Bestimmung von Aminosäuren mit LC

Institut für Laboratoriumsmedizin,
Klinische Chemie und Molekulare Diagnostik
Bestimmung von Aminosäuren
mit LC-MS/MS
Linda Kortz
7. Anwendertreffen AG LC-MS/MS, Leipzig
Gliederung
- Bedeutung der klinischen Aminosäurenanalytik
- Prinzip der LC-MS/MS für iTraqTM-derivatisierte
Aminosäuren
- Ergebnisse der Methodenevaluierung
- Zusammenfassung
Klinische Aminosäurenanalytik
Defekte des Aminosäurenstoffwechsels
z.B. Phenylketonurie (PKU), Tyrosinämie, Ahornsirupkrankheit (MSUD)
Harnstoffzyklusdefekte
z.B. Citrullinämie, Argininosuccinatlyase Defekt
- klinischer Verdacht auf Stoffwechseldefekt
- Bestätigungsdiagnostik
- Therapiekontrolle
Welche Aminosäuren sind wichtig im
Stoffwechsellabor?
O-Phosphoserin
O-Phosphoethanolamin
Taurin
Asparagin
Serin
Hydroxyprolin
Glycin
Glutamin
Ethanolamin
Asparaginsäure
Sarkosin
Histidin
Citrullin
Threonin
3-Methylhistidin
β-Alanin
Glutaminsäure
1-Methylhistidin
Argininosuccinsäure
Alanin
Carnosin
Anserin
γ-Amino-n-buttersäure
Homocitrullin
α-Aminoadipinsäure
Arginin
β-Aminoisobuttersäure
Prolin
δ-Hydroxylysin
Ornithin
α-Amino-n-buttersäure
Cystathionin
Cystin
Lysin
Valin
Methionin
Tyrosin
Homocystin
Isoleucin
Leucin
Phenylalanin
Tryptophan
270
180
90
0
10
20
24.401' Thr
26.315' Ser
18.016' Asp
30
40
50
60
66.525' H-Cystin
61.118' Phe
70
80
Chromatogramm Sigma-Standard (c= 100 µM) mit Norleucin
90
100
104.476'
106.641' Arg
93.862' Hylys
95.613' Orn
97.886' Lys
99.814' NH3
101.741' EOHNH2
91.495' Ans
92.704'
85.438'
86.735'
88.052' Car
79.914'3Mehis
His
80.778'
82.820' 1Mehis
83.884' Trp
79.238'
73.690' b-AiBA
76.236' g-ABA
70.573' b-Ala
59.218'
360
49.477' Cys
50.882'Met
Cystathionin
51.312'
52.854' Ile
53.997' Leu
55.304' Nle
57.008' Tyr
46.534' Val
450
48.313'
28.683'29.605' AsN
30.997' Glu
32.908'
33.751' Sar
35.068' a-AAA
36.998' Pro
38.542' Gly
40.022' Ala
41.062' Cit
43.094' a-ABA
12.433'
3.757' P-Ser
5.253'
6.152' PEATau
7.803' Urea
Aminosäurenanalytik mit
Ion Exchange Chromatographie (IEC)
mV
720
630
540
-90
min
Aminosäurenanalytik mit IEC
Prinzip
- chromatographische
Trennung aller relevanten
Aminosäuren
- Säule: Ionenaustauscher
- Eluenten: Pufferwechsel um
saure, neutrale und basische
Aminosäuren zu trennen
- Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrin (UV-Detektion)
Aminosäurenanalytik mit IEC
Prinzip
- chromatographische
Trennung aller relevanten
Aminosäuren
- Säule: Ionenaustauscher
- Eluenten: Pufferwechsel um
saure, neutrale und basische
Aminosäuren zu trennen
- Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrin (UV-Detektion)
Nachteile
- lange Analysenzeit
- lange Auswertungszeit
- Zuordnung der Peaks
ausschließlich über die
Retentionszeiten im Vergleich
mit dem Standard
Aminosäurenanalytik mit LC-MS/MS?
Aminosäurenanalytik
mit iTraqTM-Derivatisierung und LC-MS/MS
isobares Tag
Gesamtmasse 145
Reporter m/z 114 / 115
(geladen)
O
N
N
O
O
N
O
Balance m/z 31 / 30
(Neutralverlust)
- Tag besteht aus isotopen-angereicherter
Reporter- und Balance-Gruppe
- Reporter m/z 115 für Analyt
- Reporter m/z 114 für internen Standard
- Balance-Gruppe ändert sich mit
Reporter-Gruppe, um die Gesamtmasse
des Tags von 145 beizubehalten
- Aminogruppen der Aminosäuren binden
an aminreaktive Gruppe des Tags (NHS-Ester)
Ross et al., Molecular & Cellular Proteomics, 2004, 3.12, 1154
Aminosäurenanalytik
mit iTraqTM-Derivatisierung und LC-MS/MS
isobares Tag
Gesamtmasse 145
Reporter m/z 114 / 115
(geladen)
O
N
N
O
O
N
O
Balance m/z 31 / 30
(Neutralverlust)
H
N
N
N
m/z 114 (+1)
m/z 115 (+2)
- Tag besteht aus isotopen-angereicherter
Reporter- und Balance-Gruppe
- Reporter m/z 115 für Analyt
- Reporter m/z 114 für internen Standard
- Balance-Gruppe ändert sich mit
Reporter-Gruppe, um die Gesamtmasse
des Tags von 145 beizubehalten
- Aminogruppen der Aminosäuren binden
an aminreaktive Gruppe des Tags (NHS-Ester)
Aminosäure
O
13C
13C
2
13C18O
(+3)
18O (+2)
Ross et al., Molecular & Cellular Proteomics, 2004, 3.12, 1154
Aminosäurenanalytik
mit iTraqTM-Derivatisierung und LC-MS/MS
isobares Tag
Gesamtmasse 145
Reporter m/z 114 / 115
(geladen)
O
N
N
O
O
N
O
Balance m/z 31 / 30
(Neutralverlust)
H
N
N
N
m/z 114 (+1)
m/z 115 (+2)
Aminosäure
O
13C
13C
2
- Tag besteht aus isotopen-angereicherter
Reporter- und Balance-Gruppe
- Reporter m/z 115 für Analyt
- Reporter m/z 114 für internen Standard
- Balance-Gruppe ändert sich mit
Reporter-Gruppe, um die Gesamtmasse
des Tags von 145 beizubehalten
- Aminogruppen der Aminosäuren binden
an aminreaktive Gruppe des Tags (NHS-Ester)
- gelabelte Aminosäuren Analyt / Standard
verhalten sich durch isobares Tag in
Chromatographie und MS identisch
13C18O
(+3)
18O (+2)
Ross et al., Molecular & Cellular Proteomics, 2004, 3.12, 1154
Multiple Reaction Monitoring (MRM)
Aminosäure mit Tag
Q1
CAD
Reporter Ion
Q3
Q2
isobares Tag
- Q1 auf m/z der erwarteten Aminosäure
mit Tag
- Fragmentierung in Q2 (Kollisionszelle)
- Q3 auf m/z des Reporter Ions
42 AS + 42 IS = 84 MRMs
Reporter
geladen
Balance
NH-Aminosäure
Neutralverlust
Probenaufarbeitung
Proteine ausfällen
40 µL Plasma
+
10 µL 10% Sulfosalicylsäure
10 µL Überstand abnehmen
Puffer
10 µL Überstand
40 µL 0,45 M Borat-Puffer (pH= 8,5)
+
10 µL abnehmen
iTraqTM
10 µL Überstand in Puffer
+
5 µL iTraqTM-Reagenz 115
1 h Reaktionszeit bei RT
Reaktion stoppen
15 µL Reaktionsgemisch
+
20 x
Verdünnung
5 µL 1,2% Hydroxylaminlösung
Trocknen der Probe in Vakuum Konzentrator
Interner Standard
5 x Verdünnung
getrocknete Probe
+
32 µL 5 µM Interner Standard
(Aminosäuren mit iTraqTM-Reagenz 114)
32 µL Rekonstituierte Probe
+
128 µL Eluent A
(H2O mit 0,1% HCOOH / 0,01% HFBA)
Probe auf Mikrotiterplatte
10 µL Injektion
iTraqTM LC-MS/MS Methode
115
30 NHS + Aminosäure
(Probe)
Labeln
115 30 NH Aminosäure (Probe)
iTraqTM LC-MS/MS Methode
115
30 NHS + Aminosäure
(Probe)
Labeln
115 30 NH Aminosäure (Probe)
+ 114 31 NH Aminosäure (Standard)
Mischen 115 30 NH Aminosäure (Probe)
114 31 NH Aminosäure (Standard)
iTraqTM LC-MS/MS Methode
115
30 NHS + Aminosäure
(Probe)
Labeln
115 30 NH Aminosäure (Probe)
+ 114 31 NH Aminosäure (Standard)
Mischen 115 30 NH Aminosäure (Probe)
114 31 NH Aminosäure (Standard)
LC:
- Säule: C-18
- Eluenten: H2O, Acetonitril
mit 0,1% HCOOH / 0,01%
HFBA (Ionenpaarreagenz)
- Gradientenelution
- T= 50°C
- Fluß 800 µL/min
(Split: ca. 250 µL/min davon in
TIS-Quelle)
Intensität (cps)
HPLC
Zeit (min)
iTraqTM LC-MS/MS Methode
115
30 NHS + Aminosäure
(Probe)
Labeln
115 30 NH Aminosäure (Probe)
Mischen 115 30 NH Aminosäure (Probe)
+ 114 31 NH Aminosäure (Standard)
114 31 NH Aminosäure (Standard)
HPLC
MS/MS:
- API 2000 mit TIS
- MRM-Modus
MRM
Standard
Zeit (min)
gelabelte AS --> 115
gelabelte AS --> 114
Intensität (cps)
Analyt
Intensität (cps)
LC:
- Säule: C-18
- Eluenten: H2O, Acetonitril
mit 0,1% HCOOH / 0,01%
HFBA (Ionenpaarreagenz)
- Gradientenelution
- T= 50°C
- Fluß 800 µL/min
(Split: ca. 250 µL/min davon in
TIS-Quelle)
Zeit (min)
Chromatogramm- Totalionenstrom
7.0e4
6.5e4
6.0e4
Intensität (cps)
5.5e4
5.0e4
4.5e4
4.0e4
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
5000.0
0.0
2
4
6
8
10
12
Zeit (min)
14
16
18
20
22
24
Chromatogramm- Totalionenstrom
7.0e4
6.5e4
6.0e4
Intensität (cps)
5.5e4
5.0e4
3.Periode
1.Periode
3 AS
6 MRMs
4. Periode
10 AS
14 MRMs
24 AS
38 MRMs
4.5e4
2.Periode
4.0e4
7 AS
14 MRMs
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
5000.0
0.0
2
4
6
8
10
12
Zeit (min)
14
16
18
20
22
24
Chromatogramm- Totalionenstrom
Elution AS
7.0e4
6.5e4
6.0e4
Intensität (cps)
5.5e4
5.0e4
3.Periode
1.Periode
3 AS
6 MRMs
4. Periode
10 AS
14 MRMs
24 AS
38 MRMs
4.5e4
2.Periode
4.0e4
7 AS
14 MRMs
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
5000.0
0.0
2
4
6
8
10
12
Zeit (min)
14
16
18
20
22
24
Chromatogramm- Totalionenstrom
Equilibrierung Säule
Elution AS
7.0e4
6.5e4
6.0e4
Intensität (cps)
5.5e4
5.0e4
3.Periode
1.Periode
3 AS
6 MRMs
4. Periode
10 AS
14 MRMs
24 AS
38 MRMs
4.5e4
2.Periode
4.0e4
7 AS
14 MRMs
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
5000.0
0.0
2
4
6
8
10
12
Zeit (min)
14
16
18
20
22
24
Extracted Ion Chromatogram
3.5e4
3.4e4
3.2e4
3.0e4
2.8e4
Intensität (cps)
2.6e4
2.4e4
2.2e4
2.0e4
1.8e4
1.6e4
1.4e4
1.2e4
1.0e4
8000.0
6000.0
4000.0
2000.0
0.0
2
4
6
8
10
12
Zeit (min)
14
16
18
20
22
24
Extracted Ion Chromatogram
3.5e4
3.4e4
Ile, Leu, NLeu (Analyt)
Ile, Leu, NLeu (Standard)
3.2e4
3.0e4
XICof +MRM(14pairs): Period 4, 276.3/115.1 amu fromSample9 (Sigma200uM-09) of 07-03-20.wiff (TurboSpra...
2.6e4
1.5e4
2.4e4
1.3e4
2.2e4
2.0e4
1.8e4
1.6e4
1.4e4
Max. 1.5e4cps.
10.40
10.63
1.4e4
Intensität (cps)
Intensität (cps)
2.8e4
1.2e4
1.1e4
1.0e4
9000.0
8000.0
10.80
7000.0
6000.0
5000.0
4000.0
3000.0
2000.0
1.2e4
1000.0
0.0
1.0e4
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Time, min
10.7
Zeit (min)
8000.0
6000.0
4000.0
2000.0
0.0
10.8
2
4
6
8
10
12
Zeit (min)
14
16
18
20
22
24
10.9
11.0
11.1
Ergebnisse Methodenevaluierung
• NWG (S/N=3), linearer Bereich
• Variabilität, Richtigkeit (Intra-Assay, Inter-Assay)
• Methodenvergleich LC-MS/MS mit IEC
NWG / linearer Bereich
(Sigma-Standard)
Analyt
NWG [µM]
linearer Bereich
[µM]
Bestimmtheitsmaß
r2
Gly
1
5 -1000
0,998
Met
15
25 -1000
0,895
Intra-Assay / Inter-Assay
(Recipe Plasma-Kontrolle)
Intra-Assay
Inter-Assay
Richtigkeit
Analyt
Mittelwert
[µM]
VK
[%]
Mittelwert
[µM]
VK
[%]
[%] (Bereich)
Gly
205
3,7
187
4,8
101 (94 - 109)
Met
18
13,9
16
42,8
41 (18 - 69)
Intra-Assay: 10 Kontrollen an einem Tag gemessen
Inter-Assay: je 1 Kontrolle an 10 Messtagen
Methodenvergleich Glycin
(30 Patientenproben; IEC Uniklinikum Heidelberg)
Bablok-Passing-Regression
1400
1200
MS/MS
1000
800
600
400
200
0
0
200
400
600
800
1000
1200
IEC
Y = -9,5 + 1,0 X
Spearman‘s Rho = 0,837
1400
Methodenvergleich Glycin
(30 Patientenproben; IEC Uniklinikum Heidelberg)
Bablok-Passing-Regression
Bland-Altman-Plot
1400
(MS/MS - IEC) / Mittelwert %
20
1200
MS/MS
1000
800
+1.96 SD
15
14.6
10
5
0
Mittelwert
-5
-4.6
-10
600
-15
400
-20
-1.96 SD
-25
200
-23.7
-30
0
-35
0
200
400
600
800
1000
1200
IEC
Y = -9,5 + 1,0 X
Spearman‘s Rho = 0,837
1400
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Mittelwert MS/MS und IEC
1600
Methodenvergleich Methionin
(30 Patientenproben; IEC Uniklinikum Heidelberg)
Bablok-Passing-Regression
50
45
40
MS/MS
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
IEC
Y = -0,7 + 0,3 X
Spearman‘s Rho = 0,664
50
Methodenvergleich Methionin
(30 Patientenproben; IEC Uniklinikum Heidelberg)
Bablok-Passing-Regression
Bland-Altman-Plot
-60
(MS/MS - IEC) / Mittelwert %
50
45
40
35
+1.96 SD
-66.6
-80
MS/MS
-100
30
25
Mittelwert
-120
20
-116.7
-140
15
10
-160
5
-1.96 SD
-166.8
0
-180
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
IEC
Y = -0,7 + 0,3 X
Spearman‘s Rho = 0,664
50
5
10
15
20
25
30
Mittelwert MS/MS und IEC
35
Welche Aminosäuren sind wichtig im
Stoffwechsellabor?
O-Phosphoserin
O-Phosphoethanolamin
Taurin
Asparagin
Serin
Hydroxyprolin
Glycin
Glutamin
Ethanolamin
Asparaginsäure
Sarkosin
Histidin
Citrullin
Threonin
3-Methylhistidin
β-Alanin
Glutaminsäure
1-Methylhistidin
Argininosuccinsäure
Alanin
Carnosin
Anserin
γ-Amino-n-buttersäure
Homocitrullin
α-Aminoadipinsäure
Arginin
β-Aminoisobuttersäure
Prolin
= 42 Aminosäuren
δ-Hydroxylysin
Ornithin
α-Amino-n-buttersäure
Cystathionin
Cystin
Lysin
Valin
Methionin
Tyrosin
Homocystin
Isoleucin
Leucin
Phenylalanin
Tryptophan
Welche Aminosäuren sind wichtig im
Stoffwechsellabor?
O-Phosphoserin
O-Phosphoethanolamin
Taurin
Asparagin
Serin
Hydroxyprolin
Glycin
Glutamin
Ethanolamin
Asparaginsäure
Sarkosin
Histidin
Citrullin
Threonin
3-Methylhistidin
β-Alanin
Glutaminsäure
1-Methylhistidin
Argininosuccinsäure
Alanin
Carnosin
Anserin
γ-Amino-n-buttersäure
Homocitrullin
α-Aminoadipinsäure
Arginin
β-Aminoisobuttersäure
Prolin
Wiederfindung ± 15 %; VK ≤ 15 % (22 Aminosäuren)
δ-Hydroxylysin
Ornithin
α-Amino-n-buttersäure
Cystathionin
Cystin
Lysin
Valin
Methionin
Tyrosin
Homocystin
Isoleucin
Leucin
Phenylalanin
Tryptophan
Welche Aminosäuren sind wichtig im
Stoffwechsellabor?
O-Phosphoserin
O-Phosphoethanolamin
Taurin
Asparagin
Serin
Hydroxyprolin
Glycin
Glutamin
Ethanolamin
Asparaginsäure
Sarkosin
Histidin
Citrullin
Threonin
3-Methylhistidin
β-Alanin
Glutaminsäure
1-Methylhistidin
Argininosuccinsäure
Alanin
Carnosin
Anserin
γ-Amino-n-buttersäure
Homocitrullin
α-Aminoadipinsäure
Arginin
β-Aminoisobuttersäure
Prolin
Wiederfindung ± 15 %; VK ≤ 15 % (22 Aminosäuren)
Wiederfindung ± 25 %; VK ≤ 25 % (8 Aminosäuren)
δ-Hydroxylysin
Ornithin
α-Amino-n-buttersäure
Cystathionin
Cystin
Lysin
Valin
Methionin
Tyrosin
Homocystin
Isoleucin
Leucin
Phenylalanin
Tryptophan
Welche Aminosäuren sind wichtig im
Stoffwechsellabor?
O-Phosphoserin
O-Phosphoethanolamin
Taurin
Asparagin
Serin
Hydroxyprolin
Glycin
Glutamin
Ethanolamin
Asparaginsäure
Sarkosin
Histidin
Citrullin
Threonin
3-Methylhistidin
β-Alanin
Glutaminsäure
1-Methylhistidin
Argininosuccinsäure
Alanin
Carnosin
Anserin
γ-Amino-n-buttersäure
Homocitrullin
α-Aminoadipinsäure
Arginin
β-Aminoisobuttersäure
Prolin
δ-Hydroxylysin
Ornithin
α-Amino-n-buttersäure
Cystathionin
Cystin
Lysin
Valin
Methionin
Tyrosin
Homocystin
Isoleucin
Leucin
Phenylalanin
Tryptophan
Wiederfindung ± 15 %; VK ≤ 15 % (22 Aminosäuren)
Wiederfindung ± 25 %; VK ≤ 25 % (8 Aminosäuren)
Wiederfindung > ± 25 %; VK ≥ 25 % (10 Aminosäuren)
Zusammenfassung
iTraqTM-Derivatisierung und LC-MS/MS ermöglichen eine kurze
und robuste Analytik von Aminosäuren.
Derzeit ist mit dieser Methode die Bestimmung von 30 Aminosäuren möglich.
Eine Optimierung der Methode für Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Citrullin, Carnosin, α-Aminoadipinsäure, β-Aminoisobuttersäure, α-Amino-n-buttersäure, Cystin und Methionin ist für den
Einsatz in der Routinediagnostik notwendig.
Die Verwendung einer externen Kalibrierung wäre sinnvoll, um
durch die Derivatisierungsreaktion entstehende Variabilität (Analyt
wird derivatisiert, interner Standard hingegen derivatisiert
zugegeben!) auszublenden.
Danksagung
ILM Leipzig
Dr. Uta Ceglarek
Babette Niescher
Dr. Martin Fiedler
Prof. Dr. Joachim Thiery
Applied Biosystems
Bruno Casetta
Jianru Stahl-Zeng
Subodh Nimkar
Scott Daniels