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EUROArray HLA-B27 – Direct Molekulargenetisches Microarray-Testsystem Auswertung mittels EUROArrayScan Protokoll zu jedem Einzelbefund Indikationen: Bestimmung krankheitsassoziierter HLA-B*27-Allele in humaner, genomischer DNA zur Diagnostik rheumatischer Erkrankungen, insbesondere Morbus Bechterew (Spondylitis ankylosans, Ankylosierende Spondylitis, AS), urethro-okulo-artikuläres Syndrom (Morbus Reiter, Symptomkombination Urethritis, Konjunktivitis/Uveitis, Arthritis), Reaktive Arthritis (para-/postinfektiöse Arthritis), akute Uveitis anterior bzw. akute Iridozyklitis, Periarthritis (Periarthropathia) humeroscapularis, Arthritis psoriatica (Psoriasis-Arthritis), juvenile idiopathische Arthritis, Enteropathien (chronisch entzündliche Darmerkrankungen, CED). Klinische Bedeutung: Die Humanen Leukocyten-Antigene (HLA) sind Gewebeantigene (membranassoziierte Glykoproteine) des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC). HLA-B gehört zu den HLA-Antigenen der Klasse I (auch MHC I-Antigene genannt), die auf allen kernhaltigen Körperzellen vertreten sind. Ihre Funktion besteht in der Steuerung der T-Zell-vermittelten Immunantwort. Aufgrund eines extremen genetischen Polymorphismus existiert eine sehr große Zahl an HLA-Phänotypen. Für HLA-B sind über 1000 unterschiedliche Allele bekannt. Allein das HLA-B*27-Allel lässt sich in 51 Subtypen einteilen, die sich jeweils nur in wenigen Basen unterscheiden (B*2701 bis B*2743). EUROIMMUN IIFT Autoimmun-Diagnostik Gewebe-/Zellsubstrate: Auge, Affe Crithidia luciliae Darm, Affe DNS-gebundenes Laktoferrin Erythrozyten, human* Granulozyten, human (Ethanol-fixiert) Granulozyten, human (Formaldehyd-fixiert) Granulozyten, human (Methanol-fixiert) Großhirn, Affe Harnblase, Ratte HEp-2-Zellen HEp-20-10-Zellen Herz, Affe Hoden, Affe HUVEC Hypophyse, Affe Hypothalamus, Affe* Kleinhirn, Affe Knorpel (Trachea), Affe* Leber, Affe Leber, Maus Leber, Ratte Lippe, Affe* Lobus temporalis, Affe* Lunge, Affe Lymphknoten, Affe* Lymphozyten, human* Magen, Affe Magen, Maus Magen, Ratte Mamma, Affe* Milz, Affe* Mundschleimhaut, Affe* Nabelschnur, human Nebenniere, Affe Nebenschilddrüse, Affe Nerv, Affe Niere, Affe Niere, Maus Niere, Ratte Ösophagus, Affe Ösophagus, Ratte Ovar, Affe Pankreas, Affe Parotis, Affe Placenta, Affe* Prostata, Affe Rückenmark, Affe Saccharomyces cerevisiae Schilddrüse, Affe Skelettmuskel, Affe Spermatozoen, human Synovia, Affe Thrombocyten, human Thymus, Affe Tränendrüse, Affe VSM47-Zellen Zunge, Affe Das membranständige HLA-B27-Protein ist mit dem Auftreten mehrerer Autoimmunerkrankungen assoziiert. In Westeuropa beträgt die Prävalenz von HLA-B27 etwa 6 bis 9 %. Bei Vorliegen von HLA-B27 beträgt das relative Risiko für Morbus Bechterew (Spondylitis ankylosans, Ankylosierende Spondylitis) 87,4, für Morbus Reiter (Symptomkombination Urethritis, Konjunktivitis/Uveitis, Arthritis) 37, für die Reaktive Arthritis (para-/postinfektiöse Arthritis) 14 bis 21 (abhängig vom Erreger), für die akute Uveitis anterior bzw. akute Iridozyklitis 10,4, für die Periarthritis (Periarthropathia) humeroscapularis 6,3, für die Arthritis psoriatica (Psoriasis-Arthritis) 4 und für die juvenile idiopathische Arthritis 3,2. Auch Enteropathien (chronisch-entzündliche Darmerkrankungen) sind mit HLA-B27 assoziiert. EUROPLUS®-Substrate: AIH (LC-1 + SLA/LP) BP180 GBM Gliadin Intrinsic Faktor Myeloperoxidase (MPO) PBC (AMA-M2 + Sp100) Proteinase 3 (PR3) ribosomale P-Proteine + Jo-1 nRNP/Sm + Sm + SS-A SS-A + SS-B SS-B + ribosomale P-Proteine + Jo-1 SS-B + Scl-70 + Jo-1 Thyreoglobulin (TG) Morbus Bechterew gehört zu den chronisch-entzündlichen rheumatischen Erkrankungen des Achsenskeletts (Wirbelsäule, Iliosakralgelenke, Schambeinfugen und kleine Wirbelgelenke), der Extremitätengelenke und der Sehnenansätze. Vorwiegend erkranken Männer zwischen dem 15. und 30. Lebensjahr. Besonders deutlich ist der Zusammenhang zwischen dieser Erkrankung und dem Vorliegen von HLA-B27. Ca. 90 % aller Bechterew-Patienten sind Träger dieses Gewebsantigens, insbesondere der Subtypen B*2702, B*2704 und B*2705. Die Subtypen B*2706 und B*2709 sind hingegen nicht mit dieser Krankheit assoziiert. Die HLA-B*27-Bestimmung ist folglich von differentialdiagnostischer Bedeutung. Transfizierte Zellen: Aquaporin-4 BP230 Desmoglein 1 + 3 NMDA-Rezeptor rPAg 1 + 2 (Pankreas-Antigen 1 + 2) Stellenwert des EUROArray HLA-B27 – Direct: Die Bestimmung von HLA-B27 gelingt exakt und präzise mit molekularbiologischen Methoden über den Nachweis des entsprechenden Allels (HLA-B*27) in der genomischen DNA des Patienten. Diese Methode ist in Konkurrenz getreten zu den bisher durchgeführten Lymphocytotoxizitätstests. Insbesondere die PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung allelspezifischer Primer hat das Potential, zuverlässige Ergebnisse zu liefern, vor allem auch für die verschiedenen HLA-B*27-Subtypen. Aufgrund der bei Antikörpern auftretenden Kreuzreaktivitäten (z. B. mit HLA-B7) und möglicher falsch-negativer Befunde in der Immunphänotypisierung bei niedriger HLA-B*27-Expression ist die molekulargenetische HLA-B*27-Bestimmung spezifischer und sensitiver als serologische Methoden. Beim vorliegenden Testsystem sind die HLA-B*27-Primer so ausgewählt und optimiert worden, dass alle bisher bekannten HLA-B*27-Subtypen erfasst werden. Weiterhin wird im positiven Fall angezeigt, ob es sich um die Subtypen HLA-B*2706 oder HLA-B*2709 handeln könnte, die beide nicht mit dem Auftreten der Spondylitis ankylosans assoziert sind. BIOCHIP-Mosaiken®: ANA-Globaltest: HEp-20-10/Leber (Affe) Autoantikörper-Profile: Kombinationen von 30 verschiedenen Geweben pro Objektträger CIBD-Profil: Pankreas (Affe)/intest. Becherz. (Kultur)/ Granulozyten (EtOH)/Saccharomyces cerevisiae Basisprofil: HEp-20-10/Leber (Affe)/ Niere (Ratte)/Magen (Ratte) EUROPLUS® Endomysium + Gladin: Darm (Affe)/Leber (Affe)/Gliadin Granulozyten-Mosaik: Granulozyten (EtOH)/ Granulozyten (HCHO)/HEp-2/Leber (Affe) Leber-Mosaik: HEp-2/Leber (Affe)/Leber (Ratte) Niere (Ratte)/Magen (Ratte)/Herz (Affe) Neuronale Antikörper: Kleinhirn (Affe)/ Nerv (Affe)/Darm (Affe) Polyendokrinopathie-Mosaik: Schilddrüse (Affe)/ Pankreas (Affe)/Nebenniere (Affe)/Ovar (Affe)/ Hoden (Affe)/Magen (Affe) Weitere Mosaiken ebenfalls erhältlich Spezielle Substratkombinationen auf Anfrage * In der EU zur Zeit nicht als IVD im Vertrieb. Hergestellt in Deutschland EUROIMMUN AG · 23560 Lübeck · Seekamp 31 · Telefon 0 45 1 / 58 55-0 · Fax 58 55-591 · E-Mail [email protected] · www.euroimmun.de Test-Charakteristika EUROArray HLA-B27 – Direct EUROIMMUN IIFT Infektionsserologie Viren: Adenoviren Chikungunya-Viren Coxsackie-Viren Cytomegalie-Viren (CMV) Dengue-Viren Typen 1-4 (DENV) ECHO-Viren Epstein-Barr-Virus-Capsid-Antigen (EBV-CA) Epstein-Barr-Virus-Early-Antigen (EBV-EA) Epstein-Barr-Virus-Nuclear-Antigen (EBNA) FSME-Viren Gelbfieber-Viren (YFV) Hantaviren (Typen Hantaan, Puumala, Seoul, Saaremaa, Dobrava, Sin Nombre, Andes*) Herpes-simplex-1 und -2-Viren (HSV-1/2) HIV-1 und -2* Humane Herpes-6-Viren (HHV-6) Influenza-Viren A (Shangdong, Singapore, Beijing) Influenza-Viren B (Panama) Japanische Enzephalitis-Viren (JEV)* Krim-Kongo-Fieber-Viren (CCHFV)* Masern-Viren Mumps-Viren Parainfluenza-Viren Typen 1-4 Respiratory-Syncytial-Viren (RSV) Röteln-Viren* Sandfliegen-Fieber-Viren* (Typen Sicilian, Naples, Toscana, Cyprus) SARS-Coronaviren (SARS-CoV) Varizella-Zoster-Viren (VZV) West-Nil-Viren (WNV) Bakterien: Afipia felis* Bartonella henselae Bartonella quintana Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Borrelia afzelii Borrelia burgdorferi Borrelia garinii Campylobacter coli* Campylobacter jejuni* Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Chlamydia trachomatis Haemophilus influenzae* Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae* Legionella bozemanii* Legionella dumoffii* Legionella gormanii* Legionella jordanis* Legionella longbeachae* Legionella micdadei* Legionella pneumophila Serotypen 1-14 Listeria monocytogenes 1/2 a, 4b* Mycoplasma hominis Mycoplasma pneumoniae Treponema pallidum Treponema phagedenis Ureaplasma urealyticum Yersinia enterocolitica* DNA-Extrakt Blutprobe Testprinzip: Der EUROArray ist ein in-vitro-Test zur Blutprobe bzw. -Probe molekulargenetischen Bestimmung krankheitsassoziierter HLA-B*27-Allele in humaner, genomischer DNA. Als Probenmaterial dient EDTA-Blut (DirektDirekt-Verfahren DNA-Isolierung (Extraktionslsg. 1 + 2) (nicht im Testsatz Verfahren) oder isolierte genomische DNA des Paenthalten) tienten. Bei Verwendung des Direkt-Verfahrens wird die genomische DNA der Blutzellen für die PCR zuPCR (Polymerasegänglich gemacht, indem das Blut mit der im Testkettenreaktion) system enthaltenen Extraktionslösung verdünnt und für eine Minute inkubiert wird. Im ersten Analyseschritt werden aus dem so hergestellten Extrakt bzw. alternativ einer genomischen Patienten-DNA-Probe DNA-Microarraymit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) zwei Hybridisierung Abschnitte (Exon 2 und Exon 3) des HLA-B-Gens sowie als Positivkontrolle ein ß-Globin-Genfragment vervielfältigt. Eine Amplifizierung der HLA-B-Genabschnitte erfolgt nur, falls ein HLA-B*27-Allel in der Probe vorliegt. Alle PCR-Produkte werden bei ihrer Vollautomat. Entstehung mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Auswertung Im zweiten Schritt werden die Produkte mit einem Microarray analysiert, auf dem zur vervielfältigten DNA komplementäre Sonden immobilisiert sind. Die spezifische Bindung (Hybridisierung) des fluoreszierenden PCR-Produkts am korrespondierenden Microarray-Spot wird mit dem EUROIMMUN Microarray-Scanner detektiert. Ein Fluoreszenzsignal an den HLA-B*27-spezifischen Spots zeigt die Anwesenheit eines HLA-B*27-Allels in der Patienten-DNA an. Testdurchführung: Bei direktem Einsatz von EDTA-Blut wird die Probe zunächst für eine Minute mit Extraktionslösung 1 inkubiert und anschließend Extraktionslösung 2 zugesetzt. Für die PCR wird ein Aliquot dieses Extrakts oder alternativ einer gereinigten DNA-Probe mit den vorgefertigten PCR-Reagenzien gemischt. Die PCR-Ansätze werden im Thermocycler und anschließend auf EUROArray-Objektträgern mit Microarray-BIOCHIPs unter Anwendung der TITERPLANE®Technik inkubiert. Das Scannen und Auswerten erfolgt mit dem EUROIMMUN Microarray-Scanner und dem EUROArrayScan-Programm. Dieses Programm ermöglicht eine vollautomatische Auswertung der EUROArray-Analysen und eine detaillierte Dokumentation der Ergebnisse. Sensitivität und Spezifität: Das Microarray-Testsystem erfasst alle HLA-B*27-Subtypen und zeigt ein mögliches Vorliegen der nicht krankheitsassoziierten Subtypen HLA-B*2706 und HLA-B*2709 an. EUROPLUS®-Substrate: Borrelia VlsE (rekombinant) Borrelia OspC EBV p19 + gp125 Referenzproben EDTA-Blutproben1 von Blutspendern, Deutschland (12 HLA-B*27 positiv, 88 HLA-B*27 negativ vorcharakterisiert) 100 Hefen: Candida albicans Candida glabrata* Candida krusei* Candida parapsilosis* Candida tropicalis* DNA-Proben2 der „International Histocompatibility Working Group“ (IHWG): „Sequence Polymorphism Reference Panel (SP Reference Panel)” sowie „HLA (Anthropology) Reference Panel“ (6 HLA-B*27 positiv, 49 HLA-B*27 negativ vorcharakterisiert) 55 Parasiten: Echinococcus granulosus Leishmania donovani Plasmodium falciparum HRP-2/MSP-2 (rek.)* Plasmodium vivax MSP/CSP (rekombinant)* Toxoplasma gondii Profile: Begleithepatitis-Profil Exanthem-Profil Fieber-Profil Südostasien Flaviviren-Profil Gastrointestinaltrakt-Profil Infektarthritis-Profil Infektarthritis-Profil (Tropen) Lymphadenitis-Profil Myokarditis-Profil Ophthalmologie-Profil Otitis-Profil Respirationstrakt-Profil Schwangerschafts-Profil STD-Profil TORCH-Profil ZNS-Profil 1 2 n Referenzmethode molekulargenetisch Sensitivität Spezifität 100 % 100 % 100 % 100 % molekulargenetisch Die Untersuchungen wurden sowohl direkt aus EDTA-Blut mit Hilfe des Direkt-Verfahrens als auch mit DNA-Proben durchgeführt, die aus EDTABlut mit Hilfe des „DNA whole blood kit S CE IVD“ isoliert wurden. Diese Untersuchung wurde nicht für das Direkt-Verfahren durchgeführt. Robustheit: Mit dem Direkt-Verfahren war die Bestimmung für 100 untersuchte EDTA-Blutproben in allen Fällen (100 %) erfolgreich. Für DNA-Proben war die Bestimmung ebenfalls in allen Fällen (100 %) erfolgreich (n = 150). Technische Daten: Substrat Einzelsträngige DNA-Sonden, Länge: 20 bis 50 Nukleotide. Testablauf Arbeitszeit für 40 Proben: ca. 40 min (DNA-Proben) bzw. 60 min (Blutproben im Direkt-Verfahren). Gesamtdauer eines Testlaufs mit 40 Proben einschließlich Inkubationszeit: ca. 2 h 30 min bzw. 2 h 50 min. Reagenzien Gebrauchsfertig. Kontrollen Integrierte HLA-B27-Positivkontrolle (kein Positiv-Kontrollansatz nötig). Integrierte DNA-Positivkontrolle. Spezielle Substratkombinationen auf Anfrage CE-IVD-zertifiziert Kompletter Prozess inkl. DNA-Extraktion bzw. -Isolierung ist validiert. Hergestellt in Deutschland Packungsformate 10 oder 20 Objektträger, jeder mit 5 Testfeldern. Version: 04/10 MV_5110_D_DE_B01 Bestellnummer MN 5110-####-V * In der EU zur Zeit nicht als IVD im Vertrieb. EUROIMMUN AG · 23560 Lübeck · Seekamp 31 · Telefon 0 45 1 / 58 55-0 · Fax 58 55-591 · E-Mail [email protected] · www.euroimmun.de
