAX2 und PAX8, sowie der GDNF und die Gene Dach1 und Dach2 als Ursache für das BOFS ausgeschlossen werden [88, 89]. Später wurde dann auch das PAX3-Gen ausgeschlossen [70]. Aber auch andere PAX-Gene zeigen Expressionsmuster und Funktionen in der Embryonalentwicklung, welche durchaus zum BOFS beitragen können. Diese sind im folgenden Abschnitt beschrieben. Weitere Untersuchungen dieser anderen PAX- Gene sind daher sinnvoll. 1.3.2.2. Nicht ausgeschlossene PAX-Gene Pax1 ist für die Entwicklung der Wirbelsäule wichtig [42], da es in Sklerotomen exprimiert wird. Daher kommt es bei Mutation zu Skelettanomalien [6]. Ein weiteres Gen, das in der Entwicklung des Auges eine Rolle spielt, ist das Aniridie-Gen, welches für eine PAX6 Homöobox und Paired-Box-Gene kodiert [66, 211]. Ein Verlust der normalen Funktion des Gens führt beim Menschen zu Entwicklungsanomalien der Augen wie Irisverlust in schweren Fällen und Katarakte bei milden Formen [74]. Homozygote PAX6-Mutationen resultieren in Anophthalmie, nasaler Hypoplasie und ZNS-Defekten [67]. Auch eine vermehrte Expression von PAX6 führt zu Augenanomalien, was zeigt, dass die Augenentwicklung sehr sensitiv auf die PAX6-Dosis reagiert [185]. Bei Mäusen wird Pax6 in der Linsenplakode und der sich entwickelnden Retina exprimiert [222] und ist das Homolog des Drosophila eyeless (ey) Gens [63]. Bei Funktionsverlust kommt es zu Small-eye Mutanten (assoziiert mit verminderter Augengröße, Irishypoplasie, Korneatrübung und Katarakten) [77]. Die frühe Augenentwicklung wird durch eine Pax6-regulierte Kaskade kontrolliert. Deshalb wird Pax6 auch als Kontrollgen der Augenentwicklung bezeichnet [63, 71]. Neben Pax6 spielen, wie oben erwähnt, auch Pax2 und Six-Gene eine Rolle in der frühen und dynamischen 1. Einleitung Augenentwicklung, was zeigt, dass hier eine exakte Abstimmung von Genen mit einbezogen ist. Hierbei kooperieren Pax2 und Pax6 in einem molekularen Netzwerk, um die Abgrenzung zwischen Augenstiel und Augenbecher durch wechselseitige Kontrolle der Expressionslevel zu ermöglichen. Dies geschieht durch direkte Interaktion, wobei jeweils die Transkriptionsaktivität des anderen Gens vermindert wird. [189] PAX7 wird schwach in Myozyten exprimiert. Pax7 ist innerhalb der PaxTranskriptionsfaktor-Familie ein nahe verwandtes Mitglied zu Pax3 und ist in der Lage, die gleichen DNA-Motive zu binden wie Pax3. [124, 184] Pax9 ist ein naher Verwandter von Pax1 und beide zeigen eine funktionelle Redundanz während der Wirbelsäulenentwicklung. Beide spielen eine Rolle in der Kontrolle der Zellproliferation während der frühen Sklerotomentwicklung [159]. Mutationen im humanen PAX9 Gen sind assoziiert mit Oligodontie [201]. 1.3.2.3. Ausgeschlossene HOX-Gene Die Homöobox-Gene (Hox-Gene) wurden anhand der Drosophila-Mutation Antennapedia entdeckt. Bei diesen Fliegen sind die Fühler durch ein weiteres Beinpaar ersetzt, was als homöotische Transformation bezeichnet wird. Daraufhin konnten bei Drosophila der bithorax-Komplex, bestehend aus den Genen Ubx, Abd-A und Abd-B, und der antennapedia-Komplex (Lab, Pb, Dfd, Scr und Antp) identifiziert werden. Den Genen bithorax und antennapedia entsprechen die HoxGene bei den Vertebraten. Die HOX-Proteine wurden lange als Hauptregulatoren der Embryonalentwicklung angesehen. Die Sequenz und Funktion der Hox-Gene blieben während der Evolution hoch konserviert. Allerdings fanden mehrere Duplikationen statt, sodass bei Säugetieren heute 39 verschiedene Hox-Gene bekannt sind. Diese werden in vier verschiedene Untergruppen (A, B, C und D) unterteilt. Beim Menschen sind diese Cluster auf verschiedenen Chromosomen (HOX A: 7q14-15, HOX B: 17q21-22, HOX C: 12q12-13 und HOX D: 2q31-37) angeordnet. [190] Bei den Hox-Genen handelt es sich um sehr kleine Gene, die lediglich zwei Exons und ein variabel großes Intron enthalten. Die HOX-Gene besitzen immer eine hoch konservierte, 60 Aminosäuren große Homöobox im zweiten Exon, welche für eine Homöodomäne kodiert. Diese Domäne enthält ein Proteinmotiv, welches eine sequenzspezifische DNA-Erkennung ermöglicht, wodurch die Hox-Gene als 18 1. Einleitung 19 Transkriptionsfaktoren agieren können [94]. Upstream der Homöodomäne befindet sich ein Pentamer, welches das als Cofaktor wirkende TALE-Protein (three amino acid loop extension) bindet [110]. Im Gegensatz zu den PAX-Genen werden viele HOX-Gene eher regionspezifisch, als gewebespezifisch exprimiert. Im Jahre 1978 wurde eine Verbindung zwischen chromosomaler Anordnung der Hox-Gene und der Lokalisation ihrer Expression festgestellt. Tatsächlich gibt es spezifische Positionen der Gene in Segmenten entlang der anterior-posterior Achse. Die Anordnung der Gene innerhalb jedes Clusters reflektiert dabei ihre zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster während der Entwicklung. Hierbei werden 3’ gelegene Gene (niedrig zahlige HoxGene) eher anterior und früher exprimiert, 5’ gelegene Gene (hoch zahlige) hingegen eher posterior und später. Dies wird auch als lineare Kolinearität bezeichnet [114]. Da die Hox-Gene einer Gruppe häufig funktionelle Redundanz aufweisen, kommt es meist erst nach Mutation mehrerer Hox-Gene dieser Gruppe zu Veränderungen. Als Beispiel sind die Hox11-Gene zu nennen, welche die Entwicklung von Skelett, Extremitäten, Nieren und Reproduktionstrakt beeinflussen. Schon in frühen Stadien werden Hoxa11, Hoxc11 und Hoxd11 im metanephrogenen Blastem exprimiert [157]. Weder Hoxa11- noch Hoxd11Knockoutmäuse zeigten einen deutlich Hoxa11/Hoxd11-Doppelknockouts konnten veränderten Phänotyp. Nierenhypoplasien Erst in beobachtet werden [39, 157]. Bei Tripleknockouts (Hoxa11-/-, Hoxc11-/-, Hoxd11-/-) fehlt die metanephrogene Induktion komplett. Daher haben diese Mäuse keine Nieren. Auch die Ureterknospeninduktion erfolgt nicht. Zudem fehlt bei diesen Knockoutmäusen die Expression von Six2 und GDNF (beide im metanephrogenen Blastem). Dies zeigt, dass die Six2-Expression abhängig ist von der Expression von Hox11, Hox11 also upstream von Six2 agiert. Da der Phänotyp dieser Mäuse dem von Eya1-Mutanten [236] sehr ähnelt, ist anzunehmen, dass auch Hox-Gene in das Pax-Eya-Six-Netzwerk involviert sind. Vermutlich wird die Six2-Expression durch einen Komplex, aus Eya1 und Hox11 bestehend, aktiviert [227]. Neben Hox11-Genen sind auch Hox10 und Hoxd13 wichtig für die Nierenentwicklung. Von den vielen BOFS-Kandidaten aus dieser Genfamilie konnte zunächst nur das HOX11-Gen ausgeschlossen werden [89]. In weiteren Segregationsanalysen wurden allerdings auch die Gene HOXA2, ~4, ~9, ~10, ~11, ~13, HOX1 und HOX3 ausgeschlossen [70]. 1. Einleitung 20 1.3.2.4. Andere HOX-Gene Allerdings gibt es in dieser Genfamilie noch viele weitere Mitglieder, die als BOFSKandidat in Frage kommen und noch nicht als solcher ausgeschlossen werden konnten. Beispielsweise wird Hoxa3 im Endoderm der dritten und vierten Schlundtasche exprimiert [98]. Inaktivierung von Hoxa3 bei Mäusen führt zum Fehlen von Thymus und Nebenschilddrüse sowie persistierenden Ultimobranchialkörperchen und Schilddrüsenhypoplasie [123]. Zudem wurde über kraniofaziale Defekte bei Hoxa3-Mutanten [32], wie Gaumenspalten, Duplikationen der Ossifikationszentren der Mittelohrknochen und andere kraniale Skelettdefekte, bei Mutationen im Hoxa2-Gen – welche allerdings letal sind – berichtet [64, 171]. Histologische Untersuchungen der Hoxa2-Mutanten deuten darauf hin, dass die Duplikationen daher kommen, dass sich Skelettbestandteile, welche vom zweiten Branchialbogen abstammen, in anteriorere Strukturen umwandeln, was zur Verdopplung des Meckel-Knorpels neben der Augenkapsel führt. Daher fehlen auch Skelettbestandteile, die normalerweise vom zweiten Branchialbogen abstammen. [64] Für die Metanephros-Entwicklung sind vor allem die Gene des Hoxd-Clusters sowie Hoxb7 und Hoxb8 wichtig, wobei eine Expression für das metanephrogene Mesenchym als auch für die Ureterknospe beschrieben ist [43]. 1.3.2.5. FOX-Gene Die Forkhead-box (FOX) Genfamilie von Transkriptionsfaktoren besteht aus 43 Mitgliedern, welche zwei Klassen zugeordnet werden können [91]. Einige FOXGene liegen in Clustern vor, andere wiederum sind einzeln organisiert [91, 113]. Charakteristisch für die FOX-Gene ist ihre FOX-Domäne. Dabei handelt es sich um eine etwa 100 Aminosäuren große monomere DNA-Bindungsdomäne. Die dreidimensionale Struktur der FOX-Domäne setzt sich aus zwei Schleifen oder Flügeln (W1 und W2) und drei α-Helices zusammen. Da dies einem Schmetterling ähnelt, wird diese Domäne auch als „winged-helix“-Domäne bezeichnet. [113] FOXC1 (=FKHL7 = forkhead drosophila homolog-like) spielt eine Rolle in der Platzierung des metanephrogenen Mesenchyms. Dies konnte anhand von Foxc1-/- Mäusen gezeigt werden. Bei diesen befindet sich das metanephrogene Mesenchym und die Ureterknospe zu weit anterior [106]. Auch bei verschiedenen Glaukom-Phänotypen konnte eine FOXC1-Mutation identifiziert werden [144]. 1. Einleitung 21 Beispielsweise haben Patienten, welche an der Axenfeld-Rieger-Anomalie (OMIM 602482) erkrankt sind, FOXC1-Mutationen [131]. Neben FOXC1 gibt es allerdings noch sehr viele andere FOX-Gene, die in der Embryogenese eine sehr bedeutende Rolle spielen und aufgrund ihres Expressionsmusters (beispielsweise FOXE3: im vorderen Linsenepithel [192]; Foxc2: paraxiales und nephrogenes Mesoderm, Somiten, Endothelzellen sowie Aortenbogen [106,107]; Foxl2: im Ovar und während der Entwicklung des Augenlides [35, 215]) als BOFS- Kandidatengene in Betracht kommen. Bei Mäusen wurde festgestellt, dass kraniofaziale, vertebrale und Aortenbogenfehlbildungen mit Foxc2-Mutationen einhergehen [29]. Kombinierten Foxc1-/- Foxc2-/- homozygoten Null-Mutanten fehlt der zweite Branchialbogen und der erste Branchialbogen ist sehr klein [107]. Auch in der Nierenentwicklung spielt Foxc2 eine wichtige Rolle [106]. Foxi1 wird im endolymphatischen Gang exprimiert [81]. Weitere Mutationen und deren Ausprägung sind in Tabelle 3 aufgeführt. Fkh10 wird im Ohrenbläschen exprimiert und ist wichtig für die Entwicklung von Kochlea und Vestibulum. Das humane homologe Gen FKH10 gilt als Kandidat für Gehörlosigkeit und ist auf Chromosom 5q34 lokalisiert. [80] Bisher konnten von den vielen FOX-Genen nur FOXC1, dessen Interaktionspartner PITX2 (paired-like homeodomain, pituitary homeo box), FOXC2, FOXE1, FOXE3, FOXO1, FOXL2 und FOXH1 als BOFS-Kandidaten ausgeschlossen werden [70, 88, 89]. Tabelle 3: Erkrankungen, die durch Mutationen in FOX-Genen (forkhead-box) entstehen (OMIM = Online Mendelian Inheritance in Man) .[91] Mutiertes Ausprägung Gen FOXC2 [52] Lymphödem-Distichiasis-Syndrom (OMIM 153400) FOXE1 Kongenitaler Hypothyreoidismus, Schilddrüsenagenesie, Gaumenspalten FOXE3 [192] Katarakt und Anomalien des vorderen Augensegments FOXL2 [35, Blepharophimosis-Ptosis-Epicanthus inversus Syndrom (=BPES, OMIM 110100), 75] verfrühtes Versagen der Ovarien FOXN1 T-Zell-Immundefizienz, Hauterkrankungen, Alopezie, Nageldystrophie FOXP2 Sprech- und Sprachstörungen FOXP3 X-linked Autoimmunität-Allergisches Dysregulations-Syndrom (=XLAAD, OMIM 304790) 1. Einleitung 22 1.3.2.6. FGF-Gene Die Fibroblast Growth Faktoren (FGF) wurden ursprünglich als Wachstumsfaktoren aus Fibroblasten isoliert. Heute weiß man, dass Fgf Polypeptide mit einer Größe von ca. 150 bis 250 Aminosäuren sind. Die meisten Fgf vermitteln ihre biologische Antwort durch Bindung und Aktivierung von an der Zelloberfläche lokalisierten Tyrosinkinase-Fgf-Rezeptoren (Fgfr). Dieses FgfSignalsystem ist bei vielen Entwicklungsprozessen wie Differenzierung, Zellproliferation und Migration beteiligt [85, 153, 210]. Bisher konnten beim Menschen 22 FGF identifiziert werden: FGF1-FGF23 wobei FGF15 bisher noch nicht beschrieben wurde [85, 153]. Die Gene sind größtenteils über Duplikationen ancestraler Vorläufer entstanden. Sie werden vor allem während der Embryonalentwicklung aber auch in adultem Gewebe exprimiert [86]. Fgf werden im otischen Epithel exprimiert und frühen Ohrenentwicklung. fungieren als Signalmoleküle während der Beispielsweise wird Fgf3 Eya1-abhängig im Ohrenbläschen exprimiert, ist aber auch in Neuroblasten zu finden. Inaktivierung von Fgf3 führt zu Innenohrdefekten [236]. Auch Fgf10 wird in der Ohrplakode, dem Ohrbläschen und in Neuroblasten exprimiert [166]. Wie man sehen kann, überlappt die Expression von Fgf3 und ~10. Außerdem funktionieren beide Gene über ihren Rezeptor Fgfr2IIIb [158]. Dass diese beiden Faktoren für die Entwicklung des Ohres sehr wichtig sind, zeigt eine Studie mit Knockout-Mäusen. Werden in Mäusen diese beiden Gene ausgeschaltet, wird das Ohrbläschen nicht gebildet [232]. Die Expression dieser beiden, für die Ohrentwicklung wichtigen Gene (Fgf3 und Fgf10), wird zudem von Six1 reguliert [242]. Auch die Proliferation der Zellen der Neuralleiste wird durch FGF (FGF2) gewährleistet [142]. Zudem spielen sie eine Rolle bei der Entwicklung von Haut, Nervensystem und Knochen. Auch eine Beteiligung einiger FGF an der Wundheilung, der DNA-Synthese, der Morphogenese, der Angiogenese sowie beim Tumorwachstum konnte festgestellt werden [90, 141, 175, 208]. Mittels Mutationsanalysen an Zebrafischen konnten Fgf3- und Fgf8-Aktivitäten während der Schlundbögen- und Schlundknorpelbildung dargestellt werden. Hierbei werden die Fgf für die Segmentation benötigt und bestimmen die Migration endodermaler Zellen, welche die Schlundtaschen bilden [36]. Zudem sind sowohl Fgf3 als auch Fgf8 für die Koordination der Retinadifferenzierung wichtig [126]. Anhand von Fgf8-Mutanten konnte dessen Beteiligung während der Gastrulation sowie bei der Herz-, 1. Einleitung 23 kraniofazialen, Vorderhirn-, Mittelhirn- und cerebellären Entwicklung gezeigt werden. Zudem wurde mit Hilfe dieser Mutanten eine entscheidende Rolle von Fgf8 bei der Differenzierung der Nasenplakode und der Telenzephalonentwicklung beschrieben. Allerdings kann die Fgf8-Funktion durch andere Fgf, welche an die gleichen FGFR binden (z.B. FGF2), ausgeglichen werden. [135, 202]. Aufgrund der Expression von FGF und der Tatsache, dass FGF eine bedeutende Rolle bei der Regulation der Branchial- und Schlundbögenentwicklung zukommt, und sie somit das spätere kraniofaziale und skelettale Bild beeinflussen, können auch die FGF-Gene als BOFS-Kandidaten angesehen werden. Durch Mutationen in FGFGenen werden sehr viele Erbkrankheiten und Entwicklungsstörungen hervorgerufen. Einige davon ähneln dem BOFS. Ist beispielsweise das FGFR3Gen mutiert, führt dies zu einem vermehrten Wachstum der Knochen und der Wirbelsäule. Daher wird FGFR3 als ein negativer Regulator des Knochenwachstums angesehen [41]. FGFR3 wird zudem in embryonalen Knochenvorläufern, im sich entwickelnden ZNS, der Linse, der Kochlea, der Haut und der Niere exprimiert [160]. Die FGF sind beim Menschen auf vielen verschiedenen Chromosomen lokalisiert [90]. Das FGF13-Gen kann ausgeschlossen werden, da es sich beim BOFS um eine autosomal dominante Krankheit handelt und sich FGF13 auf dem XChromosom befindet. Mittels Segregationsanalyse wurden folgende FGF als BOFS-Kandidaten ausgeschlossen: FGF2, ~3, ~8, ~11, ~17 und ~20 [70, 89]. Neben den FGF wurden beim Menschen bisher vier Gene beschrieben, welche für FGF-Rezeptoren (FGFR1- FGFR4) kodieren [85]. Teilweise sind sie durch alternatives Spleißen entstanden, woraus eine gewisse Spezifität der Rezeptoren resultierte [59, 151, 156]. Sie weisen eine hohe Konservierung während der Evolution auf. Die Lokalisation der Gene für diese Rezeptoren auf den menschlichen Chromosomen ist wie folgt: FGFR1: 8p12, FGFR2: 10q26.12, FGFR3: 4p16.3, FGFR4: 5q35.2 [85]. FGF können an diese Rezeptoren und an Heparin oder Heparansulfatproteoglykane binden, was zu einer verbesserten Affinität und Stabilität des FGF-FGFR-Komplexes führt [152]. Über parakrine Signalvermittlung induzieren sie die Differenzierung neuroektodermaler und mesenchymaler Zellen, wodurch eine Entwicklungskontrolle gewährleistet wird [65, 216]. Auch die Expression der FGFR würde zu einem Zusammenhang mit dem BOFS passen. Diese Gene werden u.a. während der Entwicklung der Linse, 1. Einleitung 24 des auditorisch-sensorischen Epithels (FGFR1) und der Niere (FGFR1 und ~2; im metanephrogenen Mesenchym sowie in der Ureterknospe) exprimiert [8, 164, 166, 172, 241]. Von diesen vier Rezeptoren konnten bereits drei als BOFS-Kandidaten ausgeschlossen werden: FGFR1, ~2 und ~3 [70]. 1.3.2.7. POU-Gene Die Familie der POU-Domäne-Transkriptionsfaktoren wurde anhand von Untersuchungen der Säugergene Pit-1 (pituitary-specific), Oct-1 (octamer-binding protein), Oct-2 und eines Proteins, welches durch das Caenorhabditis elegans Gen unc-86 kodiert wird, entdeckt. Diese Gene besitzen eine Region mit sehr hoher Homologie, welche als POU-Domäne bezeichnet wird. Diese Domäne ist eine zweiteilige DNA-Bindungsdomäne, welche aus zwei hochkonservierten Regionen besteht, die durch einen variablen Linker verbunden sind. Die ca. 75 Aminosäuren große amino-terminale Region wird auch als POU-spezifische Domäne und die carboxy-terminale 60 Aminonäuren große Region als POUHomöodomäne bezeichnet. Beide Regionen enthalten Helix-Turn-Helix-Motive [15, 203, 218]. Aufgrund der Aminosäuresequenz der POU-Domänen und der Konservierung der variablen Verbindungsregion können die bisher 15 bekannten POU-Domäne-Proteine in sechs Klassen unterteilt werden [226]. Wie die bisher genannten Genfamilien regulieren auch die POU-Domäne-Proteine Schlüsselprozesse der Entwicklung, vor allem der Neuronalzelldifferenzierung. Bei der Regulation der Genexpression spielt die Flexibilität, mit der die POU-Domäne DNA-Bindungsstellen erkennt, eine entscheidende Rolle. Die Funktion und das Expressionsmuster der POU-Gene ist sehr breit gefächert. Die Expression beispielsweise reicht von der Hypophyse (Pit-1) über andere ZNS-Areale (murine brain; Brn-1, Brn-3.1=POU4F3), die Niere (Brn-1, Brn-4=POU3F4, Oct-2), das Ohrenbläschen (Brn-4) bis hin zu ubiquitärem Vorkommen (Oct1). Hierbei ist besonders das POU4F3-Gen (= POU-Domäne Klasse 4 Transkriptionsfaktor 3 =Brn-3.1, Brn-3c) hervorzuheben, welches für die terminale Differenzierung der Haarsinneszellen im Innenohr zuständig ist und bei Mäuse-Nullmutanten zu Gehörlosigkeit und Gleichgewichtsstörungen führt [233]. Beim Menschen wird dieses Gen in der fetalen Cochlea exprimiert und führt ebenfalls zu sensorineuraler Gehörlosigkeit. Bisher konnte eine Exon-2 Deletion des POU4F3Gens identifiziert werden, welche für die autosomal dominante Form DFNA15 1. Einleitung 25 (deafness, autosomal dominant nonsyndromic sensorineural 15) sensorineuraler Gehörlosigkeit (OMIM 602459) verantwortlich ist [217]. POU3F4 (=Brn-4) ist für die Entwicklung des Mittelohrs zuständig. Mutationen in diesem Gen führen zu Stapesdefekten und somit zu Gehörlosigkeit (humane X-chromosomal gekoppelte gemischte Schwerhörigkeit, DFN3 = Deafness 3, OMIM 304400) [40]. Auch beim BOF-Syndrom kann es zu einer sensorineuralen Schwerhörigkeit kommen. Allerdings konnte das POU4F3- sowie das POU3F4-Gen in früheren Untersuchungen ausgeschlossen werden [88]. 1.3.2.8. Andere Transkriptionsfaktoren Ttf-2 (thyroid transcription factor 2) ist ein Mitglied der Forkhead/winged-HelixDomäne Transkriptionsfaktorfamilie, welche Schlüsselregulatoren der Embryogenese sind. Zusammen mit Proteinen, wie dem Thyroid transcription factor 1 (Ttf-1) und Pax8, hat Ttf-2 bei der Schilddrüsenentwicklung eine wichtige Funktion und ist bekannt dafür, die Genexpression während der Schilddrüsendifferenzierung zu [69, 163, 239]. Das humane Homolog des Ttf-2 bei der Maus ist der Transkriptionsfaktor FKHL15, welcher auf Chromosom 9q22 lokalisiert ist [30]. Homozygote Missense-Mutationen in dessen Forkhead-Domäne konnten bei Choanalatresie Patienten mit Schilddrüsenagenesie, nachgewiesen werden [33]. Gaumenspalten Ein weiterer und Forkhead- Transkriptionsfaktor ist Mesenchym Fork Head-1 (Mfh-1). Mfh-1 wird im Mesenchym, in der Neuralleiste und in prächordalen Regionen exprimiert. Eine starke Expression dieses Transkriptionsfaktors konnte auch im sich entwickelnden Knorpelgewebe, der Niere und der dorsalen Aorta nachgewiesen werden [140]. Mfh-1-defiziente Mäuse sterben perinatal und zeigen einen unterbrochenen Aortenbogen und skelettale Defekte im Neurokranium und der Wirbelsäule. Auch Mittelohrdefekte wurden bei diesen Mutanten gefunden. [82] Beim Okulo-Aurikular Syndrom (OMIM 612109), welches sich durch ophthalmologische Anomalien wie Mikrokornea, Mikrophthalmie, Dysgenesie des anterioren Segments, Katarakt, Kolobome oder Anomalien des Pigmentepithels der Retina sowie bestimmte Ohrläppchenspalten auszeichnet, wurde eine Mutation im NKX5-3-Gen als Auslöser entdeckt [187]. Dieses Homöbox-Gen wird auch als HMX1-Gen (Homöobox) bezeichnet, ist auf Chromosom 4 lokalisiert und wird während der Embryogenese im Auge und im Ohr exprimiert [199]. 1. Einleitung 26 1.4. Fragestellung Aufgrund der Tatsache, dass es sich beim Branchio-okulo-fazialen Syndrom um ein äußerst seltenes, autosomal-dominant vererbtes Krankheitsbild mit variabler Ausprägung handelt, konnte das ursächliche Gen bisher noch nicht identifiziert werden. Bei diesem Syndrom sind vor allem kraniofaziale Fehlbildungen wie post-/ supraaurikuläre oder zervikale Hautdefekte, Augenanomalien, Tränen- Nasengangatresien, Gesichtsspalten, breiter Nasenrücken, flache Nasenspitze, dorsalrotierte frühzeitiges abstehende Ergrauen Ohren der sowie Haare), ektodermale aber auch Auffälligkeiten (wie Nierenanomalien und Wachstumsretardierung sowie Seh-, Hör- und Sprachstörungen beschrieben. Anhand der verschiedenartigen Symptome wurde als Ursache eine Verschlussstörung des ersten und zweiten Branchialbogens vermutet. Dies konnte allerdings bis heute noch nicht nachgewiesen werden. In vorangegangenen Arbeiten wurden mögliche Kandidatengene für das BOFS definiert. Diese wurden anhand ihres Expressionsmusters und der Beteiligung an der Embryogenese der beim BOFS betroffenen Organsysteme bestimmt. Auch Gene, welche bei dem BOFS ähnelnden Syndromen (BORS, BOS, TBS) mutiert sind, kamen in Betracht ebenfalls beim BOFS mutiert zu sein. Einige Gene konnten anhand gezielter Untersuchungen als BOFS-Kandidaten ausgeschlossen werden. Mit Hilfe der DNA des größten bekannten, familiären Falles wurde mittels Segregationsanalysen eine genomweite Suche nach BOFS-Kandidaten gestartet. In dieser Arbeit konnten 83% der Gene u.a. die kompletten Autosomen 1, 8, 9, 10, 16, 17 und 20 sowie das X-Chromosom als Kandidaten ausgeschlossen werden. Meine Arbeit zielte darauf ab, mittels Mikrosatellitenmarkern durchgeführte Kapillarelektrophoresen und anschließendem Vergleich der Haplotypen innerhalb einer sechsköpfigen drei-Generationen-Familie (drei gesunde und drei erkrankte Individuen), unter Einbezug der bisher veröffentlichten Daten, die möglichen Kandidatenregionen weiter einzugrenzen sowie weitere Chromosomen komplett oder teilweise auszuschließen. Nach Erhalt potenzieller Kandidatengene sollte als nächster Schritt eine Sequenzierung bestimmter Genregionen folgen, um ein Gen als tatsächlichen Kandidaten zu identifizieren und zu charakterisieren. 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. BOFS-Familie und DNA Für die Durchführung meiner Arbeit wurde mir freundlicherweise die DNA einer Familie mit Branchio-Okulo-Fazialem-Syndrom (BOFS) von Dr. Stalker von der Universität Gainesville (Florida, USA) zur Verfügung gestellt. Die Familie setzt sich aus drei gesunden (RW, TW und DPS) und drei am BOFS erkrankten (BB, RP und DPJ) Personen zusammen. Dass die Personen auch wirklich am BOFS erkrankt sind, wurde mir von dem Syndromologen, Dr. Müller, aus der Medizinischen Genetik Chemnitz bestätigt. Zum besseren Verständnis und zur genaueren Übersicht füge ich meiner Arbeit den Stammbaum der Familie bei (s. Abbildung 4). Abbildung 4: Stammbaum der Familie mit Branchio-Okulo-Fazialem-Syndrom. 1=Großvater RW, 2=Großmutter BB 4=Tante TW, 3=Mutter RP, 5=Vater DPS 6=Sohn DPJ (RW, BB, TW, RP, DPS und DPJ sind jeweils die Initialen der entsprechenden Person, S = Senior, J = Junior) 27 2. Material und Methoden Weitere BOFS-Fälle 28 wurden zur ergänzenden Mutationssuche mittels Sequenzierung herangezogen. Die DNA zweier weiterer familiärer Fälle stammte aus Chemnitz bzw. aus Belgien und wurde mir von Dr. Müller, Medizinische Genetik Chemnitz bzw. Dr. Sznajer, Pädiatrische Klinische Genetik in Brüssel zur Verfügung gestellt. Ein weiterer möglicherweise familiärer Fall stammt von Prof. Dr. Lyonnet aus Frankreich (genetische Abteilung der Neckar-Enfants-MaladesKlinik, Paris). Des Weiteren hatte ich die DNA zweier sporadischer Fälle, welche mir von Dr. Dellnitz aus Philippsburg und Dr. Baumann, genetische Abteilung der Robert-Debré-Klinik in Paris, zugesandt wurden. Für die Durchführung von Untersuchungen an der DNA der Familien und der anderen BOFS-Fälle lag das positive Votum der Ethikkommission der Universität Ulm vor (Aktenzeichen 114/2004). Zudem liegt von allen erkrankten Personen eine Einverständniserklärung vor, Bilder veröffentlichen zu dürfen, auf denen sie abgebildet sind. 2.1.1.1. Patientenbeschreibungen Zur Einschränkung der möglichen Kandidaten-Genregion verwendete ich die DNA des familiären Falles aus Florida. In dieser Familie gibt es drei erkrankte Personen aus drei Generationen (s. Abbildung 4). Bei der Person DPJ (s. Abbildung 1 auf S. 3) handelt es sich um ein einjähriges, männliches Kind, welches folgende Merkmale aufweist: zervikale Hautveränderungen beidseits, okuläre Anomalien am rechten Auge (Kolobome der Iris, der Retina sowie des Sehnervs und Mikrophthalmie), faziale Veränderungen wie aurikuläre Malformationen, geringgradig ausgeprägtes charakteristisches Gesicht sowie ein verkürztes Philtrum und eine beidseits ausgeprägte Gehörschädigung. Seine Mutter (RP, s. Abbildung 5) ist 25 Jahre alt und hat ebenfalls zervikale Hautveränderungen, allerdings nur rechtsseitig. Ansonsten zeigen sich bei ihr lediglich aurikuläre Malformationen und frühzeitig ergraute Haare [138]. Bei der Großmutter (BB) sind folgende Symptome beschrieben: zervikale (=Branchialspalten) und unilaterale Gehörlosigkeit. Hautveränderungen 2. Material und Methoden 29 Abbildung 5: Familiärer Fall mit Branchio-Okulo-Fazialem-Syndrom aus Florida, USA. Zur Mutationssuche verwendete ich die DNA der weiteren BOFS-Fälle. Bei dem zweiten familiären Fall aus Belgien sind Mutter und Tochter erkrankt. Die Mutter (VL, s. Abbildung 6) ist 33 Jahre alt und ihre Eltern sind gesund. Bei ihr zeigen sich eine Pseudospalte, eine Gaumenspalte sowie eine kongenitale Hypoplasie der rechten Niere. Des weiteren ist bei ihr ein Ergrauen der Haare im Alter von 19 Jahren, eine zunehmende Schwerhörigkeit und eine psycho-affektive Instabilität beschrieben. Die Intelligenz ist nicht gemindert. Der Vater (JC) ist nicht mit VL verwandt und gesund. Bei der Tochter (ML, s. Abbildung 6) ist eine intrauterine Wachstumsretardierung bekannt. Sie wurde in der 37. Schwangerschaftswoche (SSW) mit einem Gewicht von 1500 g (10.-25. Perzentile), einer Länge von 42 cm (unterhalb der 3. Perzentile) und einem Kopfumfang von 31 cm (unterhalb der 3. Perzentile) geboren. Sie zeigt eine rechtsseitige Gaumenspalte, eine linksseitige Nierenatrophie, Mikrophthalmie, Gehörlosigkeit und weitere BOFS-Eigenschaften wie Hypertelorismus, asymmetrisches Gesicht mit fazialer Lähmung sowie eine zweilappige Nase. Außerdem wurde kernspintomographisch eine linksseitige Augapfelatrophie mit ektoper Linse beschrieben. 2. Material und Methoden 30 Abbildung 6: Familiärer Fall aus Belgien (Tochter ML: auf den beiden linken Bildern; und Mutter VL: rechts) (ML und VL = Initialen der Personen). Die DNA der dritten Familie stammt aus Chemnitz. Zum besseren Verständnis füge ich im Anhang den Stammbaum der Familie hinzu (Abb. 35). Diese Familie wurde bereits 1995 beschrieben [117]. Die Familie besteht aus fünf am BOFS erkrankten und zwei gesunden Personen. Der Vater (408) ist gesund und nicht mit der Mutter (404) verwandt. Bei der Mutter sind ein Iriskolobom rechts, Gruben in der rechten Ohrmuschel, Hypertrophie des lateralen Philtrum, normales Wachstum und normale Intelligenz sowie ein frühzeitiges Ergrauen der Haare beschrieben. Ihr erstgeborenes Kind (406, s. Abbildung 7) ist männlich und hat folgende Symptome: rechtsseitige Mikrophthalmie mit Iris- und chorioretinalen Kolobomen, bilaterale Tränennasengangstenosen mit rekurrierenden Dakryozystitiden, Katarakt, Strabismus, tief stehende, rotierte Ohrmuscheln, einige tiefe Spalten posterior des Ohrläppchens, Pseudospalte, bilaterale zervikale Hautveränderungen und frühzeitiges Ergrauen (mit 16 Jahren). Er hat mit einer gesunden, unverwandten Frau (402) zwei ebenfalls erkrankte Kinder: eine Tochter (413) mit Mikrophthalmie rechts mit Iris- und Choroidkolobomen, Choroidkolobom links, Tränennasengangstenose, tief sitzende nach posterior rotierte Ohrmuscheln mit nach oben gedrehten Läppchen und kleine zervikale Hautveränderungen und einen Sohn (412) mit bilateralen Lippen- und Gaumenspalten, rechtsseitige Anophthalmie, linksseitige Mikrophthalmie mit Iris-, chorioretinalen und Sehnervkolobomen, Tränennasengangstenose, malformierte Ohrmuscheln und kleine postaurikuläre aplastische Hautdefekte. Seine Schwester (410, s. Abbildung 7) wurde mit schütterem Haar, Pseudospalte, Nasenmalformationen, flacher 2. Material und Methoden Nasenspitze, 31 Mikrophthalmie rechts mit Iris- und Choroidkolobomen, Irishypoplasie links, Linsenaplasie links, Tränennasengangstenose, tief sitzende nach posterior rotierte Ohrmuscheln mit nach oben gedrehten Läppchen und postaurikulären Hautveränderungen beschrieben. [117] Abbildung 7: Familiärer Fall aus Chemnitz (oben: Person 406, unten: Person 410) Die DNA eines weiteren u.U. familiären Falles (evtl. ist die Großmutter der untersuchten Patientin ebenfalls an BOFS erkrankt) stammt von einer weiblichen Patientin (13 Jahre alt, AA). Bei ihr sind folgende Symptome beschrieben: aurikuläre Fisteln, Lippen- und Gaumenspalten, Branchialsinus, zervikale aplastische Hautdefekte, Ohranomalien, Gehörlosigkeit, asymmetrische Nase mit breitem Nasenrücken und abgeflachter Nasenspitze, Mikrophthalmie, Tränennasengangstenose und Nierenanomalien. Die Eltern stammen ebenfalls aus Frankreich. 2. Material und Methoden Bei dem ersten sporadischen Fall aus Phillipsburg (s. Abbildung 8) sind beidseitige postaurikuläre Defekte, Iris- und chorioretinale Defekte rechts, Mikrophthalmie rechts, eine schmale Lidachse, Katarakt, eine hohe Stirn und eine unilaterale Lippenspalte links bekannt. [229] Abbildung 8: Sporadischer Fall aus Phillipsburg. Der zweite sporadische Fall ist männlich (15 Jahre, IA, s. Abbildung 9) und zeigt aurikuläre Fisteln, Pseudospalten, nach posterior rotierte, tief stehende Ohren, eine asymmetrische Nase mit breitem Nasenrücken und abgeflachter Nasenspitze sowie Iriskolobome. Beide Eltern sind gesund und stammen aus Algerien. Tabelle 4 zeigt eine Zusammenfassung der Patientenbeschreibungen. Abbildung 9: Sporadischer Fall aus Frankreich (Person IA). (IA = Initialen der Person) 32 2. Material und Methoden 33 Tabelle 4: Symptome der untersuchten Patienten. AD = autosomal dominant, s = sporadisch, K = Kolobom, m = männlich, w = weiblich, + = Symptom vorhanden, - = Symptom nicht vorhanden (BB, RP, DPJ, VL, ML, AA, IA = Initialen der Personen). RP DPJ VL ML 404 406 410 412 413 AA IA burg Symptome BB Phillips- Personen Vererbungsmodus A D - A D - A D - A D - A D - A D + A D + A D + A D - A D - s s s? - + + - - - + + - - - + - + - + - - - + - - + + - - - + +/- - + + - - - - - - - + - +/- - - - - - - - - - - - - + + + + - - - + - + + + - + - - - - - - - - - - + + - - + + - - - + + + + + + +/- + - + + + - - - - - - - + - - - - + - - + - - - + + - - K - + K - - - + K + + - + K + K - + K + + - + K + - - + - + - + - + + - - - - - - - - - + + - - - - - - - + w w m w w w m w w m w Postaurikuläre Gruben/Fisteln Lippenmit/ohne Gaumenspalten Pseudospaltbildung der Oberlippe Oberlippengruben Bilaterale postaurikuläre zervikale Branchialbögendefekte Spalten/Sinus/Zysten der Branchialbögen Zervikale/supraaurikuläre Defekte mit aplastischer Haut Hämangiomatöse, vernarbte Haut Tiefsitzende Ohren mit Rotation nach posterior Gehörlosigkeit (sensorineural, Schallleitungsschwerhörigkeit, gemischt) Fehlgebildete, asymmetrische Nase, mit breiter Basis und flacher Spitze Mikrophthalmie/ Kolobome (K) Tränen-NasengangStenose Vorzeitiges Ergrauen der Haare Nierenagenesie Nierenaplasie, -hypoplasie oder -dysplasie Geschlecht m w 2. Material und Methoden 34 2.1.2. Extraktion von DNA Lysepuffer 155 mM NH4Cl 10 mM KHCO3 0,1 mM EDTA-Na2 pH 7,4 (mit HCl oder NaOH) SE-Puffer [178] 75 mM NaCl 25 mM EDTA-Na2 pH 8,0 (mit NaOH) 10% Dodecylsulfat Na-Salz (SDS), 10g/100ml Serva, Heidelberg Proteinase K, 100mg in 10ml SE-Puffer (10 mg/ml) Sigma, München 6M NaCl 100% EtOH 70% EtOH TE-Puffer [179] (10x) 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 10 mM EDTA-Na2, pH 7,6 2.1.3. PCR 2.1.3.1. Primer 2.1.3.1.1. Primer für die Fragmentanalyse Zur Durchführung der PCR und Fragmentanalysen stand mir das ABI PRISM Linkage Mapping Set Version 2.5 von Applied Biosystems, Weiterstadt, zur Verfügung. Dieses Kit beinhaltet ca. 400 fluoreszenzmarkierte Primerpaare, die mit drei verschiedenen Farbstoffen ([FAM], [VIC] bzw. [HEX] und [NED]) markiert sind. Die Marker dieses Sets sind in 28 Panels unterteilt und haben ein mittleres Auflösungsvermögen von 10 cM im menschlichen Genom. ABI PRISM Primer v2.5 MD10 Applied Biosystems, Weiterstadt ABI PRISM True Allele PCR-Premix Applied Biosystems, Weiterstadt Kontroll-DNA CEPH 1347-02 Applied Biosystems, Weiterstadt Kontroll-DNA JR (50ng/µl weiblich) Inst. Humangenetik, Universität Ulm Kontroll-DNA WJ (50ng/µl männlich) Inst. Humangenetik, Universität Ulm 2. Material und Methoden 35 Zusätzlich wurden weitere Primer aus dem ABI PRISM Linkage Mapping Set v2.5 HD5 eingesetzt, die eine Auflösung von 5 cM besitzen. Tabelle 5: Zusätzlich eingesetzte Primer. Chromosom Primer Farbe 3 D3S3725 NED 4 D4S3042 FAM 6 D6S1660 VIC 6 D6S1721 FAM 6 D6S291 FAM 6 D6S1617 NED 6 D6S259 FAM 7 D7S2476 VIC 7 D7S2459 FAM 11 D11S914 VIC 11 D11S4102 FAM 12 D12S367 VIC 12 D12S1638 VIC 14 D14S1054 VIC 14 D14S1050 NED 15 D15S1014 NED 15 D15S212 NED 18 D18S465 FAM 18 D18S1127 FAM 18 D18S1147 FAM 19 D19S894 NED 19 D19S572 FAM 21 D21S1899 FAM Des Weiteren wurde der Primer D19S209 (Chromosom 19, Farbe: FAM) der Firma Biomers, Ulm verwendet. Zur weiteren Eingrenzung wurden folgende Primer anhand der NCBI-Datenbank definiert und bestellt: D6S260 (Chromosom 6, Farbe: FAM), D6S1713 (Chromosom 6, Farbe: HEX), D3S3695 (Chromosom 3, Farbe: FAM), D2S205 (Chromosom 2, Farbe: FAM), D2S2166 (Chromosom 2, Farbe: FAM). 2. Material und Methoden 36 2.1.3.1.2. Primer für die Sequenzierung Für die Durchführung der Sequenzierung wurden folgende Primer eingesetzt: in 5'=>3'-Richtung: Tabelle 6: Primer für die Sequenzierung (UTR = untranslated region, V = vorwärts, R = Rückwärts, Cds = coding sequence, bp = Basenpaare, A = Adenin, G = Guanin, T = Thymin, C = Cytosin, 5’ = DNA-Ende mit Phosphatrest , 3’ = DNA-Ende mit OH-Gruppe). Exon Primer Produktlänge Exon 1 V: 5’-AGGAGGATTTGCCTAAGCGATTCC-3’ 251 bp Transkript- R: 5’-CGCGCCTCACCTACGACTCC-3’ variante a Exon 1 V: 5’-TCCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCAC-3’ Transkript- R: 5’- TTTCCCCCATTCTTAGGCACAGC-3’ 472 bp variante b Exon 1 V: 5’-GAGCGTCGGCGCCGTGACTGG-3’ Transkript- R: 5’-TGGGGTGGGGGATGCAAATGGAGA-3’ 313 bp variante c Exon 2 V: 5’-CGATTTCCCACGCAGACT-3’ 748 bp R: 5’-AGGGAGCTCCAGAAACCATTG-3’ Exon 3 V: 5’-AATTCCAATAAGCCAAGATGAGATG-3’ 369 bp R: 5’-GCTGATTATTTAAGCATTGCTGTTC -3’ Exon 4 V: 5’-AGCCGGACGGAAAAGCGGGGACTGT-3’ 590 bp R: 5’-GCTCGCGGGAAAGCAGCGGAGAGC-3’ Exon 5 V: 5’-TCAGTTTTTGAAAGCACATTTTAGG-3’ 427 bp R: 5’-AAAGAAGGAAGAAGGATGGAGGTAT-3’ Exon 6 V: 5’-TTGGCCCTCTAGGAGAAGTGGTCAT-3’ 449 bp R: 5’-GGAAAACAAGGGAGAAGGAAGAGCA-3’ Exon 7 V: 5’-CGGCTGGATCCCGGCAGAGGTAGC-3’ 640 bp R: 5’-GGTGTGGGAGCGGGTGGGGAGGTC-3’ Exon 7 Cds V: 5’-GACAAAATGTACCTCAGCAACAACC-3’ 548 bp R: 5’-TATGTAAGGGAAGGTGGTGACTCAG-3’ Exon 7 V: 5’-TAAGAGAACAGAACAGGCCGTGAAG-3’ 3’-UTR R: 5’-TCCCCCAAACACTGGATTTC-3’ Exon 7 V: 5’-CTTGAACTTTCTCTGGCAACACGAT-3’ 3’-UTR R: 5’-ATACTTGAGGGAAACAATGGGTTCA-3’ 597 bp 907 bp 2. Material und Methoden 37 2.1.3.2. Chemikalien und Lösungen Taq DNA-Polymerase (Woodoo) T. Trautmann, Prof. W. Just, Inst. Humangenetik, Universität Ulm dNTP 20mM GE Healthcare, Freiburg Amersham-Taq GE Healthcare, Freiburg Standard-MgCl2-Mix 10x: 1,5 mM: 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 0,5 M KCl 15 mM MgCl2 0,1 % Gelatine 2,5 mM: 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 0,5 M KCl 25 mM MgCl2 0,1 % Gelatine 3,0 mM: 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 0,5 M KCl 30 mM MgCl2 0,1 % Gelatine 5,0 mM: 1 M Tris-HCl, pH 8,5 0,5 M KCl 50 mM MgCl2 0,1 % Gelatine 2.1.4. Komponenten für die Agarose-Gelelektrophorese 2% Agarose NEEO TBE-Puffer pH 8,0 (5x) Roth, Karlsruhe 0,4M Tris 0,4M Borsäure 10mM EDTA-Na2 , pH 7,6 2. Material und Methoden 38 Ladepuffer [180] 50% (w/v) Saccharose Merck, Darmstadt 0,1%(w/v) Bromphenolblau pH 7,0 Merck, Darmstadt 0,1%(w/v) Xylencyanol FF Sigma, München in 10 mM Tris-Cl, pH7,6 Loading Dye, Blue/Orange (6x) Promega, Mannheim DNA-Längenstandard PhiX174 DNA/ Hae III Ethidiumbromid (10mg/ml) Promega, Mannheim Roth, Karlsruhe 2.1.5. Komponenten für die Kapillarelektrophorese EDTA-Puffer (10x) Applied Biosystems, Weiterstadt Hi Di Formamid Applied Biosystems, Weiterstadt Genescan 400 [HD Rox] Size Standard Applied Biosystems, Weiterstadt Genescan-500ROX Size Standard Applied Biosystems, Weiterstadt Thermo-fast Detection Plate (96-well-Plate) ABgene, Hamburg 2.1.6. Komponenten für die Sequenzierung NaAc (3M pH 5,2) EtOH 70% 2.1.7. Kits ABI Kit: ABI PRISMLinkage Mapping Set v2.5 MD10 Applied Biosystems, Weiterstadt ABI PRISMLinkage Mapping Set v2.5 MD5 Applied Biosystems, Weiterstadt ABI PRISM True Allele PCR-Premix Applied Biosystems, Weiterstadt Kontroll-DNA CEPH 1347-02 Applied Biosystems, Weiterstadt 2. Material und Methoden 39 Genomiphi Kit: Illustra GenomiPhi HY DNA Amplification Kit GE Healthcare, Freiburg Sequenzierung: Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit GE Healthcare, Freiburg GC-Rich PCR-System Roche, Mannheim ABI PRISM®BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (BDT) Big Dye® Terminator v.3.1. Cycle Sequencing RR-100 Big Dye® Terminator v.1.1., v.3.1. 5x Sequencing Buffer Applied Biosystems, Weiterstadt 2.1.8. Geräte GeneAmp PCR-System 9600 Perkin&Elmer, Wellesley USA RoboCycler Gradient 96 Stratagene, Heidelberg ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer Applied Biosystems, Weiterstadt Geldokumentationssystem Kodak Digital Science DC 120 Life Technologies, Karlsruhe Eppendorf Zentrifuge 5402 Eppendorf AG, Hamburg Labofuge 400, Function Line Heraeus/Kendro Laboratory Products, Megafuge 1.0 RS Hanau Kendro Laboratory Products, Osterode Gel-Elektrophorese Power Supply: Consort E 831 LTF, Konstanz Consort E 425 LTF, Konstanz Photometer Gene Quant GE Healthcare, Freiburg Mastercycler gradient Eppendorf AG, Hamburg Thermal sequencer FTS960 Corbett Research LTF, Konstanz PTC-100™ Programmable Thermal Controller MJ Research Inc., Watertown USA 2. Material und Methoden 40 2.1.9. Computerprogramme Kodak Digital Science™ 1D Image Analysis Software Life Technologies, Karlsruhe Excel Platten Editor Dr. C. Maier, Inst. Humangenetik, Universität Ulm GeneScan Applied Biosystems, Weiterstadt GenoTyper Applied Biosystems, Weiterstadt Cyrillic v.2.1.3 Cyrillic Software, Oxfordshire UK SimWalk2 v.2.91 [197,198] HaploPainter V. 029.5 [209] SeqScape Applied Biosystems, Weiterstadt 2.1.10. Datenbanken NCBI: OMIM [130] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim Map View http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/ SNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ Transkriptisoformen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez?db=nuccore GDB (Genome Data Base) http://www.gdb.org Genome-Browser http://genome.ucsc.edu/ Ensembl http://www.ensembl.org Swissprot-EBI http://www.expasy.org/sprot Genecards http://www.genecards.org 2.2. Methoden 2.2.1. DNA-Extraktion aus EDTA-Blut (NaCl-Methode, nach Miller) [137] Um DNA zu gewinnen, wurden zunächst 10 ml Blut mit Hilfe einer EDTAMonovette (um die Koagulation durch Entzug von Ca-Ionen zu verhindern) entnommen. Zunächst wurden dem Blut 30 ml Lysepuffer zugegeben, auf Eis 30 2. Material und Methoden 41 Minuten inkubiert und anschließend bei 1000 rpm und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml Lysepuffer resuspendiert und abermals auf Eis für 10 Minuten inkubiert und zentrifugiert (1000 rpm, 10 Minuten, 4°C). Das anschließend erhaltene Pellet wurde in 5 ml SEPuffer resuspendiert und mit 500 µl 10% SDS sowie 30 µl Proteinase K (10 mg/ml) versehen um Proteine zu fällen. Über Nacht wurde die Lösung bei 55°C im Schüttel-Wasserbad inkubiert. Am folgenden Tag wurden 1,5 ml 6M NaCl zugegeben, die Lösung 15 Sekunden gevortext und im Anschluss 15 Minuten bei 4500 rpm und 20°C zentrifugiert. Nachdem der Überstand klar war, wurde dieser in ein frisches Gefäß überführt und mit 2 Volumen 100% Ethanol bei Raumtemperatur gefällt, um Salze und DNA-Bruchstücke zu entfernen und eine Konzentrierung zu erzielen. Die DNA-Wolke konnte nun mit einem Spatel entnommen und mit 70% Ethanol gewaschen werden, um die Salzkonzentration zu vermindern. Nachdem die DNA bei Raumtemperatur getrocknet war, wurde sie in 100 µl 1x TE-Puffer gelöst (1 Stunde bei 37°C oder über Nacht bei 4°C). Nach anschließender Konzentrationsmessung konnte die DNA für weitere Untersuchungen eingesetzt werden. 2.2.2. Messung der DNA-Konzentration mittels Absorptionsspektrometrie Um herauszufinden, in welcher Konzentration die mir von Dr. Stalker zur Verfügung gestellten DNA-Verdünnungen vorlagen, führte ich Messungen der optischen Dichte der DNA im Photometer durch. Hierzu wurde das Gerät zunächst mit 50 µl Wasser geeicht und anschließend die DNA in einer 1:50-Verdünnung gemessen, wobei die Extinktion (optische Dichte = OD) bei 260 nm (Absorptionsmaximum der Nukleinsäuren) und bei 280 nm (als Maß für die Verunreinigung, da bei dieser Wellenlänge sowohl Proteine, als auch DNA erfasst werden) gemessen und der Quotient aus beiden Werten ( = Ratio) bestimmt wurde, um die Reinheit der DNA zu ermitteln. Die Konzentration der DNA konnte nun durch Multiplikation der Extinktion bei 260 nm mit dem Verdünnungsfaktor und einem spezifischen Multiplikationsfaktor für doppelsträngige DNA errechnet werden (nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz). 2. Material und Methoden 42 2.2.3. DNA-Amplifikation mittels GenomiPhi Da die DNA, die mir freundlicherweise von Dr. Stalker für diese Arbeit zur Verfügung gestellt wurde, nur in sehr geringer Menge und Konzentration vorhanden war, musste sie zunächst mittels GenomiPhi (GenomiPhi Amplification Kit) amplifiziert werden. Dieses Kit ermöglicht die exponentielle Vervielfältigung durch lediglichen Einsatz einer sehr geringen Menge linearer DNA mit Hilfe der DNA-Polymerase des Bakteriophagen Phi29. Die Strangsynthese erfolgt an denaturierten DNA-Strängen an mehreren Stellen gleichzeitig, sodass große Mengen an ca. 10 kB großen DNA-Stücken entstehen. Ich verwendete diese Methode um DNA-Verdünnungen der sechs Mitglieder der BOFS-Familie zu amplifizieren. Hierzu wurden die Proben, welche sich aus 2,5 µl DNA (ca. 10 ng/µl) und 22,5 µl Probenpuffer zusammensetzten, zunächst bei 95°C für 3 Minuten hitzedenaturiert und anschließend auf Eis inkubiert. Währenddessen wurde der Mastermix vorbereitet. Dazu wurden 135 µl Reaktionspuffer mit 15 µl Enzym gemischt und auf Eis gestellt. Je gekühlte Probe wurden nun 25 µl Mastermix zugegeben, sodass ein Gesamtvolumen von 50 µl vorlag. Während einer Inkubationszeit von 4 Stunden bei 30°C wurde die DNA vervielfältigt. Danach erfolgte die Hitzedenaturierung der Polymerase bei 65°C für 10 Minuten mit anschließender Abkühlung auf Eis. Um zu überprüfen, ob die Amplifikation erfolgreich verlaufen ist, wurde eine Test-PCR mit 5 mM MgCl2-Mix und unterschiedlichen DNA-Konzentrationen durchgeführt, im Anschluss auf 2% Agarosegel NEEO aufgetragen, in Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Zur Kontrolle führte ich die PCR und Gelelektrophorese auch mit Kontroll-DNA durch, die nicht GenomiPhi-amplifiziert wurde (100 ng/µl, männlich). Zur folgenden Aufreinigung der GenomiPhi-DNA wurde das Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit von GE Healthcare verwendet. Hierzu wurden zu jeder Probe 500 µl Capture buffer (Ladepuffer) zugegeben und kräftig gemischt. Anschließend wurde die Lösung auf eine Säule pipettiert und bei 1300 rpm 30 Sekunden lang zentrifugiert. Dieses Verfahren beruht darauf, dass die doppelsträngige DNA an der Glasfasermembran haften bleibt, wohingegen Nukleotide oder Enzyme die Säule passieren. Die nach der Zentrifugation im Collection Tube enthaltene Flüssigkeit wurde verworfen, 500 µl Washbuffer auf jede Säule pipettiert und erneut bei 1300 rpm für 30 Sekunden zentrifugiert, um 2. Material und Methoden 43 jetzt noch enthaltene Kontaminationen zu entfernen. Im Anschluss an die Zentrifugation wurde die Säule auf ein neues Gefäß überführt und mit 50 µl PCRWasser versehen. Nach einminutiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde abermals bei 1300 rpm 1 Minute zentrifugiert. Dieser Schritt dient der Herauslösung der DNA aus der Membran. Daraufhin wurde wieder eine Test-PCR mit verschiedenen DNA-Konzentrationen (der DNA der Familienmitglieder und der Kontroll-DNA) durchgeführt, auf 2% Agarosegel NEEO aufgetragen, in Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Da die Amplifikation gut funktioniert hat, konnte ich für meine folgenden PCR eine 1:20-Verdünnung der amplifizierten DNA einsetzen. 2.2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) [177] Die Polymerase-Kettenreaktion dient der exponentiellen Vervielfältigung definierter DNA-Abschnitte mit Hilfe der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase, welche aus dem Bakterium Thermus aquaticus stammt, und besteht aus drei Reaktionsschritten. Zu diesen gehören die Denaturierung (hierbei wird die doppelsträngige Template-DNA durch Erhitzen auf ca. 95°C in ihre Einzelstränge aufgetrennt), das Annealing (die Temperatur wird auf etwa 55°C gesenkt, damit sich die Primer an die einzelsträngige Template-DNA anlagern können) und die Elongation (nach leichter Erhöhung der Temperatur auf 72°C kann die TaqPolymerase optimal arbeiten und somit einen neuen zum Template-DNA-Strang komplementären DNA-Strang synthetisieren, sodass wieder ein Doppelstrang vorliegt). Diese drei Schritte können nun beliebig oft wiederholt werden. 2.2.4.1 PCR für die Fragmentanalyse Für die Durchführung der PCR verwendete ich folgendes Reaktionsgemisch (Applied Biosystems, Weiterstadt): 3,8 µl H20 9 µl PCR Premix 1 µl Primer 1,2 µl DNA_________ 15 µl Gesamtvolumen 2. Material und Methoden 44 Wenn ich die nach GenomiPhi™ amplifizierte DNA eingesetzt habe, verwendete ich meistens eine 1:20-Verdünnung und folgendes Reaktionsgemisch (Applied Biosystems, Weiterstadt): 4 µl H20 9 µl PCR Premix 1 µl Primer 1 µl DNA_________ 15 µl Gesamtvolumen Nur in seltenen Fällen, in denen die PCR nicht optimal amplifizierte, verwendete ich eine 1:10-Verdünnung. Für die meisten Primerpaare konnte ich folgendes PCR-Programm verwenden: In der PCR-Maschine von Perkin&Elmer: 1) bei 95°C 12 Minuten 1 Zyklus Denaturierung 2) bei 94°C 15 Sekunden Denaturierung 3) bei 55°C 15 Sekunden Annealing 4) bei 72°C 30 Sekunden Elongation 2) - 4) 10 Zyklen 5) bei 89°C 15 Sekunden Denaturierung 6) bei 55°C 15 Sekunden Annealing 7) bei 72°C 30 Sekunden Elongation 5) - 7) 20 Zyklen 8) bei 72°C 10 Minuten 1 Zyklus 9) bei 4°C Elongation --- War die PCR nach diesem Schema nicht erfolgreich, etablierte ich die PCR der entsprechenden Primer mit dem Stratagene RoboCycler® durch Variation der Annealingtemperatur: 2. Material und Methoden I. bei 95°C 12 Minuten II. bei 94°C 15 Sekunden 47°C-58°C 15 Sekunden bei 72°C 30 Sekunden III. bei 72°C 10 Minuten IV. bei 6°C --- 45 1 Zyklus Denaturierung Denaturierung 30 Zyklen Annealing Elongation 1 Zyklus Elongation Außerdem konnte durch Veränderungen der jeweiligen Zeiten für die jeweiligen Primer die PCR-Bedingungen optimiert werden. Durch Auftragen auf ein 2% Agarosegel NEEO mit anschließender Färbung und Fotografie konnte ich die beste Annealing-Temperatur für die jeweiligen Primer ermitteln und dann die PCR mit dieser Annealing-Temperatur entweder im Stratagene RoboCycler® oder in der PCR-Maschine von Perkin&Elmer durchführen. Tabelle 7 zeigt die optimierten PCR-Bedingungen. Tabelle 7: PCR-Bedingungen der Primer D4S2964, D6S422, D15S212 und D19S894 (PCR = Polymerase chain reaction). Primer PCR-Bedingung PCR-Maschine D4S2964 1. 95°C 12 Min: Denaturierung 2. 94°C 15 Sek: Denaturierung 3. 52°C 15 Sek: Annealing 4. 72°C 30 Sek: Elongation 2.-4. 30 Zyklen 5. 72°C 10 Min: Elongation 1. 95°C 12 Min: Denaturierung 2. 94°C 15 Sek: Denaturierung 3. 54°C 15 Sek: Annealing 4. 72°C 30 Sek: Elongation 2.-4. 30 Zyklen 5. 72°C 10 Min: Elongation 1. 95°C 12 Min: Denaturierung 2. 94°C 15 Sek: Denaturierung 3. 52°C 15 Sek: Annealing 4. 72°C 30 Sek: Elongation 2.-4. 10 Zyklen 5. 89°C 15 Sek: Denaturierung 6. 52°C 15 Sek: Annealing 7. 72°C 30 Sek: Elongation 5.-7. 20 Zyklen 8. 72°C 10 Min: Elongation 1. 95°C 12 Min: Denaturierung 2. 94°C 15 Sek: Denaturierung 3. 49°C 15 Sek: Annealing 4. 72°C 30 Sek: Elongation 2.-4. 30 Zyklen 5. 72°C 10 Min: Elongation Stratagene RoboCycler D6S422 D15S212 D19S894 Stratagene RoboCycler Perkin&Elmer Stratagene RoboCycler 2. Material und Methoden 46 Zur Etablierung der neu bestellten Stammprimer D19S209, D6S260, D6S1713, D3S3695, D2S205, D2S2116 ging ich nach folgendem Schema vor: Für jeden Primer erstellte ich verschiedene PCR-Mixes. Hierzu wurden verschiedene Konzentrationen des MgCl2-Mixes eingesetzt und die PCR-Bedingungen (Temperaturgradient und Zeiten) variiert. Reaktionsgemisch: 3 µl MgCl2-Mix 0,3 µl dNTP 0,3 µl Primer 1 0,3 µl Primer 2 0,6 µl Taq-DNA Polymerase (5 U/µl) 1 µl DNA 24,5 µl H2O______ 30 µl Gesamtvolumen Hierbei betrug die Konzentration des MgCl2-Mixes entweder 1,5 mM (D19S209, D2S205, D2S2166) oder 2,5 mM (D6S260, D6S1713, D3S3695). Für die Primer D19S209, D6S205, D6S1713 und D3S3695 verwendete ich die Woodoo-Taq DNA-Polymerase (5000 U/l) und für die Primer D2S205 sowie D2S2166 die Amersham-Taq-Polymerase. Die PCRs führte ich im Stratagene RoboCycler nach obigem Schema durch. Um die besten PCR-Bedingungen zu erkennen, mischte ich 10 µl der PCR-Produkte mit 5 µl Ladepuffer und trug dies auf ein 2%iges NEEO-Agarosegel auf. Zum Vergleich wurde zusätzlich der Längenstandard ΦX174/HaeIII mit aufgetragen. Nach 30 Minuten (bei 200 V und 300 mA) wurde das Gel in Ethidiumbromid gefärbt und anschließend fotografiert. Im folgenden sind die besten PCR-Bedingungen für die neu bestellten Primer aufgeführt. 2. Material und Methoden 47 Tabelle 8: PCR-Bedingungen der Primer D19S209, D6S260, D6S1713, D2S205 und D2S2166 (PCR = Polymerase chain reaction, mM = Millimolar). Primer Farbe PCR-Bedingungen Konzentration MgCl2-Mix D19S209 FAM 1. 95°C 12 Min: Denaturierung 1,5 mM 2. 95°C 20 Sek: Denaturierung 3. 51°C 20 Sek: Annealing 4. 72°C 30 Sek: Elongation 2.-4. 30 Zyklen 5. 72°C 5 Min: Elongation D6S260 FAM 1. 95°C 5 Min: Denaturierung 2,5 mM 2. 95°C 30 Sek: Denaturierung 3. 51°C 30 Sek: Annealing 4. 72°C 45 Sek: Elongation 2.-4. 35 Zyklen 5. 72°C 5 Min: Elongation D6S1713 HEX 1. 95° 5 Min: Denaturierung 2,5 mM 2. 95° 30 Sek: Denaturierung 3. 51° 30 Sek: Annealing 4. 72° 45 Sek: Elongation 2.-4. 35 Zyklen 5. 72° 5 Min: Elongation D3S3695 FAM 1. 95°C 5 Min: Denaturierung 2,5mM 2. 95°C 30 Sek: Denaturierung 3. 51°C 30 Sek: Annealing 4. 72°C 45 Sek: Elongation 2.-4. 35 Zyklen 5. 72°C 5 Min: Elongation D2S205 FAM 1. 95°C 5 Min: Denaturierung 1,5mM 2. 95°C 30 Sek: Denaturierung 3. 55°C 30 Sek: Annealing 4. 72°C 45 Sek: Elongation 2.-4. 35 Zyklen 5. 72°C 5 Min: Elongation D2S2166 FAM 1. 95°C 5 Min: Denaturierung 2. 95°C 30 Sek: Denaturierung 3. 52°C 30 Sek: Annealing 4. 72°C 45 Sek: Elongation 2.-4. 35 Zyklen 5. 72°C 5 Min: Elongation 1,5mM 2. Material und Methoden 48 2.2.4.2. PCR für die Sequenzierung Auch für die Sequenzierung wurde eine Etablierung der verschiedenen Primer durchgeführt, um die optimalen PCR-Bedingungen zu erfassen. Hierzu wurde nach dem Standard-PCR-Protokoll vorgegangen: 3 µl MgCl2-Mix 0,3 µl dNTP 0,3 µl Primer 1 0,3 µl Primer 2 0,6 µl Woodoo-Taq-DNA Polymerase (5000 U/l) 1 µl DNA 24,5 µl H2O______ 30 µl Gesamtvolumen Anschließend wurde die PCR im Stratagene RoboCycler mit verschiedenen Annealingtemperaturen durchgeführt: I. bei 95°C 5 Minuten II. bei 95°C 30 Sekunden 52°C-72°C 30 Sekunden bei 72°C 45 Sekunden III. bei 72°C 5 Minuten IV. bei 6°C --- 1 Zyklus Denaturierung Denaturierung 35 Zyklen Annealing - Gradient Elongation 1 Zyklus Elongation War eine Etablierung für DNA-Abschnitte, die aufgrund eines hohen [GC%]Gehalts nur schwer zu denaturieren waren, so nicht möglich, führte ich die PCR nach dem PCR-Protokoll des GC-Rich-Kit durch: 2. Material und Methoden Zunächst wurde ein 1,5M-Mastermix 1 erstellt: 7,25 µl H2O 0,25 µl dNTP 0,25 µl Primer 1 0,25 µl Primer 2 7,5 µl Resolution Solution 5 M 2,0 µl DNA (100ng/µl) Gesamtvolumen: 17,5 µl Als nächstes wurde ein zweiter Mastermix pipettiert (Mastermix 2): 5,0 µl GC-Rich Buffer 0,25 µl Enzym 2,25 µl H2O Gesamtvolumen: 7,5 µl Dann wurden pro Reaktion jeweils 7,5 µl Mastermix 2 zu Mastermix 1 hinzu pipettiert und unter den unten aufgeführten PCR-Bedingungen in der PCRMaschine von Perkin&Elmer amplifiziert. Die Annealingtemperatur wurde variiert, sodass ich im folgenden nicht die Temperaturen aufführe. PCR-Bedingungen: 1. bei 98,5°C für 5 Minuten: Denaturierung 2. Annealing für 2 Sekunden 3. bei 69°C für 3 Sekunden: Elongation 1.-3. 20 Zyklen 4. bei 98,5°C + 0,1°C pro Zyklus für 5 Minuten: Denaturierung 5. Annealing für 2 Sekunden 6. bei 69°C für 3 Sekunden: Elongation 4.-6. 15 Zyklen 7. bei 69°C für 10 Minuten: Elongation 8. bei 4°C für 5 Minuten 49 2. Material und Methoden 50 2.2.5. Agarose-Gelelektrophorese Zur Überprüfung, ob die PCR erfolgreich verlaufen ist, führte ich eine AgaroseGelelektrophorese durch. Bei dieser Methode werden Makromoleküle wie DNAFragmente nach ihrer Größe aufgetrennt. Dies beruht auf dem Prinzip, dass die negativ geladenen DNA-Fragmente im Spannungsfeld zur Anode wandern und zwar umgekehrt proportional zu ihrer Größe, d.h. die kleineren Fragmente wandern schneller als die größeren und sind daher im Bild am weitesten unten zu finden. Ich führte die Agarose-Gelelektrophorese mit 2%igen Gelen (Agarose NEEO, Roth) durch. Hierzu versetzte ich, je nach vorhandener Menge an PCRProdukten, 15 µl bzw. 5 µl PCR-Produkt mit einem Ladepuffer (Blue/Orange Loading Dye 6x, Promega) und trug das Gemisch auf das 2%ige Gel auf. Um einen Anhaltspunkt für die Abschätzung der Größe der DNA-Fragmente zu erhalten, trug ich zusätzlich einen DNA-Längenstandard (PhiX174 DNA/ Hae III, Promega) auf. Die Elektrophorese wurde bei einer Feldstärke von 2 V/cm über 30 Minuten durchgeführt. Hierzu wurde 1x TBE als Laufpuffer verwendet. Um die DNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar zu machen, wurde das Gel nach der Elektrophorese für 30 Minuten in Ethidiumbromid (10mg/ml) gefärbt und anschließend für 5 Minuten in Aqua bidest. gewässert, um Kontraste zu verbessern. Nun konnte das Gel mittels Kamera (Kodak DC 120) fotografiert werden und mit Hilfe des Computerprogramms Kodak Digital Science™ 1D Image Analysis Software angesehen und manuell die Kontraste nachbearbeitet werden. 2.2.6. DNA-Fragmentanalyse mittels Kapillarelektrophorese Bei der DNA-Fragmentanalyse werden DNA-Abschnitte einer bestimmten Sequenz untersucht. Häufig werden hierzu Mikrosatelliten verwendet. Dies sind kurze, sich wiederholende (meist zwei bis vier Nukleotide, welche sich 10 bis 100 mal wiederholen), nicht-kodierende DNA-Sequenzen, welche biparental vererbt und auch als short tandem repeats (STR) bezeichnet werden. Anhand der Anzahl der Wiederholungen und somit der Größe des Mikrosatelliten, kann der Genotyp eines Organismus in der Region erstellt werden. Die PCR wurden mit fluoreszenzmarkierten Primerpaaren, d.h. einem vorwärts- und einem rückwärtsgerichteten Primer, mit einem Auflösungsvermögen von 10 cM 2. Material und Methoden 51 durchgeführt. Um die Allelgrößen der verschiedenen PCR-Produkte zu ermitteln, führte ich eine Kapillarelektrophorese in einem automatisierten Sequenziergerät (ABI PRISM® 3100), welches mehrere Proben gleichzeitig analysieren kann, durch. Hierbei werden die mittels PCR amplifizierten, fluorophormarkierten Fragmente über ihre laserinduzierte Fluoreszenz detektiert. Hierzu wurden 15 µl HiDi™ Formamid (Applied Biosystems) mit 0,5 µl GeneScan 400 [HD Rox] Size Standard (Applied Biosystems) gemischt. 15 µl von diesem Mastermix und 1 µl PCR-Produkt wurden in 96-well-Platten überführt. Anschließend wurden die Platten kurz zentrifugiert, dann wurden die PCR-Produkte bei 95°C für 3 Minuten denaturiert, um DNA-Einzelstränge zu erhalten, und sofort auf Eis gestellt, damit sich die DNA-Stränge nicht wieder zusammenlagern. Die daraufhin folgende Analyse wurde schließlich vom ABI PRISM®3100 durchgeführt. Die Steuerung des Gerätes erfolgte anhand von Vorlagen, die im Excel Platten Editor geschrieben wurden. 2.2.7. Auswertung der Fragmentanalyse mit Hilfe von Computerprogrammen Nach durchgeführter Kapillarelektrophorese mittels ABI PRISM® 3100 wurden die Ergebnisse im Computerprogramm GeneScan erfasst. Anschließend konnten die Allelpositionen Computerprogramms der einzelnen GenoTyper® Familienmitglieder definiert, betrachtet anhand und des manuell nachbearbeitet werden. Da die Marker als Dinukleotidrepeats definiert waren, konnte anhand der Peak-Position überprüft werden, wie und ob die Allele richtig unter den Familienmitgliedern vererbt wurden. Anschließend wurden die Allele für die einzelnen Marker in das Computerprogramm Cyrillic v.2.1.3 übertragen und dann in SimWalk2 v.2.91 exportiert. Dieses Programm erstellte mir die wahrscheinlichsten Haplotypen. Um diese anschaulicher zu machen, wurden mittels HaploPainter V.029.5 die Haplotypen der verschiedenen Familienmitglieder in unterschiedlichen Farben dargestellt. 2. Material und Methoden 52 2.2.8. Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese (nach Sanger) [181] Bei der Sequenzierung handelt es sich um eine Methode zur Analyse der Primärstruktur von DNA, wodurch DNA-Sequenzen dargestellt und Mutationen direkt nachgewiesen werden können. Bei der automatischen Sequenzierung wird die DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, wobei sich die Markierung entweder im Primer oder an Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTP), welche zusätzlich zu den Monodesoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) eingesetzt werden, befindet. Bei der Markierung der Didesoxynukleosidtriphosphate kann mittels verschiedener Farbstoffe jedes Didesoxynukleosidtriphosphat andersfarbig markiert werden. Die Farbstoffe werden vom Elektrophorese-Gerät mittels Laser angeregt und anschließend gemessen. Mit dieser Sequenziertechnologie können bis zu 1000 Nukleotide gelesen werden. Zunächst findet bei der Sequenzierung eine lineare Amplifikation (Cycle-Sequencing) statt. Werden nun anstatt der dNTP die farblich markierten ddNTP eingesetzt, so bricht die Kettenverlängerung ab. Diese unterschiedlich langen Ketten werden anschließend von einem ElektrophoreseGerät erkannt und somit die DNA-Sequenz ermittelt. Ich führte die Sequenzierung mit Hilfe des ABI PRISM®BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit durch. Grob kann man die Sequenzierung in sechs Schritte unterteilen: 1. PCR, 2. Reinigung des PCR-Produktes, 3. Sequenzreaktion, 4. Ethanol-Fällung der DNA, 5. Lösen der DNA mit HiDi™ Formamid, 6. Sequenzierung mittels Elektrophoresegerät. Die PCR habe ich nach den oben genannten Bedingungen etabliert und anschließend wie folgt durchgeführt: Tabelle 9 Zeigt die verwendeten PCR-Bedingungen für die einzelnen Primer. 2. Material und Methoden 53 Tabelle 9: PCR-Bedingungen für die Sequenzierprimer (PCR = polymerase chain reaction, mM = Millimolar). Primer PCR-Protokoll Annealing-Temp. PCR-Maschine/Bedingungen Exon 1 Isoform a Standard; 62°C 1,5mM MgCl2-Mix Exon 1 Isoform b RoboCycler® 62°C Standard; 1,5mM MgCl2-Mix Exon 1 Isoform c Standard; GC-Rich-Kit 64°C 1,5mM- Stratagene RoboCycler® 1,5mM MgCl2-Mix Exon 2 Stratagene Stratagene RoboCycler® 54°C Perkin&Elmer 54°C Stratagene Mastermix Exon 3 Standard; 2,5mM MgCl2-Mix Exon 4 GC-Rich-Kit 1,5mM- RoboCycler® 58°C Perkin&Elmer 52°C Stratagene Mastermix Exon 5 Standard; 1,5mM MgCl2-Mix Exon 6 Standard; RoboCycler® 62°C 2,5mM MgCl2-Mix Exon 7 GC-Rich-Kit 1,5mM- Stratagene RoboCycler® 68,1°C Perkin&Elmer 56°C Stratagene Mastermix Exon 7b Standard; 1,0mM MgCl2-Mix Exon 7c Standard; 3,0mM MgCl2-Mix RoboCycler® 52°C Stratagene RoboCycler® Im Anschluss daran reinigte ich zunächst die PCR-Produkte mit Hilfe des Illustra™ GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit. Hierzu wurden zunächst 400 µl Capture Buffer auf die Säule des Collection tube pipettiert, das PCR-Produkt hinzugegeben, gemischt und bei 1300 rpm für 30 Sekunden zentrifugiert. Das Eluat wurde aus der Säule verworfen. Anschließend wurden 400 µl Wasch-Puffer auf die Säule gegeben und erneut bei 1300 rpm für 30 Sekunden zentrifugiert. Danach wurde erneut das Eluat verworfen und bei 1300 rpm 30 Sekunden lang zentrifugiert, um die Säule zu trocknen. Daraufhin wurden 20 µl Ultrapur-Wasser direkt auf die Membran pipettiert und eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Schluss wurde erneut bei 1300 rpm 30 Sekunden lang zentrifugiert. Mit dem nun erhaltenen, gereinigten Template wurde die Sequenzreaktion durchgeführt. 2. Material und Methoden 54 Hierzu wurde folgendes Gemisch erstellt: 2 µl Big Dye® Terminator v.3.1. Cycle 2 µl Big Dye® 5x Sequencing Buffer 1 µl Primer 5 µl Template Gesamtvolumen 10 µl Dieses wurde anschließend in der PCR-Maschine von Perkin&Elmer amplifiziert. Dafür wurde es zunächst eine Minute lang bei 96°C denaturiert. Anschließend wurden 25 Zyklen mit zehn Sekunden Denaturieren bei 96°C, zehn Sekunden Annealing bei 55°C und Elongation bei 60°C für vier Minuten durchlaufen. Zum Schluss wurde die Reaktion bei 4°C gehalten. Zu den Sequenzproben wurden dann 90 µl Aqua bidest. und 10 µl Natriumacetat (3M pH 5,2) gegeben, wodurch die elektrische Ladung der DNA neutralisiert und somit die elektrische Abstoßung der Moleküle verhindert wird. Danach wurde die Probe in ein Eppendorfgefäß überführt, mit 250 µl 70%igem Ethanol gemischt, 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und daraufhin 15 Minuten bei 1300 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Probe erneut mit 200 µl 70%igem Ethanol gewaschen und bei 1300 rpm 15 Minuten zentrifugiert. Jetzt wurde der Überstand erneut verworfen und die Probe im Thermoblock bei 37°C getrocknet. Die nun folgende Lösung der Pellets wurde mit 20 µl HiDi™ Formamid bei 37°C über 10 Minuten durchgeführt. Im Anschluss daran wurden die Proben in eine 96-well-Platte pipettiert. Diese wurde zentrifugiert, bei 95°C denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Zur Analyse der Sequenzierung verwendete ich den ABI PRISM®3100. 2.2.9. Auswertung der Sequenzierung mittels Computerprogrammen Die vom ABI PRISM®3100 ermittelten Sequenzen wurden anschließend mit Referenzsequenzen der NCBI-Datenbank mit Hilfe der SeqScape®-Software verglichen, um Mutationen zu erkennen. Um entdeckte Mutationen zu bestätigen, wurden diese Regionen bei allen Probanden untersucht. Dies war Sequenzvarianten auszuschließen. nötig, um Artefakte oder irrelevante 2. Material und Methoden 55 In meiner Arbeit habe ich keine statistischen Methoden verwendet, da sowohl die Fragmentanalyse, als auch die Sequenzierung auf dem Nachweis von Fakten (beispielsweise werden Mutationen nachgewiesen) Aufgabenstellung bietet sich somit keine Statistik an. beruhen. Bei meiner 3. Ergebnisse 56 3. Ergebnisse Diese Arbeit knüpft an vorangegangene Arbeiten an. Mittels einer genomweiten Suche konnten die möglichen Genregionen, welche für das Branchio-okulo-faziale Syndrom in Frage kommen, über gemeinsame Haplotypen der Erkrankten einer Familie (aus Chemnitz), mittels Segregationsanalyse bereits deutlich eingegrenzt werden [70, 88]. Um die noch möglichen Regionen weiter einzugrenzen, führte ich diese Arbeit an einer weiteren Familie mit BOF-Syndrom durch. 3.1. DNA-Extraktion, -Konzentrationsbestimmung und Amplifizierung Die DNA der Probanden wurde mittels Natriumchloridmethode nach Miller et. al [137] aus 10 ml EDTA-Blut gewonnen. Um einen Anhaltspunkt über die mir zur Verfügung stehende Konzentration der DNA der verschiedenen Familienmitglieder zu bekommen, führte ich Messungen mit einem Photometer durch. Tabelle 10: Ermittelte DNA-Konzentrationen mittels Photometer. (BB = Großmutter, RW = Großvater, TW = Tante, RP = Mutter, DPS = Vater, DPJ = Sohn, die Buchstaben stellen die Initialen der Personen dar, DNA = Desoxyribonucleic acid) Person DNA-Konzentration BB 765 ng/ µl RW 114 ng/ µl TW 50 ng/ µl RP 50 ng/ µl DPS 37 ng/ µl DPJ 50 ng/ µl Da die Konzentration der vorhandenen DNA nicht sehr hoch und somit die Menge an DNA begrenzt war, entschied ich mich dazu, die DNA zu vervielfältigen, um genügend Material für die nachfolgenden Analysen zur Verfügung zu haben. Die Vervielfältigung führte ich nach der GenomiPhi™-Methode durch. Hierbei wurde mittels Φ29-DNA-Polymerase aus 25 ng DNA der Probanden eine erheblich 3. Ergebnisse 57 größere Menge (ca. 25 µg) an DNA hergestellt, welche zudem Konzentrationen von ca. 1000 ng/ µl aufwies. Da kein Unterschied zwischen der Original-DNA und der amplifizierten DNA festgestellt werden konnte, wurden für die weiteren Analysen hauptsächlich die Produkte der Amplifzierung eingesetzt. |Vater DPS | Mutter RP | Sohn DPJ ΦX |Orig.|1:5|1:10|1:20| Orig.|1:5|1:10|1:20| Orig.|1:5|1:10 | Kontrollen | |1:20| Orig.|1:5|1:10|1:20| LW | ΦX Abbildung 10: Vergleich der GenomiPhi™-amplifizierten DNA mit der Original-DNA mittels Gelelektrophorese. (Orig. = Original-DNA, 1:5 = 1:5-Verdünnung der GenomiPhi™-amplifizierten DNA, 1:10 = 1:10-Verdünnung der GenomiPhi™-amplifizierten DNA, 1:20 = 1:20-Verdünnung der GenomiPhi™-amplifizierten DNA, LW = Leerwert, ΦX = Längenstandard PhiX174 DNA/ Hae III, DNA = Desoxyribonucleic acid, DPS, RP, DPJ = Initialen der Personen). 3.2. PCR und Fragmentanalyse Zur Etablierung der neu bestellten Primer erstellte ich verschiedene PCR-Mixes. Hierzu wurden verschiedene Konzentrationen der MgCl2-Mixes eingesetzt und die PCR-Bedingungen (Temperaturgradient und Zeiten) variiert. Nachdem ich alle Primer etabliert hatte, konnte ich die PCR nach den jeweils besten Bedingungen durchführen. Für die Primer aus dem ABI PRISMLinkage Mapping Set verwendete ich folgende PCR-Bedingungen in der PCR-Maschine von Perkin&Elmer: Zunächst wurde bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Anschließend wurden 10 PCR-Zyklen (bei 94°C 15 Sekunden Denaturierung, bei 55°C 15 Sekunden Annealing, bei 72°C 30 Sekunden Elongation) und daraufhin 20 PCRZyklen (bei 89°C 15 Sekunden Denaturierung, bei 55°C 15 Sekunden Annealing, bei 72°C 30 Sekunden Elongation) durchgeführt. Zum Schluss fand bei 72°C für 10 Minuten die Elongation statt. Durch Variation der Annealingtemperatur konnte ich schließlich für alle Primer optimale PCR-Bedingungen festlegen. Neben den Proben der einzelnen BOFS-Familienmitglieder ließ ich bei jeder PCR einen 3. Ergebnisse 58 Leerwert und eine Positivkontrolle (Kontroll-DNA CEPH 1347-02) mitamplifizieren, um die Qualität der PCR zu überprüfen. Um die Allelgröße der verschiedenen Mikrosatellitenmarker aller Familienmitglieder zu bestimmen führte ich eine Kapillarelektrophorese durch. Hierzu wurde 1 µl PCR-Produkt mit einem Längenstandard (Genescan 400 [HD Rox]) gemischt und auf eine Mikrotiterplatte aufgetragen. Mit einem Fluoreszenzsequenziergerät (ABI PRISM®3100) wurden die Proben verarbeitet und anschließend mit einer Software (GeneScan®) erfasst und in Form von unterschiedlich farbigen Peaks sichtbar gemacht. Hierbei entstand für jeden Marker und jedes Familienmitglied eine Peak-Abfolge. Diese Peaks wiesen, je nachdem mit welchem Farbstoff (HEX/VIC, NED oder FAM) der entsprechende Primer markiert war, unterschiedliche Farben auf. Außerdem variierten die Peaks in ihrer Höhe und Größe. Dies kann auf PCR-Artefakte oder Mengenunterschiede an DNA zurückgeführt werden. 3.3. Auswertung an Computerprogrammen Um die Peaks genauer untersuchen zu können, wurden die Daten in eine andere Software (GenoTyper®) importiert und dort genauer betrachtet. In diesem Programm wurden anhand der mitgeführten Längenstandards die Allelgrößen der verschiedenen Familienmitglieder bestimmt, da zu den entsprechenden Peaks die ungefähre Basenpaaranzahl angegeben wurde. Nach vorsichtiger manueller Überarbeitung - wie beispielsweise Abgleichen der Position der Peaks, wobei aufgrund der Tatsache, dass es sich um Mikrosatelliten mit CA-Motiv handelt, alle Allele ein Vielfaches von zwei sein müssen - wurde somit für jede Person die Position der Allele für den entsprechenden Marker definiert. Daher konnte der Erbgang überprüft werden und für jedes Individuum festgestellt werden, ob es homo- (ein Peak) oder heterozygot (zwei Peaks) in diesem Bereich ist. Bereits hier sind schon zwei Marker zu erwähnen, bei denen Auffälligkeiten im Genotyper erkennbar waren: D6S309 und D6S470. Bei diesen beiden Markern findet sich eine scheinbare Homozygotie bei allen erkrankten Personen (BB, RP, DPJ), was nicht mit einem Mendel’schen Erbgang vereinbar ist. Daher muss es sich um eine interstitielle Deletion in einem Allel handeln, welche sich als Hemizygotie darstellt (s. Abbildung 11). Für den Marker D6S309 gilt 3. Ergebnisse 59 beispielsweise: Bei DPJ zeigt sich lediglich ein Peak bei 312 Bp. Dies würde heißen, er wäre an dieser Stelle homozygot. DPJ müsste allerdings jeweils ein Allel von seiner Mutter RP (Peak bei 320 Bp) und ein Allel von seinem Vater DPS (Peak bei 312 und bei 320 Bp) bekommen. Dies ist bei dieser Konstellation nicht möglich, da DPJ kein Allel seiner Mutter aufweist. Daher muss es sich um einen Allel-Verlust an dieser Stelle handeln. Das gleiche gilt für den Marker D6S470. Marker D6S470 Marker D6S309 BB DPJ DPS RP TW RW Abbildung 11: Auswertung mit Hilfe des Computerprogramms GenoTyper®. Um diese Graphik besser verstehen zu können, habe ich den Stammbaum der Familie beigefügt. (BB = Großmutter erkrankt, DPJ = Sohn erkrankt, DPS = Vater gesund, RP= Mutter erkrankt, TW = Tante gesund, RW = Großvater gesund, die Buchstaben sind die Initialen der Personen). 3. Ergebnisse 60 Im Anschluss daran wurden die Allele der verschiedenen Familienmitglieder für jeden Marker von Hand in das Computerprogramm Cyrillic v.2.1.3. eingegeben, wodurch bereits erste mögliche Haplotypenkonstellationen entstanden. Bei diesen blieb allerdings die Phase der Allele und die Häufigkeit oder Wahrscheinlichkeit einer Rekombination noch unberücksichtigt. Deshalb wurden die in Cyrillic eingegebenen Daten in das Programm SimWalk2 v.2.91 exportiert. Dieses Programm berechnet eine Rekombinationswahrscheinlichkeit unter Berücksichtigung von Position und Abstand der Marker. Schlussendlich werden die wahrscheinlichsten Haplotypen angezeigt. Auch hier fiel für Chromosom 6 bei den erkrankten Personen ein Verlust auf Höhe der Marker D6S309 und D6S470 auf (s. roter Kreis in Abbildung 12). Hierbei ist deutlich zu erkennen, dass es sich nicht um eine Homozygotie sondern eine Hemizygotie handelt. 3. Ergebnisse Abbildung 12: Berechnung der wahrscheinlichsten Haplotypen mit Hilfe des Computerprogramms SimWalk2 v.2.91. Folgende Daten werden für jede Person von links nach rechts in dieser Reihenfolge aufgeführt: M = maternaler Ursprung des Haplotyps P = paternaler Ursprung des Haplotyps Identitätsnummer 1-6 im Stammbaum Name der Mutter (2 oder 3) und des Vaters (1 oder 5) Geschlecht (F = female, M = male) Merkmale des Phänotyps (hier nicht vorhanden) Berechneter Haplotyp Die maternalen und paternalen Haplotypen werden durch eine Linie von Symbolen getrennt: - Standard-Symbol ^ in diesem Intervall Rekombinationen nur im mütterlichen Haplotyp V in diesem Intervall Rekombinationen nur im väterlichen Haplotyp | in diesem Intervall Rekombinationen in mütterlichem und väterlichem Haplotyp = markiert mütterliche oder väterliche Allele, die ursprünglich unbestimmt waren, aber von bekannten Allelen abgeleitet werden konnten * Phase konnte für diesen Marker nicht festgelegt werden. Es wurde die wahrscheinlichste Phase für die Darstellung gewählt. Für Nachkommen wurde automatisch der maternale Haplotyp oberhalb der gestrichelten Linie angezeigt. Für sogenannte Founder erfolgte die Zuordnung der parentalen Haplotypen willkürlich. Die interstitiellen Deletionen bei den Erkrankten habe ich mit einem roten Kreis kenntlich gemacht. 61 3. Ergebnisse 62 Um diese besser darzustellen, wurden die von SimWalk2 v.2.91 berechneten Haplotypen in das Programm HaploPainter V.029.5 importiert, wodurch ich eine graphische Darstellung der Haplotypen erhielt. Anhand dieser Schaubilder konnten nun aufgrund von Vererbung und gleichen oder unterschiedlichen Haplotypen verschiedene Genregionen als Kandidaten für das BOFS ausgeschlossen oder als mögliche Region für Mutationen identifiziert werden. Chromosom 2: Aufgrund unterschiedlicher Haplotypen bei den erkrankten Individuen (3 und 6) kann diese Region ausgeschlossen werden. Auffällig ist jedoch das Crossover zwischen den Markern D2S2166 und D2S2211 im maternalen Allel bei Person 3. Abbildung 13: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 2. Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel). 3. Ergebnisse Chromosom 3: Auch hier ist ein Ausschluss eines großen Bereichs möglich. Lediglich die Region um die Marker D3S3695 und D3S1267 kommt als mögliche Kandidatenregion in Frage, da in diesem Bereich alle Erkrankten den gleichen Haplotyp (maternales Allel (blau)) aufzeigen und alle gesunden Individuen einen anderen Haplotyp besitzen. Weiterhin zeigen sich mehrere Crossover. Bei Person 4 sind zwei Crossover erkennbar: im paternalen Allel zwischen den Markern D3S1267 und D3S1292 sowie im maternalen Allel zwischen den Markern D3S1292 und D3S1569. Bei Person 6 findet sich ebenfalls zwischen den Markern D3S1267 und D3S1292 ein Crossover im maternalen Allel. Abbildung 14: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 3. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Die Region, welche nicht ausgeschlossen werden kann, ist mit dem roten Kreis gekennzeichnet. 63 3. Ergebnisse Chromosom 4: Die HaploPaint-Datei von Chromosom 4 zeigt, dass sowohl die erkrankte (Person 3), als auch die gesunde Tochter (Person 4) stellenweise das gleiche maternale Allel (blau zwischen den Markern D4S3402 und D4S1534) besitzen, wodurch diese Region ausgeschlossen werden kann. Zudem zeigt Person 6 eine völlig andere Haplotypenkonstellation als Person 2. Bei Person 6 finden sich zum größten Teil Anteile der Allele des gesunden Großvaters (Person 1). Weiterhin finden sich hier eine Vielzahl von Crossover: Bei Person 3 im paternalen als auch im maternalen Allel zwischen den Markern D4S392 und D4S3042. Person 4 zeigt ein Doppel-Crossover im maternalen Allel zwischen den Markern D4S405 und D4S1592 sowie D4S1592 und D4S392. Auf Person 6 wurde das Crossover, welches sich bereits bei der Mutter (Person 3) im paternalen Allel findet, weiter vererbt. Zusätzlich findet sich allerings ein weiteres Crossover zwischen den Markern D4S2964 und D4S1534, ebenfalls im maternalen Allel. Abbildung 15: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 4. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). 64 3. Ergebnisse Chromosom 5: In der untersuchten Region weisen die erkrankten Individuen unterschiedliche Haplotypen auf. Insbesondere Individuum 6 zeigt Allele, die jeweils von einer gesunden Person stammen müssen: das eine Allel bekommt Person 6 vom gesunden Vater, das zweite Allel, das Person 6 hat, ist auch bei Person 1 zu finden, welche auch gesund ist. Deshalb kann auch diese Region auf Chromosom 5 ausgeschlossen werden. Abbildung 16: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 5. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Chromosom 6: (s. Abbildung 17) Bei diesem Chromosom besteht die Möglichkeit, dass sich das Kandidatengen für das BOFS in der untersuchten Region befindet, da alle Erkrankten den gleichen Haplotyp (grünes Allel) besitzen und dieser bei keinem Gesunden zu finden ist. Lediglich ein ca. 10 Mbp umfassender Bereich um die Marker D6S1660, D6S276 und D6S291 kann ausgeschlossen werden, da für diese Region sowohl erkrankte als auch gesunde Familienmitglieder den gleichen Haplotyp (blaues Allel) 65 3. Ergebnisse aufweisen. Dieser Ausschluss wurde durch ein Crossover ermöglicht, das bei Person 6 im maternalen Allel stattgefunden hat (zwischen D6S422 und D6S1660). Des Weiteren fallen zwei Marker ins Auge: D6S309 und D6S470. Hier findet sich, wie bereits eingangs zu diesem Kapitel erwähnt wurde, ein Verlust bei allen erkrankten Personen. Da dies bei allen erkrankten Personen zu finden ist, aber bei keiner gesunden Person, liegt der Verdacht nahe, dass diese scheinbare Homozygotie mit dem Krankheitsbild in Zusammenhang stehen könnte. Möglicherweise handelt es sich um eine interstitielle Deletion. Abbildung 17: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 6. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Die Region, welche nicht ausgeschlossen werden kann, ist mit einem roten Kreis gekennzeichnet. 66 3. Ergebnisse Chromosom 7: Im Gegensatz zu Chromosom 6 konnte Chromosom 7 komplett ausgeschlossen werden, da es keinen Haplotypen gibt, der nur bei Erkrankten zu finden ist. Auf Chromosom 7 befindet sich das ganze HoxA-Cluster, wodurch diese Gengruppe als möglicher Kandidat für das BOFS ausscheidet. Auch hier finden sich Crossover bei zwei Personen: Individuum 3 zeigt eine Rekombination im maternalen Allel zwischen den Markern D7S657 und D7S515. Zwischen D7S630 und D7S657 findet sich auch bei Person 4 ebenfalls im maternalen Allel ein Crossover. Abbildung 18: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 7. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)) 67 3. Ergebnisse Chromosom 11: Auch hier ist ein Ausschluss des kompletten Chromosoms möglich. Wie bei Chromosom 7 gibt es auch hier keinen Haplotyp, den nur erkrankte Individuen besitzen. Allerdings finden sich auch hier mehrere Crossover. Ein Doppel- Crossover im maternalen Allel bei Person 4 (zwischen D11S914 und D11S935 sowie D11S4102 und D11S4191) und eine Rekombination bei Person 3 zwischen D11S4191 und D11S987 (maternales Allel). Abbildung 19: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 11. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)) 68 3. Ergebnisse Chromosom 12: Ähnlich wie bei Chromosom 11 verhält es sich bei Chromosom 12. Aufgrund der Tatsache, dass sowohl Person 3 als auch Person 4 den gleichen Haplotyp im Bereich D12S86 bis D12S1659 aufzeigen, und Person 6 im Bereich D12S1659 bis D12S1638 einen ganz anderen Haplotyp aufzeigt als Person 3, kann dieses Chromosom ausgeschlossen werden. Hier sind bei Person 4 (maternales Allel, zwischen D12S1659 und D12S367 sowie D12S1723 und D12S1638) und bei Person 6 (maternales Allel, zwischen D12S324 und D12S1659) Crossover zu finden. Abbildung 20: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 12. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)) 69 3. Ergebnisse Chromosom 13: Chromosom 13 kommt ebenfalls nicht in Betracht das Kandidatengen für das BOFS zu enthalten. Zwar besitzen Person 2 und 3 teilweise den gleichen Haplotyp (grünes Allel), nicht jedoch Person 6. Diese erkrankte Person besitzt zwei Allele, welche von gesunden Individuen stammen (lila Allel vom gesunden Vater und das rot-gelbe Allel ist ebenfalls beim gesunden Großvater zu finden). Daher kann dieses Allel nicht für die Erkrankung verantwortlich sein, da sonst Person 6 gesund sein müsste. Bei Person 3 hat wiederum ein Crossover in der paternalen Meiose stattgefunden (zwischen D13S1265 und D13S285). Dieses Allel wurde auch an Person 6 weiter gegeben. Abbildung 21: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 13. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)) 70 3. Ergebnisse Chromosom 14: Auch hier haben sowohl die gesunde Person 4 als auch die erkrankte Person 3 im Bereich D14S1050 und D14S1054 den gleichen Haplotyp (blau). Im Bereich D14S74 und D14S280 wiederum besitz Person 6 einen anderen Haplotyp als die Personen 2 und 3. Daher kann auch Chromosom 14 komplett ausgeschlossen werden. Crossover finden sich bei Person 3 (maternale Meiose, zwischen D14S280 und D14S1050) und bei Person 6 (maternales Allel, zwischen D14S1050 und D14S1054). Abbildung 22: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 14. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)) 71 3. Ergebnisse 72 Chromosom 15: Hier zeigen zwar sowohl Person 2 als auch 3 das gleiche Allel auf (grün), dieses ist aber auch bei der gesunden Person 4 zu finden. Wodurch dieses Chromosom ausgeschlossen werden kann. Bei Person 6 fällt noch ein Doppel-Crossover im Bereich der Marker D15S131 und D15S205 sowie D15S205 und D15S130 im maternalen Allel auf. Abbildung 23: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 15. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)) Chromosom 18 (s. Abbildung 24): Neben Chromosom 6 ist Chromosom 18 ebenfalls ein Favorit, das BOFSKandidatengen zu enthalten. Auch hier besitzen alle erkrankten Personen den gleichen Haplotyp (lila Allel), hingegen besitzen alle Gesunden eine andere Allelkonstellation. Lediglich die Region um den Marker D18S68 kann ausgeschlossen werden, da hier Person 4 den gleichen Haplotyp (lila) besitzt wie 3. Ergebnisse die erkrankten Personen, aber gesund ist. In diesem Bereich hat bei Person 4 ein Doppel-Crossover stattgefunden (zwischen D18S1147 und D18S68 sowie D18S68 und D18S465 in der maternalen Meiose). Eine weitere Rekombination findet sich bei dieser Person im paternalen Allel zwischen den Markern D18S462 und D18S70. Abbildung 24: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 18. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Die Regionen, welche nicht ausgeschlossen werden konnten, sind rot eingerahmt. Chromosom 19 (s. Abbildung 25): Auch hier gibt es eine knapp 2 Mbp große Region, die als Kandidat in Frage kommt, und zwar zeigen im Bereich von D19S418 und D19S210 alle Erkrankten den gleichen Haplotyp (blau) auf. Die restliche Region dieses Chromosoms kann ausgeschlossen werden, da in diesem Bereich auch Person 4 (gesund) das gleiche Allel besitzt. Hier finden sich auch wieder zahlreiche Crossover: Person 3: im maternalen (zwischen D19S572 und D19S418) als auch im paternalen Allel 73 3. Ergebnisse (zwischen D19S884 und D19S572). Person 4: im paternalen Allel zwischen den Markern D19S572 und D19S418. Person 6 hat das Crossover im maternalen Allel der Person 3 vererbt bekommen und zeigt zusätzlich eine Rekombination zwischen den Markern D19S884 und D19S572 ebenfalls in diesem Allel. Abbildung 25: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 19. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Die Region, welche nicht ausgeschlossen werden kann, ist mit einem roten Kreis gekennzeichnet. Chromosom 21 (s.Abbildung 26): Chromosom 21 kann aufgrund der Haplotypenkonstellation nicht ausgeschlossen werden und kommt somit als möglicher Kandidat in Betracht. Allerdings ist diese Region sehr klein (zwischen D21S1256 und D21S1899 befinden sich lediglich ca. 3 Mbp). 74 3. Ergebnisse Abbildung 26: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 21. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Die Region, welche nicht ausgeschlossen werden kann, ist mit einem roten Kreis gekennzeichnet. Chromosom 22: Neben den bisher genannten möglichen Chromosomen, zählt auch die Region um die Marker D22S420 und D22S539, welche etwa 20 Mbp umfasst, zu den möglichen Kandidaten. Abbildung 27: HaploPaint-Diagramm für Chromosom 22. (Von links nach rechts sind folgende Daten aufgeführt: Name des Markers, ungefähre Position des Markers auf dem Chromosom, Haplotypen der einzelnen Personen (paternales und maternales Allel)). Die Region, welche nicht ausgeschlossen werden kann, ist mit einem roten Kreis gekennzeichnet. 75 3. Ergebnisse 76 Während ich diese Untersuchungen durchführte, wurde gleichzeitig in den USA an der DNA genau derselben Segregationsanalysen wurde Familie von geforscht. dieser Nach Abschluss Forschungsgruppe meiner explizit eine Genregion auf Chromosom 6 (6p21.31-p25.3), welche zuvor von uns als mögliche Kandidatenregion beschrieben wurde [89], untersucht und ein Gen (TFAP2A = Transkriptionsfaktor AP-2 alpha) identifiziert, in welchem sich bei Personen mit BOFS Mutationen befinden [138]. Alle AP2-Proteine haben eine charakteristische Domänenstruktur (s. Abbildung 23), welche sich aus einem hoch konservierten Helix-Span-Helix-Motiv (H-S-H) am carboxyterminalen Ende und einer Transaktivierungsdomäne (Prolin- und glutaminreich) am Aminoterminus zusammensetzt. Das Helix-Span-Helix-Motiv moduliert zusammen mit der zentralen basischen Region die Dimerisierung von AP2-Proteinen und DNA-Bindung an die Zielsequenz GCCNNNGGC. Die Proteine können sowohl Homo- als auch Heterodimere bilden. [48, 230, 231] Zielgene mit AP2-Bindungsstellen in ihren Promotersequenzen sind in biologische Prozesse wie Zellwachstum und –differenzierung involviert [48]. Abbildung 28: Schematische Darstellung der Proteinstruktur eines AP-2α-Dimers. Diese zeigt eine prolin- und glutaminreiche (P/Q-rich) Transaktivierungsdomäne (89 Aminosäuren, rotdargestellt), das PY-Motiv innerhalb dieser Domäne (5 Aminosäuren, grün), die basische Domäne (20 Aminosäuren, gelb) und das Helix-Span-Helix-Motiv (131 Aminosäuren, blau). Das Helix-Span-Helix-Motiv ist für die Dimerisierung des Proteins zuständig und vermittelt zusammen mit der basischen Domäne die DNA-Bindung. (DNA = Desoxyribonucleic acid, P = Prolin, Y = Tyrosin) [48] 3. Ergebnisse Bisher wurden folgende Mutationen entdeckt: In diesem familiären BOFS-Fall (Mutter und Sohn), den auch ich untersucht habe, wurde eine 3,2 Mbp große Deletion auf Chromosom 6p24.3 festgestellt. Bei drei Fällen konnten de novo Missense-Mutationen in Exon 4 (R255G, L249P, R254G) und in einem Fall eine de novo Missense-Mutation in Exon 5 (G262E) des TFAP2A-Gens nachgewiesen werden. Diese Mutationen befinden sich in hochkonservierten Regionen. [138] Daraufhin haben wir beschlossen diese Genregion bei weiteren BOFS-Fällen zu sequenzieren. 3.4. Sequenzierung Zunächst wurde auch für die Sequenzierung eine Etablierung der Primer für die jeweiligen Exons durchgeführt. Die genauen PCR-Bedingungen sind im Kapitel „Material und Methoden“ zu finden. Um die beste Annealing-Temperatur für jeden Primer zu finden, wurde die Annealing-Temperatur variiert. Die PCR wurden entweder nach Standard-Protokoll oder nach dem PCR-Protokoll für das GC-RichKit durchgeführt. Anschließend wurden die PCR-Produkte mit einem Lademix gemischt und auf ein 2%iges NEEO-Agarosegel aufgetragen. Somit konnten die perfekten PCR-Bedingungen für jeden Primer ermittelt werden. Daraufhin wurden die PCR-Produkte mit Hilfe des Illustra™ GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit gereinigt und eine Sequenzreaktion mittels ABI PRISM®BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit durchgeführt. Die Sequenzproben wurden anschließend mit Ethanol gefällt, auf eine 96-wellPlatte pipettiert und mittels Kapillarelektrophorese im ABI PRISM®3100 sequenziert. 3.5. Auswertung der Sequenzierung/Gefundene Mutationen Die von der Sequenzierung mittels ABI PRISM®3100 erhaltenen Daten wurden mittels SeqScape®-Software (Applied Biosystems) mit Referenzsequenzen (GI:89161210, Positionen 10504902…10527783) der NCBI-Datenbank verglichen. Somit konnte ich verschiedene Mutationen ausfindig machen. Hierbei handelt es sich um folgende Mutationen im Exon 4, 5 und 6, bei fünf nicht verwandten 77 3. Ergebnisse Familien: Eine rekurrierende Mutation in dem sporadischen Fall aus Phillipsburg und dem familiären Fall aus Belgien. Hierbei handelt es sich um die p.Arg255GlyMutation. Diese Mutation wurde bereits bei einer weiteren Familie beschrieben [138] und befindet sich in Exon 4 (s. Abbildung 29 und 30). Die Nummerierung des Proteins bezieht sich auf die TFAP2A-Isoform a des Gens (Ref ID: NP_003211.1). Eine weitere Missense-Mutation (p.Glu296Lys, s. Abbildung 31) wurde in dem familiären Fall aus Chemnitz entdeckt. Hier wird eine saure Aminosäure durch eine basische Aminosäure ersetzt. Diese Mutation befindet sich in Exon 6. Abbildung 29: p.Arg255Gly-Mutation (Proteinebene: an Position 255 wird Arginin durch Glycin ersetzt) im Exon 4, welche durch die Sequenzierung des familiären Falls aus Belgien gefunden wurden. Von oben nach unten sind folgende Daten in dieser Graphik zu erkennen: Referenzsequenz, Rückwärts-Richtung der Sequenzierung, Vorwärtsrichtung der Sequenzierung. Das „R“ steht für Purin. D.h. an dieser Stelle kann sich entweder ein A (Adenin) oder ein G (Guanin) befinden. Die Zahlen geben die Position an. Hier sieht man nun, dass sich an Position 15056 der Referenzsequenz heterozygot A und G befinden (dies wird durch den Buchstaben R angezeigt und durch einen Punkt gekennzeichnet). (A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin). 78 3. Ergebnisse Abbildung 30: p.Arg255Gly-Mutation (Proteinebene: an Position 255 wird Arginin durch Glycin ersetzt) im Exon 4, welche durch die Sequenzierung des sporadischen Falls aus Phillipsburg gefunden wurden. Von oben nach unten sind folgende Daten in dieser Graphik zu erkennen: Referenzsequenz, Rückwärts-Richtung der Sequenzierung, Vorwärtsrichtung der Sequenzierung. Auch hier zeigt sich an Position 15056 der Referenzsequenz, dass sich dort heterozygot A (Adenin) und G (Guanin) befinden. (A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin) Abbildung 31: p.Glu296Lys-Mutation (Proteinebene: an Position 296 wird Glutamat durch Lysin ersetzt) im Exon 6, welche durch die Sequenzierung des familiären Falls aus Chemnitz gefunden wurden. Von oben nach unten sind folgende Daten in dieser Graphik zu erkennen: Referenzsequenz, Rückwärts-Richtung der Sequenzierung, Vorwärtsrichtung der Sequenzierung. Hier befindet sich an Position 21091 der Referenzsequenz heterozygot C und T, was durch den Buchstaben „Y“ (= Pyrimidin) angezeigt wird. (A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin) 79 3. Ergebnisse Eine weitere Mutation konnte ich, bei dem eventuell familiären Fall (bei der Großmutter besteht der Verdacht ebenfalls am BOFS erkrankt zu sein) aus Frankreich, im Exon 5 nachweisen (s. Abbildung 32). Hierbei handelt es sich um eine heterozygote Missense-Mutation - p.Leu269Pro (c.10587T>G) - welche zu einem Aminosäureaustausch im hochkonservierten Bereich des TFAP2A-Gens führt. Abbildung 32: p.Leu269Pro-Muatation (Proteineben: an Position 269 wird Leucin durch Prolin ersetzt) im Exon 5, welche durch die Sequenzierung des evtl. familiären Falls aus Frankreich gefunden wurde. Von oben nach unten sind folgende Daten in dieser Graphik zu erkennen: Referenzsequenz, Rückwärts-Richtung der Sequenzierung, Vorwärtsrichtung der Sequenzierung. An Position 16996 der Referenzsequenz befindet sich heterozygot C und T, was durch den Buchstaben „Y“ (= Pyrimidin) angezeigt wird. (A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin) Bei dem sporadischen Fall aus Frankreich konnte ich eine weitere MissenseMutation im Exon 4 nachweisen (p.Arg237Gln – c.716G>A). Auch hier findet ein Aminosäureaustausch statt (s. Abbildung 33). 80 3. Ergebnisse 81 Abbildung 33: p.Arg237Gln-Mutation (Proteineben: an Position 237 wird Arginin durch Glutamin ersetzt) im Exon 4, welche bei der Sequenzierung des sporadischen Falls aus Frankreich gefunden wurde. Von oben nach unten sind folgende Daten in dieser Graphik zu erkennen: Referenzsequenz, Rückwärts-Richtung der Sequenzierung, Vorwärtsrichtung der Sequenzierung. An Position 15003 der Referenzsequenz befindet sich heterozygot A/G. Dies wird durch den Buchstaben „R“ angezeigt (= Purin). (A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin) Um zu überprüfen, ob es sich bei der am C-Terminus des Gens befindlichen Region auf Exon 6 um eine hochkonservierte handelt, wurde ein Vergleich der humanen Sequenz mit Sequenzen bei anderen Lebewesen durchgeführt. Hierzu wurden der Genome-Browser und Ensembl verwendet. Eine sehr hohe Aminosäurensequenz-Konservierung (s. Abbildung 34) konnte somit in dem analysierten Teil des Gens nachgewiesen werden. Die Aminosäuren- Konservierung an Position 296 konnte beispielsweise auch bei Insekten wie der Honigbiene (Apis mellifera) oder bei der Anophelesmücke (Anopheles gambiae) aufgezeigt werden. Alle gefundenen Sequenzveränderungen wurden in der NCBI/SNP-Datenbank gesucht, um die Möglichkeit auszuschließen, dass es sich um bekannte Polymorphismen handelt. Diese Suche zeigte, dass sich die meisten SNPs (Einzelnukleotidpolymorphismen) in Exon 1, 2, 5 und 7, davon viele in der 5’- und 3’-UTR des TFAP2A befinden. Der SNP rs34436436 in Exon 2 stellt die letzte Sequenzvariante vor einer Lücke jeglicher Sequenzvariation bis Exon 5 dar. Exon 2 kodiert für einen Teil der Gln/Pro-reichen Transaktivierungsdomäne des Proteins. Exon 3 und 4 sind frei von jeglichen Sequenzvarianten. 3. Ergebnisse Für alle Sequenzveränderungen der BOFS-Fälle lieferte die Suche somit ein negatives Ergebnis, daher muss davon ausgegangen werden, dass es sich um wirkliche Mutationen handelt. Abbildung 34: Vergleich der Aminosäuresequenz verschiedener Spezies. Von links nach rechts ist folgendes dargestellt: Basensequenz, Aminosäuresequenz im Einbuchstabencode, Spezies (weiß unterlegt: T = Thymin, G = Guanin, C = Cytosin, A = Adenin, Basen in annotierten repetitiven Elementen sind in Kleinbuchstaben geschrieben , - = keine Basen bei der entsprechenden Spezies; entweder durch eine abstammungs-spezifische Insertion zwischen dem entsprechenden Block und dem humanen Genom, oder durch eine abstammungs-spezifische Deletion zwischen dem entsprechenden Block und der entsprechenden Spezies, = = die entsprechende Spezies hat eine oder mehrere nicht vergleichbare Basen in der Lücke; entweder durch eine exzessive evolutionäre Distanz zwischen den Spezies, oder durch unabhängige Insertionen/Deetionen in der Region zwischen den entsprechenden Blöcken bei beiden Spezies ; blau unterlegt G = Glycin , E = Glutaminsäure, A = Alanin, V = Valin, H = Histidin, L = Leucin) 82 4. Diskussion 83 4. Diskussion Das Branchio-okulo-faziale Syndrom ist ein sehr seltenes autosomal-dominant vererbtes Krankheitsbild, welches sich vor allem durch kraniofaziale Anomalien wie postaurikuläre zervikale Defekte, branchiale Sinus und Fisteln, Augenanomalien, Tränen-Nasengangatresien oder –stenosen und Gesichtsspalten, aber auch durch Nierenanomalien und weitere Entwicklungsstörungen auszeichnet. Aufgrund der Symptome wurde eine Verschlussstörung des ersten und zweiten Kiemenbogens vermutet. Da diese Erkrankung sehr selten ist und sich unter den Erkrankten nur sehr wenig familiäre Fälle befinden, konnte ein Gen, welches beim BOFS mutiert ist, bisher noch nicht identifiziert werden. Anhand ähnlicher Krankheitsbilder und Segregationsanalysen der dazugehörigen Kandidatengene konnten bereits einzelne Gene als Kandidaten für das BOF-Syndrom ausgeschlossen werden. Die Untersuchungen führen zum Ausschluss kompletter Chromosomen. Unter diesen sind die Autosomen 1, 8, 9, 10, 16, 17 und 20 sowie das X-Chromosom [70]. Immerhin konnten in dieser vorangegangenen Arbeit nahezu 83% aller Gene als Kandidaten ausgeschlossen werden. Eine genomweite Segregationsanalyse und Datenbank- bzw. Literaturrecherchen über die zeitliche und räumliche Expression der in den Abschnitten gemeinsamen Haplotypen gefundenen Gene führten zur Nominierung vieler potenzieller Kandidatengene [70]. In meiner Arbeit konnte ich mittels Segregationsanalysen und anschließender Auswertung der Daten am Computer bei einer sechs Personen umfassenden Familie (drei gesunde und drei erkrankte Individuen) weitere Genregionen ausschließen und letztendlich Mutationen im entdeckten Kandidatengen TFAP2A nachweisen. Zur Durchführung dieser Untersuchungen habe ich mittels PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern die Allele verschiedener Marker für jedes Familienmitglied über Kapillarelektrophorese bestimmt. Die gewonnenen Haplotypen wurden im Computer verarbeitet und somit für jedes Familienmitglied unter Berücksichtigung von Rekombinationswahrscheinlichkeiten die wahrscheinlichsten Haplotypen erstellt. Werden nun die verschiedenen Haplotypen der Personen untereinander verglichen, können unter Berücksichtigung des Mendel’schen-Erbganges beispielsweise durch Vorhandensein eines identischen Haplotyps sowohl bei Erkrankten als auch bei Gesunden verschiedene 4. Diskussion 84 Genregionen ausgeschlossen werden. Andere Genregionen hingegen können als Favoriten gesehen werden, wenn alle erkrankten Personen einen gemeinsamen Haplotyp aufweisen, alle Gesunden hingegen einen anderen. Zu meinen Untersuchungen ist im Voraus schon zu erwähnen, dass sich durch Vergleichen der Haplotypen aus der durchgeführten Fragmentanalyse bereits sehr viele Genregionen komplett ausschließen ließen. Dazu zählen alle Regionen der Chromosomen 2, 5, 7 und 11 bis 15; auf Chromosom 21 blieb eine 3 Mbp Region als potenzielle Kandidatenregion übrig, deren Gene an sich aber aufgrund von Expressions- und Tiermodelldaten ebenfalls ausgeschlossen werden konnten. Nur wenige Regionen hingegen erweisen sich als mögliche Kandidaten. Unter diesen befindet sich auch eine Region auf Chromosom 6, in welcher das Kandidatengen gefunden wurde. Zunächst will ich jedoch kurz die ausgeschlossenen chromosomalen Regionen und die Bedeutung der darin enthaltenen Gene vorstellen, bevor ich die gemeinsamen Haplotypen der erkrankten Personen diskutieren werde. Für die Mehrheit der ausgeschlossenen Gene ist noch kein Phänotyp bekannt, so dass die Liste dieser Gene für vergleichende Analysen bei Krankheitsbildern mit ähnlicher Symptomatik durchaus hilfreich sein kann. Es ist nicht auszuschließen, dass diese Gene bei einem ähnlichen Krankheitsbild Favoriten-Kandidatengene sein könnten. Diese Erkenntnis baut auch auf unserer bisherigen Erfahrung mit den verwandten Krankheitsbildern BO-Syndrom und BOR-Syndrom und den bei uns untersuchten Genen an BOF-Syndrom Familien auf. Auf Chromosom 2 kann aufgrund unterschiedlicher Haplotypen bei den erkrankten Individuen (3 und 6) das Intervall von D2S319 bis D2S2211, welches zuvor noch als gemeinsamer Haplotyp bei der größten Familie mit BOFS gefunden worden war, ausgeschlossen werden. In dieser Region befinden sich 20 verdächtige Gene [70]. Auffällig in diesem Bereich ist die Häufigkeit von DNA-bindenden Proteinen wie Transkriptionsfaktoren (E2F6 (E2F transcription factor 6), SOX11 (SRY (sex determining region Y)-box 11), TFCP2L2 (transcription factor CP2-like 2)). Auch Gene, von denen eine maßgebliche Beteiligung an der embryonalen Differenzierung bekannt ist (DDEF2 (development and differentiation enhancing factor 2) und TIEG2 (TGFB inducible early growth response 2)) finden sich in dieser von mir ausgeschlossenen Region. Bei der Retinaentwicklung werden β- 4. Diskussion 85 Integrine exprimiert. Auf Chromosom 2 befindet sich das ITGB1BP1-Gen (integrin beta 1 binding protein 1). Dieses kann somit ebenfalls als Kandidatengen verworfen werden. Weiterhin befindet sich auf Chromosom 2 das komplette HOXD-Cluster. Mit den Daten der vorangegangenen Arbeit [70] kommt somit das komplette Chromosom 2 und somit auch das HOXD-Cluster als BOFS-Kandidat nicht mehr in Betracht. Durch meine Arbeit ist jetzt auch der Ausschluss des kompletten Chromosoms 4 möglich. Hierdurch kommen die zwischen den Markern D4S405 bis D4S1534 gelegenen 30 verdächtigen Gene, welche zuvor aufgrund gemeinsamer Haplotypen und ihrer Expressionsdaten als mögliche Kandidaten angesehen wurden, nicht mehr als BOFS-Kandidaten in Frage. Wichtige Gene und Krankeitsloci, die sich dort befinden, sind FRAS1 (Fraser syndrome 1), KDR (kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase)), PDGFRA (platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide), SLC4A4 (solute carrier family 4, sodium bicarbonate cotransporter, member 4). Somit befinden sich unter diesen Genen neben DNA-bindenden Proteinen auch Vertreter von Rezeptor Serin/Threoninsowie Tyrosinkinasen, von denen bekannt ist, dass sie essentielle Moleküle der Signalübertragung während der Differenzierung darstellen. Auch ein Ionentransporter (SLC4A4) befindet sich unter den ausgeschlossenen Genen. Allerdings kommen Ionentransporter und Ionenkanäle eher im Zusammenhang mit Myopathien, Neuropathien und Epilepsien als Kandidatengene in Betracht. Für das Linsenwachstum ist der Thrombozytenwachstumsfaktor PDGF (plateledderived growth factor) von Bedeutung. Das Gen für dessen Rezeptor (PDGFR) befindet sich wie oben erwähnt auf Chromosom 4 und kann daher ausgeschlossen werden. Der Rezeptor KDR (=VEGFR-2) für den Vascular endothelial growth factor (VEGF) ist bei der Hautentwicklung beteiligt. Das Gen dafür befindet sich ebenfalls in der ausgeschlossenen Region auf Chromosom 4 und ist somit kein potenzielles Kandidatengen. Ebenfalls ausgeschlossen werden kann die von mir untersuchte Region (D5S400 bis D5S408) auf Chromosom 5 und zusammen mit früher veröffentlichten Daten [70] das komplette Chromosom 5. Zwischen D5S400 und D5S408 sind 161 Gene lokalisiert, davon 39 als nur „verdächtig“ eingestufte und die nachfolgenden 4. Diskussion 86 Favoriten: DUSP1 (dual specificity phosphatase 1), FGF1 (fibroblast growth factor 1), FGF18, FGFR4 (FGF-Rezeptor 4), FLT4 (fms-related tyrosine kinase 4) und FOXI1 (forkhead box I1). Mutationen in Genen der Fibroblastenwachstumsfaktoren und deren Rezeptoren sind bekannt für Entwicklungsstörungen wie Chondrodysplasien und Kraniosynostosen. FGF1 spielt zusammen mit anderen Wachstumsfaktoren wie EGF (siehe Ausschluss Chromosom 7, unten), TGF-α (transforming growth factor)), IGF-1 (insulin-like growth factor), IGF-2 und FGF2 und korrespondierenden Rezeptoren eine maßgebliche Rolle bei der Anlage und Differenzierung der Haut. Die Haut, welche aus zwei Keimblättern entsteht, ist beim BOFS typischerweise verändert, so dass Mitglieder dieser Wachstumsfaktoren durchaus als potenzielle Kandidatengene betrachtet werden durften. Die Gene der proteinbindenden Ringfinger-Proteine RNF130 und RNF44, des Ionentransporters SLC34A1 (solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 1), sowie mehrerer Zinkfinger-Proteine, die ebenfalls zu Transkriptionsfaktoren mit DNA-bindenden und damit Genexpressions-regulierenden Eigenschaften zu rechnen sind, darunter ZNF346, ZNF354A-C und ZNF454, waren ebenfalls Favoriten auf Chromosom 5, sind nun aber definitiv ausgeschlossen. Gene, die an der Entwicklung des Ohres beteiligt sind, müssen bei der Diskussion von Kandidatengenen des BOFS wegen der beschriebenen Gehörlosigkeit berücksichtigt werden. Dafür müssen die drei Ohranteile Innenohr, Mittelohr und Außenohr separat betrachtet werden. Aus der Ohrplakode wird nach Induktion durch das ZNS ein Bläschen abgeschnürt, woraus sich die Kochlea und der vestibuläre Apparat entwickeln. Das Mittelohr hingegen entsteht aus der 1. Pharyngealtasche. Hieraus werden folglich die Tuba auditiva, das Trommelfell und die Gehörknöchelchen gebildet. Das Außenohr entsteht aus dem 1. und dem 2. Pharyngealbogen. An der Innenohrentwicklung sind sehr viele Gene beteiligt. Vor allem Homöobox-Gene scheinen eine besondere Rolle zu haben. DLX-3 (distalless homeobox 3) ist beispielsweise im Epithel der Ohrplakode exprimiert, MSH-C (muscle segment homeobox) und MSH-D in den Haarzellen. Ein Homolog des msh-Gens von Drosophila ist MSX2 (msh homeobox homolog 2). Dieses befindet sich in der ausgeschlossenen Region auf Chromosom 5 und ist damit kein Kandidatengen für das BOFS. 4. Diskussion 87 Phänotypische Merkmale des BOFS zeigen sich außerdem im Kopf- und Halsbereich. Deren Entwicklung erfolgt vor allem unter Beteiligung der Gene goosecoid GSC (siehe Auswertung von Chromosom 14, unten), LIM-1 und OTX-2 (orthodenticle homeobox). Das Gesicht wird aus fünf Wülsten gebildet: dem unpaaren Stirnnasenwulst, dem paarigen Oberkiefer- und dem paarigen Unterkieferwulst. Diese Wülste werden sowohl aus dem Ektoderm, als auch aus Mesenchym der Neuralleiste gebildet. Aus dem Stirnnasenwulst entstehen zunächst zwei Verdickungen: die Riechplakoden, welche sich anschließend zu Riechgruben und dann zur Regio olfactoria differenzieren. Diese werden von einem lateralen Nasenwulst begrenzt. Aus der Furche zwischen dem lateralen Nasenwulst und dem Oberkieferwulst entwickelt sich der Tränennasengang. Später kommt es zur Vereinigung der Nasenwülste miteinander und auch mit dem Oberkieferwulst, woraus Philtrum, Nasenflügel, Nasenbein und Nasenseptum entstehen. Aus dem Oberkieferwulst entwickeln sich Jochbein, Oberkiefer und Oberlippe. Unterkiefer und Unterlippe entstehen aus dem Mandibularbogen. In den Gesichtswülsten werden unter anderem MSX-1 und das von mir ausgeschlossene, auf Chromosom 5 gelegene, MSX-2 exprimiert. Zu den Chromosomen die komplett ausgeschlossen werden können, zählt auch Chromosom 7, da kein gemeinsamer Haplotyp bei Erkrankten zu finden war. Auf Chromosom 7 befindet sich das komplette HOXA-Cluster, dessen Gene somit als mögliche Kandidaten für das BOFS ausscheiden. Beispielsweise ist HOXA-6 für die Entstehung aller drei Ohrabschnitte wichtig und kommt somit als BOFSKandidat nicht mehr in Betracht. Neben dem HOXA-Cluster sind noch weitere 404, darunter 84 potenzielle Kandidatengene in der von mir untersuchten Region zwischen den Markern D7S502 und D7S486 lokalisiert. Auch diese fallen somit nicht mehr unter die BOFS-Kandidatengene. Zu diesen 84 Genen zählen erneut Zinkfinger-Proteine wie ZNF277, ZFD25, ZNF117, ZNF138, ZNF3, ZNF38, ZNF498, ZNF92, ZFP95 und ZNHIT1 (zinc finger, HIT domain containing 1). Neben diesem Typ von nukleinsäurebindenden Faktoren, die an der Genregulation während der Differenzierung beteiligt sein können, sind weitere Proteine mit nukleinsäurebindenden Eigenschaften ausgeschlossen, darunter TFEC (transcription factor EC) und TAF6 (TAF6 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 80kDa) – ein Initiator der Transkription. 4. Diskussion 88 Auch Rezeptoren wie FZD9 (frizzled homolog 9 (Drosophila)) und FZD1 (frizzled homolog 1 (Drosophila)), Elemente des Wnt-Signalwegs sowie der natriumunabhängige Cl-/I-Ionentransporter SLC26A4 (solute carrier family 26, member 4) waren ursprünglich als Favoriten enthalten. Weitere Gene mit Transkriptionsfaktor-Eigenschaften aus diesem Abschnitt, welche maßgeblich an der embryonalen Differenzierung beteiligt sind, sind BAZ1B (bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1B) und CHCHD2 (coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2). In den Innenohranlagen werden, wie bereits genannt, u.a. die Wachstumsfaktoren EGF (epidermal growth factor) und TGF-α (transforming growth factor α) exprimiert. Das auf Chromosom 7 liegende Gen für den EGFRezeptor (=EGFR (epidermal growth factor receptor )(erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)) ist somit ausgeschlossen. Ein weiteres Favoritengen, welches an der Augenentwicklung beteiligt ist, stellt das ODAG (ocular development-associated gene) dar. Auch dieses Gen kann jetzt ausgeschlossen werden, da es sich ebenfalls auf Chromosom 7 befindet. Wie schon bei Chromosom 4 ist auch auf diesem Chromosom, in der von mir ausgeschlossenen Region, ein Gen für ein Protein mit Tyrosinkinaseaktivität und somit signalübertragender Funktion: WNT2 (wingless-type MMTV integration site family member 2). Den Pharyngealtaschen und -bögen (auch Branchialbögen genannt) kommt bei der BOFS-Entstehung eine bedeutende Rolle zu, da sich aus diesen Taschen sowohl die Ohrtrompete, die Paukenhöhle, das Trommelfell, Ober- und Unterkiefer, die Gehörknöchelchen als auch der Thymus und weitere Organe entwickeln. Schon in sehr frühen Stadien der Pharyngealtaschenentwicklung, welche in der vierten Woche einsetzt, werden PAX1 (murine paired-box containing gene, Chromosom 20; ausgeschlossen) und PAX9 (Chromosom 14; ausgeschlossen) exprimiert. Für die spätere Differenzierung sind die auf Chromosom 17 gelegenen Gene HOXB6 bis HOXB9 (homeobox) wichtig, welche ebenfalls als Kandidaten ausgeschlossen wurden. Als Signalmoleküle sind ebenfalls beteiligt: FGF7 (Chr. 15), FGF8 (Chr. 10), BMP-Proteine und das ebenfalls auf Chromosom 7 gelegene und hier ausgeschlossene Sonic hedgehog (SHH). Bei der Entwicklung der Bögen sind zudem die HOXB-Gene 1 bis 4 exprimiert. 4. Diskussion Ein ähnliches 89 Expressionsmuster zeigt sich bei der Zahnentwicklung. Zahnfehlbildungen wurden bei BOFS-Patienten beschrieben, so dass Gene der Zahnentwicklung durchaus als potenzielle BOFS-Kandidaten betrachtet werden können. An der Zahnentwicklung sind folgende auf Chromosom 4 lokalisierten und damit ausgeschlossenen Gene beteiligt: MSX1 wird im Zahnmesenchym, LEF1 (lymphoid enhancer-binding factor 1) im Epithel exprimiert. Die z.T. schon oben genannten BMP2 (bone morphogenic protein), BMP4, FGF2, FGF4, FGF8 und SHH sind Signalstoffe des primären Schmelzknotens. Auch PAX9 ist ein wichtiges Gen der Zahnentwicklung. Ebenfalls auszuschließen ist das komplette Chromosom 11. Wie bei Chromosom 7 gibt es auch in der hier untersuchten Region (D11S1338 bis D11S987) keinen Haplotyp, den nur erkrankte Individuen besitzen. Folglich scheiden neben den in früheren Untersuchungen ausgeschlossenen Genregionen des Chromosoms 11 auch die sich in dem von mir untersuchten Bereich lokalisierten 948 Gene aus. Hierunter befinden sich 133 verdächtige Gene. Zu den wichtigsten sich dort befindenden Genen und Krankheitsloci gehören die beiden Mitglieder der FGFFamilie FGF19 (fibroblast growth factor 19) und FIBP (fibroblast growth factor (acidic) intracellular binding protein), welche für Chromosom 5 bereits beschrieben wurden. Ein als Favorit gehandeltes Kandidatgen – PAX6 (paired box gene 6 (aniridia, keratitis)), welches während der Augenentwicklung eine wichtige Rolle spielt, kann somit ausgeschlossen werden. PAX6 ist vor allem während der Entwicklung des Augenbläschens und der Linsenfasern exprimiert. Zuvor entwickelt sich aus dem Neuralrohr ein Augenbläschen. An der Stelle, an der das Bläschen das Oberflächenektoderm berührt, entsteht die Linsenplakode. Dieser Vorgang wird auch als embryonale Induktion bezeichnet. Anschließend senkt sich die Linsenplakode ab und wird zum Linsenbläschen. Neben PAX6 wird hier auch BMP7 (Bone morphogenetic protein 7) exprimiert. Gleichzeitig entsteht durch das Absinken der Linsenplakode der Augenbecher, welcher sich anschließend zum Pigmentepithel und zur Retina differenziert. Ferner finden sich Gene wie CMT4B2 (Charcot-Marie-Tooth neuropathy 4B2 (autosomal recessive, with myelin outfolding)), DELGEF (deafness locus associated putative guanine nucleotide exchange factor), HPS5 (HermanskyPudlak syndrome 5) und USH1C (Usher syndrome 1C (autosomal recessive, 4. Diskussion 90 severe)), welche bei anderen Syndromen mutiert sind, in dieser Region. Das durch Mutationen in USH1C verursachte Usher-Syndrom (OMIM 276900) ist durch eine Kombination von Gehörlosigkeit und Blindheit gekennzeichnet. Da USH1C in der von mir ausgeschlossenen Region auf Chromosom 11 lokalisiert ist, kann es für die Gehörlosigkeit beim BOF-Syndrom ausgeschlossen werden. Ein im Innenohr exprimiertes Molekül ist Otogelin (OTOG), welches ebenfalls auf Chromosom 11 lokalisiert ist. Weiterhin sind hier nukleotidbindende Proteine mit Serin/Threonin-, Tyrosin-Kinaseaktivität wie MAP3K11 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11), mit Transporterfunktion wie NXF1 (nuclear RNA export factor 1) oder mit Helikaseaktivität wie NAV2 (neuron navigator 2) zu finden. Aber auch Calciumionen bindende Proteine, welche Oxidureduktasefunktion NELL1 (NEL-like 1 (chicken)) bzw. Hydrolase-, Signaltransduktions- und Phospholipaseaktivität PLCB3 (phospholipase C, beta 3 (phosphatidylinositolspecific)) besitzen oder proteinbindende Moleküle mit Transporterfunktion wie COPB (coatomer protein complex, subunit beta) sind hier lokalisiert. Einige Zinkfingerproteine (ZBTB3 (zinc finger and BTB domain containing 3), ZDHHC13 (zinc finger, DHHC domain containing 13), ZFPL1 (zinc finger protein-like 1), ZNF143, ZNF214, ZNF215) und andere potenzielle Transkriptionsfaktoren wie TBX10 (T-box 10) befinden sich ebenfalls in dieser Region. Nachdem bei Chromosom 12 durch vorangegangene Arbeiten bereits ein Großteil der Gene ausgeschlossen werden konnte, kann nun nach meiner Segregationsanalyse auch die noch verbliebene Region zwischen D12S86 und D12S1638 ausgeschlossen werden. In der Region von 117.654.605 bp bis 131.829.011 bp befinden sich 154 Gene. Davon kamen 39 Gene als potenzielle Kandidaten in Frage, worunter auch wieder sehr viele DNA- oder Protein-bindende Transkriptionsfaktoren wie FBXL10 (F-box and leucine-rich repeat protein 10), FBXW8 (F-box and WD-40 domain protein 8), RNF10 (ring finger protein 10), sowie einige Zinkfingerproteine (ZNF10, ~140, ~26, ~268, ~605, ~84, ZCCHC8 (zinc finger, CCHC domain containing 8)) fallen. Auch hier ist wieder ein Vertreter des Wnt-Signalweges zu finden (FZD10 (frizzled homolog 10 (Drosophila))). Auf Chromosom 12 befindet sich auch das komplette HOXC-Cluster, welches somit komplett ausgeschlossen werden kann. 4. Diskussion 91 Alle Gene von Chromosom 13 konnten analog zu Chromosom 12 aufgrund unterschiedlicher Haplotypen bei den Erkrankten in der Region von D13S158 bis D13S285 durch meine, sowie durch vorangegangene Arbeiten ausgeschlossen werden. Dies bedeutet, dass auch das BOFS-verdächtige Gen SOX1 (SRY (sex determining region Y)-box 1) aus der Familie der mittlerweile 22 Vertreter umfassenden SOX-Proteine, welche für Transkriptionsfaktoren kodieren, nicht mehr als BOFS-Kandidat angesehen werden kann. Anhand der Ergebnisse meiner Segregationsanalysen können ebenfalls diejenigen Regionen der Chromosomen 14 und 15 ausgeschlossen werden, welche zuvor als Träger eines Kandidatengens in Betracht kamen. Die untersuchte Region auf Chromosom 14 (D14S74 bis D14S1054) beinhaltet 111 Gene, von denen 11 verdächtig erschienen. Besonders zu nennen sind nachfolgende Gene, welche Transferaseaktivität besitzen oder als Transkriptionsoder Wachstumsfaktoren bei der Embryonalentwicklung eine Rolle spielen und nun nicht mehr zu den BOFS-Kandidatengenen gezählt werden können: DIO2 (deiodinase, iodothyronine, type II), POMT2 (protein-O-mannosyltransferase 2), GSC (goosecoid), TGFB3 (transforming growth factor, beta 3). Goosecoid ist zur Differenzierung des Innenohrs notwendig. Die Haarsinneszellen des Innenohrs differenzieren mit Hilfe des Wachstumsfaktor Brn-3.1 (murin brain), welcher bereits in früheren Untersuchungen ausgeschlossen wurde. Ebenfalls in vorangegangen Untersuchungen wurde FGF-3, welcher in der Ohrplakode exprimiert wird, ausgeschlossen. Weitere Homöoboxgene, die während der Innenohrentwicklung exprimiert werden, sind: nkx-5.1 und nkx-5.2 (NK homeobox), aber auch der Wachstumsfaktor IGF-1 (Insulin-like growth factor 1). Auch PAX2 spielt eine Rolle bei der Innenohrentstehung, wurde allerdings schon früher ausgeschlossen. Während der Entwicklung des Innenohrs wird auch der Wachstumsfaktor TGF- α exprimiert. Ein Verwandter des TGF-α, der TGF-β3 ist ebenfalls in der ausgeschlossen Region auf Chromosom 14 lokalisiert und daher kein potenzielles Kandidatengen mehr. TGF-β3 ist an vielen Differenzierungsprozessen beteiligt, bei denen Störungen zu den typischen Symptomen des BOF-Syndroms führen können. Bei der Gaumenentwicklung ist TGF-β3 neben anderen Wachstumsfaktoren wie EGF, TGF-β und Aktivinβ3 maßgeblich beteiligt. Die Gaumenentwicklung erfolgt dabei in mehreren Stufen: 4. Diskussion 92 aus den medialen Nasenwülsten entsteht der primäre Gaumen, welcher sich zwischen die Oberkieferwülste schiebt. Aus dem primären Gaumen entsteht schlussendlich das Os incisivum. Der sekundäre Gaumen entsteht aus den paarigen Gaumenfortsätzen die miteinander, mit dem Nasenseptum und dem primären Gaumen verwachsen. Ein Teil der oben genannten Wachstumsfaktoren (EGF, IGF-1, IGF-2, TGF-α, TGF-β, BMP-7, NT-3 (3' nucleotidase) und BDNF (brain-derived neurotrophic factor)) sowie einige Zelladhäsionsmoleküle wie Syndecan, N-CAM (neural cell adhesion molecule) und E-Cadherin sind bei den Induktionsprozessen der Nierengeneration von Pronephros über Mesonephros bis hin zum Metanephros beteiligt. Eine essentielle Rolle spielen hier auch das bereits genannte, ausgeschlossene Gen PAX2, welches im Vornierenblastem exprimiert wird, sowie WT1 (Wilms Tumor 1) und einige Protoonkogene. Diese Gene waren aufgrund der bei BOFS-Patienten beschriebenen Nierenanomalien potenzielle Kandidaten. In der von mir untersuchten Region zwischen den Markern D15S131 und D15S120 auf Chromosom 15 sind unter 219 Genen sieben zuvor als verdächtig postulierte Gene zu finden, welche jetzt durch meine Analysen ausgeschlossen werden konnten. Hiervon ist das ALDH1A3-Gen (aldehyde dehydrogenase 1 family, member A3) als wichtigstes zu nennen. Dieses Gen wird während der Entwicklung von Auge und olfaktorischem System exprimiert und besitzt Aldehyddehydrogenase- und Oxidoreduktase-Aktivität. In dieser Region befinden sich wiederum Gene, die für protein- oder nukleotidbindende Moleküle mit Kinaseaktivität (LRRC28 (leucine rich repeat containing 28), LRRK1 (leucine-rich repeat kinase 1)), für Calciumionen bindende Transporter (MCTP2 (Multiple C2 and transmembrane domain-containing protein 2 )) oder für Moleküle intrazellulärer Signalwege (ASB7 (ankyrin repeat and SOCS box-containing 7)) kodieren. Chromosom 21 kann zwar aufgrund der Haplotypenkonstellation in der von mir untersuchten Region (D21S1256 bis D21S1899) nicht ausgeschlossen werden, kommt allerdings aufgrund der relativ kleinen Größe dieser Region (3 Mbp) und der Tatsache, dass die restliche Region dieses Chromosoms in früheren Untersuchungen bereits ausgeschlossen werden konnte als möglicher BOFS- 4. Diskussion 93 Kandidat eher nicht in Betracht, kann aber nicht 100%ig ausgeschlossen werden. In dem von mir untersuchten Bereich befinden sich wiederum einige Nukleotidoder RNA-bindende Transkriptionsfaktoren, wie die Helikase BACH1 (BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1), RBM11 (RNA binding motif protein 11) und ZNF294 (zinc finger protein 294), welche als potenzielle BOFS-Kandidaten gehandelt wurden - wobei anzumerken ist, dass BACH1 über die Bindung und Aktivierung von BRCA1 (breast cancer 1, early onset) und RAD51 (RAD51 homolog (RecA homolog, E. coli) (S. cerevisiae)) vor allem an der DNA-Reparatur beteiligt ist [28] und daher nicht als Differenzierungsfaktor, sondern eher als Haushaltsgen zu betrachten ist. Weiterhin finden sich dort folgende Gene: ATP5J (ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit F6), CYYR1 (cysteine and tyrosine-rich 1), MRPL39 (mitochondrial ribosomal protein L39), SAMSN1 (SAM domain, SH3 domain and nuclear localisation signals, 1), STCH (stress 70 protein chaperone, microsome-associated, 60kDa) und USP16 (ubiquitin specific protease 16). Nachdem ich bisher diejenigen Chromosomen dargestellt habe, welche anhand meiner Analysen komplett ausgeschlossen wurden, möchte ich jetzt auf die Chromosomen näher eingehen, welche zwar weitestgehend ausgeschlossen werden konnten, aber noch relativ kleine Regionen gemeinsamer Haplotypen bei erkrankten Personen der untersuchten Familien besitzen, und somit weiterhin das BOFS-Kandidatengen enthalten könnten. Zu diesen Chromosomen, bei denen der größte Teil ausgeschlossen werden kann, gehören die Autosomen 3 und 19. Auf Chromosom 3 konnte aufgrund gemeinsamer Haplotypen aller Erkrankten, die Region zwischen den Markern D3S3695 und D3S1267 (110 Mbp bis 126 Mbp) als mögliche Kandidatenregion definiert werden. Gleichzeitig konnte durch meine Untersuchungen die ca. 66 Mbp große Region zwischen den Markern D3S1292 und D3S1311, aufgrund gleicher Haplotypen bei gesunden und erkrankten Individuen, ausgeschlossen werden. Dort befinden sich einige Transkriptionsfaktoren (SOX14 (SRY (sex determining region Y)-box 14), RNF13 (ring finger protein 13), TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)), TFDP2 (transcription factor Dp-2 (E2F dimerization partner 2)), ZIC1 (Zic family member 1 (odd-paired homolog, Drosophila)), ZIC4 (Zic family member 4)) sowie 4. Diskussion ein Gen, welches bei dem BOFS ähnelnden Usher-Syndrom (OMIM 276902) mutiert ist (USH3A (Usher syndrome 3A)). In der potenziellen Kandidatenregion befinden sich 138 Gene, von denen nachfolgende erwähnenswert sind. ITGB5 (integrin, beta 5) kodiert für einen integrinbindenden Rezeptor, welcher bei der Entwicklung der Retina eine Rolle spielt. MUC13 (mucin 13, cell surface associated) ist ein Calciumionen bindendes, transmembranäres Molekül, welches bei der Signalübertragung von Zellen eine wichtige Rolle inne hat. Ein weiterer Ionentransporter, der sich in dieser Region befindet, ist SLC12A8 (solute carrier family 12 (potassium/chloride transporters), member 8). Weitere SLC-Gene (SLC9A10, SLC35A5, SLC15A2) mit ähnlicher Funktion sind ebenfalls in diesem Abschnitt lokalisiert. Auch befinden sich hier wieder Zinkfingerproteine (ZNF148, ZNF80, ZDHHC23 (zinc finger, DHHC-type containing 23), ZBTB20 (zinc finger and BTB domain containing 20)) und weitere Gene, über deren Funktion und Rolle als BOFS-Kandidat keine endgültige Aussage gemacht werden kann (BOC (BOC homolog (mouse)), SIDT1 (SID1 transmembrane family member 1), VSTM3 (V-set and transmembrane domain containing 3), GAP43 (growth associated protein 43), UPK1B (Uroplakin 1B), TMEM39A (transmembrane protein 39A), CSRP2P (cystein and glycin-rich protein 2 pseudogene), LRRC58 (leucin rich repeat containing 58), GTF2E1 (general transcription factor IIE, polypeptide 1, alpha, 56 kDa), FBX040 (F-Box protein 40)). Auch auf Chromosom 19 gibt es eine knapp 2 Mbp große Region (D19S418 bis D19S210), die als Kandidat in Frage kommt. In dem Bereich zwischen 60 Mbp und 61,7 Mbp befinden sich 70 Gene, wovon 17 Gene zu den Kandidaten gezählt werden können. U.a. sind auch hier wieder Transkriptionsfaktoren wie Zinkfingerproteine (ZNF444, ~471, ~524, ~579 bis ~583, ~628, ~667, ~784, ~787 und ZSCAN5 (zinc finger and SCAN domain containing 5A)) vertreten. Daneben sind dort Gene lokalisiert, welche an intrazellulären Signalkaskaden beteiligt sind und Hormonaktivität (GALP (galanin-like peptide precursor)) oder Transferaseaktivität (SUV420H2 (suppressor of variegation 4-20 homolog 2 (Drosophila))) besitzen. Ein weiteres sich dort befindendes Gen ist U2AF2 (U2 (RNU2) small nuclear RNA auxiliary factor 2), welches am Spleißen von prä-mRNA beteiligt ist und zur RNA-, Protein- und Nukleotidbindung befähigt ist. Die restliche Region (D19S209 bis D19S572) dieses Chromosoms kann aufgrund der Haplotypenkonstellation 94 4. Diskussion ausgeschlossen werden. Zu den nun ausgeschlossenen Kandidatengenen dieser Region zählen wiederum sehr viele Transkriptionsfaktoren, wie Mitglieder eines Zinkfinger-Clusters, welche alle als potenzielle Kandidaten angesehen wurden (ZEC (zink finger protein zec), ZFP28 (zink finger protein 28), ZNF132, ~134, ~135, ~137, ~154, ~160, ~17, ~211, ~256, ~272, ~274, ~28, ~304, ~324, ~347, ~350, ~415, ~42, ~494, ~495, ~497, ~499, ~524, ~528, ~530, ~534, ~542, ~543, ~544, ~547 bis ~552, ~577, ~578, ~584, ~586, ~587, ~600, ~606, ~610, ~611, ~613 bis ~616, ~71, ~8, ~83 und ZSCAN1 (zinc finger and SCAN domain containing 1)), das CNOT3-Gen (CCR4-NOT transcription complex, subunit 3), KLP1 (K562 cell-derived leucine-zipper-like protein 1) und TMC4 ( transmembrane channel-like 4)), ein Gen welches für einen Ionenkanal kodiert. Schließlich gibt es noch drei Chromosomen, bei denen, aufgrund der Haplotypenkonstellation und des auffälligen Allelstatus, die von mir untersuchten Regionen als BOFS-Kandidaten in Frage kommen. Dies sind Regionen auf Chromosom 22, 18 und 6. Letzteres wird ausführlich diskutiert, da dort tatsächlich das gesuchte Gen lokalisiert ist. Auf Chromosom 22 befinden sich in der Region von 0 bis 20.588.089 bp (D22S420 bis D22S539) 167 Gene. Dies sind immerhin noch ca. 40% von Chromosom 22. Von diesen Genen sind jedoch nur 15 verdächtig, BOFSKandidatengene sein zu können. Unter ihnen befinden sich Gene, die beim Katzenaugen-Syndrom (OMIM 115470) mutiert sind (CECR1 (cat eye syndrome chromosome region, candidate 1) sowie CECR5 und ~6). Bei diesem Syndrom finden sich viele klinische Merkmale wie Kolobome, präaurikuläre Grübchen, Nierenagenesie, Gaumenspalten, welche den Symptomen des BOF-Syndroms ähneln. Außerdem befindet sich dort PEX26 (peroxisome biogenesis factor 26), welches in der Lage ist, Proteine zu binden. Dieses ist bei Personen mit Zellweger Syndrom (OMIM 214100) mutiert – eine autosomal rezessiv vererbte, tödlich verlaufende Krankheit, die als typische Malformationen Entwicklungsstörungen des Schädels, der Hände und Füße zeigt. Auf Chromosom 18 kommt ein sehr großer Teil der Gene aus dem von mir untersuchten Chromosomenabschnitt zwischen den Markern D18S1127 und 95 4. Diskussion D18S1147 sowie D18S465 und D18S70 als Kandidat in Betracht. Hierbei sind besonders die Gene CDH19 (cadherin 19, type 2) und SALL3 (sal-like 3 (Drosophila)) zu nennen. CDH19 ist ein Calciumionen bindendes Zelladhäsionsprotein, welches zur Gruppe der Cadherine gehört. Cadherine sind Zelloberflächenproteine, welche an der strukturellen und funktionellen Organisation des Zellverbands in einem Gewebe beteiligt sind. Cadherine spielen bei der Nierenentwicklung eine wichtige Rolle. SALL3 ist mit SALL1 verwandt, welches bei Personen mit TownesBrocks-Syndrom (OMIM 107480) mutiert ist. Da dieses Krankheitsbild dem BOFS in der phänotypischen Ausprägung sehr ähnlich ist, wurden SALL-Gene als potenzielle Kandidaten festgelegt. SALL3 selbst stellt ein DNA-bindendes Zinkfingerprotein dar. Es wird während der Gehirnentwicklung exprimiert und ist beim 18q Deletions-Syndrom (OMIM 601808) deletiert, was zu einer Haploinsuffizienz führt, welche bei der Ausprägung des klinischen Erscheinungsbilds ursächlich sein kann [96]. Jedoch weicht der Phänotyp beim 18q-Deletions-Syndrom schon aufgrund des typischen Minderwuchses deutlich vom BOFS ab, sodass sich diese Abweichungen eher einschränkend auf eine Nominierung als Kandidatengen niederschlagen. Neben einigen Zinkfingerproteinen (ZNF407 und ZNF516), welche aufgrund ihres Potenzials als Transkriptionsfaktoren zu fungieren, alle als potenzielle Kandidaten angesehen werden können, befindet sich hier ein weiterer BOFS-Kandidat: das CTDP1-Gen (CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase II, polypeptide A) phosphatase, subunit 1). Dieses Gen kodiert ebenfalls für einen Transkriptionsfaktor, welcher die Aktivität der RNA-Polymerase II fördert. Weiterhin ist in dieser Region ZADH2 (zinc binding alcohol dehydrogenase, domain containing 2) lokalisiert, welches für eine Zinkionen bindende Oxidoreduktase kodiert. Lediglich einen etwa 4 Mbp großen Bereich konnte ich anhand der Haplotypenkonstellation ausschließen. In der Region von 57.562.910 bp bis 61.046.915 bp (um den Marker D18S68) befinden sich 24 Gene, wovon neun zur Klasse B der Serpine zählen (SERPINB8 (serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 8) sowie SERPINB2 bis ~5 und ~10 bis ~13) und alle Inhibitoren der Endopeptidase vom Serintyp darstellen. Auch die sich in dieser Region befindenden Transkriptionsfaktoren (RNF152, ZCCHC2 (zinc finger, CCHC domain containing 2)) sowie die proteinbindende Phosphatase mit katalytischer und hydrolytischer Funktion (PHLPP (PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase)) und das VPS4B-Gen (vacuolar protein sorting 4B (yeast)), 96 4. Diskussion 97 welches am intrazellulären Proteintransport beteiligt ist und eine DNA-Bindungsdomäne besitzt, können somit zu den als BOFS-Kandidaten ausgeschlossenen Genen gezählt werden. Bei der Segregationsanalyse für Chromosom 6 gab es ebenfalls einen ausgeschlossenen Bereich aufgrund unterschiedlicher Haplotypen, aber auch einen großen gemeinsamen Bereich, der wegen einiger auffälliger Markerallele und parallel erhobener Daten einer amerikanischen Studie letztendlich die Eingrenzung und Identifikation des Kandidatengens für das BOF-Syndrom gestattete. Der ausgeschlossene Bereich erstreckt sich über einen Bereich von ca. 20 MBp von Marker D6S1660 bis D6S291 in den zytogenetischen Banden 6p22.2 bis 6p21.31. Besonders erwähnenswert ist der Ausschluss nachfolgender Gene, welche bei der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle spielen und in früheren Arbeiten als BOFS-Favoriten ausdrücklich erwähnt wurden. Der Transkriptionsfaktor POU5F1 (POU domain, class 5, transcription factor 1 alias Pou class 5 homeobox 1) ist ein Kontrollgen der frühen Entwicklung und ist in neuronalen Zellen exprimiert. Ein weiteres Gen - GMNN (Geminin) – übt eine duale Funktion als Transkriptionsfaktor in einem Chromatinmodellierungskomplex und als Kontrollelement im Zellzyklus aus. Ferner konnten in der vorgenannten Region einige Transkriptionsfaktoren wie GTF2H4 (general transcription factor IIH, polypeptide 4, 52kDa), LRRC16 (leucine rich repeat containing 16), PBX2 (pre-B-cell leukemia homeobox 2), PHF1 (PHD finger protein 1), RING1 (ring finger protein 1), RNF5 (ring finger protein 5), TAF11 (TAF11 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 28kDa), TRIM10 (tripartite motif-containing 10), TRIM15, ~26, ~31, ~38 bis ~40, ZNF165, ~184, ~187, ~192, ~311, ~76 und ZNRD1 (zinc ribbon domain containing, 1) ausgeschlossen werden. Dieser Abschnitt enthält ferner drei Gene für die Kinasen CSNK2B (casein kinase 2, beta polypeptide), STK19 (serine/threonine kinase 19) und IHPK3 (inositol hexaphosphate kinase 3,) drei für Hydrolasen kodierende Gene DDAH2 (dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2), GPLD1 (glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1) und THEM2 (thioesterase superfamily member 2), sowie das Gen einer Peroxidase GPX6 (glutathione peroxidase 6 (olfactory)). Moleküle der intrazellulären Signalübertragung wie Rezeptoren (NOTCH4 (Notch homolog 4 (Drosophila)), DDR1 (discoidin domain receptor family, member 1) und 4. Diskussion 98 Ionenkanäle/ -transporter wie CLIC1 (chloride intracellular channel 1), MRS2L (MRS2-like, magnesium homeostasis factor (S. cerevisiae)), SLC39A7 (solute carrier family 39 (zinc transporter), member 7) sind somit ebenfalls ausgeschlossen. Vergleicht man die Haplotypen aller Personen aus dem Stammbaum in der von mir untersuchten Region (D6S1617 bis D6S291), so fällt auf, dass für dieses Chromosom die Haplotypen aller Erkrankten über einen sehr großen Bereich identisch sind, und im Intervall D6S1617 bis D6S422 alle Gesunden einen abweichenden Haplotyp zeigen. Dies ergibt die Möglichkeit, dass in dieser Region das BOFS-Kandidatengen enthalten sein kann. Diese ca. 25 MBp umfassende Region gemeinsamer Haplotypen bei allen Erkrankten schließt ca. 800 Gene ein, wobei die Cluster der sich dort befindenden tRNA-Gene oder der Gene für Histonproteine von vornherein als BOF-Kandidaten ausgeschlossen werden können. Jedoch befinden sich hier auch Gene wie Vertreter der Serpin B – Klasse (SERPINB1, ~6, und ~9) sowie einige Transkriptionsfaktoren, die aufgrund ihrer Funktion als Genregulatoren als Favoriten angesehen werden können. Unter den Transkriptionsfaktoren befinden sich wieder Ring- (RNF39, RNF8) und Zinkfingerproteine (ZNF322A), aber auch andere Gene wie ABT1 (activator of basal transcription 1), ein TATA-bindendes Protein, welches die basale Transkription reguliert. Weitere, während der Embryonalentwicklung exprimierte Gene sind in diesem Bereich lokalisiert und galten somit ebenfalls als Favoriten: DAAM2 (dishevelled associated activator of morphogenesis 2), FOXF2 (forkhead box F2), FOXP4 (forkhead box P4), FOXQ1 (forkhead box Q1) und FRS3 (fibroblast growth factor receptor substrate 3). Daneben finden sich ein rezeptorbindendes Protein mit Hormonaktivität, welches mit sehr vielen fetal exprimierten Genen interagiert (EDN1 (endothelin 1)), ein Mitglied der SOXFamilie (SOX4 (SRY (sex determining region Y)-box 4)), welches als Transkriptionsfaktor agiert und an der Nierenentwicklung beteiligt ist, ein Calciumionen bindender Signalsequenzrezeptor, welcher die Proteinretention am endoplasmatischen Retikulum reguliert (SSR1 (signal sequence receptor, alpha (translocon-associated protein alpha))) und ein Enzym mit Ubiquitin-ThiolesteraseAktivität (USP49 (ubiquitin specific protease 49)). Bereits bei der Auswertung der GenoTyper®-Daten sind die Allele zweier Marker aus dem soeben beschriebenen Intervall aufgefallen. Dabei zeigte sich bei den 4. Diskussion Markern D6S309 und D6S470 der Verlust je eines Allels bei allen erkrankten Personen des Stammbaums. Hingegen ist dieser Allelverlust im Bereich von ca. 9.18 Mbp bis 15.35 Mbp bei keinem gesunden Individuum nachzuweisen. Dieser Befund kann als interstitielle Deletion oder - eher unwahrscheinlich - als partielle, uniparentale (Iso-)Disomie interpretiert werden. Direkt in dieser Region, welche durch Hemizygotie, also dem Verlust eines Allels charakterisiert ist, sind nur wenige Gene nennenswert. Unter ihnen befinden sich ein das Knochenwachstum regulierendes Protein mit Zytokinaktivität (BMP6 (bone morphogenetic protein 6)) und ein Mitglied der SLC-Familie (SLC35B3 (solute carrier family 35, member B3)), welche im Wnt-Signalweg eine wichtige Rolle spielen. BMP6 ist mit BMP7 nahe verwandt, welches eine Rolle während der Augenentwicklung spielt und sowohl in der Linsenplakode als auch in der Retina exprimiert wird. Außerdem befindet sich in dieser Region noch ein Gen, welches durch Mutationen zu orofazialer Spaltbildung führt (OFCC1 (orofacial cleft 1 candidate 1)). Unter anderem ist dort auch der Transkriptionsfaktor TFAP2A (transcription factor AP2 alpha (activating enhancer binding protein 2 alpha)) lokalisiert, welcher über sequenzspezifische DNA-Bindung die Expression verschiedener Gene reguliert. Wie bereits angedeutet, hat eine Arbeitsgruppe aus Boston (USA) nach Abschluss meiner Segregationsanalysen exakt an der selben Familie auf Chromosom 6 das BOFS-Kandidatengen identifiziert und den Verlust der Allele als interstitielle Deletion charakterisiert. In der 3.2 Mbp großen Deletion wurden alle Gene sequenziert und TFAP2A als Kandidatengen des BOF-Syndroms identifiziert. Ich beschloss darauf hin, meine Arbeit zu erweitern und bei weiteren BOFS-Fällen dieses Gen zu sequenzieren. Nachdem ich bei der anschließenden Sequenzierung des TFAP2A-Gens auf Chromosom 6 bei allen untersuchten, erkrankten Personen Mutationen gefunden habe, können die anderen Favoriten eigentlich ausgeschlossen werden und die gemeinsamen Haplotypen bei den Erkrankten als Zufall bzw. aufgrund geringer Markervariabilität als nicht informative Intervalle angesehen werden. Nach der Sequenzierung konnte ich vier verschiedene Mutationen im TFAP2AGen identifizieren: eine Mutation im Exon 4 c.769A>G (auf Proteinebene: p.Arg255Gly), welche ich bei dem sporadischen Fall aus Phillipsburg und bei der Familie aus Belgien gefunden habe und die somit eine rekurrierende Mutation darstellt. Die p.Arg255Gly-Mutation ist identisch mit einer Mutation, welche in 99 4. Diskussion 100 einem weiteren sporadischen Fall mit BOF-Syndrom beschrieben wurde [Person 2 in 138]. Wenn man die Daten für das Vorhandensein der p.Arg255Gly-Mutation zusammenfasst, tritt diese sowohl in einem kürzlich veröffentlichten sporadischen Fall, als auch in einem meiner familiären Fälle sowie in einem weiteren sporadischen Fall meiner Studie auf, und kann somit als eine rekurrierende Mutation betrachtet werden. Unter allen bisher berichteten Fällen, wobei es sich um acht nicht-verwandte Fälle handelt [138 und meine Fälle], konnte diese Mutation bei drei Fällen identifiziert werden, was die c.769A>G-Mutation (g.10529A>G) zu einem Mutationshotspot machen könnte. Die zweite MissenseMutation habe ich in Exon 6 an Position c.1305G>A (Proteinebene: p.Glu296Lys) gefunden. Hier wird eine saure Aminosäure durch eine basische ersetzt. Diese Mutation wurde zuvor nie beschrieben und konnte bei allen Erkrankten der Familie aus Chemnitz nachgewiesen werden. Diese Familie stellt die größte am BOFSyndrom erkrankte Familie dar. Während die p.Arg255Gly-Mutation an einer Stelle im Exon 4 lokalisiert ist, an der eine vermehrte Anzahl an Mutationen beschrieben worden ist [138], befindet sich die p.Glu296Lys-Mutation in Exon 6 und stellt somit die erste Exon-6-Mutation überhaupt dar. Weiterhin konnte ich bei dem sporadischen Fall (eventuell familiären Fall – bei der Großmutter besteht der Verdacht, dass sie ebenfalls am BOFS erkrankt ist) eine weitere MissenseMutation c.1058T>G (Proteinebene: p.Leu269Pro) im Exon 5 nachweisen. Auch hier findet ein Aminosäurenaustausch in einem hochkonservierten Bereich des TFAP2A-Gens statt. Dies stellt somit die zweite bekannte Mutation im Exon 5 dar. Bisher wurde nur eine weitere Mutation (g.12448C>T) in diesem Exon beschrieben [138]. Alle bisher genannten Individuen, welche ich untersucht habe, sind europäischen Ursprungs. Auch die BOFS-Fälle aus dem kürzlich veröffentlichten Artikel sind europäischen Ursprungs [138]. Bei meinem zweiten Fall aus Frankreich allerdings stammen die Eltern aus Algerien und sind somit nicht europäischen Ursprungs. In diesem sporadischen Fall habe ich eine Missense-Mutation mit Aminosäurenaustausch in einer hochkonservierten Region des Exon 4 gefunden. Es handelt p.Arg237Gln). sich um folgende Mutation: c.716G>A (auf Proteinebene: 4. Diskussion 101 Allerdings ist es momentan noch zu früh über einen ursprünglichen Haplotyp zu spekulieren, da bisher noch nicht alle Daten in einer gemeinsamen Studie zusammengefasst wurden. TFAP2A kodiert für ein 436 Aminosäuren großes Protein und besteht aus sieben Exons. Bisher sind drei Transkript-Isoformen (a, b und c) des Gens bekannt, welche sich durch wechselnde Positionen und Translation von Exon 1 unterscheiden. Die Transkriptgröße der Isoformen a, b und c beträgt jeweils 3300 bp, 3808 bp und 3150 bp. In Exon 1 befindet sich das Translation-Start-Codon. Das StoppCodon befindet sich in Exon 7, gefolgt von einer 1733 bp großen 3’-UTR (untranslated region). TFAP2A gehört zur Familie der AP2-Proteine. Die AP2Familie von Transkriptionsfaktoren besteht beim Menschen aus fünf Mitgliedern: AP2α (offizieller Name: TFAP2A), AP2β (TFAP2B), AP2γ (TFAP2C), AP2δ (TFAP2D) und AP2ε (TFAP2E). Diese Paraloge sind vermutlich durch Genduplikation entstanden. Die AP2-Proteine werden zunächst im primitiven Ektoderm exprimiert, aber auch in der entstehenden Neuralleiste. Beim Zebrafisch werden die zwei AP2-Familienmitglieder Tfap2a und Tfap2b räumlich coexprimiert im Neuralrohr, dem Ektoderm und den pronephrischen Gängen der sich entwickelnden Niere. Bei Mäusen wird Tfap2a zusätzlich in Neuralleistenzellen exprimiert [48]. TFAP2A besitzt als Vertreter der AP2-Proteine eine H-S-H-Domäne, welche für die sequenzspezifische Protein-DNA-Interaktion benötigt wird [231]. Eine 89 Aminosäuren umfassende, Gln/Pro-reiche Region des Proteins, dient auch hier als Transaktivierungs-Domäne. Eine Expression dieses Gens ist für das Mesenchym von embryonalen Vorläufern des Gesichtes (faziale Prominenzen) beschrieben. Aber auch postnatal ist eine Expression in fazialem Gewebe gefunden worden [143]. Die Expression von AP2α in der embryonalen frontonasalen Erhebung und im Extremitätenknospenmesenchym wird durch ein Element im fünften Intron des Tfap2a-Gens gesteuert [240]. Funktionsverlust-Studien zeigen, dass Tfap2a eine wichtige Rolle in der fazialen, sowie in der Extremitätenmorphogenese spielt. Mäuse mit gegen Tfap2a gerichtetem Knockout zeigen okuläre und aurikuläre Defekte [3]. Hingegen generieren Cre-Rekombinase abhängige, konditionale Knockouts unter der Kontrolle des Tfap2a-Promoters abgeflachte Schnauzen, verstümmelte Nasenknochen, weit auseinander stehende Augen und veränderte 4. Diskussion 102 frontonasale Suturen. Außerdem zeigen diese Mäuse eine verringerte Fgfr2Expression [143]. Dadurch können sich ähnliche Symptome wie bei FGFR2Mutationen zeigen, die zu den typischen Formen von kraniofazialen DysostoseSyndromen führen. Somit waren die zwischenzeitlich ausgeschlossenen Gene der FGF/FGFR-Klasse durchaus berechtigte BOFS-Kandidatengene. Die TFAP2ACre-Expression ist für die kraniale Neuralleiste, die lateralen Kopfregionen, das Mesonephros, das Extremitätenknospenmesenchym, um die Nasengruben, im mittleren Teil der Unterlippe, die ventrale Maxillaprominenz und den ersten Branchialbogen beschrieben. Dies bedeutet, dass der TFAP2A-Promoter in diesen Geweben aktiv ist [143]. Auch eine Beteiligung des Gens an der Entwicklung des Verschlusses des Kraniums, des Linsenkörpers und fazialer Strukturen wurde beschrieben [188, 228]. Beispielsweise zeigen die ENU-induzierten (Ethylnitrosoharnstoff) Tcfap2a-Mutanten (Synonym: Tfap2a) Doarad (Dor) ausgeprägte faziale Anomalien, okuläre Defekte sowie Schwerhörigkeit, welche auf Veränderungen des Mittelohrs zurückzuführen ist. Diese Mutation führt zu einem Funktionsgewinn in der Transkriptionsaktivierung von Tfap2a. Allerdings zeigen Dor-Mäuse einen deutlich milder ausgeprägten Phänotyp als KnockoutMäuse, was auf die Lokalisation der Mutation in der Transaktivierungsdomäne zurückgeführt werden kann. Durch diese Mutation ist eine Homodimerbildung und DNA-Bindung weiterhin möglich. Lediglich die Transkriptionsaktivierung wird dadurch verändert [3]. Außerdem wurde gezeigt, dass Tfap2a während der Mittelohrentwicklung eine Rolle bei der Differenzierung und beim Zellüberleben in den Branchialbögen spielt [122]. Ohranomalien wurden auch beim Menschen beschrieben, gehäuft bei Patienten mit subtelomerem 6p-Deletions-Syndrom. In der deletierten Region befindet sich auch das TFAP2A-Gen [111]. Okuläre Phänotypen mit variablen Defekten des sich entwickelnden Auges, welche von verminderter Linsengröße, über Defekte des Linsenepithels bis hin zur Anophthalmie reichen, wurden zusätzlich bei Tcfap2a-Knockoutmäusen gefunden. Dies beruht darauf, dass Tcfap2a während der Augenentwicklung in der Linse, Kornea und Retina exprimiert wird. [228] Schon zuvor sind Deletionen in dieser Region beschrieben worden, welche zu Lippen- und Gaumenspalten führten. Hierbei wurde eine balancierte Translokation t(6;9)(p23;q22.3) im Zusammenhang mit Fehlbildungen der Ohrmuschel, Tränennasengang-Obstruktionen, frühzeitigem Ergrauen der Haare, aber ohne die 4. Diskussion 103 anderen typischen fazialen Veränderungen und Hautanomalien beim BOFS, beschrieben [44]. Auch Anomalien der vorderen Augenkammer wurden mit Deletionen in der TFAP2A-Region beschrieben [38]. Vor kurzem wurde gezeigt, dass die TFAP2A-Aminosäuresequenz von Exon 4 und 5, welche durch Mutationen betroffen sind, vom Menschen bis zu den Ascidacea (Seescheide) hoch konserviert ist [138]. Daher habe auch ich überprüft, ob eine Sequenzkonservierung für Exon 6 vorliegt. Ein Vergleich der Sequenzen auf der Genome-Browser-Webseite zeigte auch für diese Region eine sehr hohe Konservierung der Aminosäuresequenz an. Die Sequenzkonservierung an Position 296 wurde sogar in Tfap2a von Insekten wie der Honigbiene oder Moskitos mittels Protein BLAST-Suche [4] in der NCBI-Datenbank und auf der Swissprot EBI-Seite bestätigt. Folglich ist dieser Teil des C-Terminus des Gens aufgrund seines hohen Grades der Sequenzkonservierung essentiell. Exon 6 kodiert für die Aminosäuren von Position 280 bis 410, welche bei der Bildung der Helix-Span-Helix-Domäne (H-S-H) beteiligt sind. Diese Domäne ist entscheidend für die Dimerisierung. Daher führt eine Mutation in dieser Domäne zu einer Veränderung der DNA-Bindungs-Kapazität, was die Funktion dieses Proteins als Transkriptionsfaktor aufhebt. Die funktionelle Bedeutung der Exon 4 Domäne ist bisher noch nicht bekannt und solange keine vorzeitige Nonsense-Mutation folgt, die zu einem verkürzten Protein führen würde, ist es schwierig den dem BOFSyndrom zugrunde liegenden Pathomechanismus zu erklären. Mit Hilfe der SNP-Datenbank des NCBI führte ich eine Suche nach Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) in den Exons, in denen sich die Sequenzvarianten befinden, durch. Bemerkenswerterweise befindet sich die Mehrzahl der Mutationen, welche bei BOFS-Fällen gefunden worden sind, in Exon 4, 5 und 6, in denen sich keine SNP befinden. Diese letztgenannten Fakten sowie die hohe Sequenzkonservierung während der Evolution machen diese Regionen zu essentiellen Teilen dieses Gens. Für die monogene Erbkrankheit BOFS ist es etwas ungewöhnlich, dass in den beiden großen Familien (Chemnitz und USA), bei denen die Erkrankten über mehrere Generationen verteilt sind, die Ausprägung der Symptomatik von Generation zu Generation zunimmt. Somit zeigen die Großeltern weniger starke Ausprä- 4. Diskussion 104 gungen als die Enkel. Dieses Phänomen, Antizipation genannt, ist eher von Krankheitsbildern bekannt, die durch dynamische Mutationen charakterisiert sind. Der Gradient von den Großeltern zu den Enkeln kann wegen der geringen Fallzahlen auch auf Zufall beruhen und eine typische Form variabler Expressivität darstellen. Hier sind Gene als Modifikatoren beteiligt, indem sie die Aktivität anderer Gene regulieren. Dafür müssen sich diese Modifikatoren auf einem anderen Chromosom befinden und damit unabhängig segregieren. Allerdings können sich die Modifikator-Gene nicht unter den Genen befinden, die sich in der Region befinden, welche allen Erkrankten gemeinsam ist. Diese sind auszuschließen, da sonst die jeweilige Großmutter auch dieses Modifikator-Allel tragen müsste und somit auch einen stärker ausgeprägten Phänotyp, wie die Enkel, zeigen müsste. Daher kommen als Regionen, welche diese Modifikatoren enthalten könnten, nur solche Regionen in Betracht, die bei den Erkrankten verschieden sind. Da dieser Bereich allerdings sehr groß ist, ist es anhand so weniger Familien, die diese Krankheit haben, unmöglich mittels Segregationsanalyse die Modifikatoren zu finden. Derzeit gibt es noch keine umfangreichen Genotyp-Phänotyp-Untersuchungen zum BOF-Syndrom. Durch verschiedene Mutationen in verschiedenen Abschnitten des Gens kann es entweder zu einem Funktionsverlust, oder zu einem –gewinn kommen, was sich wiederum in verschiedenen Phänotypen äußern dürfte. 4.1. Vergleich mit ähnlichen Krankheitsbildern Vergleicht man das BOFS mit den Krankheitsbildern BORS, BOS und TBS, so fällt auf, dass zwar eine phänotypische Korrelation vorliegt, allerdings allen Syndromen Mutationen in anderen Genen als beim BOFS zu Grunde liegen. Beim Branchiooto-renalen Syndrom wurden Mutationen in EYA1 (8q12-q13), BOS2 (1q31.2q32.1), SIX1 (14q23.1) und SIX5 (19q13.3) beschrieben. Dem Branchio-otischen Syndrom liegen ebenfalls Mutationen in den Genen EYA1 und SIX1 sowie im Locus BOS2 zu Grunde. Beim Townes-Brocks-Syndrom ist SALL1 (16q21.1) mutiert. Diese Gene liegen alle in Regionen, welche beim BOFS als mögliche Kandidaten ausgeschlossen wurden. Aufgrund der ähnlichen Phänotypen wäre allerdings denkbar, dass eventuell Interaktionen der Gene oder gleiche 4. Diskussion 105 Expressionsorte während der embryonalen Entwicklung vorliegen könnten. Nicht nur die räumliche, sondern auch die zeitliche Expression sollte überlappen, da die auftretenden Symptome allesamt Defekte der Embryonalentwicklung darstellen. Das sequenzspezifische DNA-bindende Protein TFAP2A interagiert mit induzierbaren, viralen und zellulären Enhancer-Elementen über das Sequenzmotiv GCCNNNGGC, um die Transkription ausgewählter Gene zu regulieren. Eine Aktivierung von Genen, welche die Entwicklung von Auge, Gesicht und Neuralrohr regulieren, wurde ebenfalls beschrieben. Das TFAP2A-Gen ist in mehrere Signalwege involviert. Beispielsweise in der MAPK-Kaskade, bei der Transkriptionsregulation des Aminosäurestoffwechsels oder der Mitoseinduktion. Von membranständigen Rezeptoren erfolgt eine Signalübertragung über den MAP-Kinase-Weg. Hierbei sind Proteine der Zellproliferation und der Apoptose beteiligt. Kommt es zu Funktionsveränderungen oder –anomalien der Expression dieser Gene, werden die entsprechenden Entwicklungsprozesse gestört. Mutationen können daher zu schweren phänotypischen Veränderungen führen. Anhand des MAP-Kinase-Weges wird auch erkennbar, wie eng Rezeptoren, Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren bei der Differenzierung zusammenspielen. Durch extrazelluläre Signale werden die Rezeptoren aktiviert, was wiederum eine Phosphorylierung und Aktivierung verschiedener Proteine bewirkt. Diese können dann die Transkription verschiedener Gene mittels Transkriptionsfaktoren steuern. Neben der Interaktion mit dem MAPK-Weg sind Interaktionen von TFAP2A mit Integrinen der Extrazellulärmatrix sowie mit UBE2I (SUMO-conjugating enzyme UBC9) [50], EP300 (Histone acetyltransferase p300) [20], CITED2 (Cbp/p300-interacting transactivator 2) [20], GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) [9] und vielen weiteren Genen beschrieben worden. Ein weiteres wichtiges Gen, das mit den AP2-Transkriptionsfaktoren interagiert, ist PAX6 [195], welches auch beim Ausschluss der BOF-Favoritengene von Chromosom 11 bereits diskutiert wurde. Bisher wurde jedoch keine Interaktion mit einem Gen beschrieben, welches bei einem der anderen Krankheitsbilder mutiert ist. Somit kann der ähnliche Phänotyp nicht durch direkte Interaktionen hervorgerufen werden. Trotzdem besteht durchaus die Möglichkeit, dass die verschiedenen Signalwege der ähnlichen Syndrome eine gemeinsame Endstrecke besitzen könnten oder in irgendeiner anderen Weise zusammenführen. Dies wäre eine mögliche Erklärung für die ähnlichen Phänotypen. 4. Diskussion 106 Allerdings werden alle Gene dieser verwandten Krankheitsbilder während der Embryogenese in sehr ähnlichen Gebieten exprimiert: TFAP2A wird in der Planzenta, im Rückenmark, in der Niere, im Auge (auch Linsenbläschen), in der Epidermis, in den dorsalen Ganglienwurzeln und im Cerebrum exprimiert. Auch EYA1 wird während der Gehirn- und Nierenentwicklung exprimiert. SIX1 zeigt ebenfalls Expressionsgebiete, welche sich mit denen von TFAP2A überschneiden. Dies sind die dorsalen Ganglienwurzeln, das Auge, das Ohr und die Niere. Bei SIX5 gibt es eine Überschneidung während der Augenentwicklung (auch Linse). SALL1-Expressionen sind für die Niere, das Gehirn, das Auge, die Nase und das Ohr beschrieben. Dies könnte ebenfalls die ähnlichen Phänotypen erklären. Daher sollte in Zukunft untersucht werden, ob die verschiedenen Signalwege der unterschiedlichen Gene eventuell doch irgendwie zusammen hängen oder gemeinsame Zielorgane besitzen. Erstaunlicherweise sind, seit das BOFS-Gen bekannt wurde sehr viele neue v.a. sporadische BOFS-Fälle diagnostiziert worden. Diese neuen Fälle könnten bei weiteren Untersuchungen nach Zusammenhängen mit dem BORS und BOS eventuell hilfreich sein. 5. Zusammenfassung 107 5. Zusammenfassung Das Branchio-okulo-faziale Syndrom (BOFS, BOF-Syndrom) ist ein sehr seltenes, autosomal dominant Variabilität im vererbtes, Phänotyp. Veränderungen Die (Ohranomalien, monogenes Symptome Krankheitsbild reichen mit von Nasenveränderungen, äußerster kraniofazialen Gesicht- und Gaumenspalten, Tränengangstenosen, Auganomalien und Halsfisteln) über Nierenanomalien bis hin zu Wachstumsstörungen und ektodermalen Veränderungen wie frühzeitiges Ergrauen der Haare. Trotz einer Vielzahl von Untersuchungen konnte allerdings bisher das ursächliche Gen nicht identifiziert werden und somit ist die Pathogenese des BOFS bis heute unbekannt. Allerdings wird aufgrund der Symptome vermutet, dass es sich um eine Verschlussstörung des ersten oder zweiten Branchialbogen handeln muss. Eine Vielzahl von Genen konnten in vorangegangen Arbeiten als Kandidatengene bereits ausgeschlossen werden. Hierunter fallen unter anderem Gene, welche bei den, dem BOFS ähnelnden Krankheitsbildern mutiert sind. Zu diesen zählen das EYA1- (eyes absent), SIX1- (sine oculis homeobox), SIX5- und SALL1-Gen (sallike). In einer genomweiten Suche nach dem BOFS-Kandidatengen konnten 83% aller Gene, darunter die kompletten Autosomen 1, 8, 9, 10, 16, 17 und 20 sowie das X-Chromosom ausgeschlossen werden. Meine Arbeit knüpft an dieses genomweite Screening an. Anhand der DNA einer sechsköpfigen (drei gesunde und drei erkrankte Personen), drei Generationen umfassenden Familie untersuchte ich diejenigen Regionen des menschlichen Genoms, die in vorangegangenen Arbeiten noch nicht ausgeschlossen werden konnten, um somit die Region um das BOFS-Kandidatengen weiter einzugrenzen und weitere Chromosomen ausschließen zu können. Hierzu führte ich mittels fluoreszenzmarkierten Mikrosatellitenmarkern Segregationsanalysen durch. Mit Hilfe von Computerprogrammen konnte ich anschließend für jedes Familienmitglied die wahrscheinlichsten Haplotypen berechnen und anhand der Haplotypenverteilung zwischen gesunden und erkrankten Individuen weitere Genregionen definieren, welche entweder als BOFS-Kandidatenregion ausgeschlossen werden konnten oder als solche weiterhin in Betracht kommen. Anhand dieses Verfahrens konnte ich, unter Einbezug der vorangegangenen Arbeit, die kompletten Chromosomen 2, 4, 5, 7, 11, 12, 13, 14, 15 und 21 5. Zusammenfassung 108 ausschließen, die Kandidatenregion zu enthalten. Auch bei Chromosom 3 und 19 konnte ich den größten Teil der Gene ausschließen. Hingegen zeigten sich Chromosom 22, 18 und 6 als potenzielle Favoriten, das Gen zu enthalten. In den von mir untersuchten Regionen befinden sich insgesamt 5.080 Gene, wovon 651 BOFS-verdächtig erschienen. Anhand der Segregationsanalysen konnte ich weitere 3.795 Gene (510 BOFS-verdächtige) ausschließen, wodurch lediglich 1.285 Gene (hiervon sind 141 BOFS-verdächtig) als potenzielle Kandidaten übrig blieben. Da in den USA gleichzeitig an der selben Familie geforscht wurde und nach Abschluss meiner Segregationsanalysen die Genregion publiziert wurde, in der sich das BOFS-Kandidatengen befindet, führte ich an weiteren sporadischen und familiären BOFS-Fällen Sequenzierungen des BOFS-Kandidatengens (TFAP2A, transcription factor AP-2 alpha) durch. Hierbei entdeckte ich vier verschiedene Mutationen. Eine rekurrierende p.Arg255Gly-Mutation (Proteinebene: an Position 255 wird Arginin durch Glycin ersetzt) in Exon 4 und weitere Missense-Mutationen. Diese befinden sich in Exon 6 (Proteinebene: p.Glu296Lys, an Position 296 wird Glutamat durch Lysin ersetzt) - hier wird eine saure Aminosäure durch eine basische ersetzt - in Exon 5 (Proteinebene: p.Leu269Pro, an Position 269 wird Leucin durch Prolin ersetzt) und in Exon 4 (Proteinebene: p.Arg237Gln, an Position 237 wird Arginin durch Glutamin ersetzt) des TFAP2A-Gens. Um sicher zu gehen, dass es sich nicht um einfache Einzelnukleotidpolymorphismen handelt, führte ich Abgleiche mit Datenbanken durch. Diese fielen alle negativ aus. Daher muss davon ausgegangen werden, dass es sich bei den gefundenen Sequenzvarianten um echte Mutationen handelt. Zusätzlich überprüfte ich für Exon 6 die Sequenzkonservierung und fand heraus, dass diese Region bis hin zu der Ascidacea (Seescheide) hoch konserviert ist. Dies macht diese Region des Gens zu einem essentiellen Teil. Nach Publikation des BOFS-Kandidatengens, wurden plötzlich einige weitere BOFS-Fälle diagnostiziert. Dies zeigt, dass aus einem zuvor eher unbekannten und sehr seltenen Krankheitsbild ein nun mehr beachtetes Syndrom geworden ist. Diese neuen Fälle könnten bei weiteren Untersuchungen nach Zusammenhängen mit dem Branchio-oto-renalen und Branchio-otischen Syndrom eventuell hilfreich sein. 6. Literaturverzeichnis 109 6. Literaturverzeichnis 1. Abdelhak S., Kalatzis V., Heilig R., Compain S., Samson D., Vincent C., Weil D., Cruaud C., Sahly I., Leibovici M., Bitner-Glindzicz M., Francis M., Lacombe D., Vigneron J., Charachon R., Boven K., Bedbeder P., Van Regemorter N., Weissenbach J., Petit C., A human homologue of the Drosophila eyes absent gene underlies branchio-oto-renal (BOR) syndrome and identifies a novel gene family, Nat. Genet.15: 157-164, (1997a) 2. 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Biol. 298: 430-441 (2006) Anhang Abbildung 35: Stammbaum der Chemnitzer Familie [88]. 140 Danksagung 141 Danksagung Dank der tatkräftigen Unterstützung der gesamten Arbeitsgruppe des Instituts für Humangenetik war mir die erfolgreiche Fertigstellung dieser Arbeit möglich. Aus diesem Grund möchte ich mich ganz herzlich bei Marlies Miersch für die Einarbeitung, Angela Schulze, Thea Trautmann und Alexandra Süß für die technischen Hilfestellungen, sowie Mariella Neuhäuser für die stets aufmunternden Worte bedanken. Ein herzliches Dankeschön möchte ich auch an Walter Just aussprechen, welcher mir diese Arbeit ermöglichte, stets ein offenes Ohr für alle meine Fragen hatte und mir ein sehr guter Betreuer war. Ich konnte mich zu jeder Zeit auf euch verlassen und in guter Atmosphäre arbeiten. Ich hoffe ihr bleibt alle weiterhin so hilfsbereit und ausdauernd mit den weiteren Doktoranden/Doktorandinnen. Ich wünsche euch allen für die Zukunft alles Gute und viel Erfolg bei eurer Arbeit. Weiterhin bedanke ich mich ganz herzlich bei Frau von Baum, Frau KehrerSawatzki sowie Herrn Brenner, dass Sie sich bereit erklärt haben, als zweite Gutachterin bzw. als Wahlprüfer/-in zur Verfügung zu stehen. Eidesstattliche Erklärung 142 Name, Vorname: ...................................................................................................... Eidesstattliche Erklärung Ich versichere hiermit, dass ich die Arbeit selbständig angefertigt habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt sowie die wörtlich oder inhaltlich übernommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Ich habe keine Promotionsversuche an anderen Universitäten unternommen. Es laufen keine Strafverfahren gegen mich. ............................................................................................... Datum, Unterschrift
