Molekulare Regulation der IL-10 Expression in
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Molekulare Regulation der IL-10 Expression in inflammatorischen und regulatorischen T-Helfer-Zellen vorgelegt von Diplom-Ingenieur Biotechnologie Christian Neumann aus Berlin von der Fakultät III - Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzende: Gutachter: Gutachter: Prof. Dr. Vera Meyer Prof. Dr. Roland Lauster Prof. Dr. Alexander Scheffold Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 30. September 2015 Berlin 2016 „I am among those who think that science has great beauty. A scientist in his laboratory is not only a technician: he is also a child placed before natural phenomena which impress him like a fairy tale.“ (Marie Curie, 1867 - 1934) Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 1.2 Grundzüge des Immunsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.1.1 Angeborene und adaptive Immunität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.1.2 Die Biologie der T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 TH -Zell-Differenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.2.1 TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regulatorische T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Regulation von Immunantworten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3.1 Die immunsuppressive Funktion von IL-10 . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.3.2 Die Rolle von IL-10-produzierenden T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . 13 1.3.2.1 Foxp3-positive regulatorische T-Zellen . . . . . . . . . . . . . 14 1.3.2.2 Foxp3-negative TH -Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Regulation der IL-10 Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.4.1 Konzepte der Genregulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.4.1.1 Epigenetische Regulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.4.1.2 Transkriptionelle Regulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.4.1.3 Posttranskriptionelle Regulation . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.4.1.4 Posttranslationale Regulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.4.2 Struktur des Il10 Gen Lokus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.4.3 Epigenetische Regulation von IL-10 in T-Zellen . . . . . . . . . . . . . 18 1.4.4 Transkriptionelle Regulation von IL-10 in T-Zellen . . . . . . . . . . . 18 Der Notch-Signalweg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.5.1 22 1.2.2 1.3 1.4 1.5 8 Die Rolle des Notch-Signalwegs für die IL-10 Produktion von T-Zellen 12 2 Zielsetzung 24 3 Material und Methoden 26 3.1 Medien und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.2 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.3 Rekombinante Zytokine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.4 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3 3.5 Mäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.6 T-Zell-Isolierung, -Aktivierung und -Differenzierung . . . . . . . . . . . . . . 32 CD4+ 3.6.1 Anreicherung naiver TH -Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.6.2 T-Zell-Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.6.3 T-Zell-Differenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.7 IL-10 Sekretionsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.8 Transkriptomanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.9 Intrazelluläre Zytokinfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.10 ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.11 Retrovirale Transduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.12 mRNA Expressionsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.12.1 Reverse Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.12.2 Quantitative Real-Time-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.12.3 qRT-PCR Primer und Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.13 Immuno-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.14 Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.14.1 ChIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.14.2 ChIP Primer und Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.15 Luziferase-Reporter-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 3.16 Tierexperimentelle Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.16.1 Transfer-Kolitis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.16.2 Toxoplasma gondii Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.16.2.1 Infektion T.gondii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.16.2.2 Immunohistochemie der Leber . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.16.2.3 Leber-Organkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.16.2.4 T.gondii-spezifische Restimulation . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.17 Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4 Ergebnisse 4.1 Identifizierung von IL-10-assoziierten Transkriptionsfaktoren in TH 1 Zellen . 45 4.1.1 45 4.1.2 4.2 44 Sortierung von TH 1 Zellen anhand ihrer IL-10 Sekretion . . . . . . . . Vergleichende Genexpressionsanalyse von IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen 46 4.1.2.1 Globale vergleichende Analyse (Transkriptomanalyse) . . . . 46 4.1.2.2 Selektive vergleichende Analyse (Validierung) . . . . . . . . . 47 Funktionelle Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen . . . 48 4.2.1 Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression in vitro generierter TH 1 Zellen 49 4.2.1.1 IL-10 Produktion in Abwesenheit von Blimp-1 . . . . . . . . 49 4.2.1.2 IL-10 Produktion nach Blimp-1 Überexpression . . . . . . . . 50 4.2.2 4.2.2.1 Transfer-Kolitis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 4.2.2.2 Toxoplasma gondii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 Rolle von Blimp-1 für eine TH 1-vermittelte Immunantwort . . . . . . 55 Funktionelle Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen . . . . 57 4.2.3 4.3 Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression in vivo generierter TH 1 Zellen 51 4.3.1 Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression in vitro generierter TH 1 Zellen 57 4.3.1.1 IL-10 Produktion in Abwesenheit von c-Maf . . . . . . . . . 57 4.3.1.2 4.3.2 4.4 4.5 4.7 Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression in vivo generierter TH 1 Zellen 60 61 4.4.1 Rolle von IL-12 für die Expression von Blimp-1 und c-Maf . . . . . . . 61 4.4.2 Rolle von STAT4 für die Expression von Blimp-1 und c-Maf . . . . . . 62 4.4.3 Rolle von T-bet für die Expression von Blimp-1 und c-Maf . . . . . . 63 4.4.4 Rolle von ERK für die Expression von Blimp-1 und c-Maf . . . . . . . 64 Molekulare Regulation der IL-10 Produktion von TH 1 Zellen . . . . . . . . . 65 Analyse der Bindung von Blimp-1, c-Maf und STAT4 an den Il10 Lokus 65 4.5.1.1 Der Il10 Lokus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 4.5.1.2 Analyse der Bindung an konservierte Bereiche des Il10 Lokus 66 4.5.2 Rolle von STAT4 und Blimp-1 für Histonmodifizierungen am Il10 Lokus 66 4.5.3 Blimp-1 und c-Maf: unabhängige oder synergistische Wirkungsweise? . 68 Funktionelles Verhältnis zwischen Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen . . . . . 70 4.6.1 Einfluss von Blimp-1 auf die c-Maf Expression . . . . . . . . . . . . . 70 4.6.2 Einfluss von c-Maf auf die Blimp-1 Expression . . . . . . . . . . . . . 71 Funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die Notch-vermittelte IL-10 Produktion von TH 1 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.1 72 Notch-vermittelte IL-10 Expression in Abwesenheit von Blimp-1 oder c-Maf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.7.2 Einfluss von Notch auf die Blimp-1 und c-Maf Expression . . . . . . . 73 4.7.3 Einfluss von Notch auf die Bindung von Blimp-1 und c-Maf an den Il10 Lokus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8 59 Regulation der Blimp-1 und c-Maf Expression in TH 1 Zellen . . . . . . . . . . 4.5.1 4.6 IL-10 Produktion nach c-Maf Überexpression . . . . . . . . . 73 Funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.1 75 4.8.2 Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen . . 75 IL-10-Assoziation von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen 76 4.8.3 IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen in Abwesenheit von Blimp1 oder c-Maf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.4 77 IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen nach Blimp-1 oder c-Maf Überexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.9 Funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von regulatorischen T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Foxp3+ 79 4.9.1 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von Tregs 80 4.9.2 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TR 1 Zellen 80 4.9.2.1 Expression von Blimp-1 und c-Maf in TR 1 Zellen . . . . . . 81 4.9.2.2 IL-10-Assoziation von Blimp-1 und c-Maf in TR 1 Zellen . . . 82 4.9.2.3 IL-10 Produktion von TR 1 Zellen in Abwesenheit von Blimp-1 oder c-Maf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.10 Funktionelle Rolle von TGF-❜ für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen . . . 84 5 Diskussion 5.1 86 Die Expression von Blimp-1 und c-Maf korreliert mit der IL-10 Produktion in TH 1 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 5.2 Blimp-1 reguliert die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen . . . . . . . . . . . 89 5.3 Blimp-1 limitiert die TH 1-vermittelte Immunpathologie während einer T.gondii Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.4 Blimp-1 und c-Maf kooperieren bei der IL-10 Induktion . . . . . . . . . . . . 90 5.5 Die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen ist ERK- und IL-12/STAT4abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.6 Blimp-1, c-Maf und STAT4 binden an den Il10 Lokus in TH 1 Zellen . . . . . 92 5.7 STAT4 moduliert den Chromatinstatus von Il10 in TH 1 Zellen . . . . . . . . 93 5.8 Notch induziert IL-10 in TH 1 Zellen über eine Verstärkung der c-Maf Expression 93 5.9 Modell der transkriptionellen Regulation von IL-10 in TH 1 Zellen . . . . . . . 95 5.10 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen 96 5.10.1 TH 2 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 5.10.2 TH 17 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 5.11 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von regulatorischen T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.11.1 Foxp3+ 98 Tregs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 5.11.2 Foxp3– TR 1 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 5.12 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 6 Zusammenfassung 102 7 Literaturverzeichnis 105 8 Anhänge 115 I In silico Analyse von STAT, c-Maf und Blimp-1 Bindungsmotiven . . . . . . 115 II Abbildungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 III Tabellenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 IV Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 V Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 VI Eidesstattliche Erklärung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 VII Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 VIII Publikationsliste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 1 Einleitung Einleitung 9 1.1 Grundzüge des Immunsystems 1.1.1 Angeborene und adaptive Immunität Um der ständigen Bedrohung durch diverse pathogene Mikroorganismen und Parasiten zu begegnen hat unser Organismus sehr komplexe und äußerst effektive Abwehrmechanismen entwickelt, welche in ihrer Gesamtheit als Immunsystem bezeichnet werden. Grundlegend wird das Immunsystem in die angeborene und die adaptive Immunität unterteilt, denen unterschiedliche Funktionsweisen zugrunde liegen, die sich jedoch in einer Immunantwort gegenseitig ergänzen. Das angeborene Immunsystem basiert auf der Erkennung und Eliminierung wiederkehrender Strukturelemente von Pathogenen, den sogenannten pathogen associated molecular pattern (PAMP) (Übersicht in [1]). Vermittelt wird die angeborene Immunität über verschiedene Komponenten, wie dem Komplementsystem, einer Reihe von phagozytierenden Zellen (Makrophagen, Granulozyten) und natürlichen Killer-Zellen (NKZellen). Trotz der hohen Schnelligkeit und Effizienz in der Eliminierung von Pathogenen (über 90% aller Antigene werden durch das angeborene Immunsystem eleminiert) ist die angeborene Immunität unspezifisch und nur begrenzt wirksam. Das adaptive Immunsystem hingegen zeichnet sich durch Spezifität, Anpassung und der Fähigkeit zur Ausbildung eines Gedächtnisses aus. Es besitzt die Fähigkeit, vielfältigste körperfremde Strukturen (Antigene) spezifisch zu erkennen und gezielt zu bekämpfen. Gleichzeitig wird im Zuge einer Immunreaktion ein immunologisches Gedächtnis angelegt, welches es möglich macht, bei erneutem Kontakt mit dem gleichen Antigen, beschleunigt und effizienter zu reagieren (Übersicht in [2]). Die zelluläre Grundlage der adaptiven Immunität bilden die B- und T-Lymphozyten, mit den von ihnen exprimierten Antigenrezeptoren, dem B- bzw. T-Zell-Rezeptor (TZR). Jede einzelne Zelle trägt hierbei nur Rezeptoren einer einzigen Spezifität, die in einer frühen Phase der B-und T-Zell-Entwicklung in einem komplexen Rekombinationsprozess nach dem Zufallsprinzip entstehen. Die hieraus erwachsene Diversität ist die Grundlage der Antigenerkennung. Nach dem Kontakt mit dem Antigen werden nur die Lymphozyten aktiviert und expandiert, die den für das Antigen spezifischen Rezeptor auf der Zelloberfläche tragen (Übersicht in [3]). Anhand ihrer Funktions- und Wirkungsweise wird die B- und T-Zell-vermittelte Immunität in jeweils humorale bzw. zelluläre Immunantworten unterschieden. Die humorale Immunantwort wird durch lösliche Antikörpermoleküle vermittelt, die von aktivierten B-Zellen produziert werden. Antikörper können durch Bindung an pathogene Organismen oder Substanzen deren Phagozytose, Lyse oder Inaktivierung auslösen. Diese Art der Immunreaktion richtet sich gegen extrazelluläre Erreger. Die zelluläre Immunabwehr hingegen bezeichnet die Reaktion gegen intrazelluläre Erreger, bei der die Pathogene und die von ihnen befallenen Zellen durch Makrophagen, NK-Zellen oder zytotoxische T-Zellen eliminiert werden [2]. Einleitung 10 1.1.2 Die Biologie der T-Zellen Die Aktivierung von T-Zellen erfolgt über die Antigenerkennung. Grundlegend können Antigene nur dann durch T-Zellen erkannt werden, wenn sie auf der Zelloberfläche von sogenannten Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) durch Bindung an den sogenannten major histocompatibilty complex (MHC) präsentiert werden. Man unterscheidet zwei verschiedene MHC Moleküle, die Peptide aus unterschiedlichen zellulären Kompartimenten an die Zelloberfläche transportieren. MHC-I Moleküle binden zytosolisches Antigen, z.B. Moleküle von intrazellulären Erregern, wie Viren. Deren Proteine werden in der Wirtszelle selbst produziert, dort in Peptide zerlegt und dann auf das MHC-Molekül geladen. Antigene auf MHC-I Molekülen werden von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt. Nach Erkennung des Antigens wird die CD8+ T-Zelle aktiviert und sekretiert zytotoxische Moleküle, welche die infizierte Zelle töten, um eine Ausbreitung und Vermehrung des Erregers zu verhindern (Übersicht in [4]). MHC-I Moleküle werden von nahezu allen Körperzellen exprimiert, um im Falle einer Infektion vom Immunsystem erkannt und eliminiert zu werden. Peptide aus intrazellulären Vesikeln hingegen werden an MHC-II Moleküle gebunden und durch CD4+ T-Helfer-Zellen (TH -Zellen) erkannt. Diese Peptide stammen von extrazellulären Pathogenen und werden durch Phagozytose aufgenommen und im Phagolysosom in Fragmente zerlegt (Übersicht in [5]). MHC-II Moleküle werden im Gegensatz zu den Klasse-I Molekülen nur von spezialisierten, so genannten professionellen APZ exprimiert. Dazu zählen Makrophagen, B-Zellen und dendritische Zellen. In einigen besonderen Fällen können auch andere Zellen, wie zum Beispiel Endothelzellen, diese MHC-II Moleküle exprimieren. Die Aufgabe von CD4+ TH -Zellen besteht hauptsächlich darin, andere Zellen des Immunsystems so zu dirigieren, dass eine möglichst effektive Immunantwort zur Eliminierung des Pathogens entsteht. Um dieser komplexen Funktion gerecht zu werden können naive CD4+ TH -Zellen nach Antigenerkennung und Aktivierung in verschiedene Subpopulationen ausdifferenzieren. 1.2 TH -Zell-Differenzierung Den vielfältigen Aufgaben von TH -Zellen entsprechend gibt es unterschiedliche Subpopulationen dieser Zellen. Sie unterscheiden sich durch die differentielle Expression von Transkriptionsfaktoren und sekretierten Zytokinen. Die Richtung der Differenzierung (Priming) einer naiven TH -Zelle zu einer Effektor-TH -Zelle wird neben dem TZR und ko-stimulatorischen Signalen maßgeblich durch die Zytokinumgebung während der T-Zell-Aktivierung bestimmt. Einen Überblick über die periphere TH -Zell-Differenzierung liefert Abb. 1.1. Einleitung 11 Abb. 1.1: Schematische Darstellung der peripheren TH -Zell-Differenzierung. Periphere naive CD4+ TH -Zellen differenzieren in verschiedene Effektor-TH -Zell-Populationen (TH 1, TH 2, TH 17) oder unterschiedliche Subpopulationen von regulatorischen T-Zellen (tTreg, pTreg, TR 1). Die Differenzierung wird durch verschiedene Zytokine und spezifische Transkriptionsfaktoren gesteuert. Die einzelnen Subpopulationen zeichnen sich ihrerseits durch die Produktion bestimmter Zytokine aus. 1.2.1 TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen TH 1 Zellen werden vor allem durch IL-12 induziert, welches von aktivierten APZ sekretiert wird. Die Interaktion von IL-12 und dem IL-12-Rezeptor führt in der Folge zu einer Aktivierung von STAT4 und einer damit verbundenen Expression des pro-inflammatorischen Zytokins IFN-❣. IFN-❣ führt wiederum über die Aktivierung von STAT1 zu einer Induktion des Transkriptionsfaktors T-bet. Dieser ist der Hauptregulator der TH 1-Differenzierung, da er die Expression von IFN-❣ und der IL-12-Rezeptor-b2-Kette potenziert und die Produktion von TH 2-Zytokinen, insbesondere von IL-4, unterdrückt (Übersicht in [6]). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass neben IL-12 auch das Zytokin IL-27 über STAT1 T-bet induzieren kann [7]. Da T-bet die Expression der IL-12-Rezeptor-b2-Kette steuert, wird angenommen, dass IL-27 vor allem in der frühen Phase der TH 1 Differenzierung wirkt, da es naive TH -Zellen empfänglich für IL-12 macht [8]. Funktionell vermitteln TH 1 Zellen durch ihre Zytokinproduktion eine zellvermittelte Immunität. Zu diesen Zytokinen gehören IFN-❣ und TNF-❛, welche eine Aktivierung von Makrophagen bewirken und für eine effektive Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene notwendig sind. Das Zytokin IL-4 steuert die TH 2-Differenzierung durch Aktivierung von STAT6, welches wiederum GATA3, den Hauptregulator für TH 2 Zellen induziert [9]. GATA3 bindet im Folgenden an regulatorische Bereiche des IL-4 Genes und steuert sowohl die Transkription von IL-4 als auch von IL-5. Neben IL-4 produzieren TH 2 Zellen die Zytokine IL-5, IL-10 sowie Einleitung 12 IL-13. TH 2 Zellen sind notwendig für die humorale Immunantwort und vermitteln daher die Immunabwehr gegen extrazelluläre Parasiten. Außerdem sind TH 2 Zellen aber auch an pathologischen Immunreaktionen, wie z.B. Allergien beteiligt. Für die Differenzierung von TH 17 Zellen sind die Zytokine IL-6 und TGF-❜ essentiell [10, 11]. IL-23, das zunächst als Differenzierungsfaktor für TH 17 Zellen beschrieben wurde, spielt hingegen nur für die Expansion von TH 17 Zellen eine Rolle [12]. TH 17 Zellen exprimieren den Transkriptionsfaktor ROR❣t und produzieren vor allem die Zytokine IL-17A, IL-17F und IL-22 [13]. TH 17 Zellen wird eine Rolle bei der Bekämpfung von extrazellulären Bakterien und Pilzen zugeschrieben. Darüber hinaus spielen TH 17 Zellen eine entscheidende pathogene Rolle bei der Entwicklung von Autoimmunität [14, 15]. Neben TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen sind heute noch viele andere Subtypen von TH -Zellen, wie z.B. TH 9, TH 22 oder TFH Zellen, beschrieben, deren genaue Funktion jedoch mitunter noch nicht vollständig aufgeklärt ist. 1.2.2 Regulatorische T-Zellen Neben den bisher beschriebenen Effektor-TH -Zell-Populationen, die für die Immunabwehr essentiell sind, gibt es auch TH -Zellen mit einem primären regulatorischen Phänotyp. Diese Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass sie Immunantworten abschalten, statt zu fördern. Ihre immunregulatorische Funktion wird dabei unter anderem durch die Sekretion des immunsuppressiven Zytokins IL-10 vermittelt. Regulatorische T-Zellen (Treg) werden zum einen bereits im Thymus generiert oder nach Antigenkontakt in der Peripherie induziert (Übersicht in [16]). Phänotypisch zeichnen sich regulatorische T-Zellen durch eine konstitutive Expression von CD25 (Alphakette des IL-2 Rezeptor) aus. Außerdem exprimieren sie den Mastertranskriptionsfaktor Foxp3, der den immunregulatorischen Phänotyp dieser Zellen kontrolliert. Im Gegensatz zu thymischen Tregs (tTregs) können in der Peripherie auch sogenannte periphere Tregs (pTregs) durch verschiedene Signale aus naiven TH -Zellen induziert werden. Diese Signale beinhalten die Stimulation mit Antigen in Anwesenheit von Zytokinen wie IL-10 und TGF-❜ und/oder Retinolsäure, oder die Aktivierung durch unreife dendritische Zellen. Außerdem sind IL-2/STAT5 Signale essentiell für das Überleben und die Funktion dieser Zellen (Übersicht in [17]). 1.3 Regulation von Immunantworten Die Stärke einer T-Zell-Antwort wird durch die Balance zwischen Antigen-vermittelter Aktivierung und regulatorischer Suppression bestimmt. Regulatorische Mechanismen können dabei auf die Initiierung, Aktivierung oder Effektor-Phase einer T-Zell-Antwort wirken und führen dazu, dass eine Immunantwort entweder gar nicht erst entsteht (Nicht-Reaktivität; Tole- Einleitung 13 ranz) oder wieder abgeschwächt wird (Kontraktion). Im Detail zielen regulatorische Kontrollmechanismen meist auf die APZ-T-Zell-Interaktion als treibendes Element der T-Zellantwort. So haben zum Beispiel die Art der APZ, die Art und Weise der Antigen-Präsentation, die Dosis des Antigens oder das Antigen selbst entscheidenden Einfluss auf die Ausbildung der TZellantwort. Auf der anderen Seite beeinflusst aber auch die Zytokinproduktion der T-Zellen als Antwort auf die T-Zellaktivierung die weitere APZ-T-Zell-Interaktion. So führt die Sekretion von immunsuppressiven Zytokinen zu einer effektiven Inhibierung der T-Zellaktivierung. Das wichtigste bisher bekannte immunregulatorische Zytokin ist IL-10. 1.3.1 Die immunsuppressive Funktion von IL-10 Die immunregulatorischen Funktion von IL-10 besteht vor allem darin, durch seine potenten immunsuppressive Eigenschaften, eine unerwünschte oder ungehemmte Aktivierung des Immunsystems zu unterdrücken. Somit schützt es unseren Körper vor der Ausbildung von Autoimmunität, Allergien oder Infektions-assoziierter Immunpathologie. Die immunsuppressive Funktion von IL-10 beruht vor allem auf der Inhibition von Makrophagen und Dendritischen Zellen, indem es die Sekretion von zahlreichen pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-12, IL-2, IFN-❣ und TNF-❛ sowie die Expression von MHC-II und kostimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86 reprimiert (Übersicht in [18]). Somit hemmt IL-10 indirekt die Differenzierung und Proliferation von T-Zellen durch die Suppression von Antigen-präsentierenden Zellen und kann hierdurch die Initiierung und Ausrichtung einer T-Zell-Antwort regulieren. Darüber hinaus kann IL-10 auch direkt auf T-Zellen wirken. So konnte bereits gezeigt werden, dass vor allem inflammatorische TH 17 Zellen in vivo den IL-10 Rezeptor exprimieren und direkt durch IL-10 in ihrer Proliferation gehemmt werden können [19]. Außerdem benötigen Foxp3+ regulatorische T-Zellen interessanterweise zunächst selbst IL-10-Rezeptor-Signale um IL-10 produzieren zu können [20]. 1.3.2 Die Rolle von IL-10-produzierenden T-Zellen Die Bedeutung von IL-10 für die Regulation von Immunantworten und die Aufrechterhaltung einer gesunden Immunhomöostase wurde vor ungefähr 20 Jahren mit der Einführung des ersten IL-10-defizienten Maus-Modells entdeckt [21, 22]. Demnach sind pathogen verstärkte Immunantworten mit oftmals exzessiver Gewebezerstörung ein charakteristischer Phänotyp dieser Mäuse. Außerdem entwickeln diese Mäuse spontane Entzündungen des Darmgewebes. Überraschenderweise ist diese intestinale Pathologie nicht unter keimfreien Bedingungen zu beobachten, was vermuten lässt, dass IL-10 vor allem die Interaktion unseres Immunsystems mit kommensalen Mikroben reguliert [23]. Interessanterweise konnten in weiteren Studien Mutationen im Il10, Il10RA oder Il10RB Gen auch im Menschen mit intestinaler Entzündung assoziiert werden (Übersicht in [24]). Einleitung 14 Heutzutage ist bekannt, dass IL-10 von fast allen Zellen des angeborenen wie adaptiven Teil des Immunsystems sekretiert werden kann, darunter Dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen, NK-Zellen, Eosinophile, Neutrophile, B-Zellen, CD8+ und CD4+ T-Zellen. Um selektiv die Rolle von IL-10-produzierenden T-Zellen näher zu untersuchen, wurden in der Folge Experimente mit T-Zell-spezifischen IL-10-defizienten Mäusen durchgeführt [25]. Interessanterweise entwickelten diese Mäuse einen ähnlichen dysregulierten Phänotyp wie komplette IL-10-defiziente Mäuse, was zeigte, dass CD4+ T-Zellen eine wichtige nicht-redundante IL-10-Quelle für die Aufrechterhaltung von peripherer Toleranz, also der Nicht-Reaktivität gegenüber Selbstantigenen, kommensalen Mikroorganismen oder harmlosen Substanzen, wie z.B. Nahrungsmittelbestandteilen oder ubiquitären Umweltantigenen, darstellen. 1.3.2.1 Foxp3-positive regulatorische T-Zellen Unter den CD4+ T-Zellen sind vor allem Foxp3+ regulatorische T-Zellen (tTregs, pTregs; siehe Abbildung 1.1) wichtig für die Eindämmung von Immunantworten und die Ausbildung von peripherer Toleranz. Funktionsverlustmutationen im Foxp3 Lokus resultieren in einer TregDefizienz und führen zu einer systemischen Immunpathologie in Maus und Mensch (Übersicht in [26]). Interessanterweise entwickeln Mäuse mit einer selektiven IL-10-Defizienz in Foxp3+ Zellen keine systemische Inflammation, spiegeln aber den intestinalen Entzündungsphänotyp von kompletten IL-10-defizienten Mäusen wieder [27]. Dies deutet darauf hin, dass die IL10 Sekretion von Foxp3+ Tregs besonders wichtig für die Regulation von Immunantworten in mukosalen Geweben ist. Umgekehrt bedeutet dies jedoch auch, dass Foxp3+ Tregs ihre suppressive Funktion auch über IL-10-unabhängige Mechanismen ausüben. 1.3.2.2 Foxp3-negative TH -Zellen IL-10-produzierende Effektor-TH -Zellen Zusätzlich zu regulatorischen Foxp3+ Tregs können auch Foxp3– TH -Zellen unter bestimmten Bedingungen IL-10 ausschütten, um ihre eigenen Effektorfunktionen selbst zu limitieren. Dieser Kontrollmechanismus hilft das Ausmaß einer Immunantwort zu begrenzen und zum Beispiel Kollateralschäden am Gewebe während einer Entzündung zu minimieren. Am besten ist diese Selbstregulation für TH 1-vermittelte Immunantworten beschrieben. So konnten immunsuppressive IFN-❣/IL-10 koproduzierende TH 1-Zellen vor allem im Rahmen von Infektionen in der Maus und im Menschen nachgewiesen werden [28, 29, 30, 31, 32]. Interessanterweise kann diese Selbstlimitierung die Effektivität einer TH 1-Antwort jedoch auch derart beeinträchtigen, dass eine komplette Eliminierung des Pathogens nicht mehr möglich ist, wie chronische Infektionen zeigen [29]. Neueste Studien belegen, dass die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen auch Schutz vor der Ausbildung von Autoimmunität bietet. So sind IL-10+ Einleitung 15 TH 1 Zellen maßgeblich an der Aufrechterhaltung von peripherer Toleranz beteiligt, da sie auch Immunantworten gegenüber Selbst-Antigenen unterdrücken [33]. Außerdem verlieren IL-10produzierende TH 1 Zellen ihr inflammatorisches Potential und lösen keine Autoimmunität mehr in murinen Transfermodellen für Multiple Sklerose (EAE) und Kolitis aus [34]. Auch im Menschen konnten Defekte in der IFN-❣/IL-10 Koproduktion bereits mit der Ausbildung von Multipler Sklerose, Rheumatoider Athritis und Lupus assoziiert werden [35, 36, 37]. Neben IL-10+ TH 1 Zellen schützt uns auch die IL-10 Produktion von TH 17 Zellen vor Autoimmunität. So konnten mehrere Studien zeigen, dass auch IL-10-produzierende TH 17 Zellen keine Autoimmunität mehr im Transfer EAE Modell übertragen und dass diese Zellen, wenn kotransferiert, sogar eine durch konventionelle TH 17 Zellen ausgelöste EAE in einer IL-10-abhängigen Art und Weise abschwächen können [38, 39]. Darüber hinaus konnte ebenfalls gezeigt werden, dass IL-10 auch während TH 2-vermittelten Immunantworten gegen zum Beispiel parasitäre Infektionen eine letale Immunreaktion verhindert [40]. Außerdem ist die IL-10 Produktion von TH 2 Zellen mit einer Inhibition der IL-4 und IL-13 Expression während allergischen Immunantworten assoziiert [41, 42]. Typ 1 regulatorische T-Zellen (TR 1 Zellen) Des Weiteren sind in der Literatur vor allem sogenannte TR 1 Zellen als Foxp3– IL-10produzierende TH -Zellen beschrieben. Diese Zellen produzieren vorrangig IL-10, was sie von konventionellen Effektor-TH -Zellen unterscheidet, die IL-10 begleitend zu ihren jeweiligen pro-inflammatorischen Effektorzytokinen ausschütten. Nichtsdestotrotz konnte bis heute kein identitätsstiftender Mastertranskriptionsfaktor für diesen Zelltyp identifiziert werden, sodass es fraglich ist, ob TR 1 Zellen wirklich eine eigenständige TH -Zell-Linie darstellen oder doch nur einen spezifischen Aktivierungs- oder Differenzierungszustand von Effektor-TH -Zellen in der Peripherie. Diese ungenaue Abgrenzung führt zu einer schwierigen Definitionssituation in der Literatur, da die Begriffe TR 1 Zelle oder IL-10-produzierende Effektor-TH -Zelle kaum noch zufriedenstellend unterschieden werden können. Ursprünglich wurde der Begriff TR 1 für suppressive Foxp3– IL-10-produzierende TH -Zellen verwendet, die in vitro durch wiederholte Stimulation von T-Zellen in Gegenwart von IL-10 selbst generiert wurden [43]. Neuere Studien zeigen, dass die Stimulation von naiven TH Zellen mit IL-27 in Kombination mit TGF-❜ ebenfalls zur Induktion eines TR 1-Phänotyps führt (siehe Abbildung 1.1 und [44, 45, 46]). Beim Menschen wurde die Generierung von TR 1 Zellen auch durch die Kostimulation des Komplementregulators CD46 beschrieben [47]. TR 1 Zellen wurden bisher mit der Unterdrückung von Selbst-Reaktivität und der Aufrechterhaltung von Transplantationstoleranz in Verbindung gebracht [43, 48, 49]. Außerdem ist bekannt, dass TR 1 Zellen bevorzugt im Rahmen von Infektionen gebildet werden, um die durch Effektor-TH -Zellen verursachte Infektions-assozierte Immunpathologie zu begren- Einleitung 16 zen [50, 51]. Nichtsdestotrotz induzieren viele Pathogene jedoch auch die Generierung von TR 1 Zellen um einer Eliminierung durch das Immunsystem zu entgehen [52, 53, 54]. 1.4 Regulation der IL-10 Expression 1.4.1 Konzepte der Genregulation Die Expressionsstärke eines bestimmten Gens ist nicht nur von Zelltyp zu Zelltyp verschieden, sondern muss sich auch zeitlich beziehungsweise situationsbedingt anpassen. Die Kontrolle der Genexpression kann dabei auf verschiedenen Ebenen stattfinden. So unterliegt die Transkription eines Gens vor allem einer Kontrolle durch Transkriptionsfaktoren und epigenetischen Modifizierungen. Aber auch nach der Transkription wird die entstandene mRNA beziehungsweise nach Translation das fertige Genprodukt von einer Vielzahl von posttranskriptionellen und posttranslationalen Regulationsmechanismen kontrolliert, die jedoch im Rahmen dieser Studie nicht betrachtet werden konnten. 1.4.1.1 Epigenetische Regulation Zunächst bestimmt der Zustands des Chromatins wie zugänglich ein Gen für die Transkription ist. Ist die genomische DNA eng um ihre Histone gewickelt, spricht man von einer geschlossenen Modifikation. In diesem Zustand ist eine Transkription nur sehr schwer möglich, da zum Beispiel Transkriptionsfaktoren kaum an die DNA binden können. Ist die Interaktion von DNA und Histonen jedoch weniger stark, erhöht sich die Zugänglichkeit bestimmter Genabschnitte. In diesem Fall spricht man von einer offenen oder aktiven Konformation des Chromatins. Die Öffnung oder Kompaktierung des Chromatins wird zum einen über biochemische Modifikationen der Histone oder der DNA selbst gesteuert. So führt zum Beispiel eine Acetylierung von Histonen zu einer Öffnung des Chromatins, da durch die Aufhebung der positiven Ladung an den Lysinresten der Histone die Interaktion mit der negativ geladenen DNA reduziert wird. Auf der anderen Seite kann die DNA selbst auch modifiziert werden. So führt eine Methylierung der DNA wiederum zu einer Verdichtung des Chromatins und somit auch zu einer Inhibition der Transkription. Diese Ebene der Genregulation, die unabhängig von der eigentlichen DNA-Sequenz (Genotyp) ist, wird auch als epigenetische Regulation oder Prägung bezeichnet. 1.4.1.2 Transkriptionelle Regulation Die Ebene der transkriptionellen Regulation umfasst den Einfluss und das vielschichtige Zusammenspiel von sogenannten Transkriptionsfaktoren. Diese regulatorischen Proteine können über definierte DNA-Bindungsdomänen ganz spezifische DNA-Sequenzen erkennen und daran binden. Die meisten Transkriptionsfaktoren binden an sogenannte Enhancer-Elemente Einleitung 17 im regulatorischen Promoterbereich eines Gens und aktivieren die Transkription indem sie Transkriptionsenzyme wie die RNA Polymerase II und andere Kofaktoren zum Zielgen rekrutieren (Aktivator). Manche Transkriptionsfaktoren können die Transkription jedoch auch inhibieren indem sie zum Beispiel das Binden von Aktivatoren blockieren (Repressor). Normalerweise bedarf es der Bindung und physischen Interaktion von mehreren verschiedenen Transkriptionsfaktoren um einen Transkriptions-Initiationskomplex zu bilden. Dabei können Transkriptionsfaktoren auch an entfernte DNA-Abschnitte eines Gens binden und über zum Beispiel die Ausbildung einer DNA-Schleife Einfluss auf die Transkriptions-Initiierung im Promoterbereich nehmen. Der Mechanismus der transkriptionellen Regulation ist die wichtigste und komplexeste Ebene der Genregulation, da für eine erfolgreiche Genregulation meist eine koordinierte Interaktion von vielen verschiedenen Transkriptionsfaktoren nötig ist. 1.4.1.3 Posttranskriptionelle Regulation Die Ebene der posttranskriptionellen Regulation bezeichnet die Kontrolle der mRNA Level eines Gens in der Zelle, also nach der Transkription und vor der Translation. Dies umfasst Regulationsmechanismen, die die mRNA Prozessierung, den Export der mRNA aus dem Zellkern, die zelluläre Lokalisation oder die mRNA-Stabilität beeinflussen. 1.4.1.4 Posttranslationale Regulation Nach der Translation unterliegen auch Proteine oftmals selbst einer Regulation. Durch vielfältige biochemische Modifizierungen wie zum Beispiel Ubiquitinierungen, Phosphorylierungen, Hydroxylierungen, Glykosylierungen oder proteolytische Spaltungen können Proteine in ihrer Aktivität oder Stabilität verändert werden. Diese Ebene wird als posttranslationale Regulation bezeichnet. 1.4.2 Struktur des Il10 Gen Lokus Das Il10 Gen besteht aus 5 Exons und 4 Introns gefolgt von einer untranslatierten 3’ Region (UTR) und umfasst insgesamt 5 kb. Die Struktur des humanen und murinen Il10 Promoters ist gleich und beinhaltet einige rudimentäre Aktivierungselemente wie eine TATA Box und eine CCAAT Box (CCAGT in der Maus). Insgesamt besteht eine sehr starke Homologie zwischen dem menschlichen und murinen Il10 Gen Lokus, die sich in einer Reihe von konservierten nicht-kodierenden Sequenzen (CNS) vor dem Il10 Gen manifestiert (siehe Abbildung 1.2). Es wird angenommen, dass die starke Konservierung dieser Regionen ein Indiz dafür ist, dass diese DNA-Abschnitte regulatorische Elemente beinhalten und daher eine wichtige regulatorische Rolle für die Transkription von IL-10 spielen. In der Tat konnten einige dieser Regionen schon als funktionale Enhancer für die IL-10 Expression in verschiedenen Zelltypen Einleitung 18 identifiziert werden. Besonders die CNS-9 Region scheint eine wichtige aktivierende Rolle für die IL-10 Expression in T-Zellen zu spielen [55, 56]. 1.4.3 Epigenetische Regulation von IL-10 in T-Zellen Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass die Expression von IL-10 unter anderem durch Änderungen in der Chromatinstruktur reguliert wird. Eine einfache Methode zur Detektion dieser Strukturveränderungen ist der DNAse I Verdau, bei dem zugängliche DNA Regionen über ihre Sensitivität gegenüber einer enzymatischen Spaltung mit DNAse I identifiziert werden. Diese offenen Genabschnitte werden DNAse I-Hypersensitivitätsstellen (HSS-Stelle) genannt und sind meist Indikatoren für regulatorische DNA-Regionen. Bisher konnten im murinen Il10 Lokus eine Vielzahl dieser HSS-Stellen identifiziert werden (Abb. 1.2). Interessanterweise häufen sich diese Stellen in der Nähe von CNS-Regionen, was ein weiteres Indiz für die potentielle regulatorische Funktion dieser Genabschnitte ist. Die meisten bisher beschriebenen HSS-Stellen sind gleichermaßen in TH 1 und TH 2 Zellen vorzufinden. Einige spezifische HSS-Stellen konnten jedoch nur in naiven T-Zellen (HSS-8.8), TH 2 Zellen (HSS+6.5) oder Makrophagen und Dendritischen Zellen (HSS-4.5) identifiziert werden. Anderen TH -ZellSubtypen wie TH 17 Zellen, TR 1 Zellen oder Foxp3+ regulatorische T-Zellen wurden bisher noch nicht mittels DNAse I Verdau untersucht. Auf der Ebene der Histonmodifikationen konnte bisher gezeigt werden, dass TH 2-Zellen eine deutlich stärkere Histon-Acetylierung des Il10 Lokus aufweisen als TH 1 Zellen, obwohl beide Zelltypen gemessen an der DNAse I-Hypersensitivität eine ähnliche zugängliche Chromatinstruktur aufweisen [57]. Diese epigenetische Prägung könnte ein Grund dafür sein, dass TH 2 Zellen im Vergleich zu TH 1 Zellen generell höhere Level an IL-10 exprimieren und ein IL-10 Gedächtnis ausbilden. In der Tat zeigen verschiedene Studien, dass der TH 2Mastertranskriptionsfaktor GATA3 maßgeblich die Ausbildung dieser Histonmodifizierungen in TH 2 Zellen vermittelt [57, 58]. Die Tatsache, dass GATA3 jedoch nur in TH 2 Zellen und nicht in anderen IL-10+ TH -Zellen exprimiert wird, zeigt allerdings auch, dass es noch andere, bisher unbekannte Faktoren und Mechanismen geben muss, die die Chromatinstruktur des Il10 Lokus regulieren. 1.4.4 Transkriptionelle Regulation von IL-10 in T-Zellen Die Induktion und Expression von IL-10 in verschiedenen TH -Zellen wird durch eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren gesteuert, die sich in einer hierarchischen Art und Weise gegenseitig beeinflussen. Zunächst werden durch die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors elementare Transkriptionsfaktoren wie NFAT, NF-❦B oder ERK induziert (Abb. 1.3). Besonders ERK konnte bereits als universeller positiver Regulator von IL-10 in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen identifiziert werden [59]. Ein wichtiger Faktor, der zum Beispiel durch ERK induziert wird, Einleitung 19 ist AP-1, der in TH 2 Zellen an die HSS+6.5 Region im Il10 Lokus bindet [56, 60]. BATF, ein anderen Faktor der AP-1-Familie, hingegen bindet in TH 2 und TH 17 Zellen zusammen mit IRF4 an die CNS-9 Region [61]. Außerdem konnte gezeigt werden, dass IRF4 auch in Foxp3+ Tregs an die CNS-9 und zusätzlich an die CNS+0.92 Region bindet [62]. Eine Übersicht liefert Abbildung 1.2. Nichtsdestotrotz regulieren diese grundlegenden Transkriptionsfaktoren meist nicht nur die Expression von IL-10 sondern auch viele andere Gene. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass BATF und IRF4 in TH 2 Zellen nicht nur die Expression von IL-10 sondern auch die Expression des Signaturzytokins IL-4 regulieren, was auf eine übergeordnete Funktion dieser Faktoren für die T-Zell-Aktivierung und -Differenzierung hindeutet [63]. Abb. 1.2: Die Struktur des Il10 Gen Lokus. Die Sequenzhomologie des murinen versus humanen Il10 Gen Lokus ist als rVista Darstellung aufgetragen (ca. -20kb bis +6.5kb relative Entfernung zur Il10 Transkriptionsstartstelle (TSS)). Pfeile über dem Sequenzvergleich markieren HSS-Stellen und Zelltypen in denen sie detektiert wurden (naive T-Zellen, TH 1 Zellen, TH 2 Zellen, Makrophagen und DC). Rote Peaks und Pfeile unter dem Sequenzvergleich zeigen CNS-Stellen (beides benannt nach ihrer relativen Entfernung von der Il10 TSS in kb). Außerdem sind die Bindungstellen von IL-10-regulierenden Transkriptionsfaktoren dargestellt und die Zellytpen in denen sie aktiv sind (gezeigt durch die verschiedenen Farben der Umrandungen). Zusätzlich ist der proximale Promoterbereich herausgestellt, der weitere Transkriptionsfaktorbindungstellen und- motive und elementare Promoterelemente wie die TATA Box zeigt. Adaptiert von [64]. Neben diesen universellen T-Zell-Rezeptor-induzierten Faktoren bedarf eine robuste IL-10 Produktion jedoch weiterer aktivierender Transkriptionsfaktoren, die durch spezifische Zytokinsignale induziert werden. Die ersten Überträger von Zytokinsignalen sind spezifische STAT und SMAD Proteine, die nach Zytokin-Zytokinrezeptor Interaktion intrazellulär akti- Einleitung 20 viert werden. So konnte bereits gezeigt werden, dass die Expression von IL-10 in verschiedenen TH -Zellen maßgeblich von den jeweiligen Differenzierungs-induzierenden Zytokinen und ihren spezifischen STATs und SMADs abhängt (Übersicht in [64]). Auch eine direkt Bindung von verschiedenen STATs an den Il10 Lokus konnte bereits nachgewiesen werden. Die Aktivierung von verschiedenen STAT und SMAD Proteinen führt jedoch nicht nur zu einer direkten Einflussnahme auf Il10 sondern induziert zusätzlich weitere spezifische IL-10-regulierende Transkriptionsfaktoren. So ist zum Beispiel die IL-10 Expression in TH 2 Zellen zum einen abhängig von IL-4-induziertem STAT6, welches selbst an den Il10 Lokus bindet, und zum anderen von STAT6-induziertem GATA3 [57, 58, 59, 65]. In TH 17 Zellen und TR 1 Zellen hingegen aktivieren die Zytokine IL-6 bzw. IL-27 und TGF-❜ über STAT3 und SMAD Proteine die IL-10-regulierenden Transkriptionsfaktoren c-Maf und AHR [39, 66, 67, 68]. Außerdem ist bekannt, dass IL-2/STAT5 den Transkriptionsfaktor Blimp-1 induziert, der die IL-10 Produktion von Foxp3+ Tregs reguliert [62]. Abbildung 1.3 zeigt eine Übersicht der bisher bekannten IL-10-induzierenden Signale und Transkriptionsfaktoren in verschiedenen TH -Zellen. Abb. 1.3: IL-10-induzierende Signale und Transkriptionsfaktoren in murinen TH -Zellen. Die Expression von IL-10 in TH -Zellen wird durch Signale des T-Zell-Rezeptors und kostimulatorischen Molekülen wie CD28 initiiert und umfasst unter anderem den MAP Kinase ERK, den CalcineurinNFAT und den NF-❦B Signalweg. Außerdem wird die Induktion von IL-10 durch Zytokinsignale via STAT und SMAD Proteine reguliert, die gleichzeitig die Differenzierung von naiven TH -Zellen zu verschieden TH -Zell-Subpopulationen steuern. Downstream von diesen Signalen werden weitere spezifische IL-10-regulierende Transkriptionsfaktoren induziert. Zusätzlich führt auch die Aktivierung des Notch-Signalwegs zur einer Induktion der IL-10 Expression in TH -Zellen. Adaptiert von [64]. Wie in diesem Schema gut erkenntlich, hinterlässt die aktuelle Literatur zu diesem Thema jedoch einige wichtige offene Fragen. So ist zum Beispiel die transkriptionelle Regulation von IL-10 vor allem in pro-inflammatorischen TH 1 Zellen, also downstream von IL-12 oder IL-27, unvollständig untersucht. Es konnte bisher lediglich gezeigt werden, dass eine star- Einleitung 21 ke T-Zell-Rezeptor-Stimulation und IL-12/STAT4-Signale essentiell für die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen sind [59]. Andere TH 1-assoziierte IL-10-Regulatoren konnten aber bisher nicht identifiziert werden. Der einzige Hinweis auf die Beteiligung zusätzlicher Transkriptionsfaktoren kommt von einer Studie, die zeigt, dass der Transkriptionsfaktor c-Maf neben IL-10+ TH 17 Zellen auch in IL-10-produzierenden gegenüber nicht-produzierenden TH 1 und TH 2 Zellen überexprimiert ist, wobei jedoch ein funktioneller Nachweis für eine regulatorische Rolle von c-Maf für die Expression von IL-10 in diesen Zellen bislang fehlt [59]. Zusammenfassend lässt sich also festhalten, dass die transkriptionelle Regulation von IL-10 eng mit der TH -Zell-Differenzierung verknüpft ist, da sie durch die gleichen Signale kontrolliert wird. Nichtsdestotrotz sind die kritischen transkriptionellen IL-10-Regulatoren, die durch diese unterschiedlichen Differenzierungssignale letztendlich auf molekularer Ebene induziert werden und die IL-10 Expression steuern, noch unvollständig identifiziert. Außerdem stellt sich die Frage, ob die Expression von IL-10 in funktionell verschiedenen TH -Zellen von unterschiedlichen transkriptionellen Netzwerken reguliert wird oder ob es TH -Zell-unabhängige IL-10-Regulatoren gibt, die durch variable IL-10-aktivierende Signale induziert werden können (c-Maf?). 1.5 Der Notch-Signalweg Der Notch-Signalweg ist ein weit verbreiteter und evolutionär stark konservierter Signaltransduktionsweg, der an der Regulation einer Vielzahl von Zelldifferenzierungsprozessen in der Embryonalentwicklung wie auch im adulten Stadium beteiligt ist. Die vier Notch-Rezeptoren (Notch-1, -2, -3, und -4) interagieren mit Liganden, die entweder zur Jagged-Familie (Jagged1 und -2) oder zur Delta-like (Dll)-Familie gehören. Durch diese Diversität weist der NotchSignalweg ein hohes Maß an Redundanz auf, da alle Rezeptoren und Liganden untereinander bindungsfähig sind. Funktionell kann die Interaktion spezifischer Ligand-Rezeptor-Paare jedoch nur zum Teil kompensiert werden, da sich die Expression einzelner Liganden und Rezeptoren in verschiedenen Geweben unterscheidet. Funktionell stellt der Notch-Signalweg ein Mittel der Kommunikation benachbarter Zellen während des Zell-Zell-Kontakts dar. Dabei ist Notch nicht nur ein Transmembranrezeptor, sondern auch ein membrangebundener Transkriptionsfaktor. Die Notch-Signalkaskade beginnt mit der Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors, was in der Folge zu einer sequentiellen proteolytischen Spaltung durch die Protease ADAM und den y-Sekretasekomplex innerhalb der transmebranären Region und zur Freisetzung der intrazellulären Domäne führt (NIZD). Diese transloziert anschließend in den Zellkern, wo sie mit den DNA-bindenden CSL-Proteinen interagiert und die Transkription verschiedener Zielgene aktiviert. In der Abwesenheit von NIZD agieren die CSL-Proteine als transkriptionelle Repressoren, da sie mit verschiedenen Korepressoren einen Repressorkomplex bilden. NIZD Einleitung 22 wirkt dieser Bindung entgegen und verdrängt die Ko-Repressoren aus dem Komplex, sodass ein Transkriptionsaktivatorkomplex entsteht, dessen genaue Komposition noch nicht geklärt ist (Übersicht in [69, 70]. Abb. 1.4 zeigt eine schematische Darstellung der Ereignisse während der Notch-Signaltransduktion. Abb. 1.4: Der Notch Signalweg. Nach der Bindung des Notch-Liganden an den Notch-Rezeptor und der Spaltung der NIZD durch eine ADAM Metalloprotease sowie den y-Sekretasekomplex, transloziert die NIZD in den Nukleus. Dort bindet sie zusammen mit Koaktivatoren (CoA) an den Transkriptionsfaktor CSL/RBPj❦ und initiiert die Transkription verschiedener Zielgene. 1.5.1 Die Rolle des Notch-Signalwegs für die IL-10 Produktion von T-Zellen Arbeiten aus der eigenen Arbeitsgruppe haben in den letzten Jahren verdeutlicht, dass der Notch-Signalweg ebenfalls ein sehr potenter Induktor von IL-10 in TH -Zellen ist (Abb. 1.3 und [71]). Dieser Effekt wurde vor allem für TH 1 Zellen untersucht, obwohl Notch auch die IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen steigert. Im Rahmen dieser Studien konnte gezeigt werden, dass Notch-modifizierte TH 1 Zellen ihr pro-inflammatorisches Potential in vivo verlieren und in einem Modell einer akuten Entzündung suppressiv wirken. Dies zeigt, dass Notch spezifisch die IL-10-vermittelten Selbstregulationsfähigkeiten von pro-inflammatorische TH 1 Zellen induziert. Im Hinblick auf die unterschiedlichen Funktionen von verschiedenen Notch-Liganden, konnte gezeigt werden, dass die Liganden der Delta-like Familie, speziell Dll4, maßgeblich für die IL-10 Induktion in TH -Zellen verantwortlich sind. In weiterführenden Experimenten konnten vor allem plasmazytoide dendritische Zellen und Endothelzellen der Leber als spezifische Dll4-exprimierende APZ in vivo identifiziert werden [72, 73]. Die molekularen Mechanismen, die dieser Notch-vermittelten IL-10 Induktion in TH -Zellen zugrunde liegen, sind jedoch weitestgehend unbekannt. Es konnte bisher nur gezeigt werden, dass die Notch-vermittelte IL-10 Induktion sowohl in sich entwickelnden, als auch in bereits etablierten TH 1 Zellen möglich ist und eine Aktivierung von STAT4 durch die TH 1- Einleitung 23 induzierenden Zytokine IL-12 oder IL-27 benötigt. Ob Notch die Expression von IL-10 jedoch auch direkt, über die Bindung der intrazellulären Domäne an den Il10 Lokus, oder indirekt über die Modulation anderer IL-10-Regulatoren steuert, ist bisher nicht analysiert worden. Daher ist eine weitere Untersuchung der transkriptionellen Regulation von IL-10 downstream des Notch-Signalwegs essentiell, um die molekulare Regulation von IL-10 besser zu verstehen. 2 Zielsetzung Zielsetzung 25 Die Sekretion des immunsuppressiven Zytokins IL-10 durch TH -Zellen ist ein essentieller Schutzmechanismus um eine unerwünschte oder ungehemmte Aktivierung des Immunsystems zu verhindern und unseren Körper somit vor der Ausbildung von Autoimmunität, Allergien oder Infektions-assoziierter Immunpathologie zu bewahren. Verschiedene Typen von TH -Zellen steuern abhängig von der Art des Pathogens durch ihr jeweiliges spezifisches Zytokinprofil die Entstehung und den Charakter einer Immunreaktion. Obwohl naive TH -Zellen hierzu in äußerst unterschiedliche Effektorzelltypen, wie TH 1, TH 2 oder TH 17 Zellen, oder regulatorische Subpopulationen ausdifferenzieren, ist die Fähigkeit zur Sekretion von IL-10 ein gemeinsames Merkmal all dieser Zelltypen. Während Effektor-TH Zellen sich über die Koexpression von IL-10 selbst in ihrer pro-inflammatorischen Wirkung limitieren können, ist die IL-10 Produktion für regulatorische T-Zelltypen ein identitätsstiftender Wirkungsmechanismus zur effektiven Immunsuppression. Obwohl die notwendigen externen Stimuli, die eine Induktion von IL-10 in verschiedenen TH -Zellen bewirken, umfangreich beschrieben sind, sind die korrespondierenden transkriptionellen Regulationsmechanismen noch unvollständig untersucht. Das fehlende Wissen in diesem Bereich erschwert unter anderem bisher die Entwicklung gezielter Behandlungsstrategien, die auf die Modulation der anti-inflammatorischen Kapazitäten von TH -Zellen abzielen. Aus diesem Grund stellt sich also die wichtige Frage, welche regulatorischen Elemente die IL-10 Expression in funktionell verschiedenen TH -Zellen kontrollieren. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die transkriptionelle Regulation der IL-10 Expression in verschiedenen inflammatorischen und regulatorischen TH -Zellen näher untersucht werden. Der Hauptfokus der Arbeit lag dabei zunächst auf der Untersuchung von IL-10produzierenden TH 1 Zellen, da es für für diesen Zelltyp bisher kaum Erkenntnisse zur molekularen Regulation von IL-10 gibt. Ausgehend von einem Vergleich der Genexpressionsprofile von IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen, sollten IL-10-assoziierte Transkriptionsfaktoren identifiziert und danach mechanistisch untersucht werden. Anschließend sollte die funktionelle Rolle dieser Faktoren auch in anderen TH -Zell-Subtypen untersucht werden, um letztlich besser zu verstehen wie die Expression von IL-10 in unterschiedlichen TH -Zellen reguliert wird. 3 Material und Methoden Material und Methoden 27 3.1 Medien und Puffer Tab. 3.1: Medien und Puffer Gibco RPMI 1640 Medium 10 % FCS Sigma 100 U/ml Penicillin PAA 100 g/ml Streptomycin PAA 50 ♠M 2-Mercaptoethanol Invitrogen Gibco DMEM Medium 10 % FCS Sigma 100 U/ml Penicillin PAA 100 g/ml Streptomycin PAA 50 ♠M 2-Mercaptoethanol Invitrogen 0,01 M KHCO3 Merck 0,0155 M NH4 Cl Merck 0,1 mM EDTA Promega 137 mM NaCl Merck 2,7 mM KCl Merck 1,5 mM KH2 PO4 Merck 8,0 mM Na2 HPO4 x 2 H2 O Merck bovine serum albumine Sigma Tween20 Sigma EL Puffer steril filtriert, pH 7,5 PBS, pH 7,2 PBS/BSA, pH 7,2 PBS 0,5 % (w/v) PBS/0,1 % Tween20 1 ml ad 1 l PBS Material und Methoden 28 Trenngelpuffer, pH 8,8 (1,5 M Tris-HCl) 27,23 g Tris Sigma ad 150 ml H2 0 Sammelgelpuffer, pH 6,8 (0,5 M Tris-HCl) 6g Tris Roth 30,3 g Tris Roth 144 g Glycin Sigma 10 g SDS Sigma ad 100 ml H2 0 Laufpuffer (10x) ad 1 l H2 0 Blotting Puffer (10x) pH 8,1-8,4 19,3 g Tris Roth 90 g Glycin Sigma ad 1 l H2 0 Blotting Puffer (1x) 100 ml 10x Blotting Puffer 200 ml Methanol Sigma Ammoniumpersulfat Roth 1% SDS Sigma 10 mM EDTA Promega 50 mM Tris Roth ad 1 l H2 0 APS 0,1 g ad 1 ml H2 0 SDS-Lysepuffer, pH 8,1 Material und Methoden 29 ChIP Dilution Puffer, pH 8,1 0,01 % SDS 1,1 % TritonX-100 Sigma 1,2 mM EDTA Promega 16,7 mM Tris Roth 167 mM NaCl Roth Sigma Low Salt Waschpuffer, pH 8,1 0,1 % SDS 1,1 % TritonX-100 Sigma 2 mM EDTA Promega 20 mM Tris Roth 150 mM NaCl Roth Sigma High Salt Waschpuffer, pH 8,1 0,1 % SDS 1,1 % TritonX-100 Sigma 2 mM EDTA Promega 20 mM Tris Roth 500 mM NaCl Roth Sigma LiCl Waschpuffer, pH 8,1 0,25 M LiCl Sigma 1% IGEPAL Sigma 1% Na deoxycholat Sigma 1 mM EDTA Promega 10 mM Tris Roth TE Puffer, pH 8,0 1 mM EDTA Promega 10 mM Tris Roth ChIP Elution Puffer, pH 8,0 1% SDS Sigma 0,1 M NaHCO3 Roth Material und Methoden 30 2xHBS Puffer 50 mM HEPES pH 7,05 Merck 10 mM KCl Merck 12 mM Dextrose Merck 280 mM NaCl Merck 1,5 mM Na2 HPO4 Merck pH einstellen auf 7,05 3.2 Antikörper Tab. 3.2: Antikörper Spezifität Klon Fluorochrom Quelle Blockade von Zytokinen IL-4 11B11 - DRFZ IFN-❣ AN18.17.23 - DRFZ IL-2 S4B4 - DRFZ Fluoreszenzmarkierung zum durchflusszytomtrischen Nachweis CD4 RM4-5 PacBlue BD IL-10 JES5-16E3 PE eBiosciene IFN-❣ XMG1.2 PE-Cy7 BD CD154 MR1 APC Miltenyi Biotec CD45RB 16A PE BD Foxp3 3G3 APC Miltenyi Biotec Chromatin-Immunopräzipitation Dimethyl-Histon H3 (Lys4) Polyklonal - Millipore Trimethyl-Histon H3 (Lys27) Polyklonal - Millipore STAT4 (C-20) Polyklonal - Santa Cruz Blimp-1 Polyklonal - Genescript c-Maf (M-153) Polyklonal - Santa Cruz Immuno-Blot Blimp-1 6D3 - eBioscience c-Maf (M-153) Polyklonal - Santa Cruz ß-Actin C4 - Santa Cruz Material und Methoden 31 3.3 Rekombinante Zytokine Tab. 3.3: Rekombinante Zytokine Zytokin Konzentration Quelle rmIL-2 10 ng/ml R&D Systems rmIL-12 10 ng/ml R&D Systems rmIL-4 10 ng/ml R&D Systems rmIL-6 20 ng/ml R&D Systems rmIL-23 10 ng/ml R&D Systems rmIL-1-❜ 10 ng/ml R&D Systems rhTGF-❜ 2 ng/ml R&D Systems rmIL-27 25 ng/ml R&D Systems 3.4 Plasmide Die Generierung der pMY-IRES-GFP, pMY-N3ICD-IRES-GFP, pCGP und pEco Plasmide für die retrovirale Überexpression wurden ebenso wie die Herstellung der IL-10 Reporter Plasmide CNS-9-pXPG und CNS-4.5-pXPG bereits beschrieben [71, 74]. Die Prdm1 -cDNA wurde freundlicherweise von Dr. N. Prado (Stanford University, Stanford) bereitgestellt und in das pMY-IRES-GFP Plasmid kloniert (siehe Tab. 3.4). Tab. 3.4: Plasmide Konstrukt Quelle pMY-IRES-GFP Dr. K. Hozumi pMY-N3ICD-IRES-GFP Dr. K. Hozumi pMY-Prdm1-IRES-GFP - pMCSV-Maf-IRES-GFP Genentech pCGP Dr. K. Murphy pEco Dr. K. Murphy CNS-9-pXPG Dr. Sin-Hyeog Im CNS-4.5-pXPG Dr. Sin-Hyeog Im pRL-TK Promega Material und Methoden 32 3.5 Mäuse Tab. 3.5: Mäuse Bezeichnung Phänotyp Quelle C57BL/6 Wildtyp (WT) Jackson Lab RAG-/- B-und T-Zell-Defizienz eigene Zucht STAT4-/- defizient für STAT4 Dr. Thiel B6(Cg)-Il10tm1.1Karp/J IL-10:GFP Reporter Dr. Hauser CD4cre Cre-Rekombinase unter dem CD4 Promoter Dr. Kruglov Prdm1 flox/flox Prdm1 Gen von loxP Stellen flankiert Dr. Calame Maf flox/flox Maf Gen von loxP Stellen flankiert Dr. Birchmaier CD4cre x Prdm1 flox/flox T-Zell-spezifische Defizienz für Blimp-1 eigene Zucht CD4cre x Prdm1 wt/wt WT Zuchtgeschwister eigene Zucht T-Zell-spezifische Defizienz für c-Maf eigene Zucht WT Zuchtgeschwister eigene Zucht CD4cre x Maf flox/flox CD4wt x Maf flox/flox 3.6 T-Zell-Isolierung, -Aktivierung und -Differenzierung 3.6.1 Anreicherung naiver CD4+ TH -Zellen Naive T cell isolation kit Miltenyi Biotec Zur Isolierung von naiven TH -Zellen wurden aus Mäusen, die durch zervikale Dislokation getötet wurden, Milz und periphere Lymphknoten entnommen und hiervon Einzellsuspensionen in PBS/BSA hergestellt. Nach Abzentrifugieren der Zellen (300x g, 4◦ C, 10min) wurden die enthaltenen Erythrozyten mit Erythrozyten-Lysepuffer (EL Puffer) lysiert und anschließend die naiven CD4+ TH -Zellen mit Hilfe des Naive T cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) angereichert. 3.6.2 T-Zell-Stimulation T cell activation/expansion kit Miltenyi Biotec Für die polyklonale Stimulation mit ❛-CD3/❛-CD28 Antikörpern wurde das T Cell Activation/Expansion Kit (Miltenyi Biotec) verwendet. Im Detail wurden 0,25 x 106 naive TH -Zellen mit 0,75 x 106 MACSi Beads, die zuvor mit ❛-CD3 und und ❛-CD28 Antikörpern beladen wurden, in einem 96 well in 250 ♠l RPMI 1640 Medium kokultiviert. Material und Methoden 33 3.6.3 T-Zell-Differenzierung Die TH 0, TH 1, TH 2, TH 17 oder TR 1-spezifische Stimulation erfolgte wie bereits beschrieben mittels ❛-CD3/❛-CD28-beladenen MACSi Beads unter gleichzeitigem Zusatz differenzierungsbestimmender Zytokine und zytokinblockierender Antikörper (siehe Tab. 3.6). Tab. 3.6: Polarisierende TH -Zell-Kulturbedingungen Th0 TH 1 TH 2 TH 17 TR 1 10 ng/ml rIL-2 10 ng/ml rIL-12 10 ng/ml rIL-4 20 ng/ml IL-6 25 ng/ml IL-27 10 ♠g/ml ❛-IFN-❣ 10 ng/ml rIL-2 10 ng/ml rIL-2 10 ng/ml IL-23 2 ng/ml TGF-❜ 10 ♠g/ml ❛-IL-4 10 ♠g/ml ❛-IL-4 10 ♠g/ml ❛-IFN-❣ 10 ng/ml IL-1-❜ 2 ng/ml TGF-❜ 10 ♠g/ml ❛-IFN-❣ 10 ♠g/ml ❛-IL-4 10 ♠g/ml ❛-IL-2 3.7 IL-10 Sekretionsassay PMA Sigma Ionomyzin Sigma IL-10 Secretion Assay Kit Miltenyi Biotec TH 1 Zellen wurden an Tag 5 der in vitro Kultur für 3 h mit PMA (10 ng/ml) und Ionomyzin (1 ♠g/ml) restimuliert. Danach wurden die Zellen gewaschen, um alle bis dahin sekretierten Zytokine zu entfernen, und anschließend mit der Affinitätsmatrix (IL-10 Catch Reagent) markiert. Nach einer erneuten Sekretionsphase von 45 min bei 37◦ C wurden die Zellen erneut gewaschen und mit dem IL-10 Detektionsantikörper gefärbt. Abschließend wurden IL10-sekretierende und nicht-sekretierende Zellen durchflusszytometrisch separiert. Um sicherzugehen, dass die sortierten Fraktionen wirklich IL-10 Produzenten und nicht-Produzenten repräsentierten, wurde in einem Teil der sortierten Populationen in An- oder Abwesenheit des Zellpermeablisators Saponin IL-10 intrazellulär gegengefärbt. 3.8 Transkriptomanalyse Zur Analyse des globalen Genexpressionsprofils von IL-10-sekretierenden und nicht-sekretierenden TH 1 Zellen wurden Affymetrix Maus Genom 430 2.0 Arrays verwendet. Die RNA wurde mit dem Gene Chip 3‘ IVT Express Kit isoliert und für die Hybrisisierung auf dem Chip präpariert. Anschließend wurden die Chip-Signale mit dem GeneChip Scanner 3000 Material und Methoden 34 7G System und der GeneChip Operating Software (GCOS) v1.1.1. (Affymetrix) ausgelesen. Nur Transkripte, die > 2x in IL-10-sekretierenden gegenüber nicht-sekretierenden TH 1 Zellen überexpremiert waren (p-value < 0,05), wurden in die Analyse mit der AmiGO web interface [75] einbezogen. Um IL-10-assoziierte Transkriptionsfaktoren zu identifizieren wurden anschließend Transkripte, die mit dem GO:Term "transcription and/or their involvement in the biological process of positiv regulation of gene expression“ (GO:0010628) verknüpft sind, aussortiert und analysiert. 3.9 Intrazelluläre Zytokinfärbung Brefeldin A Sigma LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen PFA Sigma Saponin Sigma Foxp3 Staining Buffer Set Miltenyi Biotec In vitro differenzierte oder ex vivo isolierte TH -Zellen wurden mit PMA/Ionomyzin in RPMI 1640 Medium in einer Konzentration von maximal 3x106 Zellen/ml für 5 h im Brutschrank inkubiert. Nach 1 h wurde der Sekretionshemmer Brefeldin A (5 ♠g/ml) zugegeben. Anschließend wurden tote Zellen mit Hilfe des LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit markiert. Danach wurden die Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in 2% PFA fixiert. Die intrazelluläre Zytokinfärbung erforderte eine Permeabilisierung der Zellmembran. Hierfür wurden die fixierten TH -Zellen zusammen mit der Antikörper-Färbelösung (Mix aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern für Zelloberflächen- und intrazelluläre Antigene) in 0,5 % Saponin Lösung für 20 min bei 4◦ C inkubiert. In einigen Fällen wurde die intrazelluläre Zytokinfärbung mit einer intranukleären Transkriptionsfaktorfärbung kombiniert. Hierfür wurde anschließend an die intrazelluläre Zytokinfärbung das Foxp3 Staining Buffer Set verwendet. 3.10 ELISA Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go! (2nd Generation) eBioscience Mouse IFN gamma ELISA Ready-SET-Go! eBioscience Mouse TNF alpha ELISA Ready-SET-Go! eBioscience Mouse IL-12p70 ELISA Ready-SET-Go! eBioscience Material und Methoden 35 Die Expression von IL-10, IFN-❣, TNF-❛ und IL-12p70 wurden mittel ELISA im Serum oder im Kulturüberstand analysiert. Hierzu wurden ELISA Assays von eBioscience entsprechend des Herstellerprotokolls verwendet. 3.11 Retrovirale Transduktion Polybren Sigma Retrovirale Virusüberstände wurden durch die Transfektion der HEK293T-Zelllinie nach der Ca2 PO4 -Methode generiert. HEK293T-Zellen wurden in DMEM Medium kultiviert. Je nach Konfluenz wurden die Zellen alle zwei bis drei Tage im Verhältnis 1:10 umgesetzt. Für die retrovirale Transduktion wurden TH -Zellen 24 h nach der Stimulation infiziert. Hierzu wurde der Kulturüberstand größtenteils abgenommen und aufbewahrt. Dem Virusüberstand wurde Polybren (8 ♠g/ml) zugesetzt und der Überstand auf die Zellen gegeben (500 ♠l für 48 well). Es folgte eine Zentrifugation bei 700x g für 75 min bei 32◦ C. Anschließend wurde der Virusüberstand wieder abgenommen und durch den aufbewahrten Kulturüberstand ersetzt. 3.12 mRNA Expressionsanalyse 3.12.1 Reverse Transkription RNeasy Plus Mini Kit Qiagen TaqMan Reverse Transcription Kit Applied Biosystems Die mRNA für die quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) Analysen wurde mit dem RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) extrahiert. Im Detail wurden zunächst die Zellen mit 350 ♠L RLT Plus Lysepuffer lysiert. Die Zellsuspension wurde anschließend zur Homogenisierung auf QiaShredder-Säulen gegeben und für 15 Sekunden bei 17.000 g zentrifugiert. Im Folgenden wurde gemäß Protokoll vorgegangen (RNeasy Plus Mini Kit Quick-Start Protocol). Die RNA wurde abschließend von der Säule mit 30 ♠L RNAse-freiem Wasser eluiert. Anschließend wurde die aufgereinigte mRNA mittels TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) in cDNA transkribiert (siehe Tab. 3.7 und 3.8). Material und Methoden 36 Tab. 3.7: Reverse Transkription Tab. 3.8: PCR-Programm Ansatz: 20 ♠L Reverse Transkription PCR-Programm 2 ♠l TaqMan 10× Reaktionspuffer 10 min 25◦ C 4,4 ♠l MgCl2 (25 mM) 40 min 48◦ C 4 ♠l dNTPs 5 min 95◦ C 0,5 ♠l Random Hexamers Pause 4◦ C 0,5 ♠l Oligo(dT)16 0,4 ♠l RNAse Inhibitor 0,5 ♠l Reverse Transkriptase 7,7 ♠l mRNA Extrakt 3.12.2 Quantitative Real-Time-PCR LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Kit Roche LightCycler 20 ♠L Kapillaren Roche Die quantitative Real-Time-PCR wurde mit einem Roche LightCycler und dem LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Kit durchgeführt. Tab. 3.9: PCR-Ansatz Lightcycler Ansatz: 6 ♠L PCR (Beispiel für 2 mM MgCl2 ) 0,6 ♠l Reaktionsmix (10 ♠l 1A in 1B) 0,3 ♠l Forward-Primer 0,3 ♠l Reverse Primer 0,48 ♠l MgCl2 3 ♠l cDNA 1,32 ♠l RNAse freies H2 0 (PCR grade) Die biologischen Einzelwerte wurden als Doppelwerte vermessen. Um mehrere Proben miteinander vergleichen zu können, wurde die mRNA Expression einer untersuchten Probe in Relation zur mRNA Expression des konstitutiv exprimierten Haushaltsgens UBC gesetzt. Die relative Expression zu UBC wurde mit der folgenden Formel berechnet. relative Expression = 2 CT (UBC) – CT (Analyseparameter) Der CT -Wert ist als diejenige Anzahl von PCR-Zyklen definiert, nach denen das SYBRGreen Signal der untersuchten Probe einen festgelegten Schwellwert überschreitet. Material und Methoden 37 Tab. 3.10: PCR-Programm Lightcycler RT-PCR-Programm Denaturierung 95◦ C; 9 min; 20◦ C/s 1 Zyklus Amplifikation 95◦ C; 15 s; 20◦ C/s 65◦ C; 15 s; 20◦ C/s 72◦ C; 15 s; 20◦ C/s, einzelne Messung 45 Zyklen Schmelzkurve 95◦ C; 10 s; 20◦ C/s 65◦ C; 20 s; 20◦ C/s 95◦ C; 0 s; 0,1◦ C/s, kontinuierliche Messung 1 Zyklus Abkühlen 40◦ C; 30 s; 20◦ C/s 3.12.3 qRT-PCR Primer und Bedingungen Tab. 3.11: qRT-PCR Primer und Bedingungen Primer Sequenz (5’→3’) MgCl2 (mM) T [◦ C] IL-10 F: ATCGATTTCTCCCCTGTGAA 5 mM 60◦ C 1 mM 60◦ C 4 mM 65◦ C 2 mM 65◦ C 4 mM 60◦ C R: TTCGGAGAGAGGTACAAACGA Blimp-1 F: GACGGGGGTACTTCTGTTCA R: GGCATTCTTGGGAACTGTGT c-Maf F: GCATGCTGGACATGTATGGT R: ATGTACAACGGGAGGCTGAA Evi-1 F: GGCAACCAGGACTGTAAGGA R: GAGATCGAATGTGTCGCTGA UBC F: AGCCCAGTGTTACCACCAAG R: TCACACCCAAGAACAAGCAC Material und Methoden 38 3.13 Immuno-Blot Lämmlipuffer Bio Rad Mini-Gel Twin Biometra Mini Trans-Blot Cell Bio Rad Nitrocellulose Transfer Membrane Whatman Chromatography Paper Whatman Blocking Buffer LI-COR Für die Proteinanalyse via Immuno-Blot wurden etwa 1x106 T-Zellen in 20-40 ♠l Lämmlipuffer lysiert. Anschließend wurde die Proben sonifiziert und bei 95◦ C für 5 min in einem Heizblock erhitzt. Danach wurden die Proteinextrakte mit Hilfe eines 10 % SDS-PAGE Gels in Laufpuffer aufgetrennt (Mini-Gel Twin, siehe Tab. 3.12 und 3.13) und anschließend mit Hilfe des Nassverfahrens (Mini Trans-Blot Cell) in Blotting Puffer auf eine Nitrocellulose Membran übertragen. Nach dem Blocken mit Blocking Buffer (LI-COR) wurde die Membran mit den Primärantikörpern über Nacht bei 4◦ C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran mit Waschpuffer (PBS/0,1% Tween20) gewaschen und abschließend mit den entsprechenden IRDye Sekundärantikörpern inkubiert. Die finale Detektion wurde an einem Odyssey Infrared Imager (LI-COR) durchgeführt. Tab. 3.12: SDS-PAGE Trenngel 10 % Trenngel 10 % Tab. 3.13: SDS-Page Sammelgel Sammelgel 5,7 ml Aqua Dest. 5,7 ml Aqua Dest. 3,5 ml Trenngelpuffer 2,5 ml Sammelgelpuffer 140 ♠l SDS (10 %) 100 ♠l SDS (10 %) 4,6 ml Acrylamid (Roth) 1,7 ml Acrylamid (Roth) 65 ♠l APS 50 ♠l APS 7 ♠l TEMED (Roth) 10 ♠l TEMED (Roth) 3.14 Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) 3.14.1 ChIP Disuccinimidyl Glutarat (DSG) Sigma ♠MACS Protein A Microbeads Salmon Sperm DNA DNA Extraction Kit Miltenyi Biotec Invitrogen Macherey Nagel Material und Methoden 39 Ungefähr 2x106 in vitro generierte TH 1 Zellen (per Probe) wurden 72 h nach Aktivierung für 3 h mit PMA/Ionomyzin restimuliert und danach in einem 2-Schritt-Verfahren fixiert. Zunächst wurden die Zellen in 2 mM DSG für 45 min bei RT unter ständiger Rotation inkubiert und anschließend in 1 % PFA für 10 min fixiert. Nach Abstoppen der PFA Fixierung mit 125 mM Glycin wurden die Zellen mit SDS-Lysepuffer lysiert und das freigesetzte Chromatin wurde anschließend mit ChIP-Dilution Puffer verdünnt und per Sonifizierung in 300-500 bp große Stücke zerteilt. Um Protein-DNA Interaktionen oder epigenetische Chromatinmodifikationen zu detektieren wurde das Chromatin dann mit verschiedenen polyklonalen Antikörpern spezifisch für bestimmte Transkriptionsfaktoren oder Histonmodifikationen über Nacht bei 4◦ C inkubiert. Anschließend wurden DNA-(Protein)-Antikörper Komplexe mit Hilfe von ♠MACS Protein A Microbeads immunopräzipitiert. Um bei diesem wichtigen Schritt die Anreicherung unspezifischer DNA zu verhindern wurden die Protein A Beads vor der Antikörperbindung mit Salmon Sperm DNA vorinkubiert und danach mit ChIP-Blocking Puffer versetzt. Zusätzlich wurden während der magnetischen Separation die ♠MACS Säulen mit verschiedenen Puffern (Low Salt Waschpuffer, High Salt Waschpuffer, LiCl Waschpuffer, TE Puffer) gewaschen. Nach der Elution der Immunkomplexe mit ChIP-Elution Puffer wurden diese durch eine Inkubation bei 65◦ C für 4 h defixiert und anschließend wurde die immunpräzipitierte DNA mit Hilfe des DNA Extraction Kits (Macherey-Nagel) aufgereinigt. Schlussendlich wurde die Menge an spezifischen DNA-Fragmenten per qRT-PCR quantifiziert. Um eine Vergleichbarkeit zwischen den Proben zu garantieren wurde die Menge an immunpräzipitierter DNA in Relation zur gesamten eingesetzten DNA (Input) gesetzt. 3.14.2 ChIP Primer und Bedingungen Tab. 3.14: ChIP Primer und Bedingungen Primer Sequenz (5’→3’) MgCl2 (mM) T [◦ C] 2,5 mM 65◦ C 2 mM 65◦ C 2 mM 65◦ C 3 mM 65◦ C Il10 Lokus CNS-20 F: CTTTCCATTGCCACACACAC R: GGGTCCATTGCTTCTTTTGA CNS-9 F: CTTGAGGAAAAGCCAGCATC R: TTTGCGTGTTCACCTGTGTT CNS-4,5 F: GCCACGATTCTCAGGACATT R: GTATCCAACCCCACTTGCAC CNS-0,5 F: CTCTCCTCTGACCAACTGCC R: TGGGTTGAACGTCCGATATT Material und Methoden Primer 40 Sequenz (5’→3’) MgCl2 (mM) T [◦ C] 3 mM 65◦ C 1,5 mM 65◦ C 2,5 mM 65◦ C 3 mM 65◦ C 3 mM 65◦ C Prdm1 Lokus CNS-2 F: CCCTGTCTCCAAAAACCAAA R: GCAGGAGGCTGGATTTCTTT CNS-1,5 F: GCAAAACAAAAGCCCAACTC R: TCTGTGATACCTTCCACACACC CNS-1 F: AGTGAGTGGAAAGCTGTTGGA R: CAGGACATTGTATGCCATCATC CNS+14 F: GTTAATCTGCTTTCTCGGTTTC R: TCTTAAATGGCTGTAGGCGGAC Negative Region [76] F: GTGCATTCCCTGGTGTATCC R: GATGTTGGGGACGAGAGAAG 3.15 Luziferase-Reporter-Assay Dual Luciferase Assay System Promega HEK293T Zellen wurden mit verschiedenen Firefly Luziferase IL-10-Reporter Konstrukten (CNS-4.5-pXPG, CNS-9-pXPG) und Überexpressionsplasmiden für Blimp-1 und/oder c-Maf transfiziert (Ca2 PO4 -Methode). Als Kontrolle für die Überexpression der Transkriptionsfaktoren diente ein leeres Kontrollplasmid (pMY-IRES-GFP). Tab. 3.15: Transfektionsansatz Blimp-1 Einzeltransfektion Transfektionsansatz 375 ♠l H2 0 100 ♠l CaCl2 500 ♠l 2xHBS Puffer 5 ♠l IL-10 Reporter pXPG (500 ♠g/ml) 1 ♠l pRL-TK (160 ♠g/ml) 10 ♠l pMY-Prdm1-IRES-GFP (500 ♠g/ml) 10 ♠l pMY-IRES-GFP (500 ♠g/ml) je 200 ♠l per 12 Well HEK293T Um bei den Einzeltransfektionen von Blimp-1 und c-Maf oder des Kontrollplasmids die gleiche Menge an DNA zu transfizieren als bei der Blimp-1/c-Maf Doppeltransfektion wurden auch bei den jeweiligen Einzeltransfektionen zusätzlich das Kontrollplasmid in der entsprechenden Menge hinzugegeben. Darüber hinaus wurde in den gleichen Ansätzen ein unspezifisches Renilla-Luziferase-Expressionplasmid (pRL-TK) als interne Kontrolle für die Transfek- Material und Methoden 41 tionseffizienz verwendet. Tab. 3.15 zeigt beispielhaft einen Transfektionsansatz für die Blimp-1 Einzeltransfektion. 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen für 5 h mit PMA/Ionomyzin restimuliert und anschließend wurde die Luziferase Aktivität mit Hilfe des Dual Luciferase Assay System gemessen. In der Auswertung wurden alle Daten auf die Aktivität der Renilla Luziferase normalisiert. 3.16 Tierexperimentelle Methoden 3.16.1 Transfer-Kolitis Zur Induktion einer Transfer-Kolitis wurden 5x105 durchflusszytometrisch sortierte naive CD4+ CD45RBhigh TH -Zellen aus Blimp-1-kompetenten oder -defizienten Mäusen i.p. in 200 ♠l PBS in RAG-defiziente Empfängermäuse injiziert. Ca. 6 Wochen nach Kolitis Induktion zeigten die Mäuse starke Symptome einer Kolitis, wie Gewichtsverlust, struppiges Fell und weichen Stuhl. Zu diesem Zeitpunkt wurden die transferierten CD4+ TH -Zellen wieder aus der Milz reisoliert und anschließend hinsichtlich ihres Zytokinprofils, im speziellen ihrer Fähigkeit IL-10 zu produzieren, untersucht. 3.16.2 Toxoplasma gondii Infektion 3.16.2.1 Infektion T.gondii Zum Auslösen einer T.gondii Infektion wurden Mäuse 10 Zysten des T.gondii Stamms ME49 in einem Volumen von 0,3 ml PBS (pH 7,4) per oraler Gavage verabreicht. Die Zysten wurden aus homogenisiertem Gehirngewebe von NMRI Mäusen gewonnen, die zwei bis drei Monate zuvor selbst mit 10 Zysten T.gondii per i.p. Injektion infiziert wurden. 3.16.2.2 Immunohistochemie der Leber Formalin Lösung, neutral gepuffert, 10 % Sigma Für die immunohistochemische Untersuchung der Leber wurde ein Stück der Leber entnommen, in 4 % neutral gepufferter Formalinlösung fixiert und anschließend in Paraffin gebettet. Danach wurden dünne Paraffinschnitte (1-2 ♠m) angefertigt, deparafinisiert und mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Der Schweregrad (Score) der Leberentzündung wurde anhand dieser Schnitte in einem verblindeten Verfahren beurteilt und setzte sich aus dem individuellen Score für die lobulare und portale Entzündung zusammen (siehe Tab. 3.16). Material und Methoden 42 Tab. 3.16: Bewertungskritierien einer Leberentzündung Score Merkmale lobularer Entzündung 0 keine Entzündung 1 minimale Entzündung (wenige entzündliche Infiltrate) 2 erhöhte Anzahl an entzündlichen Zellen, wenig pyknotische Nekrose 3 stark erhöhte Anzahl an entzündlichen Zellen, viel pyknotische Nekrose 4 schwere Entzündung, Nekrose 5 sehr schwere Entzündung mit übergreifender Nekrose Score Merkmale portaler Entzündung 0 keine Entzündung 1 minimale Entzündung (<1/3 des portalen Trakts) 2 mittlere Entzündung, (ca. 1/2 des portalen Trakts) 3 schwere Entzündung, (> 2/3 des portalen Trakts) 4 sehr schwere Entzündung, Ausbreitung bis ins Parenchym 3.16.2.3 Leber-Organkultur Nach der Entnahme einer Leberbiopsie (ca. 5 mm3 ) wurden diese in 500 ♠l serumfreies RPMI 1640 Medium für 18 h in einem 24 Well bei 37◦ C inkubiert. Danach wurde der Kulturüberstand abgenommen, abzentrifugiert und für anschließende Zytokinanalysen (ELISA) verwendet. Außerdem wurde zur Normalisierung der sekretierten Zytokinmengen die Menge an Gesamtprotein im Organkultur-Überstand mit Hilfe eines Trichloressigsäure-PräzipitaionsAssays bestimmt. 3.16.2.4 T.gondii -spezifische Restimulation Zur Detektion und Charakterisierung T.gondii-spezifischer TH -Zellen wurden ex vivo isolierte Lymphozyten aus Milz oder mesenterialen Lymphknoten für 20 h bei 37◦ C mit Toxoplasma Lysat Antigen (TLA) restimuliert. Die Herstellung von TLA wurde bereits zuvor beschrieben [77]. Für die spätere intrazelluläre Zytokindetektion wurde nach 2 Stunden Inkubation der Sekretionshemmer Brefeldin A zugesetzt. Um anschließend antigen-spezifische TH -Zellen im Durchflusszytometer identifizieren zu können wurde der Aktivierungsmarker CD154 angefärbt, der sehr spezifisch auf kürzlich aktivierten T-Zellen induziert wird und damit einen direkten Zugang zu antigen-spezifischen TH Zellen bietet [78, 79]. Material und Methoden 43 3.17 Statistik Die dargestellten Daten zeigen den Mittelwert (mean) mit Standardfehler (SEM ) und fassen verschiedene unabhängige Experimente zusammen. Zur Bestimmung der Signifikanzwerte wurde der Student‘s t-Test (two-sided, unpaired) verwendet (Signifikanz bei p<0.05,*; p<0.01,**; p<0.001,***). Die Berechnung erfolgte mit Hilfe der Software Prism (Graphpad Software, Inc.). 4 Ergebnisse Ergebnisse 45 4.1 Identifizierung von IL-10-assoziierten Transkriptionsfaktoren in TH 1 Zellen Ziel dieser Arbeit war es zunächst potentielle Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, deren Expression mit der IL-10 Expression in TH 1 Zellen korreliert und die damit entweder der gleichen Regulation wie IL-10 selbst unterliegen oder selbst wichtige Regulatoren von IL-10 darstellen. Hierfür sollten direkt IL-10-produzierende und nicht-produzierende TH 1 Zellen separiert und anschließend Transkriptome dieser Zellpopulationen hergestellt werden. Basierend auf diesen Genexpressionsprofilen sollten anschließend Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die in IL-10+ gegenüber IL-10– TH 1 Zellen überexprimiert sind, um danach die womögliche funktionelle Rolle dieser Faktoren für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen untersuchen zu können. 4.1.1 Sortierung von TH 1 Zellen anhand ihrer IL-10 Sekretion Um IL-10 Produzenten von nicht-Produzenten zu trennen, wurden in vitro generierte TH 1 Zellen zunächst restimuliert um ihre Zytokinsekretion anzuregen. Anschließend wurden IL-10+ TH 1 Zellen mit Hilfe eines IL-10-Zytokin-Sekretions-Assays fluoreszenzmarkiert und anhand ihrer IL-10 Sekretion in IL-10-produzierende (IL-10+ ) und nicht-produzierende (IL-10– ) Zellen mit einer Reinheit von >99% durchflusszytometrisch sortiert (Abb. 4.1). Abb. 4.1: Sortierung IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen In vitro generierte TH 1 Zellen wurden nach PMA/Ionomyzin Restimulation an Tag 5 der Kultur mittels Zytokin-Sektretions-Assay anhand ihrer IL-10 Sekretion durchflusszytometrisch sortiert. Experiment durchgeführt von Dr. Frederik Heinrich. Ergebnisse 46 Um sicherzugehen, dass die sortierten Fraktionen wirklich IL-10 Produzenten und nichtProduzenten repräsentierten, wurde nach der Separation in einem Teil der sortierten Populationen IL-10 intrazellulär gegengefärbt. In der Tat konnte nur in der IL-10+ -sortierten Fraktion auch eine eindeutige intrazelluläre IL-10 Färbung detektiert werden, welche abhängig vom Zellpermeabilisator Saponin war (Abb. 4.2). Abb. 4.2: Intrazelluläre IL-10 Färbung in IL-10+ und IL-10– sortierten TH 1 Zellen. Durchflusszytometrisch sortierte Fraktionen wurden in An- oder Abwesenheit des Zellpermeablisators Saponin intrazellulär für IL-10 gefärbt. Anschließend wurden die sortierten Zellfraktionen für die vergleichende Genexpressionsanalyse verwendet. 4.1.2 Vergleichende Genexpressionsanalyse von IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen 4.1.2.1 Globale vergleichende Analyse (Transkriptomanalyse) Um einen globalen Überblick über die differenzielle Genexpression zwischen IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen zu erhalten, wurde nach der durchflusszytometrischen Sortierung jeweils die gesamte mRNA der beiden Fraktionen isoliert und in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde diese cDNA genutzt um mithilfe eines DNA-Microarrays die Genexpressionsstärke nahezu aller bekannten murinen Gene zu bestimmen. Um spezifisch Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die mit der IL-10 Expression in TH 1 Zellen korrelieren, wurden aus diesen Daten zunächst alle Transkriptionsfaktor-kodierenden Gene heraus sortiert, die in IL-10+ Zellen stärker exprimiert waren als in IL-10– Zellen. Anschließend wurde an diese Gruppe von Genen ein sogenannter Schwellenwert von >2 für die x–fache Überexpression angelegt, um nur signifikant überexprimierte Gene zu selektieren. (Tab. 4.1). Ergebnisse 47 Gen FC Gen FC Gen FC Gen FC Evi1 17.21 Nfat5 2.76 Foxk1 2.27 Eomes 2.17 Maf 4.01 Exo1 2.65 Nono 2.27 Crebbp 2.16 Maf 3.37 Cebpg 2.52 Ncf1 2.25 Crem 2.11 Prdm1 3.14 Cdkn2b 2.44 Il1rl1 2.23 Egr3 2.09 Fli1 2.97 E1301Rik 2.4 Hist1h2b 2.22 Hif1a 2.06 Etv5 2.84 Clspn 2.38 Lef1 2.21 Son 2.06 Maf 2.8 Timeless 2.31 Nfil3 2.2 Zfp687 2.06 Cdkn2d 2.79 Nr4a2 2.31 Baz2a 2.19 Zfhx1a 2.04 Irx3 2.77 Mxd1 2.27 Zipro1 2.18 Pml 2.02 Tab. 4.1: Liste von Transkriptionsfaktoren, die in IL-10+ gegenüber IL-10– TH 1 Zellen überexprimiert sind. Auszug aus den Daten der Transkriptomanalyse, sortiert nach x–facher Überexpression (fold change (FC); >2) in IL-10+ gegenüber IL-10– TH 1 Zellen und anschließend gefiltert für Gene, die für Transkriptionsfaktoren kodieren. Analyse durchgeführt von Dr. Frederik Heinrich. Insgesamt konnten durch dieses Analyseverfahren 36 verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die zumindestens auf mRNA Ebene mehr als doppelt so stark in IL-10+ gegenüber IL-10– TH 1 Zellen exprimiert waren. Die am stärksten mit IL-10 assoziierten Gene (x-fache Überexpression >3; grau hinterlegt in Tab. 4.1) waren dabei Evi1 (Evi-1), Maf (c-Maf) und Prdm1 (Blimp-1). Auf diese drei Faktoren wurde deshalb zunächst der weitere Fokus gelegt. 4.1.2.2 Selektive vergleichende Analyse (Validierung) Um die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse zu verifizieren und um einen Eindruck von der absoluten Expressionstärke von Evi1, Maf und Prdm1 zu bekommen, wurde im Folgenden die Expression dieser drei Faktoren noch einmal auf mRNA Ebene per quantitativer Real-time PCR (qRT-PCR) und auf Protein Ebene per Immuno-Blot in IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen bestimmt. Im Gegensatz zur Transkriptomanalyse wurden für diese Untersuchung T-Zellen aus IL-10:GFP Reporter Mäusen verwendet, was eine einfache und effiziente durchflusszytometrische Sortierung von IL-10+ TH 1 Zellen direkt über die Expression des Reportergens GFP ermöglichte. Wie erwartet konnte zunächst in den IL-10:GFP+ TH 1 Zellen eine starke Überexpression an Il10 mRNA gegenüber den IL-10:GFP– TH 1 Zellen detektiert werden (Abb. 4.3A). Diese differentielle Il10 Expression zeigte, dass die Sortierung von TH 1 Zellen anhand ihrer IL-10:GFP Expression per se erfolgreich war. In der Tat zeigten neben Il10 selbst auch die per Transkriptomanalyse identifizierten Gene Evi1, Maf und Prdm1 dieses stark differenzielle Expressionsmuster zugunsten der IL-10:GFP+ Fraktion. Überraschenderweise gab es Ergebnisse 48 Abb. 4.3: Validierung der IL-10 Assoziiation von Evi-1, c-Maf und Blimp-1 in TH 1 Zellen. (A) qRT-PCR Analyse der mRNA Level von Il10, Evi1, Maf und Prdm1 in durchflusszytometrisch sortierten IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– TH 1 Zellen. (B) Immuno-Blot Analyse der Proteinexpression von c-Maf und Blimp-1 in IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– sortierten TH 1 Zellen. Größenangabe auf der linken Seite in kD. jedoch wesentliche Unterschiede bei der Stärke der relativen Expression der drei Faktoren. Während Maf und Prdm1 eine ähnlich starke Expression zeigten, war Evi1 im Vergleich sehr viel schwächer exprimiert und selbst in den IL-10:GFP+ TH 1 Zellen nur knapp über der qRT-PCR Detektionsgrenze zu messen. Im Hinblick auf die Verifizierung auf Proteinebene konnte auch mittels Immuno-Blot eine starke Überexpression von c-Maf und Blimp-1 in IL-10:GFP+ gegenüber IL-10:GFP– TH 1 Zellen gemessen werden (Abb. 4.3B). Für Evi-1 hingegen konnte in beiden Fraktionen keine spezifische Bande detektiert werden (Daten nicht aufgeführt). In Kombination mit der bereits beschriebenen extrem schwachen Evi1 mRNA Expression ist anzunehmen, dass dieser Faktor in TH 1 Zellen in so geringem Maße exprimiert wird, dass er für weitere funktionelle Untersuchungen im Rahmen dieser Studie ungeeignet ist. Für c-Maf und Blimp-1 hingegen konnte die aus den Genexpressionsprofilen ermittelte IL-10 Assoziation sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene validiert werden. Damit stellten diese beiden Transkriptionsfaktoren aussichtsreiche Kandidaten für weitere funktionelle Untersuchungen dar. 4.2 Funktionelle Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen Um den funktionellen Einfluss eines Transkriptionsfaktors auf ein potenzielles Zielgen zu untersuchen, war es zunächst das Ziel den Faktor in seiner Expressionsstärke zu modulieren, um dann zu untersuchen inwiefern sich auch die Expression des Zielgens verändert. Für die funktionelle Analyse von Blimp-1 wurden deshalb konditionelle Prdm1 knock-out Mäuse ge- Ergebnisse 49 züchtet (CD4cre x Prdm1 flox/flox ; ‘Prdm1 KO‘), die eine Deletion des Prdm1 Gens spezifisch nur in CD4+ TH -Zellen aufweisen. Dieser Ansatz gewährleistete, dass bei der phänotypischen Analyse dieser Mäuse Blimp-1-vermittelte Effekte in anderen Zellpopulationen ausgeschlossen werden konnten. Als Umkehransatz wurde außerdem ein retrovirales Prdm1 Überexpressionsplasmid generiert. Damit konnte beidseitig untersucht werden, wie sich die IL-10 Produktion in TH 1 Zellen verändert, wenn Blimp-1 entweder nicht präsent (KO) beziehungsweise in unlimitierten Mengen (nach Überexpression) in TH 1 Zellen vorhanden ist. 4.2.1 Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression in vitro generierter TH 1 Zellen 4.2.1.1 IL-10 Produktion in Abwesenheit von Blimp-1 Im ersten Schritt der funktionellen Untersuchung sollte überprüft werden, ob die IL-10 Produktion in vitro generierter TH 1 Zellen in Abwesenheit des Transkriptionsfaktors Blimp1 beeinträchtigt ist. Deshalb wurden naive CD4+ TH -Zellen aus konditionellen Blimp-1defizienten Mäusen für die TH 1 Differenzierung verwendet. Als Kontrolle dienten CD4+ TH Zellen aus Blimp-1-kompetenten (CD4cre x Prdm1 wt/wt ; ‘Prdm1 WT‘) Zuchtgeschwistern. Abb. 4.4: Endogene Blimp-1 Expression in Prdm1 WT und KO TH 1 Zellen. Immuno-Blot Analyse der endogenen Blimp-1 Expression in Blimp-1-kompetenten (Prdm1 WT) und -defizienten (Prdm1 KO) TH 1 Zellen an Tag 3 einer in vitro TH 1 Kultur. Um zunächst exemplarisch zu kontrollieren, ob die Prdm1 -defizienten Zellen wirklich keine Blimp-1 Expression aufweisen, wurden naive CD4+ TH -Zellen aus jeweils Prdm1 WT oder KO Mäusen isoliert und unter TH 1 Bedingungen kultiviert. Anschließend wurde per ImmunoBlot die endogene Blimp-1 Expression in beiden Gruppen untersucht (Abb. 4.4). Wie erwartet konnte nur in den Prdm1 WT Zellen eine eindeutige und spezifische Blimp-1 Bande nachgewiesen werden. Die komplette Abwesenheit dieser Bande in den Prdm1 KO Zellen demonstrierte den Blimp-1 Gen-knock-out auf Proteinebene. Nach dieser Verifizierung des Blimp-1 knock-outs wurde nun die IL-10 Expression von in vitro generierter Prdm1 WT und KO TH 1 Zellen miteinander verglichen um eine potentielle regulatorische Rolle von Blimp-1 zu identifizieren. Die IL-10 Produktion wurde hierfür jeweils zu einem definierten Zeitpunkt auf Einzelzellebene mit Hilfe eines Durchflusszytometers per intrazellulärer Zytokinfärbung und zusätzlich über einen definierten Zeitraum per ELISA bestimmt (Abb. 4.5). Ergebnisse 50 Abb. 4.5: Blimp-1 reguliert die IL-10 Produktion von in vitro generierten TH 1 Zellen. (A) Frequenz von IL-10 und IFN-❣ produzierenden Prdm1 WT oder KO TH 1 Zellen an Tag 5 (Analysefenster auf CD4+ ) nach Restimulation mit PMA/Ionomyzin. Ein repräsentativer Dot-Blot ist gezeigt. (B) Menge an sekretiertem IL 10 im Kulturüberstand von Prdm1 WT oder KO TH 1 Zellen nach 3 Tagen Kultur ohne Restimulation. Bei der durchflusszytometrischen Analyse zeigte sich zunächst, dass alle IL-10 Produzenten gleichzeitig auch IFN-❣ koexpremierten und damit einen eindeutigen TH 1 Phänotyp aufwiesen. Von den WT Zellen sekretierten etwa 10% der gesamten CD4+ Zellen und ca. 12,5% der IFN-❣ Produzenten IL-10. Diese Frequenzen waren in den KO Zellen drastisch reduziert. Nur ca. 3% der gesamten KO CD4+ Zellen und etwa 4% der IFN-❣-Produzenten exprimierten IL-10. Die Frequenz der IFN-❣-Produzenten war vergleichbar zwischen den beiden Gruppen (Daten nicht aufgeführt). Auch im Kulturüberstand konnte per ELISA eine signifikante Verminderung der IL-10 Sekretion in Abwesenheit von Blimp-1 nachgewiesen werden. Zusammenfassend scheint damit die IL-10 Produktion in vitro generierter TH 1 Zellen in Abwesenheit von Blimp-1 erheblich beeinträchtigt zu sein. 4.2.1.2 IL-10 Produktion nach Blimp-1 Überexpression Um im Umkehrschluss zu überprüfen, ob die Menge an endogen exprimiertem Blimp-1 limitierend auf die IL-10 Produktion wirkt, wurden TH 1 Zellen mit einem retroviralen Prdm1 Überexpressionsplasmid transduziert. Dieses Konstrukt war zusätzlich mit einem Fluoreszenzmarker (GFP) ausgestattet, sodass eine separate durchflusszytometrische Analyse bzw. Sortierung erfolgreich transduzierter Zellen möglich war. Als Kontrolle diente ein GFP-Leerkonstrukt. Beim Vergleich der Il10 mRNA sortierter GFP+ TH 1 Zellen nach Prdm1 - oder Kontrolltransduktion konnte eine starke Induktion des Il10 Transkripts nach Blimp-1 Überexpression detektiert werden (Abb. 4.6A). Um dieses Ergebnis auch auf Proteinebene zu verifizieren wurden IL-10 und IFN-❣ nach Restimulation auch intrazellulär in transduzierten TH 1 Zellen angefärbt (Abb. 4.6B). Hier wurde das Analysefenster nun auf CD4+ GFP+ gelegt, um nur die Ergebnisse 51 erfolgreich transduzierten Zellen zu betrachten. Auch bei dieser Analyse war die Frequenz der IL-10 Produzenten innerhalb der CD4+ GFP+ Zellen nach Blimp-1 Überexpression deutlich erhöht gegenüber der Kontrolltransduktion (ca. 30% vs. 8%). Die IFN-❣ Produktion hingegen war weitestgehend unverändert nach Blimp-1 Überexpression (Daten nicht aufgeführt). Abb. 4.6: Blimp-1 Überexpression induziert IL-10 Produktion in in vitro generierten TH 1 Zellen. WT Zellen wurden 24h nach Start der in vitro TH 1 Kultur mit einem retroviralem Blimp-1 oder Kontrollplasmid transduziert. (A) Relative Il10 mRNA Expression sortierter GFP+ TH 1 Zellen nach Blimp-1 (Prdm1 RV) oder Kontrolltransduktion (GFP RV) an Tag 4. (B) Frequenz von IL-10 Produzenten innerhalb der Blimp-1 oder kontrolltransduzierten TH 1 Zellen (Analysefenster auf CD4+ GFP+ ) an Tag 5 nach Restimulation. Ein repräsentativer Dot-Blot ist gezeigt. In der Gesamtheit zeigen diese Ergebnisse, dass die IL-10 Produktion in vitro generierter TH 1 Zellen direkt von der Blimp-1 Expression abhängt und legen somit eine wichtige regulatorische Rolle von Blimp-1 nahe. 4.2.2 Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression in vivo generierter TH 1 Zellen Im nächsten Schritt sollte geklärt werden, ob sich die gewonnen Erkenntnisse aus den in vitro Versuchen zur funktionellen Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Produktion auch auf eine physiologische TH 1-vermittelte in vivo Situation übertragen lassen. 4.2.2.1 Transfer-Kolitis Um zu untersuchen, ob auch in vivo generierte Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen einen IL-10 Defekt aufweisen, wurden naive T-Zellen aus Prdm1 WT beziehungsweise KO Mäusen in RAG-defiziente Mäuse (B- und T-Zell-defiziente Mäuse) transferiert. Durch den Transfer in eine lymphopenische Umgebung kommt es zu einer unkontrollierten Aktivierung und Expansion der naiven T-Zellen, was sich schlussendlich in der Ausbildung einer Kolitis in diesen Mäusen manifestiert [80]. Dabei ist es wichtig zu erwähnen, dass diese entzündliche Reaktion Ergebnisse 52 vor allem durch TH 1 Zellen vermittelt wird [81]. Eigene Vorarbeiten haben außerdem gezeigt, dass dabei auch IL-10+ TH 1 Zellen entstehen. Deswegen wurde zunächst dieses Modell genutzt, da durch den Transfer von Blimp-1-kompetenten beziehungsweise -defizienten naiven T-Zellen sehr einfach untersucht werden konnte, ob Blimp-1 für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen im Rahmen einer Transfer-Kolitis notwendig ist. Um die IL-10 Produktion vergleichend zu untersuchen wurden 6 Wochen nach KolitisInduktion (Höhepunkt des Krankheitsverlaufs) die initial transferierten Prdm1 WT oder KO T-Zellen aus verschiedenen lymphatischen Organen reisoliert. Nach anschließender ex vivo Restimulation wurde das Zytokinprofil der T-Zellen per intrazellulärer Färbung untersucht. Wie in Abb. 4.7 zu sehen, entwickelten sich die WT T-Zellen zu einem großen Teil zu IFN-❣+ TH 1 Zellen (ca. 50-60% IFN-❣+ T-Zellen) unabhängig vom untersuchten Gewebe. Außerdem koexprimierten ca. 6-10% der IFN-❣+ TH 1 in der Milz oder den mesenterialen Lymphknoten IL-10. Im Gegensatz dazu war die IL-10 Produktion der Prdm1 KO TH 1 Zellen stark vermindert. Nur etwa 1% der IFN-❣+ KO TH 1 Zellen produzierten auch IL-10. Die IFN-❣ Produktion war dabei vergleichbar zwischen den Gruppen oder sogar in der Abwesenheit von Blimp-1 leicht erhöht (Milz). Abb. 4.7: In vivo induzierte Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen produzieren signifikant weniger IL-10 als WT Zellen während einer Transfer-Kolitis. Frequenz IL-10- oder IFN-❣produzierender Prdm1 WT oder KO CD4+ T-Zellen, reisoliert 6 Wochen nach Kolitis Induktion aus Milz und mesenterialen Lymphknoten (mLK) nach ex vivo PMA/Ionomyzin Restimulation. Ein repräsentativer Dot-Blot ist gezeigt. Zusammenfassend konnte damit gezeigt werden, dass die IL-10 Produktion in vivo induzierter TH 1 Zellen während einer Transfer-Kolitis stark von Blimp-1 abhängt. 4.2.2.2 Toxoplasma gondii Die Induktion von IL-10+ TH 1 Zellen wurde bisher vor allem in verschiedenen Infektionsmodellen beschrieben. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass während einer Toxoplasma gondii Infektion IL-10-produzierende TH 1 Zellen induziert werden, um eine exzessive TH 1vermittelte Immunpathologie selbstlimitierend zu begrenzen [28]. Deshalb stellte die Infektion Ergebnisse 53 Blimp-1-defizienter Tiere mit T.gondii ein weiteres geeignetes Modell dar, um die Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Produktion in vivo generierter TH 1 Zellen zu untersuchen. Zusätzlich konnte in diesem Modell die Frage adressiert werden, ob ein Blimp-1-abhängiger IL-10-Defekt in TH 1 Zellen auch einen systemischen Einfluss auf den Schweregrad einer T.gondii Infektion hat, wie es bereits für T-Zell-spezifische-IL-10-defiziente Mäuse gezeigt werden konnte [25]. Für die Analyse der IL-10 Produktion wurden zunächst, zum Höhepunkt des Krankheitsverlaufes, Zellen aus Milz, mesenterialen Lymphknoten und der Leber infizierter WT oder Blimp-1-defizienter Tiere isoliert und ex vivo polyklonal restimuliert. Besonders die Leber ist ein primäres Zielorgan von T.gondii und stand deshalb auch im Fokus dieser Untersuchungen. Nach anschließender intrazellulärer Zytokinfärbung konnte die Frequenz IL-10- und auch IFN-❣-produzierender CD4+ T-Zellen in Prdm1 WT Mäusen mit der in KO Mäusen verglichen werden. Zusätzlich wurden auch nicht-infizierte Tiere als Negativkontrolle mitgeführt um die gemessene Immunantwort mit den basalen Zytokinleveln in gesunden Tieren vergleichen zu können. Abb. 4.8: In vivo induzierte Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen produzieren signifikant weniger IL-10 als WT Zellen während einer T.gondii Infektion. (A) Frequenz IL-10- oder IFN-❣-produzierender CD4+ T-Zellen, isoliert 8 Tage nach T.gondii Infektion aus Leber, Milz und mesenterialen Lymphknoten (mLK) infizierter und nicht-infizierter (naive) Prdm1 WT und KO Mäuse nach PMA/Ionomyzin Restimulation. (B) Frequenz der IL-10 Produzenten innerhalb der IFN-❣produzierenden (Analysefenster CD4+ IFN-❣+ ) oder nicht-produzierenden CD4+ T-Zellen (Analysefenster CD4+ IFN-❣– ) isoliert aus verschiedenen Organen infizierter Prdm1 WT oder KO Mäuse. Ergebnisse 54 Wie in Abb. 4.8A erkenntlich, induziert T.gondii in der Tat eine starke TH 1 geprägte T-Zell Antwort. Beispielsweise produzieren ungefähr 50% aller CD4+ Zellen in der Leber IFN-❣ als Reaktion auf die Infektion. Wie erwartet konnte auch eine T.gondii-spezifische Induktion von IL-10 Produzenten detektiert werden (bis zu 10% IL-10+ CD4+ Zellen in der Milz). Vergleicht man die Frequenz der IL-10 Produzenten zwischen den beiden Versuchsgruppen wird deutlich, dass wiederum Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen signifikant weniger IL-10 produzieren. Dieser Phänotyp wurde in allen untersuchten Organen beobachtet. Wenn man die Frequenz der IL-10 Produzenten innerhalb der IFN-❣ Produzenten mit denen innerhalb der nicht-Produzenten vergleicht (Abb. 4.8B) wird deutlich, dass sich der Großteil der IL-10+ Zellen zum TH 1 Kompartiment (IFN-❣+ ) zuordnen lässt. Bis zu 25% der IFN-❣ Produzenten aus der Milz koexprimierten zum Beispiel IL-10, während diese Frequenz innerhalb der IFN-❣-negativen Zellen bei nur etwa 5% lag. Diese Daten bestätigen vorangegangene Studien, die zeigen, dass IL-10 während einer T.gondii Infektion hauptsächlich von pro-inflammatorischen TH 1 Zellen produziert wird [28]. Unabhängig davon war die Frequenz der IL-10 Produzenten in beiden Fraktionen in der Abwesenheit von Blimp-1 signifikant reduziert. Abb. 4.9: Blimp-1-defiziente T.gondii-spezifische T-Zellen produzieren weniger IL-10 und sind im Vergleich zu WT Zellen vor allem in den mesenterialen Lymphknoten überrepräsentiert. Ex vivo isolierte Lymphozyten aus Milz und mesenterialen Lymphknoten (mLK) infizierter oder nicht-infizierter (naive) Prdm1 WT und KO Mäusen wurden 8 Tage nach Infektion mit Toxoplasma Lysat Antigen (TLA) restimuliert und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. (A) Frequenz an T.gondii-spezifischen T-Zellen (CD154+ ) innerhalb der CD4+ T-Zellen. (B) Frequenz IL-10- oder IFN-❣-produzierender antigen-spezifischer T-Zellen (Analysefenster CD4+ CD154+ ). Da die polyklonale Restimulation mit PMA/Ionomyzin ein sehr starker und artifizieller T-Zell-Stimulus ist, sollte zusätzlich die Zytokinantwort in diesem System auch nach physiologischer antigen-spezifischer Restimulation untersucht werden. Hierzu wurden T-Zellen aus Milz oder Lymphknoten ex vivo mit einem T.gondii Lysat (TLA) restimuliert. Um bei der anschließenden durchflusszytometrischen Analyse selektiv die reaktivierten antigen-spezifischen T-Zellen zu identifizieren, wurde zusätzlich der Aktivierungsmarker CD154 gefärbt, der nach TZR Stimulation transient induziert wird [78, 79]. Interessanterweise war die Frequenz der Ergebnisse 55 T.gondii-spezifischen T-Zellen vor allem in den mesenterialen Lymphknoten von Prdm1 KO Tieren stark erhöht im Vergleich zum WT (Abb. 4.9A). Beim Blick auf die Frequenz der IL-10- und IFN-❣-Produzenten innerhalb der CD154+ Zellen war erneut eine signifikante Reduktion der IL-10+ Zellen in Abwesenheit von Blimp-1 zu beobachten während die IFN-❣ Produktion unverändert war (Abb. 4.9B). Im Rahmen einer T.gondii Infektion zeigen somit in vivo generierte TH 1 Zellen sowohl nach polyklonaler wie auch nach antigen-spezifischer Restimulation in Abwesenheit von Blimp-1 einen Defekt in ihrer Fähigkeit IL-10 zu produzieren. Zusammenfassend konnte somit in zwei grundlegend verschiedenen in vivo Modellen (Kolitis, T.gondii Infektion) gezeigt werden, dass auch die IL-10 Expression in vivo generierter TH 1 Zellen von Blimp-1 abhängt. 4.2.3 Rolle von Blimp-1 für eine TH 1-vermittelte Immunantwort Die Produktion von IL-10 während einer T.gondii Infektion ist essentiell für die Regulation der Immunantwort. Studien mit IL-10-defizienten Mäusen zeigen, dass diese Tiere problemlos den Parasiten kontrollieren können, allerdings durch das fehlende immunregulatorische IL-10 meist an einer unkontrollierten und in der Folge tödlichen pro-inflammatorischen TH 1Immunantwort sterben [25, 82]. Um zu untersuchen, ob sich der Blimp-1-abhängige IL-10 Defekt von TH 1 Zellen auch auf die Selbstlimitierungskapazität der TH 1 Antwort während einer T.gondii Infektion auswirkt, wurden verschiedenste Krankheits- und Entzündungsparameter von Prdm1 WT und KO Tieren miteinander verglichen. Als äußerliche Krankheitsanzeichen wurden die Gewichtsabnahme sowie die Überlebensrate nach T.gondii Infektion bestimmt. Weiter wurde die durch T.gondii induzierte Gewebeentzündung in der Leber beurteilt. Um die Kontrolle des Parasiten zu vergleichen wurde die allgemeine Parasitenbelastung gemessen. Als interne Entzündungsmarker wurden die Level an entzündungsfördernden Zytokinen (IL-12, IFN-❣, TNF-❛) im Serum und im Gewebe (Leber) infizierter WT und KO Tiere bestimmt. Wie in Abb. 4.10 zu sehen, war die initiale Gewichtsabnahme der beiden Versuchsgruppen nach Infektion (n.I.) zunächst ähnlich (Abb. 4.10A). Bis Tag 11 n.I. erlagen jedoch alle KO Tiere der Infektion während im Gegensatz etwa 50% der WT Tiere überlebten und bis Tag 14 n.I. sogar wieder Gewicht zunahmen (Abb. 4.10A+B). Die Analyse der T.gondii Belastung (Abb. 4.10C) hingegen zeigte keine Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen, was darauf schließen lässt, das die Kontrolle des Pathogens durch die TH 1 Zellen in Abwesenheit von Blimp-1 nicht beeinträchtigt war. Signifikante Unterschiede ergab jedoch die Analyse der Gewebeentzündung in der Leber. In WT Tieren führte die Infektion nur zu einer fokalen und minimalen bis durchschnittlichen Zellinfiltration des Leberparenchyms, während KO Tiere eine starke portale Infiltration mit schwerer Nekrose des Parenchyms aufwiesen (Abb. 4.10D). Gleichzeitig waren, im Vergleich zu den Kontrolltieren, auch die entzündungsfördernden TH 1- Ergebnisse 56 Abb. 4.10: Blimp-1 limitiert die TH 1-vermittelte Immunpathologie während einer T.gondii Infektion. Prdm1 WT oder KO Tiere wurden mit 10 Zysten T.gondii peroral infiziert und 8 Tage nach Infektion untersucht. Nicht-infizierte Tiere (naive) dienten als Negativkontrolle. (A) Gewichtskurve und (B) Überlebensrate von WT (n=13) und KO (n=8) Tieren nach T.gondii Infektion. (C) Parasitenbelastung von WT und KO Tieren gemessen an der relativen Menge von T.gondii DNA in ilealen Biopsien. (D) Hepatitis Score in WT und KO Tieren. Eine repräsentative histologische Färbung des entzündeten Lebergewebes ist dargestellt (HE Färbung, Balken=100 ♠m). Pfeile zeigen nekrotische Bereiche oder Areale mit starker Zellinfiltration. (E) Level von IL-12p70, IFN-❣ und TNF❛ im Serum von WT oder KO Tieren. (F) Relative Menge von IFN-❣ oder TNF-❛ im Überstand einer 24-stündigen Leberorgan-Kultur. Ergebnisse 57 Zytokine IL-12, IFN-❣ und TNF-❛ in der Abwesenheit von Blimp-1 sowohl im Serum (Abb. 4.10E) als auch im Gewebe (Abb. 4.10F) infizierter Tiere erhöht. In der Summe lässt sich schlussfolgern, dass Blimp-1 die durch T.gondii induzierte Immunpathologie begrenzt. Konditionelle Blimp-1-defiziente Mäuse spiegeln dabei in großem Maße den Phänotyp von IL-10-defizienten Mäusen nach T.gondii Infektion wieder [25, 82]. Auf Grundlage dessen kann spekuliert werden, dass die exzessive TH 1-Antwort, die in den KO Tieren zu einer letalen Immunpathologie führt, hauptsächlich durch den IL-10 Defekt der TH 1 Zellen (siehe Abb. 4.8 und 4.9) ausgelöst wird, obwohl formal auch andere IL-10-unabhängige Mechanismen nicht ausgeschlossen werden können. 4.3 Funktionelle Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen In der initialen vergleichenden Genexpressionsanalyse dieser Studie konnte neben Blimp-1 auch der Transkriptionsfaktor c-Maf als überexpremiert in IL-10-produzierenden TH 1 Zellen im Vergleich zu nicht-produzierenden Zellen identifiziert werden. Deshalb sollte nachfolgend auch die funktionelle Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen untersucht werden. 4.3.1 Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression in vitro generierter TH 1 Zellen 4.3.1.1 IL-10 Produktion in Abwesenheit von c-Maf Um zu untersuchen ob TH 1 Zellen auch in der Abwesenheit von c-Maf IL-10 produzieren können, wurden analog zur Blimp-1 Analyse T-Zell-spezifische c-Maf-knock-out Mäuse gezüchtet (CD4cre x Maf flox/flox ; ‘Maf KO‘). Als Kontrolle dienten jeweils wieder c-Maf-kompetente Zuchtgeschwister (CD4wt x Maf flox/flox ; ‘Maf WT‘). Abb. 4.11: Endogene c-Maf Expression in Maf WT und KO TH 17 Zellen. Immuno-Blot Analyse der endogenen c-Maf Expression in c-Maf-kompetenten (Maf WT) und -defizienten (Maf KO) TH 17 Zellen an Tag 3 einer in vitro TH 17 Kultur. Ergebnisse 58 Auch in diesem Fall wurde zunächst exemplarisch kontrolliert, ob Maf -defiziente Zellen wirklich keine c-Maf Expression aufweisen. Hierfür wurden naive CD4+ T-Zellen aus jeweils Maf WT oder KO Mäusen isoliert und unter TH 17 Bedingungen kultiviert, da bereits gezeigt werden konnte, dass c-Maf besonders stark unter diesen Bedingungen induziert wird [83]. Anschließend wurde per Immuno-Blot die endogene c-Maf Expression in beiden Gruppen untersucht. Im Gegensatz zu Maf WT TH 17 Zellen konnte nahezu keine c-Maf Expression in Maf KO TH 17 Zellen nachgewiesen werden (Abb. 4.11). Deshalb konnten diese Mäuse für die nachfolgenden Experimente verwendet werden, um die c-Maf-Abhängigkeit der IL-10 Expression von TH 1 Zellen zu untersuchen. Um die funktionelle Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression in vitro generierter TH 1 Zellen zu analysieren, wurden naive Maf WT oder Maf KO CD4+ T-Zellen zunächst unter TH 1 Bedingungen kultiviert. Die IL-10 Produktion wurde anschließend jeweils zu einem definierten Zeitpunkt auf Einzelzellebene per intrazellulärer Zytokinfärbung und zusätzlich über einen definierten Zeitraum per ELISA bestimmt und verglichen (Abb. 4.12). Abb. 4.12: Die IL-10 Produktion von in vitro generierten TH 1 Zellen ist unabhängig von c-Maf. (A) Frequenz von IL-10- und IFN-❣-produzierenden Maf WT oder KO TH 1 Zellen an Tag 5 der in vitro Kultur (Analysefenster auf CD4+ ) nach Restimulation mit PMA/Ionomyzin. Ein repräsentativer Dot-Blot ist gezeigt. (B) Menge an sekretiertem IL-10 und IFN-❣ im Kulturüberstand von Maf WT oder KO TH 1 Zellen nach 3 Tagen Kultur ohne Restimulation. Im Gegensatz zur Blimp-1-Defizienz führte die Abwesenheit von c-Maf zu keinem IL-10 Defekt in TH 1 Zellen, sondern im Kontrast sogar zu einer verstärkten IL-10 Produktion (Abb. 4.12A+B). Dieser Effekt wurde jedoch auch von einer erhöhten IFN-❣ Sekretion begleitet (Abb. 4.12B), sodass diese Daten eher eine unspezifische inhibierende Wirkung von c-Maf auf die gesamte TH 1 Differenzierung vermuten lassen, als einen spezifischen Effekt auf die IL-10 Produktion. Ergebnisse 59 4.3.1.2 IL-10 Produktion nach c-Maf Überexpression Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, ob andererseits die Überexpression von c-Maf in TH 1 Zellen zu einer Steigerung der IL-10 Produktion führen kann. Hierfür wurden TH 1 Zellen 24 Stunden nach Aktivierung mit einem c-Maf Überexpressionskonstrukt (c-Maf RV) retroviral transduziert. Als Kontrolle diente ein Leerplasmid (GFP RV). Um erfolgreich transduzierte Zellen durchflusszytometrisch identifizieren zu können, kodierten beide Konstrukte zusätzlich auch für GFP. Abb. 4.13: c-Maf Überexpression induziert IL-10 Produktion in in vitro generierten TH 1 Zellen. WT Zellen wurden 24h nach Start der in vitro TH 1 Kultur mit einem retroviralem c-Maf oder Kontrollplasmid transduziert. Frequenz von IL-10 und IFN-❣ Produzenten innerhalb der c-Maf oder kontrolltransduzierten TH 1 Zellen (Analysefenster auf CD4+ GFP+ ) an Tag 5 nach Restimulation. Ein repräsentativer Dot-Blot ist gezeigt. Wie in Abb. 4.13 zu sehen, führte die ektopische Expression von c-Maf zu einer starken Zunahme der Frequenz von IL-10-produzierenden TH 1 Zellen, vergleichbar mit dem Effekt der Blimp-1 Überexpression (Abb. 4.6). Ungefähr 40% aller c-Maf-transduzierten Zellen produzierten IL-10, während nur etwa 10% der kontrolltransduzierten Zellen IL 10+ waren. Dieser Effekt war spezifisch für IL-10, da die IFN-❣ Produktion unverändert zwischen den Versuchsgruppen war. Im Gesamten zeigen diese Ergebnisse, dass c-Maf, im Gegensatz zu Blimp-1, nicht essentiell für die IL-10 Expression von in vitro generierten TH 1 Zellen ist, da c-Maf-defiziente TH 1 Zellen keinen IL-10-Defekt aufweisen (Abb. 4.12). Allerdings scheint c-Maf eine expressionsfördernde Wirkung auf IL-10 zu haben, wenn es in großen Mengen, wie zum Beispiel nach retroviraler Überexpression, vorhanden ist (Abb. 4.13). Dies lässt vermuten, dass c-Maf in TH 1 Zellen nur sehr schwach exprimiert wird und folglich keine essentielle Rolle für die IL-10 Produktion spielt. Ergebnisse 60 4.3.2 Rolle von c-Maf für die IL-10 Expression in vivo generierter TH 1 Zellen Um zu überprüfen, ob auch die IL-10 Expression in vivo generierter TH 1 Zellen unabhängig von c-Maf ist, wurden im Folgenden T-Zell-spezifische c-Maf-kompetente und -defiziente Mäuse mit T.gondii infiziert. Zum Höhepunkt der Infektion wurden analog zur Blimp-1Analyse Lymphoyzten aus verschiedenen Organen isoliert und nach ex vivo PMA/Ionomyzin Restimulation die Expression von IL-10 und IFN-❣ untersucht. Abb. 4.14: In vivo induzierte c-Maf-defiziente TH 1 Zellen weisen während einer T.gondii Infektion keinen generellen IL-10 Defekt auf. (A) Frequenz IL-10- oder IFN-❣-produzierender CD4+ T-Zellen, isoliert 8 Tage nach T.gondii Infektion aus Dünndarm (LPL), Milz und mesenterialen Lymphknoten (mLK) infizierter Maf WT und KO Mäuse nach PMA/Ionomyzin Restimulation. (B) Frequenz der IL-10 Produzenten innerhalb der IFN-❣-produzierenden (Analysefenster CD4+ IFN-❣+ ) oder nicht-produzierenden CD4+ T-Zellen (Analysefenster CD4+ IFN-❣– ) isoliert aus verschiedenen Organen infizierter Maf WT oder KO Mäuse. Wie in Abb. 4.14 zu sehen, weisen in vivo generierte c-Maf-defiziente TH 1 Zellen keinen generellen IL-10 Defekt auf. Einzig bei Dünndarm-assoziierten CD4+ T-Zellen zeigte sich ein Trend zu einer verminderten Frequenz an IL-10+ Zellen (Abb. 4.14A). Im Vergleich dazu waren auch die Frequenzen an IFN-❣-produzierenden CD4+ T-Zellen vergleichbar zwischen den beiden Gruppen. Nur im mesenterialen Lymphknoten zeigten zwei von drei c-Maf-defizienten Mäusen stark erhöhte Frequenzen an IFN-❣-produzierenden CD4+ T-Zellen. Bei der Analyse der Frequenz der IL-10+ CD4+ T-Zellen innerhalb der IFN-❣+ (TH 1 Zellen) bzw. IFN-❣– CD4+ T-Zellen zeigte sich ein ähnliches Ergebnis als auf totaler Populationsebene. In beiden Fraktionen war die Frequenz an IL-10-produzierenden T-Zellen nicht gravierend verändert in der An- oder Abwesenheit von c-Maf, wobei weitere Experimente mit höherer Stichprobenzahl in der Zukunft nötig sind, um diese Ergebnisse statistisch abzusichern. Ergebnisse 61 Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass c-Maf nicht essentiell für die IL-10 Expression von in vitro sowie in vivo generierten TH 1 Zellen ist. Nichtsdestotrotz offenbarten die Überexpressionsexperimente, dass c-Maf per se in Th1 Zellen IL-10 induzieren kann, wenn es in ausreichender Menge vorhanden ist. 4.4 Regulation der Blimp-1 und c-Maf Expression in TH 1 Zellen Bisher konnten Studien anderer Arbeitsgruppen bereits zeigen, dass die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen strikt vom IL-12/STAT4-Signalweg abhängt, der gleichzeitig auch die TH 1 Differenzierung durch die Induktion von T-bet maßgeblich initiiert [6, 59]. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass auch der ERK-Signalweg downstream des TZR-Signals eine essentielle Rolle für die Induktion von IL-10 in TH 1 Zellen spielt [59]. Im Gegensatz dazu konnten die bisherigen in vitro und in vivo Experimente in dieser Studie eine neue funktionelle Rolle der Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen definieren. Deshalb stellte sich im nächsten Schritt die Frage, ob die Expression von Blimp-1 und c-Maf selbst von genau diesen Signalen in TH 1 Zellen induziert und reguliert wird. 4.4.1 Rolle von IL-12 für die Expression von Blimp-1 und c-Maf Um zu untersuchen, ob die Expression von Blimp-1 und c-Maf direkt von der Stärke des IL-12 Signals abhängt, wurden naive T-Zellen in Anwesenheit steigender IL-12 Konzentrationen kultiviert. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnte zunächst eine konzentrationsabhängige Induktion von Il10 beobachtet werden. Weiter zeigte dieses Experiment deutlich, dass IL-12 in der Tat auch die Expression von Prdm1 und Maf in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise induziert (Abb. 4.15). Abb. 4.15: Die Expression von Il10, Prdm1 und Maf in TH 1 Zellen ist IL-12 abhängig. Relative Il10, Prdm1 und Maf Expression in T-Zellen, die 48h in Anwesenheit steigender IL-12 Konzentrationen (0; 0,1; 1; 10; 100 ng/ml) kultiviert wurden. Ergebnisse 62 4.4.2 Rolle von STAT4 für die Expression von Blimp-1 und c-Maf Da das IL-12 Rezeptorsignal hauptsächlich durch die Aktivierung (Phosphorylierung) des Transkriptionsfaktors STAT4 in den Zellkern übertragen wird, wurde außerdem die IL-10, Blimp-1 und c-Maf Expression in STAT4-defizienten (STAT4-/- ) TH 1 Zellen untersucht. Wie in Abb. 4.16 ersichtlich, war die IL-10, Blimp-1 sowie c-Maf Expression in TH 1 Zellen fast vollständig abhängig von STAT4. Als negative Kontrolle dienten TH 0 Zellen. Abb. 4.16: Die Expression von IL-10, Blimp-1 und Maf in TH 1 Zellen ist STAT4 abhängig. WT oder STAT4-defiziente (STAT4-/- ) naive T-Zellen wurden 72 Stunden unter TH 0 oder TH 1 Bedingungen kultiviert.(A) Konzentration von IL-10 im Kulturüberstand. (B) Relative Blimp-1 mRNA und Proteinexpression. (C) Relative Maf Expression. Da STAT4 selbst als Transkriptionsfaktor fungiert, stellte sich anschließend die Frage, ob die Expression von Blimp-1 auch durch eine direkte Bindung von STAT4 an den Prdm1 Lokus reguliert wird. Um diesen Punkt zu adressieren wurde ein Chromatin-ImmunpräzipitationsAssay durchgeführt (ChIP), mit dem Protein-DNA-Interaktionen direkt in vivo nachgewiesen werden können. Hierfür wurden TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung fixiert und anschließend lysiert um das Chromatin zugänglich zu machen. Nach Scheren der DNA in durchschnittlich 300-500 bp große Teile, wurden womögliche STAT4-DNA Komplexe mit einem spezifischen STAT4 Antikörper immunpräzipitiert und anschließend ausgewählte Sequenzbereiche per qRT-PCR quantifiziert. Dabei lag der Fokus dieser Analyse auf dem Promoterbereich des Prdm1 Gens, der im Bereich -1 kb bis -2 kb vor dem Transkriptionsstart drei verschiedene konservierte nicht-kodierende Sequenzen (CNS; CNS-1, CNS-1.5, CNS-2) aufweist (Abb. 4.17A), in denen verschiedene STAT Bindungsmotive per in silico Analyse identifiziert werden konnten (siehe Abb. 8.1 im Anhang). Um die Spezifität des ChIP Assays zu kontrollieren wurden verschiedene Negativkontrollen mitgeführt. Zunächst wurde die Anreicherung der konservierten DNA-Abschnitte in TH 1 Zellen mit der in STAT4-defizienten TH 1 Zellen verglichen. Außerdem wurden die Ergebnisse mit Hilfe einer Isotyp-Antikörper Kontrolle normiert (x-fache Anreicherung zum Isotyp), um unspezifische Bindungen des STAT4 Antikörpers auszugleichen. Als weitere Kontrolle wurde die Anreicherung der CNS-Regionen mit der einer Region verglichen, die keine STAT4 Bindungsstellen besitzt. Ergebnisse 63 Abb. 4.17: STAT4 bindet an konservierte nicht-kodierende Sequenzen im Prdm1 Promoter. (A) Schematische Darstellung des Konservierungsgrades des Prdm1 Lokus vor der Transkriptionsstartstelle zwischen Maus und Mensch. Konservierte nicht kodierende Regionen (CNS) sind rot gefärbt. Positionen der CNS beziehen sich auf das Startkodon und sind in kb angegeben. (B) ChIP Analyse der STAT4 Bindung an CNS Regionen im Prdm1 Promoter in STAT4 kompetenten (WT) oder defizienten (STAT4-/- ) TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung. Eine Region (neg), die keine STAT4 Bindungsstelle aufweist, diente als interne Negativkontrolle. Der Chromatin-Immunpräzipitations-Assay in STAT4-kompetenten (WT) TH 1 Zellen zeigte eine signifikante Anreicherung aller drei untersuchten CNS Regionen des Prdm1 Promoterbereichs gegenüber STAT4-defizienten TH 1 Zellen (Abb. 4.17B). Die negative Region hingegen wurde erwartungsgemäß nicht verstärkt in WT TH 1 Zellen angereichert. Diese Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen maßgeblich durch den IL-12/STAT4-Signalweg gesteuert wird. Außerdem reguliert STAT4 hierbei die Expression von Blimp-1 durch direkte Bindung an konservierte nichtkodierende Sequenzen im Prdm1 Promoter. 4.4.3 Rolle von T-bet für die Expression von Blimp-1 und c-Maf Der IL-12/STAT4-Signalweg ist essentiell für die TH 1 Differenzierung von naiven TH -Zellen, da er den Mastertranskriptionsfaktor T-bet (kodiert durch Tbx21 ) induziert. T-bet wiederum steuert maßgeblich das TH 1-spezifische Genexpressionsprogramm und unterdrückt zusätzlich die Polarisierung in andere TH -Zell-Populationen wie zum Beispiel TH 2 Zellen. Deshalb sollte auch die T-bet-Abhängigkeit von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen untersucht werden. Analog zur Analyse der STAT4-Abhängigkeit wurde die Prdm1 und Maf Expression in T-bet kompetenten (WT) und defizienten (Tbx21 -/-) TH 0 und TH 1 Zellen miteinander verglichen. Wie in Abb. 4.18 zu erkennen führt die Abwesenheit von T-bet in T-Zellen, die unter TH 1 polarisierenden Bedingungen aktiviert wurden, zu einer schwächer ausgeprägten Induktion von Prdm1 und Maf im Vergleich zu T-bet-kompetenten Zellen. Diese Daten suggerieren, dass ein Teil der IL-12/STAT4-induzierten Prdm1 und Maf Expression in TH 1 Zellen auch Ergebnisse 64 Abb. 4.18: Die Expression von Prdm1 und Maf ist reduziert in T-bet-defizienten TH 1 Zellen im Vergleich zu T-bet-kompetenten Zellen. Relative Prdm1 und Maf Expression in WT oder Tbx21 defizienten (Tbx21 -/-) TH 0 und TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung. von T-bet abhängt. Gleichzeitig lässt sich aber aus dem Vergleich mit TH 0 Zellen schlussfolgern, dass T-bet nicht der Hauptinduktor von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen ist, da T-betdefiziente T-Zellen, im Gegensatz zu STAT4-defizienten T-Zellen (siehe Abb. 4.16B+C), immer noch beide Faktoren induzieren konnten. 4.4.4 Rolle von ERK für die Expression von Blimp-1 und c-Maf Neben den TH 1-induzierenden Faktoren IL-12 und STAT4 hängt die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen auch vom ERK-Signalweg beziehungsweise der Stärke des T-Zell-Rezeptorsignals ab [59]. Während das IL-12/STAT4-Signal naiven T-Zellen ihre TH 1-Spezifität verleiht, scheint die Aktivierung des ERK-Signalwegs durch den T-Zell-Rezeptor eine generelle Voraussetzung für die IL-10 Produktion in verschiedenen TH -Zell-Subtypen zu sein. Um zu überprüfen, ob die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen auch ERK-abhängig ist, wurden naive T-Zellen in Anwesenheit eines ERK-Inhibitors unter TH 1-polarisierenden Bedingungen aktiviert und kultiviert. Wie in Abb. 4.19A zu sehen führte die Blockade des ERK-Signals erwartungsgemäß zu einer spezifischen Reduktion der IL-10 Produktion während die IFN-❣ Produktion unverändert blieb. Interessanterweise wurde auch die relative Expression von Prdm1 und Maf in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise vom ERK-Inhibitor blockiert (Abb. 4.19B). Zusammenfassend lässt sich also festhalten, dass die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen von den gleichen Signalen (IL-12/STAT4, ERK) abhängt, die auch schon als essentiell für die IL-10 Produktion beschrieben wurden. Ergebnisse 65 Abb. 4.19: Die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen ist ERK abhängig. (A) Frequenz von IL-10- und IFN-❣-produzierenden T-Zellen (nach PMA/Ionomyzin Restimulation) und (B) relative Prdm1 und Maf Expression in T-Zellen, die 96h unter TH 1 polarisierenden Bedingungen und in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen des ERK-Inhibitors PD184352 (0,00; 0,08; 0,16 M) kultiviert wurden. 4.5 Molekulare Regulation der IL-10 Produktion von TH 1 Zellen Die bisherigen Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen vor allem von den Transkriptionsfaktoren STAT4 und Blimp-1 abhängt. Im Gegensatz dazu ist der Transkriptionsfaktor c-Maf zunächst entbehrlich für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen, jedoch führt seine Überexpression sehr wohl zu einer starken IL-10 Induktion. Auf molekularer Ebene konnte gezeigt werden, dass STAT4 selbst die Expression von Blimp-1 durch direkte Bindung an den Promoterbereich des Prdm1 Lokus induziert. Im Folgenden sollte nun näher untersucht werden wie die Expression von IL-10 selbst durch diese drei Faktoren mechanistisch reguliert wird. 4.5.1 Analyse der Bindung von Blimp-1, c-Maf und STAT4 an den Il10 Lokus 4.5.1.1 Der Il10 Lokus Im Rahmen unterschiedlicher Studien zur molekularen Regulation von IL-10 in T-Zellen konnten bereits verschiedene konservierte nicht-kodierende Sequenzen upstream von Il10 entdeckt werden (CNS 0.5, CNS-4.5, CNS-9, CNS-20). Abb. 4.20 zeigt eine schematische Übersicht dieser Regionen bezogen auf die Transkriptionsstartstelle. Besonders die Region CNS-9 konnte bereits als sogenannte Verstärker-Region in TH 1 und TH 2 Zellen identifiziert werden, während zum Beispiel die Region CNS-4.5 nur in Makrophagen regulatorisch aktiv ist und in T-Zellen keine funktionelle Bedeutung zu haben scheint [55, 56, 84]. Bei der in silico Analyse dieser konservierten Regionen konnten STAT Bindungsmotive in allen Regionen identifiziert werden, während potentielle Bindungsstellen für Blimp-1 nur in CNS-9 zu finden waren (siehe Abb. 8.2 im Anhang). Ergebnisse 66 Abb. 4.20: Konservierte nicht-kodierende Sequenzen upstream von Il10. Schematische Darstellung des Konservierungsgrades des Il10 Lokus vor der Transkriptionsstartstelle zwischen Maus und Mensch. Konservierte nicht-kodierende Regionen (CNS) sind rot gefärbt. Positionen der CNS beziehen sich auf das Startkodon und sind in kb angegeben. 4.5.1.2 Analyse der Bindung an konservierte Bereiche des Il10 Lokus Mit Hilfe von Chromatin-Immunopräzipitations-Assays sollte untersucht werden, ob die regulatorische Funktion von Blimp-1, c-Maf und STAT4 auf der direkten Bindung dieser Faktoren an den Il10 Lokus beruht. Analog zur Analyse der STAT4 Bindung an den Prdm1 Lokus (siehe Abb. 4.17) wurden TH 1 Zellen 72 Stunden nach Aktivierung fixiert und anschließend Protein-DNA Komplexe mit spezifischen Antikörpern für Blimp-1, c-Maf oder STAT4 immunpräzipitiert. Abb. 4.21: Blimp-1, c-Maf und STAT4 binden an die CNS-9 Region upstream von Il10 in TH 1 Zellen. ChIP Analyse der Blimp-1, c-Maf und STAT4 Bindung an CNS Regionen im Il10 Lokus in TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung. Die Ergebnisse dieses Experiments (Abb. 4.21) zeigen, dass alle drei Faktoren an die Verstärkerregion CNS-9 binden, was die Relevanz dieses DNA Bereichs für die Regulation von IL-10 noch einmal betont. Für STAT4 konnte außerdem eine signifikante Anreicherung der Promoterregion CNS-0.5 detektiert werden. 4.5.2 Rolle von STAT4 und Blimp-1 für Histonmodifizierungen am Il10 Lokus Bevor Transkriptionsfaktoren an die DNA binden können, müssen diese Regionen zunächst „geöffnet“ werden. Die Zugänglichkeit der DNA wird über biochemische Modifizierungen der Ergebnisse 67 Histone reguliert, die das Chromatin entweder in eine offene oder geschlossene Konformation versetzen. Eine offene oder auch aktive Histonmodifizierung ist zum Beispiel die Histon H3 Lysin 4 Dimethylierung (H3K4me2), während im Gegensatz dazu die Histon H3 Lysin 27 Trimethylierung (H3K27me3) ein Merkmal für eine geschlossene Konformation des Chromatins ist. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die in dieser Studie analysierten Faktoren auch diesen epigenetischen Prozess der Genregulation beeinflussen. Hierfür wurde das Auftreten von verschiedenen Histonmodifizierungen per ChIP Assay in jeweils STAT4- oder Blimp-1defizienten TH 1 Zellen mit dem in WT Zellen verglichen. Die Analyse c-Maf-defizienter Mäuse wurde an dieser Stelle ausgelassen, da c-Maf-defiziente TH 1 Zellen keinen IL-10 Defekt aufweisen und daher eine Beteiligung von c-Maf an diesem transkriptionellen Initiationsprozess unwahrscheinlich erscheint. Abb. 4.22: STAT4 reguliert H3K4me2 Histonmodifizierungen im Il10 Lokus in TH 1 Zellen. ChIP Analyse aktivierender (H3K4me2) und suppremierender (H3K4me27) Histonmodifizierungen von CNS Regionen im Il10 Lokus in (A) Blimp-1- oder (B) STAT4-kompetenten oder -defizienten TH 1 Zellen. Interessanterweise korrelierte die Bindung von STAT4 an den Il10 Lokus (Abb. 4.21) mit verstärkten aktivierenden H3K4me2 Histonmodifizierungen in genau denselben Bereichen (CNS-0.5 und CNS-9), die zusätzlich in STAT4-defizienten TH 1 Zellen signifikant reduziert waren (Abb. 4.22B). Die negative H3K27me3 Modifizierung hingegen wurde nicht durch STAT4 reguliert. Gleichermaßen hatte die Abwesenheit von Blimp-1 keine Auswirkung auf die untersuchten Histonmodifizierungen (Abb. 4.22A). Anhand dieser Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass STAT4 die IL-10 Produktion in TH 1 Zellen gleich auf mehreren Ebenen reguliert. Erstens nimmt STAT4 durch Bindung an den Il10 Lokus selbst direkten Einfluss auf die Genexpression (Abb. 4.21). Zweitens wird auch die Zugänglichkeit dieser DNA Regionen in Form von aktivierenden Histonmodifizierungen durch STAT4 reguliert (Abb. 4.22B). Drittens induziert STAT4 die transkriptionellen Regulatoren Blimp-1 und c-Maf (Abb. 4.16 und Abb. 4.17), welche wiederum genauso wie STAT4 direkt in der CNS-9 Verstärkerregion des Il10 Lokus binden und so maßgeblich die IL-10 Expression steuern (Abb. 4.21). Ergebnisse 68 4.5.3 Blimp-1 und c-Maf: unabhängige oder synergistische Wirkungsweise? Da die ektopische Expression von Blimp-1 wie auch c-Maf zu einer signifikanten Induktion von IL-10 in TH 1 Zellen führte (Abb. 4.6 und 4.13) und beide Faktoren in enger Nachbarschaft an den Il10 Lokus binden (Abb. 4.21), stellte sich die Frage, ob sich beide Faktoren in einer synergistischen Art und Weise aktivierend auf die Genexpression auswirken. Um diesen Punkt zu adressieren wurde das Transaktivierungspotential beider Faktoren in einem IL-10-Reporter Assay näher untersucht. Abb. 4.23: Die gleichzeitige Bindung von Blimp-1 und c-Maf an CNS-9 führt zu einer synergistischen Induktion der IL-10 Reporter-Aktivität. HEK293T Zellen wurden mit einem CNS-9- (pXPG-CNS-9) oder CNS-4.5-spezifischen (pXPG-CNS-4.5) IL-10-Reporter Konstrukt und zusätzlich mit Expressionsplasmiden für Blimp-1 und/oder c-Maf kotransfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit PMA/Ionomyzin restimuliert und anschließend die Aktivität des Reporterproteins Renilla Luziferase bestimmt. Um Unterschiede in der Transfektionseffizienz auszugleichen wurde die Aktivität der Renilla Luziferase mit Hilfe einer unabhängig expremierten Firefly Luziferase normiert. Zu diesem Zweck wurde die regulatorisch aktive Verstärkerregion CNS-9 (Blimp-1 und c-Maf Bindung in TH 1 Zellen nachgewiesen, siehe Abb. 4.21) vor ein Reportergen (Renilla Luziferase) in einem Überexpressionsplasmid kloniert (pXPG-CNS-9). In Bezug auf CNS-9 unterlag die Expression des Reportergens somit dem gleichen regulatorischen Einfluss wie Il10. Als negative Kontrolle wurde ein weiteres Konstrukt generiert, welches die inaktive CNS-4.5 Region (keine Bindung von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen detektierbar) anstelle der CNS-9 Region enthielt (pXPG-CNS-4.5). Um einen möglichen Synergieeffekt durch die gleichzeitige Bindung von Blimp-1 und c-Maf an CNS-9 nachweisen zu können, wurde das Reporterkonstrukt entweder alleine oder zusammen mit den beiden Transkriptionsfaktoren in der humanen embryonalen Nierenzelllinie HEK293T überexpremiert. Da diese Zelllinie keine endogene Blimp-1 oder c-Maf Expression aufweist, konnte zusätzlich auch der aktivierende Einfluss der Faktoren getrennt voneinander untersucht werden. Als Read-out wurde 24 Stunden nach Transfektion der HEK293T Zellen die Aktivität des Reporterproteins Renilla Luziferase gemessen, die direkt mit der Expression des Reportergens korreliert. Um Unter- Ergebnisse 69 schiede in der Transfektionseffizienz zwischen den verschiedenen Proben auszugleichen, wurde die Aktivität der Renilla Luziferase mit Hilfe einer weiteren unabhängigen Luziferase (Firefly Luziferase) normiert, die durch ein weiteres separates CNS-freies Expressionsplasmid kodiert wurde und somit nicht dem regulatorischen Einfluss von Blimp-1 und/oder c-Maf unterlag. Abb. 4.23 veranschaulicht, dass die Kotransfektion von pXPG-CNS-9 in Kombination mit Blimp-1 oder c-Maf alleine zu keiner signifikanten Induktion des relativen Reportersignals im Vergleich zur pXPG-CNS-9 Einzeltransfektion (Control) oder zur korrespondierenden Kotransfektion mit pXPG-CNS-4.5 führte. Wenn beide Faktoren allerdings zusammen überexpremiert wurden (Blimp-1/c-Maf), führte dies zu einer dramatischen Aktivitätssteigerung des pXPG-CNS-9 Konstrukts, während die negative CNS-4.5 Region keine derartige aktivierende Wirkung zeigte. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die gemeinsame Bindung von Blimp-1 und c-Maf an die CNS-9 Verstärkerregion des Il10 Lokus zu einer synergistischen Aktivierung der Genexpression im Rahmen eines Reporter Assays führt, während im Gegensatz die alleinige Bindung von Blimp-1 oder c-Maf die Expression nur sehr viel schwächer antreibt. Abb. 4.24: Die ektopische Expression von c-Maf ist nicht ausreichend um den IL-10Defekt Blimp-1-defizienter TH 1 Zellen zu kompensieren. WT oder Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen wurden 24h nach Aktivierung mit einem retroviralen c-Maf- (Maf RV) oder Kontrollplasmid (GFP RV) transduziert. 72h später wurde (A) die IL-10 Expression dieser Zellen auf mRNA Ebene und (B) die IL-10 und IFN-❣ Produktion nach PMA/Ionomyzin Restimulation per intrazellulärer Färbung durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt ist die Frequenz der IL-10+ und IFN-❣+ Zellen innerhalb der erfolgreich transduzierten CD4+ GFP+ Zellen. Da der eben beschriebene Reporter Assay in einer humanen Nierenzelllinie durchgeführt wurde, sollte der Synergieeffekt von Blimp-1 und c-Maf zusätzlich auch in TH 1 Zellen analysiert werden. Hierfür wurde c-Maf in WT oder Blimp-1-defizienten TH 1 Zellen überexpremiert, um zu klären, ob c-Maf auch in der Abwesenheit von Blimp-1 in der Lage ist IL-10 zu induzieren oder ob dafür beide Faktoren präsent sein müssen. Wie in Abb. 4.24 ersichtlich führte die Überexpression von c-Maf in Blimp-1-defizienten Ergebnisse 70 TH 1 Zellen zu einer nur sehr schwachen Induktion von IL-10 verglichen zur c-Maf-vermittelten IL-10 Induktion in Blimp-1-kompetenten TH 1 Zellen. Dieser Vergleich macht also deutlich, dass die Überexpression von c-Maf nicht ausreicht, um den IL-10-Defekt Blimp-1-defizienter TH 1 Zellen auszugleichen und verdeutlicht, dass Blimp-1 und c-Maf in einer synergistischen Art und Weise kooperieren um IL-10 zu induzieren. 4.6 Funktionelles Verhältnis zwischen Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen Die Daten dieser Studie demonstrierten bislang, dass die beiden Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen regulieren können. Aus diesem Grund ergab sich die Fragestellung nach dem funktionellen Verhältnis dieser beiden Faktoren. Die nähere Untersuchung der gegenseitigen Regulation von Blimp-1 und c-Maf sollte das Zusammenspiel dieser beiden Faktoren und somit das für die IL-10 Regulation in TH 1 Zellen verantwortliche transkriptionelle Netzwerk detaillierter beleuchten. 4.6.1 Einfluss von Blimp-1 auf die c-Maf Expression Um den Einfluss von Blimp 1 auf die Expression von c-Maf analysieren zu können, wurde die Blimp-1 Expression in TH 1 Zellen moduliert (Blimp-1-Defizienz oder Überexpression) und anschließend der Effekt auf die c-Maf Expression untersucht. Abb. 4.25A zeigt die Expression von Maf vergleichend in Blimp-1-kompetenten und defizienten TH 1 Zellen. Außerdem wurde Maf in Kontroll- oder Prdm1 -transduzierten TH 1 Zellen analysiert (Abb. 4.25C). Beide Ansätze demonstrieren, dass weder die Abwesenheit noch die ektopische Expression von Blimp-1 einen Einfluss auf die c-Maf Expression haben und veranschaulichen, dass c-Maf in TH 1 Zellen unabhängig von Blimp-1 exprimiert wird. Eine andere Möglichkeit der Einflussnahme von Blimp-1 auf c-Maf könnte über die Regulation der Bindung von c-Maf an den Il10 Lokus vermittelt werden. In diesem Fall würde man von einem kooperativen Charakter der Blimp-1 und c-Maf Bindung an die DNA sprechen. Um dieses Szenario näher zu beleuchten, wurde die Bindung von c-Maf an Il10 in Prdm1 WT und KO TH 1 Zellen per ChIP Assay miteinander verglichen. In Analogie zu den Expressionsdaten (siehe Abb. 4.25A) spielte die An- oder Abwesenheit von Blimp-1 auch keine Rolle für die Bindung von c-Maf an den Il10 Lokus (Abb. 4.25B) Dieses Ergebnis zeigt, dass c-Maf nicht nur unabhängig von Blimp-1 exprimiert wird, sondern auch autark an den Il10 Lokus bindet. Da Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen einen eindeutigen IL-10-Defekt aufweisen machen diese Daten außerdem deutlich, dass in Abwesenheit von Blimp-1 die Anwesenheit und Bindung von c-Maf an den Il10 Lokus nicht ausreicht um IL-10 in TH 1 Zellen zu induzieren. Ergebnisse 71 Abb. 4.25: Die Expression und Bindung von c-Maf an Il10 in TH 1 Zellen ist unabhängig von Blimp-1. (A) Relative Maf Expression in Blimp-1-kompetenten (WT) oder –defizienten (KO) TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung. (B) ChIP Analyse der c-Maf Bindung an CNS Regionen im Il10 Lokus in Prdm1 WT oder KO TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung. (C) TH 1 Zellen wurden 24h nach Aktivierung mit einem retroviralem Blimp-1 (Prdm1 RV) oder Kontrollplasmid (GFP RV) transduziert. Relative c-Maf mRNA Expression sortierter GFP+ Zellen 72h nach Blimp-1 oder Kontrolltransduktion. 4.6.2 Einfluss von c-Maf auf die Blimp-1 Expression Im Umkehrschluss sollte überprüft werden, inwieweit Blimp-1 in TH 1 Zellen von c-Maf reguliert wird und ob der aktivierende Einfluss von c-Maf auf IL-10 auch indirekt über die Regulation der Blimp-1 Expression vermittelt wird. Hierfür wurde die Blimp-1 Expression nach c-Maf-Modulation (c-Maf Defizienz oder Überexpression) analysiert. Während die Abwesenheit von c-Maf keinen Einfluss auf die Blimp-1 Expression hatte (Daten nicht aufgeführt), führte die c-Maf-Überexpression in TH 1 Zellen interessanterweise zu einer verstärkten Blimp-1 mRNA und Proteinexpression in Relation zu kontrolltransduzierten Zellen. Der Vergleich mit c-Maf überexpremierenden TH 0 Zellen zeigte, dass c-Maf jedoch nur unter TH 1 Bedingungen in der Lage war Blimp-1 signifikant zu verstärken (Abb. 4.26A). Da eine andere Arbeitsgruppe bereits zwei konservierte MARE (Maf response element) Bindungsmotive im Prdm1 Lokus identifizieren konnte (CNS-2 und CNS+14; siehe Abb. 8.1 im Anhang), die maßgeblich an der Bach-2-vermittelten Suppression von Blimp-1 in B-Zellen beteiligt sind [85], sollte im Folgenden untersucht werden, ob c-Maf die Blimp-1 Expression durch direkte Bindung an diese aktiven regulatorischen Bereiche beeinflusst. In der Tat zeigten ChIP Analysen, dass c-Maf an die intronische CNS+14 Region in TH 1 Zellen bindet (Abb. 4.26B). Es kann daher spekuliert werden, dass c-Maf selbst die Expression von Blimp-1 durch Bindung an CNS+14 verstärken kann. Alles in allem zeigen diese Daten, dass c-Maf nach Überexpression in der Tat die Expression von Blimp-1 in TH 1 Zellen durch direkte Bindung an eine intronische CNS-Region im Prdm1 Lokus regulieren kann. Daher lässt sich ableiten, dass c-Maf die IL-10 Produktion in TH 1 Zellen in Teilen auch indirekt über die Modulation der Blimp-1 Expression verstärken kann. Ergebnisse 72 Abb. 4.26: Die ektopische Expression von c-Maf verstärkt die Expression von Blimp-1 in TH 1 Zellen. (A) TH 0 oder TH 1 Zellen wurden 24h nach Aktivierung mit einem retroviralem c-Maf (Maf RV) oder Kontrollplasmid (GFP RV) transduziert. Relative Blimp-1 mRNA und Proteinexpression sortierter GFP+ Zellen 72h nach c-Maf oder Kontrolltransduktion. (B) ChIP Analyse der c-Maf Bindung an CNS Regionen im Prdm1 Lokus in TH 1 Zellen 72h nach Aktivierung. 4.7 Funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die Notch-vermittelte IL-10 Produktion von TH 1 Zellen Vorangegangene Studien in dieser Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass die Kostimulation von TH 1 Zellen durch den Notch-Rezeptor Signalweg zu einer starker Induktion der IL-10 Expression führt [71, 72]. Deshalb stellte sich die Frage ob die Notch-vermittelte IL-10 Expression ebenfalls Blimp-1- und/oder c-Maf-abhängig ist oder ob Notch, dessen intrazelluläre Domäne ebenfalls als Transkriptionsfaktor fungiert, unabhängig von diesen beiden Faktoren in der Lage ist IL-10 zu induzieren. 4.7.1 Notch-vermittelte IL-10 Expression in Abwesenheit von Blimp-1 oder c-Maf Um diese Frage zu addressieren wurden Notch-stimulierte WT und Blimp-1- beziehungsweise c-Maf-defiziente TH 1 Zellen hinsichtlich ihrer IL-10 Expression verglichen. Die Ergebnisse in Abb. 4.27 demonstrieren, dass die Notch-vermittelte IL-10 Expression von TH 1 Zellen sowohl von Blimp-1 als auch von c-Maf abhängt. Dies ist interessant, da konventionell-stimulierte c-Maf-defiziente TH 1 Zellen keinen IL-10 Defekt aufweisen (Abb. 4.12). Daher lässt sich spekulieren, dass Notch die IL-10 Expression von TH 1 Zellen nicht direkt steuert, sonder vielmehr indirekt, über die Modulation von IL-10-regulierenden Transkriptionsfaktoren wie Blimp-1 und c-Maf, Einfluss nimmt. Weiter untermauern diese Experimente die kritische Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen, da eine Aktivierung des Notch Signalwegs nicht in der Lage ist den IL-10-Defekt Blimp-1-defizienter TH 1 Zellen zu kompensieren. Ergebnisse 73 Abb. 4.27: Die Notch-vermittelte IL-10 Expression von TH 1 Zellen ist sowohl Blimp-1- als auch c-Maf-abhängig. Naive Blimp-1-kompetente bzw. -defiziente sowohl als auch c-Maf-kompetente bzw. -defiziente CD4+ TH -Zellen wurden unter TH 1 Bedingungen und in der Anwesenheit des NotchLiganden Dll4 kultiviert. An Tag 3 der Kultur wurde der Kulturüberstand entnommen und die Konzentration an IL-10 mittels ELISA bestimmt. 4.7.2 Einfluss von Notch auf die Blimp-1 und c-Maf Expression Um die Hypothese zu untersuchen, dass Notch seine induzierende Wirkung auf IL-10 über die Modulation bereits etablierter IL-10-regulierender Transkriptionsfaktoren in TH 1 Zellen ausübt, wurde der Einfluss von Notch auf die Expression von Blimp-1 und c-Maf analysiert. Nach der Stimulation von TH 0 oder TH 1 Zellen in An- oder Abwesenheit des Notch-Liganden Dll4 wurde deutlich, dass Notch vor allem die Expression von c-Maf in TH 1 Zellen stark induziert (Abb. 4.28B+C). Während konventionell-stimulierte TH 1 Zellen kaum c-Maf exprimierten, induzierte die Stimulation mit Dll4 sowohl auf mRNA wie auch auf Proteinebene eine signifikante Hochregulation von c-Maf. Im Gegensatz dazu beeinflusste Notch die Expression von Blimp-1 kaum. In Dll4-stimulierten TH 1 Zellen konnte lediglich eine leichte aber nicht signifikante Erhöhung der Blimp-1 mRNA und Proteinlevel detektiert werden (Abb. 4.28A). 4.7.3 Einfluss von Notch auf die Bindung von Blimp-1 und c-Maf an den Il10 Lokus Da im Rahmen dieser Studie bereits gezeigt werden konnte, dass sowohl Blimp-1 als auch c-Maf seine aktivierende Funktion durch direkte Bindung an den Il10 Lokus ausübt, sollte die DNA-Bindung dieser beiden Faktoren auch nach Notch-Kostimulation analysiert werden. Hierfür wurden Dll4-stimulierte TH 1 Zellen mit konventionell-stimulierten TH 1 Zellen verglichen. Analog zu den bisherigen Bindungsanalysen wurden TH 1 Zellen 72 Stunden nach Aktivierung fixiert und per ChIP Assay die Bindung von Blimp-1 und c-Maf an konservierte Bereiche des Il10 Lokus untersucht. Übereinstimmend mit der stark erhöhten c-Maf Expression in TH 1 Zellen nach Notch-Kostimulation (Abb. 4.28), konnte auch auf der Ebene der Ergebnisse 74 Abb. 4.28: Der Notch Signalweg verstärkt die Expression von c-Maf in TH 1 Zellen. Naive TH -Zellen wurden entweder unter TH 0 oder TH 1 polarisierenden Bedingungen und zusätzlich in Anoder Abwesenheit des Notch-Liganden Dll4 kultiviert. (A) Relative Prdm1 und (B) Maf Expression 72h nach Aktivierung. (C) Proteinexpression von Blimp-1 und c-Maf 72h nach Aktivierung analysiert per Immuno-Blot. Protein-DNA Interaktion eine verstärkte Bindung von c-Maf an konservierte Bereiche im Il10 Lokus detektiert werden (Abb. 4.29). Vor allem die Region CNS-9 zeigte ein stark erhöhte c-Maf Bindung, aber auch die in konventionell-stimulierten TH 1 Zellen unauffällige CNS-0.5 Region wurde nach Notch-Kostimulation von c-Maf gebunden. Im Gegensatz dazu wurde die Bindung von Blimp-1 nicht durch Notch beeinflusst. Abb. 4.29: Der Notch-Signalweg verstärkt die Bindung von c-Maf an CNS-Regionen im Il10 Lokus. ChIP Analyse der Bindung von Blimp-1 oder c-Maf an CNS Regionen im Il10 Lokus in Dll4-stimulierten (w/ Dll4) oder konventionell-aktivierten (w/o Dll4) TH 1 Zellen. Als Zusammenfassung lässt sich damit festhalten, dass Notch vor allem die c-Maf Expression und Bindung an den Il10 Lokus in TH 1 Zellen induziert, während Blimp-1 kaum durch Notch beeinflusst wird. Diese Ergebnisse lassen deshalb vermuten, dass die IL-10-induzierende Wirkung von Notch vor allem durch die Modulation der c-Maf Expression vermittelt wird. Ergebnisse 75 4.8 Funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen Die Ergebnisse dieser Studie konnten bisher zeigen, dass der transkriptionelle Regulator Blimp-1 absolut essentiell für die TH 1-vermittelte IL-10 Expression ist. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass eine Aktivierung des Notch-Signalwegs in TH 1 Zellen zu einer Induktion des Transkriptionsfaktors c-Maf führt, welcher in der Folge mit Blimp-1 in einer synergistischen Art und Weise kooperiert und somit die IL-10 Expression von TH 1 Zellen weiter verstärkt. An diesem Punkt stellte sich nun die Frage, ob dieses transkriptionelle Netzwerk spezifisch in TH 1 Zellen induziert wird oder ob Blimp-1 und c-Maf auch an der IL-10 Regulation in anderen Effektor-TH -Zellen, wie TH 2 und TH 17 Zellen, beteiligt sind. 4.8.1 Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen Um diese Frage zu beantworten, wurde zunächst die endogene Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen vergleichend untersucht. Diese Analyse sollte einen detaillierten Überblick über die Stärke der Blimp-1 und c-Maf Expression in den verschieden TH -Zellen liefern und damit einen ersten Hinweis auf ihre potentielle funktionelle Rolle geben. Abb. 4.30: Expressionskinetik von Il10, Prdm1 und Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. Zeitlicher Verlauf der relativen Il10, Prdm1 und Maf Expression in verschiedenen in vitro generierten TH -Zell-Subtypen. Ergebnisse 76 Zu diesem Zweck wurde zunächst die Prmd1 und Maf Expression täglich, über den gesamten Zeitraum der in vitro Differenzierung (120h), bestimmt. Zur Orientierung wurde parallel auch die Expression von Il10 in den verschiedenen Subtypen gemessen. Als negative Kontrolle dienten TH 0 Zellen. Wie in der Expressionskinetik in Abb. 4.30 zu sehen, exprimierten TH 1 Zellen konstante Il10 Level vor allem in der späten Phase der TH -Zell Differenzierung (72-120h). TH 2 und TH 17 Zellen hingegen exprimierten Il10 sehr transient mit einem Peak bei 72h bzw. 48h. Die Stärke der relativen Il10 Expression waren weitestgehend vergleichbar zwischen den Gruppen, obwohl die Peakexpression von TH 2 (72h) und TH 17 Zellen (48h) die Il10 Level in TH 1 Zellen deutlich überstieg. Im Hinblick auf die Expression der Transkriptionsfaktoren konnte in TH 1 Zellen eine sehr starke Induktion von Prdm1 detektiert werden, die ihren Höhepunkt 72h nach Aktivierung erreichte und danach leicht ab nahm aber im Vergleich zu TH 0 Zellen bis zum Ende der Kultur immer noch erhöht blieb. Im Gegensatz dazu zeigten TH 2 Zellen nur eine sehr schwache Prdm1 Induktion, die deutlich unter der in TH 1 Zellen lag (Peak 72h). In TH 17 Zellen konnte keine Induktion von Prdm1 festgestellt werden. Demgegenüber zeigte die Expression von Maf ein komplett umgekehrtes Muster. Während TH 17 Zellen konstant hohe Maf Level aufwiesen, konnte in TH 1 und TH 2 Zellen nur eine sehr geringe Maf Induktion nachgewiesen werden. Abb. 4.31: Endogene Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. Blimp-1 und c-Maf Expression in verschiedenen in vitro generierten TH -Zellen gemessen 72h nach Start der Kultur per Immuno-Blot. Um diese Ergebnisse abzusichern, wurde die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 0, TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen auch auf Proteinebene bestimmt. Abb. 4.31 zeigt die Expression 72h nach Aktivierung der T-Zellen. In Analogie zu den mRNA Daten zeigte Blimp-1 auch hier eine starke TH 1-spezifische Expression, während c-Maf nur sehr schwach in TH 1 Zellen exprimiert und vor allem in TH 17 Zellen induziert wurde. 4.8.2 IL-10-Assoziation von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen Da die Sekretion von IL-10 meist nur auf eine kleine Subpopulation innerhalb der TH 1, TH 2 oder TH 17 Zellen begrenzt ist, haben Expressionsanalysen auf Ebene der Gesamtpopulation wie in Abb. 4.30 und Abb. 4.31 nur eine limitierte Aussagekraft. Deshalb sollte zusätzlich die Expression von Blimp-1 und c-Maf auch direkt in IL-10+ und IL-10– TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen miteinander verglichen werden. Ergebnisse 77 Hierfür wurden erneut naive TH -Zellen von IL-10:GFP Reporter Mäusen als Ausgangspunkt für die in vitro TH -Zell-Differenzierung genutzt. Wie in Abb. 4.32 zu sehen ist, segregierte die Prdm1 Expression nur in TH 1 Zellen stark mit der IL-10:GFP Expression während c-Maf unter allen getesteten Bedingungen in IL-10:GFP+ Zellen gegenüber IL-10:GFP– Zellen überexprimiert war. Abb. 4.32: Assoziation von Prdm1 und Maf mit IL-10 in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. Relative Prdm1 und Maf Expression in IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– in vitro generierten TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. Die IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– Zellen wurden jeweils 72h nach Start der Kultur durchflusszytometrisch sortiert. Zusammenfassend lassen diese Daten vermuten, dass Blimp-1 in der Tat ein TH 1-spezifischer IL-10 Regulator ist, da seine Expression vorrangig unter TH 1 Bedingungen induziert wird (Abb. 4.30 und 4.31) und nur in TH 1 Zellen mit IL-10 assoziiert (Abb. 4.32). Die Expression von c-Maf hingegen wurde mit Abstand am stärksten unter TH 17 Bedingungen induziert, was vermuten lässt das c-Maf speziell in diesen Zellen eine wichtige regulatorische Rolle spielt. In der Tat konnte bereits gezeigt werden, dass c-Maf unter TH 17 Bedingungen an den Il10 Lokus bindet und den Il10 Promoter transaktivieren kann [67]. Interessanterweise korrelierte die Expression von c-Maf nicht nur in TH 17 Zellen, sondern auch in TH 1 und TH 2 Zellen mit der IL-10 Expression. Nichtsdestotrotz war die Stärke der c-Maf Expression in TH 1 und TH 2 Zellen um ein Vielfaches geringer als in TH 17 Zellen, was wahrscheinlich der Grund dafür ist, dass c-Maf in TH 1 Zellen entbehrlich für die IL-10 Produktion war. 4.8.3 IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen in Abwesenheit von Blimp-1 oder c-Maf Um direkt zu untersuchen, ob Blimp-1 und c-Maf essentiell für die IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen sind, wurde die IL-10 Produktion vergleichend zwischen Blimp-1- oder c-Maf-kompetenten beziehungsweise -defizienten TH 2 und TH 17 untersucht. Ergebnisse 78 Abb. 4.33: Die IL-10 Produktion von TH 17 Zellen ist abhängig von c-Maf. Naive TH -Zellen aus (A) Prdm1 WT oder KO oder (B) Maf WT oder KO Mäuse wurden unter TH 2 oder TH 17 Bedingungen kultiviert. Aufgetragen ist die Konzentration von IL-10 im Kulturüberstand 72h nach Beginn der Kultur. Wie in Abb. 4.33A erkenntlich ist die IL-10 Expression von TH 2 und TH 17 Zellen komplett unabhängig von Blimp-1. Diese Daten spiegeln die negativen Expressions- und IL-10Assoziationsdaten von Blimp-1 in TH 2 und TH 17 Zellen wieder. Im Gegensatz dazu beeinflusste die Abwesenheit von c-Maf spezifisch nur die IL-10 Expression von TH 17 Zellen, wie bereits vermutet wurde (Abb. 4.33B). Auf der Grundlage der vergleichenden Expressionsanalyse (Abb. 4.30 und 4.31) kann damit vermutet werden, dass c-Maf auch in TH 2 Zellen in einem zu geringen Maße exprimiert wird, als dass es eine essentielle Rolle für die IL-10 Expression spielen könnte. 4.8.4 IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen nach Blimp-1 oder c-Maf Überexpression Obwohl c-Maf-defiziente TH 1 Zellen keinen IL-10 Defekt aufweisen, führt die Überexpression von c-Maf in TH 1 Zellen zu einer starken Steigerung der IL-10 Expression. Um zu überprüfen ob c-Maf auch in TH 2 und TH 17 Zellen die Expression von IL-10 fördert, wurde c-Maf auch in diesen T-Zell-Subtypen überexprimiert und anschließend die Auswirkungen auf die Produktion von IL-10 untersucht. Außerdem stellte sich die Frage, ob die Überexpression von Blimp-1 in TH 2 und TH 17 auch zu einer IL-10-Induktion führen kann, da diese Zellen normalerweise kaum endogenes Blimp-1 und folglich auch kein Blimp-1-abhängiges IL-10 exprimieren (siehe Abb. 4.31 und Abb. 4.33A). Die Überexpression von Blimp-1 führte interessanterweise in TH 17 Zellen zu einer starken IL-10-Induktion (Abb. 4.34A). Wie in Abb. 4.31 bereits gezeigt, exprimieren TH 17 Zellen kein endogenes Blimp-1 aber stattdessen große Mengen an c-Maf. Es ist deshalb sehr wahrscheinlich, dass das artifizielle Einbringen von Blimp-1 in c-Maf-exprimierende TH 17 Zellen zu einer synergistischen IL-10-Induktion führte. Im Gegensatz dazu hatte die Überexpression Ergebnisse 79 Abb. 4.34: IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen nach Blimp-1 oder c-Maf Überexpression. TH 2 oder TH 17 Zellen wurden 24h nach Start der in vitro Kultur mit einem retroviralem Blimp-1, c-Maf oder Kontrollplasmid transduziert. Dargestellt ist die Frequenz von IL-10 Produzenten innerhalb der (A) Blimp-1 (Prdm1 RV), (B) c-Maf (Maf RV) oder kontrolltransduzierten (GFP RV) TH 2 oder TH 17 Zellen (Analysefenster auf CD4+ GFP+ ) an Tag 5 nach Restimulation. von Blimp-1 in TH 2 Zellen keinen Einfluss auf die IL-10 Produktion, was aber möglicherweise mit der ohnehin schon starken IL-10 Expression (bereits ca. 60% IL-10+ TH 2 Zellen nach Kontrolltransduktion) in diesen Experimenten zu erklären ist. Die Überexpression von c-Maf hingegen führte in TH 2 Zellen zu einer signifikanten Steigerung der IL-10 Produktion, während TH 17 Zellen vergleichbare Frequenzen an IL-10-Produzenten aufwiesen (Abb. 4.34B). Die drastische Induktion von IL-10 in TH 2 Zellen untermauert die Vermutung, dass sich die geringe endogene Expression von c-Maf in TH 2 Zellen als limitierend für die IL-10 Expression darstellt, wobei sich das Ausbleiben der IL-10-Induktion in TH 17 Zellen womöglich mit den bereits hohen endogenen c-Maf Leveln in diesen Zellen erklären lässt (siehe Abb. 4.31). 4.9 Funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von regulatorischen T-Zellen Neben pro-inflammatorischen TH -Zellen exprimieren vor allem auch regulatorische TH -ZellPopulationen das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 als Mechanismus der Immunsuppression. Im Folgenden sollte deshalb untersucht werden, ob die Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf auch eine funktionelle Rolle für die IL-10 Produktion von klassischen Foxp3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) oder IL-27-induzierten Typ-1-regulatorischen T-Zellen (TR 1) haben. Ergebnisse 80 4.9.1 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von Foxp3+ Tregs Aus Vorversuchen ist bekannt, dass während einer T.gondii Infektion nicht nur IL-10-produzierende TH 1 Zellen, sondern auch IL-10+ Foxp3+ Tregs enstehen. Deshalb wurde dieses Modell genutzt, um auch die funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von Foxp3+ Tregs zu untersuchen. Im Detail wurden hierfür aus der Milz infizierter WT bzw. Blimp-1- oder c-Maf-defizienter Mäuser Zellen isoliert und ex vivo mit PMA/Ionomyzin restimuliert. Um anschließend IL-10+ Foxp3+ Tregs zu untersuchen, wurden Foxp3 und IL-10 gleichzeitig intrazellulär bzw. intranukleär angefärbt und danach durchflusszytometrisch analysiert. Abb. 4.35: Die IL-10 Produktion von Foxp3+ Tregs während einer T.gondii Infektion ist abhängig von Blimp-1. Ex vivo isolierte Lymphozyten aus der Milz von (A) Prdm1 WT und KO bzw. (B) Maf WT und KO Mäusen wurden 8 Tage nach T.gondii Infektion mit PMA/Ionomyzin restimuliert und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. Dargestellt ist die Frequenz an Foxp3+ Zellen innerhalb der CD4+ TH -Zellen und die Frequenz an IL-10-produzierenden Zellen innerhalb der Foxp3+ Tregs (Analysefenster CD4+ Foxp3+ ). Die Ergebnisse dieses Versuches zeigen eindeutig, dass die IL-10 Produktion von Foxp3+ Tregs vor allem von Blimp-1 abhängt (Abb. 4.35). Nichtsdestotrotz weisen auch c-Mafdefiziente Mäuse leicht verminderte Frequenzen von IL-10+ Tregs in der Milz auf verglichen mit ihren WT Zuchtgeschwistern. Überraschenderweise zeigen beide Mausstämme stark erhöhte Frequenzen an CD4+ Foxp3+ T-Zellen in der Milz. Für Blimp-1-defiziente Mäuse ist dieser Phänotyp bereits beschrieben und lässt sich mit der anti-proliferativen Funktion von Blimp-1 erklären (Übersicht in [86]). Um die Frage zu beantworten, warum c-Maf-defiziente Mäuse während einer T.gondii Infektion erhöhte Foxp3+ Treg Frequenzen aufweisen, bedarf es in der Zukunft weiterer Experimente, die jedoch die Zielsetzung dieser Arbeit übersteigen. 4.9.2 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TR 1 Zellen In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass das Zytokin IL-27 maßgeblich die Induktion von suppressiven Foxp3-negativen IL-10-produzierenden T-Zellen vermittelt [44, 45, 46]. Da Ergebnisse 81 diese Zellen neben IL-10 selbst nur verhältnismäßig geringe Mengen an pro-inflammatorischen Effektorzytokinen produzieren, weisen sie die gleichen Charakteristika auf wie die schon zuvor beschriebenen TR 1 Zellen, die durch chronische Aktivierung in Anwesenheit von IL-10 selbst generiert wurden [43]. Interessanterweise konnte darüber hinaus herausgefunden werden, dass TGF-❜ die IL-27-induzierte IL-10 Expression in T-Zellen immens verstärkt [44]. Es war deshalb von Interesse herauszufinden, ob Blimp-1 und/oder c-Maf auch an der Regulation der IL-10 Expression in IL-27- oder IL-27/TGF-❜-induzierten TR 1 Zellen beteiligt sind. 4.9.2.1 Expression von Blimp-1 und c-Maf in TR 1 Zellen Um zunächst erneut einen detaillierten Überblick über die Expressionsstärke von IL-10, Blimp-1 und c-Maf nach IL-27 Stimulation zu erhalten, wurde erneut die Il10, Prmd1 und Maf Expression täglich, über den gesamten Zeitraum der in vitro Differenzierung (120h), bestimmt. Um den Einfluss von TGF-❜ näher zu untersuchen wurden zusätzlich auch IL-27/TGF-❜stimulierte T-Zellen analysiert. TH 0 Zellen fungierten erneut als negative Kontrolle (Abb. 4.36). Abb. 4.36: Expressionskinetik von Il10, Prdm1 und Maf in IL-27- und IL-27/TGF-❜stimulierten T-Zellen. Zeitlicher Verlauf der relativen Il10, Prdm1 und Maf Expression in TH 0, IL-27- und IL-27/TGF-❜-stimulierten T-Zellen. Ergebnisse 82 Überraschenderweise verhielt sich die Expression von Blimp-1 und c-Maf in diesem Experiment stark gegensätzlich. Während Blimp-1 vor allem nach alleiniger IL-27-Stimulation induziert wurde, war für die Induktion von c-Maf die Anwesenheit von IL-27 und TGF-❜ ausschlaggebend. An dieser Stelle ist es wichtig zu erwähnen, dass die Anwesenheit von TGF-❜ zu einer Inhibition von Blimp-1 bei gleichzeitiger Verstärkung der IL-10 und c-Maf Produktion führte. Diese Expressionsdaten lassen vermuten, dass Blimp-1 und c-Maf auch eine entscheidende Rolle für die IL-10 Expression von TR 1 Zellen spielen. Darüber hinaus stellt sich die Frage welchen Einfluss TGF-❜ auf die IL-10-regulierende Funktion von Blimp-1 und c-Maf hat. 4.9.2.2 IL-10-Assoziation von Blimp-1 und c-Maf in TR 1 Zellen Um erneut einen differenzierteren Blick auf die Expression von Blimp-1 und c-Maf speziell in IL-10-produzierenden gegenüber nicht-produzierenden T-Zellen innerhalb der TR 1 Gesamtpopulation werfen zu können, wurden IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– T-Zellen nach IL-27 oder IL-27/TGF-❜ Stimulation von naiven TH -Zellen aus IL-10:GFP Reporter Mäusen sortiert. Abb. 4.37: Assoziation von Prdm1 und Maf mit IL-10 in IL-27- und IL-27/TGF-❜stimulierten T-Zellen. Relative Prdm1 und Maf Expression in IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– IL-27oder IL-27/TGF-❜-stimulierten T-Zellen. Die IL-10:GFP+ und IL-10:GFP– Zellen wurden jeweils 72h nach Start der Kultur durchflusszytometrisch sortiert. Wie die Expressionsdaten schon vermuten ließen, zeigte Blimp-1 vor allem nach alleiniger IL-27-Stimulation eine extrem starke IL-10-Assoziation, während IL-10:GFP– IL-27stimulierte T-Zellen nahezu kein Blimp-1 exprimierten (Abb. 4.37). Auch in IL-27/TGF-❜ stimulierten T-Zellen war Blimp-1 in IL-10:GFP+ T-Zellen überexprimiert, wohingegen die absoluten Expressionslevel verglichen mit IL-27-stimulierten T-Zellen jedoch weitaus geringer waren. Im Gegensatz dazu war c-Maf unter beiden untersuchten Stimulationsbedingungen etwa gleich stark in IL-10:GFP+ T-Zellen exprimiert, wobei die IL-10-Assoziation in Anwesenheit von TGF-❜ schwächer war, da hier auch IL-10:GFP– T-Zellen c-Maf exprimierten. Ergebnisse 83 In Kombination mit den Expressionsdaten auf Gesamtpopulationsebene (Abb. 4.36) lassen diese Daten vermuten, dass Blimp-1 vor allem nach alleiniger IL-27-Stimulation eine wichtige regulatorische Rolle für die IL-10 Produktion spielt. c-Maf hingegen korrelierte in An- wie Abwesenheit von TGF-❜ mit IL-10 und könnte deshalb in beiden Situationen wichtig für IL-10 sein, obwohl eine signifikante c-Maf Expression nur in Anwesenheit von IL-27 und TGF-❜ beobachtet werden konnte (Abb. 4.36). 4.9.2.3 IL-10 Produktion von TR 1 Zellen in Abwesenheit von Blimp-1 oder c-Maf Um die funktionelle Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TR 1 Zellen zu untersuchen, wurden WT und Blimp-1-defiziente bzw. c-Maf-defiziente naive TH -Zellen in vitro unter TR 1 Bedingungen kultiviert und anschließend die Konzentration von IL-10 im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt. Da die Expressions- und IL-10-Assoziationsdaten eine unterschiedliche funktionelle Beteiligung von Blimp-1 und c-Maf an der IL-10 Regulation in IL-27 bzw. IL-27/TGF-❜-induzierten TR 1 Zellen vermuten ließen, wurden außerdem diese beiden Konditionen vergleichend untersucht. Abb. 4.38: TGF-❜ führt zu einer dynamischen Änderung der IL-10 Regulation von einem Blimp-1-abhängigen zu einem c-Maf-abhängigen Mechanismus in IL-27-stimulierten TH Zellen. Naive TH -Zellen aus (A) Prdm1 WT oder KO oder (B) Maf WT oder KO Mäuse wurden in der Anwesenheit von IL-27 alleine oder IL-27/TGF-❜ aktiviert. Aufgetragen ist die Konzentration von IL-10 im Kulturüberstand 72h nach Beginn der Aktivierung. Wie in Abb. 4.38 gut zu erkennen, ist die IL-10 Produktion von Blimp-1-defizienten TH Zellen nach IL-27 Stimulation stark beeinträchtigt, während im Gegensatz dazu c-Maf-defiziente IL-27-stimulierte TH -Zellen keinen signifikanten IL-10-Defekt aufweisen. Diese Ergebnisse spiegeln sehr gut die Expressionsdaten aus Abb. 4.36 wider, die zeigen, dass Blimp-1 vor allem nach IL-27 Stimulation exprimiert wird, wohingegen c-Maf kaum durch IL-27 alleine induziert wird. Demgegenüber ist die IL-10 Produktion in Anwesenheit von TGF-❜ weniger von Blimp-1 Ergebnisse 84 und dafür fast komplett von c-Maf abhängig. Dies wird vor allem daran deutlich, dass die Zugabe von TGF-❜ zu IL-27-stimulierten c-Maf-defizienten T-Zellen zu keiner weiteren IL-10 Induktion führt, während Blimp-1-defiziente T-Zellen nach TGF-❜ Zugabe mehr IL-10 produzieren als nach alleiniger IL-27 Stimulation. Nichtsdestotrotz ist auch die IL-10 Produktion Blimp-1-defizienter T-Zellen nach IL-27/TGF-❜ Stimulation leicht vermindert. Auch diese Daten lassen sich rückblickend gut mit den Expressionsdaten von Blimp-1 und c-Maf in Einklang bringen, da die Zugabe von TGF-❜ zu einer starken Induktion der c-Maf Expression bei gleichzeitiger Inhibition der Blimp-1 Expression führte. In der Summe lässt sich schlussfolgern, dass die transkriptionelle Regulation von IL-10 in TR 1 Zellen stark unterschiedlich ist und je nach An- oder Abwesenheit von TGF-❜ mehr von c-Maf bzw. mehr von Blimp-1 abhängt. Mit anderen Worten führt TGF-❜ zu einer dynamischen Änderung der IL-10 Regulation von einem Blimp-1-abhängigen zu einem c-Mafabhängigen Mechanismus in IL-27-stimulierten TH -Zellen. 4.10 Funktionelle Rolle von TGF-❜ für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen Die vorangegangen Experimente mit IL-27-stimulierten TR 1 Zellen zeigten eindrucksvoll, dass TGF-❜ die transkriptionelle Regulation von IL-10 stark verändert. Diese Modulation beruhte weitestgehend auf der Eigenschaft von TGF-❜ die IL-27-induzierte Expression von Blimp-1 zu inhibieren und gleichzeitig die Expression von c-Maf zu induzieren. Deshalb stellte sich nun die Frage ob TGF-❜ auch die Blimp-1-abhängige IL-10 Expression in TH 1 Zellen moduliert. Um diese Frage zu beantworten wurde zunächst der Einfluss von TGF-❜ auf die Blimp-1 und c-Maf Expression in TH 1 Zellen untersucht. Abb. 4.39: TGF-❜ moduliert die Expression von Blimp-1 und c-Maf auch in TH 1 Zellen. (A) Relative Prdm1 und Maf Expression sowie (B) Blimp-1 und und c-Maf Protein Level in TH 1 Zellen, die in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an rhTGF-❜ (0; 0,04; 0,2; 1; 5 ng/ml) für 72h kultiviert wurden. Ergebnisse 85 Analog zur IL-27-Stimulation inhibierte TGF-❜ auch in TH 1 Zellen in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise die Expression von Blimp-1 und induzierte auf der anderen Seite die Expression von c-Maf auf mRNA- und Protein-Ebene (Abb. 4.39). Im nächsten Schritt wurde deshalb überprüft, ob TH 1 Zellen auch in Anwesenheit von TGF-❜ IL-10 produzieren können, was indirekt bedeuten würde, dass TH 1 Zellen auch über einen Blimp-1-unabhängigen Weg IL-10 exprimieren können. Die Abbildung 4.40 zeigt jedoch deutlich das TGF-❜ sowohl die IFN-❣ wie auch die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen komplett unterdrückt. In der Tat konnte schon gezeigt werden, dass TGF-❜ die Differenzierung von TH 1 Zellen unterdrückt [87]. Abb. 4.40: TGF-❜ inhibiert die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen. (A) Frequenz an IL-10+ und IFN-❣+ T-Zellen, die unter TH 1 Bedingungen in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an rhTGF-❜ (0; 0,04; 0,2; 1; 5 ng/ml) für 72h kultiviert wurden. (B) Ein representativer Dot-Blot von TH 1 Zellen, die in Abwesenheit (ohne) oder Anwesenheit (mit; 5ng/ml) von rhTGF-❜ kultiviert wurden, ist gezeigt. Auf Grundlage dieser Daten kann geschlussfolgert werden, dass TGF-❜ in TH 1 Zellen im Gegensatz zu IL-27-stimulierten TR 1 Zellen keinen Blimp-1-unabhängigen Mechanismus zur IL-10 Regulation induziert, da TGF-❜ komplett die Differenzierung von TH 1 Zellen unterdrückt. Dies wiederum unterstreicht noch einmal die essentielle Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen und veranschaulicht, dass in verschiedenen TH -Zellen in der Tat unterschiedliche Transkriptionsfaktoren die IL-10 Expression regulieren. 5 Diskussion Diskussion 87 5.1 Die Expression von Blimp-1 und c-Maf korreliert mit der IL-10 Produktion in TH 1 Zellen Eine optimale T-Zell-vermittelte Immunreaktion zeichnet sich durch eine angemessene Stärke und Spezifität aus, die es ermöglicht das entsprechende Pathogen effektiv zu bekämpfen. Nach erfolgreicher Abwehr muss eine Immunantwort jedoch auch wieder abgeschaltet werden, um zum Beispiel ungewollte und unnötige Gewebeschädigungen zu verhindern. Seit langem ist bekannt, dass pro-inflammatorische TH -Zellen diese Kontraktionsphase durch die Ausschüttung des immunsuppressiven Zytokins IL-10 selbst einleiten und sich somit in ihrer entzündungsfördernden Funktion selbst regulieren können. Dieser Mechanismus der Selbstlimitation ist für unterschiedliche Effektor-TH -Zellen (TH 1, TH 2, TH 17) bekannt, aber bis jetzt am besten für TH 1-vermittelte Immunreaktionen beschrieben (Übersicht in [88]). So konnte in zahlreichen murinen Infektionsmodellen gezeigt werden, dass IL-10-produzierende TH 1 Zellen essentiell für die negative Regulation der Immunantwort sind [28, 29, 30, 31, 32]. Neuere Studien belegen aber, dass IL-10+ TH 1 Zellen auch Immunantworten gegenüber Selbst-Antigenen unterdrücken und somit entscheidend zur Aufrechterhaltung von peripherer Toleranz beitragen [33, 34]. Interessanterweise zeigen Beispiele aus chronischen Infektionen, dass Pathogene diese TH 1-vermittelte Autoregulation auch ausnutzen können, um ihre eigene Eliminierung während des Entzündungsprozess zu verhindern [29]. Abgesehen von Infektionen kann eine unangemessene TH 1-Antwort gegen Selbstantigene oder harmlose mukosale Antigene, wie z.B. Nahrungsmittel oder Kommensale, auch Autoimmunreaktionen auslösen. Die notwendigen externen Stimuli, die eine Induktion von IL-10 in TH 1 Zellen bewirken, sind umfangreich beschrieben. So ist die Expression von IL-10 stark mit der TH 1 Differenzierung an sich verknüpft. Dies bedeutet, dass die gleichen Signale, die die TH 1 Differenzierung steuern, also eine Aktivierung des T-Zell-Rezeptors durch den Peptid:MHCII Komplex sowie des IL-12 Rezeptors durch das pro-inflammatorische Zytokin IL-12, auch eine Expression von IL-10 induzieren [57, 59]. Interessanterweise korreliert dabei die Expression von IL-10 mit der Stärke dieser Signale, was die selbst-regulatorische Funktion von IL-10 gut widerspiegelt, die gerade während höchst inflammatorischen TH 1 Reaktionen (starke/chronische TZR-Aktivierung, viel IL-12), eine angemessene negative Gegenregulation ermöglicht [59]. Im Gegensatz zu den extrazellulären Signalen, sind die intrazellulären Signalwege und Regulationsmechanismen von IL-10 in TH 1 Zellen weniger gut beschrieben. So ist bisher lediglich bekannt, dass der MAP Kinase ERK-Signalweg downstream des T-Zell-Rezeptors essentiell für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen ist [59]. Allerdings gilt diese Abhängigkeit auch für TH 2 und TH 17 Zellen und betrifft nicht nur die Expression von IL-10, was die allgemeine Notwendigkeit der Aktivierung des T-Zell-Rezeptors für die Funktionalität von T-Zellen aufzeigt. Neben dem T-Zell-Rezeptor Signal konnte außerdem gezeigt werden, dass eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors STAT4 als direkter intrazellulärer Signalüberträ- Diskussion 88 ger des TH 1-induzierenden IL-12/IL-12-Rezeptorsignals essentiell für die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen ist [59]. Diese bereits beschriebene Abhängigkeit von spezifischen TH -ZellDifferenzierungssignalen konnte auch in anderen Effektor-TH -Zellen beobachtet werden. So wird zum Beispiel die IL-10 Produktion in TH 2 Zellen von IL-4/STAT6 und in TH 17 Zellen von IL-6/STAT3 und TGF-❜/SMAD Signalen induziert [59, 66]. Während jedoch in TH 2 und TH 17 Zellen jeweils downstream von diesen Zytokinsignalen weitere essentielle IL-10-Regulatoren identifiziert werden konnten, ist die molekulare Regulation von IL-10 in TH 1 Zellen bisher kaum weiter untersucht worden. Zwar zeigt eine Studie, dass die Expression des Transkriptionsfaktors c-Maf auch in IL-10-produzierenden gegenüber nicht-produzierenden TH 1 und TH 2 Zellen überexprimiert ist [59], allerdings fehlt bisher ein experimenteller Beweis für eine funktionelle Beteiligung von c-Maf an der IL-10 Regulation in TH 1 Zellen. Deshalb war es von Interesse die transkriptionelle Regulation von IL-10 speziell in TH 1 Zellen näher zu untersuchen. Dabei ging es um die Frage, welche kritischen Transkriptionsfaktoren die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen steuern. Um diese Fragestellung zu adressieren, sollten zunächst durch den Vergleich der Genexpressionsprofile von IL-10-produzierenden und nicht-produzierenden TH 1 Zellen IL-10-assoziierte Transkriptionsfaktoren identifiziert und anschließend mechanistisch untersucht werden. In dieser Studie konnte zunächst gezeigt werden, dass die Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf stark in IL-10+ gegenüber IL-10– TH 1 Zellen überexprimiert waren. Wie schon beschrieben, wurde eine Korrelation von c-Maf mit IL-10 in TH 1 Zellen zwar bereits gezeigt, allerdings differenzierte diese Studie nicht zwischen IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen. Die hier aufgezeigte strikte Separierung der c-Maf Expression zugunsten der IL-10+ Fraktion legte die Vermutung nahe, dass die Anwesenheit von c-Maf in der Tat essentiell für die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen sein könnte. Im Hinblick auf die bereits bekannte Korrelation von c-Maf und IL-10 in verschiedenen TH -Zellen (TH 1, TH 2, TH 17), stellte sich außerdem die Frage, ob c-Maf eine Art universeller IL-10-Regulator in unterschiedlichen Effektor-TH -Zellen ist. Bezüglich der IL-10-regulatorischen Rolle von Blimp-1 war bisher bereits bekannt, dass eine Blimp-1-Deletion in T-Zellen zu einer verstärkten IFN-❣ und verminderten IL-10 Produktion führt [89]. Allerdings wurden diese Analysen mit totalen ex vivo-isolierten Gedächtnis-TZellen durchgeführt, was eine differenzierte Aussage zur Funktion von Blimp-1 in verschiedenen TH -Zell-Subtypen unmöglich macht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Expression von Blimp-1 eine Subpopulation von Foxp3+ regulatorische T-Zellen identifiziert, die große Mengen an IL-10 produziert und dass im Umkehrschluss Blimp-1-defiziente Foxp3+ Tregs kein IL-10 exprimieren können [62]. In Kombination mit der hier präsentierten IL-10Assoziation in TH 1 Zellen stellte sich deshalb die Frage, ob Blimp-1 in verschiedenen inflammatorischen und regulatorischen TH -Zellen an der Regulation der IL-10 Expression beteiligt ist. Diskussion 89 5.2 Blimp-1 reguliert die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen Mit der Hilfe von T-Zell-spezifischen Blimp-1 knock-out Mäusen (CD4cre x Prdm1flox/flox ) konnte in den hier präsentierten Experimenten gezeigt werden, dass die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen in der Tat sehr stark von Blimp-1 abhängt. Im Umkehrschluss führte die retrovirale Überexpression von Blimp-1 zu einer verstärkten IL-10 Expression in TH 1 Zellen. Diese Blimp-1 Abhängigkeit konnte sowohl für in vitro wie auch für in vivo generierte IL-10+ TH 1 Zellen in jeweils einem TH 1-vermittelten Infektions- (T.gondii Infektion) und Autoimmunitätsmodell (Transfer-Kolitis) gezeigt werden. Interessanterweise ist bereits zuvor beschrieben worden, dass der Transfer von naiven Blimp-1-defizienten TH -Zellen im Vergleich zu Blimp-1-kompetenten TH -Zellen eine stärkere Transfer-Kolitis in RAG-defizienten Mäusen auslöst und dass T-Zell-spezifische Blimp-1 knock-out Mäuse im Alter von ungefähr 8-12 Wochen sogar selbst spontan eine Kolitis entwickeln, die vergleichbar mit dem Phänotyp T-Zell-spezifischer IL-10 knock-out Mäuse ist [89, 90]. Für diese Hyperinflammation wurden bisher verschiedene Ursachen beschrieben. Zum einen zeichnen sich Blimp-1-defiziente TH -Zellen durch eine Hyperproliferation und reaktivität aus [89, 90, 91]. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Blimp-1 auch den entzündlichen Phänotyp von TH -Zellen beeinflusst, indem es die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-17 und IFN-❣ unterdrückt [92, 93]. Zum anderen gibt es widersprüchliche Studien zur Rolle von Blimp-1 für die Funktionalität von Foxp3+ Tregs. Während der Transfer von Blimp-1-defizienten Foxp3+ Tregs in einem DSS-vermittelten Kolitis-Modell als nicht mehr protektiv beschrieben wird [89], scheint ihre Funktionalität im Transfer-Kolitis Modell nicht eingeschränkt zu sein [90], obwohl bereits gezeigt werden konnte, dass Blimp-1-defiziente Foxp3+ Tregs einen IL-10 Defekt aufweisen [62]. Nichtsdestotrotz ist selbst der Kotransfer von WT Foxp3+ Tregs nicht in der Lage eine durch naive Blimp-1-defiziente TH -Zellen ausgelöste Transfer-Kolitis adäquat zu unterdrücken, was den dominanten inflammatorischen Charakter von Blimp-1-defizienten Effektor-TH -Zellen aufzeigt. Die hier präsentierten Daten lassen vermuten, dass die Blimp-1-Abhängigkeit der IL-10 Produktion von TH 1 Zellen ein maßgeblicher Grund für den inflammatorischen und pathogenen Phänotyp von Blimp-1-defizienten T-Zellen im Transfer-Kolitis Modell ist und zur Hyperinflammation in T-Zell-spezifischen Blimp-1 knock-out Mäusen beiträgt. Es kann sogar spekuliert werden, dass die fehlende IL-10-vermittelte Autoregulation von TH 1 Zellen zum Teil direkt zu den beobachteten Defekten wie Hyperproliferation und verstärkter IFN-❣/IL-17 Produktion in Blimp-1-defizienten T-Zellen führt. Diskussion 90 5.3 Blimp-1 limitiert die TH 1-vermittelte Immunpathologie während einer T.gondii Infektion Die Analyse T.gondii-infizierter CD4cre x Prdm1flox/flox Mäuse zeigte deutlich, dass die Abwesenheit von Blimp-1 in CD4+ T-Zellen auch während einer TH 1-vermittelten Infektionsreaktion zu einer unkontrollierten Entzündungssituation mit tödlichen Gewebeschädigungen führte. Die immunprotektive Rolle von IL-10 während einer T.gondii Infektion wurde bereits in mehreren Studien mit IL-10-defizienten Mäusen oder durch die Antikörper-vermittelte in vivo Blockade des IL-10-Signalwegs beschrieben [28, 82]. Außerdem konnte bereits gezeigt werden, dass TH 1-Zellen die wichtigste IL-10-Quelle während einer T.gondii Infektion darstellen [28]. Die Tatsache, dass infizierte CD4cre x Prdm1flox/flox Mäuse im Bezug auf den Phänotyp IL-10-defizienten Mäusen nach T.gondii Infektion ähnelten, also im Vergleich zu WT Mäusen schwerer erkrankten, höhere Sterblichkeitsraten zeigten und höhere Level der TH 1-assozierten Zytokine IL-12 und IFN-❣ im Serum bzw. im Gewebe aufwiesen, zeigt deutlich, dass Blimp-1 essentiell für die Selbstlimitierung von TH 1 Zellen und den Schutz vor TH 1-vermittelter Immunpathologie war. Nichtsdestotrotz kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch IL-10-unabhängige Effekte zu Ausbildung dieses verstärkten pro-inflammatorischen Phänotyps in T.gondii-infizierten CD4cre x Prdm1flox/flox Mäusen führten. Es ist an dieser Stelle wichtig zu bemerken, dass die Kontrolle des Pathogens durch die Abwesenheit von Blimp-1 jedoch nicht beeinträchtigt war, was zeigt, dass die beobachtete Immunpathologie eine Folge der unkontrollierten TH 1-Immunantwort war und nicht durch eine übermäßige T.gondii Belastung ausgelöst wurde. 5.4 Blimp-1 und c-Maf kooperieren bei der IL-10 Induktion Im Gegensatz zu Blimp-1 führte die Abwesenheit von c-Maf in TH 1 Zellen zu keiner verminderten IL-10 Produktion. Mit Hilfe von T-Zell-spezifischen c-Maf knock-out Mäusen (CD4cre x Mafflox/flox ) konnte gezeigt werden, dass weder in vitro noch in vivo generierte TH 1 Zellen einen IL-10-Defekt aufweisen. Interessanterweise führte die retrovirale Überexpression von c-Maf in TH 1 Zellen hingegen zu einer verstärkten IL-10 Produktion. Dieses Experiment zeigte eindeutig, dass c-Maf per se in der Lage ist IL-10 in TH 1 Zellen zu induzieren. Außerdem ließ sich aus diesem Ergebnis schließen, dass die endogene c-Maf Expression in TH 1 Zellen möglicherweise zu gering ist und die endogene IL-10 Expression deshalb hauptsächlich von Blimp-1 abhängt. In der Tat exprimierten TH 1 Zellen im Vergleich zu TH 17 Zellen zum Beispiel nur sehr geringe endogene c-Maf Level. Nichtsdestotrotz war selbst die ektopische Expression von c-Maf nicht ausreichend, um den IL-10-Defekt Blimp-1-defizienter TH 1 Zellen zu kompensieren, was wiederum Diskussion 91 beweist, dass c-Maf alleine nicht in der Lage ist die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen anzuschalten, auch wenn es in unlimitierten Mengen vorhanden ist. Die in der Folge durchgeführte Analyse des IL-10-Transaktivierungspotentials von Blimp-1 und c-Maf mit Hilfe eines IL-10Reporter-Assays bestätigte diesen Punkt und zeigte, dass beide Faktoren die Expression von IL-10 synergistisch induzieren. In der Tat konnte bereits in einer anderen Studie nachgewiesen werden, dass c-Maf die IL-4 Produktion von TH 2 Zellen nur in Synergie mit NFAT reguliert [94], was darauf hindeutet, dass es zusätzlicher Aktivatoren bedarf, damit c-Maf aktivierend auf die Genexpression wirken kann. Somit wird deutlich, dass c-Maf die Expression von IL-10 in TH 1 Zellen nur in Anwesenheit von Blimp-1 reguliert, wobei festgehalten werden muss, dass c-Maf in konventionellen TH 1 Zellen nur sehr schwach induziert wird und folglich nicht relevant für die IL-10 Produktion ist. Paradoxerweise zeigte die Analyse c-Maf-defizienter TH 1-Zellen außerdem, dass vor allem in vitro generierte TH 1 Zellen in Abwesenheit von c-Maf sogar mehr IL-10 exprimierten. Dieser Effekt wurde allerdings auch von einer signifikant verstärkten IFN-❣ Produktion begleitet, was dafür sprechen könnte, dass c-Maf eine übergeordnete reprimierende Wirkung auf die IFN-❣ Produktion oder sogar die TH 1 Differenzierung an sich hat und der beobachtete Anstieg der IL-10 Produktion nicht mehr als eine Folge dieses verstärkten TH 1 Phänotyps war. Dafür sprechen bereits publizierte Studien, die zeigen, dass c-Maf in der Tat die Differenzierung von TH 1 Zellen inhibiert und darüber hinaus ein negativer Regulator von zahlreichen anderen pro-inflammatorischen TH 1- und TH 17-assoziierten Genen ist [95, 96]. In Kombination mit seiner expressionsfördernden Rolle für IL-10 deutet das globale Zielgen-Repertoire deshalb auf eine ausgeprägte anti-inflammatorische Funktion von c-Maf hin. 5.5 Die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen ist ERKund IL-12/STAT4-abhängig Im Hinblick auf die molekulare Regulation von IL-10 in TH 1 Zellen konnte bisher gezeigt werden, dass der ERK-Signalweg downstream des TZR-Rezeptors und der IL-12/STAT4Signalweg eine essentielle Rolle für die IL-10-Induktion in TH 1 Zellen spielen [57, 59]. Durch die chemische Blockade des ERK-Signalwegs und mit Hilfe von STAT4-/- TH 1 Zellen konnte hier gezeigt werden, dass ebenfalls die Expression der IL-10-regulierenden Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf von diesen Signalen abhängt. Dieses Ergebnis erweitert das bisher bekannte molekulare IL-10-regulatorische Netzwerk in TH 1 Zellen, indem es Blimp-1 und c-Maf als kritische IL-10-Regulatoren downstream des ERK- und STAT4-Signalwegs identifiziert (siehe Abb. 5.1). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass STAT4 die Expression von Blimp-1 direkt über die Bindung an den Prdm1 Promoter reguliert und somit über die IL12/STAT4/Blimp-1 Achse unmittelbar an der IL-10 Regulation in TH 1 Zellen beteiligt ist. Diskussion 92 5.6 Blimp-1, c-Maf und STAT4 binden an den Il10 Lokus in TH 1 Zellen Die mechanistische Untersuchung von Blimp-1 und c-Maf umfasste zunächst die Analyse der DNA-Bindung dieser Faktoren an den Il10 Lokus mit Hilfe von ChIP Assays. Der Fokus dieser DNA-Bindungsanalyse lag dabei auf spezifischen konservierten nicht-kodierenden Sequenzen upstream des Il10 Gens (CNS-20, -9, -4.5, -0.5), die als potentielle regulatorische DNAAbschnitte gelten. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass sowohl Blimp-1 also auch c-Maf in in vitro generierten TH 1 Zellen an den Il10 Lokus binden. Hierbei ist hervorzuheben, dass diese Bindung nur innerhalb einer spezifischen CNS-Sequenz nachweisbar war, die sich 9 kb upstream des eigentlichen Il10 Gens befindet (CNS-9), während andere CNS-Regionen upstream von Il10 (CNS-20, -4.5, -0.5) keine Blimp-1 oder c-Maf Bindung aufwiesen. Interessanterweise identifizierte die in silico Analyse dieser Sequenzen auch nur in dieser Region eine potentielle Bindungsstelle für Blimp-1, während c-Maf Bindungsmotive in den Regionen CNS-9, CNS-4.5 und CNS-0.5 vorhergesagt wurden (Abb. 8.2 im Anhang). In der Tat konnte bereits gezeigt werden, dass c-Maf an die CNS-4.5 Region in Makrophagen und an die CNS-0.5 Region in TH 17 und TR 1 Zellen bindet [67, 68, 97]. Die Tatsache, dass c-Maf in diesen Zellen eine essentielle Rolle für die IL-10 Expression spielt, lässt vermuten, dass die Bindung an CNS-4.5 und CNS-0.5 (proximaler Promoter) ein kritischer Mechanismus in der c-Maf-vermittelten IL-10 Regulation ist, der in TH 1 Zellen nicht nachgewiesen werden konnte. Für Blimp-1 konnte bisher lediglich eine Il10 -Bindung in Foxp3+ Tregs nachgewiesen werden, allerdings in einem intronischen Bereich, der im Rahmen dieser Studie nicht untersucht wurde [62]. Umgekehrt wurden die hier analysierten Regionen bisher nicht in Foxp3+ Tregs untersucht, sodass keine Aussage darüber getroffen werden kann, ob die Bindung von Blimp-1 an CNS-9 nur spezifisch in TH 1 Zellen auftritt. Zusätzlich zu Blimp-1 und c-Maf wurde im Rahmen dieser Studie auch die Bindung von STAT4 an den Il10 Lokus untersucht, da direktes Binden von STATs an intronische Sequenzen des Il10 Gens erst kürzlich für STAT6 in TH 2 Zellen, STAT3 in TH 17 Zellen und auch für STAT4 in TH 1 Zellen nachgewiesen werden konnte [61, 65]. Überraschenderweise zeigte die hier durchgeführte Analyse ebenfalls eine Bindung von STAT4 an die CNS-9 und CNS-0.5 Region. Damit scheint STAT4 in TH 1 Zellen in mehreren wichtigen Regionen upstream (CNS-9 und proximaler Promoter) und innerhalb des Il10 Gens selbst zu binden, was die wichtige Rolle von STAT4 für die Expression von IL-10 erklären könnte. Diskussion 93 5.7 STAT4 moduliert den Chromatinstatus von Il10 in TH 1 Zellen Um die essentielle Rolle von Blimp-1 und STAT4 für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen weiter mechanistisch zu ergründen, sollte außerdem herausgefunden werden, ob die Bindung dieser Faktoren auch zu epigenetischen Modifikationen, also zu Veränderungen in der DNAZugänglichkeit, im Il10 Lokus führt. Hierfür wurde der Einfluss von Blimp-1 und STAT4 auf die Ausbildung von aktivierenden (H3K4me2) und inhibierenden (H3K27me3) Histonmodifizierungen im Il10 Lokus untersucht. Mit Hilfe von Blimp-1- bzw. STAT4-defizienten TH 1 Zellen konnte per ChIP Analyse gezeigt werden, dass die Bindung von STAT4 unmittelbar in einer aktivierenden Histonmodifikation (H3K4me2) resultiert, während die Bindung von Blimp-1 keine Auswirkungen auf die epigenetische Regulation der IL-10 Expression hatte. Interessanterweise konnte bereits eine andere Studie mit Hilfe eines globalen ChIPSequenzierungs-Ansatzes nachweisen, dass STAT4 die Ausbildung der ebenfalls aktivierenden H3K4me3 Modifikation über den gesamten IL-10 Lokus induziert [65]. Darüber hinaus konnte die gleiche Studie zeigen, dass STAT6 die gleiche Funktion in TH 2 Zellen übernimmt, wobei in diesen Zellen sogar zusätzlich auch verstärkt inhibierend wirkende Histonmodifikationen im Il10 Lokus in Abwesenheit von STAT6 beobachtet werden konnten. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass STAT4 spezifisch in TH 1 Zellen die Expression von IL-10 initiiert und gleich auf mehreren Ebenen reguliert. Zum einen über die direkte Bindung an Il10 selbst, was zu einer erhöhten Zugänglichkeit der DNA führt und zum anderen über die Induktion weiterer IL-10-regulierender Faktoren wie Blimp-1 und c-Maf, die in der Folge ebenfalls an den Il10 Lokus binden und die Expression von IL-10 vorantreiben können. Diese hierarchische Zusammenarbeit von STATs und spezifischen IL-10-Regulatoren scheint auch für andere TH -Zell-Subtypen charakteristisch zu sein. So moduliert zum Beispiel STAT6 in TH 2 Zellen ebenfalls den Il10 -Chromatinstatus durch Bindung an den Il10 Lokus und induziert gleichzeitig die TH 2-spezifischen IL-10-Regulatoren GATA3 und IRF4 [58, 65, 74]. 5.8 Notch induziert IL-10 in TH 1 Zellen über eine Verstärkung der c-Maf Expression In der Vergangenheit konnten Studien aus dieser Arbeitsgruppe bereits nachweisen, dass die Kostimulation von TH 1 Zellen durch den Notch-Rezeptor Signalweg zu einer starken Induktion der IL-10 Expression führt und das Notch-modifizierte TH 1 Zellen deshalb eine verstärkte Kapazität zur Selbstregulation erwerben [71, 72]. Im Hinblick auf die molekularen Grundlagen ist bereits bekannt, dass die Notch-vermittelte IL-10 Induktion ebenfalls STAT4-abhängig ist und das Notch sogar Komponenten des IL-12/STAT4-Signalwegs, wie die Expression der IL-12 Rezeptor-ß2-Kette und von STAT4 selbst, induziert [71]. Außerdem konnte ein höheres Diskussion 94 Maß an STAT4-Phosphorylierung in Notch-stimulierten TH 1 Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen festgestellt werden. Es ist deshalb vorstellbar, dass die Induktion von IL-10 durch Notch vor allem durch eine Verstärkung des STAT4 Signalwegs vermittelt wird. Da in dieser Studie festgestellt werden konnte, dass die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen ebenfalls von IL-12/STAT4 induziert wird, stellte sich die Frage, ob die Notchvermittelte IL-10 Induktion auch von diesen Faktoren abhängt. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Blimp-1 in der Tat auch essentiell für die IL-10 Induktion durch Notch ist, obwohl keine signifikante Induktion der Blimp-1 Expression oder Veränderungen in der Il10 -Bindungskapazität von Blimp-1 durch Notch festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse untermauern die kritische Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Expression von TH 1 Zellen. Nichtsdestotrotz weisen sie aber auch darauf hin, dass die Notch-vermittelte IL-10 Induktion nicht durch eine Verstärkung der STAT4-vermittelten Blimp-1 Expression zu erklären ist. Überraschenderweise führte die Aktivierung durch den Notch Signalweg jedoch zu einer stark erhöhten c-Maf Expression, die die IL-12-induzierte c-Maf Expression um ein Vielfaches überstieg und in der Folge auch in einer verstärkten Bindung von c-Maf an den Il10 Lokus resultierte. Interessanterweise konnte in Notch-stimulierten TH 1 Zellen im Vergleich zu konventionell-stimulierten TH 1 Zellen sogar eine Bindung von c-Maf an die wichtige CNS-0.5 Promoterregion im Il10 Lokus detektiert werden, wie sie auch in c-Maf-abhängigen IL-10produzierenden TH 17 und TR 1 Zellen nachgewiesen werden konnte [67, 68]. Folglich exprimierten auch c-Maf-defiziente TH 1 Zellen nach Notch-Kostimulation weniger IL-10 als Notchaktivierte WT Zellen, obwohl c-Maf in konventionellen TH 1 Zellen keine essentielle Rolle für die IL-10 Expression spielte. Deshalb lässt sich schlussfolgern, dass die IL-10-induzierende Wirkung von Notch in TH 1 Zellen vor allem durch die Modulation der c-Maf Expression vermittelt wird. Im Gesamten sprechen diese Daten also gegen eine Theorie der alleinigen Verstärkung des STAT4 Signalwegs als Wirkungsmechanismus der Notch-vermittelten IL-10 Induktion. In Zukunft wird es deshalb interessant sein herauszufinden, ob Notch die Expression von c-Maf direkt über die Bindung an den Maf Lokus induziert. Außerdem zeigen unpublizierte Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe, dass Notch auch in TH 2 und TH 17 Zellen IL-10 induziert, was unmittelbar die Frage aufwirft, ob Notch auch in diesen Zellen die Expression von c-Maf induziert. Darüber hinaus kann natürlich auch nicht ausgeschlossen werden, dass Notch zusätzlich auch selbst an den Il10 Lokus bindet und so zur IL-10 Induktion beiträgt. Schlussendlich bekräftigt der Vergleich der Expressionslevel von c-Maf in konventionell-aktivierten TH 1 Zellen mit denen von Notch-aktivierten TH 1 Zellen noch einmal die Vermutung, dass c-Maf durch IL-12 alleine nur in einem sehr geringem Maße induziert wird und deshalb wahrscheinlich keine relevante Rolle für die IL-10 Expression in konventionellen TH 1 Zellen spielt. Diskussion 95 5.9 Modell der transkriptionellen Regulation von IL-10 in TH 1 Zellen Durch die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse lässt sich nun ein Modell der transkriptionellen Regulation der IL-10 Expression in TH 1 Zellen skizzieren (Abb. 5.1): Unter pro-inflammatorischen Bedingungen führt die Aktivierung einer naiven TH -Zelle durch eine aktivierte APZ unter dem Einfluss von IL-12 zur TH 1 Differenzierung. Dabei verursacht die Stimulation des T-Zell-Rezeptors durch den Antigen:MHCII Komplex auf der APZ eine Aktivierung des MAP-Kinase/ERK Signalwegs der essentiell für die Induktion von IL-10, Blimp-1 und c-Maf ist. Nichtsdestotrotz bedarf es weiterer Signale um eine robuste Expression dieser Gene auszulösen. So führt erst die Aktivierung von STAT4 durch den IL-12-Rezeptor zu einer ausgeprägten Blimp-1 Expression. Gleichzeitig bindet STAT4 selbst an den Il10 Lokus und initiiert die Ausbildung von aktivierenden epigenetischen Histonmodifikationen (H3K4me2), die die Zugänglichkeit der DNA für andere Faktoren erhöhen. In der Folge kann ebenfalls Blimp-1 als ein transkriptioneller Aktivator an den Il10 Lokus binden. Abb. 5.1: Modell der transkriptionellen Regulation der IL-10 Expression in TH 1 Zellen. Zusätzlich exprimieren aktivierte APZ unter bestimmten inflammatorischen Bedingungen, zum Beispiel nach TLR9 Stimulation [71, 72], den Notch-Liganden Dll4, der nach Bindung mit dem Notch Rezeptor auf TH 1 Zellen zur Induktion des Transkriptionsfaktors c-Maf führt. Diskussion 96 c-Maf bindet anschließend ebenfalls an den Il10 Lokus und induziert zusammen mit Blimp-1 in einer synergistischen Art und Weise die Expression von IL-10. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen außerdem, dass c-Maf nach ektopischer Expression auch die Expression von Blimp-1 fördert und man deshalb spekulieren kann, dass c-Maf die IL-10 Expression von TH 1 Zellen zu mindestens in Teilen auch indirekt über die Modulation der Blimp-1 Expression reguliert. Allerdings ist es fraglich, ob dieser Einfluss auch unter physiologischen Bedingungen zu beobachten ist. Außerdem konnten Arbeiten aus dieser Arbeitsgruppe in der Vergangenheit bereits zeigen, dass eine Aktivierung des Notch-Signalwegs ebenfalls zu einer erhöhten STAT4 Expression führt, was sich wiederum verstärkend auf die IL-10 Expression auswirkt. 5.10 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen Ein Ziel dieser Arbeit war es die Erkenntnisse zur transkriptionellen IL-10 Regulation in TH 1 Zellen auch auf andere inflammatorische und regulatorische TH -Zellen zu übertragen, um besser zu verstehen, ob es differenzierungsabhängige Unterschiede in der Regulation der IL-10 Expression in funktionell verschiedenen TH -Zellen gibt. 5.10.1 TH 2 Zellen Vorherige Studien konnten bereits zeigen, dass Blimp-1 und c-Maf ebenfalls durch den IL-4 /STAT6 Signalweg in TH 2 Zellen induziert werden [94, 98, 99]. Obwohl c-Maf auch in TH 2 Zellen mit der IL-10 Produktion korreliert [59], scheint die Expression von IL-10 in diesen Zellen trotzdem c-Maf-unabhängig zu sein [100]. Die Rolle von Blimp-1 für die IL-10 Produktion von TH 2 Zellen wurde hingegen bisher noch nicht untersucht. Es konnte lediglich gezeigt werden, dass Blimp-1 die IL-2 und c-Maf die IL-4 Produktion von TH 2 Zellen reguliert [94, 99, 100]. Die in dieser Studie durchgeführten loss-of-function-Experimente konnten zeigen, dass die IL-10 Produktion in vitro generierter TH 2 Zellen unabhängig von Blimp-1 sowie c-Maf ist. Folglich konnte auch keine Assoziation der Blimp-1 Expression mit der Expression von IL-10 in TH 2 Zellen festgestellt werden, während c-Maf in Übereinstimmung mit publizierten Daten trotzdem mit IL-10 korrelierte. Auf der Ebene der Gesamtpopulation waren Blimp-1 und c-Maf im Vergleich zu TH 1 bzw. TH 17 Zellen in einem nur sehr geringen Maße in TH 2 Zellen exprimiert. Interessanterweise führte die Überexpression von c-Maf in TH 2 Zellen jedoch zu einer starken IL-10 Induktion, während die ektopische Expression von Blimp-1 diesen Effekt nicht hervorrief. Aufgrund dieser Ergebnisse kann spekuliert werden, dass die endogene c-Maf Expression auch in TH 2 Zellen, vergleichbar zu TH 1 Zellen, nicht ausreicht, um c-Maf-abhängiges IL-10 zu Diskussion 97 induzieren. Die Ergebnisse der c-Maf Überexpression bestätigen diese Annahme und zeigen, dass c-Maf aber per se auch in diesen Zellen IL-10 induzieren kann, wenn es in ausreichenden Mengen vorhanden ist. Die Tatsache, dass Blimp-1 in den hier präsentierten Experimenten keine funktionelle Rolle für die IL-10 Produktion von TH 2 Zellen spielte, lässt zwei mögliche Schlussfolgerungen zu. Auf der einen Seite könnte es bedeuten, dass Blimp-1 für seine Funktion als IL-10-Aktivator Kofaktoren benötigt, die in TH 2 Zellen nicht exprimiert werden oder das Blimp-1 anderweitig in seiner transkriptionellen Funktion eingeschränkt wird. Auf der anderen Seite könnten aber auch die Expressionslevel von Blimp-1 in TH 2 Zellen zu gering sein, als das sie einen signifikanten Einfluss auf die IL-10 Regulation haben könnten. Dem widerspricht jedoch die Tatsache, dass auch die Überexpression von Blimp-1 in TH 2 Zellen zu keiner IL-10 Induktion führte. An dieser Stelle muss jedoch festgehalten werden, dass in diesen Experimenten die IL-10 Expression von Kontroll-transduzierten TH 2 Zellen bereits sehr hoch war, sodass eine IL-10-induzierende Wirkung der Blimp-1-Überexpression eventuell verschleiert wurde. Eine alternative Erklärung könnte sein, dass andere TH 2-spezifische IL-10-Regulatoren wie GATA3 oder IRF4 schon alleine in der Lage sind die Expression von IL-10 auf ein Maximalniveau zu induzieren, sodass die Anwesenheit von Blimp-1 keine weitere Steigerung der IL-10 Expression zur Folge hat. 5.10.2 TH 17 Zellen Während bereits bekannt ist, dass TGF-❜ die Expression von Blimp-1 in TH 17 Zellen unterdrückt [92], wird die Expression von c-Maf durch die synergistische Wirkung des IL-6/STAT3und TGF-❜-Signalwegs stark in TH 17 Zellen induziert [83, 101]. Außerdem konnte bereits gezeigt werden, dass c-Maf auch in TH 17 Zellen mit der Expression von IL-10 korreliert, sowie an die CNS-0.5 Il10 Promoterregion bindet [59, 67]. Diese Ergebnisse lassen stark vermuten, dass c-Maf ein wichtiger IL-10-Regulator in TH 17 Zellen ist, obwohl ein klassisches loss-offunction-Experiment für c-Maf in TH 17 Zellen bisher noch nicht durchgeführt wurde. Die hier präsentierten Daten konnten zunächst die inhibitorische Wirkung von TGF-❜ auf die Expression von Blimp-1 bestätigen, sodass in TH 17 Zellen so gut wie keine endogene Blimp-1 Expression detektiert werden konnte. Folglich war auch die IL-10 Expression von TH 17 Zellen unabhängig von Blimp-1. Im Gegenzug führte die Überexpression von Blimp-1 in TH 17 Zellen nichtsdestotrotz zu einer starken Induktion von IL-10, was zeigte, dass der Blimp-1-abhängige IL-10-Induktionsmechanismus von sich aus auch in TH 17 Zellen funktioniert. Im Gegensatz dazu wurde c-Maf im Vergleich zu TH 1 und TH 2 Zellen mit Abstand am stärksten in TH 17 Zellen induziert. Schlussendlich konnten die in dieser Studie durchgeführten Experimente mit c-Maf-defizienten TH 17 Zellen beweisen, dass c-Maf in der Tat essentiell Diskussion 98 für die IL-10 Expression von TH 17 Zellen ist. Interessanterweise bewirkte die ektopische Expression von c-Maf in TH 17 Zellen jedoch keine weitere Steigerung der IL-10 Expression, was aber mit der ohnehin schon starken endogenen c-Maf Expression in diesen Zellen erklärt werden kann. 5.11 Rolle von Blimp-1 und c-Maf für die IL-10 Produktion von regulatorischen T-Zellen 5.11.1 Foxp3+ Tregs Die Analyse der molekularen Regulation von IL-10 in regulatorischen T-Zellen umfasste die Untersuchung von Foxp3+ Tregs und IL-27-induzierten Foxp3– TR 1 Zellen. Während angenommen wird, dass die in vitro Differenzierung von TH 1, TH 2, TH 17 und auch TR 1 Zellen weitestgehend die in vivo Differenzierung dieser Zellen nachstellt, ist dies für Foxp3+ Tregs sehr umstritten. Diese Diskrepanz begründet sich in der Tatsache, dass die meisten Tregs in vivo direkt im Thymus generiert werden und in der Peripherie nur eine Aktivierung durch ihr Antigen erfahren. Nichtsdestotrotz können Foxp3+ Tregs auch in der Peripherie aus naiven TH -Zellen induziert werden, obwohl die Signale für diese Differenzierung noch nicht vollständig aufgeklärt sind (Übersicht in [16, 17]). Dies lässt sich vor allem daran erkennen, dass in vitro induzierte Foxp3+ Tregs im Vergleich zu ex vivo isolierten Foxp3+ Tregs durch einen unstabilen Phänotyp gekennzeichnet sind [102]. Deshalb wurden im Rahmen dieser Studie in vivo generierte Foxp3+ Tregs für die molekulare Analyse der IL-10 Regulation verwendet. Die hier präsentierten Ergebnisse bestätigen bereits publizierte Erkenntnisse, die zeigen, dass Blimp-1 in einer Subpopulation von Foxp3+ Tregs exprimiert wird, die einen EffektorPhänotyp aufweisen und große Mengen an IL-10 produzieren [62]. Folglich konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass Blimp-1-defiziente Foxp3+ Tregs deutlich weniger IL-10 als Blimp-1-kompetente Foxp3+ Tregs während einer entzündlichen Infektionsreaktion (T.gondii) exprimieren. In der Tat konnte bereits nachgewiesen werden, dass der IL-2/STAT5 Signalweg, welcher essentiell für die Funktionalität und IL-10 Expression von Foxp3+ Tregs ist [103], auch ein potenter Blimp-1 Induktor ist [104], wenn auch zum Teil indirekt über die IL-2/STAT5-vermittelte Repression des Blimp-1 Antagonisten Bcl6 [105]. Vor diesem Hintergrund ergänzen sich die Studien zur Blimp-1- bzw. IL-2-Abhängigkeit der IL-10 Expression in Foxp3+ Tregs und es lässt sich spekulieren, dass die IL-10 Expression in diesen Zellen höchstwahrscheinlich direkt über die IL-2/STAT5/Blimp-1 Achse reguliert wird. Außerdem ist Prdm1 als ein wichtiges Zielgen von Foxp3 beschrieben [106]. Demgegenüber war die IL-10 Produktion von c-Maf-defizienten Foxp3+ Tregs auch leicht vermindert, allerdings bei weitem nicht so stark wie in der Abwesenheit von Blimp-1. Interessanterweise konnte in TH 2 Zellen bereits gezeigt werden, dass c-Maf die Expression von Diskussion 99 CD25 induziert [107]. Deswegen kann spekuliert werden, dass c-Maf diese Funktion auch in Foxp3+ Tregs ausübt und über diesen Mechanismus die IL-2-Empfänglichkeit und damit auch die Kapazität zur IL-10 Produktion von Foxp3+ Tregs kontrolliert. Es ist jedoch noch nicht untersucht worden, ob Foxp3+ Tregs überhaupt signifikante Mengen an c-Maf exprimieren oder ob die Expression von c-Maf mit der von IL-10 in diesen Zellen korreliert. Eine Studie aus humanen Zellen konnte zu mindestens schon eine induzierende Wirkung des IL-2/STAT5 Signalwegs auf die Expression von c-Maf nachweisen [108]. 5.11.2 Foxp3– TR 1 Zellen Für IL-27-induzierte TR 1 Zellen ist bereits bekannt, dass IL-27 über STAT1/STAT3 die Expression von Blimp-1 und c-Maf in T-Zellen induziert [45, 67, 68, 109]. Während bereits gezeigt werden konnte, dass die IL-10 Expression von IL-27/TGF-❜-induzierten TR 1 Zellen von c-Maf abhängt [68], konnte für Blimp-1 bisher lediglich eine funktionelle Rolle für die IL-10 Regulation in IL-27-stimulierten CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden [109]. Unter anderem deshalb war es in dieser Studie von Interesse zu untersuchen, ob die IL-10 Expression von IL-27-stimulierten CD4+ T-Zellen auch von Blimp-1 abhängt. Abb. 5.2: TR 1 Zellen vereinen TH 1- und TH 17-spezifische IL-10-regulatorische Elemente. Bei dieser Analyse zeigte sich, dass die IL-27-induzierte Expression von Blimp-1 und c-Maf stark von der An- bzw. Abwesenheit von TGF-❜ abhing. Während IL-27-stimulierte T-Zellen große Mengen an Blimp-1 und kaum c-Maf exprimierten, kehrten sich die Expressionslevel in Anwesenheit von TGF-❜ um, sodass in IL-27/TGF-❜-aktivierten T-Zellen die Expression Diskussion 100 von Blimp-1 unterdrückt wurde und stattdessen eine Induktion von c-Maf zu beobachten war. Demzufolge veränderte sich auch die transkriptionelle Regulation von IL-10 von einem Blimp-1-abhängigen zu einem c-Maf-abhängigen Mechanismus. Damit konnte nachgewiesen werden, dass auch die IL-27-vermittelte IL-10 Expression von Blimp-1 abhängt, während die c-Maf-Abhängigkeit von IL-27/TGF-❜-induziertem IL-10 bereits gezeigt werden konnte [68]. Der hier aufgezeigte dynamische Wechsel in der Abhängigkeit der IL-10 Expression von Blimp-1 zu c-Maf, der nur durch die An- oder Abwesenheit von TGF-❜ ausgelöst wurde, zeigt wie flexibel die transkriptionelle Regulation von IL-10 in TR 1 Zellen ist. Interessanterweise vereinen TR 1 Zellen damit TH 1- und TH 17-spezifische IL-10-regulatorische Elemente. Darüber hinaus zeigen andere Studien, dass TGF-❜ und IL-27 nicht nur IL-10 induzieren, sondern gleichzeitig auch die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IFN-❣ beziehungsweise IL-17 unterdrücken [87, 110, 111]. Daher lässt sich spekulieren, dass TR 1 Zellen in der Tat keinen eigenen TH -Zell-Subtyp darstellen, sondern vielmehr einen entwicklungsbiologischen Endpunkt von TH 1 und TH 17 Zellen, der durch eine vorrangige IL-10 Expression gekennzeichnet ist und somit zur Selbstlimitierung und Terminierung der Immunantwort beiträgt (Abb. 5.2). Damit wären TR 1 Zellen ein weiteres Beispiel für die erstaunliche Plastizität von CD4+ TH -Zellen. 5.12 Ausblick Das Projekt eröffnet zum gegenwärtigen Zeitpunkt viele interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen. Zum einen soll die Rolle von c-Maf für die IL-10 Produktion von in vivo generierten TH 17 Zellen beziehungsweise TR 1 Zellen weiterführend untersucht werden, da die IL-10regulierende Rolle von c-Maf im Rahmen dieser Studie bisher nur in einem TH 1-vermittelten Infektionsmodell analysiert wurde. Dieser Punkt ist besonders interessant, da bereits gezeigt werden konnte, dass Il10 und Maf zu den Signaturgenen von sogenannten nicht-pathogenen TH 17 Zellen gehören, das heisst TH 17 Zellen, die keine Enzephalitogenität mehr im murinen Transfer-Modell der Multiplen Sklerose übertragen [38]. Daher lässt sich spekulieren, dass c-Maf in der Tat ein Schlüsselfaktor für die Fähigkeit zur Selbstlimitierung von TH 17 Zellen sein könnte und damit ein kritischer protektiver Transkriptionsfaktor, der die Ausbildung von TH 17-vermittelter Autoimmunität verhindert. Im Hinblick auf die molekularen Mechanismen der IL-10 Regulation ist es immer noch eine offene Frage wie der Notch Signalweg im Detail die Expression von IL-10 induziert. So ist zum Beispiel nach wie vor nicht geklärt, ob Notch die IL-10 Expression von TH 1 Zellen neben der indirekten Induktion von c-Maf auch durch eine direkte Interaktion der intrazellulären Domäne mit dem Il10 Lokus beeinflusst. Analog dazu sind auch die molekularen Grundlagen der Notch-vermittelten IL-10 Induktion in TH 2 und TH 17 Zellen bisher nicht näher untersucht Diskussion 101 worden und daher noch komplett unbekannt. Außerdem gilt es herauszufinden, ob Notch auch in regulatorischen TH -Zellen an der Kontrolle der IL-10 Expression beteiligt ist. Unabhängig von der molekularen IL-10 Regulation ist es immer noch fraglich unter welchen physiologischen Bedingungen es zu einer Notch-vermittelten IL-10 Induktion kommt. Neue Ergebnisse aus unserer Gruppe zeigen, dass spezifische Endothelzellen in der Leber große Mengen von Notchliganden exprimieren, die die Expressionslevel von konventionellen APZ bei weitem übersteigen. Folglich führt die in vitro Kokultur dieser Zellen mit TH 1 Zellen zu einer ausgeprägten IL-10 Induktion. Daher wird es in Zukunft interessant sein, die Notchvermittelte IL-10 Induktion zum Beispiel im Rahmen von Leber-assoziierten TH 1-vermittelten Immunreaktionen zu untersuchen. In einem weiteren Teilprojekt wird zudem die Übertragbarkeit der hier im Mausmodell gemachten Beobachtungen auf den Menschen untersucht. Bisher konnten andere Studien bereits einige Gemeinsamkeiten zum murinen System nachweisen. So induziert zum Beispiel das Zytokin IL-27 auch in humanen T-Zellen via STAT1/STAT3 die Expression von IL-10 [112] und auch IL-2 wurde schon als wichtiger Induktor von IL-10 in humanen Foxp3+ Tregs beschrieben [113]. Im Gegensatz dazu konnten aber auch schon wichtige Unterschiede zwischen Maus und Mensch aufgezeigt werden. So ist zum Beispiel schon lange bekannt, dass der IFN-❛/STAT3 Signalweg ein wichtiger IL-10-Stimulator in humanen T-Zellen ist [114, 115]. Zusätzlich führt auch die Kostimulation von humanen T-Zellen via den Komplementrezeptor CD46 zu einem IL-10-produzierenden TR 1-ähnlichen Phänotyp [47]. Interessanterweise wurde erst kürzlich gezeigt, dass CD46 auch Notchliganden bindet, was eine IL-10-regulierende Rolle von Notch auch in humanen T-Zellen nahelegt [116]. In der Tat zeigen erste Versuche in unserer Arbeitsgruppe, dass der Notchligand Dll4 auch eine wichtige Rolle für die IL-10 Expression von humanen naiven und Gedächtnis-TH -Zellen spielt. Abgesehen von diesen Studien, die sich vor allem auf die extrazellulären IL-10-induzierenden Signale konzentrierten, ist bisher aber kaum etwas über transkriptionelle Regulation von IL-10 in humanen T-Zellen bekannt. Deshalb wird in Zukunft ein Schwerpunkt auf der Analyse der molekularen Regulation der IL-10 Expression in verschiedenen humanen inflammatorischen und regulatorischen TH -Zellen liegen. 6 Zusammenfassung Zusammenfassung 103 Das immunsuppressive Zytokin IL-10 wird von verschiedenen pro-inflammatorischen sowie regulatorische TH -Zellen ausgeschüttet, um auf diese Weise die Stärke und das Ausmaß einer Immunantwort zu kontrollieren. Dieser negative Regulationsmechanismus ist essentiell für den Organismus, da so eine ungewünschte und unkontrollierte Aktivierung des Immunsystems verhindert wird. Dennoch ist die molekulare Regulation der IL-10 Produktion in TH -Zellen nur unzureichend verstanden. Ausgehend von der Analyse der IL-10 Regulation in pro-inflammatorischen TH 1 Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Expression von IL-10 in funktionell verschiedenen TH -Zellen durch unterschiedliche transkriptionelle Netzwerke kontrolliert wird. Diese Spezifität wird dabei durch das lokale Mikromilieu, z.B. Zytokine oder NotchLiganden, während der T-Zell-Aktivierung bestimmt, die nicht nur maßgeblich die Richtung der TH -Zell-Differenzierung, sondern auch die Expression von spezifischen IL-10-regulierenden Transkriptionsfaktoren diktiert. Abb. 6.1: IL-10-induzierende Signale und Transkriptionsfaktoren in murinen TH -Zellen. Adaptiert von [64]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Zytokine IL-12 und IL-27 den Transkriptionsfaktor Blimp-1 induzieren, der in der Folge die IL-10 Expression von pro-inflammatorischen TH 1 Zellen in vitro und in vivo reguliert. Dementsprechend führte die genetische Deletion von Blimp-1 in T-Zellen zum Verlust der TH 1-Selbstregulationskapazität, was in einer verstärkten TH 1-vermittelten Immunpathologie während einer Toxoplasma gondii Infektion resultierte. Auf molekularer Ebene konnte gezeigt werden, dass Blimp-1 direkt durch den IL-12-aktivierten STAT4-Signalweg induziert wird und dass beide Faktoren anschließend an konservierte nicht-kodierende Regionen im Il10 Lokus binden. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, Zusammenfassung 104 dass STAT4 außerdem die Ausbildung von aktivierenden epigenetischen Histonmodifizierungen am Il10 Lokus induziert. In der Vergangenheit konnte bereits gezeigt werden, dass Blimp-1 ebenfalls durch den IL-2/STAT5-Signalweg induziert wird und deshalb auch ein essentieller IL-10-Regulator in Foxp3+ regulatorischen T-Zellen ist. Im Gegensatz dazu demonstrierten die hier durchgeführten Experimente, dass die Expression von Blimp-1 in IL-6/TGF-❜-induzierten TH 17 Zellen und IL-27/TGF-❜-induzierten TR 1 Zellen durch TGF-❜ unterdrückt wird. In diesen Zellen induziert TGF-❜ stattdessen in Kombination mit IL-6 oder IL-27 die IL-10-Regulatoren c-Maf und AHR, die in der Folge die Kontrolle über die IL-10 Expression übernehmen. Demgegenüber offenbarte die Analyse Blimp-1beziehungsweise c-Maf-defizienter TH 2 Zellen, dass die IL-10 Expression in diesen Zellen weder von Blimp-1 noch von c-Maf abhängt, da beide Faktoren unter TH 2-Bedingungen kaum exprimiert werden. Stattdessen ist bereits bekannt, dass IL-10 in TH 2 Zellen unter anderem durch den IL-4-induzierten TH 2-Mastertranskriptionsfaktor GATA3 kontrolliert wird (Übersicht in Abb. 6.1). Interessanterweise konnte in dieser Studie ebenfalls gezeigt werden, dass der Notch-Signalweg den IL-10-Regulator c-Maf auch in TH 1 Zellen in der Abwesenheit von TGF-❜ induziert. Anschließende Protein-DNA-Bindungs- und IL-10-Reporter-Analysen demonstrierten, dass c-Maf infolgedessen verstärkt an den Il10 Lokus bindet und in Kooperation mit Blimp-1 zu einer synergistischen IL-10 Induktion in TH 1 Zellen führt. In der Summe veranschaulicht diese Studie wie TH -Zellen unterschiedlichste Signale aus der Umgebung in eine flexible und kohärente transkriptionelle Regulation von IL-10 integrieren. Diese Variabilität könnte als eine Art Sicherheitsmechanismus angesehen werden, der eine stabile IL-10 Expression in TH -Zellen unter verschiedenen inflammatorischen Bedingungen ermöglicht. In der Tat sind TH -Zellen während einer Immunreaktion in vivo einer äußerst veränderlichen Mikroumgebung ausgesetzt. Deshalb gilt es in Zukunft herauszufinden, welche Bedeutung die hier unter definierten in vitro Bedingungen identifizierten TH -Zell-spezifischen transkriptionellen Netzwerke unter dynamischen in vivo Bedingungen für die Expression von IL-10 haben, um dieses Wissen für eine gezielte Modulation der anti-inflammatorischen Kapazitäten von TH -Zellen in chronischen Entzündungen oder Autoimmunität nutzen zu können. 7 Literaturverzeichnis [1] C. A. Janeway and R. Medzhitov. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol., 20:197– 216, 2002. [2] T. Boehm and J. B. Swann. Origin and evolution of adaptive immunity. Annu Rev Anim Biosci, 2:259–283, Feb 2014. [3] D. Nemazee. Receptor selection in B and T lymphocytes. Annu. Rev. Immunol., 18:19–51, 2000. [4] E. A. Atkinson and R. C. Bleackley. Mechanisms of lysis by cytotoxic T cells. Crit. Rev. Immunol., 15(3-4):359–384, 1995. [5] P. Cresswell. Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. Annu. Rev. Immunol., 12:259–293, 1994. 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The CD46-Jagged1 interaction is critical for human TH1 immunity. Nat. Immunol., 13(12):1213–1221, Dec 2012. 8 Anhänge Anhänge 116 STAT Motiv: TTCN(2-4)GAA c-Maf Motiv: TGAG/CTCA Prdm1 CNS+14 (identity 88,3%) > mm10 chr10:44444389-44444891 503bps AAATGTCAGTCTCTAAAATACTTTACAGCTGGAAATTATAGACTGTATATGAAGG TACATTTTTAAAAACTCATCCTTCAGCAGCTGACTAATCACAGGAGCTGATATCA TTTCTAACTCTCCCACTTAGCAGCTTGAGTTAACATGAAAAAGAAAATCAAGATC TGTTTTTGTTCTTAAATCTTAAATGGCTGTAGGCGGACAGAGTCATTTCAAGAGT GAGCTGCTTTGGAAGGTTCTGAATGGCTTAATTATGCCGACTCACATTTTCGAT CTATAATAAGCACCCCTAAGACTACAAGAAAGAACCTAGAAGTTCTGCAGTAGG CAAAACAAAGTCTGTTTTCAACATGAACCGAGAAAGCAGATTAACATTCAGAAGT CTATAATTTGGTCAACTGATTTCTAGATGGGTTAGTTAGATAGATAGAAAAAAAAA TTACCAAAAAGGTTGGGAGGGCCAGGAGCTAAATTTAACAGTTCTTTTCCACATT CCTCTCTCC Prdm1 CNS-1 (identity 89,0%) mm10 chr10:44459445-44459716 272bps GGGATGTTGGGCTGGGGGCAGTGAGTGGAAAGCTGTTGGAGGCAGTAATTAGT GGGGCTCGTTCTGAGCCTGGCCGGCTTTTCCTTCAGCCCCAGTCTGTCTTCTG GAGAAGGAAGGACATCCTGTGATGATGGCATACAATGTCCTGTTTGTTTATTAT TAAGAGCGTGGACCTTGCATTCCTGCTTCTCATTACAAAACAAACCAGATGCGG TACTTCCTTCAATGGTCTTTTGCCTTCAGCAGGGATCCTCCAATTCACAGAAAC AATG Prdm1 CNS-1.5 (identity 83,9%) > mm10 chr10:44459873-44460126 254bps TATCTTTTCTAGTATTCTAAACACACGGGGCATACACACCCACCCACATCCAGAT CCACACCCACATTCACACACCCAGACCCAACCTAATGATACCAACTTAGTCATAC AATGAAGTGGACATTTGAGTATTTGTTTACAGGAAGAAATGAAACACAGCAAAAC AAAAGCCCAACTCAATCATAAAGACAGGCTTGTTCTTCTGTTTTCCTTTCAAGAA ACTTTCCCAGAAAAATTTTTTTGGGGGGGAGGGG Prdm1 CNS-2 (identity 84,9%) > mm10 chr10:44460425-44460609 185bps AAACCCGAATGAACAATTCTTAAGAGTTCTCAGAAAGGTCCAAGTGATAATTAAA CAAAAGAAATCCAGCCTCCTGCAGAGGGTTTATTAACCGATGCTGAGTCAGCAC CACTATGGACAGAAAAACAATGTAGTCATCTCAGGGTCTGGCCTGCTGCTAGCT GTCTCCACTGCACAGCAGTTAA Abb. 8.1: In silico Analyse von STAT und c-Maf Bindungsmotiven in CNS-Regionen im Prdm1 Lokus. Potentielle STAT und c-Maf Bindungsmotive sind in den jeweiligen CNS Regionen hervorgehoben. Bei der Identifikation der potentiellen Bindungssequenzen wurde ein Basenaustausch verglichen zur Kernsequenz toleriert. Anhänge 117 STAT Motiv: TTCN(2-4)GAA c-Maf Motiv: TGAG/CTCA Blimp-1 Motiv: T /CGAAAGT/C Il10 CNS-0.5 (identity: 80,7%) > mm10 chr1:131019438-131019696 259bps GGAGGAAACAATTATTTCTCAATCCTAATATGTTCTGGAATAGCCCATTTATCCA CGTCATTATGACCTGGGAGTGCGTGAATGGAATCCACAGATGAGGGCCTCTGTA CATAGAACAGCTGTCTGCCTCAGGAAATACAACTTTTAGTATTGAGAAGCTAAAA AGAAAAAAAAATTAAAAGAGAGGTAGCCCATACTAAAAATAGCTGTAATGCAGAA GTTCATTCCGACCAGTTCTTTAGCGCTTACAATGCAAAAA Il10 CNS-4.5 (identity: 80,0%) > mm10 chr1:131015400-131015593 194bps CAAACTTCTCATGTGAGAAGTTAGAGTAAGGTGTTGGTCCTTGAGTAAAAGTCA AATTGCTTTATGTGGCACCACAGTTACACAAAGGGGAATTCCACATTGGCTGTC CAGCGATCAGCCCTTCCGTTGTGCTTTGCAACATCTGCTTGGCCACGATTCTCA GGACATTCAATCCGGTTTGCATAATCCTGGCT Il10 CNS-9 (identity: 83,9%) > mm10 chr1:131010529-131010907 379bps TGTGGTGCTCTCGAGGGTTTTCCAGTAATTTCTCCCTGACACAGTCAATCCGAG AAACCCACCACCTCCCTCCCACACCTGGGTCGCCACCCTGGTCATGCTCTTGA GGAAAAGCCAGCATCATGTCCTGCCACTCAATGAAGGCCTCTCTGGTTTCCGAT GCTCTCAGCAGGCCTGACTCACAACGAAACTGCAACCTCAAAGCACCGGGGG CCAGGACGGCGAGAAGGAAACACAGGTGAACACGCAAAAGCTGCCCCCAGGA AAAAGGTTTGTTTCTCTTACAGAATGGCACTTCCAGAGCTGGGCAGGAGCACAG ACTAGTAGAGACTGAAGGGGCCTGCCTGGTCTTGTACCTGGGGTTTTGGTATG GAAAAAA Il10 CNS-20 (identity: 80,0%) > mm10 chr1:130999687-130999976 290bps GTTAGGAAGATGGAGAACACTGGAAGGATTACAGCTTGACAAAACGCTAGGCTT GATACAGGTCATGAAACATGGTCCAGGGAAATCCCCAAACAGAAGCACCCCAG CTGGTTTCCCCATCACTTTGGGTAACTTTCCATTGCCACACACACATACACACAC CCTGCCTACCCTCCAGGTCTCGTCTCAAGAACCTAGCTGCTCACTTGGCGGCCT GGTAAGGCATGGGAATCAAAAGAAGCAATGGACCCAGCTCCTGAACTTGAGAA GCTACATTCTTCGTAGGGAAA Abb. 8.2: In silico Analyse von STAT, c-Maf und Blimp-1 Bindungsmotiven in CNSRegionen im Il10 Lokus. Potentielle STAT, c-Maf und Blimp-1 Bindungsmotive sind in den jeweiligen CNS Regionen hervorgehoben. Bei der Identifikation der potentiellen Bindungssequenzen wurde ein Basenaustausch verglichen zur Kernsequenz toleriert. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 118 II Abbildungsverzeichnis 1.1 Schematische Darstellung der peripheren TH -Zell-Differenzierung. . . . . . . . 11 1.2 Die Struktur des Il10 Gen Lokus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.3 IL-10-induzierende Signale und Transkriptionsfaktoren in TH -Zellen. . . . . . 20 1.4 Der Notch Signalweg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.1 45 4.2 Sortierung IL-10+ und IL-10– TH 1 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Intrazelluläre IL-10 Färbung in IL-10+ und IL-10– sortierten TH 1 Zellen. . . 46 4.3 IL-10 Assoziiation von Evi-1, c-Maf und Blimp-1 in TH 1 Zellen. . . . . . . . . 48 4.4 Endogene Blimp-1 Expression in Prdm1 WT und KO TH 1 Zellen. . . . . . . 49 4.5 50 4.6 Blimp-1 reguliert die IL-10 Produktion von in vitro generierten TH 1 Zellen. . Blimp-1 Überexpression induziert IL-10 in in vitro generierten TH 1 Zellen. . . 4.7 In vivo induzierte Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen produzieren signifikant weniger IL-10 als WT Zellen während einer Transfer-Kolitis. . . . . . . . . . . . . 4.8 52 In vivo induzierte Blimp-1-defiziente TH 1 Zellen produzieren signifikant weniger IL-10 als WT Zellen während einer T.gondii Infektion. . . . . . . . . . . . 4.9 51 53 Blimp-1-defiziente T.gondii-spezifische T-Zellen produzieren weniger IL-10 und sind im Vergleich zu WT Zellen vor allem in den mesenterialen Lymphknoten überrepräsentiert. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 4.10 Blimp-1 limitiert die TH 1-vermittelte Immunpathologie während einer T.gondii Infektion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.11 Endogene c-Maf Expression in Maf WT und KO TH 17 Zellen. . . . . . . . . 57 4.12 Die IL-10 Produktion von in vitro generierten TH 1 Zellen ist unabhängig von c-Maf. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.13 c-Maf Überexpression induziert IL-10 in in vitro generierten TH 1 Zellen. . . . 4.14 In vivo induzierte c-Maf-defiziente TH 1 Zellen weisen während einer T.gondii 59 Infektion keinen generellen IL-10 Defekt auf. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.15 Die Expression von Il10, Prdm1 und Maf in TH 1 Zellen ist IL-12 abhängig. . 61 4.16 Die Expression von IL-10, Blimp-1 und Maf in TH 1 Zellen ist STAT4 abhängig. 62 4.17 STAT4 bindet an konservierte nicht-kodierende Sequenzen im Prdm1 Promoter. 63 4.18 Die Expression von Prdm1 und Maf ist reduziert in T-bet-defizienten TH 1 Zellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4.19 Die Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1 Zellen ist ERK abhängig. . . . 65 4.20 Konservierte nicht-kodierende Sequenzen upstream von Il10. . . . . . . . . . . 66 4.21 Blimp-1, c-Maf und STAT4 binden an die CNS-9 Region upstream von Il10 in TH 1 Zellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 4.22 STAT4 reguliert H3K4me2 Histonmodifizierungen im Il10 Lokus in TH 1 Zellen. 67 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 119 4.23 Die gleichzeitige Bindung von Blimp-1 und c-Maf an CNS-9 führt zu einer synergistischen Induktion der IL-10-Reporter-Aktivität. . . . . . . . . . . . . 68 4.24 Die ektopische Expression von c-Maf ist nicht ausreichend um den IL-10-Defekt Blimp-1-defizienter TH 1 Zellen zu kompensieren. . . . . . . . . . . . . . . . . 4.25 Die Expression und Bindung von c-Maf an Il10 in TH 1 Zellen ist unabhängig 69 von Blimp-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.26 Die Überexpression von c-Maf verstärkt die Blimp-1 Expression in TH 1 Zellen. 72 4.27 Die Notch-vermittelte IL-10 Expression von TH 1 Zellen ist sowohl Blimp-1- als auch c-Maf-abhängig. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 4.28 Der Notch Signalweg verstärkt die Expression von c-Maf in TH 1 Zellen. . . . 74 4.29 Der Notch-Signalweg verstärkt die Bindung von c-Maf an CNS-Regionen im Il10 Lokus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 4.30 Expressionskinetik von Il10, Prdm1 und Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. 4.31 Endogene Expression von Blimp-1 und c-Maf in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. 75 4.32 Assoziation von Prdm1 und Maf mit IL-10 in TH 1, TH 2 und TH 17 Zellen. . 4.33 Die IL-10 Produktion von TH 17 Zellen ist c-Maf-abhängig. . . . . . . . . . . 77 76 78 4.34 IL-10 Produktion von TH 2 und TH 17 Zellen nach Blimp-1 oder c-Maf Überexpression. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.35 Die IL-10 Produktion von Foxp3+ 79 Tregs während einer T.gondii Infektion ist abhängig von Blimp-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.36 Expressionskinetik von Il10, Prdm1 und Maf in IL-27- und IL-27/TGF-❜stimulierten T-Zellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 4.37 Assoziation von Prdm1 und Maf mit IL-10 in IL-27- und IL-27/TGF-❜-stimulierten T-Zellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 4.38 TGF-❜ führt zu einer dynamischen Änderung der IL-10 Regulation von einem Blimp-1-abhängigen zu einem c-Maf-abhängigen Mechanismus. . . . . . . . . 83 4.39 TGF-❜ moduliert die Expression von Blimp-1 und c-Maf auch in TH 1 Zellen. 84 4.40 TGF-❜ inhibiert die IL-10 Produktion von TH 1 Zellen. . . . . . . . . . . . . . 85 5.1 Modell der transkriptionellen Regulation der IL-10 Expression in TH 1 Zellen 95 5.2 TR 1 Zellen vereinen TH 1- und TH 17-spezifische IL-10-regulatorische Elemente. 99 6.1 IL-10-induzierende Signale und Transkriptionsfaktoren in TH -Zellen. . . . . . 8.1 In silico Analyse von STAT und c-Maf Bindungsmotiven in CNS-Regionen im Prdm1 Lokus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2 103 116 In silico Analyse von STAT, c-Maf und Blimp-1 Bindungsmotiven in CNSRegionen im Il10 Lokus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 TABELLENVERZEICHNIS 120 III Tabellenverzeichnis 3.1 Medien und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.2 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.3 Rekombinante Zytokine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.4 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.5 Mäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.6 Polarisierende TH -Zell-Kulturbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.7 Reverse Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.8 PCR-Programm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.9 PCR-Ansatz Lightcycler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.10 PCR-Programm Lightcycler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.11 qRT-PCR Primer und Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.12 SDS-PAGE Trenngel 10 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.13 SDS-Page Sammelgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.14 ChIP Primer und Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.15 Transfektionsansatz Blimp-1 Einzeltransfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 3.16 Bewertungskritierien einer Leberentzündung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.1 Überexpremierte Transkriptionsfaktoren in IL-10+ gegenüber IL-10– TH 1 Zellen. 47 Abkürzungsverzeichnis 121 IV Abkürzungsverzeichnis ❛ ..................... Anti- APC . . . . . . . . . . . . . . . . . Allophycocyanin APZ . . . . . . . . . . . . . . . . . Antigenpräsentierende Zelle BSA . . . . . . . . . . . . . . . . . Bovine Serum Albumin CD . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cluster Of Differentiation cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . Komplementäre Desoxyribonukleinsäure ChIP . . . . . . . . . . . . . . . . Chromatin-Immunopräzipitation CNS . . . . . . . . . . . . . . . . . Conserved Non-coding Sequence Dll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Delta-like DMEM . . . . . . . . . . . . . . Dulbeccos Modified Eagle Medium DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . Desoxyribonukleinsäure dNTP . . . . . . . . . . . . . . . . Desoxy-Nukleotidtriphosphat EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis EDTA . . . . . . . . . . . . . . . Ethylendiamintetraacetat ELISA . . . . . . . . . . . . . . . Enzyme Linked Immunosorbent Assay ERK . . . . . . . . . . . . . . . . . Extracellular-signal Regulated Kinase FCS . . . . . . . . . . . . . . . . . Fetal Calf Serum FITC . . . . . . . . . . . . . . . . Fluorescein-Isothiocyanat GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . Green Fluorescent Protein HEK . . . . . . . . . . . . . . . . . Human Embryonic Kidney HEPES . . . . . . . . . . . . . . 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure IFN . . . . . . . . . . . . . . . . . . Interferon IL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Interleukin IRES . . . . . . . . . . . . . . . . Internal Ribosomal Entry Site IRF . . . . . . . . . . . . . . . . . . Interferon-regulatorischer Faktor kb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kilobase kD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kilodalton KO . . . . . . . . . . . . . . . . . . Knockout loxP . . . . . . . . . . . . . . . . . Locus Of X-over P1 MACS . . . . . . . . . . . . . . . Magnetische Zellsortierung MAPK . . . . . . . . . . . . . . . Mitogen-aktiverte Proteinkinase MHC . . . . . . . . . . . . . . . . Major Histocompatibility Complex mRNA . . . . . . . . . . . . . . . Messenger-RNA NFAT . . . . . . . . . . . . . . . . Nuclear Factor Of Activated T-cells NF-❦B . . . . . . . . . . . . . . . Nuclear Factor ’kappa-light-chain-enhancer’ Of Activated B-cells NIZD . . . . . . . . . . . . . . . . Notch intrazelluläre Domäne Abkürzungsverzeichnis 122 PBS . . . . . . . . . . . . . . . . . Phosphate Buffered Saline PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . Polymerase Chain Reaction PE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phycoerythrin PMA . . . . . . . . . . . . . . . . Phorbol-12-Myristat-13-Acetat qRT-PCR . . . . . . . . . . . . Quantitative Real-Time-PCR rm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rekombinant Murin rh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rekombinant Human RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . Ribonukleinsäure RT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Raumtemperatur STAT . . . . . . . . . . . . . . . . Signal Transducer And Activator Of Transcription TGF . . . . . . . . . . . . . . . . . Transforming Growth Factor T.gondii . . . . . . . . . . . . . Toxoplasma gondii TH -Zelle . . . . . . . . . . . . . T-Helfer-Zelle TLR . . . . . . . . . . . . . . . . . Toll-like Rezeptor TNF . . . . . . . . . . . . . . . . . Tumornekrosefaktor Treg . . . . . . . . . . . . . . . . . Regulatorische T-Zelle TZR . . . . . . . . . . . . . . . . . T-Zell-Rezeptor UBC . . . . . . . . . . . . . . . . . Ubiquitin-conjugating Enzyme E2D2 WT . . . . . . . . . . . . . . . . . . Wildtyp Danksagung 123 V Danksagung An dieser Stelle möchte ich den Personen danken, ohne deren vielfältige Unterstützung die Erstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Zunächst möchte ich Roland Lauster danken, dass er diese Arbeit betreut und eine schnelle und unkomplizierte Abwicklung des Promotionsverfahrens möglich gemacht hat. Mein besonderer Dank gilt Alex Scheffold für die hervorragende Betreuung und zahlreiche anregende Diskussionen während der gesamten Zeit der Promotion. Sascha Rutz danke ich für seine unschätzbare Hilfe und Unterstützung bei der Bearbeitung dieses Projekts, die mich und diese Arbeit wissenschaftlich ungemein vorangetrieben haben. Frederik Heinrich möchte ich für die jahrelange enge und freundschaftliche Zusammenarbeit in der AG Scheffold danken. Petra Bacher danke ich für die vielen konstruktiven Diskussionen und das akribische Korrekturlesen der Promotionsschrift. Allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern der AG Scheffold möchte ich ganz herzlich für die einzigartige freundschaftliche Atmosphäre innerhalb und außerhalb des Labors danken. Allen Kollegen des Deutschen Rheuma-Forschungszentrums danke ich für den offenen und herzlichen Umgang und die große Hilfsbereitschaft untereinander. Mein tiefempfundener Dank gilt meiner Familie für ihr unbeschränktes Vertrauen, ihre liebevolle Unterstützung und den motivierenden Zuspruch in jeder Lebenslage. Mein größter Dank gilt meiner Freundin Ina und unserer wundervollen Tochter Pauline, für ihre uneingeschränkte Liebe und Unterstützung, ohne die ich diese anstrengende und langwierige Promotionszeit nicht gemeistert hätte. Eidesstattliche Erklärung 124 VI Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, Christian Neumann, geboren am 03.09.1984 in Neubrandenburg, die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt zu haben und alle verwendeten Hilfsmittel und Inhalte aus anderen Quellen als solche kenntlich gemacht zu haben. Des weiteren versichere ich, dass die vorliegende Arbeit nie in dieser oder anderer Form Gegenstand eines früheren Promotionsverfahrens war. Berlin, im Juli 2015 ______________ Lebenslauf 125 VII Lebenslauf ANGABEN ZUR PERSON: Name: Neumann Vorname: Christian Geburtsdatum: 03.09.1984 Geburtsort: Neubrandenburg Familienstand: ledig Wohnanschrift: Marienburger Str. 34, 10405 Berlin Staatsangehörigkeit: Deutsch SCHULBILDUNG: 08/1995 - 06/2003 Curie Gymnasium in Neubrandenburg Allgemeine Hochschulreife - Abitur Abschlussnote: 1,5 STUDIUM: 10/2003 - 11/2009 Studium der Biotechnologie an der TU Berlin Diplomarbeit am Centre for Inflammation Research in Edinburgh Thema: „CD46-Isoform specific T cell regulation and its potential role in Multiple Sclerosis“ Abschlussnote: 1,3 BERUFLICHER WERDEGANG: seit 01/2010 Doktorarbeit am Deutschen Rheuma-Forschungszentrum Berlin AG Zelluläre Immunologie, Prof. Dr. A. Scheffold Thema: „Molekulare Regulation der IL-10 Expression in inflammatorischen und regulatorischen T-Helfer-Zellen“ Berlin, im Juli 2015 ______________ Publikationsliste 126 VIII Publikationsliste Siobhan Ni Choileain, Nathan J Weyand, Christian Neumann, Joelle Thomas, Magdalene So, Anne L Astier: The Dynamic Processing of CD46 Intracellular Domains Provides a Molecular Rheostat for T Cell Activation. PLoS ONE 01/2011 Christian Neumann, Alexander Scheffold: Therapeutische Manipulation entzündungsfördernder T-Zellen. Zeitschrift für Rheumatologie 08/2013 1 Christian Neumann, Frederik Heinrich, Katrin Neumann, Victoria Junghans, Mir-Farzin Mashreghi, Jonas Ahlers, Marko Janke, Christine Rudolph, Nadine Mockel-Tenbrinck, Anja A. Kuehl, Markus M. Heimesaat, Charlotte Esser, Sin-Hyeog Im, Andreas Radbruch, Sascha Rutz, Alexander Scheffold: Role of Blimp-1 in programing Th effector cells into IL-10 producers. Journal of Experimental Medicine 07/2014 Claudia Haftmann, Anna-Barbara Stittrich, Jakob Zimmermann, Zhuo Fang, Kristyna Hradilkova, Markus Bardua, Kerstin Westendorf, Gitta A Heinz, René Riedel, Julia Siede, Katrin Lehmann, Esther E Weinberger, David Zimmel, Uta Lauer, Thomas Häupl, Joachim Sieper, Marina Backhaus, Christian Neumann, Ute Hoffmann, Martina Porstner, Wei Chen, Joachim R Grün, Ria Baumgrass, Mareen Matz, Max Löhning, Alexander Scheffold, Jürgen Wittmann, Hyun-Dong Chang, Nikolaus Rajewsky, Hans-Martin Jäck, Andreas Radbruch, Mir-Farzin Mashreghi: miR-148a is upregulated by Twist1 and T-bet and promotes Th1-cell survival by regulating the proapoptotic gene Bim. European Journal of Immunology 12/2014 Katrin Neumann, Christine Rudolph, Christian Neumann, Marko Janke, Derk Amsen, Alexander Scheffold: Liver sinusoidal endothelial cells induce immunosuppressive IL-10-producing Th1 cells via the Notch pathway. European Journal of Immunology 04/2015 1 Enthält vorveröffentliche Teile dieser Dissertation.
