Inhibition der Tumorzelladhäsion an
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Inhibition der Tumorzelladhäsion an Extrazellularmatrixkomponenten durch Phospholipide in vitro Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Britta Elisabeth Schmitz aus Düren Berichter: Herr Professor Dr. med. Karl-Heinz Treutner Herr Universitätsprofessor Dr. med. Christian Mittermayer Tag der mündlichen Prüfung: 12. Juli 2004 "Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar" In Erinnerung an meinen Vater. Inhaltsverzeichnis Einleitung 1 1.1 1 Peritonealkarzinose 1.1.1 Pathophysiologie 1 1.1.2 Prognose 6 1.1.3 Prävention und Therapie 8 1.2 Phospholipide 12 1.2.1 Physiologie 12 1.2.2 Adhäsionsprophylaxe 12 1.3 Extrazellularmatrixkomponenten 14 1.3.1 Laminin 15 1.3.2 Fibronektin 16 1.3.3 Kollagene 18 2 Zielsetzung 21 3 Material und Methoden 22 3.1 Material 22 3.1.1 Chemikalien 22 3.1.2 Biochemikalien 23 3.1.3 Extrazellularmatrixkomponenten 23 3.1.4 Zellkultur 24 3.1.5 Sonstiges 24 3.1.6 Nährmedien, Gebrauchs - und Pufferlösungen 26 3.2 Methoden 3.2.1 Zellkultur 28 28 3.2.1.1 Auftauen von Zellen 28 3.2.1.2 Passagieren von Zellen 28 3.2.1.3 Vorbereitung der Versuchsgefäße 29 3.2.1.4 Beschichtung mit Extrazellularmatrixkomponenten 29 3.2.1.5 Beschichtung mit 1%iger BSA-Lösung 30 3.2.1.6 Zellaussaat 30 3.2.2 3.3 4 4.1 Adhäsionsassay Statistik 33 Ergebnisse 34 Standardisierung der Adhäsionsversuche 4.1.1 4.2 31 34 Zelladhäsion auf Extrazellularmatrixkomponenten 35 Adhäsion unter Verwendung von Phospholipiden 37 4.2.1 Kolonkarzinom 37 4.2.1.1 Adhäsion an Kollagen IV 37 4.2.1.2 Adhäsion an Laminin 39 4.2.1.3 Adhäsion an Fibronektin 41 4.2.2 Magenkarzinom 43 4.2.2.1 Adhäsion an Kollagen IV 43 4.2.2.2 Adhäsion an Laminin 45 4.2.2.3 Adhäsion an Fibronektin 47 5 Diskussion 49 6 Zusammenfassung 55 7 Abbildungsverzeichnis 57 8 Abkürzungsverzeichnis 59 9 Literaturverzeichnis 60 10 Danksagung 72 11 Lebenslauf 73 Einleitung 1 1 1.1 1.1.1 Einleitung Peritonealkarzinose Pathophysiologie Einen großen Anteil der derzeit auftretenden malignen Neoplasien stellen die Karzinome des Gastrointestinaltraktes dar. Diese Tumoren metastasieren häufig neben einer lymphogenen und einer hämatogenen Streuungsroute in die Peritonealhöhle (Cannistra, 1993). Nahezu 50% aller Patienten mit gastrointestinalen Tumoren weisen bei Diagnosestellung Metastasen auf und nur die Hälfte dieser können sich einer potentiell kurativen chirurgischen Resektion unterziehen (Saario, 1987). Abbildung 1: Tumorzellinvasion: koordinierter Prozess der Tumorzelladhäsion, Proteolyse und Migration (nach Liotta 1990). Einleitung 2 Der Mechanismus der Tumorzellmetastasierung ist sehr komplex und erfolgt in mehreren Schritten: I. I. Zellmobilisation aus dem Verband I. Migration II. Adhäsion an das Peritoneum III. Invasion der Basalmembran Zellmobilisation aus dem Verband: Zunächst muß der Primärtumor eine gewisse Invasionstiefe, bei gastrointestinalen Tumoren die Serosa, erreicht haben. Dann können sich die Tumorzellen aus dem Zellverband lösen, und als sogenannte „freie Tumorzellen“ in der Peritonealflüssigkeit nachgewiesen werden (Koga 1984, Schott 1998, Bando 1999). Eine Substanz, welche bei der Aufrechterhaltung der Integrität und Organisation von Gewebestrukturen eine Rolle spielt, ist E-Cadherin. ECadherin ist ein transmembranäres Adhäsionsmolekül, dessen reduzierte Expression zu einer vermehrten Loslösung einzelner Zellen aus dem Primärtumor führt. Dies hat eine gesteigerte Metastasierungstendenz des Tumors zur Folge. II. Migration: Die Fähigkeit zur Migration erlangt die Tumorzelle durch komplexe Interaktionen zwische n Aktin und Myosinfilamenten, dem Zytoskelett der Zelle. Dadurch kommt es zur Ausbildung von Pseudopodien, welche man auch als diagnostisches Kennzeichen befindlichen Zelle nutzen kann. einer im Invasionsprozess Einleitung III. 3 Adhäsion an das Peritoneum Die Adhäsion der Zelle an die Basalmembran stellt einen entscheidenden Schritt für die Invasion und Metastasierung von Tumorzellen dar. Wie Saario und Liotta am Beispiel der Magenkarzinomzellen zeigen konnten, ändern sich die Adhäsionseigenschaften von Tumorzellen bei Anlagerung an bestimmte Membranbestandteile (Saario 1987, Liotta 1990). So wurde nachgewiesen, dass die Adhäsion der Tumorzellen an Laminin, ein Glykoprotein der Basalmembran, eine wesentliche Vorraussetzung für die Invasion und Metastasierung der Tumorzelle ist. Diese Interaktion wird über Lamininrezeptoren und lamininbindende Proteine auf der Zelloberfläche vermittelt und man erkannte, dass die Stärke der Expression von mRNA und Proteinen des lamininbindenden Proteins mit dem metastatischen als auch invasivem Potential einer Tumorzelle korreliert (Wewer 1986, Yow 1988). Ein Modell für die Interaktion zwischen Mesothelzellen und Tumorzellen ist in Abbildung 2 am Beispiel der Ovarialkarzinomzellen dargestellt. Mesothelzellen synthetisieren eine perizelluläre Membran, welche aus Proteoglykanen und den Extrazellularmatrixkomponenten Fibronektin, Laminin und Kollagenen besteht. Weiterhin exprimieren diese Zellen in einem hohen Maße CD44 auf ihrer Oberfläche. Über diese CD44Moleküle kann es zu einer Verbindung mit Hyaluronsäure auf der Oberfläche von Ovarialkarzinomzellen kommen. Ovarialkarzinomzellen produzieren ebenfalls eine perizelluläre Matrix. Diese besteht aus variablen Mengen an Hyaluronsäure und Proteoglykanen. An ihrer Oberfläche exprimieren Ovarialkarzinomzellen ß1-Integrine und CD44, welche die Interaktion mit ECM-Proteinen und Hyaluronsäure (der Mesothelzellen) erleichtern. Einleitung 4 Ovarialkarzinom Ovarialkarzinomzelle zelle Hyaluron säure CD44 a und ß1 Integrine CD44 ECM Proteine Laminin Fibronektin KollagenIV Hyaluron säure Mesothelzelle Mesothelzelle ECM ECM Abbildung 2: Modell der Interaktion zwischen Ovarialkarzinomzellen und Mesothelzellen (nach Lessan 1999). Desweiteren sind Tumorzellen in der Lage über die von ihnen produzierten Zytokine, Proteasen, Interleukine und Wachstumsfaktoren, die Proliferation der peritonealen Fibroblasten zu stimulieren. Es resultiert eine verstärkte Fibrosierung des gesamten Peritoneums. Laut Tahara et al. ist es möglich, dass Mesothelzellen die Infiltration von Karzinomzellen in das submesotheliale Gewebe verhindern (Tahara 1990). Es wurde gezeigt, dass diese Präventionsaktivität der Mesothelzellen in Abhängigkeit einer steigenden Zahl an peritonealen Fibroblasten absinkt. Fibroblasten produzieren Wachstumsfaktoren, wie TGF-β (transforming growth factor-β), HGF (hepatocyte growth factor), MMP-1 (matrix metalloproteinase-1), MMP-2 und MMP-9. Diese Faktoren stimulierten in vitro die Migrationsfähigkeit und somit das metastatische Potential von Magenkarzinomzellen (Masakazu 1996). Dieser Vorgang wird auch als „seed and soil“ Prinzip beschrieben. Am Ende des ersten Schrittes steht die Peritonealfibrose, diese stellt dann einen hervorragenden Nährboden für die Tumorzellen dar. Einleitung IV. 5 Invasion der Basalmembran Der letzte Schritt des Metastasierungsweges von Tumorzellen besteht in der Sekretion von Matrixmetalloproteinasen, welche eine Degradation der Basalmembran hervorrufen. Diese Enzyme, welche als Zymogene sezerniert werden und somit eine Aktivierung erfordern, werden in drei Subklassen unterteilt: Interstitielle Collagenasen, Type IV Collagenasen (Gelatinasen) und Stromelysine. Insgesamt kommt es durch Aktivierung dieser Enzyme zum Abbau der Collagentypen IV, V, VII, IX, und X, welche Hauptkomponenten der Basalmembran darstellen (Schwartz 1996, Stracke 1994). Es wurde postuliert, dass eine gesteigerte Expression dieser Matrixmetalloproteinasen ein erhöhtes metastatisches Potential der Tumorzellen bewirkt (Kohn 1995). Abschließend kann die abgesiedelte Tumorzelle durch vermehrte Proliferation zu einem metastatischen Tumorkomplex heranreifen. Abbildung 3: Pathogenese der Peritonealkarzinose (nach Yonemura 1998) Einleitung 6 1.1.2 Der Erfolg Prognose chirurgischer Eingriffe bei Magen- oder Kolorektalen Karzinomen ist durch das Auftreten lokaler Rezidive, Fernmetastasen oder auch durch Peritonealkarzinosen, entstanden durch freie Tumorzellen in der Peritonealhöhle, welche zum Zeitpunkt der Operation nicht mit konventionellen diagnostischen Mitteln nachzuweisen waren, limitiert. In etwa 25 – 35% der potentiell kurativen Resektionen von Kolonkarzinomen traten peritoneale Metastasen auf (Brodsky 1991). Sugarbaker et al. stellten die Hypothese der „Tumorzell Falle “ auf. Diese führt die rapide Progression von Peritonealmetastasen auf die chirurgische Therapie als einzige Maßnahme zur Bekämpfung des Primärtumors zurück. Ursachen der hohen Inzidenz und des schnellen Fortschritts der Tumorzellimplantation sind die folgenden Aspekte: 1. Freie Tumorzellen als ein Resultat der Serosainfiltration des Primärtumors 2. Abtropfen von Tumorzellen aus durchtrennten Lymphgefäßen 3. Dissemination der Tumorzellen direkt vom Primärtumor bei chirurgischer Traumatisierung und rückfließendem venösem Blut 4. Anlagerung der freien Tumorzellen über Fibrin an traumatisierter peritonealer Oberfläche 5. Vermehrte Proliferation der Tumorzellen durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren des im Heilungsprozess befindlichen Gewebes (Sugarbaker 1999). Dieses Phänomen bedingt die hohe Rate des Misserfolgs der alleinigen chirurgischen Therapie des Primärtumors (Sugarbaker 1990). Die Prognose für den Patienten ist abhängig von der Invasionstiefe des Primärtumors. Reicht der Tumor bis an die Muscularis propria oder tiefer, so ist die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen von freien Zellen in der Peritonealhöhle immer größer und somit die Prognose schlechter (Inokuchi 1984, Maruyama 1986). Einleitung 7 Auch das Differenzierungsstadium des Primärtumors ist für seine Metastasierungstendenz charakteristisch. Schlecht differenzierte Tumoren neigen zu höheren Absiedlungsraten als noch gut differenzierte Tumoren. Ein Glykoprotein, welches in der Aufrechterhaltung der Integrität und Organisation von Gewebsstrukturen eine Rolle spielt, ist E-Cadherin. Eine niedrige E-Cadherin Expression des Primärtumors korreliert mit einer steigenden Rate an Tumorrezidiven und verringert die Lebenschance der Patienten (Schwartz 1996). Lessan und seine Mitarbeiter erkannten, dass CD44-Hyaluronan Interaktionen das Wachstum von Tumoren und deren Metastasierung steigern. Eine große Zahl der Neoplasien, epithelialen und mesenchymalen Ursprungs, zeigen eine hohe Expression an CD44H (die Standart CD44-Isoform) sowie diversen Isoformen des CD44 (Zeng 1998). Bei Ovarialkarzinomen fand man eine große Variation der CD44 Expression als ein häufiges Merkmal, außerdem wurde postuliert, dass Tumorzell-assoziierte Hyaluronsäure ein ungünstiger prognostischer Befund bei kolorektalen Karzinomen ist (Cannistra 1993, Ropponen 1998). Auch Nakashio konnte dies beweisen. Seine Untersuchungen belegen, dass die Adhäsion von NUGC-4 (Magenkarzinomzellen) über CD44H und ß1 Integrine vermittelt wird, außerdem steigert eine hohe Expression an TGFß1 die Produktion von CD44. Somit sind hohe TGF ß1-Spiegel als weiterer Risikofaktor für Peritonealkarzinosen aufzuführen. Die mittlere Überlebenszeit eines Patienten mit Peritonealkarzinose beträgt 6 Monate. Dieser Zeitraum ist von der Art des Primärtumors unabhängig (Hribaschek 2001). Bei jeglichen Therapiebemühungen gilt es zu beachten, dass diese bei manifesten Peritonealkarzinosen nur noch palliativen Charakter haben. Einleitung 1.1.3 8 Prävention und Therapie Chirurgische Techniken Zur Prävention postoperativer Peritonealkarzinosen richtet sich die Aufmerksamkeit auf die folgenden Faktoren. Zunächst wird nach der „no touch technique“ Verfahren. Hier wird während der Operation der Primärtumor bedeckt und wird weder eröffnet, noch nur teilweise entfernt. Man strebt immer eine vollständige Resektion des Tumors an, um eine Verschleppung von freien Tumorzellen zu vermeiden. Desweiteren führt man sowohl eine Ligatur der aus dem Primärtumor führenden Venen als auch einen Verschluß der oralen und aboralen Lumina des Darmanteils durch. Kommt es dennoch zur Streuung von Tumorzellen, so liegt in aller Regel schon frühzeitig eine mikroskopische Dissemination in weite Teile der Bauchhöhle vor. Die systematische Entfernung des Peritoneum im Sinne einer Quadranten-Peritonektomie, wie sie von Sugarbaker eingeführt worden ist, und selbst ultraradikale Multiorganresektionen haben den Charakter einer Tumorreduktion ohne kurativen Anspruch (Sugarbaker 1995). Zudem gehen solche Eingriffe mit einer hohen Mortalität einher. In erfahrener Hand mag eine Peritonektomie in Verbindung mit einer peritonealen Chemotherapie bei selektierten Patienten allerdings erfolgreich sein und mit einer kontrollierten Mortalität einhergehen (Sugarbaker 1998, Jacquet 1996, Samel 2000). Intraperitoneale Chemotherapie Eine peritoneale Chemotherapie kann präoperativ, postoperativ oder intraoperativ durchgeführt werden. Unabhä ngig von einer Laparotomie ermöglicht die Anlage von Drainageschläuchen oder Trokaren die präoperative, neoadjuvante oder wiederholte postoperative peritoneale Chemotherapie. Intraoperativ ist eine Chemotherapie in „offener“ Technik möglich. Der chirurgische Zugang und eine Erweiterung der Bauchhöhle durch einen Bauchdeckenexpander oder Retraktor erlauben manuell eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Zytostatika (Yonemura 1995, Sugarbaker 1998). Einleitung 9 Dies kann zusätzlich durch eine mechanisch unterstützte, kontinuierliche Spülung der Bauchhöhle verbessert werden. Eine intraoperative hypertherme peritoneale Chemotherapie nutzt den Synergismus zwischen der Zytotoxizität verschiedener Zytostatika und einer regionalen Hyperthermie. Die Chemotherapeutika werden dabei in einer hyperthermen kristalloiden Lösung appliziert, mit der das Abdomen kontinuierlich gespült wird. Eine hohe Spülgeschwindigkeit gewährleistet dabei eine konstante Temperatur für die Dauer der Behandlung. Die Verfahren der peritonealen Chemotherapie und der hyperthermen peritonealen Chemotherapie sind apparativ aufwendig und komplikationsträchtig und erfordern ein hohes Maß an Erfahrung. Sie sollten darum ausgewiesenen Zentren vorbehalten bleiben (Samel 2000). Die in der Literatur dokumentierten Raten perioperativer Morbidität und Mortalität nach hyperthermer peritonealer Chemotherapie schwanken erheblich. Meist werden Darmperforationen, Anastomoseninsuffizienzen oder Pankreatitiden beschrieben. Obwohl die Blut-Peritoneum-Schranke, die systemische Resorption von peritoneal applizierten Substanzen einschränkt, werden Zytostatika über Milky-Spots (dienen der Flüssigkeitsresorption) und die diaphragmalen Stomata in ausreichender Menge resorbiert, um systemische Toxizitäten verursachen zu können. Appliziert man die Chemotherapie schon in der perioperativen Phase, so gilt zu beachten, dass nicht nur die Tumorzellen zerstört werden, sondern auch Thrombozyten, weiße Blutkörperchen und Monozyten aus der Peritonealhöhle entfernt werden. Daher wird nicht nur das Tumorwachstum, sondern auch die Wundheilung eingeschränkt. Durch die reduzierte Zahl an Leukozyten und Monozyten sind die Patienten gegenüber Infektionen aseptische Verhältnisse besonders bei der vulnerabel. Folglich Applikation von sind strikte Chemotherapie, Abdominaldrainagen etc. geboten. Insgesamt zeigt die intraperitoneale Chemotherapie zur Behandlung von intraabdominalen Tumoren eine Reduktion der lokalen als auch der intraperitonealen Rezidive. Einleitung 10 Immuntherapie Wie schon unter 1.1.2 beschrieben, korreliert die Höhe der Expression von CD44 positiv mit der Metastasierung bei Magen-, Darm-, Mamma-, und Pankreaskarzinomen. Durch Applikation von Antikörpern gegen CD44v in die Bauchhöhle, wird die Bindung von Tumorzellen an antigenrepräsentierende Zellen erheblich reduziert (Schürmann 1997, Lessan 1999). Auch Nakashio et al. konnte dies belegen. In seinen Untersuchungen an Nacktmäusen gelang es mittels einer Kombinationslösung aus Anti-CD44H und ß1-Integrin-Antikörpern die Adhäsion von NUGC-4 Zellen an die Peritonealhöhle zu blockieren, und die Überlebenszeit der Tiere zu verlängern (Nakashio 1997). Weitere Integrine, wie a2 und a6, wurden getestet. Man untersuchte verschiedene Magenkarzinomzelllinien, welche a2 und a6 exprimieren, auf ihr Invasionspotential in eine künstliche Basalmembran oder in ein Kollagengel. Bei Verwendung von Antikörpern gegen a2 und a6 konnte die Invasion in die Basalmembran bzw. das Kollagengel signifikant gehemmt werden (Koike 1996). Adhäsionsprophylaxe Am Ende der Operation, vor dem Wundverschluß kann eine Substanz zur Adhäsionsprophylaxe intraperitoneal appliziert werden, welches die Adhäsion der freien Tumorzellen an die Peritonealhöhle inhibieren soll (Iitsuka, 1979). Zu diesem Zweck wurden Dextransulfate auf ihre Wirkung untersucht. Man fand heraus, dass die intraperitoneale Applikation von Dextransulfaten das Peritoneum vor einer Implantation von freien Tumorzellen schützt und die Überlebenszeit von Mäusen verlängert (Hagiwara 1997 und 2000). Die therapeutisch einzusetzende Dosis liegt weit unter der letalen Dosis (Hagiwara 2000). Tan und Mitarbeiter konzentrierten sich auf die Untersuchung von Natrium - Hyaluronat. Natrium – Hyaluronat ist ein wesentlicher Bestandteil der Extrazellularmatrix und von Mesothelzellen. Es wurde bewiesen, dass man nach chirurgischer Therapie benigner Erkrankungen eine effiziente Adhäsionprophylaxe mittels Natrium - Hyaluronat durchführen kann. Eine Einleitung 11 Implantation von malignen Tumorzellen konnte allerdings mit dieser Substanz nicht verhindert werden (Haverlag 1999, Tan 2001). Ein weiterer Ansatz zur Adhäsionsprophylaxe ist die intraperitoneale Applikation von Erythrozyten. Erythrozyten enthalten eine Vielfalt an zytoplasmatischen Oxidantien, wie z. B. Glutathionperoxidase, Katalase und Superoxiddismutase, welche die Wirkung von freien Radikalen auf das Peritoneum verhindern und somit Peritonealläsionen vorbeugen. Denn wie schon oben erwähnt, lagern sich freie Tumorzellen bevorzugt an verwundeten Gewebebereichen an (van Rossen 1999). Einleitung 12 1.2 Phospholipide 1.2.1 Physiologie Phospholipide sind als polare Phosphorsäure–di-Ester Hauptbestandteil aller Zellmembranen und auch in der physiologischen Peritonealflüssigkeit enthalten. Diese Phospholipide werden auf natürlichem Wege von Mesothelzellen produziert und in die Peritonealflüssigkeit sezerniert (Beavis 1994). Phosphorsäure-di-Ester sind Zwitterionen und somit in der Lage mit ihrem negativen Zweig des Moleküls an die positiv geladenen Anteile der peritonealen Oberfläche zu binden. Die nun dem Peritoneum abgewandte positive Molekülseite bindet wieder neue Phospholipide, so dass letztendlich eine Schicht aus 7 bis 13 Lagen entsteht. Diese Schicht ist den Untersuchungen von Hills 1992 und Chen 2000 zu folge sehr abriebfest und besitzt gute Schmiereigenschaften. Ein Modell zur Wirkung der Phospholipide ist in Abbildung 2A,B dargestellt. 1.2.2 Adhäsionsprophylaxe Phospholipide bilden einen dünnen, membran-ähnlichen Film über das gesamte Peritoneum, insbesondere verletzter, traumatisierter Bereiche des Bauchfells, welche Prädilektionsstellen für peritoneale Adhäsionen darstellen. Intraperitoneal Mesothelzellen resorbiert, appliziert sind werden aber auch Phospholipide nach von mehreren Kochsalzspülungen noch nachweisbar (Chen 2000). Diese Eigenschaften kann man sich zu Nutze machen um peritoneale Adhäsionen infolge operativer Eingriffe zu verhindern bzw. zu verringern (Ar’Rajab 1995). Studien an Kaninchen von Müller und Mitarbeitern bewiesen diese Hypothese. Hier wurde eine signifikante Reduktion der Adhäsionsflächen nach einmaliger Applikation von Phospholipiden ohne negative Einflüsse auf die Heilung von Darmanastomosen und Laparotomiewunden gezeigt Einleitung 13 (Müller 2001). Es wurde bewiesen, dass Phospholipide sowohl bei Verwendung von abdominellen Drainagen als auch bei gynäkologischen Eingriffen wirksam sind (Treutner 2001). Da eine peritoneale Tumorzellaussaat häufig über peritoneale Adhäsionen abläuft, ist auch dies untersucht worden. Neueste Studien unserer Arbeitsgruppe wurden an Ratten und Nacktmäusen durchgeführt. Es wurden standardisierte Operationen mit einer Deperitonealisierung der rechten Bauchdecke, sowie eine Deserosierung des Zoekums durchgeführt. Den Behandlungsgruppen wurde kurz vor Abschluss der flüssigkeitsdichten Fasziennaht die Phospholipidlösung gemeinsam mit Tumorzellen intraperitoneal appliziert. Es resultierte eine Reduktion des Tumorvolumens und eine erhebliche Verringerung der Adhäsionsfläche bei beiden Tierarten. Somit konnte die Überlebenszeit der Tiere verlängert werden (Manuskripte eingereicht). Tumorzelle Tumorzelle Phospholipidfilm Extrazellularmatrix Extrazellularmatrix Abbildung 4A: Schema zur Metastasierung einer Tumorzelle Abbildung 4B: Schema zur Wirkungsweise der Phospholipidlösung Die Extrazellularmatrix präsentiert diverse Glykoproteine, welche von der Tumorzelle als Adhäsionsmoleküle erkannt werden. Es kommt zur ungehinderten Adhäsion der Tumorzelle an die Extrazellularmatrix. Durch die dipolaren Eigenschaften der Phospholipide kommt es zur Ausbildung einer oligolamellären Schicht. Diese legt sich als abriebfester Film über die Extrazellularmatrix und bedeckt die von der Extrazellularmatrix präsentierten Adhäsionsmoleküle. Eine Adhäsion metastasierender freier Tumorzellen wird somit verhindert. Einleitung 14 1.3 Die Extrazellularmatrixkomponenten Extrazellularmatrix ist ein Netzwerk aus verschiedenen Makromolekülen und bildet die Grenze vieler Zellen. Sie ist unter anderem für die Aufrechterhaltung der zellulären Stoffwechselumgebung zuständig. Die Extrazellularmatrix besteht aus Strukturmolekülen wie Kollagen und Elastin, Adhäsionsmolekülen, wie Fibronektin, Laminin, Vitronektin und Thrombospondin, und aus einer Vielzahl an Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen (Kleinman 1993). Durch eine unterschiedliche Zusammensetzung dieser Besta ndteile entstehen verschiedene Matrizes, welche für verschiedene Gewebe spezifisch sind (Oldberg 1982). Die einzelnen Moleküle der ECM reagieren intensiv miteinander und binden an multiple Zelloberflächenrezeptoren. ECM-Moleküle sind verantwortlich für die Kontrolle von Zellfunktionen, sie vermitteln Zell-Zell-Interaktionen, zelluläre Genexpression, Differenzierung und beeinflussen die Adhäsion, Größe und Migration von Zellen (Ruoslathi 1989, Schwartz 1993). Eine Adhäsion von Tumorzellen erfolgt über die oben genannten Adhäsionsmoleküle. Dies kann entweder über die Integrine der Tumorzellen vermittelt werden, oder aber durch direkte Anlagerung der Tumorzelle an die ECM. Mittels Proteoglykane kann die Anlagerung der Zelle noch verstärkt werden. Viele Studien postulieren, dass die Anlagerung von Tumorzellen an die Extrazellularmatrix der entscheidende Schritt im metastatischen Prozess von Tumorzellen darstellt (Saiki 1989). Insgesamt vermitteln Extrazellularmatrix-Proteine eine direkte Zelladhäsion und stimulieren die Zellmotilität. Die Extrazellularmatrix ist eine Produktionsquelle für Wachstumsfaktoren, welche entweder direkt das Tumorwachstum vermitteln oder über eine Stimulation der Neovaskularisation die notwendige Unterstützung bieten (Stracke 1994). Einleitung 1.3.1 15 Laminin Laminin (Ln) ist als nicht-kollagener Bestandteil, wie immunhistologische Untersuchungen nach Von der Mark belegen, eine ubiquitäre Komponente der Basalmembran (Von der Mark 1985). Es fördert die Adhäsion vieler epithelialer Zellen, auch Tumorzellen, und beeinflusst die Zellmigration, Zelldifferenzierung und das Zellwachstum (Graf 1987). Das Lamininmolekül hat ein Molekulargewicht von 900 000 Da, besteht aus einem langen und drei kurzen Ästen, welche im Gesamtbild einem Kreuz ähneln und hat eine hohe Affinität zu divalenten Kationen, insbesondere Kalzium. Dieses zweifach positiv geladene Ion aktiviert die Polymerisation des Lamininmoleküls (Yurchenco 1990). In vivo wird Laminin vermutlich von den der Basalmembran aufliegenden basalen epithelialen oder endothelialen Zellen synthetisiert. Das unter der Basalmembran gelegene interstitielle Bindegewebe und die Fibroblasten sind eher nicht an der Synthese beteiligt (Timple 1989). Die Bindung von Zellen an das Lamininmolekül erfolgt sowohl RGD- abhängig als auch – unabhängig z. B. über die Bindungsregion YIGSR (Von der Mark 1992). Einleitung 16 Abbildung 5: Lamininmolekül mit Bindungsstellen (nach Bornträger 1999). 1.3.2 Fibronektin Fibronektin ist ein hochmolekulares Glykoprotein, welches in löslicher und unlöslicher Form vorliegt. Es ist ein wichtiger Bestandteil des Blutes und des Gewebes. In verschiedenen Körperflüssigkeiten liegt es löslich vor (Mosher 1984), in der Extrazellularmatrix hingegen unlöslich. Cannistra konnte 1995 zeigen, dass peritoneale Mesothelzellen Fibronektin mRNA und Oberflächenproteine exprimieren. Die biologische Funktion des Fibronektin ist sehr vielfältig und beinhaltet die Fähigkeit zur Vermittlung der Zell-Zell und Zell-Substratum Adhäsion, Ausbreitung, Proliferation, Makrophagenfunktion, Förderung Gerinselstabilisierung der und Wundheilung, Plättchenanheftung (Proctor 1987). Giancotti postulierte, dass die Bindung von α 5β 1 an Fibronektin die Zellmigration hemmen kann, außerdem wird die Bildung von Zellaggregaten durch Fibronektin erleichtert und beschleunigt (Giancotti 1990, Tavella 1997). Einleitung 17 Das Fibronektinmolekül besitzt multiple Bindungsdomänen für Fibrinogen, Fibrin, Heparin, Kollagene, Zelloberflächenrezeptoren Gelatine, (Ruoslahti, Hyaluronat und 1982). Die Zelloberflächenrezeptoren für Fibronektin auf Ovarialkarzinomzellen zum Beispiel vermitteln die Adhäsion an peritoneale Mesothelzellen und sind somit für die Metastasierung dieser Tumoren verantwortlich (Strobel 1999). Der Aufbau des dimeren Moleküls (MW ca 44000 kDa) besteht aus zwei relativ ähnlichen disulfidgebundenen Untereinheiten, welche beide aus drei sich wiederholenden homologen Peptidsequenztypen I, II und III bestehen (Proctor, 1987). Einige dieser homologen Blöcke fungieren als funktionelle Domänen. Die Ultrastruktur des Moleküls ist einerseits von der in einer Region gebundenen Substanz und zum anderen von den Lösungsbedingungen wie pH-Wert oder Ionengehalt abhängig. Somit kann also die bindende Substanz direkt oder indirekt die Rezeptoraktivität, -affinität und auch die Spezifität des Rezeptors beeinflussen (Ugarova, 1995). Diese Wechselwirkungen sind auch in der Lage den Übergang des löslichen, kompakten Moleküls in die ausgestreckte Konformere zu bewirken. Wie Mosher 1995 herausfand ist Plasmafibronektin in physiologischen Konzentrationen nicht in der Lage selbst zu polymerisieren, es gibt zwar eine geringe passive Adhäsion von Plasmafibronektin an vorbestehender Matrix, die Organisation als Matrixmolekül von Fibronektin erfordert jedoch Zellen und geschieht an spezialisierten Stellen der Zelloberfläche. Für die Fähigkeit der Zellen an Fibronektin zu adhärieren konnte das Peptid RGD identifiziert werden. Dieses RGD-Peptid liegt in zentraler Stelle des Fibronektinmoleküls (McKeown-Longo, 1987). Einleitung 18 Abbildung 6: gestrecktes Fibronektinmolekül (nach Bornträger 1999) 1.3.3 Kollagene Kollagenmoleküle lagern sich zu charakteristischen Fasern zusammen und sind somit für die funktionelle Integrität von Geweben verantwortlich. In menschlichem Gewebe wurden zahlreiche Kollagentypen identifiziert. Alle bisher bekannten Kollagene enthalten zwei verschiedene Typen von strukturellen Domänen: die Triplehelix-Domäne und eine globuläre Domäne (Burgeson 1992). Jedes Kollagenmolekül besteht aus drei Polypeptid-Untereinheiten, die als a-Ketten bezeichnet werden. Jeder Typ eines Kollagenmoleküls ist aus einer bestimmten Kombination verschiedener a-Ketten konstruiert. Man nimmt an, dass primär strukturelle Unterschiede zwischen ihnen die Art festlegen, in welcher die Kollagenmoleküle eines einzelnen Typs untereinander, mit anderen Kollagentypen und nicht-kollagenen Makromolekülen interagieren (Sakai 1982). Im Unterschied zu Laminin und Fibronektin, welche nur einige Zellbindungsregionen besitzen, haben Kollagenmoleküle multiple zelluläre Kontaktstellen, darunter auch RGD-Regione n. Einleitung 19 Kollagen Typ IV: Kollagen Typ IV ist die Hauptkomponente der Basalmembran. Es vernetzt sich zu einem dreidimensionalen Maschenwerk, ohne dass es sich zu Fibrillen zusammenlagert (Yurchenco 1990). Wie andere Kollagene ist es aus helikalen alpha -Ketten aufgebaut, jedoch ist die helikale Struktur nicht durchgängig, sondern durch Polypeptidsequenzen unterbrochen. Dadurch erhält das Molekül eine höhere Flexibilität. Diese Diskontinuität (helikale, nicht-helikale Abschnitte) könnte auch größere Interaktionen mit nichtkollagenen Komponenten der Basalmembran ermöglichen (Burgeson 1992). Die große zentrale Triplehelixregion wird flanktiert von einer 7SRegion am N-terminalen Ende, an der sich Kollagen Typ IV -Moleküle zu Tetrameren durch parallele und anti-parallele Überlappung zusammenschließen. Am Carboxylende ist jeweils eine globuläre Domäne (Sakai 1982). Zwei solcher Moleküle können sich gelenkartig an Ihren globulären Strukturen verbinden. Daraus ergibt sich die Form eines kontinuierlichen Netzes mit einer Wabenstruktur und ein Netzwerk, das möglicherweise das Grundgerüst der Basalmembran darstellt (Stanley 1982, Timpl 1981). Kollagen IV spielt eine wichtige Rolle bei Adhäsion, Wachstum und Differenzierung von Ze llen und ist an Gewebereparationsvorgängen und molekulärer Ultrafiltration beteiligt (Sundaramoorthy 2002). Einleitung 20 Abbildung 7: Tetramerstruktur des Kollagen IV ( nach Bornträger 1999). Zielsetzung 21 2 Zielsetzung Die vorliegende Arbeit untersucht eine Phospholipidlösung zur Prävention einer Peritonealkarzinose. In vitro soll gezeigt werden, dass Phospholipide die Adhäsion von Tumorzellen auf Extrazellularmatrixkomponenten reduzieren. Zu Beginn der Versuchsreihe stellten sich folgende Fragen: 1. Wird die Tumorzelladhäsion auf den Extrazellularmatrix- komponenten Laminin, Kollagen IV und Fibronektin durch Phospholipide verringert? 2. Ist ein konzentrationsabhängiger Einfluss der Phospholipide zu verzeichnen? 3. Ist die Reduktion der Tumorzelladhäsion abhängig von der jeweiligen Extrazellularmatrixkomponente? Material und Methoden 3 3.1 22 Material und Methoden Material Die verwendeten Materialien sind hier nach Gruppen geordnet und in alphabetischer Reihenfolge aufgelistet. 3.1.1 Chemikalien Aqua ad injectabilia PH. Eur., delta pharma GmbH, Pfullingen Deutschland Dulbecco’s Phospate buffered saline PBS, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland Ethanol 70%, Merk, Darmstadt, Deutschland Gelatine Typ A from porcine skin, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland Hepes, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland Isopropanol, Merck, Darmstadt, Deutschland Kristallviolett, Merck, Darmstadt, Deutschland Penicillin/Streptomycin, Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland RPMI 1640 ohne Glutamin, PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland Triton X – 100, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland Material und Methoden 3.1.2 Bovine 23 Biochemikalien Serum Albumin Solution (BSA), Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland Fetales Calf Serumprotein, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland Trypsin, Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland 3.1.3 ECM- Extrazellularmatrixkomponenten Quelle Beschichtungs- Firma Komponente konzentration Fibronektin Humanes 0,5/ 2,5/ 5/ 7,5/ 10 µg/ml Boehringer, Plasma Deutschland ( NUGC-4) 0,5/ 2,5/ 5/ 7,5/ 10 µg/ml (HRT-18) 0,5/ 2,5/ 5/ 7,5/ 10 µg/ml Biomol, Plazenta (NUGC-4 und HRT-18) Deutschland EHS- 20/ 50/ 70/ 100 µg/ml Boehringer, Sarkom (NUGC-4) Deutschland Maus 20/ 40/ 60/ 80/ 100 µg/ml Kollagen Typ IV Humane Laminin (HRT-18) (fettgedruckte Konzentrationen wurden im Adhäsionsversuch eingesetzt) Material und Methoden 3.1.4 24 Zellkultur Primärkultur 1: NUGC-4 (human gastric cancer cell line): histolog.: schlecht differenziertes Adenokarzinom Zellkulturstandardmedium RPMI 1640 mit 10% FKS, Penicillin/Streptomycin Primärkultur 2: HRT-18 (human rectal cancer cell line) Zellkulturstandardmedium RPMI 1640 mit 10% FKS, Penicillin/Streptomycin Für die Versuchsreihen wurden ausschließlich Zellen der Passage 14-17 (NUGC-4) bzw. 92-95 (HRT-18) verwendet. 3.1.5 Sonstiges Filme Kodak 64T Kunstlicht, Kodak, Deutschland Gewebekulturflaschen, 75cm², Greiner GmbH, Frickhausen, Deutschland, #658170 Gewebekulturflaschen, 175cm2, Falcon Collaborative Biomedical Products / Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland Multiwellplatten, 96er well, Falcon Collaborative Biomedical Products / Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland, #3072 Sterilfilter Sartolab P 0,2µm, Sartorius AG, Göttingen, Deutschland Begasungsbrutschrank, Typ BB 6220 CU 02, Heraeus instruments, Hanau, Deutschland Material und Methoden 25 Cellcounter CASY 1, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland Elisa-Reader Spectra MAX 340, Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA Feinwaage Sartorius analytic A 120 S. Fotokamera Ficoh XR-X 3000, Ricoh, Tokyo, Japan IKA-Schüttler MTS 4, Janke & Kunkel GmbH&Co.KG, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Leitz Diavert Umkehrmikroskop, Ernst Leitz Wetzlar GmbH, Wetzlar, Deutschland Magnetrührer/Heizplatte IKA-Combimag RCT, Janke & Kunkel GmbH&Co. KG, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Schüttelwasserbad, Typ 1083, GFL, Burgwedel, Deutschland Schüttler MTS 4, Janke & Kunkel GmbH&Co. KG, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Sicherheitswerkbank HS 12, Heraeus Instruments, Düsseldorf, Deutschland Wärmeschrank, Typ B 6120, Heraeus instruments, Hanau, Deutschland Zeiss Axiovert 25, Zeiss, Deutschland Zeiss Laser Scan Mikroskop 410 Invert, Zeiss, Deutschland Zentrifuge, Megafuge 1.0 (Rotor: BS4402/A), Heraeus Sepatech GmbH, Osterode, Deutschland Material und Methoden 26 Zentrifuge Centrifuge 5415 C (Rotor: F-45-18-11), Eppendorf, Hamburg, Deutschland 3.1.6 Nährmedien, Gebrauchs- und Pufferlösungen HEPES-Gebrauchslösung: 55,6 ml der HEPES-Puffer-Stammlösung mit 500 ml Aqua ad injectabile versetzen. Lagerung bei 4 Grad Celsius. HEPES-Puffer-Stammlösung: 8,0 g NaCl 1,5 g KCl 11,9 g HEPES 10,0 g Glucose in 450 ml Aqua bidest. bei Zimmertemperatur lösen. Lösung mit 4N NaOH auf einen pH-Wert von 7,55 einstellen und mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 500 ml auffüllen. Steril filtrieren. Lagerung bei 4 Grad Celsius. Kristallviolett: 0,5 g Kristallviolett-Pulver in 500 ml Aqua bidest. mit Hilfe des Magnetrührers lösen. Lagerung bei 4 Grad Celsius. Natrium Acetat Puffer 0,1M (pH=4,5): 1,3608g Natrium Acetat werden in 80 ml Aqua bidest. gelöst, mittels 4N NaOH wird der pH-Wert auf 4,5 titriert und im Anschluß mit Aqua bidest. auf 100ml aufgefüllt. Standardkulturmedium (RPMI 1640): Zu 450 ml Kulturmedium RPMI 1640 werden 50 ml Fetales Kälber Serum, 4ml Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml Penicillin; 10000 µg/ml Streptomycin) und 4 ml L-Glutamin zugesetzt. Lagerung bei 4 Grad Celsius. Material und Methoden 27 Standardkulturmedium DMEM/Ham`s F12: Zu 225 ml Kulturmedium DMEM werden 225 ml Kulturmedium Ham`s F12, sowie 4 ml Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml Penicillin; 10000 µg/ml Streptomycin) und 4 ml L-Glutamin zugesetzt. Lagerung bei 4 Grad Celsius. Trypsinlösung (0,05%): EDTA-Stammlösung 2,5%: 2,5 g EDTA werden in 90 ml PBS gelöst, dann wird mittels 4N NaOH ein pH-Wert von 7,55 eingestellt und später mit PBS auf 100 ml aufgefüllt. Steril filtrieren. 20 ml EDTA-Stammlösung und 20 ml Trypsinfertiglösung Gibco 2,5% mischen und mit 169 ml Aqua bidest. verdünnen. Steril filtrieren. Lagerung bei –20 Grad Celsius. Material und Methoden 3.2 28 Methoden 3.2.1 Zellkultur 3.2.1.1 Auftauen von Zellen Das für die Zelllinie verwendete Standardkulturmedium wird im Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmt. Man taut das aus der Stickstofftonne entnommene Kryoröhrchen vorsichtig im Wasserbad bis auf ein Resteiskugel auf. Nun desinfiziert man das Kryoröhrchen in dem zuvor bereitgestellten Bad aus 70%igem Alkohol, gibt die Zellsuspension zu 20 ml des angewärmten Kulturmedium in ein Falcon- Zentrifugenröhrchen und zentrifugiert 5 Minuten bei 1200 U/min. Nach dem Dekantieren des Überstandes resuspendiert man das Zellpellet in 5ml angewärmtes Zellsuspension in Standardkulturmedium eine vorgewärmte 25cm² und überführt diese Zellkulturflasche. Die Bebrütung der Zellen erfolgt in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 10% O2. Beginnend mit dem ersten Tag nach dem Auftauen erfolgt ein Mediumwechsel alle 2-3 Tage, hierbei beurteilt man den Zustand der Kultur, d.h. Zellaussehen, Zellform und Größe, Proliferations- und Migrationsfähigkeit. So konnte die Qualität der Kultur und mögliche Kontamination durch Pilze oder Bakterien festgestellt werden. 3.2.1.2 Passagieren von Zellen Die Anzüchtung der Zelllinien für die Adhäsionsversuche erfolgte in 175cm² Gewebekulturflaschen, daher wurden die (aufgetauten) Zellen aus der 25cm² Gewebekulturflasche zunächst in eine 75cm² Gewebekulturflasche und später, bei Konfluenz dieser, in eine 175 cm² Gewebekulturflasche überführt. Die nun folgende Beschreibung des Passagierens bezieht sich auf die verwendeten 175cm² Gewebekulturflaschen. Eine konfluente Primärzellkultur wurde in einem Verhältnis von 1:3 durch enzymatische Ablösung passagiert. Material und Methoden 29 Hierzu erfolgte zunächst eine Spülung der Gewebekulturflasche mit ca. 10ml PBS. Später inkubiert man den Zellmonolayer mit 10ml 0,05%iger Trypsinlösung für 5-10 Minuten bei 37°C, die Ablösung der Zellen kontrollierte man an einem Umkehrmikroskop und bei vollständiger Ablösung wurde die Trypsinwirkung mittels 10 ml Standardkulturmedium abgestoppt. Nun wurde die Zellsuspension zentrifugiert (5 min, 1200 U/min), der Überstand dekantiert und das Zellpelett in Kulturmedium resuspendiert. Diese Suspension wurde zu gleichen Teilen in drei 175cm² Gewebekulturflaschen ausgesät. Für die Adhäsionsversuche wurden NUGC-4-Zellen der Passage 14 bis 17 und HRT-18- Zellen der Passage 92 bis 95 verwendet. 3.2.1.3 Vorbereitung der Versuchsgefäße Die Versuche wurden in 96-er Multiwell Platten durchgeführt, welche sowohl unbeschichtet als auch mit Extrazellularmatrixkomponenten beschichtet verwendet wurden. 3.2.1.4 Beschichtung mit Extrazellularmatrix- komponenten Fibronektinbeschichtung: Das in gelöster Form vorliegende Fibronektin wurde mittels serumfreiem Gewebekulturmedium auf die gewünschte Konzentration eingestellt und pro Kavität 100µl pipettiert. Die Multiwellplatte wurde verschlossen und 30 min bei 37°C inkubiert. Laminin: Laminin liegt bei einer Temperatur von –20°C fest vor. Es wurde bei 1820°C langsam aufgetaut und in serumfreiem Gewebekulturmedium auf die entsprechende Konzentration verdünnt. Man gibt 100µl in jede Kavität und Material und Methoden 30 inkubiert die Multiwellplatte 45 min im Brutschrank bei 37°C, 5%CO2 und 10%O2. Kollagen IV: Die Stammlösung von Kollagen IV liegt flüssig vor. Mittels eines 0,1M Natrium Acetat Puffers (pH=4,5) wird die erforderliche Konzentration hergestellt und pro Kavität 100µl gegeben. Die Beschichtung der Platten erfolgte durch Vorinkubation der Lösung über Nacht bei 2-8°C. 3.2.1.5 Diese Beschichtung mit 1%iger BSA-Lösung Beschichtung aufgetragen und wird auf dient die der vorherige ECM-Beschichtung Unterdrückung unspezifischer Proteinbindungen. Dazu wurde die ECM-Beschichtung vorsichtig ohne den Boden der Kavität zu berühren abgesaugt, 100µl einer 1%igen BSALösung (in Aqua ad injectabile) in jede Kavität gegeben und für 30 Minuten im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Lösung vorsichtig abgesaugt und jede Kavität mit 100µl HEPESGebrauchslösung gespült. Bis zur Zellaussaat erwärmt man die Multiwellplatten im Wärmeschrank. 3.2.1.6 Zellaussaat Die für die Versuche verwendeten Zellen werden, wie in 3.2.3 beschrieben, abgelöst, aber mittels serumfreiem Medium resuspendiert. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt durch die Dreifachbestimmung in einer Probe der Zellsuspension mittels Casy-Zellzählgerät. Nach diesem Wert kann also die gewünschte Zellkonzentration mit serumfreiem Medium hergestellt und pro Kavität jeweils 100µl pipettiert werden. In den Versuchen mit Phospholipiden wird die gewünschte Zellzahl mit einem Gemisch aus Phospholipidlösung und serumfreiem Gewebekulturmedium in dem jeweils gewünschten Verhältnis eingestellt. Material und Methoden 3.2.2 31 Adhäsionsassay Es wurde ein Zelladhäsionsassay mit dem Farbstoff Kristallviolett verwendet, bei dem die Zahl der adhärenten Zellen nach Farbstoffmarkierung photometrisch durch Extinktion bestimmt wurde. In die, wie unter 3.2.4 beschrieben, vorbereiteten 96er Multiwellplatten werden nach Absaugen der HEPES-Gebrauchslösung Zellen in serumfreiem Medium (mit und ohne Phospholipidlösung) in einer definierten Dichte ausgesät: NUGC-4: 50 000 Zellen/well bei allen ECM-Komponenten HRT-18: 70 000 Zellen/well bei Polysterol, BSA, Fibronektin 30 000 Zellen/well bei Laminin, Kollagen IV Diese werden dann 30 Minuten im Brutschrank (37°C, 5%CO2 , 10%O2) inkubiert. Nicht adhärente Zellen werden anschließend zusammen mit dem Medium abgesaugt. Die nun in den Kavitäten verbleibenden adhärenten Zellen werden mittels 100µl 70%igem Ethanol (bei RT) je well auf dem Gefäßboden fixiert. Nach dem Absaugen des Ethanols und einer Färbung mit 0,1% Kristallviolett (100µl/well, 20 Minuten, Raumtemperatur) werden die Platten mehrmals gründlich in einem Bad mit Aqua dest. solange gespült und auf einer Papierunterlage ausgeschlagen, bis keine Farbstofflösung mehr sichtbar ist. Nun werden die Platten 24 Stunden im Wärmeschrank getrocknet. Die fixierten und gefärbten Zellen werden auf der Schüttelplatte mittels 0,02% Triton-X 100 Lösung (50µl/well, 30 min, 500 U/min) lysiert, gefolgt von einer Isopropanol-Überschichtung (50µl/well, 5 min, 500 U/min). Anschließend wird die Extinktion bei 590 nm im Elisa-Reader gemessen. Zur Berücksichtigung der nicht zellvermittelten Farbstoffabsorption an Polysterol bzw. an BSA und der jeweiligen Beschichtungssubstanz wird jeweils ein Leerwert ohne Zellen ermittelt und von den gemessenen Werten mit Zellen subtrahiert. Material und Methoden 32 Der hier beschriebene leicht modifizierte Adhäsionsassay wurde zuvor bereits von Aumailley/Timpl (1989), Stefansson/Lawrence (1996) und Bornträger (1999) vorgestellt und verwendet. Material und Methoden 3.3 33 Statistik Alle Versuche wurden vierfach durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert mit Standardfehler angegeben. Die statistische Auswertung erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse (Behandlung z. B. Konzentrationen). Der paarweise Vergleich erfolgte zwischen den einzelnen Phospholipidkonzentrationen und der Kontrolle, sowie zwischen den benachbarten Phospholipidkonzentrationen. Das Signifikanzniveau wurde adjustiert nach Bonferroni auf Alpha/10 = 0,005. Ergebnisse 34 4 4.1 Ergebnisse Standardisierung der Adhäsionsversuche Zur Standardisierung der Versuchsbedingungen für den Adhäsionsassay wurden Vorversuche zur Abhängigkeit der Adhäsion von der Inkubationszeit, der verwendeten Zelldichte sowie der Konzentration der ECM-Komponenten gemacht. Daraus ergaben sich folgende Standardbedingungen: - Inkubation der Zellen im Brutschrank für 30 Minuten - Aussaat NUGC-4: 50 000 Zellen/well auf allen ECMKomponente - Aussaat HRT-18: 30 000 Zellen/well auf Fibronektin 70 000 Zellen/well auf Laminin, Kollagen IV - Kontrolle der Spezifität der Adhäsion mittels Polysterol und BSA blockierende wells Das Ergebnis der Vorversuche zeigt einen linearen Bezug zwischen ausgesäter Zellzahl und optischer Dichte, der bei verschiedenen Matrixkonzentrationen und Zeiteinheiten reproduzierbar war. Das Verfahren erweist sich zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von NUGC-4 und HRT-18 als geeignet. Ergebnisse 35 4.1.1 Zur Zelladhäsion auf Extrazellularmatrixkomponenten Ermittlung der optimalen Konzentration der Extrazellularmatrixkomponente wurden Verdünnungsreihen der jeweiligen Komponente erstellt. Die Ergebnisse werden am Beispiel der Tumorzellinie NUGC-4 bei einer standardisierten Aussaat von 50.000 Zellen/well und der Extrazellularmatrixkomponente Kollagen IV dargestellt. 1,2 Extinktion bei 590 nm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 2,5 5 7,5 10 Kollagen IV in µg/ml Abbildung 8: Adhäsion von NUGC- 4 an Kollagen IV (50.000 Zellen /well) Die Extinktion nach Inkubation von 50.000 Zellen pro well betrug bei der Kontrollgruppe auf Polysterol 0,28 ± 0,04. Durch die Beschichtung mit Kollagen IV konnte schon bei geringen Konzentrationen eine starke Erhöhung der Adhäsion der Tumorzellen erreicht werden. Bei 0,5µg/ml Kollagen IV wurden Extinktionswerte von 0,72 ± 0,04 gemessen, welche bei einer Konzentration von 2,5µg/ml auf 0,89 ± 0,09 gesteigert werden konnten. Eine weitere Erhöhung der Adhäsion konnte mit stärker Ergebnisse 36 konzentrierten Lösungen nicht erreicht werden. Die Tumorzelladhäsion blieb auf annähernd gleichen Extinktionswerten bestehen. Somit konnte eine optimale Beschichtungskonzentration von 2,5µg/ml Kollagen IV für die Zellinie NUGC-4 bei einer Aussaat von 50.000 Zellen/well angenommen werden. Analog des oben genannten Vorgehens ergaben sich für die weiteren Extrazellularmatrixkomponenten: NUGC-4: Laminin: 50µg/ml Fibronektin: 10µg/ml HRT-18: Kollagen IV : 2,5µg/ml Laminin: 20µg/ml Fibronektin: 5mg/ml Ergebnisse 37 4.2 Adhäsion unter Verwendung von Phospholipiden 4.2.1 Kolonkarzinom 4.2.1.1 Adhäsion an Kollagen IV 0,6 Extinktion bei 590 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0,5 0,75 1 1,5 PL mg/well Abbildung 9: Adhäsion von HRT-18 an Kollagen IV (30.000Zellen/well) Im Adhäsionsassay der humanen Tumorzelllinie auf Kollagen IV wurden 30.000 Tumorzellen pro well inkubiert. Die Extinktion nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten betrug in der Kontrollgruppe 0,34± 0,03. Geringe Konzentrationen von Phospholipiden führten zu keinem signifikanten Einfluss auf die Zelladhäsion. Die Gabe von 0,1mg/well erhöhte sogar die Extinktion auf 0,5 ± 0,03. Die Extinktionen der nächsthöheren Konzentrationen waren in etwa der Kontrolle gleichzusetzen (0,5 mg/well: 0,37 ± 0,02; 0,75 mg/well: 0,33 ± 0,02; 1 mg/well: 0,31 ± 0,01). Erst die höchste Phospholipiddosierung (1,5 mg/well) führte mit einer Extinktion von 0,26 ± 0,02 zu einer deutlichen Reduktion der Adhäsion der Tumorzellen. Die relative Verringerung der Ergebnisse 38 Tumorzelladhäsion durch 1,5 mg Phospholipide pro well beträgt in Relation zur Kontrolle somit 24% (Abb. 9 ) Die unifaktorielle Varianzanalyse mit adjustiertem Signifikanzniveau auf Alpha/10 = 0,005 nach Bonferroni und Kontrasten für 10 Paare erbrachte eine signifikante Reduktion der Tumorzelladhäsion nur für die maximale Phospholipidkonzentration von 1,5mg im Vergleich zur Kontrollgruppe (p< 0,0001). Auch der Vergleich der benachbarten Konzentration erbringt einen signifikanten Unterschied lediglich für die Konzentrationen 1,0mg – 1,5mg (p= 0,0005). Auffallend in dieser Versuchsreihe ist die Tatsache, dass die Zugabe der geringsten PL-Konzentration (0,1mg) zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Tumorzelladhäsion führte. Dieses Ergebnis wurde jedoch ausschließlich bei der Untersuchung der Adhäsion von HRT-18 Zellen auf Kollagen IV festgestellt. In allen anderen Versuchsansätzen wurden diese Ergebnisse nicht bestätigt. Ergebnisse 39 4.2.1.2 Adhäsion an Laminin 0,9 0,8 Extinktion bei 590 nm 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0,5 0,75 1 1,5 PL mg/well Abbildung 10: Adhäsion von HRT-18 an Laminin (70.000 Zellen/well) Die durchschnittliche Extinktion nach Adhäsion von HRT-18 Zellen auf Laminin betrug nach 30minütiger Inkubationszeit 0,7 ± 0,07 in der Kontrollgruppe. Die Zugabe von Phospholipiden führte zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion adhärenter Tumorzellen. Bereits mit 0,1mg Phospholipiden/well lag die Extinktion bei 0,66 ± 0,08. Die Behandlung mit 0,5 oder 0,75mg PL/well führte zu einem verstärkten antiadhäsiven Effekt. Die Extinktionswerte lagen bei 0,63 ± 0,07 bzw. 0,50 ± 0,08. Den deutlichsten Einfluss auf die Tumorzelladhäsion bei Laminin hatten die höchsten PL Konzentrationen. Mit 1mg PL/well konnte die Extinktion auf 0,44 ± 0,07 und mit 1,5mg PL/well sogar auf 0,39 ± 0,08 reduziert werden. Damit wurde die Tumorzelladhäsion um 46% im Vergleich zur Kontrolle gesenkt. Die unifaktorielle Varianzanalyse mit adjustiertem Signifikanzniveau auf Alpha/10 = 0,005 nach Bonferroni und Kontrasten für 10 Paare erbrachte eine signifikante Reduktion der Tumorzelladhäsion für die Konzentrationen 0,75; 1,0; 1,5mg PL (p<0,0001) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bei dem Vergleich der jeweils benachbarten Konzentrationen war der deutlichste Ergebnisse 40 Unterschied zwischen 0,5mg PL und 0,75mg PL (p=0,0064). Eine weitere Erhöhung der PL Konzentration führte im Vergleich zur benachbarten niedrigeren Konzentration zu keiner weiteren, signifikanten Reduktion der Tumorzelladhäsion (0,75 – 1mg: p = 0,13; 1 - 1,5mg: p = 0,27). Ergebnisse 41 4.2.1.3 Adhäsion an Fibronektin 1,4 1,2 Extinktion bei 590 nm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,1 0,5 0,75 1 1,5 PL mg/well Abbildung 11: Adhäsion von HRT-18 an Fibronektin (70.000 Zellen/well) Im Adhäsionsassay der Tumorzelllinie HRT-18 auf Fibronektin wurde nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten eine Extinktion von durchschnittlich 1,17 ± 0,1 in der Kontrollgruppe gemessen. Unter Einfluss von Phospholipiden kam es, analog zum Ansatz auf Laminin, zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion der Tumorzelladhäsion. Die geringste PL-Konzentration (0,1mg/well) zeigte zwar noch keinen Einfluss (Extinktion: 1,16 ± 0,08), doch bereits 0,5 mg/well verringerte die Zelladhäsion auf einen Extinktionswert von 0,99 ± 0,09. Deutlichere Effekte konnten mit 0,75 bzw. 1mg/well erreicht werden. Hier lagen die Extinktionswerte bei 0,9 ± 0,06 bzw. 0,84 ± 0,07. Unter dem Einfluss von 1,5mg PL/well wurde der geringste Extinktionswert mit 0,74 ± 0,05 dokumentiert. Die Reduktion der Tumorzelladhäsion auf Fibronektin im Vergleich zur Kontrolle lag bei 37%. Die unifaktorielle Varianzanalyse mit adjustiertem Signifikanzniveau auf Alpha/10 = 0,005 nach Bonferroni und Kontrasten für 10 Paare erbrachte Ergebnisse 42 signifikante Unterschiede der Tumorzelladhäsion auf Fibronektin nach Zugabe von 0,5mg (p= 0,0005) sowie 0,75; 1,0; 1,5mg (p< 0,0001) im Vergleich zur Kontrollgruppe nach Zugabe von NaCl. Der deutlichste Unterschied zwischen den benachbarten Konzentrationen lag zwischen 0,1mg und 0,5mg PL (p= 0,0009). Eine weitere Erhöhung der Phospholipidkonzentration führte zwar zu einer deutlichen Reduktion der Tumorzelladhäsion im Vergleich zur benachbarten, Konzentration. Die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. niedrigeren Ergebnisse 43 4.2.2 Magenkarzinom 4.2.2.1 Adhäsion an Kollagen IV 1,2 Extinktion bei 590 nm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,05 0,1 0,5 0,75 1 PL mg/well Abbildung 12: Adhäsion von NUGC-4 an Kollagen IV (50.000 Zellen/well) Tumorzellen der humanen Tumorzelllinie NUGC-4 adhärieren in vitro an Kollagen IV. Die im Adhäsionsassay gemessene Extinktion nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten mit 50.000 Zellen/well lag bei 0,97 ± 0,05. Mit 0,05 PL/well konnte eine leichte Reduktion der Tumorzellanlagerung erreicht werden. Die Extinktion bei 590 nm betrug 0,9 ± 0,02. Auch auf Kollagen IV war der Einfluss der Phospholipide konzentrationsabhängig. Mit 0,1mg/well war die Extinktion 0,75 ± 0,05, mit 0,5mg/well lag sie bei 0,61 ± 0,05 und mit 0,75 mg/well bei 0,48 ± 0,1. Eine weitere Erhöhung der Phospholipidkonzentration auf 1 mg/well konnte die Tumorzelladhäsion nicht weiter reduzieren. Die Extinktion lag bei 0,46 ± 0,07. Der relative Unterschied der Zelladhäsion auf Kollagen IV zwischen der Kontrolle und dem geringsten Wert der Therapiegruppe lag bei 53%. Ergebnisse 44 Die unifaktorielle Varianzanalyse mit adjustiertem Signifikanzniveau auf Alpha/10 = 0,005 nach Bonferroni und Kontrasten für 10 Paare erbrachte signifikante Unterschiede der Tumorzelladhäsion nach Behandlung der Tumorzellsuspension mit 0,1; 0,5; 0,75 und 1,0mg Phospholipid/well (p< 0,0001). Die deutlichsten Unterschiede fanden sich zwischen den Konzentrationen 0,05mg und 0,1mg (p= 0,0008), 0,1mg und 0,5mg (p= 0,0014) sowie 0,5 und 0,75mg (p= 0,0022). Eine weitere Erhöhung der Phospholipidkonzentration erbrachte keine signifikante Reduktion der Tumorzelladhäsion auf Kollagen IV. Ergebnisse 45 4.2.2.2 Adhäsion an Laminin 0,7 0,6 Extinktion bei 590 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,05 0,1 0,5 0,75 1 PL mg/well Abbildung 13: Adhäsion von NUGC-4 an Laminin (50.000 Zellen/well) Die durchschnittliche Extinktion der Adhäsion von NUGC-4 an Laminin nach 30-minütiger Inkubation von 50.000 Zellen/well lag in der Kontrollgruppe bei 0,56 ± 0,09. Bereits mit geringsten Mengen Phospholipiden (0,05mg/well) konnte die Tumorzelladhäsion verringert werden. Der Extinktionswert lag bei 0,4 ± 0,02. Die Reduktion der Zelladhäsion wurde konzentrationsabhängig verstärkt. Die Extinktionswerte betrugen 0,33 ± 0,05 bei 0,1 mg/well; 0,28 ± 0,04 bei 0,5mg/well; 0,25 ± 0,04 bei 0,75mg/well. 0,26 ± 0,02 bei 1mg/well. Mit der Höchstdosis an Phospholipiden konnte somit die Tumorzelladhäsion von NUGC-4 auf Laminin um 54% reduziert werden. Die unifaktorielle Varianzanalyse mit adjustiertem Signifikanzniveau auf Alpha/10 = 0,005 nach Bonferroni und Kontrasten für 10 Paare erbrachte eine signifikante Reduktion der Tumorzelladhäsion bei allen PLKonzentrationen im Vergleich zur Kontrolle mit NaCl (p< 0,0001). Dabei Ergebnisse 46 wurde bereits durch Behandlung mit 0,05mg Phospholipiden/well die deutlichste Reduktion Konzentrationen zu den erreicht. Die benachbarten, Differenzen niedrigere der höhe ren Konzentrationen Phospholipid unterschieden sich nicht mehr signifikant. Die mikroskopische Betrachtung der Multiwellplatten nach Zellaussaat und Anfärbung der Zellen mit Kristallviolett ist am Beispiel von NUGC-4 auf Laminin in Abb. 14 (Kontrollgruppe) und Abb. 15 (Behandlung mit 1mg Phospholipide/well) dargestellt. Abbildung 14: Adhäsion von NUGC-4 Zellen an Laminin in vitro, Kontrolle Abbildung 15: Adhäsion von NUGC-4 Zellen an Laminin in vitro, Phospholipide/well mit 1mg Ergebnisse 47 4.2.2.3 Adhäsion an Fibronektin 0,8 0,7 Extinktion bei 590 nm 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,05 0,1 0,5 0,75 1 PL mg/well Abbildung 16: Adhäsion von NUGC-4 an Fibronektin (50.000 Zellen/well) Nach Inkubation von 50.000 Zellen/well auf Fibronektin kommt es zu einer ausgeprägten Zelladhäsion mit einer Extinktion von 0,6 ± 0,08. Während die Zugabe von 0,1mg PL/well noch keinen Effekt hat (Extinktion: 0,6 ± 0,02), kommt es bereits nach Vorbehandlung mit 0,5mg/we ll mit einer Extinktion von 0,43 ± 0,05 zu einer Verringerung der Zelladhäsion. Dieser Effekt wird verstärkt durch höhere PL Konzentrationen. Mit 0,75mg/well liegt die Extinktion bei 0,41 ± 0,06, mit 1mg/well bei 0,39 ± 0,05. Somit kann durch die Behandlung mit Phospholipiden eine relative Reduktion der Tumorzelladhäsion auf Fibronektin um 35% erreicht werden. Die unifaktorielle Varianzanalyse mit adjustiertem Signifikanzniveau auf Alpha/10 = 0,005 nach Bonferroni und Kontrasten für 10 Paare erbrachte signifikante Unterschiede der Tumorzelladhäsion auf Fibronektin unter Einfluss von 0,5mg, 0,75mg und 1mg Phospholipide/well (p<0,0001). Die beiden geringeren Konzentrationen konnten die Zelladhäsion nicht Ergebnisse 48 signifikant reduzieren. Der wesentliche und signifikante Unterschied innerhalb der Konzentrationsreihe lag zwischen 0,1mg und 0,5mg Phospholipide/well (p<0,0001). Diskussion 49 5 Bei der Diskussion Behandlung beziehungsweise die von Karzinomen Destruktion von stellt die Metastasen Prävention ein großes therapeutisches Problem dar. Eine charakteristische Eigenschaft der Tumorzellen ist ihre Fähigkeit zur Invasion in umgebendes Gewebe, sowie als „freie Tumorzellen“ und auf dem Wege der Lymphbahnen oder Blutgefäße in vom Primärtumor ferne Organe zu gelangen. Tumorzelladhäsion, Motilität, Zellrezeptoren und proteolytische Enzyme sind für diesen Schritt der Tumorzelldissimination essentiell. Eine wichtige Barriere zur Verhinderung von Metastasen stellt die Basalmembran dar. Die Anlagerung von Tumorzellen an spezifische Glykoproteine dieser Basalmembran ist ein entscheidender Schritt und wird über Zelloberflächenrezeptoren auf der Tumorzelle vermittelt. Nun folgen die Destruktion der Extrazellularmatrix und die Migration der Tumorzelle durch die eigentliche Barriere hindurch. Die Adhäsion beschreibt im Mechanismus der Metastasierung einen zentralen Vorgang. In einigen Studien konnte durch Verwendung verschiedener Substanzen eine Verringerung der Tumorzelladhäsion bewirkt werden. Eine dieser antiadhäsiven Substanzen ist eine Phospholipidlösung, welche Gegenstand dieser in vitro Studie darstellte. Phospholipide sind ein Hauptbestandteil aller Zellmembranen und werden von Mesothelzellen produziert. Als polare Phosphorsäure-di-Ester können sie eine abriebfeste Schicht aus 7-13 Lagen ausbilden. Diese Eigenschaft als Schutzschicht nutzt man seit einigen Jahren zur postoperativen Adhäsionsprophylaxe. Laut Müller und Mitarbeiter konnte die einmalige Applikation von Phospholipiden die Adhäsionsbildung nach abdominellen Operationen signifikant reduzieren. Die Wundheilung wurde durch diese Substanz nicht beeinflusst und es traten auch keine sonstigen intraabdominalen Komplikationen auf (Müller 2001). Die Untersuchung dieser Arbeit zeigt, dass der Einsatz von Phospholipiden auch zur Prophylaxe einer Peritonealkarzinose infolge gastrointestinaler Karzinome sinnvoll ist. In vitro wurde eine Inhibition der Diskussion 50 Tumorzelladhäsion Verwendung auf von Extrazellularmatrixkomponenten Phospholipiden festgestellt. Dieser unter Effekt war konzentrationsabhängig, das heißt mit ansteigender Konzentration an Phospholipidlösung konnte die Adhäsionsinhibition verstärkt werden. Die Höhe der Adhäsionsreduktion war bei den verschiedenen Extrazellularmatrixkomponenten unterschiedlich. Die qualitative Tendenz der Versuchsreihen war allerdings in allen Ansätzen vergleichbar. Bei der Zellinie NUGC-4 konnten die Phospholipide eine maximale Reduktion von 37% bei Fibronektin, 53% bei Kollagen 4 und 54% bei Laminin bewirken. Das Ausmaß der Adhäsionsverhinderung belief sich bei der Zellinie HRT18 auf 24% bei Kollagen IV , 37% bei Fibronektin und 46% bei Laminin. Diese unterschiedlichen Erfolge lassen sich durch das unterschiedliche Integrinmuster der beiden Zellinien erklären. Nakashio und Mitarbeiter fanden heraus, dass die Zellinie NUGC-4 über die Integrinsubtypen a2, a3, a5, a6, und ß1 verfügt (Nakashio 1997). Hrt-18 weist abhängig von der Zellkulturform ein unterschiedliches Integrinmuster auf. Monolayerkulturen In diesen verwendet. Hier in vitro Experimenten exprimieren wurden HRT-18-Zellen die Integrinsubtypen: a2, a3, a6, av und ß1. Der Subtyp a5 wird nur gering exprimiert (Hauptmann 1995). Die Adhäsion der Tumorzellen an die verschiedenen Extrazellularmatrixkomponenten wird über spezifische Integrine vermittelt. Die Adhäsion an Kollagen IV erfolgt über a2ß1, an Fibronektin über a5ß1 und die Zelladhäsion an Laminin erfordert die Integrine a6ß1 (Schreiner 1991). Der vorliegende in vitro Versuchsansatz der Adhäsionsprophylaxe mit diesen Substanzen wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. Ein weiterer Ansatz zur Inhibition der Tumorzellinvasion stellen die Fucane dar. Fucane sind sulfatierte Polysaccharide, welche aus Seetang extrahiert werden können. Mittels standardisierter Adhäsions - und Chemoinvasionsuntersuchungen konnte eine Inhibition der Invasion von MDA-MB231 Zellen (humane Mammakarzinomzelllinie) in Matrigel unter Verwendung von Fucanen erreicht werden. Diese Verhinderung der Zelladhäsion wurde auf direkte Interaktionen zwischen Fucanen und Diskussion Laminin, 51 einem Bestandteil der Extrazellularmatrix, zurückgeführt. Außerdem wurde postuliert, dass die antiadhäsive Potenz von Fucanen mit der Höhe des Sulfatgehaltes des jeweiligen Fucans ansteigt (HarounBouhedja 2002). Morphin, eine stark analgetisch wirksames Opioid, wird häufig zur Schmerzlinderung infolge maligner Tumoren eingesetzt. Durch die Vermeidung des durch Schmerz ausgelösten Stresses konnte ein Rückgang der Tumormetastasierung verzeichnet werden (Page 1993). Harimaya und Mitarbeiter fanden in einer Studie an Colon 26-L5 (metastasierende Adhäsion Kolonkarzinomzellen) und Migration heraus, dieser dass Morphin Tumorzellen die an Extrazellularmatrixkomponenten verhindert. Da diese Adhäsionsinhibition durch Naloxon, ein Morphinantagonist, verhindert werden konnte, kam man zu der Annahme, dass die Wirkung von Morphin auf die Tumorzelladhäsion zumindest teilweise auf die Funktion der Mesothelzelle und Opioidrezeptoren angewiesen ist (Haimaya 2002). Integrine sind wichtige Bindeglieder zwischen metastasierender Tumorzelle. Die Theorie der direkten Blockierung von Integrinen durch spezifische Antikörper zur Verhinderung der Anlagerung der Tumorzellen wird in der Literatur beschrieben. Man fand am Beispiel zweier Magenkarzinomzelllinien MKN-28 und MKN-74 die Expression von a2- und a6-Integrinen heraus. Durch Applikation monoklonaler Antikörper gegen a2- und a6-Integrine konnte die Tumorzellinvasion in eine künstliche Basalmembran und auch in Kollagen Type I Gel verhindert werden (Koike 1997). Ähnliche Resultate zeigte eine Studie von Lessan und Mitarbeitern. Sie testeten die beiden Ovarialkarzinomzelllinien SKOV3 und NIH:OVCAR5, welche beide eine hohe Expression sowohl von CD44 als auch von ß1- Integrinen zeigten. Bei den Adhäsionsuntersuchungen resultierte im Fall von SKOV3 eine reduzierte Adhäsion nur unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen CD44. Die andere Zelllinie NIH:OVCAR5 wurde hingegen nur bei Applikation monoklonaler Antikörper gegen ß1 an der Adhäsion gehindert. Diese Ergebnisse lassen Diskussion 52 den Schluss zu, dass diese beiden Zelllinien einen unterschiedlichen Mechanismus zur Anlagerung an Mesothelzellen nutzen. Durch diese Versuchsergebnisse wird die Anwendung monoklonaler Antikörper zur Verhinderung der Metastasierung von Primärtumoren in Frage gestellt. Für die Therapie müsste jeweils das spezielle Integrinmuster des Primärtumors ermittelt werden, um dann die für diesen Tumor spezifischen Adhäsionseigenschaften herausfinden zu können. Dies ist ein sicherlich sehr zeitintensives und kostenträchtiges Verfahren. Die in vivo Effekte der Phospholipide auf die Prävention von Peritonealkarzinosen wurden in unserer Arbeitsgruppe an Tiermodellen untersucht. Es wurden NUGC-4 Karzinomzellen in Nacktmäuse implantiert und DHD/K12 –Karzinomzellen in BD-IX Ratten injiziiert. Nach einer intraperitonealen Behandlung mit Phospholipiden konnte bei einer Höchstkonzentration der Phospholipide von 150 mg/kg die Überlebensrate beider Tierspezies Behandlungserfolg verbessert verzeichnet werden. werden, Somit welcher konnte sowohl von ein der Tierspezies als auch von der verwendete n Zelllinie unabhängig ist. Diese Ergebnisse werden Versuchsansatz von Müller beschäftigte und sich Mitarbeitern mit der bestätigt. Prävention Ihr von Adhäsionsbildungen nach operativen abdominalen Eingriffen. Da die pathomechanischen Vorstellungen von Adhäsionsbildung und Ausbildung einer Peritonealkarzinose weitgehend übereinstimmen, kann diese Untersuchung zum Vergleich herangezogen werden. Die oben genannten Untersucher bewiesen eine signifikante Reduktion der Adhäsionsbildung durch Phospholipide. Die Idee der Verhinderung der Adhäsion von freien Tumorzellen an verschiedene Gewebeklassen wurde bisher, laut Literatur, von mehreren Arbeitsgruppen verfolgt. Hierzu wurden verschiedene Substanzen getestet. Eine dieser Substanzen ist das Dextransulfat. Dieses wurde an Nacktmäusen in Kombination mit einer Melanomzelllinie B-16 untersucht. Das Resultat der Versuchsreihe war eine Verlängerung der Diskussion 53 Überlebenszeit der Mäuse durch effektive Verhinderung der Implantation von freien Melanomzellen in das peritoneale Gewebe (Hagiwara 2000). Fraglich ist jedoch, ob eine Übertragung auf Magen- oder Kolorektale Tumorgeschehen, welche mit einem viel größeren Risiko zu Peritonealkarzinosen behaftet sind als Melanome, zulässig ist. Bezüglich der Toxizität von Dextransulfaten bestehen laut Hagiwara keine Bedenken, denn die letale Dosis liegt weit über der therapeutisch einzusetzenden Konzentration (Hagiwara 2000). Bedenklich ist allerdings die hohe osmotische Wirksamkeit dieser Substanzklasse. Bei intraperitonealer Anwendung von Dextranen kann es zu einer erheblichen Volumenverschiebung mit Entstehung von Ödemen, Pleuraergüssen bis zu lebensbedrohlichen Gerinnungsstörungen und Allergien kommen (Treutner 2000). Tan und Mitarbeiter verfolgten die Idee der Adhäsionsinhibition freier Tumorzellen mittels Hyaluronsäure. Diese natürlicherweise in der Extrazellularmatrix und Mesothelzellen vorkommende Substanz, steigerte allerdings signifikant die Tumorzellproliferation und Motilität. Außerdem entdeckte man eine Interaktion zwischen Hyaluronsäure und dem Adhäsionsmolekül CD44, sodass es in vivo unter intraperitonealer Applikation sogar zu einer signifikanten Erhöhung der Anzahl der Tumorknötchen in der Peritonealhöhle kam. Eine Adhäsionsprophylaxe im weiteren Sinne wurde von van Rossen und Mitarbeitern entdeckt. Sie untersuchten den Einfluss von Erythrozyten auf die Adhäsion beziehungsweise auf die Metastasierungstendenz einer Kolonkarzinomzelllinie. Es zeigte sich sowohl in vitro als auch in vivo eine Inhibition der Tumorzelladhäsion Erythrozytenkonzentraten. Man unter kam Einfluss von dem Schluss, zu Vollblut dass und die Adhäsionsinhibition nicht durch eine direkte Hemmung der Anlagerung von Tumorzellen zustande kommt, sondern durch die in Erythrozyten enthaltenen zytoplasmatischen Oxidantien die destruierende Wirkung von freien Radikalen auf das Peritoneum verhindert wird. Daher wird das peritoneale Gewebe geschützt und privilegierten Läsionen werden verhindert. die als Metastasierungsorte Diskussion 54 Phospholipide zeichnen sich durch eine unspezifische Hemmung der Tumorzelladhäsion mittels Bildung eines abriebfesten Schutzfilms aus. Die hier getestete Lösung liegt gebrauchsfertig vor und kann intraoperativ sofort verwendet werden. Aufgrund der guten experimentellen und klinischen Ergebnisse, die sich in der Adhäsionsprophylaxe aber auch bei der Inhibition der Tumorzelladhäsion zeigten, halten wir die postoperative intraperitoneale Therapie mit Phospholipiden bei abdominalchirurgischen Eingriffen für erfolgversprechend. Weitere klinische Untersuchungen sind notwendig, um den Einsatz der Phospholipide zu optimieren. Zusammenfassung 6 55 Zusammenfassung Die Prognose von Patienten mit gastrointestinalen Tumoren ist durch die mögliche Ausbildung einer Peritonealkarzinose deutlich eingeschränkt. Um der Entwicklung der nicht mehr kurativ behandelbaren Peritonealkarzinose entgegenzuwirken, wird der Prävention besondere Bedeutung zugemessen. Ursachen für die hohe Inzidenz und rapide Progredienz von peritonealen Metastasen sind unter anderem die folgenden Aspekte: 1. Freie Tumorzellen als Resultat der Serosainfiltration des Primärtumors 2. Abtropfen von Tumorzellen aus durchtrennten Lymphgefäßen 3. Dissemination der Tumorzellen direkt vom Primärtumor bei chirurgischer Traumatisierung und rückfließendem venösem Blut 4. Anlagerung der freien Tumorzellen über Fibrin an traumatisierter peritonealer Oberfläche 5. Vermehrte Proliferation der Tumorzellen durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren des im Heilungsprozess befindlichen Gewebes Zur Verhinderung einer Peritonealkarzinose werden einige lokale Therapiestrategien eingesetzt. Wie in verschiedenen Studien bewiesen wurde, kann eine intraperitoneale Chemotherapie die Prognose dieser Patienten verbessern. Durch den hohen apparativen Aufwand und die hohe Komplikationsrate ist eine solche Behandlungsstrategie allerdings nur in speziellen Zentren durchführbar. Die intraperitoneale Immuntherapie stellt eine weitere Form der Behandlung dar. Hierbei wird die Adhäsion von Tumorzellen an das Peritoneum inhibiert, indem man spezifische Antikörper gegen die jeweiligen Adhäsionsmoleküle der Tumorzellen intraperitoneal appliziert. Ein anderer Ansatz zur Inhibition der Tumorzelladhäsion stellt die Applikation adhäsionshemmender Substanzen (z. B.: Dextrane) dar. In Zusammenfassung 56 diese Substanzklasse sind auch Phospholipide verschiedenen Untersuchungen konnte durch einzuordnen. eine Bei intraperitoneale Injektion von Phospholipiden eine Verhinderung bzw. Verringerung von peritonealen Adhäsionen infolge operativer abdomineller Eingriffe gezeigt werden. Auf diesen Ergebnissen basierend, wird in der vorliegenden Arbeit die Reduktion der intraperitonealen Tumorzelladhäsion durch eine lokale Phospholipid – Therapie in vitro untersucht. Bei der Untersuchung der Adhäsion von NUGC-4 Magenkarzinomzellen und HRT-18 Kolonkarzinomzellen auf den verschiedenen Extrazellularmatrixkomponenten Laminin, Fibronektin und Kollagen IV kam es zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung der Tumorzelladhäsion. Das Ausmaß der Inhibition der Tumorzelladhäsion war unterschiedlich von maximal 37 – 54% bei der Zelllinie NUGC-4 und 24 – 46% bei der Zelllinie HRT-18. Der qualitative Effekt war in allen Versuchsreihen allerdings vergleichbar. Der Mechanismus der Adhäsionsinhibition von Phospholipiden beruht im Wesentlichen auf der Ausbildung eines 7-10 Schichten umfassenden Schutzfilmes über das gesamte Peritoneum. Daher werden die als Prädilektionsstellen für Tumorzelladhäsion prädestinierten peritonealen Läsionen abgedeckt. Durch Verwend ung von Phospholipiden wird somit die vermehrte Anlagerung in diesen Bereichen verhindert. Aufgrund der guten experimentellen und klinischen Ergebnisse, die sich in der Adhäsionsprophylaxe aber auch bei der Inhibition der Tumorzelladhäsion zeigten, halten wir die postoperative intraperitoneale Therapie mit Phospholipiden bei abdominalchirurgischen Eingriffen für erfolgversprechend. Auch die einfache Handhabung und das Fehlen von schwerwiegenden Komplikationen sprechen für einen routinemäßigen Einsatz. Weitere klinische Untersuchungen sind notwendig, um den Einsatz der Phospholipide zu optimieren. Abbildungsverzeichnis 7 Abbildung 1: 57 Abbildungsverzeichnis Tumorzellinvasion: koordinierter Prozess der Tumorzelladhäsion, Proteolyse und Migration (nach Liotta 1990) Abbildung 2: Modell der Interaktion zwischen Ovarialkarzinomzellen und Mesothelzellen (nach Lessan 1999). Abbildung 3: Pathogenese der Peritonealkarzinose (nach Yonemura 1998) Abbildung 4A: Schema zur Metastasierung einer Tumorzelle Abbildung 4B: Schema zur Wirkungsweise der Phospholipidlösung Abbildung 5: Lamininmolekül mit Bindungsstellen (nach Bornträger 1999) Abbildung 6: gestrecktes Fibrinmolekül (nach Bornträger 1999) Abbildung 7: Tetramerstruktur des Kollagen IV (nach Borntäger 1999) Abbildung 8: Adhäsion von NUGC–4 an Kollagen IV (50.000 Zellen/well) Abbildung 9: Adhäsion von HRT-18 (30.000 Zellen/well) an Kollagen IV Abbildungsverzeichnis Abbildung 10: 58 Adhäsion von HRT-18 an Laminin (70.000 Zellen/well) Abbildung 11: Adhäsion von HRT-18 an Fibronektin (70.000 Zellen/well) Abbildung 12: Adhäsion von NUGC-4 an Kollagen IV (50.000 Zellen/well) Abbildung 13: Adhäsion von NUGC-4 an Laminin (50.000 Zellen/well) Abbildung 14: Adhäsion von NUGC-4 Zellen an Laminin in vitro, Kontrolle Abbildung 15: Adhäsion von NUGC-4 Zellen an Laminin in vitro, mit 1mg Phospholipide/well Abbildung 16: Adhäsion von NUGC-4 (50.000 Zellen/well) an Fibronektin Abkürzungsverzeichnis 8 59 Abkürzungsverzeichnis BSA Bovines Serum Albumin °C Grad Celsius Da Dalton ECM Extrazelluläre Matrix Fn Fibronektin g Gramm HGF Hepatocyte growth factor KCl Kalium Chlorid kg Kilogramm Ln Laminin M Molar ml Milliliter µl Mikroliter MMP Matrix Metalloproteinase NaCl Natrium Chlorid nm Nanometer OP Optische Dichte PL Phospholipide RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase Ketten Reaktion TGF-ß Transforming growth factor - ß Literaturverzeichnis 9 60 Literaturverzeichnis Ar’Rajab A., Snoj M, Larsson K., Bengmark S.: Exogenous Phospholipid reduces postoperative peritoneal adhesions in rats. 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Für die wissenschaftliche Unterstützung bei der Bearbeitung der Thematik danke ich Herrn Privatdozent Dr. med. Karl – Heinz Treutner. Weiterhin gilt mein Dank dem Direktor des Instituts für Pathologie der RWTH Aachen, Herrn Prof. Dr. med. Christian Mittermayer, für die Bereitstellung des Laborarbeitsplatzes. Besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. med. Marc Jansen für das hervorragende Engagement bei der Betreuung der praktischen Arbeiten und für die Durchsicht des Manuskriptes bedanken. Außerdem danke ich Herrn Privatdozent Dr. med. Lothar Tietze , Frau Dr. rer. nat. Eva Becher, Dipl. - Biol. Sabine Neuss sowie allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Zellkulturlabors des Instituts für Pathologie für die freundliche Unterstützung und zahlreichen Hilfestellungen bei den Versuchen. Zuletzt richte ich meinen ganz besonderen Dank für die Unterstützung und den dauerhaften Ansporn an meine Mutter, meine beiden Großmütter sowie alle meine Freunde. Lebenslauf 73 11 Lebenslauf 04. 02. 1978 geboren in Düren 1984 – 1988 Kathol. Grundschule – Martinus Schule Schlich 1988 – 1997 Privates Gymnasium St. Angela der Ursulinen, Düren Juni 1997 Allgemeine Hochschulreife 1997 Aufnahme Humanmedizin Westfälisch des an Hochschulstudiums der Technischen Rheinisch – Hochschule Aachen Aug. 1999 Ärztliche Vorprüfung Aug. 2000 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Aug. 2002 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Mai 2004 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Seit Juni 2004 Ärztin im Praktikum, Abteilung Anästhesie, Malteser Krankenhaus, Bonn Hardtberg
