Entwicklung regulierbarer retro- und adenoviraler Vektoren für die
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Entwicklung regulierbarer retro- und adenoviraler Vektoren für die Gentherapie Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) genehmigte Dissertation von Jacqueline Unsinger aus Oldenburg 1. Referent: Prof. Dr. Jürgen Bode 2. Referent: Prof. Dr. Rüdiger Cerff eingereicht am: 14.02.2001 mündliche Prüfung (Disputation) am: 26.06.2001 Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Publikationen Kwissa, M.; Unsinger, J.; Schirmbeck, J.; Hauser, H.; Reimann, J. (2000). Polyvalent DNA vaccines with bidirectional promoters. J. Mol. Med. 78:495-506 Tagungsbeiträge Unsinger, J.; Hauser, H.; Lindenmaier, W.; Wirth, D.: Retroviral, adenoviral and retro/adenoviral chimeric vectors for regulated gene expression. (Poster) 8th Meeting of the European Society of Gene Therapy (ESGT) Stockholm, Schweden (2000) Unsinger, J.; Hauser, H.; Wirth, D.: Constitutive and inducible vectors for complement stabilization of Pig-A deficient cells. (Poster) Federal program “Health Research 2000" BMBF-program, German Aerospace Center (DLR), Berlin (2000) I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1. Gentherapie: Hoffnungen, Probleme und erste Erfolge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2. Retroviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.2.1. Aufbau von Retroviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.2.2. Lebenszyklus von Retroviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.2.3. Retroviraler Gentransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.2.4. Retrovirale Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3. Adenoviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3.1. Aufbau von Adenoviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3.2. Organisation des adenoviralen Genoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.3.3. Lebenszyklus von Adenoviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.3.3.1. Frühe Phase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.3.3.2. Späte Phase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.3.4. Adenoviraler Gentransfer und Sicherheitsaspekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.4. Regulierbare Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.4.1 Funktion des Tetracyclin-regulierten Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.4.2. Autoregulative Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.5. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2. Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.1. Auswahl des tet-on oder tet-off-Systems für den Aufbau der autoregulierten Kassetten . . . 24 2.2. Vergleich der Expressions- und Regulationseigenschaften von konstitutiv und autoreguliert exprimiertem Transaktivator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.3. Entwicklung autoregulatorischer Expressionskassetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.3.1. Konstruktion des unidirektionalen autoregulierten Systems A . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.4. Schlechte Regulation des Vektors pLEGTA nach Elektrotransformation . . . . . . . . . . . . . . 29 2.4.1. Regulation nach Infektion von NIH3T3 mit SIN-LEGTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.4.1.1. Herstellung von retroviralen SIN-LEGTA Produzentenzellen . . . 31 2.4.1.2. Die Regulationseigenschaften der Kassette SIN-LEGTA nach retroviralem Transfer sind nicht verbessert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.4.2. Anreicherung von Zellen mit vollständiger Vektorintegration durch Sortierung GFP exprimierender Infektanten im FACS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.4.3. Langzeitstabililität des nach retroviraler Infektion integrierten Vektors SIN-LEGTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.4.4. FACS-Sortierung zum Erhalt homogen regulierter Gemische mit SIN-LEGTA . . 40 2.4.5. Abschließende Bewertung der Regulationseigenschaften des autoregulierbaren Systems A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.5. Aufbau eines bidirektionalen autoregulativen Expressionssystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.5.1. Konstruktion der Fusionsgene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.6. Bewertung der Expressionsregulation der bidirektionalen Systeme B und C nach Elektrotransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.6.1. Expression und Regulation von pTLGTN (System B) nach Elektrotransformation 43 2.6.1.1. Langzeitstabilität pTLGTN-exprimierender Zellen nach Elektrotransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.6.2. Expression und Regulation von pTHTG (System C) nach Elektrotransformation . 48 2.7. Expressionsregulation der Systeme B und C nach retroviraler Infektion . . . . . . . . . . . . . . . 50 2.7.1. Herstellung und Analyse retroviraler Verpackungszellen für SIN-TLGTN. . . . . .50 2.7.1.1. Es zeigten sich keine vollständigen Vektor-Integrate nach retroviraler Infektion mit den bicistronischen Vektoren SIN-TLGTN und LTR-TLGTN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 II Inhaltsverzeichnis 2.7.2. Positionseffekt-unabhängige Expression nach Infektion mit den monocistronischen Vektoren SIN-THTG und LTR-THTG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 2.7.2.1. Die Dosis-abhängige Repressionskurve demonstriert ein übereinstimmendes Regulationsmuster der Infektanten . . . . . . . . . . 54 2.7.2.2. Induktion der Expression auch nach Langzeitkultivierung unter reprimierenden Bedingungen möglich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.8. Analysen zur Titerverbesserung des Vektorsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 2.8.1. Geringe Titer durch Vektorrearrangements? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2.8.1.1. Untersuchung auf mögliche Splice Sites oder pA-Signale im retroviralen Vektor LTR-THTG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 2.8.2. Der Titer wird leicht durch die Ausbildung der Antisense RNA reduziert . . . . . . 62 2.8.3. Änderung der Genanordnung durch Umorientieren der regulierten Kassette führt nicht zur Titererhöhung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 2.8.4. Auswirkung der suboptimalen Polyadenylierung auf den viralen Titer . . . . . . . . . 64 2.8.5. Geringer Virustiter durch Ausbildung stabiler Sekundärstrukturen im Bereich des bidirektionalen Promotors? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 2.9. Adenovirale Vektoren als effiziente Transfervehikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 2.9.1. Insertion der bidirektionalen autoregulierten Expressionskassetten in den adenoviralen Vektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 2.9.1.1.Herstellung der rekombinanten Adenoviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 2.9.2. Die hohe Regulationskapazität ist unabhängig von der episomalen Kopienzahl . . 69 2.9.3. Verbesserte Regulation im Adenovirus durch Flankieren der regulierbaren Kassette mit retroviralen Elementen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 2.9.4. Bestimmung der Integrationsfrequenz von Adenoviren und chimären Retro/Adenoviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 2.9.5. Regulationskapazität nach stabiler Integration von Ad-LTR-THTG und Ad-THTG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 3. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Regulierte Expressionssysteme für gentherapeutische Anwendungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1. Beschreibung der autoregulativen Single-Step-Transduktionsysteme A, B und C . 3.1.2. Autoregulative Systeme und die Basalexpression im reprimierten Status . . . . . . . 3.2. Bidirektionale Systeme sind in Expression und Regulation dem unidirektionalen System überlegen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1. Das unidirektionale System A zeigt nach Elektrotransformation niedrigere Luziferase-Expression als System B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1.1. Verminderte Expressionsleistung beruht möglicherweise auf einer limitierten Transaktivatorkonzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2. Bessere Regulationskapazität der Systeme B und C im Vergleich mit System A . 3.2.2.1. Einfluss benachbarter Vektorsequenzen auf die Regulationskapazität 3.2.2.2. Einfluss der Anordnung des Transaktivatorgens auf die Expressionsregulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2.3. Einfluss der Vektorinstabilität auf die Regulationseigenschaften des Systems A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2.4. Zum Erhalt hoher und stabiler Regulationsfaktoren erweisen sich die bidirektionalen Systeme B und C geeignet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Bidirektionale Kassetten B und C im Vergleich mit publizierten Systemen . . . . . . . . . . . . 3.4. Retroviraler Transfer der autoregulierten Kassetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1. Niedrige Titer durch Vektorinstabilitäten und Rearrangements . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2. Splice-Signale im bidirektionalen Promotor und im Transaktivator führen möglicherweise zur Transduktion verkürzter RNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 80 80 80 81 81 82 82 83 84 85 85 86 88 89 90 III Inhaltsverzeichnis 3.4.3. Verbesserungen des retroviralen Titers sind nicht möglich . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 3.5. Probleme des Positionseffekts (PEV) für die Gentherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 3.5.1. Bedeutung der PEV für die regulierte Genexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 3.5.2. PEV wird durch das Flankieren mit cis-agierenden retroviralen Elementen stark reduziert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 3.5.2.1. Die PEV-unabhängige Expression ist nicht auf den retroviralen Gentransfer zurückzuführen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 3.5.2.2. Die PEV-unabhängige Expression ist möglicherweise Ursache von Promotor-Interferenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 3.5.2.3. Die PEV-unabhängige Expression resultiert möglicherweise aus der reversen Orientierung des Reporters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.5.2.4. Das fehlende poly-A-Signal des revers orientierten Reporters reduziert die Expressionsleistung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.5.2.5. LTRs besitzen vermutlich keine Insulatorfunktion . . . . . . . . . . . . . . . 98 3.6. Design von positionsunabhängigen, autoregulierten Expressionskassetten . . . . . . . . . . . . . 99 3.7. Integrierende Adenoviren: vielversprechender Vektortyp für die Gentherapie? . . . . . . . . . 100 3.7.1. Regulationskapazität nach adenoviraler Integration spiegelt Regulation nach retroviraler Infektion wider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 3.7.2. Effizienz der Integration der chimären Vektoren im Vergleich mit der retroviralen Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 3.8. Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 3.8.1. in vivo Anwendung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 3.8.2. Verwendung gentherapeutisch relevanter Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 3.8.3. Detektion hochregulierbarer Genloci und Austausch des Reporters mit Hilfe der Sequenz-spezifischen Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 3.8.4.Verwendung lentiviraler Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 4. Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1. Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.1. Autoradiographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2. Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.3. Computerprogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Allgemeine Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1. Sterilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1.1. Sterilisation durch Hitze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1.2. Sterilisation durch Filtration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2. Phenolisieren von Nukleinsäuren (Deproteinisierung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.3. Fällung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4.1. ... spektrometrisch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4.2. ... fluorometisch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4.3. ... elektrophoretisch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5. Herstellung von Acrylamid/Bisacrylamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4. Arbeiten mit E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.1. Verwendete E.coli-Stämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.2. Kulturmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.3. Kultivierung von E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4. Transformation von E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4.1. Herstellung kompetenter Zellen für Elektrotransformation . . . . . . . . 4.4.4.2. Elektrotransformation von Plasmiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.5. Anlage von Stammkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 108 109 109 109 110 110 110 110 110 110 111 111 111 111 112 112 112 112 112 113 113 113 113 114 IV Inhaltsverzeichnis 4.5. Isolierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1. Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1.1. ... im analytischen Maßstab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1.1.1. nach Birnboim und Doly,1979 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1.1.2. “Boiling prep” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1.2. ... im präparativen Maßstab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1.3. ... als "Midi"-Plasmidpräparation (Fa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.2. Isolierung von DNA aus Agarosegelen mit Hilfe des QIAquick “Gel Extraktions Kits” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.3. Isolierung von hochmolekularer DNA (HMW-DNA) aus Säugerzellen . . . . . . . 4.5.3.1. HMW-DNA-Präparation (unter Verwendung von Phenol) . . . . . . . . 4.5.3.2. HMW-DNA für Southern Blots oder PCR (schnelle Methode) . . . . 4.5.4. Isolierung von RNA aus Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6. Modifikation von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.1. Restriktionsanalyse von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.2. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.3. Auffüllen 5'-überstehender Enden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.4. Ligase-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.5. Oligohybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7. Radioaktive Nachweismethoden von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.1. Markierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.1.1. Random-Priming mit "Redi-Prime DNA Labelling System" . . . . . . 4.7.1.2. Klenow-Markierung von -DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.2. Southern Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.2.1. Southern Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.2.2. Hybridisierung des Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.3. Northern Blot Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.3.1. Hybridisierung von Northern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8. Charakterisierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.2.1. DNA-Amplifikation durch PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.2.2. DNA-Mutagenese durch PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.3. Sequenzierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.3.1. ... von Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.3.2. ... von PCR-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8.3.3. ... durch die Firma EUROGENTEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9. Gelelektrophoresen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.1. Agarose Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.2. Sequenziergele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.2.1. Herstellung von Sequenziergelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.2.2. Silianisierung von Glasplatten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.2.3. Trocknung von Polyacrylamidgelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.3. Formaldehyd-Agarosegele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.4. Visualisierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.4.1. ... mit Ethidiumbromid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9.4.2. ... durch Autoradiographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10. Arbeiten mit eukaryontischen Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.1. Kulturmedien und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.2. Zellinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.3. Kultivierung von Zellinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.3.1. Passagieren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.3.2. Langzeitlagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 114 114 114 115 115 116 117 117 117 118 119 119 119 120 121 121 122 122 122 122 122 123 123 124 125 125 126 126 126 127 128 128 130 130 130 130 131 131 132 132 132 133 133 133 133 133 134 134 135 135 V Inhaltsverzeichnis 4.10.3.3. Isolierung von Zellklonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.4. Gentransfermethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.4.1. Transfektion mittels Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation . . . . . 4.10.4.1.1. Stabile Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.4.1.2. Transiente Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.4.1.3. Transfektion mit Fugene Transfektionsreagenz . . . . . . 4.10.4.2. Retrovirale Infektion von Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.4.2.1. Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.10.4.2.2. Berechnung der Infektionsmultiplizität . . . . . . . . . . . . . 4.11. Herstellung von Adenoviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.1. Transfektion von 293 LP-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.2. Zellernte nach Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.3. Prä-Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.4. Zellernte zur Herstellung des sekundären Virusstocks: Freeze-Thaw-Lysates . . 4.11.5. Adenovirale Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.6. Präparative Zellernte nach Virusinfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.7. Virus-Aufreinigung mittels CsCl-Ultrazentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.8. Infektion zur Herstellung von Virus-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.8.1. Herstellung von Virus-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.8.2. Restriktionskartierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.9. Virus-Titer-Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.11.10. Infektion nicht permissiver Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12. Proteinanalytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.1. Fluorescence activated cell sorting (FACS-Analysen) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.1.1. Indirekte Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.1.2. GFP-Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.1.3. Viruspartikelfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.2. Bilddokumentation und -bearbeitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.3. Verwendete Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.4. Herstellung von Zellextrakten für Reportergen-Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.5. Bradford-Proteinbestimmung (Mikroassay) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.12.6. Luziferase Nachweis (Aktivitätstest nach Williams et al., 1989) . . . . . . . . . . . . 135 136 136 136 137 137 138 138 139 140 140 141 141 142 142 143 143 145 145 146 147 148 149 149 149 149 150 151 151 151 151 152 5. Verwendung und Herstellung von Plasmiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 5.1. Verwendete Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 5.2. Hergestellte Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 6. Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Danksagung Lebenslauf VI Zusammenfassung Zusammenfassung Die Möglichkeit, die Expression von Genen zu regulieren, ist sowohl in der Forschung als auch in der Gentherapie ein wünschenswertes Ziel. Jedoch unterliegt die Regulation der Limitation, dass alle regulierbaren Expressionssysteme aus zwei Komponenten bestehen, dem Transaktivatorprotein und dem Transaktivator-abhängigen Promotor, die in die Zielzellen transferiert und adequat exprimiert werden müssen. Darüber hinaus ist das Expressions- und Regulationspotential abhängig von der chromosomalen Umgebung des Integrationsortes. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene autoregulative Expressionskassetten basierend auf dem tet-regulierten System entwickelt. Diese Kassetten wurden so konstruiert, dass sie alle Regulationskomponenten beinhalten und so in einem Schritt transferiert werden können (SingleStep-Systeme). Durch die autoregulative Anordnung des Transaktivators bleibt seine Expression auf die Phase der Geninduktion beschränkt. Toxische Nebenwirkungen werden so minimiert. Diese Kassetten wurden sowohl über Elektrotransformation als auch über retro- und adenovirale Infektion in die Zielzellen eingebracht und das jeweilige Expressions- und Regulationspotential ermittelt. Während sich das unidirektionale System aufgrund von niedrigen Regulationsfaktoren und hoher Vektorinstabilität zum Erhalt stabiler und regulierter Genexpression ungeeignet zeigte, offenbarten die bidirektionalen Systeme hohe Expressions- und Regulationspotentiale. Nach Elektrotransformation konnten stabile Regulationsfaktoren bis zu 1000 ermittelt werden. Jedoch war die Expression und Regulation wie erwartet abhängig vom jeweiligen chromosomalen Integrationsort. Nach retroviraler Infektion der bidirektionalen Kassetten fand sich eine sehr stringente Expressionsregulation in allen untersuchten Zellen. Diese Regulationskapazität scheint unabhängig vom Integrationsort zu sein, was die Vermutung nahe legt, dass die flankierenden LTRs die integrierte Kassette von endogenen Einflüssen abschirmen. Die verbesserte Regulation der LTR-flankierten Kassette bestätigte sich auch nach adenoviraler Infektion. Allgemein offenbarten adenoviral mit den bidirektionalen Kassetten infizierte Zellen exzellente Regulation bis über drei Logstufen unabhängig von der episomalen Kopienzahl. Bei Untersuchungen zur Integration adeno/retroviraler chimärer Vektoren, die eine Kombination der positiven retroviralen und adenoviralen Eigenschaften darstellen, zeigte sich, dass die Integrationshäufigkeit der chimären Vektoren über zwei Logstufen im Vergleich zu den LTRfreien Kassetten erhöht ist. Etwa 1 % der chimär infizierten Zellen zeigten die stabile Expression der transduzierten Kassette sowie eine mit der retroviralen Transduktion vergleichbare strikte Transgenregulation. Damit zeigten die bidirektionalen Kassetten nach jeder der für die Gentherapie relevanten Transfermethoden hohe Regulationskapazität. Das neue adeno/retrovirale chimäre System bietet neben der stabilen und strikt regulierten Expression zusätzlich alle Vorteile des adenoviralen Systems und könnte sich so zu einem relevanten System in der Gentherapie entwickeln. 1 1.Einleitung 1. Einleitung In der biologischen und medizinischen Forschung, sowie in der Gentherapie spielen der effiziente Transfer der rekombinanten DNA und die adequate Expression der interessierenden Gene eine entscheidende Rolle. Der DNA-Transfer kann dabei sehr unterschiedlich erfolgen. Während in der Forschung auch nicht virale Transfermethoden, wie die DNA-KalziumphosphatKopräzipitation, Elektroporation und Mikroinjektion zur Transduktion von Zelllinien verwendet werden, finden in der Gentherapie hauptsächlich virale Transfersysteme Anwendung. Zur Zeit werden vor allem retrovirale und adenovirale Systeme aufgrund ihre effizienten ex vivo und in vivo Transduktion von unterschiedlichen Zelltypen genutzt. Die Regulation eines eingebrachten therapeutischen Gens bietet die Möglichkeit, die Expressionsleistung zu variieren und so den verschiedenen Umständen anzupassen, um optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Regulationspotential verschiedener Expressionskassetten nach gentherapeutisch relevanten Transfermethoden zu untersuchen. Im Folgenden wird zunächst ein kurzer Überblick über die Ziele und Möglichkeiten der Gentherapie gegeben. Zum besseren Verständnis des viralen Gentransfers werden Aufbau und Lebenszyklus von Retroviren und Adenoviren beschrieben. Da das zentrale Thema dieser Arbeit den Aufbau optimaler Regulationseinheiten darstellt, wird die Wirkungsweise regulierbarer Expressionssysteme vorgestellt. 1.1. Gentherapie: Hoffnungen, Probleme und erste Erfolge Unter Gentherapie versteht man das Einbringen von Genen in somatische Zellen zu therapeutischen Zwecken, das heißt, zur Heilung oder Linderung ererbter genetischer Defekte oder erworbener Krankheiten. Der Gentransfer kann entweder ex vivo (genetische Modifizierung entnommener Zellen und Rückführung der veränderten Zellen) oder in vivo (Transfer des genetischen Materials direkt in den Organismus) erfolgen. Die Notwendigkeit der Gentherapie ergibt sich aus dem Fehlen anderer effizienter Behandlungsmöglichkeiten, bzw. deren starker Nebenwirkungen (z. B. bei der Chemotherapie bei Krebs) oder sehr kostenintensiven Behandlungen. Die Tabelle 1.1. gibt einige Beispiele für Krankheiten, die für eine gentherapeutischen Behandlung in Frage kommen (Verma und Somia. 1997) 2 Krankheit 1.Einleitung Defekt Häufigkeit Zielzellen Schwere kombinierte Adenosindesaminase selten Knochenmarkszellen Immunodefizienz (ADA) in 25% der (SCID/ADA) SCID-Patienten vererbt Hämophilie oder T-Lymphozyten A Faktor VIII Defizienz 1:10.000 Männer Leber-, Muskel-, Fibro- B Faktor IX Defizienz 1:30.000 Männer blasten-, Knochenmarkszellen Familiäre Defizienz an “low- 1: 1.000.000 Leberzellen Hypercholesterolämie density” Lipoprotein defekter Transport 1:3.000 Atemwege der Lunge von Salzen im Lun- Kaukasier (LDL)-Rezeptor Cystische Fibrose genepithel; Verlust des CFTR Genes Hämoglobinopathien: strukturelle Defekte Thallassämien/ im - oder -Globin- Sichelzellanämie Gen Gaucher's disease Defekt im Enzym 1:6.000 in bestimmten ethnischen Gruppen Mangel an 1-Anti- vererbtes Emphysem trypsin zellen (Knochenmarkszellen) 1:450 Ashkenazi GlukozerebrosidaseJuden 1-Antitrypsin-Defizienz: Erythrozytenvorläufer- Knochenmarkszellen, Makrophagen 1:3500 Lungen- oder Leberzellen erworben Krebs Vielzahl von Ur- 1 Million /Jahr Vielzahl an Krebszell- sachen, darunter (USA) Typen: Gehirn, Brust, genetische Prädispo- Niere, Pankreas, u. a. sition und Umwelt Neurologische Erkrankungen Parkinson's, Alzheimer's Verletzungen der 1 Million Parkinson's direkte Injektion in das und 4 Millionen Gehirn: Nerven-, Glia- Alzheimer's Patienten und Schwannzellen Wirbelsäule in den USA Kardiovaskuläre Retinosis 13 Millionen in den Arterien, vaskuläre Erkrankungen Arteriosklerose USA Endothelzellen Infektionskrankheiten AIDS, Hepatitis B steigende Anzahl T-Zellen, Leberzellen Makrophagen Tabelle 1.1. Beispiele für Krankheiten, die sich für gentherapeutische Ansätze eignen. Vom anfänglichen Ziel der Gentherapie, der Behandlung ererbter oder erworbener genetischer Defekte, zeichnet sich eine Trendwende ab, die vor allem von der pharmazeutischen Industrie voran getrieben wird. Hier liegt das Interesse in der Entwicklung von gentherapeutischen Protokollen für häufiger auftretende Krankheiten, wie Krebs und AIDS. 3 1.Einleitung Der erste Patient wurde 1990 gentherapeutisch behandelt (Adenosindeaminase) (Anderson, 1990). Inzwischen wurden bisher schätzungsweise etwa 3500 Patienten in gentherapeutische Projekte eingebunden (Romano et al., 2000). Dabei befassen sich weltweit etwa 70 % aller gentherapeutischen Ansätze mit der Behandlung von Krebs, 14 % mit monogenetischen Erkrankungen (hauptsächlich mit der Cystischen Fibrose), 10 % mit Infektionskrankheiten (hauptsächlich mit AIDS) und 6 % mit verschiedenen anderen Erkrankungen (Morgan und Blaese, 1999). Obwohl die Tendenz weiterhin steigend ist, sind die Erfolge gentherapeutischer Programme noch gering. Eine erfolgreiche Gentherapie setzt nicht nur die Identifizierung eines geeigneten therapeutischen Gens voraus, sondern auch den effizienten Transfer des korrigierenden Gens in die gewünschten somatischen Zielzellen, sowie die entsprechende regulierte Produktion des Transgens zur Heilung oder Linderung der Krankheitssymptome. Für den Gentransfer stehen zur Zeit eine Reihe von viralen und nicht-viralen Vektorsystemen zur Verfügung. Vektoren, die bereits in der Klinik getestet wurden, basieren auf Retroviren, Adenoviren, AAV (Adeno-assoziierte Viren), Vaccinia-Viren, Canarypox-Viren, HerpesSimplex-Virus (HSV), cationischen Liposomen, Polylysin-DNA-Komplexen und der Injektion von nackter DNA. Präklinische Studien wurden bereits für weitere virale Vektorsysteme durchgeführt (zusammenfassend in Romano et al., 2000). Tabelle 1.2. führt die spezifischen Charakteristika verschiedener häufig verwendeter Systeme auf. Bei den derzeit etwa 320 klinischen Studien (Morgan und Blaese, 1999) finden die effektiveren viralen System, vor allem retrovirale Vektoren (Romano et al., 1999) am häufigsten Anwendung. Die meisten dieser Studien befinden sich in Phase I und II (Sicherheitsstudien). Der gerichtete, d. h. zellspezifische effiziente in vivo Transfer eines therapeutischen Gens in die entsprechenden Zielzellen ohne toxische oder immunogene Nebenwirkungen ist immer noch eines der wichtigsten Ziele in der Gentherapie. Darüber hinaus ist in vielen Fällen die Regulation der Transgenexpression wünschenswert, z. B. zur Aktivierung oder Reprimierung der Expression wenn notwendig, oder zum Erhalt der Transgenkonzentration in einem therapeutischen Rahmen. Der ideale Vektor sollte in hohen Konzentrationen leicht und reproduzierbar herzustellen sein. Ein gerichteter Transfer, d. h. das in vivo Targeting der spezifischen Zielzellen ist wünschenswert. Optimal wäre die spezifische Integration in charakterisierte chromosomale Orte, die eine vorhersagbare stabile Expression erlauben, oder der stabile Erhalt episomaler 4 1.Einleitung Vektoren (z. B. nach adenoviraler Infektion). Keines der zur Zeit verfügbaren Systeme erfüllt alle diese Anforderungen (vgl. Tabelle 1.2.). Eigenschaften Retroviral Lentiviral Adenoviral nackte/Lipidverpackte DNA maximale Größe der 7-7,5 kb 7-7,5 kb ~ 30 kb unlimitiert >107 >107 >1011 unlimitiert ex vivo ex/in vivo ex/in vivo ex/in vivo nein ja ja ja Integration ja ja nein wenig Expression stabil stabil transient transient Aufreinigung / < 20-50 L unbekannt leicht her- leicht herzustellen Insertion Konzentrationen (Viruspartikel /ml) Weg des Gentransfers Infektion sich nichtteilender Zellen Herstellungs- zustellen maßstab Immunologische gering gering groß keine bereits bestehende unwahr- unwahrscheinlich ja nein Immunität scheinlich (Ausnahme Entzündungs- keine Probleme möglicherweise AIDS-Patienten) weitere Sicher- Insertions- heitsprobleme mutagenese Insertionsmutagenese reaktion, Toxizität Tabelle 1.2. Vergleich der Eigenschaften unterschiedlicher Vektorsysteme (verändert nach Verma und Somia, 1997) Das jeweils geeignetste Vektorsystem ist abhängig vom genetischen Defekt, und vom therapeutischen Ziel. Bei einem angeborenen Defekt dürfte ein Vektor am günstigsten sein, der durch die Integration ins Genom eine dauerhafte Expression des Transgens ermöglicht (z. B. retrovirale Vektoren), während sich für eine kurze aber hohe Expression, z. B. zur 5 1.Einleitung Toxinexpression in Tumorzellen, andere Systeme, wie z. B. adenovirale Vektoren eignen. Von großem Interesse ist auch die Konstruktion von adenoviralen/retroviralen Hybridvektoren, die die Vorteile beider Systeme kombinieren. So wird die effiziente in vivo Transduktion vieler Zellen (auch nicht proliferierender Zellen) durch den adenoviralen, die Integration und stabile Expression über den retroviralen Anteil möglich (Feng et al., 1997; Zheng et al., 2000). Die Anforderungen an eine erfolgreiche Gentherapie unterscheiden sich stark. Während z. B. bei der Cystischen Fibrose nur ein Teil der Zielzellen das Transgen exprimieren muß, ist es in der Krebstherapie notwendig, alle Tumorzellen zu erreichen (Miller und Vile, 1995). Erste große Erfolge der Gentherapie zeigten sich kürzlich in der Behandlung der schweren kombinierten Immundefizienz SCID-X1. Diese vererbare Krankheit ist im frühen Stadium letal. Es handelt sich hierbei um eine frühe Blockade in der T-Lymphocyt- und Natürlichen Killerzellentwicklung, ausgelöst durch die Mutation der c Cytokin-Rezeptor-Untereinheit verschiedener Interleukin-Rezeptoren. CD34+-Zellen zweier Patienten (acht und elf Monate alt) wurden ex vivo retroviral (MoMLV-basierend) mit der komplementierenden c-DNA transduziert und retransplantiert. Die T- und NK-Zellentwicklung konnte dadurch über den gesamten Untersuchungszeitraum von elf Monaten vollständig rekonstituiert werden (Cavazzana-Calvo et al., 2000; Leonard, 2000). 1.2. Retroviren 1.2.1. Aufbau von Retroviren Retroviren besitzen ein diploides, einzelsträngiges RNA-Genom positiver Polarität. Die beiden identischen RNA-Moleküle sind von einem ikosaedrischen Kapsid und einer Membranhülle umgeben (Abb. 1.1.). Sie besitzen einen Durchmesser von 80 bis 130 nm. Die RNA-Moleküle besitzen eine Größe von 8 bis 10 kb und haben die Struktur einer mRNA mit methylierter Kappe (Cap) und poly(A)-Schwanz (Coffin, 1984). Sie dimerisieren in der Nähe ihrer 5'-Enden über Basenpaarung (Prats et al. 1990) und sind assoziiert mit einer zellulären tRNA und zwei essentiellen Enzymen, der Reversen Transkriptase (RT) und der Integrase. Dieser RNA/Protein Komplex wird geschützt durch Nucleocapsid-Proteine (Nucleocapsid-Komplex). Die Matrixproteine und auch die viralen Proteasen befinden sich zwischen dem Kapsid und der äußeren viralen Hülle. Die Anordnung der Gene, die für Strukturproteine kodieren, ist stets gag- 6 1.Einleitung pol-env. Einige Virusgruppen besitzen darüber hinaus Gene für regulatorische Proteine (z.B. HIV, HTLV). Man bezeichnet diese Viren deshalb als komplexe Retroviren im Gegensatz zu den einfachen Retroviren (z. B. MMTV, Mo-MLV). Abb. 1.1. Struktur eines retroviralen Partikels (Luciw und Leung, 1992) Die Kapsid-Proteine werden von dem gag-Gen (gruppenspezifische Antigene) kodiert. Die Translation des gag-Gens erfolgt von der vollständigen viralen RNA und liefert ein VorläuferPolyprotein, welches von der viralen Protease in mindestens drei unterschiedliche Kapsidproteine gespalten wird. Die drei invarianten Proteine sind das Matrix-Protein (MA), das Kapsid-Protein (CA) und das Nukleokapsid-Protein (NC). Das Matrix-Protein ist mit der Membranhülle assoziiert, das Kapsidprotein bildet die Kapsidhülle und das Nukleoprotein ist mit der genomischen RNA assoziiert. Der Nukleoproteinkern wird als Kapsid bezeichnet. In dem Kapsid sind neben der genomischen RNA die viralen Enzyme, die vom pol-Gen kodiert werden, und eine zelluläre tRNA, die als Primer für die Virusreplikation dient, vorhanden. Die pol-Proteine gehen aus einem gag-pol-Polyprotein durch Spaltung mittels der viralen Protease (PR) hervor. Es handelt sich hierbei um die Reverse Transkriptase (RT) und die für die Integration des Provirus verantwortliche Integrase (IN). 7 1.Einleitung Um das Nukleokapsid befindet sich eine Membranhülle, die von der Zellmembran stammt. In ihr sind spezifische Virusproteine (env-Proteine) eingelagert. Das env-Gen, welches von einer gespleißten subgenomischen RNA translatiert wird, kodiert zwei Glykoproteine, das Oberflächenprotein (SU) und das Transmembranprotein (TM), die durch Spaltung aus einem größeren Vorläuferprotein hervorgehen. Das TM-Protein verankert den env-Komplex in der Membran, während das mit ihm nicht kovalent assoziierte SU-Protein verantwortlich für die Erkennung von Zelloberflächen-Rezeptoren ist. Retroviren infizieren viele Vertebratenarten, vor allem Säugetier- und Vogelarten. Sie werden nach verschiedenen Kriterien wie Morphologie, Wirtsspektrum und Pathologie in Klassen und Subklassen eingeteilt. Ihre Wirtsspezifität wird vom env-Genprodukt bestimmt, welches bestimmte Zelloberflächen-Rezeptoren erkennt. Viele Oncogen-tragende Varianten sind bekannt. Viele der Retroviren findet man sowohl als exogene als auch endogene Viren vor. Murine Retroviren werden in Abhängigkeit ihres Wirtsspektrums in ecotrope, amphotrope und xenotrope Viren unterteilt. Während ecotrope Viren nur Mauszellen infizieren können, infizieren amphotrope (und polytrope) Viren sowohl murine als auch nicht-murine Zellen. Xenotrope Viren können lediglich nicht-murine Zellen infizieren. Der ecotrope Rezeptor fungiert als Transporter für basische Aminosäuren, der amphotrope als Transporter für Phosphat. 1.2.2. Lebenszyklus von Retroviren Im retroviralen Lebenszyklus lassen sich eine frühe und eine späte Phase unterscheiden (Varmus und Swanstrom, 1984). Zu Beginn der frühen Phase bindet das Virus an den zellulären Rezeptor der Wirtszelle. Nach Fusion viraler und zellulärer Membranen und Eintritt des Kapsids in das Zytoplasma wird die virale RNA revers transkribiert (Abb. 1.2.). Die entstehende DNA ist ein lineares Molekül mit redundanten Enden von ca. 600 bp (LTR, "long terminal repeat"). Die lineare DNA, die virale Integrase und Kapsidproteine werden als Nukleoproteinkomplex in den Zellkern transportiert (Bowerman et al., 1987). Dort wird die DNA auf spezifische Weise von der viralen Integrase ins Zellgenom integriert, wozu die cis-agierenden Sequenzen (sog. "att-sides") erforderlich sind (Colicelli und Goff, 1985). Das entstehende Provirus ist von den 8 1.Einleitung LTR's begrenzt. Die späte Phase umfaßt alle Schritte, die zur Freisetzung von reifen Viren führen, die einen neuen Replikationszyklus initiieren können. Zunächst erfolgt die Transkription der proviralen DNA. Das Transkript beginnt im 5' LTR und endet im 3' LTR. Die Steuersignale (Enhancer, Promotor und Polyadenylierungssignal) für die Transkription durch die zelluläre RNA Polymerase II befinden sich in den LTRs (Coffin, 1984). Die entstehende RNA besitzt eine CAP-Struktur und einen Poly(A)-Schwanz. Sie wird partiell gespleißt. Von der gespleißten RNA wird das env-Polyprotein exprimiert, von der ungespleißten RNA werden das gagPolyprotein und das gag-pol-Polyprotein exprimiert (Coffin, 1984). Die Leserahmen von gag und pol sind je nach Virustyp durch ein Stopkodon (Yoshinaka et al., 1985) oder eine Leserasterverschiebung (Jacks und Varmus, 1985) getrennt. Durch Überlesen dieser Barrieren entsteht das gag-pol-Polyprotein in einem definierten Verhältnis zum gag-Polyprotein. Die ungespleißte RNA stellt gleichzeitig die genomische RNA dar. Sie besitzt nahe ihres 5' Endes die sogenannte Verpackungssequenz (4), die eine spezifische Verpackung der viralen RNA in Viruspartikel bewirkt. (Mann und Baltimore, 1985). Genomische RNA, gagPolyprotein und gag-pol-Polyprotein assoziieren und werden durch Ausknospung, d. h. durch Umhüllen mit einer Membran, die env-Protein enthält, freigesetzt. Die Partikel können nun Zellen mit entsprechendem Rezeptor infizieren. Die Reverse Transkription (Abb. 1.2.) beginnt am 5' Ende der RNA mit der Synthese der Minusstrang-DNA. Als Primer dient eine zelluläre RNA, die an der Primerbindungsstelle (PB) hybridisiert ist. Zunächst werden U5 und R revers transkribiert (1). Nach Degradierung von R durch RNase H (funktionelle Domäne von RT) entsteht einzelsträngige DNA (2). Es kommt zum "Template"-Sprung, wobei R' mit der komplementären R-Sequenz am 3' Ende des viralen RNA Moleküls hybridisieren kann. Der Sprung kann auf dasselbe RNA-Molekül (intramolekularer Sprung) oder das koverpackte RNA-Molekül (intermolekularer Sprung) (hier dargestellt) erfolgen (3). Die Reverse Transkription wird nun fortgesetzt bis zur Primerbindungsstelle PB (4). RNase H degradiert anschließend die virale RNA bis zur Grenze der 3' U3-Sequenz und generiert damit einen Oligonukleotidprimer, den Plus-Strang-Primer PB+, zur Synthese der Plus-Strang-DNA. Diese Primersequenz wird auch als Polypurintrakt (PPT) bezeichnet. Die DNA wird zunächst bis zur PB verlängert (5). Die t-RNA und der RNA-Primer PB+ werden entfernt, und es kommt zu einem intramolekularen Sprung aufgrund 9 1.Einleitung der Komplementarität der Primerbindungsstellen PB (6). Die Synthese der beiden DNAStränge kann nun beendet werden (7). An beiden Enden des Provirus sind identische LTR's entstanden, wobei U3 vom 3' Ende und U5 vom 5' Ende der RNA stammt. Abb. 1.2. Modell für die retrovirale DNA-Synthese durch Reverse Transkription (Luciw und Leung, 1992) 1.2.3. Retroviraler Gentransfer Retrovirale Vektoren werden seit Anfang der 80er Jahre für den Transfer von Fremdgenen in verschiedene Zielzellen eingesetzt. Dabei werden die in trans wirkenden retroviralen Leseraster (gag-pol-env) im einfachsten Fall gegen das zu transferierende Fremdgen und einen zusätzlichen Selektionsmarker zur Detektion erfolgreich transduzierter Zellen ausgetauscht. Die cis-agierenden Elemente (LTRs, 4, PPT, PBS) verbleiben in funktionaler Anordnung und gewährleisten die Verpackung der rekombinanten RNA in Viruspartikel. Die für die Verpackung notwendigen Virusproteine werden von einer sogenannten Verpackungszelle in trans zur Verfügung gestellt (Abb. 1.3.). Durch Trennung der viralen trans- und cis-Sequenzen ist nur ein Replikationszyklus möglich, da die infizierten Zielzellen keine Virusproteine produzieren. Das Wirtsspektrum wird durch das in der Verpackungszelle exprimierte ENV-Gen 10 1.Einleitung bestimmt. Der retrovirale Gentransfer bietet gegenüber anderen Transfermethoden den Vorteil, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Zelllinien aus verschiedenen Geweben effizient und stabil manipulierbar sind. Bei niedrigem Virus/Zell-Verhältnis integriert nach Infektion nur eine einzelne Kopie des viralen Vektors. Dieser Zustand ist aus Stabilitätsgründen der tandemartigen Mehrfachintegration nach Transfektion vorzuziehen. Darüber hinaus kann die Expressionsleistung durch Tandemintegrate reduziert werden (Garrick et al., 1998). Abb. 1.3. Herstellung rekombinanter Retroviren mit Hilfe von Verpackungszellen. Die Möglichkeit der RCRBildung über homologe Rekombination zwischen retroviralem Vektor und Verpackungssequenzen ist dargestellt. Ein Haupteinwand gegen die retrovirale Transfertechnik ist das Risiko der Insertionsmutagenese, die entweder zur Zerstörung zelluläre Gene führen kann, oder zur Aktivierung von zellulären Onkogenen durch den retroviralen 3' LTR. Powell et al., 1999 berichtete jedoch, dass die Transformationsrate verursacht durch die Insertion von replikationsdefekten Retroviren unter der Rate der spontanen zellulären Transformation liegt. Ein weiteres Problem ist die mögliche Gefahr der Entstehung von Viren mit veränderten Eigenschaften (Scarpa et al., 1991; Otto et al., 1994). Dabei kann es zur Koverpackung zellulärer Gene kommen (Retrofektion) (Linial, 1987; Linial und Miller, 1990) oder durch Rekombination zwischen homologen Sequenzen des retroviralen Vektors, der Helferfunktion und endogener retroviraler Sequenzen (Abb. 1.3.) zur Entstehung replikationskompetenter 11 1.Einleitung Retroviren (RCRs) (Muenchau et al., 1990; Scarpa et al., 1991; Otto et al., 1994). Die Entstehung von RCRs stellt ein vornehmliches Sicherheitsproblem dar, denn vollständig intakte Viren können sich in der Kultur verbreiten. Dies stellt für nicht-immunsupprimierte Patienten kein Problem dar, da RCRs vom Komplementsystem sofort inaktiviert werden. Es wurde jedoch die Enstehung von T-Zelllymphomen durch amphotrope RCRs in Rhesusaffen gezeigt. In den letzten Jahren wurde deshalb eine Vielzahl von Helfer/Vektorsystemen entwickelt, um die Risiken einer Rekombination in den Verpackungszellen zu minimieren. Ziel ist es, die Homologien zwischen retroviralem Vektor und Verpackungsfunktion zu reduzieren und damit die Anzahl an Rekombinationsereignissen, die zur Enstehung von RCRs führen können, zu maximieren. 1.2.4. Retrovirale Vektoren Die meisten bisher in der Gentherapie verwendeten retroviralen Vektoren basieren auf dem Moloney murinem Leukämie Virus (MLV) (Shinnick et al., 1981). In diesem Vektortyp bleibt der 5' LTR nach reverser Replikation aktiv und kann zur Expression von Transgenen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich der sogenannte SIN (self inactivating)retrovirale Vektor verwendet. Bei diesem Vektortyp wurden 299 bp der U3-Region des 3' LTRs deletiert. Die Deletion umfasst den größten Teil der zwei 72 bp Wiederholungen mit der Enhanceraktivität, sowie die Promotorregion (Yu et al., 1986). Nach Transfektion dieses Vektortyps wird aufgrund des intakten 5' LTRs die gesamte rekombinante DNA transkribiert und die so gebildetete genomische virale RNA in Viruspartikel verpackt. Während der reversen Replikation gelangt die deletierte U3-Region des 3' LTRs aufgrund der Verdopplung dieses Bereichs in den 5' LTR (vgl. Abb.1.2.). Dieser ist nun inaktiv und kann nicht zur Expression inserierter Genen genutzt werden. Durch die Inaktivierung können Promotor-Interferenzen und die Beeinflussung der Expressionsregulation des Transaktivator-abhängigen Promotors durch den 5' LTR möglicherweise reduziert werden. 1.3. Adenoviren Adenoviren verursachen im Menschen gewöhnlich akute Atemwegserkrankungen. Sie wurden erstmals 1953 aus spontan degenerierten primären Zellen humaner Gewebewucherungen des 12 1.Einleitung Nasenraum (Polypen) isoliert (Rowe et al., 1953). Bis heute umfasst die Familie der Adenoviridae über 100 Mitglieder, die eine große Zahl von Zelltypen unterschiedlicher Spezies infizieren können. Beim Menschen sind 47 Serotypen beschrieben, die in sechs Subgruppen (A bis F), anhand ihrer Fähigkeit Erythrocyten zu agglutinieren, unterteilt werden. Die meisten zum Gentransfer genutzten Adenoviren leiten sich vom Serotyp 5 der Subgruppe C ab, da sie keine pathogenen oder onkogenen Eigenschaften aufweisen. 1.3.1. Aufbau von Adenoviren Adenoviren besitzen ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom, das von einer ikosaedrischen Proteinhülle, dem Viruskapid umgeben ist. Das Kapsid besitzt eine Größe von 70 bis 100 nm und setzt sich aus 252 Untereinheiten, den Kapsomeren zusammen, die sich in 240 Hexons und 12 Pentons unterteilen (Abb. 1.4.). Abb. 1.4. Struktur eines adenoviralen Partikels (Shenk, 1996) Von den wahrscheinlich elf verschiedenen Virion-Proteinen werden sieben für die Bildung der äußeren Hülle benötigt. Das Hexon-Kapsomer ist ein Trimer aus drei eng assoziierten Polypeptid II-Molekülen. Das Gitter der Hexon-Kapsomere wird vermutlich von den Polypeptiden VI, VIII und IX stabilisiert. Die Proteine VIII und IX dienen zusätzlich als Verbindung zwischen Kapsid und den Kernkomponenten. Die Penton-Kapsomere bestehen aus einem Basis-Protein, das zur Kapsidoberfläche gehört, und einem Glykoproteinfortsatz, dem Fiber-Protein. Dieses Trimer besteht aus dem Polypeptid IV und ragt charakteristisch an jedem Scheitelpunkt des Ikosaeders heraus. 13 1.Einleitung Der Kern des Virions setzt sich aus vier Proteinen und dem viralen Genom zusammen. Die Polypeptide V, VII, X und TP binden an die virale DNA. Das Protein VII ist dabei Hauptkernprotein und besitzt möglicherweise Histon-ähnliche Funktion. Protein V bindet an das Penton-Capsomer und stellt so die Verbindung zwischen Kern und Kapsid dar. Das Terminal-Protein (TP) ist kovalent an das 5' Ende der viralen DNA angeheftet und spielt bei der viralen Replikation eine wichtige Rolle. Es wurde indirekt durch seine Fähigkeit DNA zu zirkularisieren entdeckt (Robinson et al., 1973). 1.3.2. Organisation des adenoviralen Genoms Das Genom der Adenoviren besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNA von etwa 36 kb. Eine Genkarte des Adenovirus (Abb. 1.5.) wird konventionsgemäß beginnend mit dem E1AGen am linken Ende dargestellt. Jedes Ende des Genoms weist einen inverted terminal repeat (ITR) mit jeweils einem Replikationsursprung auf. Die ITRs dienen während der Virusreplikation zur Zirkularisierung von DNA-Einzelsträngen. Innerhalb der ersten 400 Basenpaare des adenoviralen Genoms ist die Verpackungssequenz lokalisiert, die die Interaktion der Virus-DNA mit den Kapsidproteinen während des Zusammenbaus neuer VirusPartikel ermöglicht. Die Verpackungssequenz besteht aus sieben Elementen, die aufgrund ihres hohen AT-Gehalts als A-Elemente (AI bis AVII) bezeichnet werden. Das relativ komplexe Genom der Adenoviren besitzt mehrere Transkriptionseinheiten, die in zeitlichen Clustern exprimiert werden (Abb. 1.5.). Die fünf frühen Transkriptionseinheiten (E1A, E1B, E2, E3 und E4) sowie die zwei verzögert frühen Einheiten (IX und IVa2) werden vor Beginn der Replikation exprimiert, die späte Transkriptionseinheit, die in fünf späte mRNA-Familien prozessiert wird, erst nach Beginn der Replikation. Allgemein gilt, dass die in den frühen und verzögert frühen Transkriptionseinheiten codierten Proteine vor allem der Regulation der viralen und zellulären Aktivität dienen, wogegen die späte Transkriptionseinheit für die Hüllproteine codiert. Die E1A-Einheit codiert für zwei Proteine, die die Transkription adenoviraler Gene aktivieren, und gemeinsam mit den Proteinen der E1B-Einheit den Eintritt der Zelle in die S-Phase induzieren. E2 codiert für drei Proteine, die alle an der Replikation der Virus-DNA beteiligt sind (das Terminal-Protein: beteiligt an der Zirkularisierung der DNA; eine Polymerase; ein Einzelstrang-bindendes Protein). Die Proteine 14 1.Einleitung der E3-Einheit sind beteiligt an der Modulation der Immunantwort des infizierten Organismus. Die E4 codierten Proteine besitzen regulatorische Funktionen bei der Transkription und Replikation der viralen DNA sowie beim mRNA-Transport. Abb. 1.5. Schema des Adenovirus 5-Genoms mit seinen Transkriptionseinheiten Die Expression der späten Gene beginnt nach Beginn der Virus-Replikation und ist in einem einzigen langen Transkript organisiert, das in mindestens 18 mRNAs prozessiert wird. Die Unterteilung der Transkripte in die Familien L1 bis L5 erfolgt aufgrund der Verwendung gleicher Polyadenylierungsstellen. Die späten Proteine spielen bei der Produktion des Viruskapsids eine Rolle. 1.3.3. Lebenszyklus von Adenoviren Der Infektionszyklus des Adenovirus 5 wird in zwei Phasen unterteilt. Zur frühen Phase gehören die Adsorption und Penetration des Viruspartikels sowie die Expression der frühen Gene. Die späte Phase der Infektion beginnt mit der Replikation der viralen DNA und schließt mit der Zusammensetzung des Viruspartikels ab. Die Gesamtdauer eines Infektionszykluses beträgt in HeLa-Zellen etwa 20 bis 24 Stunden. 15 1.Einleitung 1.3.3.1. Frühe Phase Der Infektionsprozess beginnt mit der Adsorption des C-terminalen Endes des Fiberproteins, des sogenannten Fiber-Knobs an den zellulären Rezeptor. Bislang wurden als zelluläre Rezeptoren die MHC I 2-Domäne (Hong et al., 1997) und der Coxsackievirus/AdenovirusRezeptor (CAR) (Bergelson et al., 1997) identifiziert. Die Internalisierung des Virus erfolgt über Rezeptor-vermittelte Endocytose, wobei neben der Interaktion des Fiber-Proteins mit dem zellulären Rezeptor auch die Interaktion des Basis-Proteins des Penton-Kapsomers mit zellulären Integrinen erforderlich ist. Die Absenkung des pH-Wertes innerhalb der Endosomen führt zur Freisetzung der Viruspartikel in das Zytoplasma der Zellen. Der Transport der Viruspartikel zum Zellkern erfolgt wahrscheinlich mit Hilfe von Mikrotubuli (Shenk,1996). Am Kernporenkomplex wird vermutlich das lineare Adenovirus-Genom aus den Viruspartikeln in den Zellkern freigesetzt. Der Internalisierungsprozess ist mit der selektiven Dissoziation des Virions, z. B. durch das Absenken des pH-Wertes in den Endosomen oder durch proteolytische Degradation, verbunden. Dabei scheint die Dissoziation des Fiber-Proteins ein initiierendes Ereignis für die nachfolgende Abbaukaskade zu sein. Jede Degradation ist vermutlich Voraussetzung für folgende Strukturveränderungen. Nach Eintritt der Virus-DNA in den Zellkern erfolgt ihre über das Terminal-Protein vermittelte Assoziation an die Kernmatrix. Gleichzeitig startet die Transkription der frühen viralen Transkriptionseinheiten. Neben der Aktivierung der späten viralen Gene und der Replikation der viralen DNA modulieren die Genprodukte der frühen Gene (besonders das E1A-Protein) auch die zelluläre Aktivität der infizierten Zelle. So aktivieren sie den Zellzyklus, verhindern die Initiation der Apoptose und blockieren antivirale Maßnahmen des Wirtes. 1.3.3.2. Späte Phase Mit dem Eintritt der infizierten Zelle in die S-Phase des Zellzyklus und der Akkumulation des E2-Proteins startet die virale Replikation am Replikationsursprung des ITRs und endet erst mit der Lyse der Zelle. Das Terminalprotein fungiert als Primer für die DNA-Replikation und vermittelt die Regeneration der Enden der Virus-DNA während der Replikationsrunden. Die Elongation wird durch zwei E2-codierte Proteine, die Polymerase und das Einzelstrang- 16 1.Einleitung bindende Protein vermittelt. Einige E4-Proteine werden ebenfalls für die Replikation benötigt, ihre genaue Funktion ist jedoch unklar. Die Synthese der DNA erfolgt in zwei Abschnitten. Zunächst wird nur ein DNA-Strang vollständig repliziert. Der entstandene Doppelstrang besteht aus Eltern- und Tochterstrang. Der zweite Elternstrang wurde bei der Synthese verdrängt und wird erst im zweiten Schritt als Vorlage für die Bildung eines weiteren Stranges verwendet. Die späten Gene werden erst mit Beginn der DNA-Replikation effizient von einer Transkriptionseinheit, die unter der Kontrolle des major late Promotors steht, exprimiert. Eine Kaskade von Ereignissen, in deren Verlauf das während der verzögert frühen Phase exprimierte IVa2-Protein an den major late Promotor bindet, führt zu dessen Aktivierung und zur Induktion der späten Gene. Die nun erfolgende Akkumulation von Strukturproteinen sowie die Replikation der Adenovirus-DNA induziert den Zusammenbau der Viruspartikel in der infizierten Zelle. Dabei wird zunächst ein leeres so genanntes Präkapsid aus Hexon- und Penton-Kapsomeren gebildet, in das nachfolgend, durch die Interaktion der Verpackungssequenz mit dem Kapsid, die DNA, beginnend mit dem linken Ende, verpackt wird. Die Freisetzung der produzierten Viruspartikel erfolgt durch die Lyse der infizierten Zelle. 1.3.4. Adenoviraler Gentransfer und Sicherheitsaspekte Rekombinante adenovirale Vektoren wurden erstmals 1985 hergestellt und basieren auf den adenoviralen Serotypen 2 oder 5, da diese nicht mit Erkrankungen oder Tumoren bei Mensch oder Tier assoziiert sind. 1993 wurden rekombinante Adenoviren erstmalig zur Behandlung der Cystischen Fibrose gentherapeutisch eingesetzt (Zabner et al., 1993). Der in dieser Arbeit zur Herstellung replikationsdefekter und damit sicherer Viren verwendete rekombinante adenovirale Vektor entspricht aufgrund der Deletionen der frühen Gene E1 und E3 einem Vektortyp der ersten Generation. Mit der Deletion der E1- und E3-Region verliert der Virus die Fähigkeit zur Transkriptionsaktivierung sowie zur Modulation des Zellzykluses und der zellulären Immunantwort. Die restlichen cis-agierenden Elemente und Gene verbleiben in funktionaler Anordnung. Dieser Vektortyp bietet eine Klonierungskapazität von etwa 8 kb. Zur Herstellung der rekombinanten Adenoviren wurde das in der Arbeitsgruppe Lindenmaier/Dittmar entwickelte sehr einfache und effiziente Cosmid-System verwendet (Abb. 17 1.Einleitung 1.6.). Es basiert auf adenoviralen Cosmidvektoren, die das gesamte Adenovirus 5 Genom mit Ausnahme der E1- und E3-Region enthalten. Nach Insertion der gewünschten Transgene über konventionelle Klonierungsstrategien lassen sich diese Vektoren über die cos-Stelle des Lambda-Genoms in vitro in Lambda-Phagen verpacken. Abb. 1.6. Darstellung des Cosmidsystems zur Herstellung rekombinanter Adenoviren Die Infektion von E. coli mit Hilfe der Phagen erfolgt mit deutlich höherer Effizienz als die sonst übliche Elektrotransformation von Plasmid-DNA dieser Größe. Ein weiterer Vorteil des Cosmidsystems liegt in der selektiven Verpackung der Cosmidvektoren. Nur Genome mit cosStelle und einer Größe von 36 kb bis 52 kb werden verpackt. Da der Vektor allein eine Größe von 36 kb besitzt, werden bevorzugt Vektoren mit Transgen verpackt. Die Cosmidvektor-DNA kann nach der Vermehrung in E. coli charakterisiert und zur Produktion der Viren in die 293Helferzellen transfiziert werden, die die fehlenden Genprodukte der E1- und E3-Region in trans zur Verfügung stellen. Der adenovirale Gentransfer bietet einige positive Eigenschaften. So können ruhende und ausdifferenzierte Zellen effektiv transduziert werden. Adenoviren können mit Titern von bis zu 1010 cfu/ml produziert werden. Sie sind sehr stabil und lassen sich leicht zu Titern von 1012 cfu/ml aufkonzentrieren. Sie bieten sehr hohe, allerdings nur transiente Transgen-Expression. 18 1.Einleitung Ein entscheidender Nachteil ist jedoch ihre hohe Immunogenität. Neben entzündlichen und toxischen Reaktionen des Wirts kann es zur Eliminierung adenoviral transduzierter Zellen (Tripathy er al., 1996) und zur reduzierten Wirksamkeit bei erneuter Administration kommen (Dai et al., 1995). Zur Verminderung der Immunogenität der Vektoren wurden verschiedene Deletionen erprobt, mit vielfältigen und häufig differierenden Ergebnissen verschiedener Gruppen (Romano et al., 2000). Auch sogenannte “gut-less”-Vektoren, in denen alle viralen Gene deletiert wurden, verhindern nicht vollständig die Immunogenität der Adenoviren, da die Proteine, die mit den Viren in den Organismus eingebracht werden selbst das Immunsystem aktivieren können. Ein weiterer Nachteil ist die nur transiente Expression der episomal verbleibenden Viren. In verschiedenen Ansätzen konnte die Transgen-Expression zwar verlängert werden, z. B. durch die Deletion des E2a-Gens (Engelhardt et al., 1994), jedoch blieb sie transient. Die kürzlich durch Zheng et al. (2000) berichtet Integration von chimären Adeno-/Retroviralen Vektoren könnte möglicherweise zur stabilen Expression von adenoviral transduzierten Genen genutzt werden (vgl. auch Kap. 3.7.). Diese Eigenschaften limitieren die Anwendbarkeit rekombinanter Adenoviren in der Gentherapie, wenn die stabile Langzeitexpression zur Behandlung von ererbten oder erworbenen Defekten, wie z. B. neurologische oder kardiovaskuläre Erkrankungen, notwendig ist (Romano et al., 2000). Wie bereits bei den Retroviren beschrieben, können auch während der Produktion von Adenoviren RCAs (replikationskompetente Adenoviren) entstehen. Auch hier wurde durch die Reduktion von homologen Sequenzen zwischen dem Vektor und der Helferfunktion die Generierung von RCAs durch homologe Rekombination weitgehend minimiert. 1.4. Regulierbare Systeme Die regulierte Expression von Transgenen findet sowohl in der Biologie als auch in der Medizin breite Anwendung. Sie ist z. B. Voraussetzung für die Erforschung der Genregulation und Genfunktion während der Entwicklung, für die Analyse der Funktion spezifischer Gene an verschiedenen biologischen Prozessen, für die Expression von Genprodukten, die toxisch oder wachstumsinhibierend wirken sowie für die sichere und kontrollierte Administration in der Gentherapie. Ein regulierbares System sollte drei Charakteristika besitzen. 1.) Spezifität: Es 19 1.Einleitung sollte nicht mit endogenen Aktivatoren oder zellulären Reaktionswegen interferieren. 2.) Effektivität: Es sollte niedrige Basis-Expressionslevel im reprimierten Zustand und hohe induzierte Expression aufweisen. Die jeweiligen Expressionszustände sollten jederzeit reversibel sein. 3.) Dosis-Abhängigkeit: Die Expressionsstärke sollte modulierbar sein (Saez et al., 1997). Die ersten regulierbaren Systeme basierten auf endogenen Elementen wie Cytokin-responseElementen oder Heat-Shock-Proteinen. Sie zeigten jedoch pleiotrope Effekte und nur geringe Spezifität. Eine große Verbesserung stellt die Entwicklung von Systemen dar, deren Elemente nicht oder auf mutierten endogenen Elementen des Säugergenoms basierten. In diesen Systemen moduliert ein kleines so genanntes Inducer-Molekül die Aktivität eines synthetischen Transkriptionsfaktors, der wiederum über einen heterologen Promotor die Expression des Transgens reguliert. Vier dieser Systeme existieren bis heute: 1. Das Tetracyclin (tet)induzierbare System (Gossen und Bujard, 1992), 2. das FK506/Rapamycin-induzierbare System, 3. das RU486/Mifepriston-induzierbare System und 4. das Ecdyson-induzierbare System (Rossi und Blau, 1998). In dieser Arbeit wurde das tet-regulierte System verwendet und wird daher im Folgenden detaillierter beschrieben. 1.4.1 Funktion des Tetracyclin-regulierten Systems In dem von Gossen und Bujard (1992) entwickelten Tetracyclin-regulierten System wurden prokaryontische Regulationseinheiten aus E. coli zur regulierten Genexpression in eukaryontischen Zellen eingesetzt. Der Promotor basiert auf regulatorischen Elementen des Tn 10 spezifischen Tetracyclin-Resistenz-Operons (tetO) von E. coli, die mit einem minimalen eukaryontischen Promotor (gewöhnlich mit dem immediate early Cytomegalovirus (CMV) Promotor) ligiert wurden. Zur Transkription ist die Bindung eines koexprimierten chimären Transaktivators (tTA) erforderlich, der aus der Tetracyclin-Repressor-Domäne (tetR) von E. coli zur Anbindung an den Promotor und der potenten viralen Transkriptionsaktivator-Domäne VP16 des Herpes Simplex Viruses zur Aktivierung der Expression besteht (Abb. 1.7.). In der Originalversion dieses Systems wird durch die Zugabe von tet die Bindung des tTA an den Promotor und so die transkriptionelle Aktivierung reprimiert. Das System wird als tet-off System bezeichnet. In einer zweiten Variante, die als tet-on System bezeichnet wird und auf 20 1.Einleitung einer mutierten tetR-Sequenz basiert, wird der Transaktivator durch die Zugabe von tet aktiviert und erlangt die Fähigkeit an den Promotor zu binden und die Transkription zu starten. Da dieses Transaktivatormolekül revers zum originalen tTA agiert, wird es als reverser Transaktivator (rtTA) bezeichnet. Abb. 1.7. Repression und Aktivierung des tTA-Promotors. Die Fähigkeit des in den Zellen konstitutiv exprimierten Transaktivators, an die Operatorsequenz innerhalb des tTA-Promotors zu binden, wird durch Tetracyclin (tet) reguliert. A: Im tet-off System verhindert die Anbindung von tet an den Transaktivator durch Konformationsänderung des Repressors die Bindung an die DNA. Die Expression der Gene wird reprimiert. Bei Abwesenheit von tet kann der Repressor an die tetO-Sequenzen binden. Die Transkription wird von der Transaktivator-Domäne des Fusionsproteins vom Minimalpromotor aus aktiviert. B: Im tet-on-System wird die Aktivierung der Expression erst durch die Zugabe von tet ermöglicht. In Abwesenheit von tet wird der rtTA durch eine Konformationsänderung inaktiviert und so die Transkription reprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst beide Systeme verwendet und ihre Effizienz in der Transkriptions-Aktivierung und Repression verglichen. Baron et al. (1995) erweiterten die Funktion des tet-regulierbaren Promotors, indem beidseitig der tetO-Sequenzen minimale CMV-Promotoren fusioniert und so ein bidirektionaler tet-regulierbarer Promotor konstruiert wurde, der die simultane Expression zweier Expressionseinheiten erlaubt. Die Möglichkeit mehrere Gene mono- oder bicistronisch simultan reguliert zu exprimieren, wurde in der vorliegenden Arbeit genutzt. 21 1.Einleitung 1.4.2. Autoregulative Systeme Durch die vielfältige Anwendung des tet-regulierten Systems in unterschiedlichen Zelllinien wurden trotz der einfachen Expressionsregulation Limitationen deutlich. Eines der Hauptprobleme besteht in der Toxizität des Transaktivators. Viele verschiedene Zelltypen tolerieren hohe Konzentrationen des Transaktivatormoleküls nicht (Henninghausen et al., 1995; Shockett et al., 1995; Bohl et al., 1997; Howe et al., 1995; Shockett et al., 1996; Saez et al., 1997). Während es bei Zelllinien möglich ist, Klone mit tolerierbarer tTA-Expression und guter Regulation zu isolieren, zeigt sich die Toxizität des Transaktivators vor allem in transgenen Tieren. Eine Möglichkeit, die Konzentration des Transaktivators in den Zellen zu reduzieren, ist das in dieser Arbeit verwendetete autoregulierbare System. Hierbei wird der Transaktivator selbst unter die Kontrolle seines tTA-regulierten Promotors gestellt. Im induzierten Status führt die Bindung des Transaktivators an seinen Promotor zur Aktivierung seiner eigenen und der Expression des Transgens. Im reprimierten Status verhindert die Konformationsänderung des tTA die weitere Aktivierung des Promotors mit der Konsequenz, dass sowohl die Transgenkonzentration, als auch die Transaktivatorkonzentration in der Zelle sinkt. Auf diese Weise bleiben hohe Konzentrationen des toxischen Transaktivators auf die Phase der Induktion beschränkt. In der Abbildung 2.1. ist das autoregulative System am Beispiel des bidirektionalen tTA-abhängigen Promotors dargestellt. 22 1.Einleitung Aufgabenstellung: Die Gentherapie ist ein expandierendes Feld in der Behandlung ererbter oder erworbener genetischer Defekte. Erste durchschlagende Erfolge konnten bereits in der Behandlung der schweren Immundefizienz (SCID-X1) verzeichnet werden. Bisher wurden transferierte therapeutische Gene konstitutiv exprimiert. Für viele Anwendungen sowie auch im Tiermodell ist jedoch die Regulation des Transgens wünschenswert. Dies würde die Einhaltung einer physiologischen Transgenkonzentration sowie die Aktivierung oder Reprimierung der Expression zu notwendigen Zeitpunkten ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten regulierbare Expressionsvektoren für gentherapeutische Anwendungen entwickelt werden. Zum Erhalt regulierter Expression wurde das bereits in Zellkultur und transgenen Tieren erfolgreich eingesetzte, auf Tetracyclin basierende Regulationssystem von Gossen und Bujard verwendet. Für gentherapeutische Anwendungen existieren für dieses System allerdings einige Limitationen, die im Rahmen der Arbeit weitgehend überkommen werden sollten. $ Das Regulationspotential dieses Systems ist abhängig vom Integrationsort im Genom der Zielzelle. Endogene Sequenzen interferieren mit dem Expressions- und Regulationspotential, so dass nur eine limitierte Anzahl von Integrationsorten geeignet ist, eine strikt regulierte Expression zu unterstützen. Die Identifikation dieser Zellklone erfordert ein aufwendiges Screening, das insbesondere im Falle der gentherapeutischen Anwendung nicht durchführbar ist. $ Zwei verschiedene Gene, das Transaktivatorgen und das gewünschte Gen unter der Kontrolle des Transaktivator-abhängigen Promotors, müssen in die Zielzellen transferiert werden. Obwohl der Transfer von zwei Vektoren in permanente Zelllinien realisierbar ist, ist die Co-Transduktion zweier Vektoren in primäre Zellen nicht effizient. $ Hohe Konzentration des Transaktivator-Proteins in den Zellen führt zu toxischen Nebenwirkungen, dem sogenannten “Squelching”. Hierbei akquiriert der Transaktivator endogene Transkriptionsfaktoren und reduziert die normale Transkriptionsleistung der Zelle. Daher war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines Single-Step Transduktionssystems, das alle Komponenten, die für die regulierte Genexpression notwendig sind, in einer Expressionseinheit vereint und in nur einem Transduktionsschritt auf die Zielzellen überträgt. Dabei sollte die autoregulative Anordnung des Transaktivators seine Toxizität minimieren. 23 1.Einleitung Das Expressions- und Regulationspotential der entwickelten autoregulativen Single-Step Systeme sollte nach Transfer mit für die Gentherapie relevanten Systemen, wie der retro- und adenoviralen Infektion und Elektrotransformation untersucht und bezüglich der Regulationseigenschaften nach den verschiedenen Transfermethoden bewertet werden. 24 2. Ergebnisse 2. Ergebnisse 2.1. Auswahl des tet-on oder tet-off-Systems für den Aufbau der autoregulierten Kassetten Gossen und Bujard (1992) entwickelten zwei auf Tetracyclin (tet) basierende regulierbare Expressionssysteme. Sie bestehen aus dem Transaktivatorprotein und dem durch den Transaktivator regulierbaren Promotor. Der Transaktivator (tTA) im tet-off System wird durch die Zugabe des Antibiotikums inaktiviert, wogegen im tet-on System Tetracyclin zur Aktivierung des Transaktivators (rtTA) führt (vgl. Kap. 1.4.). Beide Systeme wurden zunächst in ihrer Expressionsstärke und Regulationskapazität verglichen. Das System mit den besseren Expressions- und Regulationseigenschaften sollte für den Aufbau eines single-step Transduktionssystem verwendet werden. Zur Herstellung von Reporter-Zellen wurden zunächst NIH3T3-Zellen mit dem Reporterkonstrukt PtTA--Luziferase (pUHD13-3) stabil transfiziert. Im Vektor pUHD13-3 steht die Expression des Reporters Luziferase unter der Kontrolle des tTA-abhängigen Promotors und die Expression ohne Transaktivator sollte nur eine basale Expression ermöglichen. Nach Selektion wurde das Reporter-Zellgemisch gesplittet und mit und ohne Doxycyclin (Dox) kultiviert. Plasmide rel. Luziferase-Expression 2x105 pTLHT tet-on (prTA) tet-off (pUHD15-1) Induktionsfaktor -tet 4x105 + tet 3x106 -tet 9x106 + tet 2x105 8 45 Tabelle. 2.1. Luziferase-Expressionen des Reporters pUHD13-3 (PtTA–Luziferase) allein und in Abhängigkeit des tet-on (prTA) und tet-off (pUHD15-1) Transaktivators im induzierten und reprimierten Zustand. Die LuziferaseExpression des pUHD13-3-Plasmids allein zeigt die Basisexpression an, verursacht durch die Durchlässigkeit des tTA-abhängigen Promotors. Die Induktionsfaktoren werden durch Division der induzierten durch die reprimierten Expressionen berechnet. Die angegebenen Expressionswerte ergeben sich aus drei unabhängig durchgeführten Messungen. 25 2. Ergebnisse In einem zweiten transienten Transfektionsschritt erfolgte nun jeweils der Transfer der beiden Transaktivatoren (tTA und rtTA) in die mit und ohne Dox kultivierte Zellpopulation. Die resultierende Luziferase-Expression wurde nach 2 Tagen im reprimierten und induzierten Zustand detektiert und die jeweiligen Induktionsfaktoren ermittelt (Tab. 2.1.). Zur Anwendung des Tet-on Systems diente das Transaktivatorplasmid prTA, für das tet-off System wurde das Plasmid pUHD15-1 verwendet. In beiden Plasmiden werden die Transaktivatoren konstitutiv exprimiert. Das Reporterplasmid pUHD13-3 zeigte bereits in Abwesenheit des Transaktivators eine deutlich messbare Luziferase-Expression. Sie entsteht aufgrund der Durchlässigkeit des tTA-Promotors, dessen Basisexpression durch chromosomale Sequenzen beeinflusst wird. Dieser Expressionswert stellt den Basiswert dar, der nicht unterschritten werden kann. Vergleicht man die gemessenen Luziferasewerte des reversen Transaktivators (rtTA; tet-on) und des Transaktivators (tTA; tet-off) miteinander, wird die Überlegenheit des tTAs deutlich. Wird er durch die Zugabe von tet inaktiviert, sinkt die Luziferase-Expression mit 2x105 relative Lichteinheiten (rlu) auf den Basislevel ab, wogegen die Repression im tet-on System mit 4x105 rlu unvollständig bleibt. Die Höhe der Expression variiert deutlich. Bei Verwendung des tTAs ist der Expressionslevel um den Faktor drei höher als beim Einsatz des reversen tTA. Insgesamt liegt die resultierende Induktion des reversen Transaktivators (rtTA) mit einem Faktor von 8 deutlich unter der Induktionskapazität des tTAs mit einem Faktor von 45. Daher wurde zur Konstruktion aller im Folgenden beschriebenen regulierbaren Single-Step Transduktionssysteme das tet-off System mit dem tTA verwendet. 2.2. Vergleich der Expressions- und Regulationseigenschaften von konstitutiv und autoreguliert exprimiertem Transaktivator Bei hoher Konzentration des Transaktivators in den Zellen wurde wiederholt über toxische Nebenwirkungen berichtet (Sadowski et al., 1988; Triezenberg et al., 1988; Strathdee et al.,1999; Baron et al., 1997), die hauptsächlich auf das sogenannte „Squelching“ zurückzuführen sind. Darunter wird das Abfangen endogener Transkriptionsfaktoren verstanden. Auf diese Weise wird der Level der endogenen Transkription verändert und die Zellen geschädigt. 26 2. Ergebnisse Toxische Konzentrationen des Transaktivator-Proteins können schnell durch eine konstitutive Expression erreicht werden. Daher erschien es sinnvoll, neben dem interessierenden Gen auch die Expression des Transaktivators zu kontrollieren, indem das Gen selbst unter die Kontrolle des tTA-abhängigen Promotors gestellt wird. In diesem Fall sollte die Expression des Transaktivators auf die Phase der Induktion beschränkt bleiben. Bei Repression sinkt auch die Konzentration des tTAs in den Zellen und Schäden durch Squelching können so reduziert werden (Abb. 2.1.) Abb. 2.1. Beispiel eines autoregulativen Expressionssystems unter Nutzung des bidirektionalen regulierbaren Promotors (Baron et al., 1995). Induktion: Der Transaktivator (tTA) bindet an den tTA-abhängigen Promotor und aktiviert in Form einer positiven Rückkopplung die eigene Transkription sowie die Transkription des Gen X. Repression: Bei Anbindung von Dox oder Tet an den Transaktivator verhindert eine Konformationsänderung des Proteins die weitere Anbindung und Transaktivierung des Promotors. Die Transkription von Transaktivator und Gen X ist reprimiert. Die Konzentration des tTAs in der Zelle fällt auf den Basiswert ab. Restliche tTA-Proteine können bei erneuter Induktion die positive Induktionsschleife aktivieren. Zunächst wurde untersucht, welche Auswirkung ein regulierter Transaktivator auf die Expressionshöhe und das Regulationspotential eines Reportergens haben. Dazu wurden NIH3T3-Zellen mit dem Reporterplasmid pUHD13-3 (PtTA--Luziferase) und jeweils einem konstitutiven (SV40-Pr.--tTA) oder mit einem autoregulierten tTA-Expressionsplasmid (PtTA-- 27 2. Ergebnisse tTA) transient cotransfiziert. Die Induktion der Luziferase-Expression wurde jeweils nach 24 h Inkubation mit und ohne Dox gemessen (Abb. 2.2.). A b b . 2.2. Vergleich der Luziferase-Expressionen und Induktionen bei Verwendung des konstitutiv oder reguliert exprimierten Transaktivators. NIH3T3-Zellen wurden transient cotransfiziert mit dem Reporterplasmid pUHD13-3 (PtTA–Luziferase) und entweder einem konstitutiv (SV40-P--tTA) oder reguliert (PtTA–tTA) exprimierten tTAExpressionsplasmid. Die Luziferase-Expression wurde jeweils 24 h nach Inkubation der Zellen mit und ohne Dox gemessen und die Induktionswerte ermittelt. Die Expressionswerte geben den Mittelwert aus drei unabhängigen Messungen an. Dabei zeigten sich vergleichbare Luziferase-Expressionen mit 8,2x104 bis 8,9x104 rlu im induzierten Zustand sowohl bei konstitutiver als auch bei regulierter Expression des tTAs. Im Gegensatz dazu war die Reprimierung der Expression bei Verwendung des regulierten tTAExpressionsplasmids stringenter (300 rlu gegenüber 1994 rlu) und ging auf die Werte der nicht transduzierten Kontrolle zurück. Dadurch ergab sich bei Verwendung des autoregulierten Transaktivators eine deutlich verbesserte Regulationskapazität (Faktor 275 gegenüber von Faktor 44). Die Vorteile des autoregulativen Systems werden in diesem Experiment deutlich. Neben der Verminderung der Toxizität des Transaktivators führt die autoregulative Anordnung zusätzlich zur Verbesserung der Regulation bei gleichbleibender Expressionsstärke im induzierten Zustand. 2.3. Entwicklung autoregulatorischer Expressionskassetten Aufgrund der verbesserten Regulation der Reportergen-Expression für den Fall der 28 2. Ergebnisse autoregulativen Expression des Transaktivatorgens wurden verschiedene autoregulative Expressionsysteme (System A, B und C) basierend auf dem tet-off-System entwickelt, die im Folgenden beschrieben werden (Abb. 2.3.). Abb. 2.3. Darstellung der in dieser Arbeit konstruierten autoregulativen Expressionskassetten (siehe Text für weitere Erläuterungen). System A: Autoregulatives System basierend auf dem unidirektionalen tTA-abhängigen Promotor (PtTA). System B und C: Beide autoregulativen Systeme basieren auf dem bidirektionalen tTA-abhängigen Promotor (PbitTA). Der Transaktivator wird jeweils monocistronisch von einer Seite des PbitTA aus exprimiert. Im System B nimmt die zweite Seite eine bicistronische Reportergen-Kassette (luc-IRES-GTN) ein, die in dem retroviralen Vektor in Sense zum viralen 5' LTR vorliegt. Im System C wurde das Reportergen (HTG) in reverser Orientierung zum viralen 5' LTR inseriert. LTR: long terminal repeat (MSCV abgekürzt mit M; SIN abgekürzt mit S in der Namensgebung); PtTA: unidirektionaler tTA-abhängiger Promotor; PbitTA: bidirektionaler tTA-abhängiger Promotor; luc-GFP: Fusionsgen aus Luziferase und eGFP; HTG: Fusionsgen aus Hygromycin-BPhosphotransferase, Thymidinkinase und eGFP; GTN: Fusionsgen aus eGFP, Thymidinkinase und Neomycin-BPhosphotransferase; schwarzer Kasten: internal ribosomal entry site (IRES, aus dem Poliovirus); tTA: Transaktivator; PH4: Histon-4-Promotor; neo: Neomycin-Resistenzgen; Luziferase: Firefly Luziferasegen; schwarze Kreise: SV40-Polyadenylierungssequenz 29 2. Ergebnisse 2.3.1. Konstruktion des unidirektionalen autoregulierten Systems A: Im System A (pLEGTA, SIN-LEGTA, LTR-LEGTA) wird die Expression des Reporters im ersten Cistron und die Transkription des Transaktivators im zweiten Cistron über den unidirektionalen tTA-abhängigen Promotor (P tTA) aktiviert. Als Reporter wurde ein Fusionsprotein konstruiert, bestehend aus dem enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) und dem Luziferasegen (luc) (Konstruktion: Material und Methoden). Der GFP-Anteil dient der Identifizierung und Sortierung transduzierter Zellen über FACS-Analysen, der luc-Anteil ermöglicht die genaue Quantifizierung der Expressions- und Regulationskapazität von Zellklonen und Populationen. Sowohl die Luziferase- als auch die GFP-Expression wurde durch die Fusion nur geringfügig (ca. 2 fach) abgeschwächt. Zusätzlich besitzt der Vektor zur Selektion erfolgreich transduzierter Zellen das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven (tTA-unabhängigen) Histon4-Promotors (PH4). Diese Expressionseinheit wurde sowohl in einen MLV-basierenden retroviralen Vektor, als auch in einen sogenannten Selbst-inaktivierenden (SIN)-retroviralen Vektor (vgl. Kap. 1.2.4.) inseriert. In diesem Enhancer-deletierten retroviralen Vektortyp sollte es nicht zur Beeinflussung der Expressionsregulation der integrierten Kassette durch die retroviralen Enhancer-Elemente kommen, bzw. die Beeinflussung reduziert sein. 2.4. Schlechte Regulation des Vektors pLEGTA nach Elektrotransformation Die Expressions- und Regulationskapazität der regulierbaren Kassette pLEGTA des Systems A (Abb. 2.3.) wurde zunächst nach Elektrotransformation kontrolliert. Im Gegensatz zur Transfektion gelingt es mit Hilfe der Elektrotransformation, einzelne Kopien oder nur eine geringe Kopienzahl des Vektors in die Zellen zu transferieren (ca. 30 % der transduzierten Zellen tragen eine einzelne Kopie, Daten nicht gezeigt). Da die Expressionsregulation durch die umgebenden chromosomalen Sequenzen des Integrationsortes beeinflusst werden, fällt mit steigender Kopienzahl in der Zelle die Chance auf das Auffinden gut regulierter Zellklone. Nach Elektrotransformation von pLEGTA wurden 32 Zellklone isoliert und das Expressions- und Regulationspotential in Abhängigkeit von Dox ermittelt (Abb. 2.4.). 25 der 32 untersuchten Zellklone zeigten im induzierten Zustand eine Expression über 1x105 rlu. In den restlichen sieben Klonen konnte mit 1x103 rlu nahezu keine Expression detektiert 30 2. Ergebnisse werden, obwohl alle untersuchten Zellklone G418-Resistenz aufwiesen. Abb. 2.4. Expressions- und Regulationskapazität der unidirektionalen Kassette pLEGTA nach Elektrotransformation. 40 g der linearisierten DNA wurden per Elektrotransformation in 1x106 NIH3T3-Zellen eingebracht und die transformierten Zellen in verschiedenen Verdünnungen in G418-haltigem Medium ausgesät. Nach etwa 14 Tagen wurden 32 G418 resistente Zellklone isoliert und mit und ohne Dox kultiviert. Drei Tage nach Kulivierung unter reprimierenden und induzierenden Bedingungen erfolgte die Detektion der Luziferase-Expression und die Evaluierung der Regulationsfaktoren. Die gemessenen Regulationsfaktoren variierten zwischen zwei und 53, wobei der Hauptanteil der untersuchten Zellklone nur einen Induktionswert von unter zehn aufwies (15 von 32). Nur sieben Zellklone zeigten bessere Regulationseigenschaften mit Werten zwischen 15 und 53. Zehn Zellklone reagierten nicht auf die Zugabe von Dox. Die Expressionen im induzierten und reprimierten Status blieben nahezu gleich. Zu den Zellklonen mit keiner bzw. nur sehr begrenzter Regulation gehörten die fünf Kulturen, die bereits im induzierten Zustand nur geringe Expressionen zeigten, sowie auch Zellklone mit guter Luziferase-Expression (Klon 3, 7, 9, 15, 24, 25, 28, 30). Für eine Langzeitstudie wurden sieben Zellklone mit Regulationsfaktoren über zehn ausgewählt, über 20 Passagen in G418-haltigem Medium kultiviert und anschließend erneut die Expression im induzierten und reprimierten Zustand gemessen. Nach der Kultivierung waren die Induktionswerte in allen Zellklonen unter 10 gesunken. Für keinen Zellklon konnte über einen längeren Kultivierungszeitraum eine stabile Induktion ermittelt werden (Daten nicht gezeigt). Insgesamt betrachtet lag in 78 % der gemessenen Klone der Regulationsfaktor unter 10. Zusätzlich konnte in keinem Fall stabile Expression und Regulation über einen 31 2. Ergebnisse Kultivierungszeitraum von 10 Wochen detektiert werden. Damit erwies sich die Kassette pLEGTA ungeeignet zur regulierten Expression eines gewünschten Gens nach Elektrotransformation. 2.4.1. Regulation nach Infektion von NIH3T3 mit SIN-LEGTA Retroviren sind die am häufigsten genutzten Systeme zur Transduktion Fremd-DNA. Sie bieten neben der effizienten Genübertragung den Vorteil der stabilen Integration des rekombinanten retroviralen Vektors ins Wirtsgenom und ermöglichen so die stabile Expression des interessierenden Gens über einen langen Zeitraum (Daly und Chernajovsky, 2000). Da sie bevorzugt in transkriptionell aktive Bereiche integrieren (Scherdin et al., 1990) können hohe Expressionslevel erreicht werden. Darüber hinaus haben Baer et al. (2000) gezeigt, dass nach retroviraler Integration die Expression im Vergleich zu elektrotransformierten Vektoren über einen längeren Zeitraum stabil erhalten bleibt. Es wurde untersucht, ob durch retrovirale Transduktion die Expressions- und Regulationskapazität der unidirektionalen Expressionskassette (System A) gegenüber der Elektroporation verändert ist. Die Flankierung der Expressionskassette durch retrovirale Sequenzen einerseits und andererseits die bevorzugte Integration dieser rekombinanten Viren in transkriptionell aktive Domainen könnte das Expressions- und Regulationspotential positiv beeinflussen. Zunächst wurde die Expressionskassette in den retroviralen SIN-Vektor (Yu et al., 1996) inseriert und so der Vektor SIN-LEGTA (Abb. 2.3.) generiert. 2.4.1.1. Herstellung von retroviralen SIN-LEGTA Produzentenzellen Zur Herstellung einer retroviralen Produzentenzellinie wurde die amphotrope Helferzelllinie PA317 mit dem retroviralen Vektor SIN-LEGTA transfiziert und die erfolgreich transduzierten Zellen über G418 selektiert. 16 Produzentenzellklone und ein Gemisch wurden hergestellt und auf Luziferase- und eGFP-Expression sowie auf Virusproduktion untersucht (Abb. 2.5.). Auf die Ermittlung der Regulationsfaktoren wurde aufgrund der Multicopy-Integrate nach Transfektion verzichtet. Alle 16 Zellklone (PA-SIN-LEGTA-1 bis 16) und das Produzentenzellgemisch (PA-SINLEGTApool) exprimierten Luziferase im induzierten Zustand mit 4x105 bis 5x108 rlu. In 14 der untersuchten Zellklone konnte ebenfalls die Expression von eGFP detektiert werden. Zwei der 32 2. Ergebnisse untersuchten Zellklone (Klon 10 und 13) zeigten keine detektierbare GFP-Expression. Da aber in diesem Vektor die Reporter Luziferase und eGFP als Fusionsgen vorliegen, sollte man von einer gleichmäßigen Expression beider Reporter ausgehen können. Jedoch findet man insbesondere bei niedrigen Luziferasewerten keine Korrelation. Vermutlich trägt die unterschiedliche Sensitivität beider Assays zu differierenden Expressionsdaten bei. Eine Korrelation von GFP- und Luziferase-Expression findet man vor allem in Zellklonen, in denen hohe Luziferase-Werte gemessen wurden (PA-SIN-LEGTA-4, -7, -11, -14, -16). Hier war auch der Anteil an eGFP-positiven Zellen höher. Abb. 2.5. Expression und virale Titer der Produzentenzellen PA-SIN-LEGTA unter induzierten Bedingungen. Nach Transfektion der amphotropen Verpackungszellline PA317 mit 5 g SIN-LEGTA und G418-Selektion der transduzierten Zellen wurden 16 Zellklone (PA-SIN-LEGTA-1 bis 16) sowie ein Produzentenzellpool (PA-SINLEGTApool) generiert und ihre Expression im induzierten Zustand ermittelt. Die viralen Titer wurden mit Hilfe eines Titerassays auf NIH3T3-Zellen bestimmt. Unabhängig von der Höhe der tTA-abhängigen Reportergen-Expression ist der gemessene Virustiter, der die Aktivität des viralen LTRs widerspiegelt. Zellklon 11 zeigt trotz hoher Luziferase-Expression nur eine geringe Virusproduktion, wogegen die Zellklone PA-SINLEGTA-2, -3, -4 und -5 mit niedriger Luziferase-Expression virale Titer bis zu 5x103 cfu aufweisen. Das Produzentenzellgemisch PA-SIN-LEGTApool liegt mit einem viralen Titer von 3x103 cfu deutlich über der Virusproduktion der meisten Zellklone. Insgesamt konnte die Funktionalität des Vektors in den Produzentenzellen durch die Expression der Reporter Luziferase und eGFP sowie durch die gezeigte Virusproduktion nachgewiesen werden. 33 2. Ergebnisse 2.4.1.2. Die Regulationseigenschaften der Kassette SIN-LEGTA nach retroviralem sind Transfer nicht verbessert Das Gemisch PA-SIN-LEGTApool wurde für die Infektion der NIH3T3-Zellen eingesetzt. Dabei wurden Bedingungen verwendet, bei denen statistisch nur ein Virus pro Zelle infizieren kann, so dass bei den infizierten Zellklonen von Einzelkopieintegraten ausgegangen werden kann. Nach Infektion und G418-Selektion von NIH3T3-Zellen wurden elf Zellklone (I-SIN-LEGTA-1 bis 11), sowie ein Infektionsgemisch (I-SIN-LEGTApool) generiert und die Expressions- und Regulationskapazität in Abhängigkeit von Dox untersucht (Abb. 2.6.). Abb. 2.6. Expressions- und Regulationskapazität elf infizierter Zellklone (I-SIN-LEGTA-1 bis 11) und eines Pools (I-SIN-LEGTApool). 1x106 NIH3T3-Zellen wurden mit 0,5 ml virushaltigem Überstand des Produzentenpools PASIN-LEGTApool infiziert und mit G418 selektiert. Die isolierten Zellklone sowie das Gemisch wurden mit und ohne Dox kultiviert und nach drei Tagen die Expression im induzierten und reprimierten Zustand ermittelt. Trotz der erworbenen G418-Resistenz, die die erfolgreiche Infektion und Integration des Vektors anzeigte, konnte nur in vier von elf untersuchten Zellklonen die Expression von Luziferase und eGFP detektiert werden (I-SIN-LEGTA-5, -6, -10 und -11). Die GFP-Expression blieb mit 1 - 2 % innerhalb eines exprimierenden Zellklons so gering, dass die Messung im reprimierten Zustand der Zellen nicht sinnvoll war. In den vier exprimierenden Zellklonen konnte die Genexpression praktisch nicht reguliert werden (Regulationsfaktoren von 2 bis 4). Da sieben von elf der untersuchten Zellklone weder Luziferase noch GFP exprimierten, wurden Southern Blot Analysen durchgeführt, um zu klären, ob der verwendete Vektor SIN-LEGTA in den Produzentenzellen (PA-SIN-LEGTA) und in den infizierten NIH3T3-Zellen (I-SIN-LEGTA) 34 2. Ergebnisse vollständig integriert vorlag (Abb. 2.7.). Dazu wurden das verwendete Produzentenzellgemisch PA-SIN-LEGTApool und drei weitere Produzentenzellklone, die Luziferase- und eGFPExpression zeigten (PA-SIN-LEGTA-7, -14, -16), sowie die infizierten Zellklone I-SINLEGTA-2, -6 und -10 ausgewählt. Abb. 2. 7. Southern Blot Analyse des nach Transfektion und Infektion integrierten Vektors SIN-LEGTA. Die HMW-DNA der ausgewählten Zellen wurde SpeI/HindIII geschnitten und mit zwei unterschiedlichen Sonden hybridisiert, wobei die Sonde I gegen die Luziferase-Sequenz des Fusionsgens Luziferase-eGFP, und die Sonde II gegen die Transaktivator-Sequenz gerichtet war. Die Hybridisierung mit ProbeI sollte zu einem 4141 bp großen Signal, mit ProbeII zu einer 1665 bp großen Bande führen. Spur 1: PA-SIN-SLEGTApool; 2 - 4: Zellklone PA-SINSLEGTA-7, -14 -16; 5 - 7: Zellklone I-SIN-SLEGTA-2, -6, -10 Die Southern Blot Analyse zeigte in den Produzentenzellen (Spur 1-4) nach SpeI/HindIII Restriktion mit Sonde I und Sonde II Banden der erwarteten Größe (4141bp und 1665bp). Allerdings ließen sich in den untersuchten Produzentenzellen zusätzliche Banden unterschiedlicher Größe detektieren. Diese Banden weisen auf die zusätzliche Integration veränderter Vektoren hin, die im Fall von verkürzten Banden auf den Verlust von DNASequenzen innerhalb der Restriktionsschnittstellen hindeuten, wogegen zu große Fragmente eher auf Deletionen hinweisen, die die Schnittstelle mit einschließen. Die jeweiligen erwarteten Banden lagen jedoch in der höchsten Konzentration vor, so dass davon ausgegangen werden 35 2. Ergebnisse kann, dass vollständige Viren in den Verpackungszellen vorlagen. Die untersuchten Infektanten zeigten dagegen ein unerwartetes Bandenmuster (Abb. 2.7. Spuren 5-7). In Klon I-SIN-LEGTA-2 konnte nach Hybridisierung mit Sonde I keine Bande detektiert werden, obwohl vergleichbare DNA-Mengen aufgetragen wurden. Die Bande in Zellklon I-SINLEGTA-6 war geringfügig größer. Nur Zellklon -10 zeigte ein Fragment der richtigen Größe. Bei Verwendung der Sonde II zeigte sich allerdings, dass der Vektor in Zellklon -10 (Spur 7) nicht vollständig vorlag. In keinem der analysierten Infektanten fand sich die TransaktivatorBande mit einer Größe von 1665 bp. Statt dessen erscheinen die Banden bei Größen zwischen 3000 und 4100 bp. Obwohl die infizierten Zellklone -6 und -10 Luziferase exprimierten, lag der Vektor in veränderter Form in den Zellen vor. Die im Southern Blot detektierte Veränderung kann mit dem Verlust von Vektorelementen erklärt werden, die die HindIII-Schnittstelle zwischen Reportergen und IRES-Element umfassen. Dies würde erklären, wieso die detektierten Banden mit beiden Proben gleiche Größen aufweisen. Eine derartige Vektor-Veränderung würde dann aufgrund der ganzen oder teilweisen Deletion des IRES-Elementes zum Verlust der Transaktivator-Expression führen. Das würde die fehlende Expressionsregulation erklären. Die gemessene Luziferase-Aktivität könnte auf die Basisexpression des tTA-abhängigen Promotors zurückzuführen sein. Insgesamt zeigt die Southern Blot Analyse, dass die autoregulierbare Kassette nach retroviraler Transduktion große Instabilitäten aufweist, die mit sehr hoher Frequenz zum Verlust von Vektorelementen führt und den Verlust der Regulation erklären kann. 2.4.2. Anreicherung von Zellen mit vollständiger Vektorintegration durch Sortierung GFP exprimierender Infektanten im FACS Da die tatsächliche Expressions- und Regulationskapazität der retroviral transduzierten autoregulatorischen Kassette A (SIN-LEGTA) aufgrund der aufgetretenen Deletionen nicht abschließend beurteilt werden konnte, wurden Zellen mit vollständiger Vektorintegration angereicht und die Expressionseigenschaften erneut analysiert. Dazu wurden infizierte G418-resistente, GFP-exprimierende NIH3T3-Zellen mittels FACS isoliert. Die Expressions- und Regulationskapazität von 39 sortierten Zellklonen wurde mit 36 2. Ergebnisse Hilfe der Luziferase-Expression im reprimierten (+Dox) und induzierten Zustand (-Dox) ermittelt (Tab. 2.2). Induktionsfaktoren Anzahl der Zellklone prozentuale Verteilung 1 2-5 6 - 10 11 - 20 21 - 30 31 - 50 51 - 100 101 - 150 4 10 4 10 3 6 1 1 10 26 10 26 8 15 2 2 Tabelle. 2.2. Regulationskapazität SIN-LEGTA-infizierter Zellklone nach Sortierung auf GFP-Expression im FACS. Die mit PA-SIN-LEGTApool infizierten NIH3T3-Zellen wurden auf G418-Resistenz selektiert und anschließend im FACS auf GFP-Expression sortiert. Die 39 generierten Zellklone sind gemäß ihrer Induktionsfaktoren zusammengefasst. Die prozentuale Verteilung der auftretenden Induktionsfaktoren ist angegeben. Von 39 untersuchten Zellklonen exprimierten 38 Luziferase. In vier Zellklonen war die Expressionsregulation mit Dox nicht möglich. In der Tabelle 2.2. ist die prozentuale Verteilung der Zellklone auf die verschiedenen Induktionsfaktoren angegeben. Die Höhe der Induktionsfaktoren lag in 62 % der analysierten Zellklone zwischen zwei und 20. 23 % der Zellklone zeigten höhere Regulationsfaktoren zwischen 21 und 50. Nur in zwei Zellklonen lag die Regulation der Expression über dem Faktor 50 und erreichte mit Faktor 150 das Maximum. In zehn Prozent der Zellklone war die Expression nicht regulierbar. Diese Expressions- und Regulationsunterschiede (Tabelle 2.2.) zeigen den Einfluss der chromosomalen Umgebung nach Integration des Vektors. Je nach Integrationsort können benachbarte chromosomale Elemente die regulierte Expression beeinflussen. So können endogene Enhancer die Expression der eingebrachten Kassette auch im reprimierten Zustand tTA-unabhängig aktivieren, wogegen durch die Nähe von Silencer-Elementen die induzierte Expression reprimiert werden kann. Diese positionsabhängige Varianz in der Expression und Regulation wird als “position effect variegation” (PEV) bezeichnet (vgl. Kap. 3.5.). Durch die GFP-Sortierung konnten somit Zellklone angereichert werden, die Luziferase exprimierten und in 90 % der Zellen Expressionsregulation zeigten. Dennoch blieben die Regulationsfaktoren gering. Southern Blot Analysen sollten klären, ob nach GFP-Sortierung tatsächlich Zellen isoliert wurden, in denen der Vektor vollständig integriert vorlag. Zehn 37 2. Ergebnisse Zellklone, die unterschiedliche Expressionen und Induktionen aufwiesen, wurde mittels Southern Blot mit EcoRI- und SpeI/HindIII-Restriktion analysiert (Abb. 2.8.). Als Sonde wurde Sonde II verwendet. Abb. 2.8. Southern Blot Analyse von SIN-LEGTA infizierten Zellklonen nach G418-Selektion und GFP-Sortierung im FACS. Die chromosomale DNA von zehn Zellklonen mit unterschiedlicher Expressions- und Regulationskapazität wurde SpeI/HindIII und EcoRI geschnitten und mit der Sonde II, gerichtet gegen die tTASequenz hybridisiert. Im Doppelverdau SpeI/HindIII beträgt die Größe der erwarteten Bande 4097 bp, für EcoRI 1665 bp. Nummerierung des Blots: Ziffern geben die Nummern der SIN-LEGTA infizierten und GFP-sortierten Zellklone an. K: nicht transduzierte Kontrolle; M: Größenmarker. Nach Hybridisierung zeigte sich im Vergleich zu Kap. 2.4.1.2. ein homogenes Bild. In neun Zellklonen erschien nach SpeI/HindIII-Restriktion die erwartete Bande mit einer Größe von 1665 bp. Diese Klone trugen somit vollständige Vektorintegrate. Eine Ausnahme bildete Zellklon 34. Die hier detektierte Bande war deutlich zu groß (~ 4800 bp). Diese zu große Bande tauchte auch im Klon 26 auf, hier allerdings zusätzlich zu der erwarteten Bande. Die EcoRIRestriktion zeigte für diese beiden Zellklone nur die Integration verkürzter DNA-Fragmente. 38 2. Ergebnisse Sowohl in Klon 26, als auch in Klon 34 erschien eine etwa 3000bp-Bande anstelle einer 4100bp Bande. Dieses Bandenmuster spricht für Deletionen, die die mittlere HindIII-Schnittstelle und umliegende Sequenzen von insgesamt etwa 1000 bp umfassen. Die fehlende Expressionsregulation in den Zellklonen 26 und 34 weist auf Integration des verkürzten Vektors hin. In Klon 4 taucht eine zusätzliche sehr große Bande auf, die möglicherweise auf die unvollständige Restriktion mit EcoRI zurückzuführen ist. Großräumige Rearrangements können aber nicht ausgeschlossen werden. Für die Zellklone 9, 11 und 21 wurden keine Banden detektiert. Dies ist vermutlich zurückzuführen auf die unvollständige Restriktion der chromosomalen DNA mit EcoRI. Für diese Zellklone wurde zudem weniger DNA aufgetragen. Nach Kopplung von G418-Selektion und GFP-Sortierung konnte der Anteil an Infektanten mit vollständiger Vektorintegration auf etwa 80 % erhöht werden (acht von zehn Zellklonen). Gleichzeitig zeigte sich auch ein Anstieg der durchschnittlichen Regulationkapazität um den Faktor zehn. Insgesamt blieben die Regulationsfaktoren aber weiterhin unbefriedigend. 2.4.3. Langzeitstabilität des nach retroviraler Infektion integrierten Vektors SIN-LEGTA Das Erscheinen zweier Banden kann aus drei verschiedenen Effekten resultieren. Erstens kann die Rearrangierung der Vektor-DNA, resultierend im Verlust der GFP/luc Expression bereits in einem Teil des Verpackungszellpools stattgefunden haben. Die rekombinierte virale RNA könnte zusätzlich zur intakten RNA in Virionen verpackt werden und per Infektion in die Zielzellen gelangen. Zweitens könnten sich die Rearrangements während der revesen Transkription als Folge von falschen Template-Wechseln ergeben. Da allerdings Zellen selektiert wurden, die GFP/luc exprimierten, also einen intakten Vektor integriert hatten, können die zusätzlichen Banden in beiden Fällen auf Doppelinfektion der Zelle mit vollständigem und deletiertem Vektor hindeuten. Diese beiden Effekte sind schwer voneinander zu unterscheiden. Drittens ist es auch möglich, dass der Vektor erst nach Infektion im Laufe der Passagierung der Infektanten rekombiniert. In diesem Fall würden Subklone innerhalb eines Zellklons entstehen, die für die unterschiedlichen Banden im Southern Blot verantwortlich sind. Welcher der Effekte hauptsächlich verantwortlich ist, sollte eine Untersuchung der Stabilität ausgewählter Infektanten mit vollständiger Vektorintegration klären. Im Falle des Rearrangements nach Infektion sollten, bei der Häufigkeit der auftretenden Veränderungen, Rearrangements in einem anfänglich homogenen Zellklon und die Bildung von Subklonen zu beobachten sein. 39 2. Ergebnisse Dazu wurde chromosomale DNA der G418-selektierten und GFP-sortierten Zellklone 4, 5, 8, und 32 nach den Passagen zwei und zehn hergestellt und NcoI und SpeI/HindIII geschnitten . Für die Southern Blot Analyse wurde wieder Sonde II verwendet (Abb. 2.9.). Abb.2. 9. Southern Blot Analyse der Langzeitstabilität des retroviral transduzierten Vektors SIN-LEGTA. Vier Zellklone mit anfänglich vollständiger Vektorintegration (Passage 2) wurden bis zu Passage 10 kultiviert. Anschließend wurde die chromosomale DNA der Zellklone auf das Auftauchen von Rearrangements hin untersucht. Die verwendete Sonde II hybridisiert gegen die tTA-Sequenz. Die erwartete Bandengröße der NcoI-Restriktion beträgt 2733 bp. Für die SpeI/HindIII-Restriktion wird eine 1665 bp große Bande erwartet. M: Größenmarker; K: nicht transduzierte Kontrolle; 4, 5, 8 und 32: Nummern der ausgewählten Zellklone mit vollständiger Vektorintegration nach G418-Selektion und Sortierung auf GFP-Expression. Nach Passage 2 fand sich in allen Zellklonen eine Bande der richtigen Größe (NcoI: 2733 bp, SpeI/HindIII: 1665bp). Die Zellklone waren in Bezug auf den vollständig integrierten Vektor homogen. Nach 10 Passagen zeigten sich im Zellklon 4 die ersten Anzeichen der SubklonBildung. Im NcoI-Verdau erscheinen nur Banden der erwarteten Größe. Im SpeI/HindIIIVerdau dagegen konnte zusätzlich zur erwarteten Bande der Größe 1665bp eine Bande mit einer Größe von etwa 4800bp detektiert werden. Diese Zusatzbande wurde auch im SpeI/HindIIIVerdau mit der ProbeI gegen die Luziferasesequenz gefunden (Daten nicht gezeigt). Das weist auf die Bildung von Subklonen hin. Die Untersuchung zeigt, dass Rearrangements auch nach Infektion und Integration des 40 2. Ergebnisse vollständigen Vektors vorkommen. Die gefundene Häufigkeit (ein Zellklon von vier nach 10 Passagen) kann allerdings nicht die hohe Anzahl an GFP-negativen Infektanten (98%) sofort nach Infektion und G418-Selektion erklären. Daraus kann geschlossen werden, dass diese Art der Rekombination entweder bereits in den Verpackungszellen auftritt und die resultierende verkürzte RNA bevorzugt in die Viren verpackt wird, oder dass sich die Rearrangements während der reversen Transkription ereignen. Auffällig ist, dass es sich immer um Zusatzbanden der gleichen Größe handelt, die sich durch den Verlust der HindIII-Schnittstelle zwischen dem Fusionsgen Luziferase-eGFP und dem IRES-Element erklären lassen. Hierbei muß es sich um einen Rekombinations-Hotspot handeln. Da die NcoI-Schnittstelle im IRES-Element nicht von der Deletion betroffen ist (Abb. 2.9.), die Größe des deletierten Fragments aber etwa bei 1000bp liegt, müssen große Teile des eGFPAnteils des Fusionsgens betroffen sein. Das erklärt den sehr geringen Anteil an GFP exprimierenden Zellen nach Infektion und G418-Selektion. 2.4.4. FACS-Sortierung zum Erhalt homogen regulierter Gemische mit SIN-LEGTA Hofmann et al. (1996) konstruierten einen sehr ähnlich aufgebauten unidirektionalen autoregulativen Expressionsvektor. Als Reporter wurde lacZ im ersten Cistron exprimiert, im zweiten über ein IRES-Element der Transaktivator des tet-off Systems, der auch in dieser Arbeit verwendet wurde. Diese Expressionskassette wurde in einen SIN-retroviralen Vektor inseriert. Nach Infektion von primären Maus-Fibroblasten-Zellen zeigte sich ein sehr inhomogenes Regulationsverhalten der infizierten Zellen, deren Homogenität durch negativ/positivSortierungen im FACS verbessert wurden. Hierunter versteht man zunächst die Anreicherung von Zellen, deren Expression im reprimierten Status nur unwesentlich gegenüber der nicht transduzierten Kontrolle erhöht ist. In einem zweiten Schritt werden nun die Zellen verworfen, deren Expression in Abwesenheit von Dox nicht im gewünschten Maß induzierbar ist. Beliebig viele Runden dieser negativ/positiv Selektion können hintereinander durchgeführt werden und so ein Zielgemisch mit homogenem Regulationsverhalten generiert werden. Diese Methode wurde auch auf eine mit dem Vektor SIN-LEGTA infizierte Population von NIH3T3-Zellen angewandt. Dabei wurde zwei Tage nach Infektion zunächst eine Positivselektion (PS1) durchgeführt (Zellen sind induziert), in der diejenigen Zellen per FACS isoliert und anschließend weiter kultiviert wurden, deren GFP-Expression bei einer gegenüber 41 2. Ergebnisse der Kontrolle erhöhten relativen Fluoreszenz von 102 bis 103 lag. Nach Heranwachsen der sortierten Zellen (nach etwa 14 Tagen) wurde eine weitere Positiv-Selektion (PS2) durchgeführt, da FACS-Analysen auf den Verlust der GFP-Expression in vielen Zellen nach PS1 hinwiesen. Vermutlich ist dieser Verlust auf die bereits beschrieben erhöhte Rekombinationsfrequenz zurückzuführen. Nach Heranwachsen der in P2 sortierten Zellen erfolgte eine Sortierung nicht exprimierender Zellen im reprimierten Zustand (NS3), um die zwar exprimierenden, aber nicht regulierbaren Zellen zu eliminieren. Die Verbesserungen der Expression und Induktion innerhalb der sortierten Gemische sind in Tabelle 2.3.angegeben. Sortierung GFP-Expression in % induziert reprimiert ohne 1,5 2,3 PS1 18,1 PS2 Induktion Luziferase-Expression Induktion induziert reprimiert 1 8,9x106 1,5x106 6 1,5 12 5,3x106 7.0x105 8 42.0 1.2 35 1,8x108 3,5x106 51 NS3 2,4 0,1 24 7,6x107 6,1x106 12 Kontrolle 0,01 0,01 1 220 212 1 Tab. 2.3. Expressions- und Induktionskapazität eines Infektionsgemisches nach verschiedenen Sortierungsschritten im FACS. Die GFP-Expression der sortierten Zellgemische ist in Prozent angegeben. Als Kontrolle dienten nicht transduzierte NIH3T3-Zellen. PS1: Erste Sortierung GFP-exprimierender Zellen im induzierten Zustand; PS2: Zweite Sortierung der induzierten Zellen; NS3: Dritte Sortierung der in Anwesenheit von Dox reprimierbaren Zellen; Kontrolle: nicht transduzierte NIH3T3-Zellen; ohne: Expressions- und Regulationskapazität nur SINLEGTA infizierter und G418 selektierter Zellen ohne Sortierung. Gestartet wurde mit einem Infektionsgemisch, das erwartungsgemäß nur einen sehr geringen Anteil an GFP-exprimierenden Zellen aufwies (1-2 %). In diesem Gemisch konnte für GFP keine Regulation, für Luziferase eine Regulation mit Faktor 6 gemessen werden. Nach der ersten Sortierung PS1 stieg der Anteil GFP-exprimierender Zellen auf 18,1 % an. Sowohl für GFP als auch für Luziferase kam es zu einem leichten Anstieg der Regulationsfaktoren nach PS1 (Faktor 12/8), die nach PS2 noch weiter gesteigert werden konnten (Faktor 35/51). Die nachfolgende Negativselektion, in der Zellen eliminiert wurden, deren Expression nicht mit Dox reprimiert werden konnte, brachte jedoch eine deutliche Verschlechterung. Sowohl die Expressionshöhe, als auch die Regulationsfaktoren gingen zurück (Faktoren: 24/12) Die in den nicht sortierten Zellen gemessene Luziferase-Basisexpression war mit 1,5x106 rlu im Vergleich zur nicht transduzierten Kontrolle (212 rlu) sehr hoch. Durch die nachfolgenden 42 2. Ergebnisse positiv/negativ-Sortierungen konnte dieser Basislevel nicht reduziert werden. Das Gemisch zeigte zwar nach den drei Sortierungen ein homogeneres Regulationsverhalten mit verbesserten Faktoren, allerdings mit weiterhin hoher Basisexpression. Zusätzlich exprimierte trotz Positivselektion immer nur ein Teil der Zellen über einen längeren Zeitraum GFP. Zum Zeitpunkt der Expressions- und Regulationsmessung im FACS hatte ein Großteil der Zellen in den sortierten Gemischen bereits wieder ihre GFP-Expression verloren. Dies ist vermutlich auf die bereits beschriebene Vektorinstabilität zurückzuführen. 2.4.5. Abschließende Bewertung der Regulationseigenschaften des autoregulierbaren Systems A In den vorangegangenen Kapiteln wurde die Expressions- und Regulationskapazität der autoregulativen unidirektionalen Expressionskassette A sowohl nach Elektrotransformation als auch nach retroviraler Infektion untersucht. Sie wies allerdings unabhängig vom gewählten Transduktionsweg nur geringe Regulationsfähigkeiten auf, die stark vom chromosomalen Integrationsort (Variation in den Klonen zwischen zwei und 150 facher Induktion, siehe Kap. 2.4.2.) abhing. Über die positiv/negativ Sortierungen im FACS konnte zwar die Regulationsund Expressionskapazität eines infizierten Gemisches verbessert werden, letztlich blieben die dadurch erreichten Regulationsfaktoren (bis Faktor 50) jedoch gering. Zusätzlich muss eine mehrschichtige Sortierung für gentherapeutische Nutzung als ungeeignet angesehen werden, da es sich um eine zeitintensive Selektion handelt. Im retroviralen Kontext wurde zusätzlich die Instabilität der Expressionskasette aufgezeigt. Obwohl durch die Sortierung der Anteil an Zellen mit vollständig integriertem Vektor stark erhöht wurde, ist ein Rearrangement des Vektors auch im Laufe der Kultivierung der Zellen nicht auszuschließen. Da die Deletionen die HindIIISchnittstelle zwischen IRES und Reportergen umfassen, geht die Rekombination vermutlich mit dem Verlust der Expressionsregulation einher. Hierbei handelt es sich möglicherweise um einen Rekombinations-Hotspot, der mit hoher Effizienz zur Deletion bestimmter Vektorelemente führte. Insgesamt betrachtet blieb die Regulationskapazität auch nach vollständiger Vektorintegration eher gering (bis 20 fach in 72 % der Klone). Aus diesen Gründen ist dieser Vektortyp zum Erhalt stabil regulierbarer Zellen nicht geeignet. 43 2. Ergebnisse 2.5. Aufbau eines bidirektionalen autoregulativen Expressionssystems Eine weitere Möglichkeit ein autoregulatives System aufzubauen bietet, der von Baron et al. (1995) konstruierte bidirektionale tTA-abhängige Promotor. Bei diesem Promotor wurde beidseitig der sieben tetO-Sequenzen ein minimaler humaner CMV-Promotor fusioniert. Diese Anordnung erlaubt die simultane Expression und Regulation zweier Transkriptionseinheiten durch nur einen Promotor. Basierend auf dem bidirektionalen Promotor wurden zwei autoregulative Expressionskassetten konstruiert (System B und C). In beiden Kassetten codiert eine mRNA für den Transaktivator, die zweite mRNA (mono- oder bicistronisch) führt zur Expression von Reporter- und Selektionsgen (Abb. 2.3.). 2.5.1. Konstruktion der Fusionsgene Für die Evaluierung der Expressions- und Regulationseigenschaften der bidirektionalen Expressionssysteme B und C wurden Reportergene verwendet, die eine Positiv- und NegativSelektion der transduzierten Zellen zur Verbesserung der Regulationseigenschaften und darüber hinaus eine Quantifizierung mittels FACS erlauben. Als positiv-Selektionsmarker wurden die Resistenzgene neo und hygro, zur Negativselektion der Selektionsmarker Thymidinkinase (Tk) ausgewählt. Zur Quantifizierung im FACS wurde eGFP verwendet. Damit die Vektoren eine Größe von 8-10 kb nicht überschreiten und um eine möglichst strikte Kopplung der Expression zu erzielen, wurden die je drei Komponenten zu zwei trifunktionalen Proteinen (GTN und HTG) fusioniert (Konstruktion siehe Material und Methoden). Im Fusionsprotein GTN wurde GFP Nterminal an die Sequenz des TkNeo-Gens fusioniert. Im Protein HTG fand die Fusion von GFP C-terminal an HygTk statt. Für alle Komponenten der Fusionsproteine konnte die volle Funktionalität nachgewiesen werden (Daten nicht bezeigt). 2.6. Bewertung der Expressionsregulation der bidirektionalen Systeme B und C nach Elektrotransformation 2.6.1. Expression und Regulation von pTLGTN (System B) nach Elektrotransformation Um die Funktionalität und die Regulationskapazität des bidirektionalen Systems an Zellen mit 44 2. Ergebnisse Einzel- oder wenigen Kopien zu messen, wurde die Expressionskassette per Elektrotransformation in NIH3T3-Zellen eingebracht. Nach G418-Selektion wurde in 41 isolierten Zellklonen das Expressionsverhalten in Abhängigkeit von Dox untersucht (Abb. 2.10. und Tab. 2.4.). Abb. 2.10. Expressions- und Regulationskapazität der bidirektionalen autoregulatorischen Kassette pTLGTN (System C) nach Elektrotransformation von NIH3T3-Zellen. 10 g des linearisierten Vektors wurden transformiert und die Regulationseigenschaften von 41 G418-resistenten Zellklonen ermittelt. Dazu wurden die Zellklone jeweils für drei Tage in Selektionsmedium (induziert) oder in Dox-haltigem Medium (reprimiert) kultiviert und anschließend die Luziferase-Expression ermittelt. Tabelle. 2.4. Zusammenfassung der Luziferase-Expressionen und Induktionen der 41 Zellklone. Die Klone wurden gemäß ihrer Basis-Expression in drei Gruppen unterteilt. Innerhalb dieser Gruppen wurden die Klone anhand ihrer Regulationsfaktoren in vier Abteilungen untergliedert. Die Anzahl der Klone in jeder Gruppe ist angegeben. 45 2. Ergebnisse Zwei der 41 untersuchten Zellklone exprimierten keine Luziferase. In den meisten Zellklonen (36 von 41) variierte die Expressionstärke im induzierten Zustand zwischen 1x106 und 1x108 rlu. Durch die Zugabe von Dox konnte in 38 der 41 Zellklone die Expression deutlich reduziert werden. In der Tabelle 2.4. sind diese Daten zusammen gefasst. Der Hauptteil der untersuchten Zellklone zeigte Induktionsfaktoren zwischen 100 und 500 (23 von 41). In drei Zellklonen lagen die Regulationsfaktoren mit 967 (Zellklon 9), 844 (Zellklon 31) und 688 (Zellklon 21) noch deutlich darüber. Zellklone mit dieser hohen Regulationskapazität zeigten relativ niedrige BasisExpressionen in Abhängigkeit von Dox. Der Hauptteil der Zellklone mit guten Induktionswerten wies allerdings auch im reprimierten Zustand Expressionslevel zwischen 1x105 und 1x106 rlu auf (19 von 41 Zellklonen). Nur in einem der analysierten Zellklone konnte die Expression vollständig durch die Zugabe von Dox abgeschaltet werden (Klon 31). In diesem Klon blieb die Expression im induzierten Status jedoch mit 1,2x104 rlu verhältnismäßig gering. Diese Expressions- und Regulationsunterschiede (Tabelle 2.4.) zeigen auch hier die Positionseffekt-Varianz nach Integration des Vektors (vgl. Kap. 2.4.2. und 3.). Trotz der gemessenen Varianz konnte durch Verwendung des bidirektionalen Systems die Expressionsregulation gegenüber dem unidirektionalen System A um den Faktor 100-200 verbessert werden. 2.6.1.1. Langzeitstabilität pTLGTN-exprimierender Zellen nach Elektrotransformation Neben der ausreichenden Regulation eines Gens ist auch die Stabilität der Expression und in diesem Fall der Regulation über einen langen Zeitraum wichtig. Aus diesem Grund wurden neun mit pTLGTN eletrotransformierte Zellklone über einen Zeitraum von 15 Wochen kultiviert. Die Expressions- und Regulationskapazität wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten kontrolliert. Die dazu ausgewählten Klone unterschieden sich sowohl in der absoluten Expression als auch in den ermittelten Regulationsfaktoren (Abb. 2.11.). Die ausgesuchten Zellklone wurden insgesamt über 30 Passagen (P) unter Selektionsdruck kultiviert. Zu den Zeitpunkten P2, P10, P20 und P30 wurde die Expression von Luziferase in Anwesenheit und Abwesenheit von Dox gemessen und die Regulationsfaktoren berechnet. Ab Passage 18 wurden die Zellklone parallel ohne Selektionsdruck bis Passage 30 gehalten, um eine Abhängigkeit der Expressionsstabilität vom ausgeübten Selektionsdruck zu vermeiden (Abb. 2.12). 46 2. Ergebnisse Abb. 2.11. Expressions- und Regulationskapazität der neun unterschiedlichen Zellklone, die zur Untersuchung der Langzeitstabilität verwendet wurden. Die hier aufgeführte Expression wurde in Passage 2 gemessen. Betrachtet man die Expressionsstabilität bei Kultivierung der Zellklone unter Selektionsdruck (H200), zeigt sich, dass die Expressionsstärke sehr konstant beibehalten wird. Eine Ausnahme bildete die Expression von Zellklon 8. Hier fiel die Expression im Laufe der 30 Passagen über zwei Größenordnungen von 1x106 auf 1x104 rlu ab. Bei Kultivierung der Zellklone ab Passage 18 ohne Selektionsdruck konnte in drei von neun untersuchten Zellklonen (Klon 3, 9 und 19) ein jeweils leichter Rückgang der Expression von einer Größenordnungen im Laufe von 12 Passagen ohne Selektionsdruck aufgezeigt werden. Zellklon 8 verlor seine Expression in diesem Zeitraum dagegen fast vollständig. In vier Zellklonen (Klon 14, 21, 23 und 35) blieb die Expression auch ohne Selektionsdruck weiterhin stabil. Die anfänglich sehr hohen Induktionsfaktoren der Zellklone 8, 9, 11 und 21 fielen in einem Zeitraum von zehn Passagen (Klon 21) bis 20 Passagen (Klon 8, 9 und 11) auf einen mittleren Induktionswert, der genau wie in der Mehrheit der untersuchten 41 Zellklone zwischen 100-200 lag. Diese Regulationsfaktoren blieben bei Kultivierung mit Selektionsdruck stabil. Dies galt auch für die Zellklone, derer Regulationsfaktoren von Beginn an in diesem Bereich lagen (Klon 3, 14 und 19). Stabil zeigte sich auch die Regulation in Klon 23, einem Zellklon mit verhältnismäßig niedrigem Regulationswert. Die Ausnahme bildet Zellklon 35. Hier blieb die Regulation mit leichten Schwankungen relativ hoch (bis 550 fach) unabhängig von der Kultivierung mit oder ohne Selektionsdruck. 47 2. Ergebnisse Abb. 2.12. Langzeitstudie des Expressions- und Induktionsverhalten ausgewählter Zellklone nach Elektrotransformation des Vektors pTLGTN. A: Die Zellklone wurden über 30 Passagen unter Selektionsdruck kultiviert. In den Passagen 2, 10, 20 und 30 wurde das Expressions- und Regulationsverhalten der Zellklone in Abhängigkeit von Dox kontrolliert. Zusätzlich wurden die Zellklone über 12 Passagen (ab Passage 18) ohne Selektionsdruck kultiviert, und das Expressionsverhalten in den Passagen 2 und 12 ohne Selektionsdruck gemessen. B: Die aus den Expressionsdaten ermittelten Induktionsfaktoren sind angegeben. In drei von neun Zellklonen fiel der Regulationsfaktor allerdings bei Kultivierung der Zellen ohne Selektionsdruck. So verringerte sich der Induktionsfaktor in den Klonen 3, 9 und 19 auf 48 2. Ergebnisse Werte unter 100. Dieser Regulationsverlust ist hauptsächlich durch den Rückgang der Expression im induzierten Zustand zu erklären. Für Zellklon 8 konnte aufgrund des vollständigen Expressionsverlustes keine Regulation gemessen werden. Die Induktionsfaktoren der Klone 14, 21, 23 und 35 dagegen blieben aber weitgehend konstant. Zusammenfassend gesagt ermöglicht die autoregulierbare bidirektionale Expressionskassette pTLGTN im Gegensatz zur zuvor beschriebenen unidirektionalen Kassette (Kap. 2.4.) hohe Induktionsfaktoren, die in 26 der 41 analysierten Klone zwischen 2 und 3 Größenordnungen variierten. Langzeitanalysen zeigten, dass die Expression bei Anwendung von Selektionsdruck in acht von neun Zellklonen über einen Kultivierungszeitraum von 30 Passagen stabil blieb. Auch die Induktionsfaktoren der stabil exprimierenden Zellklone blieben konstant. Dies weißt ebenfalls auf eine stabile niedrige Expression im reprimierten Status der Zellen hin. Diese Daten zeigen, dass mit Verwendung eines bidirektionalen Expressionssystems neben hoher Expressions- und Regulationskapazität auch Expressionsstabilität über einen längeren Zeitraum erreicht werden kann. Auch hier zeigt sich die Positionseffekt-Varianz im induzierten und reprimierten Zustand der einzelnen Zellklone (Tab. 2.4. vgl. Kap. 2.4.2. und 3.5.). Nur in einem aus 41 analysierten Zellklonen wurde ein Integrationsort detektiert, der das vollständige Abschalten der Expression bei Anwesenheit von Dox ermöglicht. 2.6.2. Expression und Regulation von pTHTG (System C) nach Elektrotransformation Um zu überprüfen, ob die Expressions- und Regulationseigenschaften der autoregulatorischen Kassetten von den zu exprimierenden Genen und der Anordnung der Gene in den Expressionskassetten abhängig sind, wurde alternativ ein zweites bidirektionales aber monocistronisches Expressionssystem aufgebaut (System C; Abb. 2.3.). In diesem Vektor wurde die bicistronische Expressionseinheit (luc-IRES-GTN) gegen den Selektionsmarker und Reporter HTG ausgetauscht und das Expressions- und Regulationsverhalten nach Elektrotransformation analysiert. Dazu wurden NIH3T3-Zellen mit dem Vektor pTHTG elektrotransformiert. 30 Hygromycin-resistente Zellklone wurden isoliert und ihre eGFP-Expression in Anwesenheit und Abwesenheit von Dox im FACS ermittelt (Abb. 2.13). Alle untersuchten Zellklone zeigten hohe GFP-Expression, die im induzierten Zustand zwischen 102 und 103 relativer Fluoreszenz variierte. Im Gegensatz zur GFP-Expression des Systems A, 49 2. Ergebnisse indem sich immer nur in einem geringen Teil eines Zellklons Expression nachweisen ließ, exprimierten nach pTHTG-Transformation alle Zellen eines Klons. Obwohl die Repression in den verschiedenen Zellklonen stark differierte, führte Dox in allen Fällen zu einem klaren Expressionsrückgang. Die Abbildung 2.13. zeigt die Expressionsregulation von zehn repräsentativen Zellklonen. Abb. 2.13. FACS-Profile der Expressions- und Regulationskapazität der bidirektionalen autoregulatorischen Kassette pTHTG (System C) nach Elektrotransformation in NIH3T3-Zellen. Gezeigt sind Histogramme der GFP-Expression von zehn repräsentativen Hygromycin-selektierten NIH3T3-Zellklonen nach Elektrotransformation des linearisierten Vektors. Zuvor wurden die Zellen jeweils kultiviert in Selektionsmedium (dicke Linie; induziert) und in Doxhaltigem Medium (dünne Linie; reprimiert). Gepunktete Linie: nicht transduzierte Kontrolle. Ziffer in den FACSAbbildungen gibt die Anzahl der integrierten Kopien pro Zellklon an. Zellklon j zeigte mit einem Induktionsfaktor von nur einer Zehnerpotenz die geringste Expressionsregulation. In Zellklon h dagegen ließ sich die eGFP-Expression in Anwesenheit von Dox über zwei Größenordnungen vollständig reprimieren. Die hier gemessene Basis-Expression ist nahezu identisch mit der Expression der nicht transduzierten Kontrolle. In allen untersuchten Zellklonen variierten die Regulationswerte zwischen ein und zwei Zehnerpotenzen. Um abzuschätzen, ob die variierenden Regulationsfaktoren aus unterschiedlichen Kopienzahlen des Vektors in den transduzierten Zellklonen resultierten, wurden Southern Blot Analysen zur Bestimmung der Kopienzahl durchgeführt. Sieben der untersuchten Zellklone besassen eine 50 2. Ergebnisse einzelne Integrationsstelle (b, c, d, f, h, i, j), drei Klone drei Integrationen oder mehr (a, e, g) (Daten nicht gezeigt). Eine Korrelation zwischen hoher Induktion, niedriger Basisexpression und der Kopienzahl zeigte sich bei zehn untersuchten Zellklonen nicht. Die gemessenen Expressionsund Regulationsvarianz resultiert vermutlich aus den Einflüssen der jeweiligen chromosomalen Umgebung nach Integration (PEV) der autoregulierten Kassetten (vgl Kap. 2.4.2. und 3.5.). 2.7. Expressionsregulation der Systeme B und C nach retroviraler Infektion Um die Vorteile der effizienten Genübertragung und die Insertion in transkriptionell aktive Domänen zu nutzen, wurden beide bidirektionalen autoregulativen Expressionskassetten jeweils in zwei verschiedene retrovirale Vektoren inseriert. Der erste Vektor basiert auf dem murinen Leukämie Virus (MLV mit MSCV-LTR), der zweite auf dem selbst inaktivierenden Vektor (SIN) (Yu et al., 1996) (Abb. 2.14.). Abb. 2.14. Insertion der Expressionskassetten pTHTG und pTLGTN in die retroviralen Vektoren MLV und SIN. System B: Der Reporter und Selektionsmarker HTG wurde in reverser Orientierung zum 5' LTR inseriert. System C: Die bicistronische Reporter- und Selektionsmarkerkassette wurde in Sense, der tTA in reverser Orientierung zum 5' LTR inseriert. LTR: long terminal repeat; HTG: Triple-Fusionsprotein aus Hygromycin-B-Phosphotransferase, Thymidinkinase und eGFP; GTN: Triple-Fusionsprotein aus eGFP, Tymidinkinase und Neomycin-BPhosphotransferase; tTA: Transaktivator. 2.7.1. Herstellung und Analyse retroviraler Verpackungszellen für SIN-TLGTN Die amphotrope murine Verpackungszellinie PA317 wurde mit dem Vektor SIN-THTG transfiziert. Nach G418-Selektion wurden 42 Produzentenzellklone und vier 51 2. Ergebnisse Produzentenzellgemische generiert und zunächst auf Virusproduktion geprüft. Dazu wurde für alle Klone und Gemische ein Titerassay mit NIH3T3-Zellen durchgeführt. Nur 20 der 45 untersuchten Verpackungszellklone produzierten Viren. Bei elf dieser Klone lag der Titer jedoch unter 103 cfu/ml. Insgesamt zeigten nur neun Zellklone und drei der Produzentenzellgemische Titer über 103 cfu. Bei diesen Zellen wurde die Regulation der Luziferaseexpression untersucht. Zwei Zellklone exprimierten keine Luziferase und wurden nicht zur weiteren Untersuchung eingesetzt. In Abbildung 2.15. sind die Expressions- und Regulationseigenschaften sowie die Virusproduktion der sieben Produzentenzellklone und der drei Gemische aufgeführt. Abb. 2.15. Expression, Induktionsfaktoren und Virusproduktion der mit SIN-TLGTN transfizierten Verpackungszellen PA317. Nach Transfektion wurden 42 Zellklone und vier Gemische untersucht. Aufgeführt sind nur die Produzentenzellen, die Virustiter über 103 cfu produzierten und Luziferase exprimierten. 2.7.1.1. Es zeigten sich keine vollständigen Vektor-Integrate nach retroviraler Infektion mit den bicistronischen Vektoren SIN-TLGTN und LTR-TLGTN Zur Messung der Expressionsregulation nach Infektion wurde der virushaltige Überstand der in Abbildung 2.15. aufgeführten Produzentenzellen zur Infektion von NIH3T3-Zellen verwendet. Nach G418-Selektion und Isolation von je acht infizierten Zellklonen und einem Infektionsgemisch pro Produzentenzelle wurde die Regulation in Abhängigkeit von Dox untersucht. Jedoch exprimierte keiner der insgesamt 80 infizierten Zellklone und keines der 52 2. Ergebnisse Gemische Luziferase. Eine Ausnahme bildete die mit Produzentenzellklon 13 infizierte Zellpopulation. Hier konnte eine sehr schwache Expression von Luziferase (1x104 rlu) detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Durchgeführte Southern-Blot-Analysen zeigten auch hier in den untersuchten Infektanten mit hoher Frequenz auftretende Rekombinationen, die vermutlich zu Deletionen der tTA-Sequenz in Verbindung mit dem bidirektionalen Promotor und Teilen des Luziferasegens führten (Daten nicht gezeigt). Um auszuschließen, dass die hohe Rekombinationseffizienz ein Problem des verwendeten retroviralen SIN-Vektors darstellt, wurde die Kassette in einen MLV-basierenden Vektor inseriert (LTR-TLGTN) und alle Experimente wiederholt. Doch auch in diesem retroviralen Hintergrund zeigte sich ähnliche Instabilität der integrierten Kassette (Daten nicht gezeigt). 2.7.2. Positionseffekt-unabhängige Expression nach Infektion mit den monocistronischen Vektoren SIN-THTG und LTR-THTG Da die Rekombination immer sequenzabhängig ist, wurde auch die Stabilität und Expressionsregulation des monocistronischen Vektors pTHTG (Abb. 2.13. und 2.14.) nach retroviralem Transfer untersucht. Dazu wurde die autoregulierbare Kassette von pTHTG in den MLV-basierenden Vektor integriert (LTR-THTG; Abb. 2.14). Um LTR-spezifische Expression der inserierten Kassette zu reduzieren, wurde der Reporter HTG in reverser Orientierung zum viralen Promotor/Enhancer-Element inseriert. Um LTR-spezifische Interaktionen zu vermeiden, wurde die Kassette auch in den SIN-Vektor integriert (SIN-THTG). Nach Transfektion der Konstrukte in die Verpackungszelllinie PT67 und Selektion Hygromycin resistenter Gemische (PT-LTR-THTGPool und PT-SIN-THTGPool) wurde im nachfolgenden Titerassay mit NIH3T3Zellen der virale Titer beider Produzentenzellgemische bestimmt. Es zeigte sich jedoch nur eine sehr geringe Virusproduktion (50 cfu/1x106 Zellen). Mit diesem geringen Virustiter wurden 23 infizierte Hygromycin-resistente Zellklone (19 für LTR-THTG, 4 für SIN-THTG) und je ein Infektionsgemisch etabliert und die jeweilige Expressions- und Regulationskapazität in Abhängigkeit von Dox ermittelt. Zwei Zellklone exprimierten kein eGFP in detektierbaren Konzentrationen, erstaunlicherweise zeigte sich aber für die verbleibenden 21 Zellklone, sowie für die Infektionsgemische ein sehr übereinstimmendes Expressions- und Regulationsverhalten (Abb. 2.16). Die Zellklone und Gemische konnten durch die Zugabe von Dox vollständig in ihrer GFP- 53 2. Ergebnisse Expression reprimiert werden, wogegen die Doxycyclin-freie Kultivierung in allen Zellklonen und Gemischen zur Induktion der eGFP-Expression führte. Diese stringente Expression und Regulation war nahezu unabhängig von der transkriptionellen Aktivität des retroviralen LTRs, da beide Vektoren, vollständig und Enhancer deletiert, nahezu vollständige Regulation aufwiesen. Darüber hinaus zeigte sich in den 21 unabhängigen Zellklonen und den Gemischen nahezu identische Expressionslevel im induzierten Zustand. Im Gegensatz zum erhaltenen Expressionsmuster nach Elektroporation der Retrovirus-freien Kassette pTHTG, die von Zellklon zu Zellklon starke Varianz aufwies (Abbildung 2. 13.), führte hier die Induktion und Repression in allen Infektanten zu einem übereinstimmenden Expressionslevel, dessen Fluoreszenz im induzierten Status zwischen 101 und 102 relativen fluoreszierenden Einheiten lag und im reprimierten Zustand der Expression der nicht transduzierten Kontrolle entsprach. Abb. 2.16. Expressions- und Regulationskapazität der mit LTR-THTG bzw. SIN-THTG infizierten NIH3T3Zellpopulationen in Passage zwei. Die infizierten Zellgemische wurden jeweils für drei Tage in Selektionsmedium (Hygromycin) oder in Dox-haltigem Medium kultiviert. Nachfolgend wurde die GFP-Expression im FACS ermittelt. Die in Passage 12 wiederholte Messung der Expressionsregulation offenbarte identische Expressionsmuster in Abhängigkeit von Dox. Dicke Linie: induzierte Expression; Dünne Linie: reprimierte Expression; gepunktete Linie: nicht transduzierte Kontrolle. Die jeweils gezeigte Expression und Regulation der Infektionsgemische ist übereinstimmend mit dem Expressionsverhalten der 23 Einzelklone (Daten nicht gezeigt). Die nach Elektroporation von pTHTG gemessene Zellklon zu Zellklon-Varianz trat nach retroviraler Infektion nicht auf. Darüber hinaus blieb die gemessene Expressionsregulation über die Kultivierungsdauer von 6 Wochen stabil, da die in Passage 12 wiederholte Messung der Regulationskapazität mit der in der Abbildung 2.16. gezeigten Regulation identisch blieb (Daten nicht gezeigt). 54 2. Ergebnisse 2.7.2.1. Die Dosis-abhängige Repressionskurve demonstriert ein übereinstimmendes Regulationsmuster der Infektanten Um das übereinstimmende Expressionsmuster der LTR-THTG und SIN-THTG infizierten Zellen auf Zellgemisch- und Zellklon-Ebene zu demonstrieren, wurden beide Gemische (Abb. 2.16.) und je zwei LTR-THTG und SIN-THTG infizierte Zellklone für die Aufnahme einer Dosisabhängigen Repressionskurve verwendet. Die Kulturen wurden dazu gesplittet und in ansteigenden Konzentrationen von Dox kultiviert (0,001 ng/ml bis 1000ng/ml). Täglicher Medienwechsel garantierte gleichbleibende Dox-Konzentrationen. Nach drei Tagen wurde die Expression im FACS vermessen (Abb. 2.17.). Abb. 2.17. Dosis-abhängige Repressionskurve der beiden Infektionsgemische LTR-THTG und SIN-THTG, sowie von je zwei infizierten Zellklonen in Abhängigkeit von Dox. Beide Infektionsgemische und die zwei Zellklone der LTR-THTG und SIN-THTG Infektanten wurden in den angegebenen Konzentrationen von Dox für je drei Tage mit täglichem Mediumwechsel kultiviert. Der prozentuale Anteil der GFP-exprimierenden Zellen nach FACS-Analysen ist angegeben. Auch hier zeigten die Gemische und Zellklone sehr übereinstimmende Expressionsmuster. Bei Kultivierung der Zellen ohne Dox exprimierten jeweils 90 bis 100 % der Zellen eGFP. Eine leichte Expressionsabnahme auf 80% positive Zellen konnte bei Konzentration bis zu 0,01 ng Dox pro ml gemessen werden. Die Erhöhung der Dox-Konzentration auf 0,1 ng/ml führte in allen Kulturen zu einem sehr starken Expressionsrückgang auf nur noch 10 bis 25 % exprimierende Zellen, 1 ng Dox/ml und mehr zur vollständigen Repression in allen Kulturen. Auch hier zeigte sich das auffällig übereinstimmende Repressionsverhalten der unabhängigen 55 2. Ergebnisse Zellklone und Gemische nach retroviraler Infektion. Es unterscheidet sich deutlich vom Expressionsmuster der Zellklone nach Elektrotransformation (vgl. Abb. 2.13.). Offenbar spielt der Einfluß der chromosomalen Umgebung auf die Expressionsregulation nach Integration der bidirektionalen Expressionskassette in retrovirale Vektoren nur eine untergeordnete Rolle. 2.7.2.2. Induktion der Expression auch nach Langzeitkultivierung unter reprimierenden Bedingungen möglich Die autoregulierte bidirektionale Kassette zeigte im retroviralen Kontext sehr gute Expressionsund Regulationseigenschaften. Diese gemessenen Eigenschaften wurden jedoch nach relativ kurzen Induktions- oder Repressionszeiträumen ermittelt. Es wurde daher geklärt, ob die positiven Regulationseigenschaften auch über einen langen Kultivierungszeitraum der Zellen unter reprimierenden Bedingungen erhalten bleiben. Dazu wurden beide Gemische (I-LTRTHTGPool) und (I-SIN-THTGPool) sowie je ein Zellklon über einen Zeitraum von 30 Passagen unter reprimierenden Bedingungen (+ Dox) kultiviert und so die Expression vollständig abgeschaltet. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Passage 9, 18, und 30) wurden die Kulturen gesplittet, zum Entfernen des Dox gewaschen und entweder in DME, in DME plus Hygromycin oder in Dox-haltigem Medium weiter kultiviert. Um die vollständige Abwesenheit von Dox und damit die Induktion der Expression zu garantieren, wurde die eGFP-Detektion im FACS erst nach sieben Tagen durchgeführt (Abb. 2.18.). Für die untersuchten Zellklone und Gemische zeigen sich auch übereinstimmende Induktionseigenschaften nach Langzeitkultivierung unter reprimierenden Bedingungen. Passage 2 gibt die Ausgangsexpression der Zellen direkt nach Hygromycin-Selektion sowohl für den induzierten als auch für den reprimierten Status an. Nach neun Passagen in Dox-haltigem Medium variierte der Anteil induzierbarer Zellen zwischen 28 % (LTR-THTGPool) und 65 % (LTR-THTGKlon). Durch Kultivierung mit Selektionsdruck (Hygromycin) stieg der Anteil der induzierten Zellen auf 50 bis 75 % an. Auch nach längerer reprimierender Kultivierungsdauer (Passage 18, 30) blieben diese Induktionswerte konstant, so dass offenbar zu jedem Zeitpunkt der Kultivierung etwa gleiche Anteile der Zellen zur eGFP-Expression induziert werden können. Dadurch zeichnet sich die verwendete autoregulierbare bidirektionale Kassette neben sehr guten Regulationseigenschaften auch durch eine hohe Expressions- und Induktionsstabilität aus. 56 2. Ergebnisse Abb. 2.18. Konstante Induktionsfähigkeit der Gemische und Zellklone nach Langzeitkultivierung unter reprimierenden Bedingungen. Die Infektionsgemische I-LTR-THTGPool und I-SIN-THTGPool und je ein Zellklon wurden über 30 Passagen in Dox-haltigem Medium kultiviert (schwarze Säulen). Zu den angegebenen Passagen wurden die Kulturen gesplittet, gewaschen und in Dox-freiem Medium ohne Selektionsdruck (weiße Säulen) oder mit Selektionsmedium (graue Säulen) kultiviert, um eine effiziente Expressionsinduktion zu ermöglichen. Anschließend wurde der prozentuale Anteil GFP-positiver Zellen im FACS ermittelt. Passage 2 zeigt die Ausgangsexpression direkt nach Selektion sowohl für den induzierten als auch den reprimierten Status an. Die Expression ohne Selektionsdruck wurde hier nicht ermittelt. 2.8. Analysen zur Titerverbesserung des Vektorsystems Für eine effiziente gentherapeutische Nutzung ist der bisher erreichte Titer funktionsfähiger Viren mit bis zu 50 cfu/ml zu gering. Virale Titer von 1x105 bis 1x106 cfu/ml müssen für eine erfolgversprechende gentherapeutische Anwendung angestrebt werden. Im beschriebenen Vektorsystem C können folgende Punkte die Höhe der Virusproduktion negativ beeinflussen: a) 2.8.1. Vektorrearrangements durch Splice- oder poly-A-Signale a) 2.8.2. Die Bildung von Antisense RNA 2.8.3. Hohe Transaktivator-Konzentrationen und niedrige Expression des Selektionsmarkers b) 2.8.4. das sogenannte „Poly-A-Trapping” c) 2.8.5. Sekundäre Strukturen der viralen genomischen RNA aufgrund des symmetrisch aufgebauten Promotors Diese Punkte werden im folgenden erläutert und detaillierter untersucht. 57 2. Ergebnisse 2.8.1. Geringe Titer durch Vektorrearrangements? Trotz der guten Regulationseigenschaften ist der Titer der retroviralen Vektoren SIN-THTG und LTR-THTG unbefriedigend. Da für die im ersten Teil der Arbeit untersuchten Vektoren (Kap. 2.4. und 2.7.1.1.) gezeigt werden konnte, dass Rearrangements für niedrige Titer oder die Transduktion von verkürzten Vektorsequenzen verantwortlich waren, wurde auch hier untersucht, ob die geringe Virusproduktion durch Rearrangements zu erklären ist. Dazu wurde chromosomale DNA der verwendeten Produzentenzellgemische (PT-LTR-THTGPool und PT-SIN-THTGPool) und Infektionsgemische (I-LTR-THTGPool und I-SIN-THTGPool), sowie von je vier infizierten Zellklonen nach Passage 2 generiert, HindIII/StuI geschnitten und sowohl gegen die Transaktivator-Sequenz als auch gegen HTG hybridisiert (Abb. 2.19.). Abb. 2.19. Southern Blot Analyse der mit LTR-THTG und SIN-THTG transfizierten und infizierten Zellen. Untersucht wurden beide Produzentenzellgemische (PT-SIN-THTGPool und PT-LTR-THTGPool) sowie für jeden Vektor ein Infektionsgemisch und vier infizierte Zellklone (I-LTR-THTGPool + vier Klone und I-SIN-THTGPool + vier Klone). Die chromosomale DNA wurde HindIII/StuI geschnitten und zunächst gegen HTG (Sonde IV) und nach Dehybridisierung des Blots im zweiten Schritt gegen tTA (Sonde II) hybridisiert. Die bei Sonde IV noch erkennbaren Banden der Größe 1543 bp zeigen die unvollständige Dehybridisierung der Sonde II an. Diese Banden sind nicht auf die Hybridisierung mit der Sonde IV zurückzuführen. M: Größenmarker; 1: PT-SIN-THTGPool; 2: PT-LTR-THTGPool; 3: I-SIN-THTGPool; 4 - 7: I-SIN-THTG-Zellklone; 8: I-LTR-THTGPool; 9 - 12: I-LTR-THTG-Zellklone. 58 2. Ergebnisse In beiden Produzentenzellgemischen (Spur 1 und 2) erscheinen für beide verwendeten Sonden Banden der erwarteten Größe von 1543 bp für die Sonde II und von 2276 bp für die Sonde IV. Es ließ sich jedoch in beiden Gemischen, unabhängig von der verwendeten Sonde, eine Zusatzbande mit einer Größe von etwa 3000 bp detektieren. Im Falle der SIN-THTG-Infektanten ließen sich nur Banden der richtigen Größe detektieren (Spur 3 bis 7). In den mit LTR-THTG infizierten Zellklonen (I-LTR-THTG Klon 10 und 12) und im Infektionsgemisch I-LTR-THTGPool erschien jedoch zusätzlich zu der Bande der richtigen Größe die beschriebene Bande von ~ 3000 bp. Da diese Zusatzbande sowohl im alleinigen HindIII-Verdau (Daten nicht gezeigt) als auch im HindIII/StuI-Verdau die Größe von 3000 bp beibehielt, wäre dieses Muster mit dem Verlust der im Promotor liegenden StuI-Schnittstelle mit zusätzlich etwa 1000 bp zu erklären, wodurch entweder Teile des tTA-Gens oder der HTGSequenz mit betroffen sind. FACS-Analysen zeigten, dass die positiven Regulationseigenschaften der Infektanten durch die zusätzliche Integration der veränderten Vektorsequenz nicht beeinflusst wurden (Abb. 2.16. für die Infektionsgemische, Histogramme der Einzelklone sind nicht gezeigt). Darüber hinaus tauchte die Zusatzbande immer nur in Verbindung mit der vollständigen Sequenz auf, was daraufhin deutet, dass die verkürzte Version allein nicht in der Lage ist, den Zellen Hygromycin-Resistenz zu vermitteln. Die Banden des Southern Blot sprechen dafür, dass die Deletionen neben den vollständigen Vektoren bereits in den Produzentenzellgemischen (PT-LTR-THTG und PT-SIN-THTG) auftreten (Bande von ~ 3000 bp; Lane 1 und 2). Um zu klären, ob sich auch noch nach Infektion und Integration vollständiger Vektoren Rearrangements ereignen, wurden die in Passage zwei untersuchten infizierten Gemische und Zellklone über 12 Passagen kultiviert und anschließend erneut die chromosomale DNA mit beiden Sonden hybridisiert. Jedoch änderte sich das Bandenmuster der nach Passage zwei untersuchten Klone auch nach Passage 12 nicht. Es konnten keine weiteren Vektorveränderungen detektiert werden. Auch ließ sich im FACS keine Verschlechterung der Expressions- und Regulationskapazität der Klone detektieren (Daten nicht gezeigt). Das spricht dafür, dass die Vektoren in den infizierten Zellen stabil sind. Daraus kann gefolgert werden, dass sich die Rekombination entweder bereits in den Produzentenzellen nach Transfektion ereignet hat und die veränderten Vektoren möglicherweise mit höherer Effizienz als der originale Vektor verpackt und transduziert werden, oder dass die Rearrangements, aufgrund von fehlerhaften Templatewechseln der reversen Transkriptase sehr effizient während der reversen Transkription ablaufen. Jedoch erhalten nur die Zellen 59 2. Ergebnisse Hygromycin-Resistenz, die zusätzlich das vollständige Konstrukt erhalten haben. 2.8.1.1. Untersuchung auf mögliche Splice Sites oder pA-Signale im retroviralen Vektor LTR-THTG Leboulch et al. (1994) beschrieben zwei generelle Mechanismen, die für Instabilitäten und geringe Titer der retroviralen Vektoren verantwortlich sind: kryptische Splice- und Polyadenylierungssignale sowie das Auftreten von häufig wiederholten Sequenzen im Vektor. Dies ist darauf zurückzuführen, dass nicht nur die in den retroviralen Vektor integrierte Expressionskassette vom internen Promotor aus transkribiert wird, sondern auch der gesamte Vektor vom 5' LTR bis zum 3' LTR. Im Wildtyp-Virus werden über die genomische RNA die viralen Gene gag und pol exprimiert. Das Env-Polyprotein wird über eine gespleißte Message exprimiert. Die dazu notwendigen Splice-Signale finden sich in der Psi-Region (Splice-Donor) und kurz vor dem überlappenden Leserasters des pol und env Gens (Splice-Akzeptor). Durch Austausch der viralen Sequenzen mit der rekombinanten Expressionskassette ist im retroviralen Vektor dieser Splice-Akzeptor deletiert, jedoch bleibt der Splice-Donor in der Psi-Region erhalten. Werden Elemente, die kryptische Splice-Akzeptor-Sequenzen enthalten, inseriert, so können die dazwischenliegenden Sequenzbereiche deletiert werden. Da damit auch die PsiRegion der Vektoren deletiert wird, werden diese RNAs schlecht verpackt. Das Spleißen gilt auch für die Insertion genomischer DNA mit Exon- und Intronsequenzen. Die enthaltenen SpliceSignale zwischen Intron und Exon führen zu hohen Instabilitäten und niedrigen Titern der viralen rekombinanten Vektoren (Leboulch et al., 1994; Li et al., 1999). Kryptische Polyadenylierungssignale dagegen führen zum frühzeitigen Abbruch der viralen Transkription. Die Poly-A-Signale in Säugerzellen sind gut charakterisiert. Sie enthalten zwei Elemente: Die AAUAAA-Sequenz 20-30 Nucleotide vor und eine diffuse GU-reiche Region sofort nach dem 3 Ende der mRNA (Proudfoot, 1991). Obwohl das AAUAAA-GU-Signal die Minimum-Sequenz für die Poly-A-Addition darstellt, können weitere aufwärts gelegene Elemente die Effizienz beeinflussen (Levitt et al, 1989; Carswell and Alwine, 1989). Im Normalfall enthalten die in den Vektoren verwendeten cDNAs keine Splice-oder Polyadenylierungssignale. Allerdings können durch die Verwendung von normalerweise nicht transkribierten Elementen (z.B. SARs oder LCRs) oder durch Insertion von cDNA-Genen in reverser Orientierung zur viralen Transkription krytische Signale generiert werden. 60 2. Ergebnisse Der Reporter HTG wurde in reverser Orientierung zum viralen Promotor inseriert. Durch die Umkehr der Sequenz sowie auch durch die verschiedenen Klonierungsschritte ist die Generierung von Splice-Signalen nicht auszuschließen. Darüber hinaus berichteten Urlinger et al. (2000) ebenfalls, dass abhängig vom Sequenz-Kontext die für den Transaktivator codierende mRNA durch kryptische im tTA-Gen vorhandene Splice-Donor und Akzeptor Sequenzen gespleißt werden kann. Daher wurde die gesamte Sequenz von LTR-THTG per Computer auf Splice- und Polyadenylierungssignale untersucht. Da vermutlich eine 1000 bp große Region um die StuISchnittstelle im bidirektionalen Promotor betroffen ist, wurde auf diesen Bereich besonders geachtet (Tab. 2.5.). Gesucht wurde nach folgenden Konsensus-Sequenzen: 5`Splice-Site: C38/A39A62G77G100T100A60A74G84T50 Dabei wurden bis zu drei Mismatches akzeptiert (ausgenommen war die GT-Region). Gesucht wurden auch die von Krainer und Maniatis (1988), abgeleiteten altenativen Splice-Sites: AGGTA; GTAAG; RGGTGAG oder AGGTNNGT 3`Splice-Site: Y77Y78Y81Y89Y85Y82Y81Y86Y91Y87NY97A100G100 Auch hier wurden bis zu drei Mismatches akzeptiert (ausgenommen war die AG-Region) Branchpoint-Sites: Y13/16NY16/16T14/16R13/16A16/16Y15/15 Hier wurde auf genaue Übereinstimmung geachtet, obwohl der Konsensus eher als schwach und nicht ausschlaggebend zu betrachten ist. Sequenz sollte 2-21 bp vor der möglichen 3 SS liegen. Poly-A-Signal: AATAAA mit nachfolgendem Poly-A-Element wie [T]n, [GT]n oder YGTGTTYY Auch wurde die Anwesenheit seltener pA-Signale überprüft: AUUAAA (10%); AAUACA (2%) oder AAUUAA (2%) 61 2. Ergebnisse B a s e n p a a re 5 ´S p lic e S ig nal B ran c h point 457 TC G C TG A T 5 8 0 g A G G TA A G c 912 1000 1025 tA G G Tc A c T 1096 1121 1151 1256 1387 1653 1944 2319 2877 3478 3784 3867 4033 4142 C C TTC Tg C TC TG C A G C TTTA A C C TTTA A C TTTTG A C TC a C TC C TTC TC TA G C C TTTG A T tA G G Tc A G g g A G G TA A G T A g G G TG A G t C TC TG A T C A C TG A C TA TTG A C tA G G Tc A G g g C Ta TTTa C C C G C A G C A C TG A T C A C TG A T C A C TG A T C A C TG A T C A C TG A T C A C TG A T TTTTG A C 5194 5483 TA C TG A T 6531 P o ly A S igna l TC TTg TC Tg C TG C A G a C C a C TC C C TTA a G T 4315 4559 4595 4637 4721 4763 4805 4897 6097 6151 6162 3`S p lic e S ig n al TC C Ta Ta C TTTC TA G C TC Ta TC a C Tg A TA G C TC Ta TC a C Tg A TA G C TC Ta TC a C Tg A TA G C TC Ta TC a C Tg A TA G C TC Ta TC a C Tg A TA G TTTTg a C C TC C A TA G a C TTTTg C C C TTTA G TTTTG A C A A TA A A TTa TTTa g TC TC C A G A A TA A A Tab. 2.5. DNA-Sequenz-Analyse des retroviralen Vektors LTR-THTG. Die Analyse beginnt am Start der R-Region im 5' LTR und endet nach der R-Region des 3'LTRs. Die Konsensus-Sequenzen für 5' und 3' Splice-Signale, Branchpoint- und Polyadenylierungssignale sind in den Ergebnissen beschrieben. Bis zu 3 Mismatches (Kleinbuchstaben) wurden akzeptiert. Basen, die dem Konsensus entsprechen, sind in Großbuchstaben dargestellt. Die dargestellten Größen der verschiedenen Vektorelemente werden bedingt durch die in ihnen gefundenen Signale und entsprechen nicht der realen Größe. Lage der retroviralen Splice-Donoren (rv SD) und der StuI-Schnittstelle ist angegeben. Es wurde nur eine Polyadenylierungsstelle identifiziert, die innerhalb der R-Region des 3' LTRs lag, und somit nicht für Rearrangements verantwortlich sein kann. Zwei 5`Splice-Donoren (rv SD) mit zwei und drei Mismatches fanden sich in der Psi-Region. Der erste Splice-Donor dient in wt-Viren als Donor für das Spleißen der viralen RNA zur Translation des Env-Proteins. Das Auftauchen des zweiten Donors ist ungewöhnlich. Das Spleißen über diesen Donor ließe einen Großteil der Psi-Region in Takt, und würde erklären, warum derart gespleißte RNAs in Virionen 62 2. Ergebnisse verpackt werden. Vier weitere mögliche 5 SS mit einem bis zu drei Mismatches fanden sich im revers orientierten Reportergen HTG und könnten als mögliche Donoren in Frage kommen. 3`Splice-Signale in Verbindung mit der Branchpoint-Sequenz fanden sich in großer Anzahl (acht mal) im Bereich des bidirektionalen Promotors. Allerdings überlagerten sich in sieben Fällen beide Sequenzen, so dass diese Sequenzen vermutlich als effektive Splice-Akzeptoren ausgeschlossen werden können. In einem Fall jedoch liegt die Branchpoint-Sequenz 28 bp vor der 3`Slice-Signal, also in einer optimalen Entfernung, und jenseits der StuI-Restriktionsstelle. Sollte sie als Splice-Akzeptor fungieren, so käme es wie im Southern Blot gezeigt zum Verlust der StuI-Schnittstelle. Allerdings sollte sich dann etwa 1000 bp aufwärts eine mögliche SpliceDonor Schnittstelle befinden, so dass es, wie im Southern Blot gezeigt zur effizienten Deletion von etwa 1000 bp kommt. Allerdings fand sich aufwärts keine entsprechende Sequenz. Auch bleibt unklar, warum Rearrangements hauptsächlich im retroviralen Kontext auftreten, obwohl die retroviralen Sequenzen selbst nicht direkt von den Deletionen betroffen zu sein scheinen. Eindeutige Splice-Signale konnten mit Hilfe des Computers nicht identifiziert werden. Auffällig allerdings ist die Anhäufung von möglichen 3 Splice-Signale im Bereich des bidirektionalen Promotors, die zur Instabilität der retroviralen Vektoren beitragen könnten. 2.8.2. Der Titer wird leicht durch die Ausbildung der Antisense RNA reduziert Die Anordnung des Reporters HTG in reverser Orientierung zum viralen LTR verhindert eine unerwünschte Beeinflussung der Reportergen-Expression durch die Enhancer-Elemente des viralen Promotors. Jedoch könnte die so gebildete vom PbitTA initiierte RNA, die den Reporter aber auch die Verpackungsregion Psi beinhaltet, mit der LTR-initiierten RNA des viralen Vektors hybridisieren und ihre anschließende Verpackung in die Virionen verhindern. Um die Bildung der Antisense-RNA herabzusetzen wurden die verwendeten Produzentenzellen für den Zeitraum der Virusproduktion in Dox-haltigem Medium kultiviert und so die Expression des Reporters reprimiert. Zur Evaluierung des Titers wurden die erhaltenen Viren zur Infektion von NIH3T3-Zellen eingesetzt. Vergleiche der erhaltenen Virustiter während reprimierter oder induzierter Expression des Antisense-Reporters zeigten allerdings keinen signifikanten Unterschied in der Menge der produzierten Viren. Damit kann für dieses Vektorsystem ein negativer Einfluß der Antisense-RNA auf den viralen Titer ausgeschlossen werden. 63 2. Ergebnisse 2.8.3. Änderung der Genanordnung durch Umorientieren der regulierten Kassette führt nicht zur Titererhöhung Durch die spezifische Anordnung der Gene im Vektor LTR-THTG (Abb. 2.20.A) kommt es zur Bildung von Antisense RNA zwischen der vom tTA-Promotor initiierten Reporter-RNA und der viralen genomischen RNA transkribiert vom 5' LTR. Dadurch ist eine verminderte Translation des Resistenzmarkers HTG denkbar. Zusätzlich ist auch eine verstärkte Expression des Transaktivators durch den aktivierenden Einfluss des aktiven viralen 5 LTRs sowie durch Translation des tTAs von der genomischen viralen RNA denkbar (z.B. über gespleißte RNA, siehe oben). Im ungünstigen Fall würde dies zu hohen toxischen Konzentrationen des Transaktivators in erfolgreich infizierten Zellen führen, ohne eine entsprechende stabile Resistenz gegen Hygromycin zu bewirken. Dadurch würden nach Selektion nur die Zellen detektiert werden, in denen der Vektor nach Integration eine genügend hohe Selektionsmarker-Expression zulässt, bei gleichzeitig tolerierbaren Konzentrationen des Transaktivators. Daher wurde die in den Vektor integrierte Kassette gedreht, so dass nun der Selektionsmarker HTG in gleicher Orientierung des LTRs und der Transaktivator in reverser Orientierung zum 5 LTR lokalisiert ist. Dadurch sollte die Konzentration des Transaktivators vermindert und die des Selektionsmarkers erhöht werden (Abb. 2.20.B). Der Vektor LTR-THTG und der Vektor LTR-GTHT mit revers regulierter Kassette wurden in die humane amphotrope Verpackungszelllinie FlyA13 transfiziert. Nach Hygromycin-Selektion wurden für die reverse Orientierung mehr Klone erhalten, wodurch eine verbesserte Resistenzvermittlung durch die gedrehte Vektorversion ersichtlich ist (4-10 fach). Der Überstand des Hygromycin-resistenten Produzentenzellgemisches wurde zur Infektion von NIH3T3-Zellen verwendet. Nach Hygromycin-Selektion zeigte sich für den “ gedrehten” Vektor LTR-GTHT eine Titerverbesserung um den Faktor 5 im Vergleich zum Originalvektor LTR-THTG (bis zu 250 cfu gegenüber von bis zu 50 cfu). FACS-Analysen von 13 infizierten Zellklonen und einem Infektionsgemisch zur Evaluierung der Expressionsregulation in Abhängigkeit von Dox offenbarten allerdings, dass die Drehung der integrierten Kassette zum fast vollständigen Verlust der Reporter-Regulation geführt hat (Abb. 2.20.B). Die Drehung der Kassette führte somit zwar zu einer leichten Erhöhung des viralen Titers jedoch kam es gleichzeitig zum Verlust der Regulationseigenschaften, so dass diese Veränderung keine Verbesserung darstellt. 64 2. Ergebnisse Abb. 2.20. Untersuchungen zur Verbesserung des retroviralen Titers. A: “originaler” Vektor LTR-THTG. Vektorveränderungen in Form von reverser Orientierung der integrierten Kassette (LTR-GTHT; B), Austausch eines minimalen CMV-Promotors gegen den Tk-Minimalpromotor (LTR-tk-THTG; C) und Insertion von Polyadenylierungssignalen (LTR-THTGbghNotI; D). Angegeben ist der jeweilige virale Titer und die erhaltene Regulation der GFP-Expression in Abhängigkeit von Dox in Form von Histogrammen. 2.8.4. Auswirkung der suboptimalen Polyadenylierung auf den viralen Titer Normalerweise werden innerhalb von retroviralen Vektoren keine zusätzlichen Polyadenylierungssequenzen in direkter Orientierung zum 5' LTR eingesetzt. Aufgrund der Prozessierung und Polyadenylierung der RNA an dieser Stelle käme es zur Verkürzung der genomischen viralen RNA mit der Konsequenz von niedrigen Titern und deletierten Vektorintegrationen. Auch hinter revers orientierten Genen werden häufig keine Poly-A-Signale inseriert, da viele Poly-A-Signale auch in reverser Orientierung aktiv sind (z. B. das SV40-PolyA-Signal) und es somit zum Abbruch der Transkription der genomischen RNA käme. Es stellt sich jedoch die Frage, wie die Transkripte revers orientierter Gene korrekt prozessiert und effizient polyadenyliert werden. Für die Termination und Polyadenylierung der in Sense 65 2. Ergebnisse verwendeten rekombinanten Gene wird die im 3`LTR liegende retrovirale Terminationsregion, die sogenannte R-Region genutzt. Es ist allerdings nicht beschrieben, ob diese Region auch in reverser Orientierung im 5' LTR aktiv ist und die RNA revers zum LTR inserierter Gene in der R-Region des 5' LTRs prozessiert wird, oder ob die Polyadenylierung über zelluläre poly-ASignale erfolgt. Daher wurde untersucht, ob die tTA-abhängigen Reportergen-Transkripte in der R-Region des 5' LTRs enden, ob also das poly-A-Signal in der R-Region auch in reverser Orientierung aktiv ist. Dazu wurde die Gesamt-RNA aus mit SIN-THTG (3 Klone) und LTRTHTG (8 Klone) infizierten Zellklonen isoliert und gegen die Transaktivator- und die HTGSequenz hybridisiert (Abb. 2.21). Abb. 2.21. Northern Blot Analyse zur Überprüfung der Größe der vom bidirektionalen Promotor aus initiierten Transkripte. A: Hybridisierung der Gesamt-RNA infizierter Zellen gegen die tTA-Sequenz (Sonde I). Nach Dehybridisierung wurde der Blot mit Sonde II rehybridisiert. M: Größenmarker; 1-3: SIN-THTG infizierte Zellklone; 4-10: LTR-THTG infizierte Zellklone. Alle Klone besassen nur eine integrierte Vektorkopie (detektiert durch Southern Blot Analyse, Daten nicht gezeigt) In allen untersuchten Zellklonen (Ausnahme Klon 4, aufgrund zu geringer RNA-Mengen) ist die 1500-1600 Basen lange vom bidirektionalen Promotor initiierte, Transaktivator-RNA deutlich zu erkennen. Als zweite Bande mit einer Größe von ~ 6500 Basen läßt sich die Bande der viralen genomischen RNA für LTR-THTG infizierte Zellklone detektieren. Diese Bande taucht in den mit dem SIN-Vektor infizierten Zellklonen aufgrund des inaktiven 5`LTRs nicht auf. Bei Hybridisierung desselben Blots gegen die in reverser Orientierung liegende Hygromycin-Sequenz 66 2. Ergebnisse zeigte sich ein breit gefächertes Bandenmuster, dessen kleinste Bande etwa bei 4400 Basen lag. Würde die Polyadenylierung des Reporters HTG in der R-Region des 5`LTRs erfolgen, so sollte in allen untersuchten Zellklonen eine Bande der Größe von ~ 4250 Basen (~4100 Basen der RNA und ~150 Basen des poly–A-Signals) auftauchen. Da jedoch häufig doppelte Banden mit unterschiedlichen Größen über 4400 Basen in den verschiedenen Zellklonen auftreten, kann vermutet werden, dass in der R-Region des 5' LTR keine effiziente Polyadenylierung der revers laufenden Transkription erfolgt. Anstelle von homogen terminierten Reporter-RNAs entstehen vermutlich Durchlese-Transkripte, die an geeigneten Sequenzen des zellulären Genoms polyadenyliert werden. Je nach Integrationsort des rekombinanten Vektors entstehen so Transkripte, die in ihrer Länge variieren. Möglich ist, dass nur den Zellen die übertragene Antibiotikum-Resistenz vermittelt wird, in denen der Vektor nach Infektion in der Nähe einer geeigneten endogenen Polyadenylierungsstelle integriert hat. Zellen, in denen nach Infektion keine geeigneten Integrationsstellen getroffen werden, sterben ab. Auch dies würde sich in einem vermeintlich niedrigen Titer widerspiegeln. Die Insertion von Polyadenylierungssignalen zur Prozessierung der revers laufenden ReporterTranskription könnte den infizierten Zellen eine verbesserte Resistenz vermitteln. Voraussetzung ist, dass die verwendeten poly-A-Signale keine Aktivität in reverser Orientierung aufweisen dürfen. Das heißt, dass die virale Transkription durch das inserierte poly-A-Signal nicht behindert werden darf. In denen für die Integration in retrovirale Vektoren nutzbaren Poly-A-Signalen sollten Elemente, die zur Polyadenylierung führen (AAUAAA-Sequenz und diffuse GU-reiche Region, siehe Kap. 2.8.1.1.) nur in gleicher Richtung wie die Reporter-Transkription aktiv sein, nicht aber in reverser Orientierung. Zwei poly-A-Signale wurden ausgewählt. Das Tymidinkinase poly-A-Signal (TkpA) und das poly-A-Signal des bovine growth hormones (BGHpA). Beide Signale wurden mit Hilfe von PCR aus Expressionsvektoren isoliert und direkt hinter das HTG-Gen des Vektors LTR-THTG inseriert. Zusätzlich wurde das TkpA-Signal auch in die in der Psi-Region liegende SpeI-Schnittstelle kloniert. Die drei Vektoren mit zusätzlich internem poly-A-Signal (LTRTHTGtkNot; LTR-THTGbghNot und LTR-THTGtkSpe) wurden per Transfektion in die murine amphotrophe Verpackungszellinie PA317 eingebracht und der Titer mit NIH3T3-Zellen bestimmt. Für die retroviralen Titer gab es allerdings keine Änderung durch die Insertion der Poly-A-Signale. Sowohl für das BGHpA, als auch für das TkpA (SpeI- und NotI-Insertion) blieb der Titer zwischen 15 und 50 cfu/ml Virusüberstand. Je 16 infizierte Zellklone wurden isoliert 67 2. Ergebnisse und ihre eGFP-Expressions- und Regulationskapazität im FACS untersucht. Zellklone, deren transduzierte Vektoren das TkpA in der SpeI- oder NotI-Schnittstelle enthielten, zeigten vergleichbar gute Expressionhöhen und Regulationseigenschaften mit dem Originalplasmid LTRTHTG. Mit dem in die NotI-Schnittstelle inserierten BGHpA konnte zwar der Titer nicht verbessert werden, jedoch zeigten die analysierten Infektanten höhere relative eGFPFluoreszenzen bei gleichbleibender sehr guter Regulation (Abb. 2.20.C). Insgesamt konnte der Titer durch die korrekte Polyadenylierung des Selektionsmarkers nicht verbessert werden, wohl aber die Transkription des Reporters. Das zeigt, dass die Polyadenylierung in der chromosomalen Umgebung zwar nicht optimal ist, aber nicht als Grund für den geringen Virustiter angesehen werden kann. 2.8.5. Geringer Virustiter durch Ausbildung stabiler Sekundärstrukturen im Bereich des bidirektionalen Promotors? Durch die gegenläufige Anordnung der beiden CMV-Minimalpromotoren im bidirektionalen tTA-Promotor ist die Ausbildung von Sekundärstrukturen in der viralen RNA in Form eines stabilen Stemloops denkbar. Eine solche RNA-Konformation könnte ebenfalls die Virusproduktion durch eine ineffiziente Verpackung der RNA negativ beeinflussen. Zur Aufhebung der Symmetrie des bidirektionalen Promotors wurde der CMV-Minimalpromotor auf seiten des Transaktivators gegen den schwächeren TK-Minimalpromotor ausgetauscht (LTR-TkTHTG in Abb. 2.20.D, Strathdee et al., 1999). Gleichzeitig sollte so eine mögliche toxisch hohe Konzentration des Transaktivators während der Selektion der infizierten Zellen reduziert werden. Nach Transfektion des Vektors LTR-Tk-THTG in die Verpackungszellen PA317 und Infektion von NIH3T3-Zellen wurde sowohl der Titer als auch die Expressionshöhe und Regulation in zehn infizierten Zellklonen und einer Zellpopulation bestimmt. Dabei zeigte sich neben der sehr geringen Expression nicht der beabsichtigte Titeranstieg. Damit kann ausgeschlossen werden, dass Sekundärstrukturen durch die Sequenz-Symmetrie des bidirektionalen Promotors die Verpackung der Vektor-RNA signifikant reduzieren. 68 2. Ergebnisse 2.9. Adenovirale Vektoren als effiziente Transfervehikel Da sich der retrovirale Titer trotz der beschriebenen Ansätze nicht signifikant erhöhen ließ, wurde versucht, die sehr gut regulierbaren autoregulatorischen bidirektionalen Kassetten (Abb. 2.14. pTLGTN und pTHTG) mit Hilfe von Adenoviren in Zielzellen zu transferieren. Der Nachteil der rekombinanten Adenoviren liegt in ihrer transienten Expression als Folge des Verlustes der nur episomal vorliegenden Vektorkopien in sich teilenden Zellen. Stabile Integrationen sind zufällig und mit einer Frequenz von 1x10-5 selten (Harui et al., 1999). Adenoviren besitzen aber neben einem sehr breiten Wirtsspektrum und der hohen Transduktionseffizienz auch von nicht proliferierenden Zellen den weiteren Vorteil, dass sie in sehr hohen Konzentrationen (1x1010 bis 1x1012 cfu/ml) hergestellt werden können. Darüber hinaus berichteten Zheng et al. (2000) kürzlich über eine Integrationsfrequenz von bis zu 15 % der infizierten Zellen, wenn adenovirale Vektoren mit cis-agierenden retroviralen Elementen (LTRs) kombiniert werden. Zunächst sollte untersucht werden, ob die bisher gut regulierbaren autoregulatorischen Kassetten auch im adenoviralen Kontext und bei episomaler Expression ihre überzeugenden Regulationseigenschaften beibehalten. Da das Genom des verwendeten Adenovirus Typ 5 mit 36 kb relativ groß ist und eigene Promotoren und Enhancer enthält, ist nicht auszuschließen, dass auch hier die Regulationskapazität der autoregulatorischen Kassette beeinflusst werden kann. 2.9.1. Insertion der bidirektionalen autoregulierten Expressionskassetten in den adenoviralen Vektor Zunächst wurden die bereits beschriebenen und nach Elektrotransformation und/oder retroviraler Infektion getesteten Konstrukte pTHTG, LTR-THTG und pTLGTN in einen E1/E3 deletierten rekombinanten Adenovirus Typ 5 inseriert und so die Vektoren Ad-THTG, Ad-LTR-THTG und Ad-TLGTN konstruiert (Abb. 2. 22.). 2.9.1.1. Herstellung der rekombinanten Adenoviren Die rekombinanten adenoviralen DNAs wurden zur Herstellung der Adenoviren in die permissive humane embryonale Nieren Zelllinie 293 transfiziert. Die erfolgreiche Transfektion wurde durch 69 2. Ergebnisse die Replikation der Viren und die resultierende Plaquebildung im konfluenten Zellrasen nach etwa 14 Tagen angezeigt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Viren aus den Zellen geerntet und zur Amplifikation zunächst zur sogenannten Prä-Infektion der 293-Zellen eingesetzt. Nach drei bis fünf Tagen wurden die amplifizierten Viren geerntet und die viralen Titer ebenfalls auf 293Zellen bestimmt. Abb. 2.22. Die autoregulativen bidirektionalen Kassetten pTHTG, pLTR-THTG und pTLGTN wurden in die MCS des E1/E3 deletierten rekombinanten adenovirale Genom Typ 5 inseriert, wobei die Transaktivator Sequenz immer in reverser Orientierung zum adenoviralen ITR vorlag. Bidirektionaler Pfeil: bidirektionale Promotor; schwarze Kreise: Polyadenylierungssignal; schwarze Box: interne Ribosomen Eintrittsstelle des Polio-Virus (IRES). 2.9.2. Die hohe Regulationskapazität ist unabhängig von der episomalen Kopienzahl Zur Evaluierung der Regulationskapazität bidirektionaler bicistronischer Expressionskassetten im adenoviralen Kontext wurden Ad-LTR-THTG und Ad-TLGTN (Abb. 2.22.) zur Infektion von nicht permissiven murinen NIH3T3- und humanen A549-Zellen verwendet. Nach Infektion der murinen NIH3T3 Zellen mit einer MOI von 200 sowie der A549-Zellen mit einer MOI von 50 in An- oder Abwesenheit von Doxycyclin erfolgte die Messung der jeweiligen Expression im FACS vier Tage nach Infektion. Dabei zeigten sich 60 bzw. 30 % der NIH3T3Zellen infiziert (für Ad-LTR-THTG bzw. Ad-TLTGN) (Abb. 2.23.A), wogegen der Prozentsatz der infizierten A549-Zellen mit 15 bzw. 5 % deutlich niedriger lag (Abb. 2.23.B). Der Prozentsatz der GFP-positiven NIH3T3-Zellen konnte auch nach Infektion mit einer MOI von 400 nicht erhöht werden. Dies demonstrierte, dass diese Zellen nicht homogen transduziert werden können. Infektionen der A549-Zellen mit einer MOI von 200 erhöhten den Anteil GFP- 70 2. Ergebnisse exprimierender Zellen zwar auf etwa 35 %, wirkten aber toxisch und ließen die Zellen etwa vier Tage nach Infektion absterben. Nach adenoviraler Transduktion der autoregulierbaren Kassetten konnte für beide Vektortypen sowohl in den NIH3T3-Zellen als auch in den A549-Zellen sehr gute Regulation der Expression detektiert werden. Im induzierten Status (- Dox) kam es sowohl in den NIH3T3-Zellen (Abb. 2.23.A) als auch in den A549-Zellen (Abb. 2.23.B) zu einer sehr starken Expression, die zwischen 103 und 104 relativen Fluoreszenz-Einheiten für Ad-LTR-THTG lag. Bei Anwesenheit von Dox während des Infektionsprozesses und der nachfolgenden Kultivierung der Zellen lag die gemessene Expression von GFP nur geringfügig über der gemessenen Basis-Expression der mit GFP-defizienten Adenoviren transduzierten Kontrolle. Daraus läßt sich ein Regulationspotential von fast 3 Größenordnungen ableiten. Abb. 2.23. Regulationskapazität der adenoviralen Vektoren Ad-LTR-THTG und Ad-TLGTN in NIH3T3- und A549 Zellen. A: GFP-Expression als Histogramm-Überlagerung der induzierten und reprimierten NIH3T3-Zellen. Dicke Linie: induzierte Expression; dünne Linie: reprimierte Expression; gepunktete Linie: Background-Expression der nicht transduzierten Kontrolle. B: Dot-Plot-Darstellung der in A549-Zellen gemessenen reprimierten und induzierten GFP-Expression. Der prozentuale Anteil an GFP-positiven Zellen ist jeweils angegeben. Kontrolle: mit GFPdefizienten Adenoviren infizierte Zellen 71 2. Ergebnisse Die Infektion der Zellen mit Ad-TLGTN führte zu einer verminderten GFP-Fluoreszenz bei aber ebenfalls guter Expressionsregulation. Bei Infektion der induzierten Zellen lagen die gemessenen Fluoreszenzen zwischen 102 und 103 relativen Einheiten, wogegen die Expression im reprimierten Status der Zellen nicht von GFP-defizienten Kontrolle zu unterscheiden war, also durch Dox das vollständige Abschalten der Expression erreicht wurde. Die verringerte GFP-Expression in den mit Ad-TLGTN infizierten Zellen im Vergleich mit Ad-LTR-THTG ist vermutlich auf die Expression von GFP vom zweiten Cistron aus zurückzuführen. Dieser Effekt wurde ebenfalls nach Elektrotransformation der Vektoren pTLGTN und pTHTG in isolierten Zellklonen und Gemischen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Das zeigt, dass die autoregulierbaren Kassetten auch im adenoviralen Kontext ihre positiven Eigenschaften behalten. Die Messung der Expression während der Kultivierung der infizierten Zellen zeigte wie erwartet den Rückgang der Expression für beide adenoviralen Vektoren. Bereits 14 Tage nach Infektion ließ sich keine GFP-Fluoreszenz mehr in den Zellen nachweisen (Abb. 2.24.). Abb. 2.24. Verlauf der GFP-Expression nach Infektion von induzierten (-Dox) und reprimierten (+Dox) Zellen mit Ad-TLGTN. Der Verlust der GFP-Expression innerhalb von 13 Tagen ist angegeben als Prozent GFP-positiver Zellen. Dieser Effekt beruht auf der nur transienten Expression der Adenoviren. Die episomal vorliegende und nicht replizierende DNA geht durch die Proliferation der Zellen schnell verloren. Mit Hilfe des sehr sensitiven Luziferase-Assays wurde die Regulation der Expression in den mit Ad-TLGTN infizierten Zellen genau quantifiziert. Dafür wurden NIH3T3-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Dox infiziert und nach fünf, sieben, neun und 13 Tagen ihre Luziferaseexpression untersucht und der Induktionsfaktor ermittelt (Abb. 2.25.). 72 2. Ergebnisse Sehr hohe Luziferase-Expressionen von 2x109 rlu konnten im induzierten Zellgemisch fünf Tage nach Infektion detektiert werden, wogegen in den Zellen, die unter reprimierenden Bedingungen infiziert wurden, die Luziferase-Level um den Faktor 1000 niedriger lagen. Die ermittelten Induktionsfaktoren am Tag fünf, sieben, neun und 13 nach Infektion blieben nahezu konstant und lagen zwischen 2 und 3 Größenordnungen. Wie erwartet wurde auch hier eine absolute Abnahme der Luziferase-Expression durch die Proliferation der infizierten Zellen detektiert. Innerhalb des gemessenen Zeitraums reduzierte sich die Expression in den Zellen um den Faktor 1000. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der eGFP-Expression mit weniger als 1 % GFP-positiver Zellen 13 Tage nach Infektion (Abb. 2.24.). Abb. 2.25. Expressions- und Regulationskapazität von NIH3T3-Zellpopulationen nach Infektion mit Ad-TLGTN unter reprimierenden und induzierenden Bedingungen. Die Luziferaseexpression wurde an den angezeigten Tagen ermittelt. Gezeigt ist weiterhin das Ab- oder Anschalten der Expression zuvor induzierter bzw. reprimierter Zellpopulationen. Dicke Linie: Expression der konstant induzierten Zellpopulation; Dünne Linie: Expression der konstant reprimierten Zellpopulation. Pfeile: geben Induktion bzw. die Repression der konstant kultivierten Populationen an. In Abbildung 2.25 ist ebenfalls das An- und Abschalten der Luziferaseexpression in den mit AdTLGTN infizierten Gemischen gezeigt. Zellen, die unter induzierenden Bedingungen infiziert wurden, können sehr effektiv durch die Zugabe von Tetracyclin in ihrer Expression reprimiert werden, wogegen die Aktivierung der Expression in Zellgemischen, die unter reprimierenden Konditionen infiziert wurden durch das Auswaschen von Tet ebenfalls sehr effektiv erfolgt. Für diese Versuche wurde anstelle des Dox das weniger stabile und nur in höheren Konzentrationen wirksame Tetracyclin eingesetzt, da es schneller seine Wirkung verliert. Repression der konstant induzierten Zellpopulation am Tag 5 nach Infektion zeigte eine starke Abnahme der Luziferase- 73 2. Ergebnisse Expression bis Tag 7von 2,1x109 rlu auf 3,2x105 rlu. Dieser Wert war niedriger als der Kontrollwert des konstant reprimierten Zellpools am Tag 7 (1,1x106). Der daraus resulierende Regulationsfaktor lag mit 1300 noch über drei Größenordnungen. Durch Entfernen von Tet wurde die Luziferase-Expression des reprimierten Zellpools wieder induziert. Am Tag 13 ließen sich wieder 9,4x105 rlu detektieren. Der Vergleich mit der am Tag 13 erreichten Expression des konstant induzierten Zellpools (1,1x106 rlu) zeigte übereinstimmende Daten. Der Wechsel zwischen induzierter und reprimierter Expression konnte ebenfalls sehr effektiv für die bis Tag 5 konstant reprimierte Kultur gezeigt werden. Die Expressionslevel, die nach jedem Statuswechsel erreicht werden, sind denen der konstant induzierten oder reprimierten Zellpopulationen nahezu gleich. Insgesamt ist die Induktion ein langwierigerer Prozess als die Repression (vier Tage bis zur vollen Induktion im Gegensatz zu nur zwei Tagen bis zur vollständigen Repression), ausgelöst vermutlich durch restliches intrazelluläres Tet, dass in hohem Überschuss (2000x; siehe Abb. 2.17.; 1 ng/ml reicht zur vollständigen Repression) zur Repression auf die Zellen gegeben wird (2 g/ml). Die Daten zeigen mit Regulationsfaktoren von über 1000 eine sehr hohe Regulationskapazität zu jedem Zeitpunkt nach Infektion. Jedoch ist der reprimierte Expressionslevel mit 2,2x106 rlu fünf Tage nach Infektion im Vergleich zur detektierten GFP-Expression relativ hoch. Die in NIH3T3- und A549-Zellen gemessene stringente Regulation konnte ebenso in den permissiven, die adenovirale Replikation unterstützenden, 293-Zellen nachgewiesen werden. Obwohl diese Zellen durch die virale Replikation sehr hohe adenovirale Kopienzahlen besitzen, bleibt die detektierbare GFP-Expression, selbst kurz vor der Lyse auf den induzierten Status der Zellen beschränkt (Abb. 2.26.). Unter reprimierenden Bedingungen kann auch in 293-Zellen die Expression von GFP nach Ad-LTR-THTG Infektion nicht detektiert werden. Diese Daten zeigen zusammenfassend, dass die detektierbare GFP-Expression im reprimierten Zustand, selbst bei hoher Kopienzahl, gering bleibt und dass die Regulationskapazität der integrierten autoregulierten Kassette weitgehend unabhängig ist von der episomalen Kopienzahl. 2.9.3. Verbesserte Regulation im Adenovirus durch Flankieren der regulierbaren Kassette mit retroviralen Elementen Wie bereits im Kapitel 2.7.2. erwähnt, schien die Regulation der Kassette LTR-THTG durch die Flankierung mit retroviralen LTRs weniger beeinflussbar durch umgebenden endogenen 74 2. Ergebnisse Sequenzen als die LTR-freie Kassette pTHTG. Untersucht werden sollte, ob die retroviralen LTRs die Expression der regulierbaren Kassette ebenfalls vor Einflüssen des episomalen adenoviralen Genoms abschirmen, ob also die LTRs die Regulation der Kassette in den adenoviralen Vektoren verbessern. Dazu wurden konfluente 293-Zellen zum Vergleich mit AdLTR-THTG, als auch mit Ad-THTG unter reprimierenden und induzierenden Bedingungen infiziert. Die beiden Vektoren unterscheiden sich nur durch die Flankierung der Kassette in AdLTR-THTG mit retroviralen LTRs. Zu einem Zeitpunkt, an dem die Virus-Replikation zu einem klaren zytopathischen Effekt führte und die Zellen zu lysieren begannen, wurde die GFPExpression der Infektanten beider Viren im reprimierten und induzierten Zustand in Form von Photos dokumentiert (Abb. 2.26.). Die Replikation der Viren ist durch die Kultivierung der Zellen in Dox-haltigem Medium nicht beeinflusst. Abb. 2 26. Vergleich der Regulationskapazität der freien und LTR-flankierten autoregulativen Kassetten Ad-THTG und Ad-LTR-THTG nach adenoviraler Infektion von 293-Zellen. Die Fotos zeigen starke GFP-Fluoreszenz für beide Virustypen im induzierten Status der Zellen. Obwohl die Expression für den Vektor Ad-THTG durch die Zugabe von Dox deutlich verringert ist, bleibt eine schwache GFP-Fluoreszenz detektierbar. Im Gegensatz dazu konnte die GFPExpression des Vektors Ad-LTR-THTG durch Dox vollkommen bis zum Background reduziert werden. Beide Virustypen wurden ebenfalls nach Infektion der nicht permissiven NIH3T3-Zellen miteinander verglichen (Abb. 2.27.). Auch hier wurden die Zellen mit beiden adenoviralen Vektoren unter reprimierenden und induzierenden Bedingungen infiziert. Vier Tage nach Infektion wurde die GFP-Expression im 75 2. Ergebnisse FACS analysiert. Obwohl für beide Vektoren die gleichen MOIs verwendet wurden, führte die Infektion der Ad-THTG-Viren zu einer nur geringen Anzahl an GFP-exprimierenden Zellen im Vergleich zum Vektor Ad-LTR-THTG (3,5 % gegenüber 38,5 %). Durch die Zugabe von Dox ließ sich der Hauptteil der GFP-exprimierenden Zellen nach Ad-LTR-THTG-Infektion auf den Basislevel der nicht transduzierten Kontrolle reprimieren (38,5 % gegenüber von 2,8 %). Die Anzahl der GFP-positiven Zellen nach Ad-THTG-Infektion konnte zwar prozentual auf den Basislevel reduziert werden (3,6 % gegenüber von 2,1 %), doch einige Ad-THTG infizierte Zellen exprimierten aber auch unter reprimierenden Bedingungen mit relativen Fluoreszenzen von mehr als 103. Zellen mit so hoher Basisexpression konnten bei Ad-LTR-THTG nicht detektiert werden. Diese Differenz zwischen der Expressions- und Regulationskapazität der beiden Vektoren wurde tendenziell auch in A549-Zellen beobachtet (Abb. 2.27.). Abb. 2.27. Gezeigt sind FACS-Profile der unter reprimierenden und induzierenden Bedingungen mit Ad-LTR-THTG und Ad-THTG infizierte NIH3T3- und A549-Zellpopulationen als Dot-Plot-Analysen. Der Anteil an GFP-positiven Zellen ist für jeden Plot angegeben. Als Kontrollen dienten jeweils NIH3T3- oder A549-Zellen transfiziert mit GFPdefizienten adenoviralen Vektoren. Das zeigt, dass die abschirmende und regulationsverbessernde Funktion der retroviralen LTRSequenzen auch im adenoviralen Vektorkontext und im episomalen Status erhalten bleibt und 76 2. Ergebnisse vergleichbar ist mit ihrem Einfluss nach retroviraler Infektion. 2.9.4. Bestimmung der Integrationsfrequenz von Adenoviren und chimären Retro/Adenoviren Normalerweise liegt die adenovirale DNA hauptsächlich episomal vor. Die Freqeunz von zufälligen und spontan auftretenden Integrationen ist mit etwa 1x10-5 Integrationen pro infizierter Zelle sehr gering (Harui et al., 1999). Zheng et al. (2000) zeigten jedoch erhöhte Integrationsfrequenzen durch die Insertion retroviraler LTRs in den adenoviralen Vektor (vgl. Kap. 3.7.). Dieser Effekt retroviraler Elemente auf die Integrationsfrequenz wurde mit den Vektoren AdLTR-THTG und Ad-THTG nach Infektion von NIH3T3-Zellen überprüft. Dazu wurden zunächst NIH3T3-Zellen mit beiden adenoviralen Vektoren infiziert. Da sich die Infektionseffizienz beider Vektoren unterscheiden kann, wurde durch die nach 3 Tagen durchgeführte Isolation GFP-positiver Zellen durch FACS die alleinige Kultivierung erfolgreich infizierter Zellen garantiert, und damit für beide Vektoren vergleichbare Ausgangsbedingungen geschaffen. Beide sortierten Infektionsgemische wurden ohne Selektionsdruck weiter kultiviert, um Zellen mit stabiler Integration keinen Selektionsvorteil zu bieten. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Infektion (zwei, drei und vier Wochen) wurden jeweils 1x105 der sortierten Zellen in Hygromycin-haltigem Medium ausgesät, die Anzahl der erhaltenen resistenten Klone bestimmt und in Bezug auf die ausgesäte Zellzahl die Integrationsfrequenz bestimmt. Der Versuch der Infektion und Sortierung mit anschließender Bestimmung der Integrationshäufigkeit wurde zwei mal wiederholt. Daraus ergab sich für Ad-THTG eine Integrationshäufigkeit von 1,5x10-5 bis 5,9x10-5. Das Flankieren der regulierbaren Kassette mit retroviralen Elementen führte zu einer um den Faktor 100 verbesserten Integrationshäufigkeit (1,4x10-3 bis 6,3x10-3). Durch Southern Blot Analysen von 22 stabil exprimierenden Zellklonen konnte stabile Integration nachgewiesen werden. 18 der 22 Zellklone zeigten unterschiedliche Integrationsorte für Ad-LTRTHTG (Daten nicht gezeigt). Damit konnte eine erhöhte Integrationshäufigkeit von LTR-flankierten Kassetten bestätigt werden. Der retro/adenovirale chimäre Vektor Ad-LTR-THTG zeigte im Vergleich zum rein adenoviralen Vektor Ad-THTG eine etwa 100 fach verbesserte Integrationsfrequenz. Die absolute Frequenz ist jedoch 10-100 fach niedriger als von Zheng et al. (2000) beschrieben. Auf mögliche 77 2. Ergebnisse Ursachen hierfür wird in der Diskussion eingegangen. 2.9.5. Regulationskapazität nach stabiler Integration von Ad-LTR-THTG und Ad-THTG Der Integrationsmechanismus, der die Integration der chimären Vektoren ermöglicht, ist noch nicht geklärt. Gezeigt ist jedoch, dass die Integration zwar nicht Integrase vermittelt abläuft, jedoch innerhalb der retroviralen LTRs erfolgt. Dies bedeutet, dass die Integrate Teile des LTRs enthalten (Zheng et al., 2000). Es stellt sich daher die Frage, wie gut die Expressions- und Regulationskapazität nach stabiler Integration der Vektoren Ad-THTG und Ad-LTR-THTG ist. Die für beide Vektoren im Kapitel 2.9.4. durch Hygromycin-Selektion isolierten Einzelklone zweier unabhängiger Versuchsdurchführungen wurden jeweils gepoolt und weiter unter Selektionsdruck kultiviert. Acht Wochen nach Infektion wurde die GFP-Expression dieser vier Zellgemische in Abhängigkeit von Dox im FACS vermessen (Abb. 2.28.A). Abb. 2.28. Histogramm-Darstellung der GFP-Expressionen nach Integration A: Vergleich der Regulationskapazität von je zwei Populationen von Zellen mit stabiler Integration von Ad-LTR-THTG und Ad-THTG. Gezeigt sind Histogramm-Überlagerungen der induzierten Expression (dicke Linie), der reprimierten Expression (dünne Linie) und der nicht transduzierten Kontrolle (gepunktete Linie). B: Regulationsschema eines stabil exprimierenden Zellgemisches nach retroviraler Infektion mit LTR-THTG. Regulationsmuster ist übereinstimmend mit erreichter Regulation nach stabiler Integration des retro/adenoviralen Vektors Ad-LTR-THTG. 78 2. Ergebnisse Nach stabiler Integration von LTR-freiem Ad-THTG erhält man im induzierten Status in beiden untersuchten Zellpopulationen GFP-Expression bis zu 103 relativen Fluoreszenzen. Die Expressionshöhen der beiden Zellgemische differieren jedoch voneinander. Die Repression in Anwesenheit von Dox ist in Zellgemisch 1 nur unvollständig, in Zellgemisch 2 fast gar nicht vorhanden. Im Gegensatz dazu steht die Regulationskapazität nach Integration des chimären Vektors Ad-LTR-THTG. In Abwesenheit von Dox zeigten beide Populationen sehr übereinstimmende Expressionshöhen (zwischen 101 und 102 relativer Fluoreszenz), in Anwesenheit von Dox konnte in beiden unabhängigen Populationen die Expression vollkommen auf den Basislevel der Kontrolle abgeschaltet werden. Erstaunlicherweise sind die gemessenen Regulationskapazitäten nach adenoviraler Integration der LTR-flankierten Kassette absolut mit den Expressionsdaten der Kassette nach retroviraler Infekton vergleichbar (Abb. 2.28.B). Auch hier scheint die Regulation unabhängig von der chromosomalen Umgebung zu sein, wogegen bei adenoviraler Integration der LTR-freien Kassette erneut der Einfluß der umgebenden Sequenzen auf die Regulation der Kassette deutlich wird. Damit zeigte der retro/adenovirale Vektor nach Infektion neben der hohen Expression und der stringenten Regulation in Abhängigkeit von Dox ebenfalls um den Faktor 100 erhöhte Integrationsfähigkeiten. Darüber hinaus entsprach die Regulationskapazität nach adenoviraler Integration vollkommen dem stringenten Regulationsmuster der Kassette nach retroviraler Integration. Damit ist gezeigt, dass auch durch Verwendung von adeno/retroviralen chimären Vektoren stabile und regulierbare Expression in adenoviral infizierbaren Zellen erhalten werden kann. 79 3. Diskussion 3. Diskussion 3.1. Regulierte Expressionssysteme für gentherapeutische Anwendungen Bisher basieren gentherapeutische Strategien auf Vektoren, in denen das gewünschte therapeutische Gen konstitutiv aktiv ist. Jedoch gibt es viele gentherapeutische Ansätze, für die es erforderlich wäre, die Expressionsstärke direkt kontrollieren bzw. einstellen zu können und gegebenenfalls anzupassen. Auch ist für die Erprobung einer Therapie im Tiermodell eine modulierte Expression in vielen Fällen wünschenswert. Viele der bisher in Zellkultur und in transgenen Tieren verwendeten regulierbaren Expressionssysteme basieren auf zwei Komponenten: einem Gen, das für einen Transaktivator kodiert, und dem interessierenden Gen unter der Kontrolle des zum Transaktivator gehörenden Promotors. Zum Erhalt einer regulierten Expression müssen daraus resultierend zwei Komponenten in die Zielzellen transferiert werden. In vielen Ansätzen wurden beide Komponenten unabhängig voneinander in die Zielzellen eingebracht (Bohl et al.1997; Rossi et al.1998; Pitzer et al., 1999). Obwohl in diesem Zwei-Schritt-System gute Regulationseigenschaften des gewünschten Gens gezeigt werden konnten, sind doch immer doppelte Transduktionen der Zielzellen notwendig. Diese Vorgehensweise ist allerdings wegen der relativ niedrigen Transduktionseffizienz vieler Zielzellen für gentherapeutische Ansätze häufig nicht praktikabel. Daher ist die Verwendung von Single-Step-Transduktionssystemen, d. h. die Insertion beider Komponenten innerhalb eines Vektors, Voraussetzung für die gentherapeutische Anwendung. Dabei wird der Transaktivator häufig unter die Kontrolle eines zusätzlichen konstitutiv aktiven Promotors gestellt (Hoshimaru et al., 1996; Paulus et al., 1996; Pitzer et al., 1999; Hwang et al., 1996). Der Nachteil dieser Anordnung liegt in der konstitutiven Expression des Transaktivators und dem daraus resultierenden Problem des toxischen “Squelchings” (vgl. Kap. 2.2.). In dieser Arbeit wurden verschiedene Single-Step-Transduktionskassetten auf Basis des tet-offSystems entwickelt. Sie bestehen aus dem Transaktivator (tTA) und dem tTA-abhängigen Promotor, unter dessen Kontrolle das zu regulierende Gen steht. Der Transaktivator ist autoregulativ angeordnet. Diese Anordnung erlaubt es, die Transkription gemeinsam mit dem interessierenden Gen auf die Phase der Expressionsinduktion zu beschränken und den Effekt des Squelchings zu reduzieren. Das Expressions- und Regulationspotential der autoregulatorischen 80 3. Diskussion Kassetten wurde nach gentherapeutisch relevanten Transfermethoden, wie der Elektrotransformation und der retroviralen und adenoviralen Infektion, ermittelt und bewertet. 3.1.1. Beschreibung der autoregulativen Single-Step-Transduktionsysteme A, B und C Es wurden drei Expressionskassetten etabliert (siehe Abb. 2.3.). Die autoregulierte Kassette des Systems A basiert auf dem unidirektionalen Promotor (Gossen und Bujard, 1992), wobei das Reporterfusionsprotein Luziferase-eGFP vom ersten Cistron, der Transaktivator (tTA) über ein IRES-Element vom zweiten Cistron exprimiert wird. Zur Selektion transduzierter Zellen dient das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des tTA-unabhängigen Histon4-Promotors. In den Systemen B und C wird die Expression über den bidirektionalen Promotor (Baron et al., 1995) aktiviert. Hierbei wird der Transaktivator monocistronisch von einer Seite des Promotors aktiviert. Im System B nimmt die zweite Seite eine bicistronische Expressionseinheit ein, bestehend aus dem Luziferase-Gen im ersten Cistron und dem Selektions/ReporterFusionsprotein GTN im zweiten Cistron. Im System C wird die Selektions/Reporterfusion HTG monocistronisch exprimiert. 3.1.2. Autoregulative Systeme und die Basalexpression im reprimierten Status Die Expressionskassetten (System A, B und C) basieren auf der autoregulativen Anordnung des Transaktivators. Alle Systeme erlauben neben der Expressionsregulation des interessierenden Gens auch die Kontrolle der Transaktivator-Konzentration in der Zelle. Bei der Bindung von Tetracyclin oder seinen Derivaten unterliegt der Transaktivator einer Konformationsänderung, die seine Bindung an den tTA-abhängigen Promotor und damit die weitere Transkription verhindert (Abb. 2.1.). Die Konzentration des Transaktivators wird gleichzeitig mit der Konzentration des Reporterproteins in der Zelle gesenkt. Die Expression beider Proteine bleibt daher auf die Zeit der Induktion beschränkt. Damit dieses System auch nach einer längeren Phase der Repression aktiviert werden kann, ist eine geringfügige Basisexpression des Transaktivators, durch eine geringe tTA-unabhängige Aktivität des Promotors in den Zellen Voraussetzung. Bei erneuter Aktivierung der Expression erfolgt die Induktion in Form einer positiven Rückkopplung. Die im reprimierten Status tTA-unabhängig exprimierten tTA-Proteine binden an den Promotor und aktivieren die eigene Transkription sowie die Transkription des 81 3. Diskussion Reporters. Damit kann bei autoregulativer Anordnung des Transaktivators kein chromosomaler Integrationsort genutzt werden, der bei Repression des tTA das komplette Abschalten der Expression ermöglicht (Hofmann et al., 1996; Shockett et al., 1995). So ist z. B. die Expressionsregulation extrem toxischer Proteine, wie des Diphteria Toxins in autoregulatorischen Systemen wahrscheinlich nicht möglich (Lee et al., 1998). Die Basisexpression autoregulatorischer Systeme ist abhängig vom Integrationsort und dem transduzierten Zelltyp. Die Anzahl der detektierten Moleküle im reprimierten Status variiert zusätzlich mit der Halbwertszeit des Proteins (Shockett et al., 1995; A-Mohammadi und Hawkins, 1998). In vielen Fällen ist die Basisexpression autoregulativer Systeme jedoch so gering, dass die Expression der Reporter-Proteine im reprimierten Zustand nicht detektiert werden kann. Dies gilt z. B. für die Expression von GFP (Fussenegger et al., 1997) oder für GM-CSF (A-Mohammadi und Hawkins, 1998). In der vorliegenden Arbeit konnte im reprimierten Status nach retroviraler Infektion der Vektoren LTR-THTG und SIN-THTG (Abb. 2.16.) sowie nach adenoviraler Infektion der Vektoren Ad-LTR-THTG und Ad-TLGTN (Abb. 2.23.) die Expression von GFP ebenfalls nicht detektiert werden. Das zeigt, dass die zu erwartende Basisexpression der autoregulativen Systeme für viele Fragestellungen und Anwendungen zu vernachlässigen ist. Wird allerdings ein hochsensitiver Assay verwendet, wie in dieser Arbeit der Nachweis der Luziferase, so lässt sich die Expression im reprimierten Status feststellen. 3.2. Bidirektionale Systeme sind in Expression und Regulation dem unidirektionalen System überlegen 3.2.1. Das unidirektionale System A zeigt nach Elektrotransformation niedrigere Luziferase-Expression als System B Nach Elektrotransformation zeigte die unidirektionale Kassette des Systems A im Vergleich zur bidirektionalen Kassette des Systems B (32 und 41 untersuchte Zellklone) insgesamt niedrigere Luziferase-Expression. Während 84 % der mit System A transformierten Zellklone (pLEGTA; Abb. 2.4.) weniger als 107 rlu/106 Zellen exprimierten, lag die Expression bei 80 % der mit System B transduzierten Zellklone um 1x108 rlu (pTLGTN; Abb. 2.10.). Eine mögliche Ursache dafür wird im Folgenden diskutiert. 82 3. Diskussion 3.2.1.1. Verminderte Expressionsleistung beruht möglicherweise auf einer limitierten Transaktivatorkonzentration Die niedrigere Expression des Systems A ist nicht allein zurückzuführen auf die abgeschwächte Expression aufgrund der Fusion mit eGFP. Der transiente Expressionsvergleich der konstitutiv exprimierten Proteine Luziferase-eGFP und Luziferase demonstrierte eine nur um den Faktor 2,5 abgeschwächte Expression der Luziferase im Fusionsprotein (Daten nicht gezeigt). Vermutlich ist die abgeschwächte Expression auf eine niedrige Transaktivatorkonzentration in den Zellen zurückzuführen, bedingt durch die Positionierung des tTA-Gens im zweiten Cistron. Dirks et al. (1993) zeigten eine gegenüber der Cap-abhängigen Translationseffizienz dreifach schwächere Cap-unabhängige Translation. Dieses Verhältnis ist jedoch nicht generell auf alle inserierten Gene übertragbar. Hennecke et al. (in Bearbeitung) demonstrierten eine klare Abhängigkeit der Translationseffizienz von der Kombination und der Orientierung der inserierten Gene sowie von den verwendeten IRES-Elementen. So konnten sie zeigen, dass die in dieser Arbeit verwendete Firefly Luziferase positioniert im ersten Cistron die Expression vieler Gene des zweiten Cistrons stark reduziert. Dieser Effekt ist auch in beiden untersuchten Vektoren zu erwarten. Beide besitzen die Luziferase im ersten Cistron. Jedoch nur im System A wird der Transaktivator IRES-vermittelt exprimiert. Die mögliche Translationsinhibition des tTAs verhindert eine effiziente Transaktivierung des Promotors und führt so zu einer verringerten Luziferase-Expression und somit auch zu geringen Regulationsfaktoren. Im System B ist ebenfalls die Firefly-Luziferase im ersten Cistron positioniert, jedoch wird in diesem Fall der Transaktivator unabhängig vom Luziferase-Gen ebenfalls vom ersten Cistron des bidirektionalen Promotors exprimiert. In zweiten Cistron hinter dem Luziferase-Gen befindet sich der Selektionsmarker GTN. Es ist anzunehmen, dass auch hier die Expression des zweiten Cistrons durch die Luziferase reduziert ist, jedoch wird nach der Elektroporation auf die von diesem Marker vermittelte Resistenz selektiert. Daher werden Zellklone mit unzureichender Expression nicht detektiert. 3.2.2. Bessere Regulationskapazität der Systeme B und C im Vergleich mit System A Nach Elektrotransformation des unidirektionalen Systems A wurden 32 G418-resistente Zellklone untersucht (Abb. 2.4.). Obwohl 25 der untersuchten Zellklone Luziferase 83 3. Diskussion exprimierten, ließ sich die Expression in nur sieben Zellklonen mit Faktoren von über zehn regulieren. Zehn Zellklone reagierten nicht auf die Zugabe von Doxycylin. Nach retroviraler Infektion und Sortierung der infizierten Zellen auf GFP-Expression ließ sich der Anteil an Zellklonen mit regulierter Genexpression zwar steigern (35 von 39 untersuchten Infektanten zeigten Expressionsregulation), jedoch blieb das Regulationspotential mit Faktoren hauptsächlich zwischen zwei und 20 gering. Ein anderes Bild zeigt sich nach Elektrotransformation der bidirektionalen Expressionskassetten (Systeme B und C). Nach Transduktion von System B konnte in 38 von 41 Zellklonen die Expression von Luziferase deutlich reguliert werden. Dabei überwogen Faktoren zwischen 100 und 500 (Abb. 2.10. und Tab. 2.4.). Auch für das Vektorsystem C zeigte sich in allen 30 untersuchten Zellklonen die Regulation der GFP-Expression zwischen ein bis zwei Zehnerpotenzen (Abb. 2.13.). Langzeitstudien bestätigten darüber hinaus die Stabilität von Expression und Regulation beider bidirektionaler Systeme über einen Zeitraum von 30 Passagen (Abb. 2.12. und Abb. 2.18.), wogegen für das System A in Zellklonen mit Regulationsfaktoren über 10 die Regulationkapazität innerhalb von 20 Passagen nahezu vollständig verloren ging. Damit ist die bidirektionale Anordnung (Systeme B und C) der unidirektionalen deutlich überlegen. Dieser Trend zeigte sich auch nach retroviraler Infektion. Während nach Infektion des Systems A, die Regulationsfaktoren trotz G418-Selektion und GFP-Positiv/Negativ-Sortierungen im FACS nur geringfügig verbessert werden konnten (bis Faktor 51; Kap. 2.4.4.), erhielt man nach Infektion des Systems B hautsächlich Zellklone mit vollständiger Expressionsregulation (Kap. 2.7.2.). Im Folgenden werden mögliche Ursachen für die verminderte Expressionsregulation des Systems A diskutiert. 3.2.2.1. Einfluss benachbarter Vektorsequenzen auf die Regulationskapazität Es wurde gezeigt, dass die Expression tet-regulierter Kassetten in eukaryontischen Zellen und im transgenen Tier stark beeinflusst wird durch die jeweiligen genomischen Integrationsorte (Gossen und Bujard, 1992; Shockett et al, 1995; Baron et al.,1995; Klucher et al., 1997; siehe dazu Kap. 3.5.). Der alleinige Einfluss chromosomaler Sequenzen kann jedoch die schlechten Regulationseigenschaften des Expressionssystems A nicht erklären. Für alle drei Vektorsysteme wurden statistisch relevante Anzahlen von Zellklonen mit stabiler Vektorintegration untersucht und nur im Fall des Systems A findet man sehr schlechte Expressionsregulation mit hoher 84 3. Diskussion Basis-Expression in allen Zellklonen (Abb. 2.4.). Die regulierte Genexpression kann sowohl durch die chromosomale Umgebung als auch durch benachbarte Vektorelemente beeinflusst werden. Die Insertion weiterer Promotor/EnhancerElemente in Nachbarschaft des tTA-abhängigen Promotors kann zur tTA-unabhängigen Aktivierung des tTA-Promotors führen. Aus diesem Grund empfehlen Yin et al. (1996) die Separierung konstitutiv exprimierter Gene wie z. B. der Transaktivator-Einheit vom zu regulierenden Gen. Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit vorgestellten Systemen B und C ist im System A direkt 3 der regulierbaren Kassette das Selektionsmarkergen neo unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven Histon4 -Promotor inseriert. Genau wie die chromosomale Elemente in der Nähe der Integrationsstellen können auch mitgebrachte Enhancer-Elemente, wie hier der Histon4-Promotor, direkt aktivierend auf den tTA-regulierten Promotor wirken. Es ist zu vermuten, dass die schlechte Reprimierbarkeit des Systems A zu einem Teil durch die im Histon-Promotor lokalisierten aktivierenden Elemente verursacht wird. Niedrige Regulationsfaktoren und relativ hohe Basisexpression sowie ein relativ hoher Anteil an nicht exprimierenden Zellen zeigten sich auch nach Transduktion anderer Single-Step-Systeme. O Brien et al. (1997) z. B. entwickelten ein Single-Step-System unter Verwendung von drei Promotoren. Zwei konstitutive Promotoren aktivierten die Expression eines Selektionsmarkers und des Transaktivators, der regulierbare Promotor aktivierte das interessierende Gen. Die erreichten Regulationsfaktoren lagen auch hier nur zwischen 12 und 85 und nur 10 bis 47 % der untersuchten Zellklone exprimierten das gewünschte Gen. Somit scheint notwendig, wie in den Systemen B und C gezeigt, zum Erhalt stringenter Regulation auf zusätzliche Promotoren weitgehend zu verzichten. 3.2.2.2. Einfluss der Anordnung des Transaktivatorgens auf die Expressionsregulation Die Transaktivierung eines Gens, und damit der gemessene Induktionsfaktor, ist auch abhängig von der Konzentration des Transaktivators in den Zellen (Yin et al., 1996). Wie bereits in Kap. 3.2.1.1. beschrieben, kann die IRES-vermittelte cap-unabhängige Translation des Transaktivators im System A zur geringeren Expression des Transaktivators im Vergleich zu den Systemen B und C führen. Daraus würde auch im induzierten Status eine geringe Konzentration des Transaktivators in den Zellen resultierenden, die möglicherweise die effiziente Transaktivierung der Luziferase-Expression verhindert und so zu niedrigen 85 3. Diskussion Regulationsfaktoren führt. 3.2.2.3. Einfluss der Vektorinstabilität auf die Regulationseigenschaften des Systems A Die nach retroviraler Infektion detektierte Vektorinstabilität ist als eine weitere Ursache für die reduzierte Expressionsregulation anzusehen. Southern Blot Analysen chromosomaler DNA der mit System A infizierten Zellklone deuten auf die Deletion des IRES-Elementes hin (Abb. 2.7.). Dies bedingt den Verlust der Transaktivator-Expression, so dass die Transaktivierung der Luziferase-Expression auch im induzierten Status nicht mehr möglich ist. Möglicherweise treten diese Deletionen bereits nach Elektrotransformation auf und verhindern so die effiziente Induktion der Reporterexpression. Jedoch kann das niedrige Regulationspotential nicht allein auf die Instabilität zurückgeführt werden. Die Doppelselektion G418-resistenter und GFPexprimierender Zellen führte zur Anreicherung von Zellklonen mit vollständiger Vektorintegration (Tab. 2.2.), jedoch blieben auch hier die Regulationsfaktoren hauptsächlich zwischen zwei und 20. Für die Systeme B und C konnten ebenfalls Rearrangements nach retroviraler Infektion aufgezeigt werden, die allerdings nach Elektotransformation (Abb. 2.10. und Abb. 2.13.) aufgrund der guten und stabilen Regulationseigenschaften der untersuchten Zellen (bis Faktor 1000) vermutlich keine Rolle spielen. Die Instabilitäten beschränken sich hier hautsächlich auf den retroviralen Transfer. 3.2.2.4. Zum Erhalt hoher und stabiler Regulationsfaktoren erweisen sich die bidirektionalen Systeme B und C geeignet Das Vektorsystem A ist zum Erhalt regulierter Genexpression nicht geeignet. Stabile Regulationsfaktoren über 20 konnten nur nach aufwendiger positiv/negativ-Sortierung infizierter Zellen mit Hilfe des FACS erlangt werden, und auch dann blieben die Faktoren mit Werten um 50 verhältnismäßig gering. Langzeitstabilität von Expression und Regulation konnte in keinem der analysierten Zellklone aufgezeigt werden. Die bidirektionalen Vektorsysteme B und C zeigen sich weitaus geeigneter zum Erhalt regulierter Expression mit hoher Regulations- und Expressionskapazität. Nach Elektrotransformation des Systems B lagen die haupsächlichen Regulationsfaktoren zwischen 86 3. Diskussion 100 und 500, in einzelnen Fällen noch darüber (bis 976). Langzeitkultivierungen bis zu 30 Passagen zeigten darüber hinaus hohe Stabilität der Expression im induzierten und reprimierten Status für den Haupteil der untersuchten Zellklone. Auch im adenoviralen Kontext konnte die Expression von GFP über zwei Größenordnungen durch die Zugabe von Dox vollständig abgeschaltet werden (Abb. 2.23.). Mit Hilfe des sensitiven Luziferase-Assays zeigten sich Regulationsfaktoren von bis zu 4000 (Abb. 2.25.). Auch das Vektorsystem C, in dem ein weiterer Reporter in monocistronischer und reverser Orientierung inseriert vorliegt, zeigte ähnlich gute Regulationen über ein bis zwei Zehnerpotenzen nach Elektrotransformation (Abb. 2.13.) und bis zu drei Größenordnungen nach adenoviraler Infektion (Abb 2.23.). Gründe für die verbesserte Expressions- und Regulationskapazität der bidirektionalen Kassetten liegen vermutlich in der Expression des Transaktivators vom ersten Cistron und in der Verwendung nur eines internen Promotors, wodurch Promotor-Interferenzen (Cullen et al., 1984; Adhya et al., 1982) und die tTA-unabhängige Aktivierung des tTA-Promotors reduziert werden. Auch die direkte Selektion auf die Expression des Resistenzmarkers innerhalb der regulierbaren Kassetten, im Gegensatz zur tet-unabhängigen Expression des Selektionsmarkers neo unter der Kontrolle des H4-Promotors im unidirektionalen System A kann zu Zellen mit verbesserter Expressions- und Regulationskapazität führen. Neben dem hohen und stabilen Expressions- und Regulationspotential bieten die bidirektionalen Expressionskassetten einen weiteren entscheidenden Vorteil. Durch die bidirektionale Promotoraktivität ist es möglich, mehrere Gene gleichzeitig über nur einen Promotor zu aktivieren. So ist es auf der Seite des Transaktivators möglich ein weiteres Gen IRES-vermittelt zu exprimieren. Auch die tricistronische Expression wurde bereits gezeigt (Fussenegger et al., 1997; Kröger, Dissertation). 3.3. Bidirektionale Kassetten B und C im Vergleich mit publizierten Systemen In der Literatur sind verschiedene alternative Single-Step Transduktionssysteme mit regulierbarer Genexpression beschrieben. Sie basieren zumeist auf der konstitutiven Expression des Transaktivators und eines Selektionsmarkers zusätzlich zur tTA-abhängigen Expressionseinheit des interessierenden Transgens (Schultze et al., 1996; O’Brien et al., 1997; A-Mohammadi et al., 1997). Die niedrige Regulationskapazität in vitro resultiert vermutlich aus der Verwendung von drei Promotor/Enhancer-Elementen in direkter Nachbarschaft auf einem 87 3. Diskussion Vektor. Diese Anordnung kann zur tTA-unabhängigen Aktivierung der regulierbaren Expressionseinheit führen. Promotor-Interferenzen können ebenfalls zu einer reduzierten Expression und Regulation führen (Cullen et al., 1984; Adhya et al., 1982). Auch in retroviralen Vektoren wurde der Transaktivator oft durch einen konstitutiven Promotor (LTR oder zusätzlicher Promotor) aktiviert (Hoshimaru et al., 1996; Paulus et al., 1996; Hwang et al., 1996). Die konstitutive Expression des tTAs kann jedoch zum Effekt des toxischen Squelchings führen (Sadowski et al., 1988; Triezenberg et al., 1988; Gill et al., 1988; Berger et al., 1990 und1992; Kelleher et al., 1990). Aus diesem Grund wurden autoregulative Expressionseinheiten konstruiert, die es ermöglichen, die Transaktivator- und die Reporterkonzentration simultan durch die Zugabe von tet zu regulieren (Strathdee et al., 1999; A-Mohammadi und Hawkins, 1998; Liang et al., 1996; Hofmann et al., 1996). Doch auch hier blieb die ermittelte Regulation mit Faktoren zwischen 20 und 100 eher gering. Abwechselnde im induzierten und reprimierten Zustand der Zellen durchgeführte Sortierungen im FACS führten zu einer homogen regulierbaren Zellpopulation mit Faktoren von 600 (Hofmann et al., 1996). Jedoch ist eine so aufwendige Selektion primärer Zellen in der Gentherapie in der Regel nicht anwendbar. Retrovirale Two-Step-Systeme, in denen die beiden Komponenten für die regulierte Expression auf zwei unabhängigen retroviralen Vektoren untergebracht sind, zeigten gute Regulationen (Bohl et al., 1997; Rossi et al., 1998; Pitzer et al., 1999). Hierfür ist allerdings die doppelte Infektion der gewünschten Zielzellen notwendig. Diese Vorgehensweise ist z. B. für die Infektion von hämatopoetischen Zellen sehr ineffizient. In jüngerer Zeit wurden auch Adenoviren für die Transduktion regulierbarer Expressionskassetten verwendet. Die meisten dieser Systeme basieren auf zwei oder mehr adenoviralen Vektoren, die entweder den konstitutiven Transaktivator exprimieren, bzw. die regulierbare Expressionseinheit tragen (Harding et al., 1997; Massie et al., 1998; Yoshida et al., 1997; Molin et al., 1998; Yoshida und Hamada, 1997). Dadurch werden jedoch wiederum mehrere Infektionsschritte notwendig. Es wurden ebenfalls einige adenovirale Single-StepTransduktionsvektoren entwickelt, in denen jedoch der Transaktivator konstitutiv exprimiert wird (Corti et al., 1999; Kojima et al.,1997; Rubinchik et al., 2000). Die Expressionsregulation dieser Systeme differiert. Während Corti et al. (1999 A und B) die komplette Regulation ihres Transgens in Folge vollständiger Repression der Expression in Anwesenheit von Dox aufzeigten, blieb bei Kojima et al. (1997) und Rubinchik et al. (2000) eine deutliche Basalexpression im reprimierten Zustand messbar. Die Unterschiede können im Design der 88 3. Diskussion Vektoren, aber auch in unterschiedlichen Sensitivitäten der Gen-Assays begründet sein. Das in dieser Arbeit vorgestellte autoregulative bidirektionale Expressionssystem bietet für mono- (System C) und bicistronische (System B) Expressionseinheiten Regulationsfaktoren bis über 3 Größenordnungen, sowohl für die Expression von Luziferase als auch für GFP. Durch die autoregulative Anordnung des Transaktivators bleibt die Expression und so auch der Effekt des “Squelchings” auf die Phase der Gen-Induktion beschränkt. Da alle Komponenten in eine Expressionseinheit inseriert wurden, ist sowohl für die Elektroporation, als auch für Retro-, Adeno- und chimäre Retro/Adenoviren (vgl. Kap. 3.7.) nur ein Transduktionsschritt zum Erhalt regulierter Transgen-Expression in den Zielzellen notwendig. Darüber hinaus bietet der verwendete bidirektionale Promotor die Möglichkeit über IRES-Elemente noch weitere Gene biund tricistronisch zeitgleich und reguliert zu exprimieren. Durch die Kombination der effizienten Transduktion nicht proliferierender Zellen durch den adenoviralen Anteil und die stabile Langzeitexpression des retroviralen Anteils stellt vor allem das chimäre System in Verbindung mit der Autoregulation und der gleichzeitigen Transduktion von vier oder mehr Genen eine große Verbesserung gegenüber bisher gezeigten Systemen dar. (siehe auch Kap. 3.7.: Integrierende Adenoviren: vielversprechender Vektortyp für die Gentherapie?) 3.4. Retroviraler Transfer der autoregulierten Kassetten Murine Leukemievirus (MLV)-basierende retrovirale Vektoren sind in der Gentherapie ein häufig genutztes DNA-Transfersystem (Robbins et al., 1998). Mit Titern von 106 bis 107 cfu/ml können Zellen sehr einfach und effizient transduziert werden. Ein weiterer Vorteil der Retroviren liegt in ihrer stabilen Expression. Baer et al. (2000) verglichen die Langzeitstabilität der Expression in Zellklonen mit Einzelkopie-Integrationen nach Elektrotransformation und retroviraler Infektion. Dabei zeigte sich die nach retroviraler Infektion erhaltene Expression ohne Selektionsdruck sehr stabil, wogegen die nach Elektrotransformation erhaltene Expression über einen kurzen Kultivierungszeitraum in vielen Klonen verloren ging. Retroviren scheinen bevorzugt in bestimmte chromosomale Bereiche zu integrieren (Shih et al., 1988; Katzman and Katz, 1999), die häufig transkriptionell aktiv sind (Scherdin et al., 1990). Doch scheinen sie auch in alle anderen Bereiche des Genoms zu integrieren (Withers-Ward et al., 1994). Weitere Studien zeigten, dass die Integrationsorte häufig in der Nähe von CpG-Inseln 89 3. Diskussion und DNaseI hypersensitiven Stellen liegen (Fincham and Wyke, 1991; Rohdewohld er al., 1987). Diese Chromatinstrukturen sind assoziiert mit transkriptionell aktiven Genen. Mielke et al. (1996) zeigten, das retrovirale Integrationsorte häufig in der Nachbarschaft von SARElementen (scaffold attached regions) liegen. Diese binden an die Nuclear-Matrix und erhöhen dadurch die transkriptionelle Aktivität von naheliegenden Promotoren (Klehr et al., 1991). Diese Integrationspräferenz könnte sich negativ auf das Regulationsverhalten der in die Retroviren integrierten Kassette auswirken, da nach Integration mit erhöhter Wahrscheinlichkeit in der näheren chromosomalen Umgebung aktivierende Sequenzen vorliegen, die Einfluss auf die Basisexpression der regulierbaren Kassette nehmen könnten. Diese Hypothese ließ sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit allerdings nicht überprüfen, da Vektorinstabilitäten den Transfer der vollständigen aller Expressionskassetten erschwerten. Für die für alle Vektoren nur sehr niedrigen Titer werden im Folgenden mögliche Ursachen diskutiert. 3.4.1. Niedrige Titer durch Vektorinstabilitäten und Rearrangements Gründe für Vektorinstabilitäten, Rearrangements und illegitime Rekombinationen bei retroviralem Gentransfer sind sehr vielfältig. Sie können z. B. abhängig sein vom chromosomalen Integrationsort des Vektors oder von der enzymatischen Ausstattung der transduzierten Zellen. Natürlich spielen vor allem spezifische Sequenzmotive wie Palindrome und Haarnadel-Strukturen (Weston-Hafer und Berg, 1991; d Alencon et al., 1994), Z-Strukturen der DNA durch alternierende GC- oder GT-Dinucleotide (Meuth et al., 1989; Ehrlich et al., 1993; Pinder et al., 1997) oder kurze direkte Sequenzwiederholungen (Chedin et al., 1994; Vilette et al., 1995) eine ausschlaggebende Rolle. Varela-Echavarria et al. (1993) und Parthasarathi et al. (1995) evaluierten die innerhalb eines Replikantionszykluses auftretenden Rearrangements von MoMLV-basierenden Vektoren. Dazu wurde die Frequenz der Inaktivierung des Tk-Gens untersucht. Ohne das Vorhandensein offensichtlicher Hot-SpotRegionen wie z. B. direkter Sequenzwiederholungen wurde eine Rekombinationsfrequenz von acht bis neun Prozent ermittelt. Zum überwiegenden Teil lagen größere Rearrangements vor, deren Entstehung dem Schritt der reversen Transkription zugeschrieben werden. Die Ursachenforschung der Deletionen erfordert die genaue Kenntnis der 3 und 5 Bruchkanten in einer großen Anzahl von verschiedenen Kontrollvektoren sowie die Bestimmung möglicher Konsensussequenzen, die aus verschiedenen Deletionen resultieren könnten. Eine genaue 90 3. Diskussion Analyse der Deletionen wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt, jedoch wird deutlich, dass in jedem der eingesetzten regulierbaren Vektoren ganz spezifische Sequenzabschnitte deletiert werden (System A: 1000bp bis 1600 bp, die die HindIIISchnittstelle zwischen Reporter und IRES-Element umfassen; System C: 1000 bp, die die StuISchnittstelle des PbitTA umfassen). Zu bedenken ist allerdings, dass nur die rekombinierten Vektoren detektiert werden, die auch weiterhin Resistenz gegen die spezifischen Antibiotika vermitteln können. Deletionen, die die Resistenzmarker der Vektoren betreffen, gehen nach Infektion und Selektion der Zellen verloren. 3.4.2. Splice-Signale im bidirektionalen Promotor und im Transaktivator führen möglicherweise zur Transduktion verkürzter RNAs Auffällig übereinstimmende Deletionen und niedrige retrovirale Titer entstehen auch immer d a n n , w e n n s i c h i n n e r h a l b d e r V e k t o r e n k r yp t i s c h e S p l i ce-S i gnal e od e r Polyadenylierungssequenzen befinden (McIvor, 1990). Im Falle von Splice-Signalen werden bei der Transkription der genomischen viralen RNA spezifische Sequenzen deletiert. Das Vorhandensein von Polyadenylierungssignalen führt zum Abbruch der Transkription der viralen RNA. Im letzteren Fall entsteht eine RNA, die keinen 3' LTR besitzt und nach Infektion nicht ins Genom der Zielzellen integrieren kann. Dadurch werden vermeintlich niedrige virale Titer detektiert. Leboulch et al. (1994) und Li et al. (1999) berichten über auffällige Vektorinstabilitäten und Rearrangements innerhalb retroviraler Vektoren, in die genomische DNA inseriert wurde. In diesem Fall wurden neben den codierenden Sequenzen auch nicht transkribierte Elemente inseriert. Die Instabilität basiert dann auf vorhandenen kryptischen Splice-Signalen, die zu spezifischen Vektordeletionen führen. Auch die retrovirale genomische wt-RNA besitzt Splice-Donor und Akzeptor (vgl. Kap. 1.2.1.). Der Splice-Akzeptor wird durch den Austausch der retroviralen Gene durch die rekombinanten Expressionskassetten entfernt. Der Splice-Donor der Psi-Region bleibt jedoch vorhanden. Interagieren Splice-Akzeptoren, die über rekombinante Sequenzen eingeführt wurden, mit dem retroviralen Splice-Donor, so werden Vektorsequenzen und Hauptteile der Psi-Region deletiert und die Verpackung dieser RNA in Virionen ist nicht mehr möglich. Die Folge ist wiederum ein niedriger viraler Titer. Normalerweise sollten Splice-Signale nicht mehr in den verwendeten cDNAs vorliegen, da diese Gene nur noch codierende Sequenzen und keine Introns mehr enthalten. Die zufällige 91 3. Diskussion Generierung von Splice-Signalen bei der Vektorkonstruktion sowie bei Insertion der Gene in reverser Orientierung kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Auch können normalerweise nicht transkribierte Sequenzabschnitte, wie z. B. Promotoren kryptische Splice-Signale enthalten (McIvor, 1990). Darüber hinaus berichteten Urlinger et al. (2000) über potentielle Splice-Donorund Akzeptor-Sequenzen innerhalb des Transaktivator-Gens. Das Vorhandensein von 5'- und 3'-Splice-Signalen sowie von Polyadenylierungssequenzen wurde für den Vektor LTR-THTG überprüft (siehe Kap. 2.8.1.1.). Dazu wurden die von Krainer und Maniatis, 1988 beschriebenen Konsensus-Sequenzen verwendet, in denen bis zu drei Mismatches akzeptiert wurden. Bei der im Southern-Blot detektierten Rekombination handelt es sich vermutlich um eine Deletion von etwa 1000 bp, die die StuI-Schnittstelle des bidirektionalen Promotors umfasst. Durch die Computer-Analyse wurde zwar eine potentielle Splice-Akzeptor-Stelle im bidirektionalen Promotor jenseits der StuI-Schnittstelle identifiziert, jedoch konnte keine DonorSequenz im ungefähren Abstand von 1000 bp aufgefunden werden. Auch wenn die mittels Sequenzanalyse detektierten Splice-Signale keine offensichtliche Erklärung für die auftretende Vektordeletion liefern, so ist die Anhäufung von kryptischen 3' Splice-Signalen innerhalb der tet-O-Sequenzen des regulierbaren Promotors sehr auffällig. Ihre Beteiligung an der Vektorinstabilität ist nicht auszuschließen. 3.4.3. Verbesserungen des retroviralen Titers sind nicht möglich Nach Infektion mit den Vektoren SIN-THTG und LTR-THTG des Systems C (Abb. 2.16.) konnte strikte Regulation der Reportergenexpression beobachtet werden. Jedoch wiesen beide Vektoren mit 50 cfu/ml für gentherapeutische Einsätze unbefriedigende Titer auf. Für eine effiziente Transduktion verschiedener Zielzellen müssen Titer von 105 bis 107 cfu/ml angestrebt werden. Neben den bereits erwähnten Vektor-Rearrangements können auch noch andere Faktoren für die geringe Virusproduktion verantwortlich sein. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der Ausbildung von Antisense-RNA zwischen Reporter- und viraler RNA, die Orientierung der integrierten Kassette, das “poly-A-Trapping” und die Auswirkung möglicher Sekundärstrukturen des symmetrischen bidirektionalen Promotors auf den viralen Titer untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass die Ausbildung von Antisense-RNA zwischen Reportergen- 92 3. Diskussion RNA und viraler RNA die Virusproduktion nicht beeinflusst. Im reprimierten Zustand, d. h. bei Reduktion der tTA-abhängigen Transkription konnte der Titer nicht erhöht werden. Daher ist eine spezielle Inhibierung der Verpackung aufgrund der Hybridisierung der genomischen RNA mit der tTA-abhängigen RNA auszuschließen (Kap. 2.8.2.). In Northern-Blots konnte gezeigt werden, dass Transkripte, die in reverser Orientierung zum 5' LTR verlaufen, nicht effizient in der R-Region des 5' LTRs terminieren und daher erst an krytischen poly-A-Signalen in der chromosomalen Umgebung polyadenyliert werden (Kap. 2.8.4.). Möglicherweise werden viele dieser so gebildeten Transkripte aufgrund ihrer Länge oder der Ausbildung von Sekundärstrukturen nicht effizient translatiert. Der Einbau von poly-A-Signalen, die nur Aktivität in Sense zum Reportergen aufwiesen und so die virale Transkription nicht beeinflussen konnten, führten jedoch nicht zur Titererhöhung. Erstaunlicherweise konnte allerdings die Expressionsstärke des Reporters HTG bei gleichbleibender Regulationskapazität leicht verbessert werden. Auch die Aufhebung der Symmetrie des bidirektionalen Promotors durch Austausch von einem der beiden CMV-Minimalpromotoren, gegen den TK-Minimalpromotor (Strathdee et al., 1999) brachte keine verbesserte Virusproduktion (Kap. 2.8.5.). Lediglich durch die Umorientierung der regulierbaren Kassette wurde eine geringfügige Titer-Erhöhung erreicht (Kap.2.8.3.). Das könnte darauf hin deuten, dass die Expression des Resistenzmarkers HTG durch die Hybridisierung mit der viralen in Antisense verlaufenden RNA in vielen Integrationsorten zu gering bleibt, um die notwendige Hygromycin-Resistenz zu vermitteln. Möglicherweise wurden nur Zellklone mit Integrationsorten detektiert, deren Expression zur Resistenz-Vermittlung ausreichend ist und deren Konzentration des in Sense zum 5' LTR initiierten TransaktivatorProteins noch tolerierbar ist. Diese sehr stringente Selektion könnte ein weiterer Grund für die in allen untersuchten Zellklonen sehr übereinstimmende Expressions- und Regulationskapazität sein. Gegen diese Hypothese spricht allerdings das mit LTR-THTG übereinstimmende Expressionsmuster nach Infektion mit SIN-THTG. Bei diesen Vektoren kommt es nicht, oder nur in sehr geringem Maße zur viralen Transkription, daher sollte die Hybridisierung der Antisense-RNA hier keinen Einfluss auf die Expressionsstärke nehmen. 93 3. Diskussion 3.5. Probleme des Positionseffekts (PEV) für die Gentherapie Für eine Gentherapie ist neben einer sehr hohen Transduktionseffizienz auch die stabile, langanhaltende und vorhersagbare Expression der transduzierten Gene in den jeweiligen Zielzellen von großer Bedeutung. Obwohl im Primaten-Model für die Infektion von hämatopoetischen Stammzellen Transduktionseffizienzen von 10% mit Hilfe von MLVbasierenden Retroviren routinemäßig erreicht werden (Bodine et al., 1993; van Beusechem und Valerio, 1996), ist der Erhalt einer gleichförmigen Expression in allen transduzierten Zellen bisher aufgrund unterschiedlicher Chromatinstrukturen der verschiedenen Integrationsorte problematisch. Da der Großteil des Säugetiergenoms zu Heterochromatin verpackt ist, integrieren Vektoren zumeist in transkriptionell inaktive Bereiche, in denen auch die Transkription des Transgens häufig abgeschaltet wird. An Retroviren ist gezeigt, dass zunächst die Methylierung, und darauffolgend die Deacetylierung zur transkriptionellen Inaktivierung führt (Laker et al., 1998). Dagegen kann die Integration von Transgenen in die Nähe endogener Enhancer/Promotor-Elemente die Transkriptionsleistung verstärken. Beide Effekte führen zu einer hohen Varianz in der Transgenexpression zwischen verschiedenen Zellklonen. Sie variiert zwischen dem kompletten Abschalten der Expression sofort nach Insertion oder während der Kultivierung bis hin zur stabilen Expression (Emery et al., 2000). Dieser Effekt wird als Positionseffekt-Varianz (PEV) oder kurz als Positionseffekt bezeichnet. 3.5.1. Bedeutung der PEV für die regulierte Genexpression Die positionsabhängige Variation der Expression ist für viele konstitutiv exprimierte Expressionseinheiten gezeigt worden (Zentilin et al., 2000; Robbins et al., 1997). In diesen Systemen zeigt sich die PEV allerdings nur in der unterschiedlichen Expressionsleistung der verwendeten Vektoren nach Integration. Werden wie in der vorliegenden Arbeit regulierbare Expressionskassetten verwendet, ergeben sich aus dem Positionseffekt zwei Komponenten deren Verhalten nicht vorhersagbar ist. Neben der absoluten Expressionsleistung im induzierten Zustand spielt vor allem die Stringenz der Regulation im reprimierten Zustand eine wichtige Rolle. Paulus et al. (2000) berichteten kürzlich über PEV-basierende Expressionsvarianz der tetregulierten Luziferase nach retroviraler Infektion. Es zeigten sich Expressionsunterschiede im reprimierten Status verschiedener Zellklone zwischen 3 und 4 Größenordnungen und die 94 3. Diskussion erreichten Regulationfaktoren variierten bis zu 90 fach. Diese hohe Varianz bringt natürlich große Probleme mit sich, denn für viele Gene ist die stringente Regulation absolut notwendig, z.B. bei Genen, die für Toxine codieren. Auch in der vorliegenden Arbeit zeigt sich der Einfluss der PEV auf die Regulation und Expression der drei vorgestellten Expressionssysteme. Nach Elektrotransformation zeigte sich eine hohe Varianz sowohl im induzierten Status, als auch im reprimierten Status der Expression. In einigen mit System C transduzierten Zellen ließ sich die GFP-Expression durch die Zugabe von Dox vollständig reprimieren (z. B. Klon h in Abb. 2.13.). In anderen Klonen blieb die Expression trotz Repression (+ Dox) deutlich über der ermittelten Basisexpression (z. B. Klon a, b, und j). Das Gleiche galt für die Expression der mit System B elektrotransformierten Zellen. Auch hier fanden sich große Unterschiede in den verschiedenen Zellklonen, wobei die Luziferaseexpression im induzierten Status bis zu vier Zehnerpotenzen, die reprimierte Expression bis zu sechs Zehnerpotenzen variierte (Abb. 2.10.). Wie bei Paulus et al. (2000) beschrieben hat auch hier die PEV größeren Einfluss auf die Effizienz der Repression. Dieser Effekt demonstriert, dass der transkriptionelle Einfluss des Integrationsorts in einer spezifischen Basisexpression resultiert, die aus der Durchlässigkeit des tTA-abhängigen Promotors resultiert und nicht aus der Restaktivität des an tet gebundenen Transaktivators. In Kap. 2.1. konnte bereits Luziferase-Expression detektiert werden (2x105 rlu/1x106 Zellen) ohne die Anwesenheit des Transaktivators in der Zelle. Hier wird der Einfluss aktivierender endogener Sequenzen, wie z.B. nahegelegene endogene Enhancer-Elemente, auf die integrierte Kassette demonstriert. 3.5.2. PEV wird durch das Flankieren mit cis-agierenden retroviralen Elementen stark reduziert Die für das System C nach Elektrotransformation gemessene positionsabhängige Varianz wurde unerwarteter Weise drastisch reduziert durch das Flankieren der Expressionskassette B mit retroviralen Elementen. Nach Insertion der regulierten Kassette in die retroviralen Vektoren (SIN- und MLV-basierend) und Infektion von NIH3T3-Zellen wurde in den Hygromycinselektierten Infektanten ein überraschend gleichförmiges Expressions- und Regulationsverhalten in Abhängigkeit von Dox detektiert. Alle untersuchten Zellklone und Zellpopulationen exprimierten GFP im induzierten Status mit einer relativen Fluoreszenz zwischen 101 und 102. Im reprimierten Status dagegen kam es nahezu in allen Zellklonen zum vollständigen 95 3. Diskussion Abschalten der Expression (Abb. 2.16.). Darüber hinaus zeigten beide Infektionsgemische (ILTR-THTGPool und I-SIN-THTGPool) sowie vier weitere analysierte Zellklone sehr übereinstimmende Dosis-abhängige Repressionen (Abb. 2.17.). Der Effekt der LTRs zeigt sich auch nach adenoviraler Infektion der nicht permissiven Zellinien NIH3T3 und A549 (Abb. 2.27.) sowie der permissiven humanen Zellinie 293 (Abb. 2.26.) mit den adenoviralen Vektoren Ad-LTR-THTG und Ad-THTG (System C). In der 293-Zelllinie wird aufgrund der Expression des im Vektor deletierten adenoviralen Gens E1 die Virusreplikation ermöglicht. Trotz der dadurch resultierenden sehr hohen viralen Kopienzahl in den kurz vor der Lyse stehenden Zellen lässt sich die GFP-Expression nach Ad-LTR-THTG Infektion durch Dox vollständig reprimieren. Im Gegensatz dazu ist eine deutliche Rest-Expression des Vektors Ad-THTG im reprimierten Zustand detektierbar. Offensichtlich aktivieren die adenoviralen Sequenzen ebenfalls die Expression der autoregulativen Kassette im reprimierten Zustand. Dieser Effekt scheint durch die LTRs reduziert zu werden. Im Folgenden wird versucht, die möglichen Ursachen hierfür zu diskutieren. 3.5.2.1. Die PEV-unabhängige Expression ist nicht auf den retroviralen Gentransfer zurückzuführen Southern-Blot Analysen bestätigten, dass es sich bei den untersuchten Infektanten mit PEVunabhängiger Expression tatsächlich um Zellklone mit unterschiedlichen Integrationsorten handelte (Daten nicht gezeigt). Katzman und Katz, (1999) und Shih et al. (1988) berichteten über die bevorzugte Integration von Retroviren in chromosomale Bereiche mit ähnlichen Sequenzen. Um zu klären, ob die übereinstimmende Expressionsregulation aus dem Infektionsprozess und der Integration in aktive chromosomale Sequenzen resultiert, wurde der retrovirale Vektor LTR-THTG ebenfalls per Elektrotransformation in die Zellen eingebracht und Hygromycin-resistente Zellklone auf ihr Regulationsverhalten im FACS untersucht. Doch auch nach Elektrotransformation zeigte sich das gleiche auffällig übereinstimmende Expressions- und Regulationspotential der elektrotransformierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Damit kann die selektive virusspezifische Integration in geeignete Orte als Ursache für die gleichförmige Expressionsregulation ausgeschlossen werden. Der positive Einfluss der retroviralen Elemente auf das Regulationspotential der flankierten Kassette wurde auch im episomalen Zustand nach adenoviraler Infektion deutlich (Abb. 2.26. 96 3. Diskussion und 2.27.). Im Vergleich mit dem Vektor Ad-THTG zeigte der chimäre retro/adenovirale Vektor Ad-LTR-THTG nach Infektion stringentere Regulationseigenschaften. Das deutet darauf hin, dass die retroviralen LTRs ebenfalls episomal die Expressionskassette von Einflüssen der adenoviralen Sequenzen abschirmen. 3.5.2.2. Die PEV-unabhängige Expression ist möglicherweise Ursache von PromotorInterferenzen Die homogene aber niedrige Expression im induzierten Status der mit LTR-THTG und SINTHTG (System B) infizierten Zellen (Abb. 2.16.) kann eventuell durch Promotor-Interferenzen erklärt werden. Dies ist ein Effekt, der sehr häufig beobachtet wird, wenn zwei oder mehrerer Promotoren/Enhancer-Elemente in direkter Nachbarschaft vorliegen. Cullen et al. (1984) entwickelten ein Modell um die beobachteten LTR- und internen Promotor-Interferenzen zu erklären. Sie zeigten, dass durch die Transkription der viralen mRNA vom 5' LTR die Aktivität des identisch aufgebauten 3' LTR inhibiert wird. Diese als transkriptionell überlappende Interferenz bezeichnete Inhibition wird durch das Entfernen des aufwärts gelegenen LTR wieder aufgehoben. In Prokaryonten wird das entsprechende Phänomen als Promotor-Occlusion bezeichnet (Adhya et al., 1982). Es ist nicht auszuschließen, dass die im Vergleich zu den Expressionswerten der LTR-freien Kassette (Abb. 2.13.) begrenzte Expression der LTRflankierten Kassette (Abb. 2.16) aus der beschriebenen überlappenden Interferenz des 5' LTR auf den internen tTA-abhängigen Promotor resultiert, mit der Konsequenz der niedrigen Reporterexpression. Zu bedenken ist, dass nach Infektion jedoch nur die Zellen detektiert werden können, deren Expression zum Erhalt der Hygromycin-Resistenz ausreichend ist. Dadurch wird möglicherweise ein sehr enger Selektionsrahmen errichtet. Nur Zellen, deren Expression gerade zur Resistenzvermittlung ausreicht, werden detektiert. Diese Erklärung ist nicht uneingeschränkt auf den verwendeten SIN-Vektor übertragbar. In diesem Vektortyp sind im proviralen Zustand 299 bp des 5' LTR deletiert. Diese Deletion umfasst den größten Teil der zwei 72bp Wiederholungen, die die Enhancer-Aktivität besitzen sowie einen Großteil der Promotor-Region (Yu et al., 1986). Dass die verbleibende LTR-Sequenz ebenfalls zur Interferenz führen kann, ist unwahrscheinlich. 97 3. Diskussion 3.5.2.3. Die PEV-unabhängige Expression resultiert möglicherweise aus der reversen Orientierung des Reporters Ein weiterer Grund für das homogene Expressionsmuster mit zwar verminderter Expression aber deutlich stringenterer Regulation liegt vermutlich in der reversen Orientierung des Reporters HTG im retroviralen Vektor. Die beste Repression durch Dox wurde in Zellklonen mit vollständigem LTR erhalten (Abb. 2.16). Möglicherweise hybridisiert die vom bidirektionalen Promotor transkribierte Reporter-RNA mit der dazu in reverser Orientierung laufenden retroviralen mRNA, und verhindert so die Translation. Im reprimierten Zustand werden die tTA-abhängigen Transkripte vollständig abgefangen. Im aktivierten Zustand wird mehr tTA-abhängige RNA als LTR-transkribierte RNA produziert. Somit könnte nur im induzierten Zustand translatierbare RNA zur Verfügung stehen. Das würde sowohl die reduzierte Expression als auch die gute Regulation erklären. Dieser Effekt zeigt sich im FACS durch das vollständige Abschalten der GFP-Expression mit Hilfe von Dox (Abb. 2.16.). Bei Verwendung des SIN-Vektors ist die retrovirale Transkription des 5' LTRs stark reduziert. Dies zeigt sich in einer leicht erhöhten Basisexpression im Vergleich zur nicht transduzierten Kontrolle, sowie in einer geringfügig höheren Expression im induzierten Zustand im Vergleich zur intakten LTR-Expression. Durch die Inaktivierung des LTRs ist hier das Abfangen von Reporter-RNA durch die virale genomische RNA weniger effizient. Dies legt nahe, dass durch die Insertion des interessierenden Gens in Antisense zu einem intakten retroviralen LTR die Regulationseigenschaften der Kassette deutlich verbessert werden. Unklar bleibt allerdings, ob die nach Infektion gemessene PEV-Unabhängigkeit allein der Antisense-Expression der Reporter zugesprochen werden kann. Gerade im Fall des Enhancerdeletierten SIN-Vektors scheint es unwahrscheinlich, dass die regulierte Expression von chromosomalen Sequenzen unbeeinflusst bleibt. 3.5.2.4. Das fehlende poly-A-Signal des revers orientierten Reporters reduziert die Expressionsleistung Im Rahmen der Untersuchungen zur Verbesserung des retroviralen Titers zeigte sich, dass durch die Insertion von Poly-A-Signalen zur korrekten Polyadenylierung des Reporters HTG zwar nicht der retrovirale Titer erhöht werden konnte, jedoch die detektierte GFP-Expression in den 98 3. Diskussion infizierten Zellklonen anstieg. Daraus kann geschlossen werden, dass die inkorrekte Polyadenylierung an poly-A-Signalen in der chromosomalen Umgebung möglicherweise die Translationseffizienz herabsetzt und in einer verringerten GFP-Expression resultiert. Jedoch sollten in verschiedenen Zellklonen mit unterschiedlichen Integrationsorten auch differierende endogene poly-A-Signale verwendet werden, die je nach ihrer Lage unterschiedlichen Einfluss auf die Expressionseffizienz haben. 3.5.2.5. LTRs besitzen vermutlich keine Insulator-Funktion In jüngerer Zeit wurden DNA–Elemente entdeckt, die das Genom in diskrete chromosomale Domänen unterteilen. Diese DNA-Sequenzen werden als Insulatoren bezeichnet. Sie wurden zuerst in Drosophila beschrieben, später aber auch in verschiedenen Vertebraten-Spezies gefunden (Bell und Felsenfeld, 1999). Insulator–Sequenzen definieren die Grenzen zwischen unterschiedlich regulierten Loci und schützen Promotoren vor dem Einfluss benachbarter regulatorischer Elemente (Prioleau et al.,1999). Werden sie zwischen Enhancer und Promotor lokalisiert, so blockieren sie die Promotor-Enhancer-Interaktion. Insulator-Sequenzen besitzen keine transkriptionell stimulatorischen oder inhibitorischen Fähigkeiten, wodurch sie sich klar von klassischen Enhancern oder Silencern unterscheiden (Emery et al., 2000). Eine häufig beschriebene Eigenschaft verschiedener Insulator-Elemente ist ihre Fähigkeit, transfizierte Reportergene von chromosomalen Positionseffekten zu entkoppeln. Pikaart et al. (1998) demonstrierten die Entkopplung von Reportergenen von der PEV durch die Verwendung des ßGlobin-Insulators. In diesen Experimenten wurde ein Zelloberflächen-Markers als Reporter verwendet. Ohne Insulator variierte die Expression in den unterschiedlichen Zellklonen dramatisch. Im Gegensatz dazu resultierte das Flankieren des Konstruktes mit den InsulatorSequenzen des ß-Globin-Locus vom Huhn (chicken HS4-Insulator) in einem weitgehend uniformen Expressionslevel. Auch Emery et al. (2000) und Rivella et al. (2000) nutzten den 1,2 kb cHS4-Insulator und plazierten ihn in die LTRs MLV-basierender rekombinanter Retroviren. Es zeigte sich, dass das cHS4-Element die Wahrscheinlichkeit der Expression des integrierten Proviruses stark erhöht, sowie den Level der Virusinaktivierung durch de novo-Methylierung des 5'LTRs minimiert (Rivella et al., 2000). Zusätzlich konnte ein Schutz der LTR-vermittelten Reporter-Expression gegen Positionseffekte gezeigt werden (Emery et al., 2000). Auch in der vorliegenden Arbeit könnte aufgrund der positionsunabhängigen Expression des 99 3. Diskussion Reporters nach retroviraler Infektion mit den Vektoren SIN-THTG und LTR-THTG (System C) Insulator ähnliche Wirkung der flankierenden LTRs angenommen werden. Allerdings wurde bisher für retrovirale Elemente keine solche Funktion gezeigt. Vielmehr unterliegt auch die LTR-vermittelte Expression positionsbedingten Schwankungen (Verma und Somia, 1997). Retrovirale Vektoren mit internem Promotor haben zwar häufig das Problem der Promotorinteraktion, die Positionseffekte überlagern (Verhoeyen el al., in Bearbeitung), doch auch hier gibt es keine Hinweise auf die abschirmende Wirkung der LTRs. Die computergesteuerte Suche nach Insulator-ähnlichen Sequenzen ist nicht möglich, da bisher keine Konsensus-Motive identifiziert wurden. Scaffold-attachment regions (SARs/MARs) werden ebenfalls als strukturelle und funktionelle Grenzelemente angesehen, die verschiedene transkriptionell aktive Bereiche voneinander trennen. Einige SAR-Elemente scheinen ebenfalls Insulator-Funktionen aufzuweisen, da sie Gene vor positionsbedingter Varianz schützen (z.B. SAR des Apolipoprotein B-Gens; Namciu et al., 1998). Andersherum wurde z. B. für den in Drosophila vorkommenden Insulator gypsy SAR/MAR-Charakter nachgewiesen. Die in dieser Arbeit verwendeten cis-aktiven retroviralen Elemente wurden per Computer (Programm MARfinder, Singh et al., 1997) auf SAR/MAREigenschaften untersucht (AT-Reichtum, TG-Reichtum, Konsensus für origin of replikation, Homeobox-Protein-Konsensus-Sequenzen (ATTTA, ATTTTA oder ATTTTTTA), ATCSequenzen, SAR unwinding motif Konsensus). Danach besitzen die retroviralen LTRs keine SAR/MAR-Eigenschaften. 3.6. Design von positionsunabhängigen, autoregulierten Expressionskassetten Das Flankieren der regulierbaren Expressionskassetten mit Insulatorsequenzen stellt eine attraktive Möglichkeit dar, nach verschiedenen Transduktionsverfahren homogene Expressionen zu erhalten. Die Wirkung der Insulator-Sequenzen ist bisher nur für die konstitutive Expression von Reportergenen gezeigt (Rivella et al., 2000; Emery et al., 2000). Interessant ist darüber hinaus aber auch ihre mögliche Wirkung auf die regulierte Expression. Es stellt sich die Frage, ob flankierende Insulatorfragmente die vollständige Repression des tTA-abhängigen Promotors unabhängig vom Integrationsort, aufgrund der fehlenden Basisaktivierung des regulierbaren Promotors durch die chromosomale Umgebung, 100 3. Diskussion ermöglichen. Weiterhin ist zu klären, ob die erreichten Induktionswerte homogen sind, da allein die Stärke des Promotors die Expressionshöhe bestimmt. Möglicherweise lassen sich durch Insulatorsequenzen Expressionskassetten mit vorhersagbarer Expression und Regulation konstruieren. Um die Wirkung verschiedener Insulator-Elemente, aber auch die der LTRs miteinander vergleichen zu können, wäre es sinnvoll, identische Expressionskassetten mit verschiedenen abschirmenden Elementen in identischer chromosomaler Umgebung zu beurteilen. Hierzu bieten sich Sequenz-spezifische Rekombinationssysteme wie das Cre/loxPSystem (Hoess und Abremski, 1985) oder das FLP/FRT-System (Volkert et al., 1989) an. Durch Verwendung z.B. einer Wt- und einer veränderten zweiten FRT-Sequenz ist es möglich Expressionskassetten sequenzspezifisch gegeneinander in den zuvor charakterisierten Genorten auszutauschen (vgl. Kap.3.8.3. und Abb. 3.2.). Dadurch kann die Wirkung verschiedener Elemente auf die PEV-unabhängige Expression und Regulation in identischen Genorten evaluiert werden. 3.7. Integrierende Adenoviren: vielversprechender Vektortyp für die Gentherapie? In der Klinik spielen neben den MLV-basierenden retroviralen Vektoren auch adenovirale Vektoren eine große Rolle. Sie besitzen gegenüber Retroviren viele Vorteile. So können sie sowohl sich teilende als auch ruhende Zellen infizieren. Sie haben ein breites Wirtsspektrum und sind einfach in hohen Konzentrationen zu produzieren (109-1011 cfu/ml) (Verma und Somia, 1997; Corti et al., 1999). Jedoch sind anders als bei Retroviren Integrationen der episomal vorliegenden Adenoviren nur zufällig und ereignen sich mit geringer Frequenz (Harui et al., 1999). Die episomal vorliegenden adenoviralen Vektorkopien gehen im Laufe der Proliferation der transduzierten Zellen verloren und mit ihnen die Expression des Transgens (Bilbao et al.,1997; Mittal et al., 1993; Hitt et al., 1995). Dieser Effekt wird auch nach Infektion von NIH3T3-Zellen mit dem Vektor Ad-TLGTN (System B) deutlich (Abb. 2.24 und 2.25). Innerhalb von 13 Tagen geht die anfängliche in 40 % der Zellen gemessene GFP-Expression vollständig zurück. Auch die Luziferase-Expression sinkt innerhalb des gemessenen Zeitraums um den Faktor 1000. Die Kombination der positiven adenoviralen Eigenschaften des hohen Titers und des breiten Wirtsspektrums mit der stabilen Langzeitexpression der Retroviren würde für die gentherapeutische Anwendung einen großen Fortschritt bedeuten. In den letzten Jahren wurden von verschiedenen Forschergruppen erstmalig retro/adenovirale 101 3. Diskussion chimäre Vektoren konstruiert (Feng et al., 1997; Caplen et al., 1999). Das Ziel war hier die adenovirale (in vivo) Transduktion retroviraler Helfergene und rekombinanter retroviraler Vektoren zur in vivo Produktion retroviraler Viruspartikel. Die Durchführbarkeit dieses Ansatzes wurde durch die provirale Integration von Retroviren im Maus-Tumor-Modell aufgezeigt. Der Nachteil dieser Ansätze liegt darin, dass die Zielzellen mit mindestens zwei verschiedenen Adenoviren infiziert werden müssen, um die Produktion von Retroviren in vivo zu ermöglichen (Abb. 3.1). Darüber hinaus ist die Zellteilung immer noch notwendig für die Integration der in vivo gebildeten Retroviren. Abb. 3.1. Stabiler Gentransfer über chimäre adenovirale/retrovirale Vektoren. Die Zielzellen werden über Infektion mit rekombinanten Adenoviren, die für retrovirale Proteine (Gag/Pol und Env) sowie für den retroviralen Vektor codieren, zu transienten retroviralen Produzentenzellen. Die Retroviren werden so direkt im Zielgewebe freigesetzt und können die benachbarten Zellen infizieren. ITR: inverted terminal repeat; LTR: long terminal repeat. Aufgrund der Hypothese, dass MoMLV 5' und 3' LTRs die Integrationsfrequenz des adenoviralen Vektors erhöhen könnten, untersuchten Zheng et al. (2000) erstmalig die 102 3. Diskussion Integrationshäufigkeit der chimären Vektoren. Erstaunlicherweise wurde in bis zu 15 % der infizierten Zellen die Integration des Vektors detektiert. Genauere Analysen zeigten, dass die Integration zwar über die Sequenz des 5' LTRs erfolgt, jedoch unabhängig von der Integrationssequenz AATG nahe des 5' Endes des LTRs, sowie vom Enzym Integrase abläuft. Der Prozess wird als atypisch bezeichnet und sein genauer Ablauf ist bisher unbekannt. Die von Zheng et al. detektierte erhöhte Integrationsfrequenz gegenüber der rein adenoviralen Integration konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, wobei hier die Integration allerdings nur in 1 % der infizierten Zellen ermittelt wurde. Das entspricht jedoch einer um den Faktor 100 verbesserten Integration des chimären retro/adenoviralen Vektors Ad-LTR-THTG gegenüber der LTR-freien Kontrolle Ad-THTG. Somit können die Ergebnisse von Zheng et al. im Prinzip bestätigt werden. Mögliche Gründe für die in diesem System geringere Integrationshäufigkeit werden in Kapitel 3.7.1. aufgezeigt. 3.7.1. Regulationskapazität nach adenoviraler Integration spiegelt Regulation nach retroviraler Infektion wider Da die genaue molekulare Ursache für die erhöhte Integrationsfrequenz der chimären Vektoren sowie der Mechanismus noch nicht bekannt ist, war das Regulationsverhalten der integrierten adenoviralen Vektoren von großem Interesse. Überraschenderweise stimmte das Regulationsverhalten der integrierten LTR-flankierten Expressionskassette nach adenoviraler Transduktion mit der Regulationskapazität nach retroviraler Infektion vollständig überein (Abb. 2.28.). Auch hier, wie nach retroviraler Infektion, scheint die Expression unabhängig vom Integrationsort zu erfolgen. Dagegen zeigt sich nach Integration der adenoviral transduzierten LTR-freien Kassette in Ad-THTG die Expression stark beeinflusst vom Integrationsort, genau wie bereits nach Elektroporation der LTR-freien Kassette pTHTG beobachtet werden konnte (Abb. 2.13.). Zu bedenken ist allerdings, dass der genaue Integrationsmechanismus nicht bekannt ist. In den chimären Vektoren erfolgt er offensichtlich über die LTR-Sequenzen. Es ist jedoch nicht bekannt wie die LTR-freie Kassette integriert. Die fehlende Regulation kann möglicherweise auch auf die unvollständige Integration des Vektors (z. B. auf den Verlust des tTAs) hindeuten. Die Vollständigkeit der über adenoviralen Transfer integrierten Kassette wurde nicht kontrolliert. 103 3. Diskussion 3.7.2. Effizienz der Integration der chimären Vektoren im Vergleich mit der retroviralen Infektion In der vorliegenden Arbeit wurden Integrationen der chimären Vektoren in 1 % der infizierten Zellen detektiert. Zheng et al. (2000) berichten sogar über eine Integrationshäufigkeit von 15 %. Diese Differenz erklärt sich vermutlich aus der Nutzung unterschiedlicher Reporterzellen sowie aus differierenden Assays zum Nachweis der Integration. So wird in der Publikation die Häufigkeit des Verlustes von Teilen des 5' LTRs in den infizierten Zellklonen über PCR bestimmt und mit der Integrationshäufigkeit gleich gesetzt. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass bei dieser Analyse ebenfalls rearrangierte episomale chimäre Vektoren detektiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die infizierten Zellen nach FACS-Sortierung über 8 Wochen selektionsfrei kultiviert und anschließend mit Hilfe von Hygromycin selektiert, so dass nur Zellen mit stabiler Vektorintegration detektiert wurden. Die Anzahl der Zellen mit stabiler Vektorintegration wurde im Vergleich zur ausgesäten Zellzahl kalkuliert. Über diesen Weg ergab sich eine Integrationshäufigkeit von 1 %. Im Vergleich mit hochtitrigen Retroviren ist die über die chimären Vektoren erhaltenen Integrationshäufigkeit jedoch gering. Über die retrovirale Infektion können abhängig vom Zelltyp und der Proliferationshäufigkeit bis zu 95 % der Zellen stabil transduziert werden (Movassagh et al., 2000). Damit stellen die Retroviren immer noch das effizienteste Transfervehikel zum Erhalt stabil exprimierender Zellen dar. Es ist allerdings denkbar, dass durch die genauere Untersuchung des Integrationsmechanismus der chimären Vektoren effiziente Optimierungen durchgeführt werden können. Es bleibt weiterhin zu untersuchen, ob die adenovirale Transduktion von retroviralen Expressionskassetten vergleichbare oder sogar bessere stabile Transduktionen insbesondere von Zellen zulassen, die sich mit der klassischen retroviralen Infektion nur schwer transduzieren lassen. In diesem Fall könnten die kombinierten Vektoren mit ihren positiven retro- und adenoviralen Eigenschaften in der Zukunft große Bedeutung erlangen. Es darf an dieser Stelle allerdings nicht vergessen werden, dass trotz der Kombination beider Virustypen, die die stabile Integration neben hoher Infektiosität von proliferierenden und ruhenden Zellen erlaubt, die Probleme der entzündlichen Immunreaktion gegen adenovirale Komponenten und das effiziente Targeting bestimmter Zielzellen in vivo noch nicht geklärt sind. 104 3. Diskussion 3.8. Ausblick 3.8.1. in vivo Anwendung Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen des Expressions- und Regulationspotentials autoregulierbarer Kassetten fand mit Hilfe der Reporter Luziferase und eGFP in Zellkultur statt. Dabei zeigte sich vor allem die Verwendung des bidirektionalen Promotors geeignet zum Erhalt hoher Regulationskapazitäten. Für eine abschließende Bewertung der vorgestellten Expressionseinheiten sollte die Fähigkeit zur Regulation ebenfalls im Tiermodell ermittelt werden, da die Expressionsregulation in vivo und in vitro stark differieren kann. Aufgrund des zu geringen Titers der retroviralen Konstrukte sollte der adenovirale Transfer favorisiert werden. Da der verwendete Adenovirus 5 die Eigenschaft hat, nach in vivo Injektion vornehmlich Leberzellen zu infizieren, sollen die adenoviralen Konstrukte Ad-LTR-THTG, AdTHTG und Ad-TLGTN (Systeme B und C) zunächst direkt in die Maus (mit und ohne Dox im Trinkwasser) injiziert und die GFP- sowie die Luziferase-Expression nach Infektion der Leber in den induziert und reprimiert gehaltenen Mäusen ermittelt werden. Gleichzeitig soll evaluiert werden, in welchem Ausmaß die in vivo Expression der Reporter in Abhängigkeit von Dox reprimiert oder induziert werden kann. Zusätzlich können verschiedene ex vivo Untersuchungen z.B. an CD34+ hämatopoetischen Progenitorzellen oder primären Hepatocytenzelllinien durchgeführt werden. Nach Isolation und Infektion der primären Zellen kann ebenfalls die Expressionsregulation in Abhängigkeit von Dox evaluiert werden. Darüber hinaus soll die Effizienz der stabile Expression und Regulation nach adenoviraler Transduktion von Zellen untersucht werden, die auf retroviralem Wege nur sehr ineffizient zu transduzieren sind. 3.8.2. Verwendung gentherapeutisch relevanter Gene Interessant ist es weiterhin, anstelle der erwähnten Reportergene die Expressionsregulation gentherapeutisch relevanter Gene in primären Zellen zu ermitteln. Eines der dafür unter anderem ausgewählten Gene ist das Pig-A-Gen (glycosyl phosphatidylinositol complementation group A). Es ist an der Biosynthese eines Glycolipid-Anker, des sogenannten GPI-Anker (glycosylphoshatidylinositol) beteiligt, der u. a. die Komplement-Schutzproteine CD59 und DAF (decay accelerating factor) in der Zellmembran verankert. Die Pig-A-Defizienz führt zur 105 3. Diskussion Komplement vermittelten Lyse hämatopoetischer Zellen, vor allem der Erythrocyten (Rosse et al 1997). Das Krankheitsbild wird als Paroxysmale Nocturnale Hämoglobinurie (PNH) bezeichnet. Da der erworbene Defekt über viele Jahre persistiert, wird eine Mutation in den hämatopoetischen Progenitorzellen angenommen. Erstaunlicherweise scheinen die Pig-A defizienten Zellen einen Wachstumsvorteil zu besitzen und die gesunden Zellen zu überwachsen (Kinoshita et al., 1995). Es hat sich gezeigt, dass die konstitutive Expression des Pig-A-Gens zur Apoptose der transduzierten Zellen führt (persönliche Mitteilung, Medizinische Hochschule Hannover MHH). Durch die regulierte Expression soll sowohl die erfolgreiche Transduktion permanenter und primärer Zellen ermöglicht sowie die notwendige Expressionsstärke zur Reversibilität des Krankheitsbildes ermittelt werden. Ziel ist es auch das “kompetitive Modell” zu untersuchen, d. h. es soll die Frage geklärt werden, aus welchem Grund die defizienten Zellen einen Wachstumsvorteil besitzen. 3.8.3. Detektion hochregulierbarer Genloci und Austausch des Reporters mit Hilfe der Sequenz-spezifischen Rekombination Häufig ist die genaue Evaluierung der Genexpression relevanter Gene schwierig und wenig sensitiv. Nach Infektion verschiedener Zelllinien und Integration der in dieser Arbeit konstruierten Retro- und chimären Retro/Adenoviren können mit Hilfe des verwendeten Reporters GFP hochregulative Integrationsorte mit hoher Expression im induzierten Zustand und vollständiger Repression der Expression im reprimierten Zustand detektiert werden. Koppelt man das beschriebene, LTR-flankierte, autoregulative System mit Elementen, die einen effizienten Austausch des Reporters durch die entsprechenden Gene erlauben, können die geeigneten Integrationsorte wiederverwendet werden. Dies sollte zur vorhersagbaren Expression unter Beibehaltung der strikten Regulation führen. Für einen derartigen Ansatz bietet sich das FLP/FRT-System an. Die FLP-Rekombinase erkennt spezifische Rekombinationssequenzen, sogenannte FRT- (FLP recognition target) Sequenzen. Rekombination zwischen diesen Sequenzen kann je nach ihrer Orientierung zur Inversion oder Exzision des flankierten Bereichs führen. Durch die Konstruktion verschiedener mutierter FLP-Sequenzen (z.B. F1 und F2), die nur noch untereinander, aber nicht miteinander reagieren können (Senecoff und Cox, 1986; Umlauf und Cox, 1988; Schlake und Bode,1994), kann effizient ein Genaustausch zwischen Reporter und interessierendem Gen durchgeführt werden (Abb. 3.2.). Für das Targeting 106 3. Diskussion regulierbarer Loci muss der auszutauschende Reporter sowie das einzubringende Gen durch ein Set FRT-Sequenzen flankiert werden. Dabei sollte die Sequenzen zwischen den retroviralen LTRs liegen, um ihren vollständigen Erhalt nach adenoviraler Integration zu garantieren. Auf diesem Weg wäre es möglich die Regulationskapazität der Expressionseinheiten an identischen, charakterisierten Genorten, aber mit unterschiedlichen Genen zu testen. Abb. 3.2. Einbringen von Expressionskassetten an charakterisierte Genorte. Über retrovirale Infektion wird ein regulierbares mit FLP-Sequenzen (F1 und F2) flankiertes Reporterkonstrukt in die Zellen eingebracht (A) und die verschiedenen Genorte nach Integration charakterisiert. Genorte mit geeigneter Expression und Regulation können nachfolgend für die Expression relevanter Gene durch Verwendung eines Targeting-Vektors (B) erneut verwendet werden. Über die flankierenden FRT-Sequenzen findet bei Expression der Flip-Rekombinase ein direkter Kassenaustausch statt. Der Targeting-Vektor mit dem interessierenden Gen (Gen B) wird in den vorcharakterisierten Genort eingebracht. 3.8.4.Verwendung lentiviraler Vektoren Retroviren besitzen gegenüber Adenoviren den Vorteil der stabilen Integration in das Genom. Darüber hinaus exprimieren sie keine viralen Proteine, die eine virus-spezifische Immunantwort auslösen. Bisher wurden in der klinischen Anwendung ausschließlich Onco-Retroviren, wie z. B. das murine Leukämie Virus verwendet. Jedoch sind diese Viren anders als Adenoviren nicht in der Lage Zellen zu infizieren, die sich nicht in Teilung befinden. Eine Alternative zu den Adenoviren bieten die Lentiviren, wie z. B. das humane Immunodefizienz Virus Typ 1 (HIV-1). 107 3. Diskussion Sie gehören ebenfalls zu den Retroviren, jedoch besitzen sie den Vorteil, proliferierende und nicht proliferierende Zellen infizieren zu können (Zuffery et al., 1997). Rekombinante Lentiviren zeigen sich effizient in der Transduktion von Hirn, Leber und Muskel in vivo sowie hämatopoetischen Zellen (Miyoshi et al., 1999) ohne messbare Toxizität oder Immunantwort (Kafri et al., 1997;Miyoshi et al., 1997; Naldini et al., 1996). Darüber hinaus berichtete Kafri et al. (1999) über die Produktion VSV-G pseudotypisierter rekombinanter lentiviraler Viren mit Titern von 3x106, die aufgrund der Stabilität des VSV-G Proteins zu Titern von 1x109 Viren/ml aufkonzentriert werden können. Die lentivirale Transduktion regulierbarer Expressionseinheiten führt ebenfalls zur erfolgreichen Regulation der Transgene. Kafri et al. (2000) entwickelten ein lentivirales Single-Step-Transduktionssystem, basierend auf dem tet-off-System, mit regulierter GFP-Expression und konstitutiv exprimiertem tTA. Obwohl die GFP-Expression in vitro und in vivo nicht vollständig reprimierbar war, konnten Regulationsfaktoren von mehr als 500 detektiert werden. Damit sind Lentiviren erfolgversprechende Transfersysteme zur Transduktion der in dieser Arbeit vorgestellten autoregulierten Kassetten. Zu Adenoviren und chimären Retro/Adenoviren bieten sich Lentiviren als vielversprechende Alternative an. Allerdings liegen die Hauptbedenken für ihre Anwendung in der möglichen Rekonstitution des pathogenen Virus, wie es bereits für die Produktion MLV-basierender Viren gezeigt wurde (Scarpa et al., 1991, Otto et al., 1994; Martinez und Dornburg, 1996; Chong und Vile, 1996; Garrett et al., 2000; Chong et al., 1998). 108 4. Material und Methoden 4. Material und Methoden 4.1. Geräte Tischzentrifugen: Eppendorf 5417C Heraeus Biofuge 13 Hettich Mikro 12-24 Jouan CR412 Sigma - 202 MK Kühlzentrifugen: Sorval Superspeed RC5-C Festwinkelrotoren: GSA, GS3, SS34 Ultrazentrifugen: Sorval OTD combi Festwinkelrotor: Ti60, Ti75, Ti1270, VTI65 Speedvac concentrator: Savant Instruments Inc. mit Ölschieber-Vakuumpumpe und Kühlfalle Geltrockner: Bio-Rad 224 und 1125 mit Ölschieber-Vakuumpumpe und Kühlfalle Durchflußzytometer: FACScan und FACSCalibur von Becton Dickinson Photometer: Hitachi U 1100 Fluorometer: Hoefer TKO 100 pH-Meter: 0 50, Beckmann Thermomixer: Eppendorf Thermomixer 5436 Vortex: Scientific Industries Vortex Genie 2 ELISA-Reader: Labsystems Multiskan MS Dynatech MR5000, computerunterstützt Oligonukleotidsynthese: Applied Biosystems DNA Thermal Cycler: Perkin-Elmer Cetus 480 Netzgeräte: Bachofer 300/0,4 Hemlab Power Supply Type 264 Pharmacia ECPS 3000 / 150 LifeTechnologies ST305 Horizontal-Elektrophorese: BRL H3 und H6 109 4. Material und Methoden BRL Horizon 58 und Horizon 11-14 UV-Beleuchtungskammer: Appligene mit 302 nm Gelfotographie/Scanning: Herolab EasyStore/Flachbettscanner Agfa PhosphorImaging: Molecular Dynamics PhosphorImager STORM Luminometer: Berthold Lumat LB 9501 Cleanbenches: Heraeus Lamin Air HLB 2448 The Baker Co. Inc. Sterilcard Hood VBM 600 Zellkultur-Inkubatoren: Heraeus B 5060 EK-002 Forma Scientific Water-jacked Inkubator 3325 Zellzähler: Schärfe-System CASY1 Elektrapette: Matrix Technologies Mikroskope: Leitz Labovert Olympus CK2 Zeiss Axiovert TV135 mit Fluoreszenzvorrichtung Zeiss Axiophot mit Fluoreszenzvorrichtung CCD-Kamera-System: Photometics PXL 1400 (Grade 2) Elektrotransformator: BioRad Gene Pulser Verstärkerfolien: Curix MR 600 SE6 Wasseraufbereitungsanlage: Millipore Milli-Q 4.2. Material 4.2.1. Autoradiographie Kassetten für den Phosphorimager: Molecular Dynamics Phosphor Storage Screen 4.2.2. Chemikalien Es wurden Chemikalien der Firmen Bayer, Biolabs, Biorad, Boehringer, BRL Difco, Gibco, Merck, Miles, Renner, Roth, Pharmacia, Qiagen, Seromed, Serva und Sigma verwendet. Die Enzyme lieferten Biolabs, Boehringer, BRL, Merck, Perkin-Elmer, Promega, Serva und USB. Oligonukleotide wurden von der DNA-Synthese-Gruppe der GBF erhalten bzw. von den Firmen 110 4. Material und Methoden Gibco, Eurogentec und MWG bezogen. Radioaktive Chemikalien wurden von AmershamBuchler erhalten. DNA-Sequenzierungen, falls nicht selber durchgeführt, wurden den Firmen Eurogentec und MWG in Auftrag gestellt. Radioaktive Chemikalien wurden von AmershamBulcher bezogen. 4.2.3. Computerprogramme Die Bearbeitung der DNA- und Protein-Sequenzen, das heißt die Suche nach Sequenzen, Stellen für Schnitte von Restriktionsendonukleasen, Sequenzvergleiche etc. erfolgte mit dem in der GBF entwickelten GENMON Programmpaket sowie mit dem von C. Karremann (GBF) entwickelten Programm CUT. Die Auswertung von PhosphorImager-Analysen wurde mit dem Programm ImageQuaNT von Molecular Dynamics durchgeführt. Die Bearbeitung der CCDKamera-Aufnahmen erfolgte mit den Programmen IPLab Spectrum von Signal Analytics auf Macintosh-Rechnern. Die Auswertung der FACS-Analysen erfolgte Cell Quest 3.2.1. oder 3.3. ebenfalls auf Macintosh-Rechnern. Die Konvertierung in ein PC-Format erfolgte mit Adobe Photoshop 5.0. Diese Arbeit wurde mit dem Textverarbeitungsprogramm WordPerfect geschrieben, Abbildungen wurden mit WordPerfect Presentation angefertigt. Das Programm VCH-Biblio diente der Literaturverwaltung. 4.3. Allgemeine Methoden (nach Maniatis et al., 1982) 4.3.1. Sterilisation 4.3.1.1. Sterilisation durch Hitze Glasgeräte wurden bei 180C im Trockenschrank sterilisiert. Geeignete Plastikgefäße und Lösungen sowie Holzstäbe wurden bei 121C und 1 bar für 25 min. autoklaviert. Um RNasefreie Glasgeräte zu erhalten, werden diese 4 h bei 250C gebacken. Alle anderen Geräte wurden steril verpackt vom Hersteller bezogen. 4.3.1.2. Sterilisation durch Filtration Das Sterilisieren von für das Autoklavieren nicht geeigneten Lösungen wurde über Sterilfiltration (0.2 m Filter) durchgeführt. 4.3.2. Phenolisieren von Nukleinsäuren (Deproteinisierung) Phenol (Fa. Roth): redestilliertes, in TE äquilibriertes Phenol (pH 7,5-8,0), Zusatz von 0,1 % (w/v) 8-Hydroxychinolin TE: 10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) Man versetzt die wässrige Nukleinsäurelösung im Eppendorf-Gefäß mit 1 Volumen an Phenol 111 4. Material und Methoden und mischt auf dem Vortex-Mixer. Zur besseren Phasentrennung wird 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugesetzt. Die Phasen werden durch eine kurze Zentrifugation getrennt. Phenolreste werden durch zweimaliges Extrahieren mit Chloroform/Isoamylalkohol beseitigt. Anschließend wird die Nukleinsäurelösung mit 2 Volumen 0,6 M LiCl in Ethanol gefällt. Das erhaltene Präzipitat wird zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE aufgenommen. 4.3.3. Fällung von Nukleinsäuren Die Ethanol-Fällung ist ein häufig benutztes Verfahren zur Konzentrierung von Nukleinsäurelösungen. Durch das Waschen der gefällten DNA mit 70 % Ethanol werden noch vorhandene Salze entfernt. Wässrige Lösungen von RNA werden mit ½ Vol 7,5 M NH4OAc und 2,5 Volumen Ethanol gefällt. Wässrige Lösungen von DNA werden mit 2 Volumen 0,6 M LiCl in Ethanol gefällt. Die Fällung erfolgt durch 10 min. Inkubation bei 4 und anschließende Zentrifugation für 30 min in der auf 4°C gekühlten Kühlzentrifuge bei 13000 rpm. Die ausgefällten Nukleinsäuren werden zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen und im Vakuum oder bei 37C getrocknet. Die DNA wird nach dem Trocknen in sterilem TE Puffer und die RNA in sterilem Wasser resuspendiert. Die Ausbeute an kleinen DNA-Fragmenten ( 200 bp) läßt sich durch MgCl 2 (Endkonzentration: 10 mM) verbessern. Außerdem wird statt Ethanol 0,6 Vol Isopropanol benutzt. 4.3.4. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 4.3.4.1. ... spektrometrisch Die Extinktion der Nukleinsäure wird photometrisch bei 260 nm bestimmt. Eine Extinktion von 1 bei einer Schichtdicke der Küvette von 1 cm entspricht annähernd 50 g DNA bzw. 35 g RNA in 1 ml Volumen. Hierbei ist die optische Dichte der DNA-Lösung abhängig von dem GCGehalt. Bei einer Konzentration von 50 g/ml doppelsträngiger DNA mit einem 72 %igen GCAnteil beträgt die OD 1,04, während bei einem 30 %igen GC-Anteil die OD 0,94 beträgt. Das Verhältnis der bei 260 nm und 280 nm gemessenen Extinktionen sollte für eine sorgfältig präparierte und proteinfreie Nukleinsäure zwischen 1,8 (DNA) und 2,0 (RNA) liegen. 4.3.4.2. ... fluorometisch Zur fluorometrischen Konzentrationsbestimmung wird die DNA mit dem spezifischen Fluoreszenz-Farbstoff HOECHST 33258 angefärbt. Die Anregungswellenlänge für den DNAFarbstoff-Komplex beträgt 356 nm, die Emission findet bei 460 nm statt. Die Messung erfolgt im HOEFER-Fluorometer und kann nach Kalibrierung mit einer definiert konzentrierten DNALösung direkt in g/ml abgelesen werden. 112 4. Material und Methoden Erfahrungsgemäß ergibt diese Art der Konzentrationsbestimmung niedrigere, aber genauere Werte, da die Messung nicht von der Proteinabsorption überlagert wird und von Verunreinigungen (RNA) weitgehend unabhängig ist. 4.3.4.3. ... elektrophoretisch Zur Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA wird ein Teil der DNA auf einem Gel aufgetragen. Als Referenz dient DNA bekannter Konzentration. Nach Elektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid kann durch visuellen Vergleich der Fluoreszenzintensitäten unter UV-Licht die unbekannte Menge abgeschätzt werden, da die Intensität der Fluoreszenz der Nukleinsäuren ihrer Menge direkt proportional ist. 4.3.5. Herstellung von Acrylamid/Bisacrylamid Acrylamid und N,N'-Methylenbisacrylamid werden in den entsprechenden Mengen eingewogen, gelöst, mit dem Ionenaustauscher Amberlite (Serva) mindestens ½ Stunde gerührt und schließlich filtriert. Die Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung wird in einer dunklen Flaschen bei 4°C aufbewahrt. Außerdem wurden Fertiglösungen der Firma Roth verwendet. Die Angabe Acrylamid/Bisacrylamid 40/2 bedeutet, dass 38 g Acrylamid und 2 g N,N'Methylenbisacrylamid eingewogen und ad 100 ml Wasser gelöst worden sind. 4.4. Arbeiten mit E.coli 4.4.1. Verwendete E.coli-Stämme DH5: DH10B: CMK: Shure: XL1-Blue: F-, endA1, hsdR17, (r-K, m+k), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, (argF-lacZYA)U169, 180lacZM15 (Hanahan, 1983) mcrA, mcrB, mrr, hsdR17, deoR, recA1, endA1, lacZDM15 (Gibco BRL) thr, leu, thi, supE, T1r, T5r, recBC, (r-, m+), lacZM15, lacIq, ZM15pro+ (Koenen, Dissertation 1984) (hsdRMS), mcrA, mcrB, mrr, endA1, supE44, thi-1, -, gyrA96, relA1, lac, recB, recJ, sbcC, umuC, uvrC, LF', proAB, lacIqZM15, Tn10, (tetr)] (Bullock et al., 1987) endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, lac LF', proAB, lacIqZM15, Tn10, (tetr)], (Bullock et al., 1987) 4.4.2. Kulturmedien LB-Medium: 10 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl TB-Medium: 12 g/l Bacto-Trypton, 24 g/l Bacto-Hefeextrakt, 4 ml Glycerin ad. 113 4. Material und Methoden 900 ml, autoklavieren; vor Gebrauch werden 100 ml steriles 17 mM KH2PO4 und 72 mM K2HPO4 zugesetzt. Agarplatten: Dem Medium werden 15 g Agar (Difco) pro Liter LB-Medium zugegeben. Zur Herstellung ampicillinhaltiger Agarplatten wird nach Abkühlen des Mediums auf etwa 45C 1/1000 Volumen Ampicillin einer sterilfiltrierten Stammlösung mit 5 mg/ml beigemischt. 4.4.3. Kultivierung von E.coli E.coli-Zellen werden in Flüssigmedien (LB oder TB ± Antibiotikum) bei 37C unter Schütteln angezogen. Dazu werden 2 ml Kulturmedium mit einer E.coli Kolonie (Einzelklone von Agarplatte) angeimpft. Nach 6 - 8 Stunden kann mit dieser Vorkultur die Hauptkultur in einem Verhältnis von 1:500 bis 1:1000 angeimpft werden. 4.4.4. Transformation von E.coli 4.4.4.1. Herstellung kompetenter Zellen für Elektrotransformation 1 l LB-Medium wird mit 10 ml einer Vorkultur des Bakterienstammes angeimpft und bei 37C im Erlenmeierkolben mit Schikane geschüttelt. Sind die Zellen zu einer OD600 von 0,7 bis 0,8 gewachsen, werden sie in sterile GS3-Röhrchen für 15 bis 30 min auf Eis gestellt. Anschließend wird 10 min bei 4C im GS3-Rotor (4000 UpM) zentrifugiert. Das Pellet wird in 1 l kaltem, sterilen H2O vorsichtig suspendiert, 15 bis 30 min auf Eis inkubiert und nochmals zentrifugiert. Nun wird mit 0,5 l H2O erneut gewaschen. Das Pellet wird nach der Zentrifugation in 20 ml 10 %igem, kalten, sterilen Glycerin suspendiert, auf Eis inkubiert und zentrifugiert. Zum Schluß wird es in 3 ml 10 %igem Glycerin suspendiert und in 50 l Aliquots zunächst in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die kompetenten Zellen werden bei -70C gelagert. 4.4.4.2. Elektrotransformation von Plasmiden Nach dem Auftauen (auf Eis) werden die kompetenten Zellen (50 l) mit z.B. 1 l Ligationsans at z (ca. 1 ng Vekt or-DNA) i n sterile, trockene und gek ühlte Elektrotransformationsküvetten gegeben und bei einer Spannung von 2,5 V, einer Kapazität von 25 FD und einem Widerstand von 200 6 transformiert. Sofort nach der Transformation wird 1 ml SOG-Medium in die Küvette gegeben. Der Transformationsansatz wird für 30 min bis 1 h bei 37°C geschüttelt. Die Zellen werden in 100 l Portionen und/oder Verdünnungen auf entsprechenden antibiotikahaltigen LB-Agarplatten mit einem Drigalski-Spatel ausplattiert. SOB: 2 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4. Die Mg-Salze werden separat sterilisiert und erst 114 4. Material und Methoden vor Gebrauch der Stammlösung zugesetzt. SOG: SOB mit 20 mM Glukose. 4.4.5. Anlage von Stammkulturen Zur kurzfristigen Lagerung werden die Bakterien auf Agarplatten ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert und im Kühlraum bei 4°C aufbewahrt. Eine langfristige Lagerung ist als Stammkultur möglich. Hierzu wird 87 %iges Glycerin im Verhältnis 1:1 mit einer Übernachtkultur gemischt und direkt im Anschluss bei -20°C oder -70°C gelagert. 4.5. Isolierung von Nukleinsäuren 4.5.1. Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli 4.5.1.1. ... im analytischen Maßstab 4.5.1.1.1. (nach Birnboim und Doly, 1979; verändert nach G. Morelle, unveröffentlicht) Lysozympuffer: Lysozymlösung: Denaturierungslösung: Renaturierungslösung: 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 50 mM Glukose 4 mg Lysozym/ml Lysozympuffer 0,2 M NaOH, 1 % SDS (Lösung frisch ansetzen) 7,5 M NH4OAc Es werden 2 ml Kulturen (LB + Ampicillin) von den zu untersuchenden Klonen angelegt und in Kapsenbergröhrchen über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach dem Umfüllen in 2,2 ml Eppendorfreaktionsgefäße werden die Proben für 1 Minute bei 8000 UpM zentrifugiert. Die Pellets werden in je 200 l Lysozymlösung aufgenommen, gut gemischt (Vortex) und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgt die Zugabe von je 400 l Denaturierungslösung, die ebenfalls gut vermischt werden muß. Die Proben werden anschließend 5 Minuten im Eisbad belassen. Daraufhin werden je 300 l Renaturierungslösung zugegeben (gut mischen) und 10 Minuten im Eisbad inkubiert. Man erhält einen flockigen, weißen Niederschlag, der durch 5minütige Zentrifugation bei 4C und 10000 UpM abgetrennt wird. Im Pellet bleiben genomische DNA, RNA, Proteine und Membranfragmente. Der klare Überstand wird vorsichtig abpipettiert ( 720 l) und durch Zugabe von 0,7 Volumen Isopropanol wird die Plasmid DNA gefällt. Die Proben werden gut gemischt, 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen und anschließend 10 Minuten bei 13000 UpM zentrifugiert. Die Pellets werden einmal mit 70 %igem Ethanol gewaschen und leicht getrocknet. Die DNA wird in 50 - 100 l TE + 1 l RNase A (1 mg/ml) 115 4. Material und Methoden aufgenommen. Für Restriktionsanalysen können 5 - 10 l eingesetzt werden. 4.5.1.1.2. „Boiling Prep“ (nach Dan Cimbora, FHCR, Seattle) Diese Methode eignet sich zur DNA-Isolierung für alle E. coli Laborstämme (DH5, DH10B, XL1Blue), außer für CMK603 (recA+) und BL21. Vorteile liegen in der schnellen Durchführung (etwa 30 min) und in der hohen Qualität der DNA (basiert auf Boiling Prep nach Holmes und Quigley). STET-Puffer: LTE: TER: 8% Sucrose 0,5% Triton 50 mM EDTA 10 mM Tris (pH8,0) 10 mg Lysozym/1ml TE 10 g RNase A/1ml TE 7,5 M NH4OAc Autoklavierte Zahnstocher Eine E. coli 2ml LB/TB-Kultur mit dem entsprechenden Antibiotikum wird für 4 bis 16 Stunden bei 37C geschüttelt. Nach Umfüllen in 2,2 ml-Eppendorfgefäße werden die Proben für 1 min bei 5000 UpM zentrifugiert. Die Pellets werden in je 500l STET-Puffer resuspendiert und mit 50l LTE versetzt. Nach einer Inkubation von 2-3 min bei RT werden die Proben für 90 s im Thermomixer bei 95C inkubiert. Nach 5 minütiger Zentrifugation (14000 UpM) bildet sich ein zähflüssiges Pellet, das mit Hilfe eines Zahnstochers entfernt wird. 50l 7,5M NH4OAc und 500 l Isopropanol werden zugefügt, gevortext und die DNA für 5 min bei 14000 UpM pelletiert. Nach kurzen Trocknen wird das Pellet in 50-100l TER aufgenommen. Es werden 5 l zur Restriktionsanalyse verwendet. 4.5.1.2. ... im präparativen Maßstab (nach Ish-Horowitz & Burk, 1981) 1 Liter TB-Medium werden mit einer Vorkultur 1:1000 angeimpft. Die E.coli-Zellen werden über Nacht bei 37C angezogen. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 8 Minuten bei 7000 UpM im GS 3 Rotor geerntet und in 36 ml Lysozympuffer resuspendiert. Durch Zugabe von 4 ml Lysozymlösung (40 mg/ml in Lysozympuffer) werden die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Nach Zufügen von 80 ml Denaturierungslösung verbleibt die Lösung für 5 Minuten auf Eis. Anschließend werden 40 ml 3 M K-Acetat (pH 4,8) hinzugegeben, geschüttelt und 15 Minuten auf Eis inkubiert, wobei die Proteine ausfallen. Diese werden durch 116 4. Material und Methoden 10-minütige Zentrifugation bei 8000 UpM im GS 3 Rotor abgetrennt. Der Überstand wird durch ein Zellstofftuch filtriert, die darin enthaltenen Nukleinsäuren durch Zugabe von 0,7 Vol% Isopropanol gefällt und 10 Minuten im GS 3 Rotor bei 8000 UpM abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 9 ml TE 10/10 gelöst. Mit 2 M Tris/Base (pH 12) wird der pH auf 7,0 eingestellt. In einem Corex-Röhrchen werden 10 g CsCl eingewogenen. Unter erwärmen werden die ca. 10 ml Plasmid-DNA-Lösung in dem CsCl gelöst. Nach der Zugabe und dem Mischen mit 500 l Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) wird der Ansatz mindestens 10 Minuten im Dunkeln aufbewahrt. Um die verbliebenen, jetzt präzipitierten Proteine und Ribonukleinsäuren zu sedimentieren wird 10 Minuten bei 10000 UpM bei 18C im SS 34 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wird in Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend werden die Zentrifugenröhrchen verschweißt. Es wird 40 h bei 50000 UpM (Ti1270-Rotor) oder 40 h bei 38000 UpM (Ti60-Rotor) oder 24 h bei 50000 UpM (Ti75-Rotor) bei 18C zentrifugiert. Nach Beendigung der Zentrifugation wird die im UV-Licht sichtbare Plasmid-Bande mit einer Spritze abgezogen (über der Plasmid-Bande kann sich noch eine Bande mit Resten chromosomaler DNA befinden). Soll die isolierte Plasmid-DNA für Transfektionsexperimente benutzt werden, so folgt eine weitere Auf-reinigung der DNA über einen zweiten CsCl-Gradienten. Die Lösung mit der Plasmid-DNA wird dazu in ein neues Zentrifugenröhrchen gegeben, mit CsCl-Lösung (1 mg/ml) auf 12 ml aufgefüllt und noch einmal für 24 Stunden (Ti1270- oder VTI65-Rotor) zentrifugiert. Anschließend wird die Plasmid-DNA abgezogen, das Ethidiumbromid mit NaClgesättigtem Isopropanol mehrfach extrahiert und gegen 10 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA bei mehrfachem Pufferwechsel dialysiert. 4.5.1.3. ... als "Midi"-Plasmidpräparation (Fa. Qiagen) Puffer P1 (Resuspensionspuffer): 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 100 g/ml RNase A Puffer P2 (Lysispuffer): 200 mM NaOH, 1% SDS Puffer P3 (Renaturierungspuffer): 3,0 M NH4OAc Puffer QBT (Äquilibrierungspuffer): 750 mM NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0), 15 % Ethanol, 0,15 % Triton X-100 Puffer QC (Waschpuffer): 1,0 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0), 15 % Ethanol Puffer QF (Elutionspuffer): 1,25 M NaCl, 50 mM Tris/HCl (pH 8,5), 15 % Ethanol Die zu präparierenden Bakterienklone werden in 200 ml LB-Medium in einer Schüttelkultur bei 117 4. Material und Methoden 37C über Nacht inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren (7 min., 8000 UpM) werden die Kulturen nach Angaben des Herstellers Qiagen aufgearbeitet. Die Aufreinigung der PlasmidDNA erfolgt bei dieser Methode durch die Bindung der DNA an eine AnionenaustauscherSäule. Nach dem Entfernen von Verunreinigungen durch mehrere Waschschritte wird die DNA mit einem Hochsalzpuffer von der Säule eluiert, mit Isopropanol präzipitiert und entsalzt. 4.5.2. Isolierung von DNA aus Agarosegelen mit Hilfe des QIAquick “Gel Extraktions Kits” Unter Hochsalzbedingungen wird das ausgeschnittene Gelstück bei 50C 10 min. geschmolzen. Diese Lösung wird dann 1 min. durch eine Mini-Säule zentrifugiert. Dabei bindet die DNA an die Säulenmarix, während die Agarose-Salz-Lösung hindurch sedimentiert. Die Säule wird nun mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer gewaschen. Durch Zugabe von TE oder MilliporeWasser wird die DNA von der Säule eluiert. 4.5.3. Isolierung von hochmolekularer DNA (HMW-DNA) aus Säugerzellen 4.5.3.1. HMW-DNA-Präparation (unter Verwendung von Phenol) 5x Proteinase K-Puffer: 5 % SDS, 80 mM EDTA, 0,4 M Tris/HCl (pH 7,5), sterilfiltrieren Proteinase K-Lösung: 10 mg/ml in 1x Proteinase K-Puffer Zellen einer großen Platte (141 cm2, ca. 1,2 x 108 Zellen) werden zweimal mit PBS gewaschen und direkt mit 5 ml Proteinase K-Puffer mit Proteinase K (Endkonz. 100 g/ml) versetzt. (Alternativ können die Zellen zunächst abgelöst (Zugabe von TEN-Puffer oder trypsinisieren) und in einem 50 ml-Röhrchen pelletiert werden. Sie werden dann anschließend in 1 ml PBS resuspendiert. und mit 4 ml 1.2 x Proteinase K-Puffer mit Proteinase K (Endkonz. 100 g/ml) versetzt.) Das Lysat wird mit einer Vollpipette mit abgeschnittener Öffnung in ein 50 mlRöhrchen überführt (Scherkräfte vermeiden, wenn die DNA im Southern Blot eingesetzt werden soll) und (2 h bei 60C und) über Nacht bei 37°C am Rotor drehend inkubiert. Zum Ansatz wird 1 Vol Phenol zugegeben und 60 min bei RT "end over end" gedreht. Danach wird 1 Vol Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben und der Ansatz weitere 30 min rotiert. In der Minifuge werden bei 2500 UpM für 10 min die Phasen getrennt. Die wäßrige Oberphase enthält die HMW-DNA. Sie wird ohne Interphase vorsichtig abgenonmmen und in ein neues 50 mlRöhrchen überführt. Die Extraktion wird wiederholt: 1 Vol Phenol und 1 Vol Chloroform/Isoamylalkohol 30 min bei RT drehen. Zur Phasentrennung zentrifugieren. Die wäßrige Oberphase wird ohne Interphase abgenommen, mit 1 Vol Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und zentrifugiert. Die DNA-Lösung erneut mit Chloroform/Isoamylalkohol 118 4. Material und Methoden extrahieren. Die wässerige Oberphase wird anschließend gegen TE (10:1) dialysiert. (Alternativ kann die DNA in der wäßrigen Oberphase mit 1,5 Vol Isopropanol gefällt werden. Dazu wird das Röhrchen eine Minute waagerecht bewegt, bis die HMW-DNA in Form weißer Fäden ausfällt und langsam verklumpt. Sie wird abzentrifugiert, und das Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Nach Zugabe von TE (pH 7,5) wird die Probe über Nacht auf dem Rocker bewegt, damit sich die HMW-DNA lösen kann.) Carrier-DNA für Transfektionen wird durch ca. 7-maliges Aufziehen in einer 21-gauge Kanüle auf eine mittlere Länge von 20 kb geschert. Die DNA wird bei 4C gelagert. 4.5.3.2. HMW-DNA für Southern Blots oder PCR (schnelle Methode) Das aufgeführte Protokoll ermöglicht eine schnelle und ungiftige Isolierung von genomischer DNA aus einer geringen Menge an Kulturzellen (1 bis 5 x 105). Die gewonnene DNA dient zur Analyse im Southern Blot oder in der PCR. Der Zellaufschluß erfolgt mittels SDS und Proteinabdau mit Proteinase K. Die Entfernung von Nicht-DNA-Bestandteilen und der Proteinase K erfolgt nur durch Ethanol-Fällung und mehrfaches Waschen, so daß kein Phenolschritt erforderlich ist. "Modified Bradleys": 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.5 % SDS, 1 mg/ml Proteinase K (frisch zugeben) 100% EtOH mit 75 mM NaAc (-20C) 70% EtOH (-20C) Zellen einer konfluenten 6-Loch-Platte (je nach Zelldichte (ES>BHK>3T3)) werden mit PBS gewaschen und mit 0,5 ml "Modified Bradleys"-Lösung mit Proteinase K versetzt. Nach kurzer Inkuabtion wird die zähflüssige Lösung in ein 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und über Nacht bei 55C inkubiert. Man läßt die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, gibt langsam 1 ml 100% EtOH 75 mM NaAc zu und läßt die DNA langsam und ohne Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Stunden präzipitieren. Es entsteht ein zuerst gelartiges, später weißes Pellet. Am Ende durch Überkopfschütteln und (leichtes) Vortexen so vermischen, dass keine Luftblasen am Pellet zu erkennen sind. Die DNA wird bei 5000 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgesaugt (Pellet nicht trocknen lassen). Anschließend werden 0.5 ml 70% Ethanol hinzufügt, und man läßt die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Es wird erneut zentrifugiert und der Waschschritt wiederholt. Das kurz bei Raumtemperatur getrocknete Pellet wird in 30-50 l TE aufgenommen. Die DNA Konzentration sollte bei 1 g/l liegen (bei Messung im Fluorometer, UV-Messung bringt aufgrund der RNA den doppelten Wert). Sie kann direkt zur Restriktion verwendet werden. Der Spaltungsansatz sollte 1 x BSA (100x acetylated von New England Biolabs) und 1 g RNAseA enthalten. Die hohe Konzentration der DNA ermöglicht eine Spaltung in geringem 119 4. Material und Methoden Volumen, so dass vor Auftrag auf das Gel keine Fällung nötig ist. 4.5.4. Isolierung von RNA aus Säugerzellen TEN: 40 mM Tris/HCl, pH8,150 mM NaCl, 1mM EDTA 2x Bindungspuffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA Waschpuffer: 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA Elutionspuffer: 2 mM EDTA, pH 7,5 1x Auftragspuffer für RNA-Gel: 0,75 ml deionisiertes Formamid, 0,15 ml 10x MOPS, 0,24 ml Formaldehyd, 0,1 ml H2O, 0,08 ml Bromphenolblau-Lösung TRIZOL-Reagenz (Fa. Life Technologies) Mindestens 1x106 werden mehrfach mit PBS gewaschen und mit TEN geerntet. Nach dem Abzentrifugieren (5 min, 1000 UpM) kann das Zellpellet bei -70C eingefroren oder direkt weiter verarbeitet werden. Isolierung der Gesamt-RNA: Das Zellpellet wird mit 500 l TRIZOL resuspendiert. Nach Zugabe von 100 l Chloroform mischt man kurz und läßt den Ansatz für 2-3 min bei RT stehen. Zur Phasentrennung wird nun für 15 min bei 4C und 12000g zentrifugiert. Ist die obere wässrige Phase klar, wird sie vorsichtig abgezogen. Sollte sie nicht klar sein, muß der Ansatz noch weiter geschüttelt werden. 250 l Überstand werden mit 1 Volumen Isopropanol gemischt und 10 min bei RT belassen. Nach dem Abzentrifugieren wird der Überstand vorsichtig abgezogen und die RNA, die als gelartiges Pellet erkennbar wird mit 75% Ethanol gewaschen. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 4C und 8000g wird das Ethanol vorsichtig entfernt und die RNA bei RT getrocknet und in 100 l H2O aufgenommen. 4.6. Modifikation von Nukleinsäuren 4.6.1. Restriktionsanalyse von DNA Ein mit Hilfe der analytischen oder präparativen Plasmidpräparation isoliertes Plasmid kann durch die Spaltung mit Restriktionsendonukleasen charakterisiert oder verändert werden. Für die enzymatischen Spaltungen mit Restriktionsendonukleasen werden die von den Herstellern der einzelnen Enzyme angegebenen Reaktionsbedingungen angewendet. Die Restriktionspuffer, deren genaue Zusammensetzung den Beipackzetteln der jeweiligen Enzyme zu entnehmen sind, werden als 10fach konzentrierte Stammlösungen bei -20C gelagert. Die Aktivität der Restriktionsenzyme wird durch Zugabe von 1/5 Volumen 5 x Stop-Lösung sowie durch 10 minütiges Erhitzen auf 65C gestoppt. Für eine analytische Spaltung werden 0,2 - 1,0 120 4. Material und Methoden g DNA (Plasmid-DNA oder DNA-Fragment) in einem 10 - 20 l Ansatz gespalten. Das Ansatzvolumen präparativer Spaltungen ist von der Konzentration der zu spaltenden DNA abhängig. Zur Spaltung der Plasmid-DNA werden für 1 g Plasmid die 1- bis 5fache Menge an Enzymeinheiten (Units) eingesetzt. Die Zugabe des Enzyms sollte 10 % des gesamten Volumens nicht überschreiten, da das in dem Aufbewahrungspuffer des Enzyms enthaltene Glycerin die Enzymaktivität inhibiert oder eine Sternaktivität verursachen kann. Die Sternaktivität wird außerdem z.B. durch hohe Enzyme/DNA Verhältnisse (> 25 U/g) oder 45 % Ethylenglycol gefördert. Zur Spaltung wird der Reaktionsansatz 1 - 3 Stunden bei der angegebenen Temperatur inkubiert. Nach dem Abstoppen der Reaktion mit 5 x Stop-Lösung wird das Spaltergebnis durch Auftragen der Probe auf ein Agarose-Gel und anschließender Elektrophorese kontrolliert. Ist die Plasmidpräparation mit RNA verunreinigt, wird dem Spaltungsansatz 1/10 Volumen einer RNase-Lösung zugesetzt (10000 Einheiten RNase-T1 und 5 mg pankreatische RNaseA werden pro ml H2O gelöst. Die restliche DNase-Aktivität wird durch 10 minütiges Kochen zerstört. Die RNase wird bei -20C gelagert und erst kurz vor Gebrauch aufgetaut). Bei Spaltungen mit mehreren Enzymen ist zu beachten, dass die verwendeten Enzyme unter gleichen Bedingungen aktiv sind und daß der Abstand zwischen den Spaltstellen eine gleichzeitige Spaltung zulässt. Sind die benötigten Salzkonzentrationen im Puffer sehr unterschiedlich, wird zuerst im Niedrigsalzpuffer gespalten. Anschließend wird die Salzkonzentration erhöht und die zweite Spaltung durchgeführt. In einigen Fällen ist es günstiger, die DNA erst zu phenolisieren und zu fällen, um dann die nächste Spaltung durchzuführen. 4.6.2. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Zur radioaktiven Markierung des 5'-Endes eines Fragments oder um bei einer Ligation eine Selbstligation zu verhindern, werden überstehende 5'- oder 3'-Enden der DNA-Fragmente mit alkalischer Phosphatase (“calf intestine phosphatase” = CIP) dephosphoryliert. 10 x Phosphatase-Puffer: 500 mM Tris/HCl (pH 9,0) 10 mM MgCL2; 1 mM ZnCl2 1 mM Spermidin Zur Dephosphorylierung überstehender 5'-Enden werden in einem Reaktionsansatz von 50 l Endvolumen 5 l 10 x Phosphatase-Puffer, 20 - 100 pmol überstehende 5'-Enden und 1 Unit alkalische Phosphatase 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 l 125 mM EDTA, 1 % SDS gestoppt oder durch Inkubation bei 65C für 10 Minuten inaktiviert. Zur Dephosphorylierung gleichlanger 5'- und 3'-Enden oder überstehender 3'-Enden wird der gleiche Reaktionsansatz erstellt. Der Ansatz wird aber 15 Minuten bei 37C und anschließend 15 Minuten bei 56C inkubiert. 121 4. Material und Methoden Nach einer nochmaligen Zugabe von 1 Unit alkalischer Phosphatase werden die Inkubationschritte wiederholt. 4.6.3. Auffüllen 5'-überstehender Enden Durch Spaltungen mit Restriktionsenzymen entstehen oft überstehende Enden, die nicht miteinander kompatibel sind. Die Ligation kann nur erfolgen, wenn diese zu glatten Enden modifiziert worden sind. Das aus der Polymerase I durch Subtilisin-Behandlung gewonnene Klenow-Enzym besitzt die 3' 5'-Exonuklease- und die 5' 3'- Polymerase-Aktivität (5' 3'-Exonukleaseaktivität fehlt) und füllt mit dNTP's die komplementären Basen des 5'-überstehenden DNA-Stranges auf. 10 x Klenow-Puffer: Nukleotide: 50 mM Tris/HCl (pH 7,2) 10 mM MgSO4 0,1 mM DTT 10 mM dNTP Ein Ansatz von 50 l enthält bis zu 5 pmol überstehende 5'-Enden (bis zu 1 g DNA), alle dNTPs in einer Endkonzentration von 100 - 200 M, 1 x Klenow-Puffer und 1 - 2 Einheiten des Klenow-Enzyms. Die Inkubation erfolgt 15 Minuten bei Raumtemperatur oder bei 30C. Der Ansatz wird phenolisiert, gefällt und in TE Puffer aufgenommen. 4.6.4. Ligase-Reaktion Bei der Ligation verknüpft die T4-DNA-Ligase DNA-Fragmente, die sowohl kompatible, überstehende als auch glatte Enden besitzen. Dabei kommt es zu einer Phosphodiester-Bindung zwischen den 3'-OH- und den 5'-P-Enden der DNA. 5 x Ligase-Puffer: 250 mM Tris/HCl pH 7,6 50 mM MgCl2 25% (w/v) PEG 8000 5 mM ATP 5 mM DTT Für die Ligation überstehender, kompatibler Enden werden in einem 10 l Ansatz ca. 20 fmol eines zuvor gegebenenfalls dephosphorylierten Vektors mit ca. 60 fmol eines DNA-Fragments, 2 l 5 x Ligase-Puffer und 2 U T4-DNA-Ligase eingesetzt. Inkubiert wird mindestens 5 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4C über Nacht. Überstehende, komplementäre Enden werden relativ schnell und vollständig verknüpft, glatte 3'- und 5'-Enden erfordern eine höhere Enzymkonzentration. Bei der Ligation mit synthetischen Oligonukleotiden wird mit der 1000- 122 4. Material und Methoden fachen molaren Menge des Fragments ligiert. 4.6.5. Oligohybridisierung Zum Einfügen kurzer Nucleotidfragmente mit bekannter Sequenz eignet sich die Oligohybridisierung. Dabei werden je 5 g komplementäre Nucleotidstränge (bis zu 150 Basen) mit deionisiertem Wasser auf 25 l Gesamtvolumen aufgefüllt und für 5 min auf 80 - 90C erhitzt. Danach läßt man den Ansatz langsam auf RT abkühlen. Zur Ligation wird die maximale Menge für den Ligationsansatz verwendet. 4.7. Radioaktive Nachweismethoden von Nukleinsäuren 4.7.1. Markierung von DNA 4.7.1.1. Random-Priming mit "Redi-Prime DNA Labelling System" Labelling Mix (Firma Amersham, Life Science): dATP, dGTP, dTTP, exonukleasefreies KlenowEnzym, Oligonukleotidprimer (9mer) Bei diesem Verfahren wird ein kommerziell angebotenes System der Firma Amersham verwendet. Der Reaktionsmix liegt in einem Eppendorfreaktionsgefäß in gefriergetrockneter Form vor. Es werden 2,5-100 ng DNA-Probe in 45 l sterilem Wasser oder 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) / 1 mM EDTA (TE-Puffer) zur Denaturierung für 5 min bei 95C im Wasserbad aufgekocht, und sofort auf Eis gestellt. Die kurz zentrifugierte DNA wird zum Labelling-Mix zugefügt, vermischt und nochmals kurz zentrifugiert. Es werden 5 l [32P]dCTP zugegeben. Der Mix wird für 10-30 min bei 37C inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion werden 2 l 0,5 M EDTA zugegeben. Nach der Markierungsreaktion wird die Probe über eine fertige Micro-SpinTM G-50-Säulen der Firma Pharmacia Biotech von nicht eingebauten Nukleotiden gereinigt.. Der Reaktionsansatz wird auf die Säule aufgetragen. Bei 2800 UpM für 2 min wird die markierte DNA abzentrifugiert, die nicht eingebauten Nucleotide bleiben in der Säule zurück. Vor Zugabe der Probe zur Hybridisierungslösung wird diese zur Denaturierung 5 min. im Wasserbad aufgekocht und sofort auf Eis gestellt. 4.7.1.2. Klenow-Markierung von -DNA Zur Größenbestimmung von Fragmenten im Southern Blot wird ein mit 35S-dATP markierter Größenmarker (Lambda-DNA, HindIII/EcoRI verdaut) eingesetzt. Dazu markiert man die verdaute -DNA durch eine Auffüll-Reaktion mit dem Klenow-Enzym. Man versetzt den 123 4. Material und Methoden Verdauungsansatz (ca. 1 g DNA in einem Volumen von 20 l) mit 2 l Nukleotid-Mix, 4 l [35S]dATP (>1000 Ci/mmol) und 2 U Klenow. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37C und Abstoppen mit 20 l Stopmix erfolgt die Aufreinigung über eine Micro-SpinTM G50 Säule. 4.7.2. Southern Blot 4.7.2.1. Southern Transfer Enzymatischer Verdau der HMW-DNA: 8-10 g der aufgereinigten, hochmolekularen DNA (HMW-DNA) werden im einem Endvolumen von 20 l mit 2 l des jeweiligen Restriktionspuffers, 1 l RNase (10 g/ml), 1 l BSA (100 x) und 1-2 l konzentriertem Enzym (40-100 U/l) über Nacht bei 37C verdaut. Die DNA wird mit 8 l Gelladepuffer versetzt und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Als Größenstandard wird ein 35S-markierter HindIII/EcoRI-Verdau von -DNA verwendet. Bei gering konzentrierten DNA-Lösungen ergeben sich große Volumina des Restriktionsansatzes. Der Ansatz muß deshalb vor dem Auftrag auf das Agarosegel gefällt werden. DNA-Transfer: Der Transfer der DNA vom Gel auf die positiv geladenen Membran (ZetaProbe, Fa. BioRad) erfolgt mit 0,4 M NaOH. Lange DNA-Fragmente (>2kb) sollten vor dem Transfer mittels 0,25 M HCl für bis zu 30 min depuriniert werden (bis sich das Bromphenolblau des Proben-Auftragpuffers gelb färbt), so daß sie während des alkalischen Transfers in Teilfragmente zerfallen und leichter aus dem Gel heraustreten können. Das Gel wird anschließend mit H20 gespült und in 0,4 M NaOH neutralisiert (bis sich das Bromphenolblau des Proben-Auftragpuffers wieder blau färbt) und in die Blotapparatur (z. B. Gelkammer) überführt. Das Gel liegt dabei mit der Unterseite nach oben oberhalb des Flüssigkeitsspiegels auf einem feuchten Filterpapierstreifen (Whatman 3MM), dessen gegenüberliegende Enden in das Pufferreservoir (0,4 M NaOH) eintauchen. Unter diesem Filterpapier sollten zwei weitere Lagen Filterpapier liegen, die nicht mit der Flüssigkeit in Berührung stehen. Auf das Gel wird eine Nylon-Folie (Zeta-Probe, Fa. BioRad) gelegt, die zuvor in NaOH getaucht wurde. Luftblasen müssen sorgfältig entfernt werden. Auf die Membran werden eine Lage angefeuchtetes und zwei Lagen trockenes Filterpapier geschichtet. Nach oben schließt ein Stapel saugfähiges Papier (z. B. "Apura Swanex") die Anordnung ab. Die Apparatur wird vorsichtig mit Plastikfolie abgedeckt und eine Glasplatte sowie ein Gewicht (ca. 500 g) aufgelegt. Der Transfer sollte mindestens 6 Stunden, bei hochprozentigen Gelen jedoch bis zu 12 Stunden andauern (am besten über Nacht). Anschließend wird die Nylonfolie 2 mal 5 min. in 2 x SSC neutralisiert, 30 min. bei 65C gebacken und zur Hybridisierung weiterverwendet. 124 4. Material und Methoden 4.7.2.2. Hybridisierung des Southern Blots NaxHxPO4: Na2HPO4 (1M) und NaH2PO4 (1M) werden im Verhältnis 4:1 vermischt (pH-Wert 7,2 (sehr genaue Einstellung !)) SDS (20 %) EDTA (0,5 M) 20xSSC: Hybridisierungslösung: Prähybridisierungslösung: filtriert 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat (pH 7,6) filtriert; bei Raumtemperatur über Monate haltbar 0,5 M NaxHxPO4, pH 7,2 Hybridisierungslösung + 7 % SDS + 2 mM EDTA Prähybridisierung: 5-8 ml Prähybridisierungslösung werden in ein Hybridisierungsröhrchen (Fa. Robbins Scientific) gefüllt. Anschließend wird die mit der Prähybridisierungslösung angefeuchtete Nylonmembran um eine Glaspipette gewickelt und die DNA freie Seite luftblasenfrei an die Glaswand des Röhrchen überführt. Die Prähybridisierung im Hybridisierungsofen erfolgt bei 68C für mindestens 10 min. Hybridisierung: Die radioaktive Probe wird durch 5 minütiges Aufkochen denaturiert und sofort auf Eis gekühlt. Anschließend wird die Probe einfach in das Hybridisierungsröhrchen überführt. Die Hybridisierung erfolgt bei 68C über Nacht. Waschen der Nylonmembran: Waschpuffer1: 40 mM NaxHxPO4, 1 % SDS, 2 mM EDTA, pH 7,2 Waschpuffer2: 40 mM NaxHxPO4, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, pH 7,2 Waschpuffer3: 100 mM NaxHxPO4, 2 mM EDTA, pH 7,2 Von jedem Waschpuffer werden 500 ml hergestellt. Die Hybridisierungslösung wird vorsichtig abgegossen. Die ersten Waschschritte werden im Hybridisierungsröhrchen durchgeführt. WP1: WP2: WP3: 2 x 10 min. 68C im Hybridisierungsofen 1 x 5-10 min. 68C im Wasserbad 3 x 5-10 min 68C im Wasserbad zum Entfernen der SDS-Reste Die noch feuchte Membran wird auf Filterpapier (Whatman 3 MM) gelegt, in Klarsichtfolie eingeschlagen und über Nacht (oder länger) mit einem Röntgenfilm oder einem PhosphorScreen exponiert. Rehybridisierung: Zur Rehybridisierung wird die Aktivität durch mehrfaches Waschen in 0,1% SSC/0,1 %SDS bei 95C entfernt. Die vollständige Ablösung der radioaktiven Probe wird durch anschließende 125 4. Material und Methoden Exposition sichergestellt. Erneute Prähybridisierungen und Hybridisierungen erfolgen wie gehabt. 4.7.3. Northern Blot Transfer Das Formaldehyd-Agarosegel wird 5 min in H2O und anschließend 2x für 15 min in 10x SSC geschwenkt. Danach erfolgt der Aufbau der Blotapparatur wie unter Southern Blot beschrieben. Allerdings erfolgt der Transfer mit 10x SSC über Nacht. Als Membran dient eine Nylonfolie (GeneScreenPlus, NEN), die vor Gebrauch kurz in H2O geschwenkt wurde. Nach dem Transfer wird die Membran mehrfach mit 2x SSC gespült, zwischen 2 Lagen Whatmann getrocknet und anschließend bei 80C gebacken. 4.7.3.1. Hybridisierung von Northern Blots Hefe-RNA: 1g in 100 ml H2O lösen, bei 4C lagern; zum Gebrauch wird die Hefe-RNA 10 min auf 100 C erhitzt und sofort in der Prähybridisierungslösung verdünnt (Endkonzentration 0,5 mg/ml). Prähybridisierungslösung: 10% Dextransulfat (2 ml 50% Dextransulfat), 1 %SDS (0,5 ml 20% SDS), 1 M NaCl, H2O ad 9 ml; vor Gebrauch 0,5 ml denaturierte Carrier-DNA sowie 0,5 ml denaturierte Hefe-RNA. Hybridisierungslösung: wie Prähybridisierungslösung, jedoch mit radioaktiv markierter Probe; Probe vorher 10 min auf 100C erhitzen und dann sofort in der Hybridisierungslösung verdünnen. Prähybridisierung: Die Prähybridisierung erfolgt analog zu der für DNA-Blots, wird jedoch ebenfalls bei 60C durchgeführt und sollte mindestens 30 min dauern. Hybridisierung : Die Hybridisierung erfolgt analog zu der für DNA Blots, wird jedoch bei 60 C durchgeführt. Waschen: Nach dem Entfernen der Hybridisierungslösung wird die Nylonfolie zunächst innerhalb des Röhrchens kurz mit 2x SSC gewaschen und dann mittels dieser Waschlösung aus dem Röhrchen gespült. Anschließend wird die Membran zunächst für 5 min in 2x SSC und danach mindestens 2x für 15 min mit einer auf 60C vorgewärmten Lösung von 2x SSC/1% SDS gewaschen. Die Zahl der Waschschritte hängt von der gemessenen Aktivität ab. Zum Abschluss erfolgt ein 5 minütiger Waschschritt mit 0,1x SSC. Der Blot wird in Klarsichtfolie eingeschlagen und exponiert. 126 4. Material und Methoden 4.8. Charakterisierung von Nukleinsäuren 4.8.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 4.8.2.1. DNA-Amplifikation durch PCR Die PCR ist vom Konzept her, eine einfache Methode, Nukleinsäuren in einer Lösung zu "vermehren". Dabei wird der natürliche Replikationszyklus der Zelle nachgeahmt, wobei sich die Zahl der DNA Moleküle nach jedem Zyklus verdoppelt. Die Methode basiert auf der Wiederholung eines Sets von drei Schritten mit bestimmten Reaktionsbedingungen: Denaturierung der Template DNA: Die doppelsträngige Ausgangs-DNA wird bei hohen Temperaturen inkubiert. Die Doppelstränge dissoziieren und bleiben in der Lösung einzelsträngig, bis die Temperatur abgesenkt wird. Annealing von Primern: Die Extension-Primer werden so gewählt, daß sie den zu amplifizierenden Bereich der DNA flankieren. Sie sind so beschaffen, daß einer der Primer komplementär zum codierenden Strang diesen bindet, der andere Primer aber den nicht-codierenden Strang erkennt. Da die Konzentration der Primer in der Lösung sehr hoch ist, wird die Ausbildung von Primer-Template-Komplexen gegenüber der Renaturierung der beiden Einzelstränge bevorzugt werden. Primer Extension: Der letzte Schritt ist die, von der DNA-Polymerase vermittelte, Verlängerung der Primer in den Primer-Template-Komplexen. Die Verwendung von Taq-Polymerase erlaubt die Erhöhung der Temperatur für die Extensionsreaktion auf über 70C. Die hohe Thermostabilität des Enzyms bedingt gleichzeitig, dass viele Zyklen der PCR durchlaufen werden können, ohne dass neues Enzym zugegeben werden muß. 10x Reaktionspuffer: 10 x Nukleotidmix: 500 mM KCl 100 mM Tris/HCl (pH 8,3) 12,5(-17,5) mM MgCl2 0,01 % Gelatine 25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP Ein Standardansatz wird in der folgenden Reihenfolge zusammenpipettiert: Wasser: 10 x Reaktionspuffer: 10 x Nukleotidmix: Primer 1: 21,5 l 4,5 l 4 l (2,5 mM jeden Nukleotids) 5 l (10 pmol/l) 127 4. Material und Methoden Primer 2: 5 l (10 pmol/l) Template-DNA: 5 l (100 pg Plasmid-DNA oder 100 ng HMW-DNA) Taq-Polymerase: 5 l (1,25 U), Enzymverdünnung 1: 20 in 1 x PCR-Puffer oder DNA-Polymerase-Mix 5 l (2,5 U/l) (ExpandTMLong Template PCR System) Die PCR wird unter sterilen Bedingungen in Reaktionsgefäßen (Perkin Elmer Cetus) angesetzt. Das Wasser, der PCR-Puffer, das Nukleotid-Mix, die Primer und die DNA werden vermischt und mit Mineralöl überschichtet (um ein Verdunsten der Flüssigkeit und damit die Veränderung der Reaktionsbedingungnen zu vermeiden). Der Reaktionsansatz wird in ein mit einem Tropfen Mineralöl benetztes Bohrloch eines Thermal Cyclers (Perkin ELmer Cetus) überführt und das Temperaturprogramm gestartet. In einem ersten Temperatur-Programm wird der Reaktionsansatz 5 min. auf 94C erhitzt und anschließend für 10 min. auf 72C temperiert, wobei während dieser 10 min. die Taq-Polymerase hinzugegeben wird. Ein Standardtemperaturprofil für die DNA-Amplifikation mit HMW-DNA oder Plasmid-DNA als Template sieht wie folgt aus (in Klammern Standard-Bedingungen für ExpandTM Long Template PCR-System): Schmelzen: Annealing: Polymerase-Reaktion: 1 min 94C (1 min 92C) 1 min 58C (1 min 62C) 2 min 72C (3 min 68C) Die letzten drei Schritte werden 30-35 mal wiederholt. Abweichungen von diesem Temperaturprofil können bei der Verwendung anderer Primer oder größerer zu amplifizierender Fragmente notwendig werden. Zum Entfernen des Mineralöls wird mit Chloroform extrahiert, wobei die wässrige Phase eine kleine Micelle ausbildet, die mit der Eppendorfpipette leicht abgezogen werden kann. Zur Analyse der PCR Produkte wird 1/10 des Reaktionsansatzes auf ein Agarosegel geladen. 4.8.2.2. DNA-Mutagenese durch PCR Gezielte Veränderungen der DNA-Sequenz bei der PCR können lediglich an den Enden der PCR-Produkte, im Bereich der Homologie zu den Primern eingefügt werden. Hierfür plant man die Oligonukleotide so, dass sie, wenn sie die Mutation aufweisen, nicht vollständig komplementär zur Template-DNA sind, sondern entweder einzelne Mismatches oder sogar ein längeres, nicht komplementäres 5'-Ende aufweisen. Es ist darauf zu achten, daß wenigstens über eine Länge von 16 Basen vollständige Komplementarität besteht. Da GC-Bindungen stabiler als AT-Bindungen sind, sollten die Oligonukleotide möglichst mit einigen Cytosinen oder Guaninen enden, um eine sichere Hybridisierung zwischen Primer und Template zu erreichen. 128 4. Material und Methoden 4.8.3. Sequenzierung von DNA 4.8.3.1. ... von Plasmid-DNA Die Sequenzierung mit Sequenase ist eine Variante der Sequenzierung mit T7-DNA Polymerase. Die Sequenase ist aus der T7-DNA Polymerase durch Deletion der 3'5' Exonukleaseaktivität hervorgegangen. Die Sequenziermethode ist eine Abwandlung der Methode nach Sanger. Alle notwendigen Reagenzien sind in einem Kit von USB enthalten. Die Sequenzierreaktion läßt sich in fünf Schritte unterteilen: Denaturierung der Template DNA: Die DNA wird unter basischen Bedingungen denaturiert und anschließend gefällt. Die DNA liegt schließlich als Einzelstrang vor. Zur Sequenzierung werden 2 g DNA mit 2 l Denaturierungspuffer 5 min bei Raumtemperatur denaturiert, mit 3 l 3 M Natriumacetat (pH 5,5) neutralisiert, mit 75 l Ethanol gefällt und 2 x mit 70 % Ethanol gewaschen. Direkt vor Reaktionsstart wird die DNA in 7 l Wasser aufgenommen. Denaturierungspuffer: 2 M NaOH 2 mM EDTA Annealing von Primern: Die Primer werden so gewählt, dass sie homolog zu dem Bereich sind, der 5' vor der zu lesenden Sequenz liegt. Bei der Sequenzierung kann ein Bereich bis zu etwa 300 bp vom Primer entfernt gelesen werden. Zur Bindung zwischen Template-DNA und Primer wird die Temperatur langsam von der Schmelztemperatur auf 37°C gesenkt. Zum Annealing wird folgender Ansatz pipettiert: 7 l denaturierte DNA 2 l Sequenase-Puffer 1 l Primer (5 pmol/l) Der Ansatz wird 2 min auf 65C erhitzt und dann langsam auf 37C abgekühlt. Primerverlängerung und DNA-Markierung: Die Primerverlängerung entsprechend der Sequenz des Templates und der Einbau von [35S]dATP wird durch die Sequenase-Reaktion durchgeführt. Die anderen drei notwendigen Nukleotide liegen unmarkiert vor. [35S]dATP: 600 mCi/mmol 129 Label-Mix: 4. Material und Methoden 1,5 M dGTP 1,5 M dCTP 1,5 M dTTP Die Sequenase wird auf 1/8 verdünnt eingesetzt. Zur Verdünnung dient ein spezieller EnzymVerdünnungspuffer (10 mM Tris/HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA). Die Labelling-Reaktion wird folgendermaßen pipettiert: 10 l denaturierte DNA 1 l 100 mM DTT 2 l Label-Mix 0,5 l [35S]dATP 2 l verdünnte Sequenase Die Inkubation erfolgt 5 min bei Raumtemperatur. Termination durch Didesoxy-Nukleotide: Die Termination der Primerverlängerung erfolgt durch die Zugabe von Didesoxynukleotiden, bei denen die 3'-OH Gruppe der Ribose des Nukleotids durch ein H ausgetauscht ist. Da die Verlängerung der Nukleinsäure über die 5'- und 3'-OH der Ribosen der Nukleotide verläuft, kann an einem Didesoxynukleotid kein weiteres Nukleotid ansynthetisiert werden. Durch Zugabe von ddGTP, ddATP, ddTTP oder ddCTP kann die Nukleinsäuresynthese spezifisch nach einem C, T, A oder G in der Template-DNA abgebrochen werden. Da nicht ausschließlich nur die Didesoxynukleotide angeboten werden, sondern auch die Desoxynukleotide, finden die Syntheseabbrüche statistisch hinter jedem Vorkommen des entsprechenden Nukleotids des Templates statt. ddG-Terminations-Mix: ddA-Termination-Mix: ddT-Terminations-Mix: 80 M dGTP, dATP, dCTP, dTTP 8 M ddGTP 50 mM NaCl 80 M dGTP, dATP, dCTP, dTTP 8 M ddATP 50 mM NaCl 80 M dGTP, dATP, dCTP, dTTP 8 M ddTTP 50 mM NaCl 80 M dGTP, dATP, dCTP, dTTP 8 M ddCTP 50 mM NaCl Für die Termination werden jeweils 3,5 l aus dem Labelling-Ansatz auf 2,5 l auf 37°C vorgewärmten Terminationsmix ddG, ddA, ddT und ddC gegeben und 5 min bei 37°C inkubiert. ddC-Terminations-Mix: 130 4. Material und Methoden Reaktionsstop: Die Reaktion wird durch Zugabe von 4 l Stop-Puffer beendet. Für den Auftrag auf das Sequenziergel (5.8.2.5) reichen 2-4 l pro Bahn aus. Stop-Puffer: 95 % Formamid 20 mM EDTA 0,05 % Bromphenolblau 0,05 % Xylencyanol 4.8.3.2. ... von PCR-Fragmenten Zur Sequenzierung von PCR-Fragmenten werden die PCR-Primer durch Verwendung von Microcon-30-Filter (Fa. Amicon) aus dem Ansatz entfernt. Die DNA-Lösung wird zunächst konzentriert und mit Wasser auf 20 l aufgefüllt. Nach Zugabe von 4 l NaOH (1M) zur Denaturierung wird der Ansatz zunächst 10 min. bei 37C inkubiert und anschließend mit 100 l einer 0,6 M LiCl/Ethanol-Lösung versetzt, gefällt und in 7 l Wasser aufgenommen. Zur Hybridisierung des Primers werden die 7 l DNA-Lösung mit 2 l Sequenzier-Puffer und 1 l Primer vermischt, 2 min. in einem Wasserbad aufgekocht und anschließend sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine Primer-Bindung, verhindert jedoch, dass die beiden DNA-Stränge des kurzen DNA-Fragmentes renaturieren können. Man belässt die Proben anschließend auf Eis. Die weiteren Schritte (Sequenzierungsreaktion) werden wie oben beschrieben durchgeführt. 4.8.3.3. ... durch die Firma EUROGENTEC Ein Teil der Sequenzierungen von PCR-Fragmenten wurde durch die Firma EUROGENTEC, Belgien, durchgeführt. Hierzu wurden die Proben wie folgt aufgearbeitet: Die PCR-Ansätze wurden entweder direkt aufgereinigt oder zunächst in einem Agarosegel aufgetrennt und die zu sequenzierenden Fragmente isoliert. In einigen Fällen wurden gleiche Fragmente aus identischen parallelen PCR-Ansätzen vereinigt, um eine ausreichende DNAMenge für die Sequenzierung zu erhalten. Zur Kontrolle der PCR-Fragmente wurde 1/10 des Ansatzes auf ein Agarosegel geladen. 4.9. Gelelektrophoresen 4.9.1. Agarose Gelelektrophorese (nach Maniatis et al., 1982) Laufpuffer (TAE): 5 x Stop-Puffer: 40 mM Tris/Acetat (pH 7,5), 20 mM NaOAc, 1 mM EDTA 15 % Ficoll, 50 mM EDTA, 5 x TAE, 0,05 % 131 Färbelösung: 4. Material und Methoden Bromphenolblau, 0,05 % Xylencyanol 5 mg/ml Ethidiumbromid in H2O Die Agarose wird in Laufpuffer aufgenommen und in einem Mikrowellenherd gekocht. Zur Anfertigung eines Gels werden in eine Gelkammer Agarose-Lösung + Färbelösung (abhängig von der Größe des Gels: auf 20 ml Agarose etwa 1 l Färbelösung) ausgegossen. Um die Geltaschen zu formen, wird der Kamm eingesetzt. Nach dem Erstarren wird das Gel in eine mit Laufpuffer gefüllte Elektrophoresekammer gesetzt. Die Proben werden vor dem Auftragen mit 1 /4 Volumen des 5 x Stop-Puffers versetzt und aufgetragen. Für die Erkennung der Größe eines Fragmentes werden Standards parallel mit aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei ungefähr 100 V und 30 mA durchgeführt. Je nach Größe der Fragmente werden die DNA-Banden nach 1-3-stündiger Elektrophorese (Minigel entsprechend kürzer) fotografiert. Für die präparative Gewinnung der DNA-Fragmente werden die Banden unter UV-Licht (302 nm) aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Agarosegele für den Southern-Transfer: Hierfür wurden 140 ml 0,8 %ige Gele mit 1,5 l Ethidiumbromid (5 mg/ml) verwendet, die sehr heiß gegossen wurden. 4.9.2. Sequenziergele 4.9.2.1. Herstellung von Sequenziergelen (nach Maniatis et al., 1982) Laufpuffer (TBE): 100 mM Tris/Borat (pH 8,3), 2,5 mM EDTA Ein 6 %iges Sequenziergel wird folgendermaßen angesetzt: Harnstoff: 10 x TBE: Acrylamid/Bis-Acrylamid (40/2): Wasser: 50 g 10 ml 15 ml 38 ml bei 50C lösen und auf 100 ml mit Wasser auffüllen. Die Lösung wird filtriert, mit 40 l TEMED und 400 l 10 %igem APS zur Polymerisation gebracht und sofort das Gel gegossen. Aufbau des Gels: Die beiden Glasplatten der Sequenzierapparatur werden gründlich mit Spülmittel gereinigt und flusenfrei getrocknet. Die beiden Platten werden aufeinander gelegt, nachdem die seitlichen Spacer (0,4 mm) aufgelegt wurden. Dieser Aufbau wird mit Klammern fixiert. Die Lösung wird nun zügig und Luftblasen frei zwischen die beiden Glasplatten gegossen. Der Sequenzierkamm wird mit der falschen Seite zwischen die Platten geschoben. Nach mindestens einer Stunde Polymerisation wird das Gel in die Apparatur eingespannt. die Kämme richtig eingesetzt und die Taschen auf Dichtigkeit überprüft. Das Gel sollte bei 2000V 132 4. Material und Methoden mindestens 60 Minuten vorlaufen und trägt dann die denaturierten Proben auf. Nach dem Lauf werden die Glasplatten vorsichtig voneinander getrennt und das Gel auf Whatman 3MM Papier überführt und für eine Stunde bei 80C auf einem Geltrockner getrocknet und anschließend in einer Expositionskassette mit Phoshor-Screen für 1-3 Tage entwickelt. 4.9.2.2. Silianisierung von Glasplatten Um zu gewährleisten, dass sich nach Beendigung der Elektrophorese das Sequenziergel einerseits von der Thermoplatte lösen andererseits aber auf der Glasplatte haften bleiben bzw. die Gele leichter auf Whatman Papier gezogen werden können, werden die Glasplatten mit folgenden Lösungen beschichtet: Die Thermoplatte wird sorgfältig mit einem fettlösenden Mittel gewaschen und mit Wasser abgespült. Dann wird die Platte zweimal hintereinander mit 5 ml Repel-Silane (Firma LKB) eingerieben, trocknen gelassen und sorgfältig poliert. Nachdem die Platte mit Ethanol abgespült wurde, wird sie, noch während sie feucht ist, mit einem fusselfreien Tuch trocken poliert. Die Glasplatte wird nach dem Waschen mit 5 ml frisch angesetzter Bind-Silan-Lösung (20 ml Ethanol + 5 ml 10%ige Essigsäure + 75 l Bind-Silan der Firma LKB) eingerieben. Nach dem Trocknen wird auch diese Platte mit Ethanol abgespült und poliert. Die beiden Glasplatten der S2 Apparatur werden mit Repel-Silane behandelt und wie oben beschrieben weiterverarbeitet. 4.9.2.3. Trocknung von Polyacrylamidgelen Polyacrylamidgele aller Art werden nach der Elektrophorese auf Whatmann 3MM Papier gezogen und auf einem Geltrockner bei 60C oder 80C im Vakuum getrocknet. SDS- und Tricin-SDS-Polyacryl-amidgele werden vor dem Trocknen gefärbt (wenn möglich) in jedem Fall aber fixiert. 4.9.3. Formaldehyd-Agarosegele 10x MOPS: 0,2 M Morpholinopropansulfonsäure, 10 mM EDTA, 10 mM NaOAc, pH 7 1,2 g Agarose werden in 72 ml H2O durch Aufkochen gelöst und auf 55C abgekühlt. Danach werden 10 ml 10x MOPS und 18 ml 37%ige Formaldehydlösung hinzugefügt und gut gemischt. Anschließend wird die Lösung in einen Gelträger überführt und für mindestens 1 h polymerisiert. Die Elektrophorese bei 100V (oder 25V über Nacht) und in 1x MOPS-Puffer durchgeführt. Als Größenstandard dient eine RNA-Leiter (o,24-9,5 kb, BRL). 133 4. Material und Methoden 4.9.4. Visualisierung von Nukleinsäuren 4.9.4.1. ... mit Ethidiumbromid Zur Färbung von Nukleinsäuren in Agarosegelen wird der gekochten Agarose Ethidiumbromid in einer Konzentration von 0,5 g/ml zugesetzt. Die Gele können im Anschluss an den Lauf gleich im UV-Licht betrachtet werden. Polyacrylamidgele werden nach der Elektrophorese in einem Ethidiumbromidbad (1 g/ml) unter leichtem Schwenken für 10 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt und anschließend unter UV-Licht analysiert und fotografiert. 4.9.4.2. ... durch Autoradiographie Befinden sich radioaktiv markierte Nukleinsäuren auf einem Agarose- oder Polacrylamidgel, das zu analytischen Zwecken angefertigt wurde, so werden solche Gele nach Trocknung in Expositionskassette für den Phoshorimager entwickelt. 4.10. Arbeiten mit eukaryotischen Zellkulturen 4.10.1. Kulturmedien und Lösungen Alle Reagenzien werden in "Millipore"-Wasser gelöst und sterilfiltriert (Porengröße 2 m). Pen/Strep (100x): 1,212 g Ampicillin/200ml (10.000 U/ml) 2 g Streptomycin/200 ml(10 mg/ml) zum lösen mit NaOH auf pH 7,0 einstellen, bei -20°C lagern PBS: 140 mM NaCl 27 mM KCl 7,2 mM Na2HPO4 14,7 mM KH2PO4 (pH 6,8 - 7,0) TEP: 500 ml steriles PBS 0,6 ml 0,5 M EDTA (Endkonz. : 6 mM) 15-20 ml Trypsin (0,1 - 0,2%; je nach Aktivität) Puromycin: 5 mg/ml in H2O, sterilfiltriert bei -20°C lagern G418: 100 mg/ml in H2O, sterilfiltriert bei -20°C lagern Hygromycin: 431660 U/ml (Chargen-abhängig), sterilfiltriert bei 4C lagern HEBS (2x): 280 mM NaCl 50 mM HEPES 1,5 mM Na2HPO4 (pH 7,1) 134 4. Material und Methoden DME-Medium: Man füllt Millipore-Wasser in 10 l Steilbrustflaschen, gibt die erforderliche Menge Pulvermedium (DME-Pulver von Flow) dazu und rührt mit einem Rührkern, bis das Medium vollständig aufgelöst ist. Nach Zugabe von 1/100 Volumen 1 M HEPES und 3,75 g/l NaHCO3 wird das Medium in sterile Flaschen filtriert. Die Flaschen werden zwei Tage bei Raumtemperatur inkubiert, um eventuelle Kontaminationen zu erkennen, und anschließend bei 4°C gelagert. Die Fertigstellung erfolgt bei Bedarf. 1/10 Volumen Serum, 1/100 Volumen Glutaminlösung (29,23 g/l) und 1 /100 Volumen Pen/Strep (Antibiotika) werden erst kurz vor Gebrauch zugesetzt. RPMI-Medium: Die Herstellung erfolgt, wie für das DME-Medium der entsprechenden RPMI-Trockensubstanz. Es werden 2,386 g/l HEPES, 1,68 g/l NaHCO3, 1/5000 Volumen ß-Mercaptoethanol hinzugesetzt. Die Fertigstellung erfolgt wie unter DME-Medium angegeben. Für adenovirale Infektionen von 293-Zellen wird Serum in 5 %iger Endkonzentration verwendet. 4.10.2. Zellinien NIH3T3: embryonale Mausfibrobasten-Zellen, ATCC CRL 1658 293: humane embryonale Nieren-Zellinie, Microbix PD-02-01 A549: humane Lungenkarzinom Zellinie, ATCC CCL-185 PT67: murine xenotrophe Verpackungs-Zellinie (Clontech) PA317: amphotrope Verpackungszellen (Miller und Buttimore, 1986) 42: ecotrope Verpackungszellen (Mann et al., 1983) 4.10.3. Kultivierung von Zellinien Grundsätzlich gilt, dass bei der Kultivierung von Zellen aufgrund des langsamen Wachstums auf extrem sterile Arbeitsbedingungen zu achten ist. So dürfen zuvor sterilisierte Geräte und Lösungen nur unter der sterilen Werkbank geöffnet werden. Die Zellen werden bei 37C und 5% CO2 in einem nassbegasten Brutschrank kultiviert. Für die verwendeten Zelltypen wird DME-Medium mit 10% FCS, 20 mM Glutamin, 60 g/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin verwendet. Die Zellen werden, wenn sie konfluent sind, umgesetzt (passagiert). 135 4. Material und Methoden 4.10.3.1. Passagieren Aus dem Kulturgefäß wird das Medium abgesogen und die adhärenten Zellen mit PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wird der Zellrasen mit einer minimalen Menge an TEP-Puffer bedeckt und die Zellen nach ungefähr einer Minute durch einen Handschlag von der Wachstumsunterlage abgelöst. Die Trypsinaktivität wird durch die sofortige Zugabe von dem 4fachen Volumen an serumhaltigen DME-Medium gestoppt (das verwendete Serum enthält Trypsininhibitoren). C243-Zellen werden ohne Trypsin-Behandlung durch mehrmaliges Abschlagen abgelöst. Ein Aliquot wird in ein neues Kulturgefäß überführt. 4.10.3.2. Langzeitlagerung Fast konfluent gewachsene Zellen einer mittleren Kulturflasche (ca. 1 x 107 Zellen) werden mit PBS gewaschen und wenn möglich mit 2 ml TEP abgelöst. Die Zellsuspension wird in 8 ml DME-Medium aufgenommen und 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt. Zum Waschen der Zellen werden diese in 5 ml PBS resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Die Zellen werden in 5 ml kaltem Einfriermedium (FCS mit 5% DMSO) aufgenommen, auf 5 vorgekühlte Einfrierröhrchen (Bio-Freeze-Vials, Fa. Costar) aliquotiert und sofort auf Eis gestellt. Die Röhrchen werden maximal 60 Minuten auf Eis belassen, anschließend in Zellstoff verpackt und in Styroporkästen bei -70C gelagert. Nach 12 Stunden können sie in flüssigen Stickstoff überführt und dort für längere Zeit gelagert werden. Das Auftauen der Zellen sollte möglichst schnell erfolgen. Dazu erwärmt man die Röhrchen im 37C-Wasserbad und nimmt die Zellsuspension in 10 ml Medium auf, um das DMSO zu verdünnen. Sobald die Zellen angewachsen sind, wird zur Entfernung von DMSO das Medium gewechselt. Für sehr empfindliche Zellen empfiehlt sich, das DMSO-haltige Einfriermedium sofort zu entfernen. Hierzu werden die aufgetauten Zellen in 10 ml Medium zu überführt, 5 min. bei 1000 UpM zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in frischem Medium aufgenommen. 4.10.3.3. Isolierung von Zellklonen Zur Isolierung von Zellklonen existieren mehrere Möglichkeiten: Zur Isolierung von Zellklonen werden Zellen nach der Transfektion oder Infektion so ausgesät, dass pro große Zellkulturplatte (141 cm2) maximal 40 Zellen anwachsen. Die herangewachsenen Zellklone werden unter dem Mikroskop zunächst sorgfältig markiert. Es können nur Klone isoliert werden, die einzeln und nicht in direkter Nachbarschaft zu anderen Klonen liegen. Nach dem Absaugen des Mediums werden die Zellen mit PBS gewaschen, und das PBS wird vollständig abgesaugt. 5 l TEP-Lösung werden direkt auf einen markierten Zellklon gegeben (die Zellkulturplatte muß dabei völlig waagerecht gehalten werden), und die abgelösten Zellen werden wieder aufgesaugt und in eine 24-Loch-Platte überführt. Alternativ können die Zellklone 136 4. Material und Methoden unter dem Mikroskop, welches man unter die Werkbank stellt, in der beschriebenen Art und Weise isoliert werden. Diese Vorgehensweise erleichtert die Isolierung, geht jedoch mit einer etwas größeren Kontaminationsgefahr einher. Infizierte oder transfizierte Zellen werden in einer 96-Loch-Platte so ausgesät, daß jedes Loch durchschnittlich weniger als eine einzelne Zelle erhält. In einer anschließenden mikroskopischen Kontrolle werden Löcher mit genau einer Zelle markiert. Diese heranwachsenden Klone werden sukzessive auf größere Zellkultur-Platten umgesetzt. 4.10.4. Gentransfermethoden 4.10.4.1. Transfektion mittels Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation 4.10.4.1.1. Stabile Expression (nach Graham & van der Eb, 1973; Wigler et al., 1977) Die Transfektion von isolierter Plasmid-DNA wird mit Hilfe von Calciumphosphat-Präzipitaten durchgeführt. Einen Tag vor der Transfektion werden die entsprechenden Zellen in neue Kulturflaschen umgesetzt (1-3x105 Zellen / 25 cm2). Vier Stunden vor der Transfektion wird ein Medienwechsel mit DME-Medium durchgeführt. 1-15 g der zu transfizierenden (zirkulären oder linearen) DNA werden (bei sehr geringen DNA-Mengen gegebenenfalls zusammen mit 5 g hochmolekularer DNA als sogenannte Carrier-DNA) in 250 l 250 mM CaCl2 suspendiert. Im Falle eines Cotransfers werden 5-15 g DNA und 0,5-1,0 g Selektionsmarker (jedoch höchstens 1/10 der DNA) eingesetzt. Die Lösung wird langsam unter ständigem Vortexen zu 250 l 2x HEPS-Puffer gegeben, wobei die DNA zusammen mit dem Calciumphosphat ausfällt. Man läßt die Lösung 5-30 min. präzipitieren. Anschließend werden die Präzipitate zum Nährmedium gegeben, 15 Stunden später erfolgt abermals ein Medienwechsel. Bei sehr empfindlichen Zellen kann nach 6-8 Stunden bereits ein Medienwechsel durchgeführt werden. Zwei Tage nach der Transfektion beginnt die Selektion auf stabil transfizierte Zellen durch Wechsel von DME-Medium auf Selektionsmedium. Dabei werden die Zellen auf mittlere Platten (55 cm2) umgesetzt. Der Medienwechsel wird alle 2-3 Tage wiederholt. Die Selektion ist in der Regel nach 7-14 Tagen abgeschlossen. Nach der Selektion können die Zellen als Mischung weiterverwendet oder subkloniert werden. Die zur Selektion verwendeten Drogenkonzentrationen sind vom Zelltyp abhängig und müssen vorher ausgetestet werden. Für die vorliegende Arbeit wurden folgende Konzentrationen verwendet: 137 4. Material und Methoden Zellinie G418 (g/ml) NIN3T3 1000 250 10 700-1000 90 -- A549 -- -- -- PA317 1000 200 10 PT67 1000 200 10 42 1000 200-250 10 293 Hygromycin (U/ml) Gancyclovir (M/ml) 4.10.4.1.2. Transiente Expression Die Herstellung der Präzipitate verläuft wie bei der stabilen Transfektion Bei dieser Methode kann auf die Verwendung von Selektionsplasmiden verzichtet werden, da die Expressionsbestimmung an der extrachromosomalen Fremd-DNA durchgeführt wird. Am ersten Tag nach der Transfektion werden die Präzipitate durch Mediumwechsel vom Zellüberstand entfernt. Am zweiten Tag können die Zellen auf die Expression des transfizierten Gens untersucht werden. In transienten Expressionsexperimenten (TEX) variiert die Transfektionseffizienz häufig sehr stark und ist nur begrenzt reproduzierbar. Sie hängt unter anderem vom physiologischen Zustand der Zellen und der Reinheit der transfizierten DNA ab. Daher muß bei jeder TEX gleichzeitig die Transfektionseffizienz bestimmt werden. Dazu wird eine konstante Menge eines Referenzplasmids mit einem zweiten Expressionsgen kotransfiziert. Die Expression des Referenzgens ist ein Maß für die Transfektionseffizienz. Die Reportergenexpression wird auf die Referenzgenexpression normiert, so daß sie unabhängig von der Transfektionseffizienz ist. Die Referenzgenexpression sollte in parallelen Ansätzen trotzdem nicht stark variieren (maximal Faktor 2 bis 3). Das Ergebnis transienter Transfektionen mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) bzw. mit GFP-Fusionsproteinen kann direkt in den lebenden Zellen mikroskopisch dokumentiert werden. Hierzu werden die Zellen in 6-Loch-Platten auf Deckgläschen ausgesät und transient mit Plasmiden transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion werden die Zellen mit PBS gewaschen und in einem dünnen Flüssigkeitsfilm auf einen Objekträger gebracht. Mit dem Mikroskop werden transfizierte Zellen bei 400 bis 1000-facher Vergrößerung (Ölimmersion) und einer Fluoreszenzanregung von 450-490 nm (FITC-Filter) identifiziert und fotografiert. 4.10.4.1.3. Transfektion mit Fugene Transfektionsreagenz Das Transfektionsprotokoll basiert auf dem Transfektionsreagenz Fugene von Boehringer Mannheim. 138 4. Material und Methoden Zur Transfektion werden 8x104 NIH3T3-Zellen pro 6-Loch ausgesät. Transfektion findet bei 50-80 %iger Konfluenz der Zellen statt (meist am folgenden Tag). Dazu wird in einem Eppendorfgefäß 3 l Fugene 6-Reagenz mit 97 l serumfreiem Medium für 5 min bei RT inkubiert. In einem zweitem Gefäß wird die DNA (normalerweise 2,5 g) vorgelegt. Der Inhalt des ersten Gefäßes wird nun unter vortexen tropfenweise zur DNA gegeben, und das Ganze 15 min bei RT inkubiert. Die Lösung wird direkt auf die Zellen gegeben. Medienwechsel erfolgt am nächsten Tag (nicht unbedingt notwendig). 2 Tage nach Transfektion werden die Zellen unter Selektionsdruck für stabile Expressionen weiter kultiviert. Soll ein transienter Assay durchgeführt werden, kann am Tag 2 nach Transfektion die Expression bestimmt werden. 4.10.4.2. Retrovirale Infektion von Säugerzellen 4.10.4.2.1. Infektion Beim retroviralen Gentransfer werden rekombinate Retroviren benutzt, um Fremdgene mittels Infektion in Zellen einzuschleusen. Die Infektion von Säugerzellen ist in der Regel eine sehr effiziente Gentransfermethode, die gegenüber der Transfektion vorzuziehen ist, wenn stabile Einzelkopieintegrate der zu transferierenden DNA erwünscht sind oder wenn sich Zellen nur schwer transfizieren lassen. Wählt man eine geeignete MOI (multiplicity of infection), so kann sogar nur eine Kopie pro Zelle erzielt werden, beispielsweise werden bei einer MOI von 0.01 statistisch gesehen 99 % aller Zellen einmal infiziert. Da die Nukleinsäure nur nach Auflösung der Kernmembran in den Kern gelangen kann (gilt für murine Viren), müssen sich die zu infizierenden Zellen jedoch zum Zeitpunkt der Infektion in Teilung befinden, d. h. sie dürfen nicht konfluent sein. Lösungen, Puffer, Substanzen, Material: Kulturgefäße, Sterilfilter (0.45 m), 5 ml Spritzen oder alternativ Costar Spin-X (0.45 m Filtereinsatz) Zellzähler oder Zählkammer Kristallviolett-Färbelösung PBS, TEP DME mit Serum, Selektionsmedium Polybren-Stocklösung (4 mg /ml) Virusproduzierende Zellen 1-2 x 105 Zellen pro Infektionsansatz, zusätzlich Zellen für den Titer-Assay Virusproduzierende Zellen (Verpackungszellen), die relativ hohe Titer zeigen (104 - 105 CFU / ml) werden so ausgesät, dass sie am übernächsten Tag (Tag der Infektion) subkonfluent sind. Virusproduzierende Zellen, die sehr geringe Titer zeigen, können auch so ausgesät werden, dass sie am Tag der Infektion konfluent sind. Am Vortag der Infektion wird ein Medienwechsel mit möglichst wenig Medium ohne Selektionsdruck (3-4 ml / 25 cm2 Flasche) durchgeführt 139 4. Material und Methoden (Produktionsmedium). Das Produktionsmedium sollte für mindestens 24 h auf den Produzenten verbleiben. Zusätzlich werden an diesem Tag die zu infizierenden Zellen ausgesät und zwar je nach Proliferationsrate der Zellen 1 - 2 x 105 Zellen / 25 cm2 Flasche. Soll zusätzlich der Titer der Virusproduzenten ermittelt werden, werden die zu infizierenden Zellen zusätzlich in 24 Lochplatten mit 5000 Zellen pro Loch ausgesät. Am nächsten Tag (Tag der Infektion) wird der Zellüberstand von den Produzenten abgenommen, mit Polybren (8 g / ml Endkonzentration) vermischt, filtriert (0.45 m Filter), um im Überstand befindliche Zellen abzutrennen, und in geeigneten Verdünnungen (im Polybren-haltigen Medium) auf die zu infizierenden Zellen gegeben. (Polybren erhöht die Effizienz der Infektion durch eine verbesserte Virusaufnahme.) Für maximal 700 l Virusüberstand können zur Filtration alternativ Costar Spin-X (0.45 m Filter, Zentrifugation 2000 Upm, 5 min.) verwendet werden. Für den Titer-Assay werden Verdünnungen bis 10-6 als Doppelbestimmungen in den 24-Lochplatten durchgeführt, nachdem das Medium gegen Polybren-haltiges Medium ausgetauscht wurde. Zur genauen Virustiterbestimmung muß die Zellzahl der Produzenten pro ml Produktionsmedium bestimmt werden (Zellzähler oder Zählkammer). 24 - 48 Stunden nach der Infektion wird das Medium gegen entsprechendes Selektionsmedium ausgetauscht, gegebenenfalls können die Zellen zu diesem Zeitpunkt auf andere Kulturgefäße umgesetzt werden, beispielsweise um Zellklone picken zu können. 7 - 12 Tage nach der Infektion können die Klone je nach Bedarf (Virustiterbestimmung) mit Kristallviolett angefärbt oder weiter passagiert werden. Die Virustiter wurden in dieser Arbeit als CFU/106 Produzentenzellen angegeben. Da sich Infektionsprotokolle unterscheiden können, sagt die Einheit “CFU / ml”, wie sie üblicherweise in der Literatur verwendet wird, nichts über die Verpackungseffizienz der mRNA eines retroviralen Provirus oder die Qualität von Verpackungszellen aus. 4.10.4.2.2. Berechnung der Infektionsmultiplizität Damit jede Zelle nur von einem Virus infiziert wird, muß eine kleine Infektionsmultiplizität (MOI) gewählt werden. Die MOI gibt die Anzahl der Viren pro Anzahl der zu infizierenden Zellen an. Mit der Poisson-Verteilung kann berechnet werden, wie viele Zellen mit 0, 1, 2 und mehr Viren bei definierter MOI infiziert werden. Poissonverteilung: P(k)= xk/k! x e-x, wobei P(k) die Wahrscheinlichkeit für k Ereignisse, k die Anzahl der Ereignisse (hier: Anzahl der Viren, die eine Zelle infizieren) und x die durchschnittliche Ereignisanzahl (hier: MOI) angibt. Für den hier angewendeten Fall lautet die Poissonverteilung: P(K) = MOIk/k! X e-MOI. Bei einer MOI = 0,01 (e-00,1 = 0,99) ergeben sich die folgenden Wahrscheinlichkeiten: P(0) = 1/1 x 0,99 = 0,99 99 % der Zellen werden nicht infiziert. 140 P(1) = 0,01/1 x 0,99 = 9,9 x 103 4. Material und Methoden 0,99 % der Zellen werden mit einem Virus infiziert. Wenn 105 Zellen infiziert werden, bedeutet das, daß 990 Zellen mit einem Virus und 10 Zellen mit zwei oder mehr Viren infiziert werden. Es sind also 1 % der infizierten Zellen mit mehreren Viren infiziert, wenn die MOI gleich 0,01 ist. Bei den Experimenten lag die MOI deutlich unter diesem Wert. 4.11. Herstellung von Adenoviren 4.11.1. Transfektion von 293 LP-Zellen (Calciumphosphat-Präzipitation) Material und Lösungen: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) $ DNA-Lösung (1 g/ml in TE 10/0,1) 2x HEBS-Puffer CaCl2- Lösung (2,5 M) Millipore-Wasser DME-Medium / 10% FCS MEM-Medium / 10% FCS MEM-Medium / 5% FCS sterile ...5 ml Röhrchen sterile, konische 12 ml PS-Röhrchen Vortex Mikroliterpipetten Clean Bench CO2-begasbarer Brutschrank Aussäen der Zellen in MEM-Medium / 10 % FCS, so daß sie am Tage der Transfektion 80 bis 90 % konfluent sind. Vier Stunden vor der Transfektion wird ein Medienwechsel mit DMEMedium (10 % FCS) durchgeführt (22,5 ml). Für die Transfektion werden pro mittlere RouxFlasche 1105 l H2O, 125 l CaCl2- Lösung (2,5 M) und 20 l DNA-Lösung (1 g/l) in einem sterilen 5 ml Transfektionsröhrchen vermischt. Die Lösung wird langsam unter ständigem Vortexen zu 1250 l 2x HEBS-Puffer gegeben (konisches 12 ml PS-Röhrchen), wobei die DNA zusammen mit dem Calciumphosphat ausfällt. Man läßt die Lösung 60 min. präzipitieren. Anschließend werden die Präzipitate (2,5 ml) zum Nährmedium gegeben. Nach etwa 16 Stunden wird ein Medienwechsel mit MEM / 5% FCS durchgeführt. Anschließend erfolgt eine Inkubation im Brutschrank bei 37 oC / 5% CO2. Es ist in regelmäßigen Abständen ein Medienwechsel durchzuführen. Die mikrokopische Kontrolle der Transfektion (Phasenkontrast/Fluoreszenz) erfolgt am Tag 2/3, 10, 14 und je nach Stärke des zytopathischen 141 4. Material und Methoden Effektes dann in kürzeren Abständen. 4.11.2. Zellernte nach Transfektion Die transfizierten Zellen werden von einer mittleren Roux-Flasche vorsichtig im Medium abgeschabt und geerntet (2 bis 3 Wochen nach Transfektion, wenn der zytopatische Effekt deutlich sichtbar ist) (Zellschaber der Länge 23 cm verwenden). Die Zellsuspension wird in ein 50 ml Nunc-Röhrchen überführt und bei 1000 rpm., 10 min. und 4 oC zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und bei - 70 oC gelagert. Das Zell-Pellet wird in 5 ml PBS++ ohne Pipettieren gelöst. Zum Freisetzen der Viren werden die Zellen bei -70 oC eingefroren (dauert etwa 10 min.)(gegebenenfalls bei -70 oC bis zur weiteren Verarbeitung lagern). Die Zellen werden anschließend bei 37 oC im Wasserbad aufgetaut und sofort wieder bei -70 oC eingefroren. Der Vorgang des Einfrierens und wieder Auftauens wird insgesamt 3 mal durchgeführt (Freeze-Thaw-Lysat FTL). Die Zelltrümmer werden bei 1200 rpm., 10 min., 4 oC abzentrifugiert und die Lysatüberstände (primärer Virusstock) zur Prä-Infektion eingesetzt. 4.11.3. Prä-Infektion $ $ $ $ $ $ $ $ $ Clean Bench CO2-begasbarer Brutschrank Wippe 50 ml Röhrchen 100 ml Standzylinder Pipettierhilfe Plastikpipetten (5 ml) PBS/ 2% FCS MEM / 5% FCS (hitzeinaktiviert: 45 min., 56 oC), sterilfiltriert Die Virusverdünnung wird im sterilen 50 ml Röhrchen hergestellt: Virusstock (FTL-Überstand aus der Transfektion) 1:10 in PBS / 2%FCS. Das Medium der großen Kulturflaschen mit konfluent gewachsenen 293-Zellen wird abgegossen und mit 5 ml verdünnte Virussuspension bedeckt (Standard: Infektion von 2 großen RouxFlaschen). Die Virussuspension inkubiert 1 Std.bei RT auf dem Rocker. Anschließend wird 45 ml MEM / 5% FCS (Abmessung und Zugabe mit 50 ml Falcon-Röhrchen) zugegeben und bei bei 37 oC / 5% CO2 im Brutschrank inkubiert, bis nach 3-4 Tagen ein deutlicher zytopatischer Effekt zu sehen ist. 142 4. Material und Methoden 4.11.4. Zellernte zur Herstellung des sekundären Virusstocks: Freeze-Thaw-Lysates $ $ $ $ $ $ $ $ $ Clean Bench Ständer für 50 ml Röhrchen Zell-Scraper (Länge 32 cm) 50 ml Nunc-Röhrchen Plastik-Pipetten (5 und 10 ml) Pipettierhilfe (Pipetboy) Heraeus-Benchtop-Zentrifuge, kühlbar mit Einsätzen für konische 50 ml Röhrchen Gefrierschrank - 70 oC PBS++ Die infizierte Zellen von 2 großen Roux-Flaschen werden vorsichtig im Medium abgeschabt und nacheinander in ein 50 ml Nunc-Röhrchen überführt. Die Zentrifugation erfolgt bei 1000 rpm., 10 min., 4 oC. Der Überstand wird abgegossen, die 2. Zellsuspension zu dem 1. Pellet geben und erneut wie oben zentrifugieren. Überstand abnehmen und bei - 70 oC lagern. Die Pellet werden in 10 ml PBS++ ohne Pipettieren gelöst und Freeze-Thaw-Lysats gemacht. Zum Abtrennen der Zelltrümmer wird bei 1500 rpm., 10 min., 4 oC zentrifugiert. Die Lysatüberstände können zur Infektion zur Herstellung des präparativen Virusstocks eingesetzt werden Anmerkungen: Die Zellernte erfolgt, wenn der zytopathische Effekt deutlich sichtbar ist: die meisten Zellen sind abgerundet und zum Teil abgelöst. Dies ist in der Regel 3-4 Tage nach Infektion der Fall. 4.11.5. Adenovirale Infektion (von 32 großen Roux-Flaschen mit gerade konfluent bewachsenen 293-Zellen zur Herstellung eines präparativen Virusstocks) $ $ $ $ $ $ $ $ $ Clean Bench CO2-begasbarer Brutschrank Wippe steriles Plastik-Einmalgefäß für Virussuspension / 2000 ml Glas-Sammelgefäß 50 ml Falcon-Röhrchen Pipettierhilfe Plastikpipetten (5 ml) PBS/ 2% FCS MEM / 5% FCS (hitzeinaktiviert: 45 min., 56 oC), sterilfiltriert Virusverdünnung herstellen: Virusstock 1:100 in PBS / 2%FCS: 170 ml + 1,7 ml der sekundären Virussuspension (Rest nach der Infektion verwerfen). Medium der großen Kulturflaschen abgießen (jeweils in Gruppen von vier großen Roux-Flaschen arbeiten). Medientropfen am 143 4. Material und Methoden Flaschenhals mit einer sterilen Pasteurpipette absaugen. Pro große Roux-Flasche werden 5 ml Virussuspension mit einer 5 ml Plastikpipette zugegeben und 1 Std. bei RT auf einer Wippe mit niedriger Wipp-Geschwindigkeit inkubiert. Anschließend werden 45 ml MEM / 5% FCS (Abmessung und Zugabe mit 50 ml Falcon-Röhrchen) zugegeben und im Brutschrank bei 37 oC / 5% CO2 inkubiert. 4.11.6. Präparative Zellernte nach Virusinfektion $ $ $ $ $ $ $ $ $ Clean Bench Ständer für 50 ml Röhrchen Zell-Scraper (32 cm) 50 ml Nunc-Röhrchen Plastik-Pipetten (5 und 10 ml, kurz und lang) Pipettierhilfe Heraeus-Benchtop-Zentrifuge, kühlbar mit Einsätzen für konische 50 ml Röhrchen Gefrierschrank - 70 oC 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 Die Zellernte erfolgt, wenn ein deutlich zytopathischer Effekt sichtbar ist (3 bis 3 ½ Tage nach der Infektion). Die Zellen von 8 großen Flaschen werden vorsichtig im Medium abgeschabt (1 lange Plastikpipette und 1 Scraper pro 8 große Roux-Flaschen, dann wechseln oder nach Bedarf) und in 50 ml Nunc-Röhrchen überführt: Zellen von 8 großen Roux-Flaschen in 8 Röhrchen sammeln und bei 1000 rpm., 10 min., 4 oC zentrifugieren. Der Überstand wird abgossen (und in 2000 ml sterilem Glasgefäß sammeln) und die nächsten 8 gescrapten Zellsuspensionen mit einer 10 ml Plastikpipette zu dem jeweils 1. Pellet zugeben. Zentrifugation 1000 rpm., 10 min., 4 oC usw. Zellen werden zu einem Pellet gepoolt (entspricht 1. Waschschritt): zu den acht gepoolten Zellpellets werden jeweils 5 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8.0 zugegeben, resuspendiert und in ein neues 50 ml Röhrchen überführt; alle acht Röhrchen mit insgesamt 5 ml 0,1 M Tris-Lösung (d.h. dieselben 5 ml nacheinander in alle acht Röhrchen überführen) werden gespült und zum Pool geben. Zentrifugation 1000 rpm, 10 min., 4 oC. Der Überstand wird mit einer10 ml Plastikpipette abgenommen und das Pellet noch zweimal gewaschen (2. und 3. Waschschritt) mit 30 ml 0,1 M Tris-HCl pH 8.0 mit anschließender Zentrifugation (s.o.) umgepuffert. Das gesamte Zellpellet wird mit 3 ml Tris-HCl überschichtet und durch Schütteln leicht vermischt. Lagerung bei -70C. 4.11.7. Virus-Aufreinigung mittels CsCl-Ultrazentrifugation $ Ultrazentrifuge TL 100 mit Rotor TLA 110 $ Zentrifugenröhrchen: Quick-Seal Polyallomer-Zentrifugenröhrchen, Kapazität 5,1 ml (13 x 144 $ $ $ $ $ $ $ $ 4. Material und Methoden 51 mm (½ x 2 inches) (Bestell-Nr. 362248) Gerät zum Verschweißen der Zentrifugen-Röhrchen Benzonase (Benzon Nuclease), Merck Art. 1653 (10.000 U/ml) Desoxycholat (5 %ig), bei Raumtemperatur lagern) CsCl-gesättigter TE-Puffer (0,01 M Tris, 0,001 M EDTA, beide pH 8,0) 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0 Eisbad Ultraschallgerät: Bandelin Sonopuls GM 200 Das bei -70 oC eingefrorene Viruspellet (50 ml Nunc-Röhrchen) wird im 37 oC Wasserbad aufgetaut (dabei durch leichtes Schütteln vermischen). 1/10 Volumen Desoxycholat (5 %) wird zugegeben und durch Schwenken gemischt. Inkubation 30 min. auf Eis. Zugabe von 3 l Benzonase ( pro Pellet von 32 großen Roux-Flaschen) und Inkubation 30 - 70 min bei RT (bis sich nach deutlicher Abnahme der Viskosität diese nicht mehr verändert), zwischendurch wird vorsichtig gemischt. Danach folgt eine indirekte Ultraschallbehandlung der Lösung: max. / Intervall 50 % / ca. 2 x 2 min (zwischendurch schwenken) , bis die Lösung dünnflüssig ist. Zentrifugation 2000 rpm., 10 min., 4 oC. Der Überstand wird abgenommen , in ein neues Röhrchen überführt und mit gesättigter CsCl-Lösung vermischt. Beschickung des CsCl-Gradienten: pro 3,1 ml Virussuspension Zugabe von 1,8 ml gesättigter CsCl-Lösung (Raumtemperatur; vorher gut aufschütteln und anschließend sich nicht gelöstes CsCl absetzen lassen). Hierzu wird die Virussuspension auf die entsprechende Anzahl an Gradienten aufgeteilt und gegebenenfalls mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 auf 3,1 ml aufgefüllt. Das Einfüllen der Virussuspension / CsCl-Lösung erfolgt mit einer sterilen Pasteurpipette und Pipettierhilfe (sehr vorsichtig und langsam einfüllen, Schaumbildung unbedingt vermeiden). Die Röhrchen werden mit 0,1 M Tris-Cl / gesätt. CsCl-Lösung (3,1:1,8) austariert, die restlichen Rotorplätze mit Tara-Röhrchen belegt (befüllt mit 0,1 M Tris-Cl / gesätt. CsCl-Lösung (3,1:1,8) Das Verschließen der Röhrchen erfolgt mit einem Quick-Seal-Schweißgerät. Zentrifugation im TLA 110-Rotor, 47.000 rpm., 4 oC, 13 Stunden. Das Ernten der Virusbande erfolgt in einer Edelstahl-Wanne (Plastikschale mit 2 LagenKleenex unterlegen): Das Zentrifugenröhrchen wird am oberen Ende in ein Stativ (in Edelstahlwanne) eingespannt (dunklen Hintergrund verwenden) und mit einer G23-Kanüle oben eingestochen. Mit einer sterilen 2 ml Spritze mit einer G20-Kanüle wird vorsichtig ca. 3mm unterhalb der Virusbande eingestochen und die Virusbande vorsichtig abgezogen. (Die Virusbande sollte sich in der Mitte des CsCl-Gradienten befinden. Deutlich höher gelegene zusätzliche Banden können sich durch leere Virushüllen und Reste chromosomaler DNA ergeben). Die Kanüle wird entfernt und die Virussuspension vorsichtig in ein steriles Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Virushaltige Suspension (Volumenbestimmung mit Mikoliterpipette) wird mit Tris/CsCl-Mischung (3,1:1,8) 145 4. Material und Methoden auf 4,9 ml aufgefüllt, gemischt und in die Zentrifugen-Röhrchen eingefüllt, austariert und zugeschweisst. Die restlichen Rotorplätze werden mit Tara-Röhrchen belegt (befüllt mit 0,1 M Tris-Cl / gesätt. CsCl-Lösung (3,1:1,8). Verschließen der Röhrchen mit Quick-SealSchweißgerät. Zentrifugation im TLA 110-Rotor, 47.000 rpm., 4 oC, 13 Stunden. Ernten der Virusbanden wie beschrieben. Anschließend wird mit einer Mikroliterpipette eine Volumenbestimmung durchgeführt und die aufgereinigte Virussuspension in ein Kryoröhrchen überführt und bei 4 oC im Kühlschrank gelagert. 4.11.8. Infektion zur Herstellung von Virus-DNA Gerade konfluent gewachsene Zellen einer 6-Loch-Platte werden mit 1 ml einer geeigneten Virusverdünnung (in PBS / 2 % FCS) gemäß dem allgemeinen Infektionsprotokoll (Medium absaugen, Zugabe der Virusverdünnung, 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Rocker) infiziert, anschließend werden pro Loch 4 ml MEM / 5 % FCS zugegeben und im Brutschrank unter Standardbedingungen solange inkubiert, bis sich ein deutlich zytopathischer Effekt zeigt. Zellernte und Aufschluß: Material und Lösungen: $ Pronase-Stock-Lösung: 0,5 g Pronase in 100 ml 10 mM Tris-Cl pH 7,5 $ Pronase-Puffer: 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % (w/v) SDS, frisch angesetzt $ Pronase-Arbeitslösung: Pronase-Stock-Lösung 1:10 in Pronase-Puffer verdünnen Zellaufschluß: Die 6-Loch-Kultur-Platte sollte ca. 20 bis 30 min. ruhig unter der Bench stehen. Danach wird das Medium vorsichtig mit einer 1000 l Pipette bei jedem Loch einzeln abgezogen und 1 ml Pronase-Arbeitslösung pro Loch zugegeben. Inkubation für 18 bis 20 Stunden bei 37 oC, 5 % CO2 im Brutschrank. Anschließend wird die hoch viskose Lösung mit einer 1000 ml Pipette langsam und vorsichtig in ein 15 ml Röhrchen überführt und dabei das Volumen bestimmt. 4.11.8.1. Herstellung von Virus-DNA $ Phenol (Fa. Roth) $ Chloroform/Isoamylalkohl (24:1) $ 50 ml Nunc-Röhrchen $ Plastikpipetten $ Pipettierhilfe $ absolutes Ethanol $ 70 %iges Ethanol $ Pasteurpipetten 146 $ $ $ $ $ $ $ 4. Material und Methoden TE-Puffer (10/1), pH 8,0 -20 oC Gefrierschrank Head-Over-Head-Schüttler Heizplatte gekühlte Benchtopzentrifuge Abzug Absaugvorrichtung Die hoch viskose Lösung wird (siehe oben) mit TE (10/1), pH 8,0 auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml aufgefüllt und 1 Volumen Phenol zugegeben. 30 min wird im Head-Over-Head gemischt und anschließend 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohl (24:1) zugegeben. 15 min Head-OverHead. Zentrifugieren bei 5 min., 2500 rpm., 16 oC, anschließend wird der Überstand vorsichtig abgenommen und in ein neues 50 ml Röhrchen überführt. Der Chloroform/Isoamylalkohl (24:1)-Waschschritt wird noch zweimal wiederholt. Dann wird zum Überstand 2-2,5 Volumen absolutes Ethanol (eiskalt) hinzugefügt und 1 h bei -20 oC inkubiert. Zentrifugieren bei 30 min, 3000 rpm, 4 oC, anschließend dekantieren und über Kopf abtropfen lassen. 1-2 ml 70 %iges Ethanol (eiskalt) wird zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Zentrifugation und Waschschritt werden wiederholt. Die restlichen Ethanol-Tropfen werden mit einer Pasteurpipette abzogen, das Pellet auf der Heizplatte bei 37 oC leicht getrocknet, in 200 l TE (10/1) aufgenommen und bei 4 oC (gegebenenfalls über Nacht) gelöst. 4.11.8.2. Restriktionskartierung (z. B. EcoRI und HindIII) $ Virus-DNA $ Kontroll-Cosmid-DNA $ Enzym-Puffer (10fach) $ Restriktionsenzym $ Millipore-Wasser $ Gelladepuffer (5fach) $ -Marker (HindIII/EcoRI und HindIII) $ Ethidiumbromid (5 mg/ml) $ 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße $ Mikroliter-Pipetten mit sterilen Spitzen $ Eisbad $ TAE-Puffer (pH 8,0) $ Virus-DNA: pro Ansatz*: 5 - 10 l Virus/HMW-DNA in TE (10/1), pH 8,0 2 l Enzym-Puffer (10fach) 0,5 l Enzym (40 - 100 Unit/l) 147 4. Material und Methoden In 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit Millipore-Wasser auf 20 l auffüllen und anschließend 3 h bei 37 oC inkubieren $ anschließend 5 min. auf Eis stellen und bis zum Auftrag auf das Agarose-Gel bei 4 oC lagern $ Cosmid-DNA: pro Ansatz*: 0,5 - 1,0 g DNA (Kontrolle) 2 l Enzym-Puffer (10fach) 1 l Enzym (10 Unit/l) mit Millipore-Wasser auf 20 l auffüllen und anschließend 2 - 3 h bei 37 oC inkubieren Für mehrere Ansätze wird zunächst ein Mix aus Enzym-Puffer, Millipore-Wasser und Enzym hergestellt, entsprechend auf Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilt, und die jeweilige DNA wird dann hinzupipettiert. Auftrag der Proben auf ein Agarose-TAE-Gel. 4.11.9. Virus-Titer-Bestimmung (wird mindestens als Doppelbestimmung durchgeführt) $ $ $ $ $ $ $ $ gerade konfluente 293 (LP)-Zellen einer oder mehrerer 24-Loch-Platten 24-Loch-Platten Rocker Elektrapette (250 l und 1250 l) und entsprechende gestopfte sterile Pipettenspitzen Pipettierhilfe Plastikpipetten (5 ml) PBS/ 2% FCS MEM / 5% FCS (hitzeinaktiviert: 45 min., 56 oC), sterilfiltriert Herstellung der Masterplatten: Virus-Verdünnungen in 24-Loch-Platten: (abhängig vom geschätzten Virustiter) Standard: 10-4 bis 10-14 über zwei 24-Loch-Platten. Die letzte Reihe der zweiten 24-Loch-Platte dient als MOCInfektion; Masterplatten entsprechen beschriften. Vorverdünnung der Virusstocks bis 10-2 in PBS / 2 % FCS im Eppendorf-Reaktionsgefäß In die Löcher der ersten Reihe werden 990 l, in alle weiteren 900 l PBS / 2 % FCS mit der Elektrapette vorgelegt. In die erste Reihe werden 10 l der jeweiligen Virussuspension (10-2 Verdünnung) einzeln mit einer Mikroliterpipette pipettiert. (Programmierung der Elektrapette: Zwei Mischzyklen mit 700 l Mischvolumen, 100 l Ansaugvolumen, 100 l Ausgabevolumen). In der ersten Reihe wird mit dem Mischen begonnen, neue Pipettenspitzen genommen und anschließend 100 l angesaugt, in die zweite Reihe gegeben und anschließend gemischt und neue Pipettenspitzen genommen. Der Vorgang wird mit den nächsten Reihen wiederholt. Die Masterplatten können bei -20 oC gelagert werden. 148 4. Material und Methoden Virusinfektion: Die gerade konfluent mit 293 (LP)-Zellen bewachsenen 24-Loch-Platten werden entsprechend der Virusverdünnungen beschriftet. Das Medium wird abgesaugt. Mit der MultikanalElektrapette wird in einer Reihe gleicher Verdünnung jeweils 200 l Virusverdünnung pro Loch hinzupipettiert. Es wird jeweils bei der höchsten Verdünnung begonnen: hierzu von der Masterplatte jeweils 200 l der höchsten Verdünnung einer ganzen Spalte (mit der MultikanalElektrapette) ansaugen, in die entsprechende beschriftete Reihe auf die 293-Zellen pipettieren (am Rand hinzugeben), von der Masterplatte 200 l der nächst niedrigeren Verdünnung entnehmen, auf die entsprechenden Zellen geben usw. Die Inkubation der Zellen erfolgt auf dem Rocker: 60 min. bei Raumtemperatur. Anschließend wird mit einer sterilen 5 ml Plastikpipette jeweils 1 ml MEM/5 % FCS pro Loch hinzugefügt und bei 37 oC im 5 % CO2 begasten Brutschrank inkubiert. Anmerkung: mit jeder sterilen Plastikpipette wird nur einmal Medium aufgenommen, danach wird eine neue Pipette verwendet. Auswertung: $ Die Bestimmung der GTU (Gentransfer-Units) erfolgt am dritten Tag nach der Infektion mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und einer Videokamera: Objektiv: 10fach Vergrößerung, plan, FITC-Filter: es wird die Anzahl von Zellen mit grüner Fluoreszenz (GFP-Expression) am Bildschirm bei vier unterschiedlichen, zufällig ausgewählten Ausschnitten ausgezählt. $ Die Bestimmung der PFU (Plaque-forming Units) erfolgt am zehnten Tag nach der Infektion mittels einer Kombination aus Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Mikroskopie: Objektiv 10fach, plan, gegebenenfalls FITC-Filter: es wird die Gesamtzahl der sichtbaren Plaques pro 24-Loch im Phasenkontrast ausgezählt. Die Plaque-Kontrolle erfolgt mittels Fluoreszenz: die Plaques sind von grün-fluoreszierenden (GFP-exprimierenden Zellen) umgeben. $ Bestimmung der PFU/ml: Anzahl der Plaques pro Loch einer 24-Loch-Platte x 5/Virusverdünnung 4.11.10. Infektion nicht permissiver Zelllinien Die Infektion nicht permissiver Zellinien erfolgt mit Adenoviren des sekundären Virusstock oder aus CsCl-aufgereinigten Virusstocks genau wie bereits für 293-Zellen beschreiben. Da mit genauen MOIs infiziert wird muß zuvor für die verwendeten Virusstocks die Titer ermittelt werden. Unterschiedliche Zellinien benötigen nach dem Infektionsprozess unterschiedliche Kulturmedien. Die verwendeten Medien sollten soweit das möglich ist auf 5 % FCS reduziert werden. 149 4. Material und Methoden 4.12. Proteinanalytik 4.12.1. Fluorescence activated cell sorting (FACS-Analysen) 4.12.1.1. Indirekte Immunfluoreszenz Die Immunfluoreszenz dient zum in situ Nachweis von zellulären Antigenen. Dabei benutzt man spezifische Antikörper, an die ein fluoreszierender Farbstoff gebunden ist. Bei der indirekten Immunfluoreszenz wird zunächst ein unmarkierter Antikörper zu den zu untersuchenden fixierten Zellen gegeben und anschließend ein mit fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelter anti-Immunglobulin Antikörper, der den ersten spezifisch erkennt, hinzugegeben. Mikroskopisch läßt sich die Lokalisierung der Antigene bestimmen. Adhärente Zellen werden auf Deckgläschen wachsen gelassen. Die Zellen sollen mitteldicht und einlagig angewachsen sein. Um intrazelluläre Antigene zu analysieren, erfolgt eine Fixierung der Zellen mit einem eiskalten Gemisch aus Methanol/Aceton (1:1) bei -20°C für 5 min, was gleichzeitig zu einer Permeabilisierung der Zellen führt. Alternativ wird mit 4% Paraformaldehyd fixiert (für GFP-Nachweis). Nach der Fixierung, wobei ein Austrocknen der Zellen sorgfältig vermieden werden muß, werden die Zellen dreimal mit PBS mit 3 % BSA gewaschen. Das BSA verhindert unspezifische Bindungen der Antikörper. Vor Zugabe des ersten Antikörpers werden die Zellen einmal mit PBS plus 0,1% Saponin gewaschen. Es folgt die Zugabe des ersten Antikörpers, der spezifisch das gewünschte Antigen erkennt. Dazu werden 30 l in PBS/0,1 % Saponin verdünnte Antikörper-Lösung auf eine gespannte ParafilmOberfläche aufgetropft und das Deckgläschen auf diesen Tropfen gelegt, so daß die Zellen auf einem dünnen Film aus Antikörper-Lösung liegen. Es wird für 1 h bei RT inkubiert. Die Zellen werden anschließend dreimal mit PBS/0,1 % Saponin gewaschen. Der zweite Antikörper wird unter den gleichen Bedingungen eingesetzt, wobei im Dunkeln gearbeitet und inkubiert wird. Darauf werden die Zellen dreimal mit PBS/0,1% Saponin und abschließend zweimal mit H2O gewaschen. Das Deckgläschen wird mit den Zellen nach unten in einem kleinen Tropfen Elvanol auf einem Objektträger eingedeckelt. Das Präparat muß 1 h bei RT trocknen und wird im Dunkeln aufbewahrt. Elvanol: 1g Mowiol (Calbiochem), 4 ml PBS, 2 ml Glycerin 4.12.1.2. GFP-Fluoreszenz+ PBS*: Pbs mit 2% FCS sowie je 1% Pen/Strep und Glutamin. Die Lösung wird anschließend sterilfiltriert (0,2 m Filter). PBS*/PI: PBS* mit Propidiumiodid (0,5 g/ml) Im Gegensatz zur indirekten Immunfluoreszenz ist es mit Hilfe des green fluorescent proteins 150 4. Material und Methoden (GFP oder enhanced GFP, eGFP) möglich die GFP-exprimierenden Zellen im FACS direkt zu detektieren. Dazu werden Zellen einer 6-Loch-Platte mit 0,5 ml TEP abgelöst und in 4ml PBS* verdünnt. Nach Zentrifugation (5 min, 1000 UpM, 4C) wird der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 400 l PBS+PI gelöst. Sie können jetzt direkt der FACS-Analyse zugeführt werden. Das PI dient während der FACS-Analyse zur Ausgrenzung von beschädigten Zellen, die rot angefärbt werden. So werden in der Auswertung nur lebende Zellen berücksichtigt. Als Kontrollen dient jeweils die nicht transduzierte Zelllinie. Die Analyse wird am FACScan oder am FACS calibur von Becton Dickinson durchgeführt. 4.12.1.3. Viruspartikelfärbung Die Viruspartikel-Färbung mit Hilfe spezifischer Antikörper dient der Visualisierung der Anzahl der aus den Verpackungszellen ausgeschleusten viralen Partikel. Dabei besagt die analysierte Virusmenge nichts über den viralen Titer aus, da die detektierte Partikelmenge sich sehr stark von der Anzahl der infektiösen Partikel unterscheidet. 1x PBS**: Waschlösung: PBS + 0,01% MgCl2, 0,01% CaCl2 1x PBS** + 1 % BSA, 1 % FCS, 0,1 % Tween20 Absättigungslösung:1x PBS** + 1% BSA, 1% FCS Beads: Molecular Probes, Eugene Fluospheres, carboxylate-modified microsheres, 0,1 m, red fluorescent (580/605) 48 l filtrierter (0,45 m Filter) virushaltiger Produktionszellüberstand wird mit 1 l Polybrene (0,4 mg/ml) und 1 l Beads (7,2x105/l) vermischt und auf einen Glas-Objektträger mit einer etwa 1 cm2 großen abgeklebten Fläche aufgebracht und 1 h inkubiert (Viren und Beads binden and den Träger). Danach wird mit Waschlösung gewaschen (mit einer Pipette Lösung auftropfen und absaugen) und 15 min abgesättigt. Dabei muß darauf geachtet werden, dass die gesamte Fläche mit der entsprechenden Lösung bedeckt wird. Es folgt eine 45 minütige Inkubation mit dem ersten Antikörper (anti-env-Ratte; 1:400 - 1:1000 verdünnt). Nach 5 Waschschritten erfolgt eine 45 minütige Inkubation mit dem zweiten FITC-markierten Antikörper (anti-Ratte-FITC; 1:150 verdünnt). Nach 5 maligem Waschen wird der Objektträger mit Einschlussmedium (Dako) überschichtet. Nach Trocknung kann die Viruspartikelzahl unter dem Mikroskop mit Hilfe einer CCD-Kamera bestimmt werden. Als Standard dient dabei die Anzahl der rotmarkierten Beads. Zur Auswertung werden 5 Stellen definierter Größe fotografiert und die Anzahl der Viruspartikel ausgezählt. 151 4. Material und Methoden 4.12.2. Bilddokumentation und -bearbeitung Die Bilddokumentation von fluoreszierenden Zellen oder Viren erfolgt entweder durch direktes Belichten des Mikroskop-Bildes auf einen Diafilm (Fujichrome Sensia 400) oder über eine digitale CCD-Kamera (Photometics PXL 1400, Grade 2). Die Auflösung der Kamera beträgt 1317 x 1035 Pixel. Standardmäßig wurde bei Verwendung der CCD-Kamera ein 63er Ölimersionsobjektiv benutzt. Die erhaltenen Daten-Bilder wurden mit Hilfe der Software IPLab Spectrum der Firma SignalAnalytics bearbeitet. Dies beinhaltete: Kolorierung der s/w Bilder; Normalisierung auf einen gleichmäßigen Hintergrundwert; Prozessierung auf 8 bit TIFF-Bilder. 4.12.3. Verwendete Antikörper Folgende Antikörper mit Angabe der Standard-Verdünnung wurden verwendet. Abweichungen hiervon sind in den entsprechenden Bildunterschriften angegeben. Antikörper Firma Herkunft Verdünnung Hyb83A25 NIH Ratte 1:500 Ratte 1:400 1:1000 Ziege 1:150 Anit-Env-Ratte Anti-Ratte-FITC Dianova 4.12.4. Herstellung von Zellextrakten für Reportergen-Assays Zellen einer 6-Lochplatte werden mit PBS gewaschen und in PBS oder TEN-Puffer abgelöst. Sie werden durch Zentrifugieren (5 min, 1000 UpM) pelletiert und in 100-150 l 250 mM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Durch dreimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und schnellem Auftauen bei 37C werden die Zellen aufgeschlossen. Die Zelltrümmer werden abzentrifugiert (10 min, 13000 UpM). TEN-Puffer: 40 mM Tris/HCl, pH 7,5 1 mM EDTA 150 mM NaCl 4.12.5. Bradford-Proteinbestimmung (Mikroassay) Bradfordlösung: 70 mg Coomassie Brilliant Blue G 250 (Fa. Serva) in 50 ml abs. Ethanol lösen, 100 ml 85 %ige (w/v) Phosphorsäure zugeben, ad 1 l mit aqua bidest. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden und ist ca. 152 4. Material und Methoden 3 Monate haltbar. Alternativ wurde eine Bradford-Lösung von Biorad (1:5 verdünnt) verwendet. In eine 96-Lochplatte werden in die Löcher der ersten Reihe 190 l H2O vorgelegt, in alle anderen 100 l. 10 l der Eichproteinlösung (1 mg/ml Lysozym) bzw. der zu messenden Proben werden in die Löcher der ersten Reihe dazu pipettiert. Mit einer Multikanalpipette wird gut durchmischt, 100 l entnommen und in die zweite Reihe gegeben. So fährt man fort und erhält jeweils eine 1:2-Verdünnung. Nach Zugabe von 100 l Bradfordlösung in jedes Loch können die Proben nach 2 min im ELISA-Reader bei 595 nm gemessen werden. Aus den gemessenen Eichwerten läßt sich eine Eichgerade erstellen, aus der der Proteingehalt der Proben direkt ermittelt werden kann. 4.12.6. Luziferase Nachweis (Aktivitätstest nach Williams et al., 1989) Das Luziferasegen des Leuchtkäfers Photinus eignet sich aufgrund der Biolumineszenz der Luziferin-Luziferasereaktion und deren empfindlichen Nachweises im Luminometer als Reportergen in rekombinanten höheren Zellen. Reaktionspuffer: 25 mM Glycylglycin, pH 7,8; 15 mM MgSO4 1/5 25 mM ATP (Endkonzentration: 5mM) frisch hinzufügen Luziferinlösung: 0,2 mM Luziferin in 25 mM Glycylglycin, pH 7,8; (D-Luziferin, synthetisch) Subkonfluente Zellen einer 6-Loch-Platte werden 2 x mit PBS gewaschen und anschließend in 1 ml PBS geerntet. 50 l Zelllösung werden zur Zellzahlbestimmung im Counter verwendet. Die restlichen Zellen werden durch Zentrifugation (1000 UpM, 5 min) pelletiert (Zellpellet kann bei - 20 C gelagert werden), und anschließend in 150 l 250 mM Tris/HCl, pH 7,5 resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgt durch einen 3-4 maligen Wechsel der Zellsuspension zwischen flüssigem Stickstoff und 37 C-Wasserbad. Die Zelltrümmer werden 10 min bei 14000 UpM abzentrifugiert und der Überstand im Luminometer vermessen. Zur Messung: In die Reaktionsgefäße wird 400 l des Reaktionspuffers vorgelegt. Abhängig von der Konzentration der Luziferase im Lysat werden bis zu 50 l pro Messröhrchen zugegeben und anschließend direkt im Luminometer gemessen (10 s Integral). Der Injektor des Counters wird dazu zuvor mit Luziferinlösung gefüllt. Pro Reaktion wird 50 l Luziferin injiziert. Die gemessenen Lichtblitze werden anschließend auf 1 mg Protein oder auf 1x106 Zellen/ml Zellsuspension normiert. Zur Erstellung der Standardkurve werden Konzentrationen zwischen 153 4. Material und Methoden 100 ng/ml und 10 pg/ml verwendet (Verdünnungsschritte 1:2). In der vorliegenden Arbeit wurden die relativen Lichteinheiten für 1x106 Zellen bestimmt. 154 5. Plasmide 5. Verwendung und Herstellung von Plasmiden 5.1. Verwendete Plasmide pFTkN-1 D. Schübeler, GBF, Braunschweig pEGFP-N1 Firma Clontech pEGFP-1 Firma Clontech pSBC-1 Dirks et al., 1993 pHT F. Kuhnert, Diplomarbeit, 1995 pHYGTKFUS C. Karremann, GBF, Braunschweig pSBC-2 Dirks et al., 1993 pAG60 Colbère et al., 1981 PUHD15-1 Gossen and Bujard, 1992 pBTVBC-1 A. Kröger, Dissertation 1999 pBI-4 Baron et al., 1995 pVBC-3 A. Kröger, Dissertation 1999 pSBC1luc W. Dirks, GBF, Braunschweig pSIR Firma Clontech pSIST A. Kröger, GBF, Braunschweig pMSCVneo2 Hawley et al., 1994 pAdcos45 Hohn and Colin, 1980 pMC1luzi C. Mielke, GBF, Braunschweig pTBC-1 S. Kirchhoff, GBF, Braunschweig pLUEGNTA E. Verhoeyen, Dissertation pCR3.1 Firma Invitrogen pBIG3R Strathdee et al. 1999 5.2. Hergestellte Plasmide pGTN: Das Fusionsprotein aus Thymidinkinase und Neomycin-Phosphotransferase wurde per PCR (Oligos: JUN5 P315 und 6 P314) aus pFTkN-1 amplifiziert BsrGI/NotI nachgeschnitten und in den ebenso geöffneten Vektor pEGFP-1 inseriert und auf diese Weise eine Tripelfusion mit eGFP geschaffen. pSGTN: Das GTN-Fusionsprotein wurde NotI/EcoRI aus pGTN exzisiert, in den NotI/EcoRI geöffneten pSBC-1 inseriert und damit unter die Kontrolle des SV40-Promotors gestellt. 155 5. Plasmide pHTG: Das Fusionsprotein aus Hygromycin-B-Phosphotransferase und Thymidinkinase wurde per PCR (Oligos: JUN24 P430 und JUN31 P506) aus pHT amplifiziert, BamHI/XhoI nachgeschnitten und in den ebenso geöffneten Vektor pEGFP-N1 inseriert. Auf diese Weise wurde eine Triplefusion mit eGFP unter Kontrolle des CMV-Promotors geschaffen. pRBT1: pBTVBC-1 wurde NotI/HpaI geöffnet und anschließend mit einem NotI/HpaI nachgeschnittenen PCR-Fragment, gewonnen durch die Amplifikation der MCS von pBTVBC-1 mit den Oligos Jaoli 1 P312 und Nr.6972, ligiert. Dadurch wurde eine zusätzliche SrfI-Site in die MCS inseriert. Dieser Vektor enthält den bidirektionalen tet-regulierbaren Promotor, gefolgt von der MCS und einem IRES-Element (Poliovirus). PRBT1luc: Das Luziferasegen wurde SmaI/HindIII aus pSBC1luc exzisiert und über diese Schnittstellen in pRBT1 kloniert. In diesem Vektor steht das Gen der Luziferase unter der Kontrolle des bidirektionalen Promotors. pRBT2: Zum Entfernen des IRES-Elements wurde pRBT1 NotI/HindIII geöffnet. Über Oligohybridisierung von Jaoli3 P312 und 4 P317 und Insertion der kurzen hybridisierten Sequenz in das pRBT1-Fragment wurde eine zusätzliche VspISchnittstelle geschaffen. Dieser Vektor dient damit zusammen mit pRBT1 zur Konstruktion von bicistronischen Plasmiden. pRBTTTA: Das Gen des Transaktivators wurde über EcoRI/BamHI aus pUHD15-1 exzisiert und in den ebenso geöffneten pRBT2 inseriert. Auf diese Weise wurde das Transaktivator-Gen unter die Kontrolle des tetregulierbaren bidirektionalen Promotors gestellt. pRLGTN: Das Fusionsprotein GTN wurde per PCR (Oligos: JUN6 P314 und 7 P313) amplifiziert und über die so erhaltenden flankierenden NotI-Schnittstellen in den NotI geöffneten pRBT1luc inseriert. Auf diese Weise wurde eine bicistronische regulierbare Kassette konstruiert, in der das Luziferase-Gen das erste und das Fusionsprotein GTN das zweite Cistron einnimmt. pTLGTN: Die bicistronische Kassette aus pRLGTN wurde durch PmeI exzisiert und in den 156 5. Plasmide SwaI geöffneten pRBTTTA inseriert. Auf diese Weise wurde eine autoregulative, bicistronische Kassette konstruiert, in der sowohl der Transaktivator, als auch die Expressionskassette aus pRLGTN über den bidirektionalen tet-regulierbaren Promotor exprimiert werden. Synomym: pRLFTA pRBTwF: pRBT2 wurde EcoRI/SalI geöffnet und über Oligohybridisierung der Oligos JUN32 P628 und 33 P629 eine Wildtyp FRT-Site 5` des Promotors eingefügt. pRwFHTG: pRBTwF wurde SalI/NotI geöffnet und das über XhoI/NotI isolierte HTG-Gen aus pHTG 3` der FRT-Schnittstelle inseriert. pRHTG: Das Fusionsprotein HTG wurde NotI/XhoI aus pHTG exzisiert und in den SalI/NotI geöffneten pRBT2 inseriert. Damit wurde das Gen HTG (3`) unter die Kontrolle des regulierbaren Promotors gestellt. pTHTG: Das HTG-Gen wurde über PmeI aus pRwFHTG exzisiert und in den SwaI geöffneten pRBTTTA inseriert. Damit wurde eine autoregulative Kassette konstruiert, in der der Transaktivator und das Gen HTG vom bidirektionalen Promotor exprimiert werden. Synomym: pRFHTGTA pSIN: Das Neomycin-Resistenzgen mit H4-Promotor wurde über NaeI-Restriktion aus pSIST exzisiert und der Vektor zu pSIN autoligiert. Dieser retrovirale Vektor sind die Enhancer-Elemente in U3 des 3`LTR deletiert. pSISN: Zum Einfügen einer zusätzlichen NotI-Schnittstelle in die MCS, wurde pSIST XhoI/BamHI geöffnet und ein Hybrid der Oligos JUN28 P504 und SIRNOTO P438 inseriert. Dieser Vektor entspricht pSIN enthält aber noch das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des Histon4-Promotors. pSINN: Zur Deletion des Neomycin-Resistenzgens mit H4-Promotor wurde pSISN NaeI restringiert und anschließend der Vektor autoligiert. pSNRLFTA2: Die autoregulatorische Kassette aus pRLFTA wurde über einen NotI partiellen Verdau isoliert und in den NotI geöffneten pSINN inseriert. Dabei wurde die 157 5. Plasmide Reporterexpressionseinheit in Sense zum viralen LTR orientiert. Fertiger Vektor zur Produktion von Retroviren. SIN-THTG: Die autoregulierte Expressionskassette aus pTHTG wurde NotI exzisiert und in den NotI geöffneten pSINN eingesetzt. Dabei wurde der Reporter in Antisense zum viralen LTR orientiert. Fertiger Vektor zur Produktion von Retroviren. Synomym: pSFFTA2 LTR-THTG; LTR-THTG wurde aus 3 Fragmenten konstruiert. Der NotI/HindIII geöffneten pMSCVneo2 wurde ligiert mit dem NsiI/HindIII Fragment aus pTHTG und dem NsiI/NotI Fragment aus SIN-THTG. Dieser Vektor entspricht SIN-THTG. Allerdings werden hier MSCV-basierende und somit aktive LTRs verwendet. Synomym: pMFFTA AD-LTR-THTG: In den über XbaI geöffneten und anschließend mit Hilfe von KlenowFragment aufgefüllten pAdcos45 wurde die SapI/FspI isolierte autoregulierbare Kassette aus LTR-THTG inseriert. Synomym: pAdcos45mffta AD-THTG: In den über XbaI geöffneten und anschließend mit Hilfe von Klenow aufgefüllten pAdcos45 wurde die HpaI isolierte Kassette aus pTHTG inseriert. Synomym: pAdcos45rfhtgta pAD-TLGTN: In den über XbaI geöffneten und anschließend mit Hilfe von KlenowFragment aufgefüllten pAdcos45 wurde die HpaI isolierte autoregulative Kassette aus pTLGTN inseriert. Synomym: pAdcos45rlfta pLUEG: Das Luziferase-Gen wurde per PCR (Oligos: CMVPL P84 und LuziGFP P192) amplifiziert, EcoRI/BamHI nachgeschnitten und in den EcoRI/BamHI geöffneten Vektor inseriert. Dadurch entstand ein Fusionsprotein aus Luziferase und eGFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors. pTLUEG: Das Fusionsprotein wurde per PCR (Oligos: Luzi3 P220 und EGFP-Hind P221) aus pLUEG amplifiziert, EcoRI/HindIII nachgeschnitten und in den ebenso geöffneten pTBC-1 inseriert. 158 5. Plasmide Auf diese Weise wurde das Fusionsprotein Luziferase-eGFP unter die Kontrolle des tet-regulierbaren Promotors gestellt. SIN-LEGTA: Dieser Vektor wurde in 2 Schritten kloniert. 1.) Das XhoI/HindIII-Fragment aus pLUEGNTA wurde in den ebenso geöffneten pSIR eingesetzt. 2.) Die so erhaltene Vorstufe wurde anschließend HindIII geöffnet, dephosphoryliert, und mit dem HindIII-Fragment aus pLUEGNTA ligiert. Auf diese Weise wurde ein retroviraler SIN-Vektor konstruiert, der die unidirektionale autoregulierbare Kassette (tTA-Promotor-LuziGFP-IREStTA) und als Selektionsmarker das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des H4-Promotors in Sense Orientierung zum LTR besitzt. Synonym: pSLEGTA LTR-GTHT: pTHTG wurde über BsrGI geöffnet mit Klenow-Fragment aufgefüllt, mit NotI nachgeschnitten und anschließend die so exzisierte autoregulative Kassette in den NotI/HindII geöffneten pMSCVneo2 inseriert. Dieser Vektor entspricht LTR-THTG, allerdings ist die integrierte Kassette um 180 gedreht. Synomym: pMTAFF SIN-GTHT: Die autoregulierbare Kassette aus pSFFTA2 wurde per NotI Restriktion exzisiert und wiederum NotI in den selben Backbone inseriert. Dieser Vektor entspricht pSFFTA2, allerdings ist die integrierte Kassette um 180 gedreht. Synomym: pSTAFF LTR-THTGtkNot: Die über PCR amplifizierte HSVTk-Polyadenylierungssequenz (Oligos: JUNpA1 P788 und JUNpA2 P789) wurde NotI nachgeschnitten und in den NotI geöffneten LTR-THTG in Sense zum HTG-Gen inseriert. Synonym: pMFFTATkpAN LTR-THTGtkSpe: Die über PCR amplifizierte HSVTk-pA-Sequenz (Oligos: siehe pMFFTATkpAN) wurde SpeI nachgeschnitten und in den SpeI geöffneten LTR-THTG in Sense zum HTG-Gen inseriert. LTR-THTGtkSpe und Not unterscheiden sich lediglich in der Insertionsstelle des eingefügten pA-Signals. Synonym: pMFFTATkpAS 159 5. Plasmide LTR-THTGbghNot: Die über PCR amplifizierte BGH-pA-Sequenz (Oligos: JUNpA3 P790 und JUNpA4 P791) wurde NotI nachgeschnitten und in den NotI geöffneten LTRTHTG inseriert. Dieser Vektor unterscheidet sich nur durch die eingefügte pA-Sequenz von LTR-THTGtkNot. Synonym: pMFFTABGHpAN pBIG3R-I: Zum Entfernen von Intron-Sequenzen 3`des minimalen Tk-Promotors wurde pBIG3R PpuMI geöffnet, mit Hilfe von Klenow-Fragment aufgefüllt und XmnI nachgeschnitten. Beide Fragmente wurden autoligiert. Dieser Vektor besitzt mit der Verwendung des minimalen CMV- und des minimalen Tk-Promotors eine Variante des bidirektionalen tet-regulierbaren Promotors. Auf seiten des Tk-Promotor Anteils ist die Transaktivator-Sequenz mit NLS inseriert, auf der CMV-Seite befindet sich die MCS. p3RHTG: In den NotI/StuI geöffneten pBIG3R wurde das HTG-Gen 5`vom CMV minimalen Promotor aus dem ebenso geschnittenen LTR-THTG inseriert. LTR-Tk-THTG: pMFFTA wurde StuI/NsiI geöffnet und der TK-Minimalpromotor mit einem Teil des Transaktivators aus p3RHTG (StuI/NsiI) inseriert. Dieser Vektor unterscheidet sich von pMFFTA durch die Expression des tTA mit zusätzlicher NLS vom Tk-Minimalpromotor aus. Synonym: pMFPTA 160 6.Literatur A MOHAMMADI, S. AND HAWKINS, R. 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ADA AIDS amp ATCC ATG ATP AV AAV Adenosin alpha Verpackungsequenzen der Adenoviren Abbildung Adenosin deaminase Acquired immunodeficiency syndrome Ampicillin American Type Culture Collection Translationsstart Adenosintriphosphat Adenoviren Adeno-assoziierte Viren b ß BGHpA bp BSA Base beta Polyadenylierungssignal des bovine growth hormon gene Basenpaar Rinderserumalbumin C CA CFU CIP CMV Cre CTP Cytidin Kapsid-Protein “colony forming units” alkalische Phosphatase cytomegalovirus cyclization recombination (Cre recombinase) Cytidintriphosphat DAF DME DMSO DNA dNTP Dox DTT decay accelerating factor Dulbecco’s modification of Eagle’s (medium) Dimethylsulfoxid Desoxyribonucleinsäure Desoxyribonucleotidtriphosphat Doxycyclin Dithiotriotol E. coli EDTA eGFP env E1 bis E4 Escherichia coli Ethylendiamintetraacetat enhanced green fluorescent protein envelope gene Transkriptionseinheiten der Adenoviren FACS FCS FITC FLP fluorescence activated cell sorting fötales Kälberserum fluorescein isothiocyanate Flip Rekombinase 173 Abkürzungsverzeichnis FRT FLP recognition target G Guanin gamma Gruppenspezifische Antigene, Gen für die viralen Kapsidproteine green flourescent protein glycosyl phosphatidylinositol Guanosintriphoshat Aminoglycoside-2'-deoxystreptine (Gentamycin-derivative) gag GFP GPI GTP G418 h Stunde hCMV humanes Cytomegalovirus Hepes N-2-(Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-Ethansulfonsäure HindIII Restriktionsendonuclease HIV Human Immunodeficiency Virus HMW-DNA “High molecular weight”-DNA HSV Herpes Simplex Virus Hygromycin-B-Phosphotransferase Gen hyg Hygro Hygromycin Hygromycin-B-Phosphotransferase/Thymidinkinase Fusionsgen hygtk IN IRES ITR retrovirale Integrase internal ribosomal entry site adenoviraler inverted terminal repeat L loxP LTR luc Leader Sequenz locus of X-over (Targetsequenz der Cre-Rekombinase) retroviraler “long terminal repeat” Gen der firefly Luziferase Kap. kb Kapitel 1000 Basenpaare MA MAR MCS MLV MMTV MOI Mo-MuLV MSCV mRNA n NC n.d. Matrixprotein “matrix attached region” multiple cloning site micro Myeloproliferative sarcoma virus Mouse Mammary Tumor Virus “multiplicity of infection” Moloney Murine Leukemia Virus murine stem cell virus messenger RNA nano Nucleocapsid nicht durchgeführt 174 Abkürzungsverzeichnis neo NLS NPT-Gen NS Neomycin-B-Phosphotransferase Gen “nuclear localisation signal” Gen für die Neomycin-B-Phosphotransferase negative Selektion OD optische Dichte P pA PB(S) PBS PbitTA PCMV-1 PCR pol Polio polyA PR prt PtTA PPT PR PS 4 Promotor Polyadenylierungssignal Primerbindungsstelle Phosphat gepufferte Salzlösung/”primer binding site” bidirektionaler tTA-abhängiger Promotor human cytomegalovirus immediate early minimal promoter “Polymerase chain reaction” Gen für die enzymatischen Proteine von Retroviren Poliovirus Polyadenylierungssignal retrovirale Protease Gen der retroviralen Protease unidirektionaler tTA-abhängiger Promotor Polypurintrakt virale Protease Positivselektion Psi, retrovirale Verpackungsequenz RCA RCR rlu RNA RNase rpm RT rtTA “replication competent adenvirus “replication competent retrovirus” “relative light units” Ribonucleinsäure Ribonuclease “rotation per minute” Reverse Transkriptase/Reverse Transkription/Raumtemperatur reverser Transaktivator SA SAR SCID SD SDS SIN SU SV40 Splice Akzeptor “scaffold attached region” “severe combined immunodeficiency” Splice Donor Natriumdodecylsulfat “self inactivating” retrovirales Oberflächenprotein Simian Virus 40 T Tab. Tet tetO Thymidin Tabelle Tetracyclin Tetracyclin Operatorsequenz 175 tetR TK TM TP Tris tRNA tTA tTA-System Tetracyclin Repressordomäne Thymidinkinase Transmembranprotein “terminal protein” Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan Transfer RNA Transaktivator Transaktivator-abhängiges Promotorsystem TTP Tymidintriphosphat U U3 U5 UTR Units “unique 3' RNA-sequenz” “unique 5' RNA-sequenz” “untranslated region” vgl. vergleiche wt Wildtyp z.B. zum Beispiel Abkürzungsverzeichnis Danksagung Herrn Prof. Dr. Jürgen Bode und Herrn Prof. Dr. Rüdiger Cerff danke ich dafür, dass sie diese Arbeit vor der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Braunschweig vertreten. Herrn Prof. Dr. Mendel danke ich für seine Bereitschaft zur Teilnahme an der Prüfungskommission. Die vorliegende Arbeit wurde unter der Anleitung von Frau Dr. Dagmar Wirth und Herrn Dr. Hansjörg Hauser in der Arbeitsgruppe Regulation und Differenzierung an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), Braunschweig angefertigt. Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Dagmar Wirth, die diese Arbeit immer unterstützt und mit ihrer Diskussionsbereitschaft vorangetrieben hat. Danken möchte ich auch Herrn Dr. Hansjörg Hauser für die Bereitstellung des Themas und für die vielen Anregungen. Der gesamten Arbeitsgruppe danke ich für das angenehme und lockere Arbeitsklima, für die vielen netten Neckereien und die große Hilfsbereitschaft, die nie jemand vermissen ließ. Mein besonderer Dank gilt natürlich dem “Schweine- oder Viruslabor” für die vielen sachlichen und unsachlichen Diskussionen, die gute Laune und den Zusammenhalt. Besonders zu erwähnen sind: Ute Pägelow und Meike Tümmler, die mir den Einstieg leicht gemacht und Licht in meine Unwissenheit gebracht haben. Andrea Kröger, die mir den rechten Weg wies. Els Verhoeyen, die mich mit ihrer unnachahmlich herzlichen Art immer wieder zum Lachen gebracht hat und mit der ich so manche Nacht durchtanzt habe. Alex Baer, mit der ich viele vergnügliche Stunden mit lauter Musik und skurrilen Geschichten im Viruslabor verbracht habe. Zusammen mit Angela Knopp haben wir uns zu sportlichen Höchstleistungen im “SAM” angetrieben. André Oumard, Dirk Spitzer und besonders Angela Knopp danke ich für ihre Geduld, wenn es darum ging mir die Funktionsweise der Computer zu erklären (auch zwei oder dreimal) und die immer alles wieder zum Laufen gebracht haben. Dagmar Wirth und Alex Baer danke ich besonders dafür, dass sie meine “literarischen Ergüsse” in die rechte Form gebracht haben. Eine Arbeit, um die sie sicher nicht zu beneiden waren. Mein herzlichster Dank geht natürlich an meine Eltern und an Didi, die mich nach Kräften unterstützt und die lange Ausbildung erst ermöglicht haben. Hier fand ich immer einen Ort, an den ich mich verkriechen konnte, wenn die “Welt” mal wieder schlecht war.
