Charakterisierung der Yersinia enterocolitica - Ti
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Tierärztliche Hochschule Hannover Charakterisierung der Yersinia enterocolitica– Infektion im Minipigmodell INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) vorgelegt von Anna Charlotte Drees aus Berlin Hannover 2013 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand Institut für Mikrobiologie 1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Karl-Heinz Waldmann Tag der mündlichen Prüfung: 15.10.2013 Diese Forschungsarbeit wurde unterstützt vom Bundesministerium für Bildung undForschung (BMBF) im Rahmen des Forschungsverbunds Food-Borne Zoonotic Infections of Humans (FBI-Zoo) und des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF). Gewidmet all meinen Sponsoren an Liebe, Zeit, Geduld und Geld Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert: A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, A. von Altrock, F. Seehusen, P. Dersch, P. Valentin-Weigand (2011): Establishment of a Yersinia enterocolitica infection model in minipigs Poster auf dem National Symposium on Zoonoses Research, 06.10. – 07.10. 2011, Berlin In: National Symposium on Zoonoses Research, 6-7 October 2011, Berlin, Programme und Abstracts A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, P. Dersch, A. von Altrock, F. Seehusen, P. Valentin-Weigand (2012): Serotyp-abhängige Kolonisation von Yersinia enterocolitica im Minipig-Modell Vortrag auf der Tagung der Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie” der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG), 27.06. – 29.06. 2012, Leipzig In: DVG Tagung der Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie”, Leipzig, 27. bis 29. Juli 2012, ISBN 978-3-86345-080-9 A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, P. Dersch, A. von Altrock, P. Valentin-Weigand (2012): Serotype dependent Colonization of Yersinia enterocolitica in a Minipig Infection Model Vortrag auf dem 3rd National Yersinia 13.07. – 14.07. 2012, Tübingen In: 3rd National Yersinia Meeting, 13. bis 14. Juli 2012, Tagungsband Inhalt A Einleitung ..................................................................................... 11 A.1 Einleitung und Zielsetzung ...................................................................... 11 A.2 Literaturübersicht ..................................................................................... 13 A.2.1 Allgemeine Eigenschaften von Yersinia enterocolitica ........................ 13 A.2.2 Yersinia enterocolitica: Epidemiologie und zoonotische Bedeutung ... 14 A.2.3 Yersiniose bei Menschen und Tieren: Klinische Symptome................ 17 A.2.4 Virulenzfaktoren enteropathogener Yersinien ..................................... 18 A.2.5 Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin ............................................... 19 A.2.6 Kultureller Nachweis pathogener Yersinien ........................................ 21 A.2.7 Infektionsversuche im Mausmodell ..................................................... 22 A.2.8 Infektionsversuche im Schwein ........................................................... 23 B Material und Methoden ............................................................... 26 B.1 Bakterienstämme, Kultivierung und Differenzierung ............................ 26 B.1.1 Verwendete Yersinia enterocolitica-Stämme ...................................... 26 B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion ............... 27 B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch Resistenzen ........................................................................................ 28 B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung ........... 28 B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate ........................................... 29 B.2 Versuchstiere, experimentelle Infektionen und Versuchsdesign ........ 30 B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere .............. 30 B.2.2 Versuchsaufbau .................................................................................. 31 B.2.3 Orale Infektion der Minipigs ................................................................ 32 B.2.4 Probenentnahme ................................................................................ 32 B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung ........................................... 33 B.2.6 Histopathologische Untersuchung ...................................................... 34 B.2.7 Serologische Untersuchung ................................................................ 34 B.3 C C.1 Statistische Auswertung.......................................................................... 34 Ergebnisse ................................................................................... 36 Etablierung eines Infektionsmodells für Yersinia enterocolitica im Minipig ....................................................................................................... 36 C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3 ......................................................................................... 36 C.1.2 C.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 .................. 40 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 ................ 48 C.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere ........................................................... 49 C.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung ............................................... 49 C.2.3 Histopathologische Beurteilung........................................................... 49 C.2.4 Quantitative Organbelastung .............................................................. 50 C.2.5 Qualitative Organbelastung................................................................. 52 C.2.6 Bakterielle Ausscheidung .................................................................... 53 C.2.7 Serologie ............................................................................................. 55 C.3 Koinfektionsversuche mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invasinassoziierten Gendefekten im MinipigModell ........................................................................................................ 57 C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante............................................................. 58 C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante ............................................................... 67 C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invA-Mutante ............................................................................ 75 C.4 Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse aus Infektionsversuchen im Maus- und Minipig-Modell .............................. 85 C.4.1 Vergleich der Infektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 und O:8 Stämmen ............................................................................... 86 C.4.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invA-assoziierten Gendefekten ........... 87 D Diskussion ................................................................................... 95 E Zusammenfassung.................................................................... 106 F Summary .................................................................................... 108 G Literaturverzeichnis .................................................................. 110 H Anhang ....................................................................................... 121 H.1 Detaillierte klinische Beurteilung der Minipigs .................................... 121 H.2 Detaillierte pathologisch-anatomische Beurteilung ............................ 128 H.3 Detaillierte histopathologische Beurteilung ........................................ 134 H.4 Tabellarische Auflistung der quantitativen Organbelastung.............. 145 H.5 Nährböden, Medien und Antibiotika ..................................................... 150 H.5.1 Nährböden ........................................................................................ 150 H.5.2 (Nähr-) Medien .................................................................................. 151 H.5.3 „Bunte Reihe“ .................................................................................... 151 H.5.4 Zusätze ............................................................................................. 154 H.5.5 Verwendete Antibiotika ..................................................................... 155 H.6 Tabellenverzeichnis ............................................................................... 155 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung A. bidest. Aqua bidestilliert A. dest Aqua destilliert Ail engl.: attachment and invasion locus allg. allgemein API engl.: analytical profile index ATP Adenosintriphosphat bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius CI engl.: competitive index CIN-Agar Cefsulodin- Irgasan- Novobiocin- Agar d.p.i. engl.: days post infection ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assay g Gramm GALT engl.:gut associated lymphoid tissue ggr. geringgradig GIT Gastrointestinaltrakt H2S Schwefelwasserstoff hgr. hochgradig H-NS engl.: Histone-like nucleoid-structuring protein h lat.: hora i.c. intracardial i.m. intramuskulär InvA Invasin (Invasin A) i.p. intraperitoneal IS Insertionselement i.v. intravenös Yops engl.: Yersinia outer proteins k.A. keine Angaben KBE koloniebildende Einheiten KnR Kanamycinresistent L. propria Lamina propria LB Agar Luria Bertani Agar LB Medium Luria Bertani Medium Lnn. Lymphonodi LPS Lipopolysaccharide lymph. lymphatisch M Molar MCH Mittleres korpuskuläres Hämoglobin (engl.: mean corpuscular hemoglobin) MCHC Mittlere korpuskuläre Hämoglobin-Konzentration (engl.: mean corpuscular hemoglobin concentration) MCV Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (engl.: mean corpuscular volume) mg Milligramm ml Milliliter mM Millimolar μg Microgramm μl Microliter min Minute mgr. mittelgradig Myf engl.: Mucoid Yersinia factor neg. negative OD optische Dichte ODC Ornithindecarboxylase O/F Oxidativ/ Fermentativ PBS engl.: phosphate buffered saline PCR engl.: polymerase chain reaction pH pondus hydrogenii p.i. post infectionem pos. positiv PP Peyersche Platten pYV engl.: Yersinia Virulence plasmid RovA engl.: regulator of virulence A rpm engl.: revolutions per minute RVR engl.: relative virulence ratio s. siehe SPF spezifiziert pathogenfrei ST Serotyp Std. Stunde Tab. Tabelle T3SS Typ 3 Sekretionssystem u.a. unter anderem vgl. vergleiche wt Wildtyp YadA Yersinia Adhäsin A Y. enterocolitica Yersinia enterocolitica YeO:3 Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 YeO:8 Yersinia enterocolitica Serotyp O:8 YmoA engl.: Yersinia modulator A Yops engl.: Yersinia outer proteins Y. pseudotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis Yst engl.: Yersinia stable toxin z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil Einleitung A Einleitung A.1 Einleitung und Zielsetzung Yersinien gehören in Europa zu den häufigsten bakteriellen Erregern von gastrointestinalen Infekten beim Menschen (Epidemiologisches Bulletin des Robert Koch Instituts (RKI), 2012; ECDC-Annual epidemiological report, 2011; European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). Die in erster Linie durch Yersinia (Y.) enterocolitica verursachte Yersiniose ist eine durch Lebensmittel übertragene Zoonose und zeichnet sich klinisch durch Diarrhoe, krampfhafte Bauchschmerzen (Pseudoappendizitis), Fieber und Erbrechen aus. Besonders häufig betroffen sind Kleinkinder (Wehebrink et al., 2008; ECDC-Annual epidemiological report, 2011). Selten kommt es zu einer Sepsis oder zu ernsten Spätfolgen, wie reaktiver Arthritis oder Erythema nodosum (Bottone, 1997; Bottone, 1999). Das Schwein gilt als Reservoirwirt und rohes Schweinefleisch als eine der Hauptinfektionsquellen (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). Y. enterocolitica konnte in mehreren Studien aus Proben von klinisch unauffälligen Mastschweinen isoliert werden (von Altrock et al., 2010; von Altrock et al., 2006; Gürtler et al., 2005). Weitere Untersuchungen zeigten eine serologische Prävalenz von bis zu 66,8 % in Mastbeständen (von Altrock et al., 2006). In Infektionsversuchen im Schwein konnte gezeigt werden, dass der Erreger in der Lage ist, die Tonsillen und den Darmtrakt zu kolonisieren, ohne eine klinisch apparente Erkrankung auszulösen (Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Nielsen et al., 1996). Sowohl in Schweinebeständen als auch in humanen Patienten kommt in Europa und Japan hauptsächlich der Bioserotyp 4/O:3 vor (Wehebrink et al., 2008; Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Fukushima et al., 1983). Die meisten Studien in den letzten Jahren wurden allerdings mit Stämmen des Bioserotyps 1B/O:8 (YeO:8) durchgeführt. Dieser zeigt sich in Mäusen sehr viel virulenter als Serotyp O:3 (YeO:3) (Schiemann, 1988; Robins-Browne und Prpic, 1985) und war bis vor einigen Jahren in Nordamerika endemisch, wird dort aber zunehmend von YeO:3 verdrängt (Schiemann, 1988; Epidemiologisches Bulletin des Robert Koch Instituts (RKI), 2012; Bottone, 1999). Die beiden Serotypen YeO:3 und YeO:8 unterscheiden sich u.a. durch ihre unterschiedliche Expression des Virulenzfaktors Invasin und dessen Regulation durch den Transkriptionsfaktor RovA. Invasin, ein Oberflächenprotein, ermöglicht den Yersinien das Eindringen in die Darmwand durch direkte Bindung an die β1-Integrine 11 Einleitung antigenpräsentierender M-Zellen (Grützkau et al., 1990; Clark et al., 1998). Die invAExpression wird durch RovA temperaturabhängig aktiviert und reguliert (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011). Da Y. enterocolitica auch in der Umwelt vorkommt und sich als psychrotrophes Bakterium bei Temperaturen zwischen 0°C und 43°C vermehren kann (Wehebrink et al., 2008), stellt die Temperaturänderung im Wirtsorganismus auf 37°C wahrscheinlich einen auslösenden Stimulus für die Aktivierung bestimmter Virulenzgene dar. Zum Serotyp O:3 gehörende Stämme weisen im RovA-Gen eine Punktmutation auf, die den Austausch einer Aminosäure im Protein bedingt (Prolin wird durch Serin ersetzt). Dies führt zu einer größeren Stabilität des RovAO:3 (RovAS98) bei höheren Temperaturen (37°C). RovAO:3 ist weniger empfänglich für den Abbau durch ATPabhängige Proteasen und weist eine verbesserte DNA-Bindung auf als RovAO:8 (RovAP98) (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011). Außerdem befindet sich bei Serotyp O:3 ein Insertionselement in der invA-Promotorregion (PinvAIS1667). Dieses beinhaltet einen zusätzlichen Promotor und führt somit zu einer erhöhten invAExpression. Der Serotyp O:8 verfügt nicht über ein solches Insertionselement. Beides führt zu einer vermehrten invA-Exprimierung in YeO:3 verglichen mit YeO:8 (Uliczka et al., 2011). Diese Vorteile könnten ursächlich für das häufigere Vorkommen von Bioserotyp 4/O:3 in Schweinebeständen und auch in humanen Patienten sein. Die Mechanismen, die zu einer symptomlosen Kolonisation des Schweins führen, sind noch unbekannt. Infektionsversuche mit Yersinia enterocolitica in Schweinen wurden zwar bereits durchgeführt (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Nielsen et al., 1996), allerdings stammen Veröffentlichungen hierzu größtenteils aus den 1980er Jahren und sind nur schwer miteinander vergleichbar. Ein einheitliches Infektionsmodell existiert bisher nicht. Auch vergleichende Untersuchungen zu den beiden Serotypen O:3 und O:8 wurden im Schwein bislang nicht durchgeführt. Vor diesem Hintergrund war es das erste Ziel der vorliegenden Arbeit, ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Schwein zu etablieren. Minipigs wurden aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf Unterbringung und Handhabung ausgewählt. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden experimentelle Infektionen mit den Serotypen O:3 und O:8 durchgeführt. In diesen Studien sollte untersucht werden, inwieweit die eingesetzten Stämme in der Lage sind, das Schwein als Wirt zu kolonisieren bzw. zu 12 Einleitung infizieren und ob sich hier Unterschiede in der Virulenz zeigen, wie sie zuvor bereits im Mausmodell beobachtet wurden. Anschließend wurden im dritten Abschnitt die Effekte der vermehrten InvasinExpression in Serotyp O:3 durch Koinfektionsversuche im Minipig untersucht. Eingesetzt wurden verschiedene Mutanten des Serotyp O:3 Stamms Y1, die eine stufenweise verringerte Invasinbildung zeigten. Die Mutagenese „transformiert“ quasi den Serotyp O:3 bezüglich der Invasin-Expression in den Serotyp O:8. So wurden eine RovA-Stabilitätsmutante (YeO:3RovAP98), die das weniger stabile RovA des YeO:8 (RovAP98) aufwies und eine PinvAΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im Promotorbereich des invA-Gens fehlte, untersucht. Schließlich wurde eine Invasin-Knockout-Mutante (ΔinvA) eingesetzt, die kein Invasin exprimierte, um zu untersuchen, wie wichtig dieser Virulenzfaktor für eine Infektion des Schweins durch Y. enterocolitica ist. Abschließend wurden die Ergebnisse der Infektionsversuche im Minipigmodell mit denen des Mausmodells verglichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen, durch Untersuchungen im natürlichen Wirtsorganismus Erkenntnisse zu den Anpassungsmechanismen enteropathogener Yersinien an ihre Wirtshabitate gewinnen zu können. A.2 Literaturübersicht A.2.1 Allgemeine Eigenschaften von Yersinia enterocolitica Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein gramnegatives, kokkoides bis pleomorphes Stäbchenbakterium. Die Gattung Yersinia gehört zur Familie der Enterobacteriaceae. Bisher wurden 15 Spezies beschrieben, von denen drei als humanpathogene Erreger von Bedeutung sind: Y. pestis, der Erreger der Pest, und die beiden enteropathogenen Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis. Yersinien wachsen fakultativ anaerob und können sich als psychrophile Bakterien bei Temperaturen von 4– 42°C vermehren. Diese Eigenschaft wird in der bakteriologischen Diagnostik mit der „Kälteanreicherung“ genutzt. Die optimale Kultivierungstemperatur liegt bei 30°C. Y. enterocolitica ist Oxidase- und Laktosenegativ, Katalase-positiv und bildet weder eine Kapsel noch Sporen (Grötzbach, 2007; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1994). Bei Temperaturen um 13 Einleitung 25°C ist Y. enterocolitica peritrich begeißelt und beweglich, bei 37°C weist das Bakterium keine Begeißelung und somit auch keine Beweglichkeit mehr auf (Bottone, 1977). Y. enterocolitica wird in zwei Subspezies, Y. enterocolitica ssp. palearctica und Y. enterocolitica ssp. enterocolitica, unterteilt (Neubauer et al., 2000). Zudem lassen sich biochemisch sechs Biotypen (Biotyp 1A, 1B, 2- 5) und serologisch 28 Serotypen (nach Oberflächenantigenen) unterscheiden. Die als hoch virulent geltende Y. enterocolitica ssp. enterocolitica umfasst den Biotyp 1B, Y. enterocolitica ssp. palearctica die als weniger virulent angesehenen Biotypen 1A und 2-5 (Batzilla et al., 2011a; Neubauer et al., 2000). Die Einteilung in Bio- und Serovare ist neben molekularbiologischen Methoden diagnostisch von großer Bedeutung, um pathogene Bioserotypen von apathogenen Umweltisolaten zu unterscheiden (Neubauer et al., 2001). A.2.2 Yersinia enterocolitica: Epidemiologie und zoonotische Bedeutung Verbreitung Y. enterocolitica gilt als ein wichtiger durch Lebenmittel übertragbarer Krankheitserreger und hauptsächlicher Verursacher der Yersiniose. Durch Y. pseudotuberculosis verursachte Fälle treten nur selten auf (European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). In Deutschland besteht seit 2001 eine Meldepflicht für humane Yersiniosefälle. Das Robert-Koch-Institut (RKI) registrierte im Jahr 2011 in Deutschland 3.397 gemeldete Erkrankungen (Epidemiologisches Bulletin des Robert Koch Instituts (RKI), 2012), in der Europäischen Union wurden im Jahr 2009 laut European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) 7.686 Fälle erfasst (ECDC-Annual epidemiological report, 2011). Weltweit am häufigsten werden Erkrankungen beim Menschen durch Bioserotyp 4/O3 verursacht (Wehebrink et al., 2008; Bottone, 1999; European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). In Deutschland verursacht Serotyp O:3 annähernd 90 % aller gemeldeten humanen Yersiniosefälle (Rosner et al., 2010), auch in Japan, Australien, Südafrika, Kanada und den USA kommt Serotyp O:3 vor (Bottone, 1999) und scheint in Nordamerika den zuvor dort endemischen Serotyp O:8 zu verdrängen (Schiemann, 1988; Lee et al., 1990; Tauxe, 2002; Bottone, 1999). Seltener kommen Isolate der ebenfalls humanpathogenen Bioserotypen 1B/O:8, 2/O:5,27, 2/O:9 und 3/O:3 vor (Fredriksson- 14 Einleitung Ahomaa et al., 2006a). Biotyp 1A gilt als apathogen, wobei eine fakultative Pathogenität diskutiert wird (Batzilla et al., 2011b; Bottone, 1999). Das Schwein als Reservoirwirt Schweine, insbesondere Mastschweine, gelten als Reservoir für humanpathogene Yersinien (Bottone, 1999; Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). In zahlreichen Studien konnte Y. enterocolitica aus Proben von klinisch gesunden Schweinen isoliert werden (Fukushima et al., 1983). Die serologische Prävalenz in Mastschweinen lag bei bis zu 66,8 % (von Altrock et al., 2006). Kulturell konnten Yersinien mit ähnlich hoher Prävalenz aus Tonsillen von Schlachtschweinen isoliert werden, aus Faeces waren die Nachweisraten allerdings geringer (Thibodeau et al., 1999; FredrikssonAhomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005; von Altrock et al., 2006). Dabei wurden z.T. große Unterschiede zwischen den Prävalenzen innerhalb der einzelnen Betriebe festgestellt (Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005). In epidemiologischen Untersuchungen, die mittels PCR durchgeführt wurden, war die Nachweisrate oftmals höher als in Studien mit rein kulturellen Nachweismethoden (Johannessen et al., 2000; Fredriksson-Ahomaa und Korkeala, 2003; Bhaduri et al., 2005). Die von Schweinen gewonnenen Isolate gehörten fast ausschließlich zu Bioserotyp 4/O:3 (Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Fukushima et al., 1983; Pilon et al., 2000; von Altrock et al., 2010), der auch bei humanen Yersiniosepatienten dominiert. Mit kulturell-biochemischen (Fukushima et al., 1983; Lee et al., 1990) und molekularbiologischen (Andersen und Saunders, 1990; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001b; Wojciech et al., 2004) Methoden konnte eine große Übereinstimmung zwischen Y. enterocolitica Stämmen aus Proben humanen und porzinen Ursprungs festgestellt werden. Auch für pathogene Yersinien typische Virulenzfaktoren konnten in Isolaten aus Schweinebeständen nachgewiesen werden (Korte et al., 2004; Gürtler et al., 2005). Innerhalb der Schweinebestände ist eine fäkal-orale Übertragung und Verbreitung der Yersinien durch Zukauf von Absetzferkeln von verschiedenen Ferkelerzeugern oder über Transportfahrzeuge anzunehmen (Fukushima et al., 1983; Skjerve et al., 1998; Thibodeau et al., 1999). Während von Mastschweinen sehr frequent Y. enterocolitica -Stämme isoliert werden konnten, gelang der Nachweis in Proben von neugeborenen Ferkeln und Sauen nur selten oder z.T. überhaupt nicht (Korte et al., 2004; Gürtler et al., 2005). Korte et al. (2004) diskutieren eine Rolle der Sau als 15 Einleitung Quelle für Saugferkelinfektionen. Nach experimenteller Infektion von tragenden Sauen mit Y. enterocolitica konnte der Erreger aus dem Organmaterial totgeborener Ferkel und der Plazenta isoliert werden (Platt-Samoraj et al., 2009a). Gürtler et al. (2005) zeigten außerdem eine Persistenz von Y. enterocolitica in den Tonsillen von Mastschweinen. In Untersuchungen von Umweltproben aus Schweinebeständen (Futter, Oberflächen, Staub, Fliegen) konnten keine Yersinien nachgewiesen werden (Gürtler et al., 2005), was für eine direkte Übertragung von Tier zu Tier spricht. Infektionsquellen für den Menschen Die psychrophile Eigenschaft von Y. enterocolitica führt zu einer großen Bedeutung des Erregers in der Lebensmittelsicherheit, da eine Vermehrung auch unter Kühlbedingungen (ca. 4°C) möglich ist. Für eine wichtige Rolle des Schweins als Überträger von pathogenen Yersinien auf den Menschen spricht die hohe Nachweisrate von Y. enterocolitica in rohem Schweinefleisch und Schweinefleischprodukten (Fredriksson-Ahomaa et al., 2004). Besonders häufig konnte das Bakterium aus Zunge und Innereien isoliert werden, aber auch aus Hackund anderen Fleischproben. Fredriksson-Ahomaa et al. wiesen yadA-positive Yersinien in Proben von Tonsillen, Leber, Herz und Nieren von Schlachtschweinen nach (Fredriksson-Ahomaa et al., 2000b; Fredriksson-Ahomaa et al., 2000a). In einer Fallkontrollstudie konnten ail-positive Stämme in 10 % der untersuchten rohen Schweinefleischproben (Lende, Filet, Kotelett, Schinken, Hackfleisch) nachgewiesen werden (Thisted Lambertz S. und Danielsson-Tham, 2005). Fredriksson-Ahomaa et al. (2001a) konnten zeigen, dass es durch den Umgang mit dem Geschlinge während des Schlachtprozesses zu einer Kontamination von Zunge, Lunge, Herz, Leber und ggf. auch Nieren kommt, da Zunge und Tonsillen mit den anderen Organen zusammen an Haken aufgehängt oder auf Förderbänder gelegt werden. Tauxe et al. (1987) vermuteten die Ursache für eine z.T. hohe Kontamination von Hackfleisch mit Y. enterocolitica in einer regional üblichen Verwertung von Kopffleisch und Tonsillen. In Fallkontrollstudien stellte sich der Verzehr von rohem Schweinefleisch als größter Risikofaktor für die Erkrankung an Yersiniose heraus (Tauxe et al., 1987; Ostroff et al., 1994). Außer rohem Schweinefleisch spielt in einigen Ländern auch unbehandeltes Trinkoder Oberflächenwasser eine Rolle als mögliche Infektionsquelle (Ostroff et al., 1994; Sandery et al., 1996; Falcao et al., 2004). Der enge Kontakt zu Haustieren, wie 16 Einleitung Hunden und Katzen, kommt vor allem für Kleinkinder als eine weitere Infektionquelle infrage. Fredriksson-Ahomaa et al. (2001c) konnten zeigen, dass sowohl für Hunde als auch für Katzen eine Infektion über die Fütterung mit rohem Schweinefleisch und Schlachtnebenprodukten vom Schwein möglich ist und diese Tierarten die Yersinien über einen längeren Zeitraum mit dem Kot ausscheiden. A.2.3 Yersiniose bei Menschen und Tieren: Klinische Symptome Die humane Yersiniose zeigt sich klinisch in einer Gastroenteritis mit Diarrhoe. Sie tritt besondes häufig bei Kleinkindern auf und kann bei diesen auch zu einer hämorrhagischen Diarrhoe führen. In älteren Kindern und Jugendlichen tritt oft eine Ileitis und akute mesenterische Lymphadenitis mit krampfartigen Schmerzen (Pseudoappendizitis) auf, die nicht selten zu einer ineffektiven Appendektomie führt. In Verbindung mit prädisponierenden Faktoren, wie Immundefizienz oder Eisenüberladung, wurden auch Fälle von Sepsis durch Y. enterocolitica beschrieben. Eine Yersiniose kann außerdem immunogene Spätfolgen, wie reaktive Arthritis, Erythema nodosum, Myocarditis und Glomerulonephritis, nach sich ziehen (Bottone, 1999). Die Primärerkrankung selbst verläuft allerdings häufig als eine milde, selbstlimitierende Diarrhoe (Tauxe et al., 1987). Serologische Untersuchungen bei gesunden Blutspendern in Finnland und Deutschland zeigten eine hohe Prävalenz von Serotyp O:3 bzw. O:9 spezifischen Antikörpern, was auf ein häufiges Vorkommen von subklinischen Infektionen hinweist (Mäki-Ikola et al., 1997). Beim Schwein treten klinisch manifeste Erkrankungen nur bei Jungtieren auf, ältere Tiere sind symptomlose Träger (Neubauer et al., 2001). In einem Fallbericht wurde eine durch Y. enterocolitica Serotyp O:3 verursachte, letal verlaufende Infektion in einem Minipig-Ferkel geschildert, die mit hochgradiger Enteritis und Septikämie einherging (Brügmann et al., 2001). Dieser Fall scheint allerdings eine seltene Ausnahme zu bilden. Auch in einigen Infektionsversuchen im Schwein konnte unter besonderen Bedingungen eine klinisch manifeste Erkrankung der Tiere beobachtet werden [vgl. 2.8 Infektionsversuche im Schwein]. Experimentelle Infektionen in Mäusen werden unter A.2.7 beschrieben. Hunde und Katzen gelten wie das Schwein als asymptomatische Träger von Y. enterocolitica (Fenwick et al., 1994; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001c), allerdings 17 Einleitung gab es bisher nur wenige Studien zum Vorkommen humanpathogener Yersinien in Haustieren und einer möglichen Übertragung auf den Menschen. A.2.4 Virulenzfaktoren enteropathogener Yersinien Y. enterocolitica kolonisiert nach erfolgter oraler Aufnahme den Dünndarm, überwindet die Darmbarriere über M-Zellen und vermehrt sich anschließend im darunterliegenden lymphatischen Gewebe, den Peyerschen Platten (Pujol und Bliska, 2005). Über den Lymphfluss oder Blutgefäße gelangen die Yersinien anschließend auch in die regionalen Lymphknoten und können so eine akute Lymphadenitis verursachen (Bottone, 1999). Alle bisher als pathogen eingestuften Y. enterocolitica Stämme besitzen nur ein Virulenzplasmid. Dieses 70 kb große Virulenzplasmid (pYV) codiert für ein Typ-IIISekretionssystem (T3SS) und verschiedene Effektorproteine, die sogenannten Yops (engl.: Yersinia outer proteins): YopH, YopM, YopE, YpkA/YopO und YopJ/P. YopT konnte bisher ausschließlich in Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Effektorproteine werden mithilfe des T3SS über eine nadelähnliche Struktur in die Wirtszelle sezerniert. Sie ermöglichen es dem Bakterium, der angeborenen Immunantwort des Wirtsorganismus zu entgehen. YopH ist eine Tyrosinphosphatase mit antiphagozytischer Wirkung (Viboud und Bliska, 2005). YopE, ein GTPaseaktivierendes Protein, wirkt zytotoxisch (Rosqvist et al., 1994) und konnte im Mausmodell als wichtiger Virulenzfaktor ermittelt werden (Black und Bliska, 2000). YopM, ein Gerüstprotein, ist im Mausmodell ebenfalls wichtig für die Virulenz des Erregers (Mulder et al., 1989; Navarro et al., 2005). YopT ist eine Cysteinprotease mit antizytotoxischer Wirkung (Trosky et al., 2008), YpkA/YopO verhindert als multifunktionelles Protein u.a. die Phagozytose des Bakteriums und wird ebenfalls für einen virulenten Phänotyp in der Maus benötigt (Grosdent et al., 2002; Navarro et al., 2005; Wiley et al., 2006; Trasak et al., 2007). YopJ, eine Serin- Threoninacetyltransferase, blockiert die Zytokinproduktion durch Hemmung von Signalwegen in infizierten Zellen und fördert dadurch die Apoptose der Wirtszelle (Palmer et al., 1998). YopB stellt kein eigentliches Effektorprotein dar, sondern wird als Bestandteil der Pore für die Translokation der Yops benötigt (Tardy et al., 1999). Außer den Genen für das T3SS und die Effektorproteine befinden sich auf dem pYV auch die Gene für yadA (Yersinia Adhäsin A) und virF, einen Transkriptionsfaktor, 18 Einleitung der das Virulenz-Regulon aktiviert. YadA vermittelt außer seiner adhäsiven Funktion auch die Fähigkeit der pathogenen (Virulenzplasmid tragenden) Yersinien zur Autoagglutination (Laird und Cavanaugh, 1980; Roggenkamp et al., 1996) und besitzt protektive Eigenschaften gegenüber dem Komplementsystem des Wirtsorganismus (Schindler et al., 2012). Das Virulenzplasmid vermittelt die Fähigkeit der pathogenen Yersinien, zu denen die Biotypen 1B, 2, 3, 4 und 5 gerechnet werden, in lymphatischem Gewebe zu überleben und sich zu vermehren (Tennant et al., 2003). In Studien mit verschiedenen Serotypen konnte gezeigt werden, dass pathogene Y. enterocolitica Stämme das Virulenzplasmid auch unter Kultivierungsbedingungen mit sehr hohem Salzgehalt oder niedrigem pH, wie sie zur Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt werden, nicht verlieren (Bhaduri, 2011). Das Vorhandensein des Virulenzplasmids allein genügt allerdings nicht für die vollständige Ausprägung eines virulenten Phänotyps (Heesemann et al., 1984). Chromosomal codierte Virulenzfaktoren sind außerdem Invasin (invA), Ail (engl.: attachment and invasion locus), Myf (engl.: mucoid yersinia factor) und das hitzestabile Enterotoxin Yst (engl.: Yersinia stable toxin). Ail ist ein membranassoziiertes Protein, das unabhängig von Invasin die Aufnahme der Bakterien in die Wirtszellen vermittelt (Miller und Falkow, 1988). Außerdem begünstigt Ail ebenso wie YadA eine Serumresistenz der Yersinien. Das Myf-Antigen ist ein fimbrienähnliches Oberflächenprotein und putatives Adhäsin (Iriarte et al., 1993). Das hitzestabile Enterotoxin (Yst) der Yersinien weist Ähnlichkeit mit dem bei enterotoxischen Escherichia coli vorkommenden Enterotoxin auf, weshalb davon ausgegangen wird, dass es für das Auftreten von Diarrhoe im Rahmen einer Yersiniose verantwortlich ist (Takao et al., 1985). Es wurde mehrfach eine Korrelation zwischen den Bioserotypen und dem Vorkommen der verschiedenen Virulenzfaktoren nachgewiesen (Thoerner et al., 2003; Falcao et al., 2004; Gürtler et al., 2005). A.2.5 Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin Für das Anhaften an und die Invasion in Epithelzellen werden die beiden chromosomal codierten Virulenzgene invasin (invA) und ail (engl.: attachment and invasion locus) benötigt (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). Auch yadA vermittelt 19 Einleitung die Adhäsion an Epithelzellen, allerdings spielt es eine größere Rolle im späteren Stadium der Infektion, z.B. für die Persistenz in Lymphfollikeln (Pepe et al., 1995). Invasin wird bislang als wichtigster Faktor für die initiale Invasion der Bakterien in die Darmepithelzellen und das darunterliegende Gewebe angesehen (Miller und Falkow, 1988). Es ist ein relativ großes Protein (92 kD) auf der Bakterienoberfläche, das direkt an β1-Integrine der antigenpräsentierenden M-Zellen bindet und so die Internalisierung der Bakterien in die Zellen vermittelt (Grützkau et al., 1990; Clark et al., 1998). Die invasin-Expression wird temperaturabhängig durch den Transkriptionsfaktor RovA (engl.: regulator of virulence A) reguliert (Ellison et al., 2004; Heroven et al., 2008; Quade et al., 2012). RovA, ein globaler Regulator, bindet direkt an den Promotor des invA-Gens und aktiviert dadurch die Bildung von Invasin (Nagel et al., 2001). RovA zeigt dabei eine antagonistische Wirkung gegenüber H-NS (engl.: histone-like nucleoid structuring protein) und YmoA (engl.: Yersinia modulator A), die die invA-Expression inhibieren (Heroven et al., 2004; Ellison und Miller, 2006). Bei Temperaturen von 37°C ändert sich die Faltung des RovA-Proteins. Seine DNABindungskapazität verringert sich bei diesen Temperaturen und es wird leichter angreifbar für die Spaltung durch ATP-abhängige Proteasen. Da die Expression von rovA positiv autoreguliert ist, vermindert dies die Bildung von RovA in den Bakterien erheblich (Herbst et al., 2009). In Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) führt eine Punktmutation zum Austausch einer Aminosäure im RovA-Protein (Prolin wird durch Serin ersetzt). Das RovA des YeO:3 (RovAO:3 bzw. RovAS98) bleibt dadurch bei 37°C in seiner Proteinfaltung stabil, weist eine verbesserte DNA-Bindung auf und ist weniger empfänglich für den Abbau durch ATP-abhängige Proteasen als das RovA des Serotyps O:8 (RovAP98) (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011). Uliczka et al. (2011) konnten zeigen, dass ein weiterer Unterschied zwischen YeO:3 und YeO:8 im Vorhandensein eines Insertionselements im Promotorbereich des invA-Gens (PinvAIS1667) bei Serotyp O:3 liegt. Dieses Insertionselement beinhaltet einen zusätzlichen Promotor und erhöht dadurch die Expression des Virulenzgens invA. Bei Serotyp O:8 fehlt ein solches Insertionselement. Die beiden beschriebenen Unterschiede führen letztlich zu einer erhöhten Invasinbildung in YeO:3 verglichen mit YeO:8. 20 Einleitung A.2.6 Kultureller Nachweis pathogener Yersinien Eine einheitliche Vorgabe zum kulturellen Nachweis von präsumptiv pathogenen Y. enterocolitica in Lebens- und Futtermitteln findet sich in der Norm DIN EN ISO 10273:2003-12.: „In der Norm ist ein horizontales Verfahren zum Nachweis von präsumtiv pathogenen Yersinia enterocolitica festgelegt. Der Nachweis wird in drei aufeinander folgenden Schritten durchgeführt: Der Anreicherung in den selektiven flüssigen Medien PSBBouillon und ITC-Bouillon folgt die Verbringung der gewonnenen Kulturen auf CINAgar und SSDC-Agar zwecks Identifizierung. Nach 24- bzw. bei Bedarf 48-stündiger Inkubation in Abhängigkeit vom Medium wird die Anwesenheit charakteristischer Kolonien von Y. enterocolitica geprüft. Es folgen die biochemische Bestätigung sowie die Prüfungen zur Biotypisierung, die Prüfung zur Feststellung der Pathogenitätskriterien und falls erforderlich serologische Untersuchungen.“ Eine Evaluierung dieser Methode zeigte allerdings eine sehr geringe Sensitivität der kulturellen Methode. Mit dieser gelang der Nachweis pathogener Yersinien in Lebensmitteln erst ab einer Belastung von >104 KBE/g, während der Nachweis mittels Real-Time PCR zum Nachweis des ail-Gens als geeignete ScreeningMethode beschrieben wurde (Fredriksson-Ahomaa et al., 2008). Für den kulturellen Nachweis von Y. enterocolitica aus Proben mit geringem Keimgehalt oder hoher Begleitflora eignet sich die Kälteanreicherung bei 4°C in PBS für bis zu 21 Tage mit wöchentlichem Ausstrich auf Selektivnährböden. Die Anzucht auf Nährböden erfolgt bei 28-30°C für bis zu 48 Std. Auf CIN-Agar (Yersinia-Agar nach Schiemann) bildet Y. enterocolitica charakteristische, feine dunkelviolette Kolonien, die von einem transparenten Hof umgeben sind (Bisping W. und Amtsberg G., 1988). Das Vorhandensein des pYV geht mit bestimmten phänotypischen Merkmalen einher, die in die diagnostische Untersuchung mit einbezogen werden können. Zu diesen Merkmalen gehören die Autoagglutination (Laird und Cavanaugh, 1980; Aulisio et al., 1983), die Calciumabhängigkeit des Wachstums (Gemski et al., 1980), die Kristallviolettbinding (Bhaduri et al., 1987) und die Kongorotbindung (Prpic et al., 1983). 21 Einleitung A.2.7 Infektionsversuche im Mausmodell Schiemann et al. (1988) zeigten in experimentellen Infektionen im Mausmodell, dass YeO:8 virulenter war als YeO:3, letzterer allerdings bis zu fünf Tage p.i. in hohem Maße mit den Faeces ausgeschieden wird. Auch in anderen Studien wurde YeO:8 in Mäusen als sehr virulent beschrieben (Robins-Browne und Prpic, 1985). Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm 8081v zeigte sich im Mausmodell wesentlich weniger virulent, wenn das invasin-Gen ausgeschaltet wurde. Die LD50 allerdings blieb bei der invA-Mutante und dem Wildtyp sowohl bei oraler als auch bei intraperitonealer Infektion der Mäuse gleich (Pepe und Miller, 1993). Y. enterocolitica Serotyp O:8-Mutanten, denen das rovA fehlt, zeigten sich im Mausversuch insofern attenuiert als sie in geringerer Anzahl in Organen nachweisbar waren und eine mildere Entzündung in den Peyerschen Platten auslösten als der YeO:8 Wildtyp (Dube et al., 2003). Auch eine 70fach erhöhte LD50 im Vergleich mit dem Wildtypstamm konnte gezeigt werden (Revell und Miller, 2000). Dube et al. (2003) fanden allerdings heraus, dass sich diese Attenuierung in erster Linie nach oraler Infektion der Mäuse zeigte, während die rovA-Mutante nach intraperitonealer Infektion wesentlich virulenter erschien. Diese Beobachtung werteten sie als Hinweis darauf, dass RovA eine wesentliche Rolle in den ersten Phasen der Infektion spielt. Insgesamt zeigte sich die rovA-Mutante um ein vielfaches abgeschwächter, als eine invA-Mutante, was darauf hindeutet, dass RovA außer invA noch weitere Virulenzgene reguliert, die ebenfalls notwendig für eine Invasion der Bakterien in die Peyerschen Platten oder tiefer liegende Gewebe sind (Ellison et al., 2004). Uliczka et al. (2011) testeten Serotyp O:3-Mutanten im Mausmodell und konnten in Infektionen mit jeweils einem Stamm pro Tiergruppe keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante feststellen. In Koinfektionsversuchen allerdings konnten sie eine wesentlich größere Organbelastung mit einer RovAP98-Mutante feststellen, die das weniger stabile RovA des YeO:8 exprimierte, als mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1. Im Kontrast dazu konnten Uliczka et al. (2011) auch zeigen, dass eine PinvAΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im invA-Promotorbereich fehlte, im Vergleich zum YeO:3 Wildtyp in wesentlich geringeren Mengen aus den Peyerschen Platten und den mesenterialen Lymphknoten der infizierten Mäuse reisoliert werden konnte. 22 Einleitung A.2.8 Infektionsversuche im Schwein Fukushima et al. (1984) fanden nach oraler experimenteller Infektion von Mastschweinen verschiedenen Alters große Unterschiede zwischen den Individuen bezüglich der Ausscheidung der Yersinien mit den Faeces. Die Ausscheidung nach einer Infektion mit Bioserotyp 4/O:3 schien dabei unabhängig vom Alter der Tiere, für eine Infektion mit Bioserotyp 2/O:5,27 erschienen jüngere Tiere anfälliger. Die Infektionsdosis betrug 2,6x109 KBE und wurde per Katheter direkt in den Magen appliziert. Nach einer Infektion mit gleichzeitiger Gabe von 100 ml einer 10 %igen NaHCO3-Lösung konnte nachfolgend eine höhere Ausscheidung beobachtet werden. In den Faeces konnten 102 bis 106 KBE/g über mehrere Wochen p.i. nachgewiesen werden. Außerdem wurde eine horizontale Übertragung beobachtet. Robins-Browne et al. (1985) untersuchten die Pathogenität von Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 sowie verschiedener Mutanten in gnotobiotischen Ferkeln. Sie beobachteten, dass eine klinische Manifestation in den Tieren mit intestinalen Läsionen in Abhängigkeit von der Infektionsdosis auftrat: Nach oraler Infektion mit 2x109 KBE pro Tier war der Verlauf subklinisch bis mild, während alle gnotobiotischen Ferkel, die 4x1010 KBE erhielten, innerhalb von 24 Stunden verendeten. Pathologisch-anatomisch sowie histologisch konnten in den Organen der Tiere leicht geschwollene mesenteriale Lymphknoten, Nekrosen in der Lamina propria (L. propria), bakterielle Mikrokolonien, Entzündungszellen und Ulzera an den Zottenspitzen sowie Zottenverlust festgestellt werden. Dabei war das Ileum stärker betroffen als Jejunum und Dickdarm. Elektronenmikroskopisch konnten Bakterien im Zytoplasma von Phagozyten beobachtet werden. Bioserotyp 1/O:5 hingegen zeigte keine Invasion in die Darmwand oder extraintestinale Organe. Es konnten keine Auswirkungen des Enterotoxins und kein entsprechendes Toxin im Darm nachgewiesen werden. Mutanten, denen das Virulenzplasmid fehlte, lösten keine klinischen Symptome in den infizierten Tieren aus, waren jedoch aus dem Gewebe isolierbar. Schiemann (1988) verglich in per Kaiserschnitt entbundenen Ferkeln ohne Kolostrumgabe und natürlich geborenen Ferkeln die Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:8, O:21, O:3 und O:13, wobei Serotyp O:3 nicht in natürlich geborenen Ferkeln untersucht wurde. Letztere schieden die Bakterien in geringeren Mengen aus, auch die Organbelastung war bei diesen Tieren geringer. Er schlussfolgerte, 23 Einleitung dass sich die Infektion bei Ferkeln normalerweise auf Rachen und Darmtrakt beschränkte. Eine klinisch manifeste Erkrankung konnte in den natürlich geborenen Ferkeln mit Zugang zu Kolostrum nicht beobachtet werden, obwohl diese mit einer sehr hohen Infektionsdosis von 1013 KBE belastet wurden. Per Kaiserschnitt entbundene Ferkel erhielten 1010 KBE und entwickelten nach erfolgter Infektion mit den Serotypen O:13 und O:21 schwere Symptome oder verendeten. Auch bei Serotyp O:8 zeigte sich eine schwerwiegende Erkrankung in einem von zwei per Sektio entbundenen Ferkeln. In allen infizierten Tieren wurde eine bakterielle Kolonisation der Tonsillen und Ausscheidung mit den Faeces nachgewiesen. Da sich die natürlich geborenen Ferkel wesentlich weniger anfällig zeigten und keines von ihnen trotz der sehr hohen Infektionsdosis verendete oder schwere Symptome zeigte, zog Schiemann den Schluss, dass Y. enterocolitica nicht sehr virulent für Ferkel sei. Thibodeau et al. (1999) infizierten fünf Wochen alte Hybridschweine mit ca. 108 KBE YeO:3 und fanden anschließend keine klinischen Symptome in den infizierten Tieren und pathologisch-anatomisch nur ggr. Läsionen im Magendarmtrakt. Thibodeau et al. (2001) infizierten ebenfalls fünf Wochen alte Hybridschweine mit einer „relativ geringen Infektionsdosis“ der Serotypen O:3, O:5,27 und O:9 und konnten nachfolgend keine klinischen Symptome beobachten. Sie reisolierten die Bakterien aus den Tonsillen und Faeces der Tiere, konnten sie allerdings nicht in den Lnn. retropharyngei, den mesenterischen Lymphknoten, dem Ösophagus, Duodenum, Jejunum, Ileum (PPs), Magen, sowie der Leber und Milz nachweisen. Nielsen et al. (1996) infizierten SPF-Schweine über das Futter mit ca. 108 KBE Y. enterocolitica Bioserovar 4/O:3. Sie konnten ebenfalls keine klinisch manifeste Erkrankung der Tiere feststellen, fanden die Bakterien jedoch vom fünften bis zum 21. Tag p.i. in den Faeces. Platt-Samoraj et al. (2009a) infizierten tragende Sauen auf oralem Weg in verschiedenen Trächtigkeitsstadien mit ca. 2,7x109 KBE eines Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamms, der zuvor aus Tonsillen eines abortierten Schweinefetus isoliert worden war. Auch die Sauen zeigten keine Klinik bis auf die spät infizierten (Tag 89 dp) Tiere, die eitrigen Vaginalausfluss aufwiesen. Die Sauen zeigten einen unauffälligen Trächtigkeitsverlauf ohne Aborte, allerdings gelang der Nachweis der Yersinien in Rektal-, Oral-, Vaginal- und Halstupfern und zudem in Placentaproben und Organen von totgeborenen Ferkeln. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass 24 Einleitung nach einer Infektion im letzten Drittel der Trächtigkeit eine intrauterine Übertragung auf die Ferkel möglich sei. Experimentelle Infektionen mit Y. enterocolitica in Minipigs wurden bisher nicht beschrieben. Auch ein orales Infektionsmodell in Hybridschweinen, das für Folgestudien eingesetzt wurde, ist bislang nicht publiziert worden. 25 Material und Methoden B Material und Methoden B.1 Bakterienstämme, Kultivierung und Differenzierung B.1.1 Verwendete Yersinia enterocolitica-Stämme Für die experimentellen Infektionen wurden zwei verschiedene Wildtypstämme von Yersinia (Y.) enterocolitica eingesetzt. Der Stamm Y1 gehört zum Bioserotyp 4/O:3 (YeO:3) und stammt von einem humanen Patienten. Stamm 8081v gehört zum Bioserotyp 1B/O:8 (YeO:8) und ist ebenfalls ein Patientenisolat aus der Humanmedizin. In den Koinfektionsversuchen [vgl. C.3.2] wurde zudem der Stamm YE13 eingesetzt. Dieser verhält sich wie Stamm Y1, besitzt aber eine Kanamycinresistenzkassette, die es ermöglicht, ihn von der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 zu unterscheiden. Die drei in den Koinfektionsversuchen eingesetzten Mutanten stammen ebenfalls vom YeO:3 Stamm Y1. In der RovA-Stabilitätsmutante YE14 wird das bei 37°C weniger stabile RovA des YeO:8 exprimiert (RovAP98, RovAYeO:8); bei diesem ist die Aminosäure Serin des RovA-Proteins an der Position 98 durch Prolin ersetzt. Bei der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invAPromotorbereich. Das IS1667 ist bei YeO:3 vorhanden und führt zu einer verstärkten invA-Expression, fehlt aber bei YeO:8. Der ∆invA-Mutante fehlt das invA-Gen, dadurch wird Invasin A nicht exprimiert. Die Stämme YE13, YE14 und YE21 sind kanamycinresistent (KnR) aufgrund einer chromosomal verankerten Kanamycinresistenzkassette, während die Stämme 8081v, Y1 und YE15 kanamycinsensibel sind (Tab. 1). Die Stämme YE13, YE14, YE15 und YE21 wurden in der Arbeit von Frank Uliczka, Ph.D. konstruiert (Uliczka et al., 2011). Der Serotyp O:8 Stamm 8081v wurde von Pepe und Miller (1993) beschrieben. Alle eingesetzten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Yersinienstämme wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Petra Dersch (Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie, HelmholtzZentrum für Infektionsforschung, Braunschweig) und Dr. Eckhard Strauch (Bundesinstitut für Risikobewertung) im Rahmen der Kooperation innerhalb des BMBF-Forschungsverbunds Foo-Borne Zoonotic Infections of Humans (FBI-Zoo) zur Verfügung gestellt. 26 Material und Methoden Tab. 1: Verwendete Y. enterocolitica Stämme und deren Herkunft. B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion Die Yersinien wurden zunächst auf Blutagar mit 3 % Schafblut über Nacht angezüchtet. Dann wurde eine Einzelkolonie in 50 ml LB-Medium in einen 4erSchikanekolben überimpft und über Nacht (für 13 bis 15 h) bei 25°C und 150 rpm in einem Inkubations-Schüttler (CERTOMAT® IS, Sartorius Stedim Biotech, Sartorius) inkubiert. Bei der Anzucht der Kanamycin-resistenten Stämme (YE13, YE14, YE21) wurden dem LB-Medium 25 µg Kanamycin pro ml zugesetzt. Von den Übernachtkulturen (ÜNK) wurden 30 ml Aliquots bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet in sterilem PBS aufgenommen. Der Waschschritt in PBS wurde dreifach durchgeführt. Anschließend wurde die Infektionssuspension mit sterilem PBS auf eine OD600 = 1,0 eingestellt (Eppendorf Bio Photometer, Eppendorf AG). Diese Trübung entspricht einer Konzentration von ca. 109 KBE/ml. Für die orale Infektion wurde die benötigte Menge pro Tier in 1 ml sterilem PBS aufgenommen und jede Infektionsdosis bis zur Verwendung in einem 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß auf Eis gelagert. Die Reinheit der ÜNK und der Verdünnung in PBS wurde mittels fraktionierten Ausstrichen auf Blut- und Gassneragar kontrolliert. Die exakte Infektionsdosis wurde durch Verdünnungsreihen der OD600 = 1,0 Lösung bestimmt. Hierzu wurden vier Verdünnungsstufen (10-4 bis 10-7) im Doppelansatz auf LB-Agar ausgestrichen (je 100µl), über Nacht bei 30°C inkubiert und die KBE/100 µl gezählt. Die Zusammensetzung bzw. Herstellung Antibiotikazusätze ist im Anhang aufgeführt. 27 aller Medien, Nährböden und Material und Methoden B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch Resistenzen Die bei der Sektion entnommenen Organproben von Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum (nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener Infektionsdosen, vgl. C.1.1), mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber, Milz und Niere wurden quantitativ auf die Belastung mit Y. enterocolitica untersucht. Tonsillen und Darmabschnitte wurden zuvor mit sterilem PBS gespült und für 30 Min. in Gentamicinlösung (50 µg/ml in PBS) inkubiert, um Bakterien auf der (luminalen) Oberfläche abzutöten. Nach der Inkubation mit Gentamicin wurden die Tonsillen und Darmabschnitte dreimal mit sterilem PBS gewaschen. Die Organstücke wurden gewogen und ca. 1 g pro Organ wurde in 5 ml sterilem PBS homogenisiert (30000 rpm, 30 Sek., Polytron PT 2100 Homogenisator, Kinematica AG). Von vier Verdünnungsstufen (100, 10-1, 10-2, 10-3) dieses Homogenisats wurden je 50 µl im Doppelansatz auf CIN-Agar mit Carbenicillinzusatz (carb) ausplattiert, bei 30°C für bis zu 48 Std. inkubiert und die Kolonien ausgezählt. Im Rahmen der Koinfektionsversuche wurde je ein Doppelansatz jeder Verdünnungsstufe auf CINAgar mit (CIN +carb +Kn) und ohne zusätzlichen Kanamycinzusatz (CIN +carb) ausplattiert. In der statistischen Auswertung wurden nur Zählwerte ≥ 15 Kolonien pro Platte berücksichtigt. Von jeder Agarplatte wurde eine typische Kolonie subkultiviert, um den jeweiligen Y. enterocolitica -Stamm zu überprüfen [vgl. B.1.5]. B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung Rektal- und Tonsillentupfer, Kotproben und Organproben aus der Sektion wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht. Im Fall der Organproben geschah dieses zusätzlich zur quantitativen Untersuchung, da die Kälteanreicherung zwar nur eine rein qualitative Aussage zulässt, aber sensitiver ist als die Direktkultur (Bisping W. und Amtsberg G., 1988). Tupfer, 1 g Kot bzw. 200 µl des OrganHomogenisats [s. B.1.3] wurden zu 9 ml sterilem PBS in Reagenzgläser gegeben und für 21 Tage bei 4°C inkubiert. Jeweils nach sieben, vierzehn und einundzwanzig Tagen wurden fraktionierte Ausstriche auf CIN-Agar untersucht. In Koinfektionsversuchen wurden diese auf CIN-Agar mit und ohne Kanamycinzusatz ausgestrichen. Von typisch aussehenden Kolonien wurden Subkulturen biochemisch untersucht [s. B.1.5]. 28 Material und Methoden B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate Von den Kolonien, die auf CIN-Agar die für Y. enterocolitica charakteristische Morphologie zeigten (dunkelviolette, kleine Kolonien mit hellem Randsaum, Ø 1 mm, Nährboden um die Kolonien rosa verfärbt), wurden Subkulturen auf Blut- und Gassneragar angelegt. Wenn auch diese morphologisch Y. enterocolitica entsprachen (auf Blutagar feine, weißlich-undurchsichtige Kolonien, Ø 1 mm, laktosenegativ auf Gassneragar) und ein Oxidasetest (Bactident® Oxidase, Merck KGaA) negativ ausfiel, wurde eine weitere biochemische Differenzierung durchgeführt. Folgende Reaktionen wurden hierbei überprüft: H2S-Bildung (KliglerAgar), Harnstoffabbau (Urease), Citratverwertung, Mannitspaltung, Ornithin- decarboxylase (ODC), oxidativer und fermentativer Kohlenhydratabbau (O/F-Test) und Indolbildung. Weitere biochemische Reaktionen wurden nach Bedarf durchgeführt, um die Infektionsstämme von vor der Infektion von den Minipigs isolierten Stämmen (Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. enterocolitica) zu unterscheiden. Die ggf. zusätzlich getesteten Reaktionen waren Inositspaltung (Säurebildung aus Myo-Inosit), Rhamnoseabbau und Äskulinspaltung. Die biochemischen Reaktionen der eingesetzten Yersinienstämme sind in Tabelle 2 dargestellt. In den wenigen Fällen, in denen Yersinien bei der Einstallung aus Kottupfern isoliert wurden, war es nie möglich, diese im weiteren Versuchsverlauf erneut aus Proben der Tiere zu isolieren. Tab. 2: Biochemische Reaktionen der eingesetzten Y. enterocolitica Stämme. 29 Material und Methoden Von den aus Organproben gewonnenen Isolaten wurde zusätzlich pro Tier ein Isolat mit dem API 20E®-Testsystem (bioMérieux Deutschland GmbH) untersucht. B.2 Versuchstiere, experimentelle Infektionen und Versuchsdesign Insgesamt wurden fünf Tierversuche mit 114 Minipigs durchgeführt. Die Ferkel waren zwischen fünf und sieben Wochen alt (durchschnittliches Alter: 44 Tage). Es wurden sowohl weibliche als auch kastrierte männliche Tiere für die Versuche eingesetzt (65 ♂, 49 ♀). Die Aufteilung in Gruppen erfolgte randomisiert nach Geschlecht und Alter. Die Tierversuche erfolgten in Kooperation mit Frau Prof. Dr. Petra Dersch und Julia Schaake, M. Sc. aus der Abteilung Molekulare Infektionsbiologie des HelmholtzZentrums für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig. B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere Die Mini-Lewe-Ferkel stammten vom Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Absetzferkel und Sauen wurden vor dem ersten Tierversuch stichprobenartig auf das Vorhandensein von Yersinien untersucht, alle Stichproben waren in der bakteriologischen Untersuchung negativ. Die Antikörpertiter der eingestallten Ferkel in der serologischen Untersuchung lagen unterhalb des „Cut-off“-Wertes und waren somit als negativ einzustufen. Versuche, in denen ausschließlich Wildtypstämme untersucht wurden, fanden in den Stallungen des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt. Koinfektionsstudien mit gentechnisch veränderten Stämmen wurden in der Isolierstation des Instituts für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Minipigs wurden in Gruppen von mindestens drei bis maximal zwölf Ferkeln in Ställen von etwa 8 m2 (Institut für Mikrobiologie) bzw. 11 m2 (Isolierstation des Instituts für Virologie) eingestallt. In ersterem wurde ein Teil des Stalls mit Stroh eingestreut, in letzterem wurden im Liegebereich Gummimatten ausgelegt. Rotlichtlampen ermöglichten es den Tieren, aktiv den für sie angenehmsten Temperaturbereich zum Ruhen aufzusuchen. Diese wurden entfernt, wenn die Ferkel nicht mehr darunter lagen. Die Tiere wurden innerhalb der ersten fünf Tage dreimal, an den folgenden Tagen zweimal täglich gefüttert, sie erhielten je nach Alter und Körpergewicht 200 bis 250 g/Tag eines kommerziellen Futters. Die Ration stellte sich 30 Material und Methoden zu je 50 % aus Ferkelstartern (primo wean, deuka, Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG) und einem Spezialfutter für Minipigs (ssniff®MPigH, ssniff Spezialdiäten GmbH) zusammen. Zusätzlich wurden zur Beschäftigung Heucobs (pre alpin, Agrobs GmbH) und mit geringen Mengen pelletierten Futters gefüllte Spielbälle angeboten. Zweimal täglich wurden die Stalltemperatur und Luftfeuchte sowie das Allgemeinbefinden der Tiere (Haltung, Verhalten, Futteraufnahme, Kotabsatz, Körpertemperatur) kontrolliert und dokumentiert. Die Haltung, Unterbringung und jede Behandlung der Tiere erfolgte gemäß den Vorgaben des Tierschutzgesetzes (Genehmigung durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Aktenzeichen 33.1242502-04-10/0173 und 33.9-42502-04-11/0462) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Europäischen Übereinkommens zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere und den Empfehlungen der GV-SOLAS. B.2.2 Versuchsaufbau Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Tonsillen- und Rektaltupferproben genommen, und die Tiere wurden in die zuvor festgelegten Gruppen unterteilt. Nach siebentägiger Eingewöhnungszeit erfolgte die orale Infektion der Minipigs mit 109 KBE Y. enterocolitica pro Schwein. Nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener Infektionsdosen (vgl. C.1.1) wurden Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 KBE/Tier eingesetzt. Nach der oralen Infektion wurden Rektaltupfer zweimal wöchentlich bakteriologisch und Blutproben einmal wöchentlich hämatologisch und serologisch untersucht. Am siebten bzw. 21. Tag p.i. wurden die Schweine euthanasiert, seziert und sowohl Organ- als auch Kotproben für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Auch die pathologisch-anatomische Untersuchung und die Entnahme von Organproben für die histopathologische Beurteilung wurden während der Sektion durchgeführt. Die letzte Blutentnahme fand ebenfalls am Tag der Sektion der Tiere statt (Abb. 1). 31 Material und Methoden Abb. 1: Zeitlicher Ablauf des Versuchs. (Angegeben in Tagen vor (-) und nach der Infektion) B.2.3 Orale Infektion der Minipigs Die Infektionsdosen [vgl. B.1.2] wurden in 1 ml sterilem PBS suspendiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäßen auf Eis zu den Stallabteilen transportiert. Im Stallbereich wurde jede Dosis einzeln resuspendiert, mit einer sterilen 2 mlEinmalspritze aufgezogen und den Tieren direkt in die Maulhöhle eingegeben. Eine Person fixierte dabei das Tier, eine weitere öffnete und fixierte das Maul und eine dritte Person applizierte die Bakteriensuspension, so dass die Infektion immer von drei Personen durchgeführt wurde. Die Infektionen erfolgten immer morgens unmittelbar vor der morgendlichen Fütterung. Die Kontrolltiere erhielten je 1 ml steriles PBS („Pseudoinfektion“), das ihnen auf die gleiche Art eingegeben wurde. B.2.4 Probenentnahme Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Rektal- und Tonsillentupfer genommen. Hierzu wurden die Tiere fixiert. Für das Abtupfern der Tonsillen wurde das Maul mit einem arretierbaren Maulgatter geöffnet und mit einem sterilen Tupfer (UNI-TER AMIES CH, Meuss S.r.l.) fest über die Tonsillen gestrichen. Für Rektaltupfer wurde der sterile Tupfer vorsichtig in den Anus eingeführt. Die Tupfer wurden anschließend im mitgelieferten Amies-Medium mit Kohlezusatz ins Labor transportiert. Rektaltupfer wurden nach der Infektion zweimal wöchentlich genommen. Für hämatologische und serologische Untersuchungen wurden den Minipigs einmal wöchentlich EDTA- und Serumproben (EDTA-, Serum-Monovetten®, Sarstedt AG & Co.) unter Verwendung steriler Einmalkanülen (18G 11/2'') entnommen. Dieses 32 Material und Methoden geschah durch Punktion der Vena cava cranialis, für die die Tiere in Rückenlage fixiert wurden. Es wurden maximal 5 ml Blut/kg Körpergewicht pro Woche entnommen (entsprechend den Vorgaben der Tierärztlichen Vereinigung für Tierschutz (TVT) e.V.). Die letzte Blutentnahme fand unmittelbar vor der Euthanasie und Sektion der Tiere statt. Um unnötigen Stress für die Tiere zu vermeiden, wurden sie bereits vor der Blutentnahme mit Ketamin (80 mg/kg KGW i.m.; Ursotamin®, Serum-Werke-Bernburg AG) und Azaperon (16 mg/kg KGW i.m.; Stresnil®, JanssenCilag GmbH) narkotisiert. Während des ersten Tierversuchs wurde initial eine Dosis von 3 mg/kg KGW Azaperon und 25 mg/kg KGW Ketamin verabreicht. Diese führte jedoch häufig nicht zu einer ausreichenden Narkosetiefe und zur Notwendigkeit von Nachdosierungen. Aus diesem Grund wurde ab dem zweiten Tierversuch bereits initial die oben erwähnte, hohe Dosierung mit sehr gutem Erfolg verwendet. Die Blutentnahme erfolgte unter der Narkose durch eine Herzpunktion mit direkt anschließender Euthanasie durch die intracardiale Applikation von Pentobarbital (120 mg/kg KGW, Release®, WDT eG). Nach Eintritt des Todes wurden die Minipigs auf einen Sektionstisch verbracht und Brust und Bauchhöhle eröffnet. Während der Sektion wurden von jedem Tier mit sterilem Sektionsbesteck folgende Proben in eben dieser Reihenfolge entnommen: Leber, Milz, Nieren, mesenteriale Lymphknoten (Lnn. jejunales), Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum (nur für den Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3), Kot aus dem Rectum und Tonsillen. Alle Organe wurden während der Entnahme aus dem Tierkörper makroskopisch untersucht. Durch die Reihenfolge der Probenentnahme von eher gering hin zu voraussichtlich stark kontaminierten Organen sollte das Risiko einer Kontamination bei der Entnahme minimiert werden. Die Proben wurden in fest verschlossenen, sauberen Plastikgefäßen direkt nach der Entnahme ins Labor transportiert. B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung Vor der Sektion wurden die Körperoberfläche und die Körperöffnungen begutachtet. Nach der Eröffnung der Brust- und Bauchhöhle wurden die Pleura, Lungen und Herz untersucht. Dabei wurde auf Verklebungen insbesondere der Spitzenlappen geachtet und der Herzbeutel eröffnet. Danach wurden das Peritoneum, Leber, Milz und Nieren untersucht; die Organe wurden zu diesem Zweck aus der Bauchhöhle entnommen. 33 Material und Methoden Es wurde darauf geachtet, ob die Nierenkapsel leicht abziehbar war, um Hinweise auf entzündliche oder nekrotische Prozesse zu erhalten. Alle Organe wurden während der Untersuchung angeschnitten, um die Schnittfläche beurteilen zu können. Die mesenterialen Lymphknoten sowie die einzelnen Darmabschnitte wurden zur Begutachtung aus der Bauchhöhle heraus gelagert und palpiert, jedoch nicht zusätzlich zur Entnahme der nötigen Proben longitudinal eröffnet. B.2.6 Histopathologische Untersuchung Für die histologische Untersuchung wurden Organproben von Leber, Milz, Ileum und mesenterialen Lymphknoten sofort nach der Entnahme für mindestens 24 Std. in 10 %igem, nicht-gepuffertem Formalin fixiert und für die histopathologische Untersuchung in das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verbracht. Dort fand die weitere Herstellung der histologischen Schnitte (Paraffineinbettung, Schnittherstellung mittels Mikrotom, Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung) und die Beurteilung dieser in Kooperation mit Dr. Frauke Seehusen statt. B.2.7 Serologische Untersuchung Die serologischen Untersuchungen wurden in Kooperation mit Dr. Alexandra von Altrock in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit einem ELISA-Testsystem (PIGTYPE® YOPSCREEN ELISA Testkit, Labor Diagnostik Leipzig GmbH/ Quiagen Leipzig GmbH) durchgeführt. Dieses basiert auf rekombinanten Yops (engl.: Yersinia outer proteins) und dient zum Nachweis von Antikörpern gegen pathogene Yersinien bei Schweinen. Der ELISA wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt und ausgewertet. B.3 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms SAS® (SAS Institute Inc., Cary) in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. Lothar Kreienbrock und Herrn Dr. Martin Beyerbach aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die relative virulence ratio (RVR) und der competitive index (CI) zur Auswertung der Koinfektionsversuche wurden wie folgt berechnet: 34 Material und Methoden RVR: % im Organ % im Inoculum CI: RVR Mutante RVR wt Die Auswertung der RVR und des CI erfolgte mit GraphPad Prism® in Kooperation mit Julia Schaake, M.Sc. aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Petra Dersch vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig. 35 Ergebnisse C Ergebnisse C.1 Etablierung eines Infektionsmodells für Yersinia enterocolitica im Minipig Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica ) ist ein bedeutender Durchfallerreger beim Menschen. Schweine gelten als Reservoirwirt, da sie den Erreger mit einer hohen Prävalenz beherbergen, jedoch keine klinischen Symptome zeigen (Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005). In Europa ist Serotyp O:3 sowohl in humanen Patienten als auch in Mastschweinebeständen der häufigste Serotyp (Thibodeau et al., 1999; Bottone, 1999; Rosner et al., 2010). Obwohl schon experimentelle Infektionen beim Schwein durchgeführt wurden (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999), sind die Mechanismen, die zu einer Kolonisierung des Schweins führen, noch weitgehend unbekannt. Molekularbiologische Untersuchungen erfolgten in erster Linie mit Serotyp O:8 (YeO:8) und im gut standardisierten Mausmodell. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit für weitergehende Untersuchungen zur Kolonisation bzw. Infektion von Y. enterocolitica im natürlichen Wirt, dem Schwein, zunächst ein Modell entwickelt werden, das möglichst nah an der natürlichen epidemiologischen Situation in Schweinemastbetrieben bleibt. Es wurde der orale Infektionsweg gewählt, da Y. enterocolitica häufig in Tonsillen von Schlachtschweinen nachgewiesen werden konnte (Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005) und möglicherweise dort persistiert. Als Versuchstiere wurden aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf Unterbringung und Handhabung sowie ihrer zunehmenden Verwendung als Labortiere Minipigs eingesetzt. Für die Etablierung wurde der in Europa am häufigsten vorkommende Serotyp O:3 (YeO:3) eingesetzt. C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3 In Anlehnung an bereits publizierte Daten wurden in drei Tiergruppen von jeweils vier Minipigs Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Ferkel getestet [vgl. B.1.2]. In Publikationen zu oralen Infektionsversuchen im Schwein (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; 36 Ergebnisse Thibodeau et al., 1999) führten diese Dosen zu einer subklinischen Infektion, die auch im Minipigmodell angestrebt wurde. Die Tiere wurden sieben Tage nach Einstallung oral mit YeO:3 Stamm Y1 infiziert und danach zweimal täglich im Hinblick auf klinische Symptome untersucht. Zudem wurden einmal wöchentlich Blutproben hämatologisch [vgl. B.2.2 bis B.2.4] und zweimal wöchentlich Rektaltupfer bakteriologisch untersucht [vgl. B.1.4 und B.2.4]. Sieben Tage nach der Infektion wurden alle Tiere euthanasiert und nachfolgend seziert. Bei der Sektion wurde eine makroskopische Untersuchung des Tierkörpers und der Organe durchgeführt [vgl. B.2.5]. Für eine quantitative und qualitative bakteriologische Untersuchung auf Yersinien wurden Proben von folgenden Organen entnommen: Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum, mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber, Milz und Niere. Nur qualitativ mittels Kälteanreicherung untersucht wurden bei der Sektion direkt aus dem Enddarm entnommene Kotproben [vgl. B.2.4]. Die Daten von drei Tieren wurden von der Auswertung ausgeschlossen, daher beziehen sich alle folgenden Ergebnisse auf eine Gruppengröße von je drei Tieren. Die Gründe hierfür werden im folgenden Abschnitt näher erläutert. C.1.1.1 Klinische und pathologisch-anatomische Beurteilung der Tiere Nach der Einstallung mussten zwei Ferkel wegen akuten Kreislaufversagens mit Dexamethason behandelt werden, eines von ihnen verendete innerhalb von 24 Stunden. Diese Tiere und ein drittes, das vor der Infektion positiv auf Y. enterocolitica untersucht wurde, wurden von der Auswertung ausgeschlossen. Keines der Minipigs zeigte nach der Infektion klinische Symptome. Allerdings zeigten einige Ferkel im Blutbild eine Anämie, Lympho- oder Leukozytopenie und alle Ferkel eine Hämokonzentration, sowohl vor als auch nach der Infektion. Pathologisch-anatomisch konnten nur unspezifische Befunde in überwiegend milder Ausprägung beobachtet werden. Detaillierte Beschreibungen zu klinischen und pathologisch-anatomischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1 und 2]. 37 Ergebnisse C.1.1.2 Quantitative Organbelastung Quantitativ konnte Y. enterocolitica in verschiedenen Organen mit bis zu 2,45x106 KBE/g Organ nachgewiesen werden. Besonders stark belastet waren Tonsillen, Caecum, Colon und z.T. auch Ileum. In Tonsillen, Ileum und Caecum konnten von allen neun infizierten Minipigs Yersinien quantitativ bestimmt werden. Aus Jejunum, Colon und Rectum konnten nur in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) nicht aus allen Proben Yersinien in der Direktkultur nachgewiesen werden. Bei Proben von Jejunum und Rectum blieben in dieser Gruppe zwei, vom Colon eine der drei Proben negativ. In den mesenterialen Lymphknoten, der Leber und Niere konnten die Bakterien nur bei einem Tier aus Gruppe C (Infektionsdosis: 1010 KBE/ Tier) quantitativ nachgewiesen werden (Abb. 2). Abb. 2: Quantitative Organbelastung in den drei Dosisgruppen. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder Dosisgruppe wurden drei Tiere oral infiziert und am siebten Tag p.i. seziert. Die Infektionsdosen betrugen 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw. 1010 (Gruppe C) KBE/Tier. In den Tonsillen stieg die mittlere Organbelastung (Mittelwert der drei untersuchten Tiere je Gruppe) mit der Infektionsdosis an. Im Ileum, Caecum, Colon und Rectum war die mittlere Organbelastung in Gruppe A (Infektionsdosis: 108 KBE/ Tier) zwar geringer als in Gruppe C (Infektionsdosis: 1010 KBE/ Tier), jedoch war diese auch in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) geringer als in Gruppe A. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4]. 38 Ergebnisse C.1.1.3 Qualitative Organbelastung Aus Tonsillen, Ileum, Caecum und Colon konnten die Yersinien bei allen infizierten Tieren aus allen drei Dosisgruppen mittels Kälteanreicherung reisoliert werden. Die Rectumproben waren ebenfalls bis auf eine Probe positiv. Qualitativ wurden die Bakterien auch aus dem Jejunum aller Tiere der Gruppen A (niedrigste Infektionsdosis) und C (höchste Dosis) sowie einem Tier aus Gruppe B (mittlere Dosis) reisoliert. Aus den mesenterialen Lymphknoten von Tieren der niedrigsten und höchsten Dosisgruppe, aus der Leber von Tieren der mittleren und höchsten Dosisgruppe und aus der Milz eines Tieres der höchsten Dosisgruppe konnten die Bakterien ebenfalls reisoliert werden (Abb. 3). Gruppe A Gruppe B Gruppe C Abb. 3: Prozentualer Anteil der positiv getesteten Tiere in den drei Dosisgruppen. Y. enterocolitica wurde mittels Kälteanreicherung in den Organproben nachgewiesen. Die Infektionsdosen betrugen 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw. 1010 (Gruppe C) KBE/Tier. In jeder Gruppe wurden Proben von jeweils drei Tieren am siebten Tag p.i. untersucht. C.1.1.4 Bakterielle Ausscheidung Einen Tag nach der oralen Infektion konnten in Gruppe A (108 KBE/Tier) und C (1010 KBE/Tier) von 67 % der Tiere Yersinien in Kottupfern nachgewiesen werden. In Gruppe B (109 KBE/Tier) war nur eines der drei Tiere positiv. Drei Tage p.i. waren in 67 % der untersuchten Rektaltupfer aus Gruppe A und B sowie in allen Tieren aus 39 Ergebnisse Gruppe C Yersinien nachweisbar. An Tag sieben p.i. waren alle bei der Sektion entnommenen Kotproben positiv (Abb. 4). Gruppe A Gruppe B Gruppe C Abb. 4: Prozentualer Anteil der Tiere in den drei Dosisgruppen, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden. Rektaltupfer der Minipigs (drei Tiere pro Gruppe) wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach der oralen Infektion genommen und mittels Kälteanreicherung untersucht. Die Ausscheidung mit dem Kot begann somit bei 33 bis 67 % der Tiere bereits 24 Stunden nach der Infektion und dauerte bis zum siebten Tag p.i. bei allen Tieren an. Fazit: Eine Kolonisation der Tonsillen und der Darmabschnitte sowie eine Ausscheidung mit den Faeces konnte nach der Infektion mit allen drei untersuchten Infektionsdosen beobachtet werden. Da in der Gruppe der höchsten Infektionsdosis die Bakterien auch aus Lymphknoten, Leber und Milz reisoliert werden konnten, wurden alle weiteren experimentellen Infektionsstudien mit einer oralen Infektionsdosis von 109 KBE durchgeführt. Diese sollte eine Kolonisierung der Tonsillen sowie der verschiedenen Darmabschnitte und eine Ausscheidung der Yersinien mit dem Kot gewährleisten, das Risiko einer klinisch manifesten Erkrankung jedoch möglichst gering halten. C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Im zweiten Versuch zur Etablierung wurde der zeitliche Verlauf der Kolonisation, Infektion und der fäkalen Ausscheidung 40 nach einer oralen Infektion mit Ergebnisse Y. enterocolitica untersucht. Zwölf Minipig-Ferkel im Alter von fünf bis sieben Wochen [vgl. B.2.1] wurden mit je 109 KBE YeO:3 Stamm Y1 infiziert [vgl. B.2.3]. Erwartungsgemäß zeigten auch diese Tiere keine klinischen Symptome. Je drei Tiere wurden am dritten, siebten, vierzehnten und einundzwanzigsten Tag post infectionem (p.i.) euthanasiert und seziert. Vier zusätzliche Tiere fungierten als Kontrollgruppe. Diese wurden separat aufgestallt, mit sterilem PBS „pseudoinfiziert“ und am 21. Tag p.i. seziert [vgl. B.2.2]. Mit Ausnahme des Rectums wurden von allen Tieren die gleichen Organe beprobt wie in der vorangegangenen Studie [vgl. C.1.1]. Alle Organproben wurden sowohl quantitativ als auch qualitativ untersucht, Rektal-, Tonsillentupfer und Kotproben hingegen nur qualitativ mittels Kälteanreicherung [vgl. B.1.3 bis B.1.5]. Zusätzlich wurden einmal wöchentlich Serumproben genommen und mit einem kommerziellen ELISA (PIGTYPE® YOPSCREEN) auf Antikörper gegen pathogene Yersinien untersucht [vgl. B.2.7]. Das Ileum und die mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales) jedes Tieres wurden pathologisch-histologisch untersucht [vgl. B.2.6]. C.1.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere Auch in dieser Infektionsstudie zeigten weder die infizierten noch die Kontrolltiere klinische Symptome wie Fieber oder Diarrhoe. Sowohl vor als auch nach der Infektion konnten allerdings bei allen Tieren abweichende Befunde im Blutbild erfasst werden, diese wiesen jedoch nicht deutlich auf eine akute bakterielle Infektion hin [vgl. H.1]. C.1.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung In den Sektionen wurden ebenfalls nur unspezifische, größtenteils geringgradige Befunde erhoben. Vergrößerte Darmlymphknoten und Anzeichen einer GALTHyperplasie konnten sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren beobachtet werden [vgl. H.2]. 41 Ergebnisse C.1.2.3 Histopathologische Beurteilung Die histologische Untersuchung wurde in allen Versuchen in Kooperation mit Dr. Frauke Seehusen aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Auch hier zeigten sich fast ausschließlich unspezifische Veränderungen, die auch in der nicht infizierten Kontrollgruppe auftraten. Im Ileum traten ggr. Nekrosen, Zottenveränderungen, Verluste von Epithelzellen und eine ggr. entzündliche Infiltration der Lamina propria etwas häufiger am dritten und siebten Tag p.i., als am 14. und 21. Tag p.i. auf. Die mesenterialen Lymphknoten waren histologisch bis auf eine ggr. lymphatische Hyperplasie unauffällig [vgl. H.3]. Detaillierte Beschreibungen zu klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, H.2 und H.3]. C.1.2.4 Quantitative Organbelastung Am dritten Tag nach der oralen Infektion konnten bei allen drei Tieren Yersinien in Tonsillen, Jejunum, Ileum und Caecum quantitativ nachgewiesen werden. In den Tonsillen und den Darmabschnitten, hier insbesondere dem Ileum, war die Organbelastung mit bis zu 1,35x106 KBE/g am höchsten. Im Colon konnten nur von zwei Ferkeln Yersinien quantitativ nachgewiesen werden. In Leber, Milz und Niere waren die Bakterien nur von je einem der drei Minipigs direkt reisolierbar (102 KBE/g). An Tag sieben p.i. war im Hinblick auf die befallenen Organe kein detektierbarer Unterschied zu Tag drei p.i. zu beobachten. Aus Jejunum, Ileum, Caecum und Colon konnte bei allen Tieren Y. enterocolitica reisoliert und quantifiziert werden. In den Tonsillen konnten nur bei zwei, in den mesenterialen Lymphknoten sowie in Leber und Niere bei einem von drei Schweinen quantitativ Yersinien nachgewiesen werden. Aus der Milz war sieben Tage p.i. kein quantitativer Erregernachweis möglich. Die Organbelastung unterschied sich kaum von der an Tag drei p.i. ermittelten. Zwei Wochen nach der Infektion konnte nur noch aus Ileum, Caecum und Colon aller drei Tiere Y. enterocolitica quantitativ reisoliert werden. Jeweils bei einem der drei Tiere konnten Yersinien aus dem Jejunum, den mesenterialen Lymphknoten, Nieren und Tonsillen quantitativ bestimmt werden. Proben von Leber und Milz blieben bei allen drei Ferkeln negativ. Die Keimbelastung lag allerdings in niedrigeren Bereichen, 42 Ergebnisse in den Tonsillen beispielsweise bei 9,09x102 KBE/g. Deutliche Unterschiede bezüglich der Organbelastungen zeigten sich zwischen Tag drei und Tag 14 p.i. in Jejunum, Ileum, Caecum und Tonsillen. Zwischen Tag sieben und Tag 14 p.i. konnten große Unterschiede in Jejunum, Caecum und Colon festgestellt werden. Drei Wochen nach oraler Infektion waren schließlich nur noch in den Caeca aller drei Schweine Yersinien qualitativ nachweisbar. Sie konnten zudem aus zwei der drei Colon- und Tonsillenproben und aus einer Ileumprobe direkt reisoliert werden. Auch hier konnte eine weitere Abnahme der Organbelastung beobachtet werden, die im Vergleich zum dritten und siebten Tag post infectionem besonders stark hervortrat. Deutliche Unterschiede zeigten sich zwischen Tag drei und Tag 21 p.i. in Jejunum, Ileum und Caecum, sowie zwischen Tag sieben und Tag 21 p.i. in Jejunum, Ileum, Caecum und Colon und auch zwischen Tag 14 und Tag 21 p.i. in der Belastung des Ileums (Abb. 5 und Abb. 6). Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4]. Aus den Organen der vier am 21. Tag p.i. sezierten Kontrolltiere konnten keine Yersinien isoliert werden. Tage p.i. Abb. 5: Quantitative Organbelastung der Minipigs zu vier Zeitpunkten nach der Infektion. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. Zu jedem Zeitpunkt (drei, sieben, 14 und 21 Tage p.i.) wurden drei Tiere seziert. 43 Ergebnisse Abb. 6: Quantitative Belastung der intestinalen Organe (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon) im Verlauf der Infektion. Je drei Tiere wurden am dritten, siebten, 14. und 21. Tag p.i. euthanasiert und seziert. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus des Mittelwerts der drei untersuchten Tiere. Die Balken zeigen die Standardabweichung an. C.1.2.5 Qualitative Organbelastung Qualitativ konnten mittels Kälteanreicherung von Organproben der an Tag drei p.i. sezierten Schweine Yersinien aus allen Proben von Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum und Colon reisoliert werden. Somit waren zu diesem Zeitpunkt alle Proben von Tonsillen und Darmabschnitten positiv. In zwei von drei der beprobten mesenterialen Lymphknoten und Nieren, sowie in je einer Probe von Leber und Milz konnte Y. enterocolitica ebenfalls nachgewiesen werden. Sieben Tage p.i. erwiesen sich noch immer alle Darmproben und zwei der drei Darmlymphknoten als positiv. Zudem waren die Yersinien in je einer der Proben von Tonsillen, Leber, Milz und Niere nachweisbar. Am 14. Tag p.i. fanden sich die Bakterien noch in allen drei Proben von Ileum, Caecum und Colon, in zwei der Tonsillenproben und in jeweils einer Probe der mesenterialen Lymphknoten und Nieren. Negativ blieben zu diesem Zeitpunkt alle Proben von Jejunum, Leber und Milz. Am 21. Tag nach der Infektion waren noch alle drei Colonproben positiv, zudem je zwei der drei Proben von Tonsillen und Caecum. In Jejunum, Ileum, mesenterialen Lymphknoten, Leber, Milz und Nieren aller drei Tiere konnten keine Yersinien nachgewiesen werden (Abb. 7). In den Organproben der vier Kontrolltiere konnten auch in der Kälteanreicherung keine Yersinien nachgewiesen werden. 44 Ergebnisse Tage p.i. Abb. 7: Prozentualer Anteil positiv getesteter Organproben im Bezug zum Zeitpunkt nach der Infektion (Tage p.i.). Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung untersucht. Zu jedem der vier angegebenen Zeitpunkte wurden drei Tiere in der Sektion untersucht. C.1.2.6 Bakterielle Ausscheidung Um die Ausscheidung der Yersinien mit dem Kot zu untersuchen, wurden zweimal pro Woche Rektaltupfer aller Tiere und bei den Sektionen frisch aus dem Enddarm entnommener Kot qualitativ auf Y. enterocolitica untersucht. Auch hier kam die Kälteanreicherung zum Einsatz, aufgrund der extrem hohen Begleitflora in Kotproben wurde auf eine quantitative Untersuchung verzichtet. Einen Tag nach der oralen Belastung der Ferkel waren in allen zwölf untersuchten Rektaltupfern Yersinien nachweisbar. Drei Tage p.i. wurden elf von zwölf Tupfern positiv getestet, sieben Tage p.i. waren in allen neun untersuchten Tupfern Yersinien nachweisbar. Zehn und 14 Tage p.i. waren alle Rektaltupfer der sechs Minipigs positiv. An Tag 17 p.i. konnten keine Yersinien nachgewiesen werden, 21 Tage p.i. hingegen waren alle drei Proben dieser Tiere wieder positiv (Abb. 8). 45 Ergebnisse Abb. 8: Prozentualer Anteil der infizierten Tiere, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden. Die Untersuchung erfolgte mittels Kälteanreicherung von Rektaltupfern. Am ersten und dritten Tag p.i. wurden 12 Tiere untersucht, am siebten Tag neun Tiere, am zehnten und 14. Tag sechs und am 17. und 21. Tag drei Tiere. Auch aus Rektaltupfern oder Kotproben der vier Kontrolltiere konnten keine Yersinia spp. isoliert werden. In den, von jedem Tier sieben Tage vor der Infektion genommenen, Rektal- und Tonsillentupfern waren kulturell ebenfalls keine Yersinien nachweisbar. C.1.2.7 Serologie Serumanalysen wurden in allen Versuchen mittels eines kommerziellen ELISASystems [vgl. B.2.7] in Kooperation mit Dr. Alexandra von Altrock (Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover) durchgeführt. Die serologische Untersuchung zeigte einen starken Titeranstieg im Serum der infizierten Tiere ab dem siebten Tag nach der Infektion. Während die vier nicht infizierten Kontrolltiere negativ (unter dem „Cut-off“ von 20 OD %) blieben, zeigten die infizierten Tiere Werte von bis zu 85 OD % und einen steten Titeranstieg bis zum 21. Tag p.i. (Abb. 9). Bis zum siebten Tag p.i. unterschieden sich die Titer der Infektions- und der Kontrollgruppe kaum, ab dem 14. Tag p.i. konnte trotz deutlich ersichtlicher Unterschiede aufgrund der geringen Tierzahlen keine statistische Signifikanz nachgewiesen werden. 46 Ergebnisse Abb. 9: Bestimmun ng der Seru umantikörpe er-Titer mitttels ELISA im Verlauf der Infektio on. Jeder Punkt re epräsentiert den Mittelw wert der zum m angegebenen Zeitpun nkt untersuchhten Tiere in i % der optische en Dichte (O OD). Werte unterhalb u vo on 20 % sind d als negativ einzustufeen (Cut-off). Bis zum ersten T Tag p.i. wurde en in der Infe ektionsgrupp pe (YeO:3) 12 Tiere untersucht, am ssiebten Tag neun, n am 14. Tag fünf und am m 21. Tag zw wei Tiere. In der Kontrollg gruppe wurd den von siebben Tage vorr bis zum 21. Tag nach der Pseudoinfektion vier Tiere sserologisch untersucht u (K Kontrolle). Fazit: Die Org ganbelastu ung der Sc chweine m mit Y. enterrocolitica Serotyp S O:33 Stamm Y1 Y ging im Verllauf der Inffektion zwischen dem m siebten und dem 21. 2 Tag p. i. deutlich zurück. Die A Ausscheidu ung mit dem K Kot hinge egen zeig gte eine n zum letzten Untersu uchungsze eitpunkt intermittiere nden Verlauf und war w vom eersten Tag g bis zu drei Wo ochen nacch der orale en Infektio n nachweisbar. Zwis schen dem m siebten und dem 14. Tag g p.i. konn nte eine starke Serokkonversion n der mit YeO:3 Y Stam mm Y1 inffizierten Tiere b beobachtett werden. Für F nachfo olgende Ve ersuche wurde der ssiebte Tag p.i. als Sektion nstag aussgewählt, da zu d diesem Ze eitpunkt die d maxim male Kolonisation beobacchtet werde en konnte. 47 Ergebnisse C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) ist in Europa der häufigste Auslöser humaner Yersiniosis-Fälle und wurde in mehreren epidemiologischen Studien auch aus Proben von Mastschweinen isoliert (Fukushima et al., 1983; von Altrock et al., 2006; Bottone, 1997; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999). In experimentellen Infektionen im Mausmodell zeigte er sich allerdings wenig virulent. Serotyp O:8 (YeO:8) hingegen kommt selten in Europa vor und konnte selten aus Mastschweinen isoliert werden, zeigte sich im Mausversuch aber sehr viel virulenter (Schiemann, 1988; Robins-Browne und Prpic, 1985) und war in den letzten Jahren wesentlich häufiger Gegenstand molekularbiologischer Forschung als der Serotyp O:3. Auch in vitro-Experimente in der Zellkultur zeigten Unterschiede zwischen den beiden Serotypen (Uliczka et al., 2011). Vor diesem Hintergrund war ein zweites Ziel dieser Arbeit, die Serotypen YeO:3 und YeO:8 im Minipig-Infektionsmodell zu vergleichen. Die Infektionsversuche wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Petra Dersch am Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig und Julia Schaake, M.Sc., aus der Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie des HZI durchgeführt. In einer ersten Studie wurden jeweils acht Minipig-Ferkel mit 109 KBE pro Tier YeO:3 Stamm Y1 bzw. YeO:8 Stamm 8081v infiziert [vgl. B.1.1]. Vier Tiere je Gruppe wurden an Tag sieben und die verbleibenden vier an Tag 21 p.i. euthanasiert und seziert [vgl. B.2.2]. Die Kontrollgruppe bestand aus drei Ferkeln, welche ebenfalls 21 Tage nach der („Pseudo“-) Infektion [vgl. B.2.3] seziert wurden. Alle Versuchstiere wurden bei der Einstallung (sieben Tage vor der Infektion) mittels Rektal- und Tonsillentupfern auf das Vorhandensein von Y. enterocolitica überprüft. Blutproben (Serum und EDTA-Blut) wurden von allen Minipigs vor und nach der Infektion einmal wöchentlich auf Antikörper gegen pathogene Yersinien bzw. Auffälligkeiten im Blutbild untersucht. Rektaltupfer wurden zweimal wöchentlich auf Y. enterocolitica hin getestet. Bei den Sektionen wurden die gleichen Organe beprobt wie in der Infektionsverlaufsstudie [vgl. C.1.2]. Auch die pathologisch-anatomischen, histopathologischen und mikrobiologischen Untersuchungsmethoden sowie die regelmäßige klinische Kontrolle der Tiere wurden aus dieser Studie beibehalten [siehe C.1.2]. 48 Ergebnisse In einer zweiten Studie wurden nochmals je sechs Ferkel mit dem YeO:3 Stamm Y1 bzw. dem YeO:8 Stamm 8081v infiziert und sieben Tage p.i. seziert. Die orale Infektionsdosis betrug 109 KBE pro Tier. Sämtliche Untersuchungsmethoden wurden beibehalten und die Ergebnisse der beiden nacheinander erfolgten Infektionsversuche zusammengefasst. Die einzigen Ausnahmen stellen hier die Serologie und die Sektion eines Teils der Tiergruppen am 21. Tag p.i. dar. Serologische Untersuchungen wurden nur in der ersten der beiden Studien durchgeführt und auch die Belastung am 21. Tag p.i. wurde nur in dieser erfasst. C.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere In den vergleichenden Infektionsstudien mit den Serotypen O:3 und O:8 wiesen alle Versuchstiere eine Anämie sowie weitere unspezifische Befunde in der hämotologischen Untersuchung auf. Klinisch fiel ein Ferkel innerhalb der letzten Tage des Versuchs durch schleimig-blutige, z.T. auch fibrinöse Kotbeimengungen auf. Fieber konnte nicht festgestellt werden, einige Tiere wiesen sowohl vor als auch nach der Infektion eine ggr. Diarrhoe auf. In der Kontrollgruppe verendete ein Tier perakut an einer Blasenruptur [vgl. H.1]. C.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung In den Sektionen konnten sowohl am siebten als auch am 21. Tag p.i. nur unspezifische Befunde erhoben werden, die überwiegend von milder Ausprägung und sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren zu beobachten waren [vgl. H.2]. C.2.3 Histopathologische Beurteilung In der histopathologischen Beurteilung der Leber, Milz, mesenterialen Lymphknoten und des Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben werden. Lediglich in der Leber traten keine Veränderungen bei den Kontrolltieren auf, allerdings waren auch die in infizierten Tieren beobachteten Veränderungen unspezifisch und nur minimal bis ggr. ausgeprägt. Hervorzuheben ist allerdings, dass 49 Ergebnisse bei einem der Tiere aus Gruppe A (infiziert mit YeO:3) am siebten Tag p.i. Bakterienkolonien in der Wand des Ileums gefunden wurden [vgl. H.3]. Detaillierte Beschreibungen zu klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, H.2 und H.3]. C.2.4 Quantitative Organbelastung Die Organbelastung mit Y. enterocolitica fiel in den beiden Infektionsgruppen sehr unterschiedlich aus. Während der YeO:3-Wildtypstamm Y1 am siebten Tag p.i. quantitativ in mehreren intestinalen Proben (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon) und in den Tonsillen nachgewiesen werden konnte, war der YeO:8-Wildtypstamm 8081v in der Direktkultur nur aus den Tonsillen eines Tieres reisolierbar. In Leber, Milz, Nieren und mesenterialen Lymphknoten konnten in beiden Gruppen quantitativ keine Yersinien nachgewiesen werden. Am siebten Tag p.i. war in der mit YeO:3 infizierten Gruppe die Anzahl der reisolierten Bakterien pro Gramm Organ aus Proben vom Ileum besonders groß, hier konnten in sieben der insgesamt zehn Ferkel zwischen 104 und 106 KBE/g gefunden werden. In dieser Gruppe waren auch bei sechs von zehn Minipigs Yersinien quantitativ in den Tonsillen nachweisbar, die Zahlen schwankten zwischen 8x102 und 3x105 KBE/g. Aus vier von zehn Jejunumproben (104 bis 106 KBE/g), vier von zehn Caecumproben (101 bis 106 KBE/g) und drei von zehn Colonproben (105 KBE/g) konnte der YeO:3 Stamm Y1 ebenfalls reisoliert werden. Im Vergleich dazu fand sich der Serotyp O:8 Stamm 8081v am siebten Tag p.i. nur in einer von zehn Tonsillenproben in einer Menge von 1,33x103 KBE/g. In keiner der anderen Organproben konnte der YeO:8-Stamm quantitativ bestimmt werden. Im Fisher’s Exact Test unterschied sich die Organbelastung durch die beiden Stämme signifikant in Tonsillen, Jejunum und Caecum (P<0,05). Im Ileum war der Unterschied noch deutlicher (P<0,01), während im Colon und in den extraintestinalen Organen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte (Abb. 10 A). Am 21. Tag p.i. wurden je vier Tiere pro Infektionsgruppe untersucht. In der mit YeO:3 Stamm Y1 infizierten Gruppe konnten die Yersinien aus zwei der vier Tonsillenproben (103 und 105 KBE/g) reisoliert werden. Auch in einer Probe vom Jejunum (102 KBE/g), zwei Proben vom Ileum (103 KBE/g), zwei Proben vom Caecum (102 KBE/g) und drei Colonproben (102 bis 105 KBE/g) konnte YeO:3 in der 50 Ergebnisse Direktkultur quantitativ nachgewiesen werden. Auch zu diesem Zeitpunkt zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Infektionsgruppen. YeO:8 Stamm 8081v konnte auch drei Wochen nach der Infektion nur aus den Tonsillen reisoliert werden, allerdings von einem größeren Anteil der Tiere. So wiesen von vier Tieren drei eine Belastung der Tonsillen mit YeO:8 zwischen 103 und 104 KBE/g auf (Abb. 10 B). Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4]. A B Abb. 10: Quantitative Organbelastung der Minipigs am siebten Tag (A) bzw. am 21. Tag (B) p.i.. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder der beiden Infektionsgruppen wurden zehn Tiere (A) bzw. vier Tiere (B) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. 51 Ergebnisse C.2.5 Qualitative Organbelastung Von den zehn Tieren, die mit YeO:3 Stamm Y1 infiziert und an Tag sieben p.i. seziert wurden, konnten mittels Kälteanreicherung in 90 % der Tonsillen und der Proben von Jejunum, Caecum und Colon Yersinien nachgewiesen werden. Die Ileumproben waren zu 100 % positiv. Von den untersuchten extraintestinalen Proben erwiesen sich 70 % der mesenterialen Lymphknoten, 40 % der Nieren- und 30 % der Milzproben als positiv. Im Gegensatz dazu konnten von den zehn Minipigs, die mit YeO:8 Stamm 8081v infiziert wurden, ausschließlich aus Proben von Tonsillen und Ileum in der Kälteanreicherung Yersinien reisoliert werden. Die Tonsillen waren zu 70 % und Ileumproben zu 30 % positiv, alle extraintestinalen Organe waren frei von Y.enterocolitica Serotyp O:8. Am 21. Tag p.i. konnte Serotyp O:3 aus den Tonsillen, dem Ileum, Caecum und Colon aus drei von vier Proben mit der Kälteanreicherung reisoliert werden. Eine von drei Jejunumproben war ebenfalls positiv. Alle extraintestinalen Proben blieben negativ. Serotyp O:8 konnte am 21. Tag p.i. qualitativ aus drei der vier Tonsillenproben und aus einer Caecumprobe reisoliert werden. Proben von Jejunum, Ileum, Colon sowie den extraintestinalen Organen blieben in der Kälteanreicherung negativ. Die Organe der mit YeO:3 infizierten Tiere waren insgesamt häufiger und stärker befallen als die der mit YeO:8 infizierten Ferkel. Im Fisher’s Exact Test unterschied sich die Häufigkeit, in der die beiden Stämme in den Organen vorkamen, deutlich signifikant im Ileum (P<0.01). In Jejunum, Caecum und Colon war der Unterschied hoch signifikant (P<0.001), während in den Tonsillen und in den extraintestinalen Organen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte (Abb. 11). Alle Organproben von Kontrolltieren waren sowohl in der Direktkultur als auch in der Kälteanreicherung frei von Y. enterocolitica . 52 Ergebnisse Abb. 11: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) oder Serotyp O:8 Stamm 8081v (YeO:8). Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Alle Proben wurden am siebten Tag p.i. gewonnen. In jeder der beiden Infektionsgruppen wurden zehn Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. C.2.6 Bakterielle Ausscheidung Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. wurden bezüglich der bakteriellen Ausscheidung zu jedem der beiden Serotypen Daten von 14 Tieren gewonnen. Vom achten bis zum 21. Tag p.i. wurden nur vier Tiere je Serotyp auf Yersinien in Rektaltupfern untersucht. Der Anteil der Ausscheider stieg bei Serotyp O:3 Stamm Y1 bis zum siebten Tag an und blieb bis zum 21. Tag p.i. sehr hoch, während er bei Serotyp O:8 Stamm 8081v zum siebten Tag hin abnahm. Ab dem zehnten Tag waren in Rektaltupfern bzw. Kottupfern von Tieren der Gruppe B keine Yersinien mehr nachweisbar. Einen Tag nach der oralen Infektion schieden 50 % der Ferkel YeO:3 und 36 % YeO:8 mit dem Kot aus. An Tag drei p.i. waren 93 % der Proben von Ferkeln aus Gruppe A und 7 % der Rektaltupfer von Tieren der Gruppe B positiv. Am siebten Tag nach der Infektion wurden alle Tiere in Gruppe A positiv getestet, während es in Gruppe B nur 7 % waren. Im Fisher’s Exact Test unterschied sich die Häufigkeit, in der die beiden Stämme in den Kotproben vorkamen, deutlich signifikant 53 Ergebnisse (P < 0,001) ab dem dritten Tag p.i.. Am ersten Tag p.i. konnte noch kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (Abb. 12). Abb. 12: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v. Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. In jeder der beiden Infektionsgruppen wurden 14 Tiere untersucht. Die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst. Von Tag zehn bis Tag 21 p.i. waren alle Proben in Gruppe A positiv, aus den Proben der Gruppe B konnten hingegen keine Yersinien reisoliert werden (Abb. 13). Die Kontrolltiere schieden während der gesamten Versuchsdauer keine Yersinien mit dem Kot aus. 54 Ergebnisse Abb. 13: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v. Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Die Ergebnisse stammen aus dem ersten Infektionsversuch. (Anzahl der Tiere: Tag 1-7 p.i.: n=8, Tag 8-21 p.i.: n=4) C.2.7 Serologie Während des ersten Infektionsversuchs wurden vor und nach der Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 bzw. YeO:8 Stamm 8081v einmal wöchentlich Serumproben auf Antikörper gegen pathogene Yersinien untersucht [vgl. B.2.7]. Die gewonnenen Daten beziehen sich bis zum siebten Tag p.i. auf acht Tiere und vom achten bis zum 21. Tag p.i. auf vier Tiere je Infektionsgruppe. Die Kontrollgruppe von drei Tieren wurde bis zum 21. Tag p.i. serologisch untersucht. Die mit YeO:3 infizierten Ferkel zeigten zwischen Tag sieben und Tag 14 p.i. einen sehr deutlichen Titeranstieg auf im Mittel bis zu 80 OD %. In Serumproben der mit YeO:8 infizierten Minipigs und der Kontrolltiere blieben die Titer bis zum 21. Tag p.i. unterhalb des Cut-off Werts von 20 OD %, wobei sie im Verlauf in der Kontrollgruppe sanken, in der YeO:8- Gruppe ganz leicht anstiegen (Abb. 14). Aufgrund der geringen Tierzahlen ab dem 14. Tag p.i. konnte keine statistische Signifikanz nachgewiesen werden. 55 Ergebnisse Abb. 14 4: Bestimmu ung der Serumantikörp per-Titer mittels ELISA im Verlauf d der oralen Infektion I mit YeO O:3 Stamm Y1 Y bzw. YeO O:8 Stamm 8081v. Jede er Punkt repräsentiert deen Mittelwertt der zum angegeb benen Zeitpu unkt untersuc chten Tiere in n Prozent de er optischen Dichte (OD).. Werte unterhalb von 20 OD % sind als negativ einz zustufen (Cu ut-off). Bis zum z siebten Tag p.i. wuurden in den beiden Infektion nsgruppen je e acht Tiere untersucht, ab dem 14. Tag p.i. je vier Tiere. IIn der Kontrollgruppe wurden a am ersten Ta ag p.i. vier und ab dem ssiebten Tag p.i. p drei Tiere e serologischh untersucht. Fazit: Die Org gane der Tiere T aus Gruppe A (YeO:3 Stamm S Y1)) waren innsgesamt häufiger h und stä ärker befallen als die e der Ferkkel aus Grruppe B (Y YeO:8 Stam mm 8081v v). Auch aus Ko otproben bzw. Rektaltupfern ko onnte YeO O:3 ab dem m dritten T Tag p.i. wesentlich häufige er nachgew wiesen werden, was für eine lä ängere Aus sscheidungg mit den Faeces spricht.. In Grupp pe A konntte zudem e eine Serok konversion n beobachttet werden n, die in Gruppe e B und der Kontrollgruppe au usblieb. Fo olgende Untersuchunngen im Schwein S wurden n daher mitt Serotyp O:3 O durchg geführt. 56 Ergebnisse C.3 Koinfektionsversuche mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invasinassoziierten Gendefekten im Minipig-Modell In der vergleichenden Infektionsstudie konnten deutliche Unterschiede im Phänotyp zwischen dem Serotyp O:3 Stamm Y1 und dem Serotyp O:8 Stamm 8081v beobachtet werden. Auf genetischer Ebene unterscheiden sich Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) und Serotyp O:8 (YeO:8) u.a. hinsichtlich der Expression des Virulenzfaktors Invasin. Der erste Unterschied besteht in einer Punktmutation des globalen Regulators RovA, der als Transkriptionsfaktor die invA-Expression aktiviert. Durch diese Punktmutation befindet sich an Position 98 bei YeO:3 die Aminosäure Serin (RovAS98 bzw. RovAYeO:3), bei YeO:8 hingegen Prolin (RovAP98 bzw. RovAYeO:8). Diese eine Aminosäure verändert die Faltung des Proteins bei höheren Temperaturen (37°C) und bewirkt dadurch eine geringere Empfindlichkeit des RovAYeO:3 gegenüber der Lon-Protease. RovA wird bei 37°C somit nicht von dieser degradiert, und die höhere RovA-Konzentration führt zu einer verstärkten invA-Expression (Uliczka et al., 2011). Der zweite Unterschied besteht im Vorhandensein eines Insertionselements in der invA-Promotorregion (PinvAIS1667) bei Serotyp O:3. Dieses beinhaltet einen zusätzlichen Promotor, der eine konstitutive invA-Expression bewirkt (Uliczka et al., 2011). Um herauszufinden, inwiefern die genannten genetischen Merkmale dafür verantwortlich sein könnten, dass die beiden Serotypen im Schwein einen so unterschiedlichen Phänotyp zeigten [vergleiche C.2.], führten wir Koinfektionsversuche mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und verschiedenen Mutanten durch. In diesen Koinfektionen können Wildtyp und Mutante im selben Tier verglichen werden, was die Auswirkungen individueller Unterschiede zwischen den Wirtstieren relativiert und somit einen Erkenntnisgewinn unter Verwendung geringerer Versuchstierzahlen ermöglicht (Monk et al., 2008). Eingesetzt wurden eine RovA-Stabilitätsmutante, in der das stabilere RovAYeO:3 durch das weniger stabile RovAYeO:8 ersetzt wurde, und eine PinvA∆IS1667-Mutante, der das Insertionselement im Promotorbereich des Invasingens fehlt. Beide Mutanten lassen somit Serotyp O:3 in einem bestimmten Merkmal dem Serotyp O:8 gleichen und zeichnen sich im Vergleich mit dem YeO:3 Wildtypstamm durch eine verringerte invA-Expression aus. Abschließend testeten wir auch eine komplette invA-Knockout 57 Ergebnisse Mutante, um zu zeigen, welche Rolle Invasin prinzipiell für die Infektion des Wirtes Schwein spielt. Die Koinfektionsversuche wurden, ebenso wie die Vergleichsstudien der beiden Serotypen O:3 und O:8, in Kooperation mit Prof. Dr. Petra Dersch und Julia Schaake, M.Sc. aus der Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie des Helmholtz Zentrums für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig durchgeführt. C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante In einem ersten Koinfektionsversuch wurden acht Mini-Lewe-Ferkel jeweils mit ca. 5x108 KBE YeO:3 Stamm Y1 (wt) und 5x108 KBE der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (Y1 RovAP98, KnR) infiziert. YE14 ist mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 identisch, bis auf ein weniger stabiles RovA-Protein, das ihn in diesem einen Punkt dem Serotyp O:8 Stamm 8081v gleichen lässt. Außerdem besitzt YE14 eine KanamycinResistenzkassette, die es ermöglicht, ihn kulturell vom Wildtypstamm Y1 zu unterscheiden. Jeweils vier Schweine pro Gruppe wurden in einem ersten Koinfektionsversuch am siebten und am 21. Tag p.i. euthanasiert und seziert. In einem zweiten Koinfektionsversuch wurden nochmals vier Minipigs mit je 5x108 KBE YeO:3 Stamm Y1 (wt) und 5x108 KBE der RovA-Stabilitätsmutante YE14 infiziert und nach sieben Tagen seziert. Die Ergebnisse vom siebten Tag p.i. wurden aus beiden Versuchen zusammengefasst und umfassen daher die Daten von insgesamt acht Tieren. Vier Kontrolltiere wurden mit sterilem PBS pseudoinfiziert und am 21. Tag p.i. seziert. Um das Verhältnis der Organbelastung durch die Mutante zu der Belastung durch den Wildtyp zu ermitteln, wurden zwei unabhängige Verdünnungsreihen auf CINAgarplatten mit und ohne Kanamycin-Zusatz ausplattiert und ausgezählt. Danach wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KBE/g) Organ aus dem Verhältnis der auf Agarplatten mit und ohne Kanamycinzusatz gewachsenen Kolonien errechnet. Für die Berechnung der RVR (engl.: relative virulence ratio) wurde zudem der Bezug zum exakten Anteil der beiden Stämme am Inokulum hergestellt. Der CI (engl.: competitive index) zeigt das Verhältnis der RVRs der beiden Stämme zueinander innerhalb eines Tieres [vgl. B.3]. 58 Ergebnisse C.3.1.1 Klinische Beurteilung der Tiere Die Versuchstiere wiesen sowohl vor als auch nach der Infektion diverse unspezifische Befunde in der hämatologischen Untersuchung auf. Klinische Symptome konnten abgesehen von gelegentlich auftretendem breiigen Kot nicht beobachtet werden [vgl. H.1]. C.3.1.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung In den Sektionen konnten sowohl am siebten als auch am 21. Tag p.i. nur unspezifische Befunde erhoben werden, die überwiegend von milder Ausprägung und sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren zu beobachten waren [vgl. H.2]. C.3.1.3 Histopathologische Beurteilung In der histopathologischen Beurteilung der mesenterialen Lymphknoten und des Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben werden, die sowohl bei den Tieren der Koinfektions- als auch den Ferkeln der Kontrollgruppen auftraten. Im Ileum eines der koinfizierten Tiere konnten Bakterienkolonien in der Darmwand beobachtet werden [vgl. H.3]. Detaillierte Beschreibungen zu klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, 2 und 3]. C.3.1.4 Quantitative Organbelastung Von den insgesamt acht am siebten Tag p.i. sezierten Ferkeln, konnten sowohl der Wildtypstamm Y1 als auch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 in den Tonsillen und den verschiedenen Darmabschnitten (Jejunum, Ileum, Caecum und Colon) aller Tiere quantitativ nachgewiesen werden. Hiervon gab es nur drei Ausnahmen, bei einem Tier kam der Wildtypstamm nicht in den Tonsillen vor, bei einem weiteren Tier nicht im Caecum und bei einem dritten nicht im Colon. Die Organbelastung mit dem Wildtypstamm lag in den Tonsillen zwischen 102 und 104 KBE/g, in einer der acht untersuchten Tonsillen konnte der Wildtypstamm quantitativ nicht nachgewiesen 59 Ergebnisse werden. Im Jejunum schwankte die Belastung zwischen 102 und 105 KBE/g, das Ileum war mit 104 bis 106 KBE/g besonders stark belastet und im Caecum konnten zwischen 103 und 104 KBE/g, mit Ausnahme der einen negativen Probe, gefunden werden. Auch das Colon war mit bis zu 106 KBE/g Organ sehr hoch belastet, nur in einer Probe konnte der Wildtypstamm nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum Wildtyp konnte die RovA-Stabilitätsmutante YE14 in allen intestinalen Organ- und Tonsillenproben quantitativ nachgewiesen werden. Sie wurde in den Tonsillen mit 102 bis 104 KBE/g Organ gefunden. Die Belastung des Jejunums schwankte wie auch beim Wildtypstamm sehr stark (zwischen 101 und 105 KBE/g). Ileum (103 bis 106 KBE/g) und Colon (102 und 105 KBE/g) waren auch hier besonders hoch belastet. Im Caecum fanden sich zwischen 102 und 104 KBE/g der RovA-Stabilitätsmutante. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4]. In den extraintestinalen Organen, wie den mesenterialen Lymphknoten, Leber, Milz und Nieren, konnte weder der Wildtypstamm noch die Mutante quantitativ nachgewiesen werden. Im Student’s t-Test und Signed Rank Test konnten keine signifikanten Unterschiede in der quantitativen Organbelastung (KBE/g Organ) durch den Wildtyp und die RovAStabilitätsmutante nachgewiesen werden (Abb. 15). Abb. 15: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovAStabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98). (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben in log KBE/g Organ) 60 Ergebnisse Hinsich htlich der RVR R (engl.: relative vvirulence ratio) r konntte nur im IIleum ein Nachteil N der Mu utante geg genüber de em Wildtyp p beobach htet werden n. Dieser zeigte sich h durch einen ssignifikante en Unterschied im St udent’s t-T Test (P<0,0 01) (Abb. 116). Abb. 16 6: Quantitattive Belastu ung der To onsillen und d der intes stinalen Org gane der einzelnen e Minipig--Ferkel mit Y. entero ocolitica S Serotyp O::3 Stamm Y1 (wt) und derr RovAStabilitä ätsmutante YE14 (Rov vAP98) im V Verhältnis zum Anteil des Inokul ums. (Zeitp punkt der Probena ahme am sie ebten Tag p.i., untersuch ht wurden insgesamt ach ht koinfiziertee Ferkel, An ngaben in log RVR R (relative viru ulence ratio)) Auch d der „comp petitive ind dex“ (CI) zzeigte zwar nur im m Ileum ei nen signiffikanten Unterscchied (P<0 0.05) zwisc chen den b beiden Stä ämmen (on ne sample t-Test), alllerdings war durchaus ein ne Tendenz z erkennba ar, nach der der CI der d Mutantte meist un nterhalb ms lag (Ab bb. 17). des Wildtypstamm 61 Ergebnisse Abb. 17: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben als CI (competitive index)) Am 21. Tag nach der Infektion wurden nur im ersten Koinfektionsversuch vier Tiere untersucht. Zu diesem Zeitpunkt konnte quantitativ nur in den Tonsillen eines Tieres sowohl der Wildtyp als auch die Mutante nachgewiesen werden. Die Organbelastung lag bei 3,17x104 KBE/g (Y1) und 1,5x104 KBE/g (YE14). Es konnte somit zwar kein Unterschied zwischen den beiden Stämmen, jedoch ein starker Rückgang der Organbelastung durch sowohl den Wildtypstamm als auch die RovA- Stabilitätsmutante zwischen dem siebten und dem 21. Tag p.i. festgestellt werden. C.3.1.5 Qualitative Organbelastung Mit Hilfe der Kälteanreicherungstechnik konnten am siebten Tag p.i. sowohl der Wildtypstamm Y1 als auch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 aus allen vier Proben von Tonsillen, Jejunum, Caecum, Colon und Ileum reisoliert werden. Eine Probe von mesenterialen Lymphknoten konnte positiv auf Wildtyp und Mutante getestet werden, in einer weiteren war nur die Mutante nachweisbar. Aus den vier Proben von Leber, Milz und Nieren konnte keiner der beiden Stämme reisoliert werden. Die Daten zur qualitativen Organbelastung der vier Tiere aus dem ersten Versuch waren nicht auswertbar, daher beziehen sich diese Ergebnisse nur auf vier Tiere (Abb. 18 A). Vom 21. Tag p.i. liegen ebenfalls qualitative Daten von jeweils vier Tieren vor. Zu diesem Zeitpunkt war der Wildtypstamm Y1 in drei, die RovA-Stabilitätsmutante nur 62 Ergebnisse in einer von vier Tonsillen nachweisbar. In Ileum, Caecum und Colon wurden allerdings mehr Tiere positiv auf die Mutante getestet, als auf den Wildtyp. So fand sich der Wildtypstamm Y1 nur in einer Caecum- und zwei Colonproben, die RovAStabilitätsmutante hingegen in einer Ileum-, zwei Caecum- und drei Colonproben. Das Jejunum und alle extraintestinalen Organe außer den Tonsillen wurden drei Wochen nach der Infektion mit negativem Ergebnis auf Y. enterocolitica untersucht (Abb. 18 B). 63 Ergebnisse A B Abb. 18: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden zu jedem Zeitpunkt Organproben von je vier Tieren ausgewertet. 64 Ergebnisse C.3.1.6 Bakterielle Ausscheidung Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. wurden Daten zur bakteriellen Ausscheidung von insgesamt zwölf Minipigs erhoben, vom zehnten bis zum 21. Tag p.i. beziehen sich die Werte nur noch auf vier Tiere. Einen Tag nach der Infektion konnte der Wildtypstamm Y1 in acht und die RovAStabilitätsmutante in zehn von zwölf Rektaltupfern nachgewiesen werden. Am dritten Tag p.i. wurden alle Proben positiv auf beide Stämme getestet, am siebten ebenfalls bis auf eine Probe, in der der Wildtypstamm nicht nachweisbar war (Abb. 19). Am zehnten Tag p.i. konnte die Mutante in allen vier, der Wildtypstamm in drei Rektaltupfern nachgewiesen werden. Nach 14 Tagen konnten Wildtyp und Mutante aus je drei Proben reisoliert werden, am 17. Tag p.i. war der Wildtypstamm in allen vier, die Mutante in drei Proben nachweisbar. Drei Wochen nach der Infektion waren wieder drei von vier Proben positiv in der Untersuchung auf beide Stämme. Abb. 19: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98). Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht; die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden zwölf Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Ausscheidung zwischen dem YeO:3 Wildtypstamm Stabilitätsmutante YE14 nachgewiesen werden. 65 Y1 und der RovA- Ergebnisse 7 Serologiie C.3.1.7 Währen nd des erssten Koinfe ektionsverssuchs wurd den einma al wöchentllich Serum mproben von allen Tieren untersuch ht. Von ein ner Woche e vor bis zum siebtten Tag na ach der Infektio on wurden acht Ferke el serologissch unters sucht, vom achten biss zum 21. Tag p.i. nur nocch vier Fe erkel. Wie auch nac h der Infe ektion mit dem d Wildttyp Y1 alle ein (vgl. C.1.2.7 7 und C.2..7) zeigte sich nach h der Koin nfektion mit diesem und der Mutante M YE14 im ELISA ebenfalls ein starke er Titerans stieg zwisc chen dem siebten un nd dem vierzeh hnten Tag nach der Infektion n auf bis zu 80 OD D %. Die vvier Minip pigs der Kontrolllgruppe ze eigten kein nen Titera nstieg, ihre e Werte blieben bis zum 21. Tag T p.i. weit un nter dem Cut-off Wertt von 20 O OD % (Abb.. 20). Abb. 20 0: Bestimmu ung der Serrumantikörp per-Titer mitttels ELISA vor und naach oraler Infektion mit YeO O:3 Stamm Y1 und de er RovA-Sta abilitätsmuttante YE14.. Jeder Punnkt repräsen ntiert den Mittelwert der zum angegebenen a n Zeitpunkt u untersuchten Tiere in % der d optische n Dichte (OD D). Werte unterhalb von 20 OD D % sind als negativ einzzustufen (Cu ut-off). Bis zu um siebten T Tag p.i. wurd den in der Infektion nsgruppe ach ht und ab de em 14. Tag p.i. vier Tie ere untersucht. In der Koontrollgruppe e wurden während d des gesamtten Verlaufs vier Tiere se erologisch un ntersucht. Fazit: Im Hinblicck auf die e Organbe elastung konnte k eine Attenuieerung derr RovAStabilitä ätsmutante e gegenüb ber dem Y YeO:3 Willdtypstamm m Y1 aussschließlich h in der Belastu ung des Ile eums festg gestellt werrden. Diese Attenuierung konnnte nicht im m Bezug auf die e absoluten Zahlen in KBE/g Organ, je edoch in den d relativven Werten unter Berückksichtigung g des Anteils am Inokulum (RVR) nachgewie n sen werd den. Im compettitive indexx (CI) zeig gte sich a llerdings auch a in de er Belastunng des Je ejunums 66 Ergebnisse eine Tendenz, nach der die Mutante attenuiert war. Hinsichtlich der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces konnte kein Unterschied zwischen den beiden Stämmen beobachtet werden. C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante Ähnlich wie im Koinfektionsversuch mit der RovA-Stabilitätsmutante (RovAP98) wurden auch in diesem Versuch zuerst acht Mini-Lewe-Ferkel und in einem späteren Versuch nochmals vier Minipigs mit je ca. 5x108 KBE des Wildtypstamms (Stamm YE13, Y1 wt, KnR) und 5x108 KBE der Mutante (YE15, Y1 PinvA∆IS1667) infiziert. Beide Stämme wurden zu einem Inokulum vermischt und oral verabreicht. YE13 und YE15 sind mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 identisch, bis auf eine Kanamycin-Resistenzkassette des Wildtypstamms YE13 und das fehlende Insertionselement IS1667 im Invasin-Promotorbereich der Mutante YE15. Das Insertionselement IS1667 bei Serotyp O:3 beinhaltet einen zusätzlichen Promotor und führt dadurch zu einer erhöhten invA-Expression. Das Insertionselement IS1667 fehlt bei Serotyp O:8. Der Versuchsaufbau entsprach bezüglich Tierzahlen, Sektionsterminen und Untersuchungsmethoden dem vorigen Koinfektionsversuch (vgl. C.3.1). Die Kontrolltiere waren mit den im Abschnitt C.3.1. beschriebenen identisch. In Tabellen werden sie dennoch wieder aufgeführt, um den Vergleich mit Tieren der Koinfektionsgruppe zu erleichtern. C.3.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere In den Koinfektionsversuchen mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm YE13 (wt) und Stamm YE15 (PinvA∆IS1667- Mutante) traten bei der hämatologischen Untersuchung der Tiere verschiedene unspezifische Veränderungen auf. Einige Ferkel zeigten am siebten Tag p.i. auch Anzeichen einer akuten Entzündung. Fieber, Diarrhoe oder andere klinische Symptome konnten jedoch nicht beobachtet werden [vgl. H.1]. 67 Ergebnisse C.3.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung In den Sektionen konnten sowohl am siebten als auch am 21. Tag p.i. nur unspezifische Befunde erhoben werden, die überwiegend von milder Ausprägung und sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren zu beobachten waren [vgl. H.2]. C.3.2.3 Histopathologische Beurteilung In der histopathologischen Beurteilung der mesenterialen Lymphknoten und des Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben werden, die sowohl bei den Tieren der Koinfektions- als auch den Ferkeln der Kontrollgruppen auftraten [vgl. H.3]. Detaillierte Beschreibungen zu den klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, 2 und 3]. C.3.2.4 Quantitative Organbelastung Am siebten Tag p.i. wurden Organproben von insgesamt acht Tieren auf den YeO:3 Wildtypstamm YE13 und die PinvA∆IS1667- Mutante YE15 untersucht. Am siebten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm quantitativ aus allen acht Tonsillenproben, vier Jejunum-, fünf Ileum-, sieben Caecum-, fünf Colon- und einer Nierenprobe reisoliert werden. Besonders hoch belastet war hierbei wiederum das Ileum mit bis zu 107 KBE/g, aber auch die anderen intestinalen Proben wiesen z.T. Belastungen von bis zu 106 (Colon) oder 105 KBE/g (Jejunum, Caecum) auf. In den Tonsillen fanden sich im Mittel 104 KBE/g des Wildtypstamms YE13. Die PinvA∆IS1667- Mutante YE15 war am siebten Tag p.i. quantitativ in sechs von acht Tonsillen-, zwei Jejunum-, vier Ileum-, sieben Caecum-, sechs Colon- und ebenfalls einer Nierenprobe nachweisbar. Auch für die ∆IS1667-Mutante lag die Belastung der Tonsillen zwischen 103 und 105 KBE/g, im Mittel bei 104 KBE/g Organ. Nur im Ileum kam die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 mit bis zu 106 KBE/g vor, in Jejunum, Caecum und Colon konnten maximal 105 KBE/g gefunden werden. Die Belastung der Niere eines Tieres lag bei 1,5x103 KBE/g des Wildtypstamms YE13 und 6,7x102 KBE der PinvA∆IS1667-Mutante. 68 Ergebnisse Im Vergleich der direkten Organbelastung (KBE/g) aller Tiere konnten mithilfe des Student’s t-Test und Signed Rank Test keine signifikanten Unterschiede durch den Wildtypstamm YE13 und die PinvA∆IS1667- Mutante YE15 nachgewiesen werden (Abb. 21). Abb. 21: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben in log KBE/g Organ) Am 21. Tag p.i. konnten sowohl der Wildtypstamm YE13 als auch die PinvA∆IS1667Mutante YE15 aus einer der drei Tonsillenproben, zwei Caecum- und einer Colonprobe reisoliert und quantitativ bestimmt werden. Im Ileum wurde nur der Wildtypstamm in einem der drei Minipigs quantitativ nachgewiesen. Weder der Wildtypstamm noch die Mutante konnten zu diesem Zeitpunkt quantitativ in Jejunumproben bestimmt werden. Die Belastung der Tonsillen, des Ileums und des Colons lag um 103 KBE/g Organ durch beide Stämme, die des Caecums durch den Wildtypstamm YE13 bei 4,5x101 und 2x103 KBE/g und durch die PinvA∆IS1667Mutante bei 1,8x103 und 3x102 KBE/g Organ. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4]. Hinsichtlich der RVR (engl.: relative virulence ratio) konnte im Ileum und Caecum eine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante gegenüber dem Wildtypstamm YE 13 beobachtet werden, diese zeigte sich durch einen signifikanten Unterschied im Student’s t-Test (**:P<0,01; ***:P<0,001) (Abb. 22). 69 Ergebnisse Abb. 22 2: Quantitattive Belastu ung der To onsillen und d der intes stinalen Org gane der einzelnen e Minipig--Ferkel mitt YeO:3 Stamm S YE1 13 (YeO:3w wt) und der d PinvAIS11667-Mutantte YE15 (YeO:3Δ ΔIS1667) im m Verhältnis s zum Ante eil des Inok kulums. Unttersucht wurrden insgesamt acht koinfizierte Ferkel. (Zeitpunkt ( de er Probenah hme am sieb bten Tag p.i., Angaben in log RVR R (relative virulence e ratio)) Im „co ompetitive index“ (C CI) zeigte sich ein signifikanter Untersschied (*:P<0.05; ***:P<0 0,001) zwischen den beiden Stämmen in allen intestinaleen Organe en (one sample e t-Test) (A Abb. 23). Abb. 23 3: Quantitattive Belastu ung der To onsillen und d der intes stinalen Org gane der einzelnen e Minipig--Ferkel durc ch die PinvAIS S1667-Muta ante YE15 (Y YeO:3ΔIS166 67) im Verhäältnis zur Belastung durch d den Wildtypstamm YE13 innerhalb b desselben n Tieres. Un ntersucht wuurden insges samt acht koinfizierte Ferkel. (Zeitpunkt ( der Probenah hme am sie ebten Tag p.i., Angabenn als CI (co ompetitive index)) 70 Ergebnisse C.3.2.5 Qualitative Organbelastung In der Kälteanreicherung konnten vom siebten Tag p.i. nur die Daten von vier Tieren ausgewertet werden. In allen Tonsillenproben konnte sowohl der wt-Stamm YE13 als auch die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 nachgewiesen werden. Im Jejunum war aus einer Probe die Mutante, jedoch aus keiner der vier Proben der Wildtyp reisolierbar. In den restlichen Darmabschnitten (Ileum, Caecum und Colon) konnte der Wildtyp allerdings in einer größeren Anzahl von Proben gefunden werden als die Mutante. So wurde der Wildtypstamm YE13 in diesen drei Darmabschnitten jeweils aus drei von vier Proben reisoliert, die Mutante hingegen nur aus je einer Ileum- und Caecumprobe sowie aus zwei Colonproben. In den extraintestinalen Organproben (mesenteriale Lymphknoten, Leber, Milz, Nieren) konnten in der Kälteanreicherung keine Yersinien nachgewiesen werden. Lediglich aus einem der vier mesenterialen Lymphknoten konnte die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 reisoliert werden. In einer Nierenprobe konnte der Wildtypstamm YE13 gefunden werden (Abb. 24 A). Am 21. Tag p.i. wurden nur drei der vier infizierten Ferkel seziert, da ein Tier vorzeitig nach einer Blutentnahme verstorben war. Zu diesem Zeitpunkt konnte der Wildtypstamm YE13 nur noch aus einer der drei Tonsillenproben reisoliert werden, die PinvA∆IS1667-Mutante YE 15 wurde in keiner Tonsillenprobe nachgewiesen. Auch aus dem Ileum konnte der Wildtypstamm YE13 aus zwei, die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 nur aus einer von drei Proben reisoliert werden. Im Dickdarm war das Verhältnis zwischen Wildtyp und Mutante umgekehrt, hier fand sich der Wildtypstamm YE13 in zwei Caecum- und einer Colonprobe, die PinvA∆IS1667Mutante YE15 hingegen in allen drei Caecum- und in zwei Colonproben. Im Jejunum und den extraintestinalen Organen konnten weder der Wildtyp noch die Mutante nachgewiesen werden (Abb. 24 B). 71 Ergebnisse A B Abb. 24: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden am 7. Tag p.i. Organproben von vier und am 21. Tag p.i. von drei Tieren ausgewertet. 72 Ergebnisse C.3.2.6 Bakterielle Ausscheidung Am ersten Tag nach der oralen Infektion wurden Rektaltupfer von zwölf Tieren untersucht. Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. konnten Daten zur bakteriellen Ausscheidung von insgesamt elf Minipigs erhoben werden. Vom zehnten bis zum 21. Tag p.i. beziehen sich die Werte nur noch auf vier Tiere. Das Fehlen eines Tieres ist durch den subakuten Tod eines Ferkels nach der Blutentnahme am ersten Tag p.i. begründet. Die Rektaltupfer und Kotproben wurden mittels Kälteanreicherung untersucht. Einen Tag nach der Infektion konnte der Wildtypstamm YE13 in neun und die PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in zehn von zwölf Tupferproben nachgewiesen werden. Am dritten Tag p.i. fand sich der Wildtypstamm in sieben, die Mutante in sechs der elf Proben. Am siebten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm aus zehn und die Mutante aus neun von elf Rektaltupfern reisoliert werden (Abb. 25). Abb. 25: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAΔIS1667-Mutante YE15 (YeO:3 ΔIS1667). Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Am ersten Tag p.i. wurden zwölf Tiere untersucht, ab dem dritten Tag p.i. elf Tiere. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Ausscheidung zwischen dem Wildtypstamm YE13 und der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 nachgewiesen werden. Am zehnten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm YE13 in allen drei, die Mutante nur in zwei der Proben nachgewiesen werden. Nach zwei Wochen war in drei von drei Proben der Wildtypstamm und in zwei von drei Proben die PinvA∆IS1667-Mutante 73 Ergebnisse YE15 n nachweisbar, am 17. Tag p.i. kkonnten be eide Stämme in je zzwei Rekta altupfern gefunden werden n. Am 21.. Tag p.i. war, wie am zehnten Tag, dder Wildtyp pstamm YE13 aus allen n drei un nd die PinnvA∆IS1667 7-Mutante YE15 a us zwei Proben reisolie erbar. 7 Serologiie C.3.2.7 Währen nd des ersten e Ko oinfektionssversuchs wurden auch vonn den mit m dem Wildtyp pstamm YE13 Y und der PinvA∆ ∆IS1667-M Mutante YE15 Y infizi erten Min ni-LeweFerkeln n einmal wöchentlich w h Serumpro oben auf Antikörper A gegen patthogene Ye ersinien untersu ucht. Auch h in dieserr Koinfektiionsgruppe e glichen die seroloogischen Befunde B denen nach eine er Infektion n mit dem Wildtypsta amm Y1. Zwischen dem siebtten und e starke r Titeransttieg auf bis zu 80 O OD % festtgestellt dem 21. Tag p.ii. konnte ein werden n, während d der Titer der d vier Ko ontrolltiere nahe null und weit uunterhalb des d Cutoff Werrts von 20 OD % blieb (Abb. 26 6). Abb. 26 6: Bestimmu ung der Serrumantikörp per-Titer mitttels ELISA vor und naach oraler Infektion mit YeO O:3 Stamm YE13 und der PinvA∆ ∆IS1667-Muttante YE15. Jeder Punnkt repräsen ntiert den Mittelwert der zum angegebenen a n Zeitpunkt u untersuchten Tiere in % der d optische n Dichte (OD D). Werte unterhalb von 20 OD D % sind als s negativ ein zustufen (Cu ut-off). Bis zum ersten T Tag p.i. wurden in der Infektion nsgruppe ach ht Tiere untersucht, am ssiebten Tag p.i. p sieben un nd ab dem 1 4. Tag p.i. drei d Tiere. In der Ko ontrollgruppe e wurden zu allen Zeitpun nkten vier Tiere serologis sch untersuccht. 74 Ergebnisse Fazit: Hinsichtlich der qualitativen Organbelastung und der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces war keine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 zu erkennen. Auch im direkten Vergleich der Organbelastung aller Tiere in absoluten Zahlen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Jedoch zeigte sich eine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in den relativen Werten (unter Berücksichtigung des Anteils der Mutante am Inokulum (RVR)). Die Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante konnte noch deutlicher im direkten Vergleich mit dem Wildtypstamm YE13 innerhalb eines Tieres beobachtet werden (CI). C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invA-Mutante Um herauszufinden, welche Auswirkungen der Virulenzfaktor Invasin auf die Kolonisation bzw. Infektion hat, wurden Koinfektionsversuche mit dem Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 und einer invA-Knockout-Mutante (ΔinvA YE21) durchgeführt. Alle Minipigs wurden oral mit je 5x108 KBE des YeO:3 Wildtypstamms Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 infiziert. Beide Stämme wurden zu einem Inokulum vermischt. In einem ersten Koinfektionsversuch wurden acht Minipigs oral infiziert und am siebten Tag p.i. euthanasiert und seziert. Von diesen wurde ein Tier von der Auswertung ausgeschlossen, da Y. enterocolitica aus einem Rektaltupfer vom Tag der Einstallung nachgewiesen wurde. Zudem wurden aus diesem Versuch zu den vorherigen Ergebnissen widersprüchliche Daten bezüglich der quantitativen Organbelastung erhalten. Daher wurde der Koinfektionsversuch mit zehn MinipigFerkeln wiederholt, von denen eines am Tag nach der Einstallung nach erfolgter Blutentnahme perakut verstarb. Somit verblieben neun Tiere für die quantitative Auswertung der Organbelastung. Alle Tiere wurden am siebten Tag p.i. seziert, eine Untersuchung einer Teilmenge der Tiere am 21. Tag p.i. wurde nicht vorgenommen. Die klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunde der Kontrolltiere entsprechen den im Abschnitt C.3.1. und C.3.2. beschriebenen und werden daher nachfolgend nicht im Text erwähnt. Die Proben von Ileum und mesenterialen Lymphknoten wurden nur während des ersten Koinfektionsversuchs histopathologisch untersucht. Eine hämatologische und serologische Untersuchung 75 Ergebnisse der Tiere fand aufgrund der Annahme einer erhöhten Stressempfindlichkeit bei Blutentnahmen nicht mehr statt. C.3.3.1 Klinische Beurteilung der Tiere Die Versuchstiere zeigten nur vereinzelt minimale bis leichte Anzeichen einer Diarrhoe. Ein Tier fiel zweimalig mit leichtem Husten auf. Bei keinem der Ferkel konnte Fieber festgestellt werden [vgl. H.1]. C.3.3.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung In der Sektion am siebten Tag p.i. zeigten sich die Versuchstiere eher unauffällig. Nur wenige unspezifische Befunde konnten erhoben werden [vgl. H.2]. C.3.3.3 Histopathologische Beurteilung In der histopathologischen Beurteilung der mesenterialen Lymphknoten und des Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben werden, die sowohl bei den Tieren der Koinfektions- als auch den Ferkeln der Kontrollgruppen auftraten. Insbesondere die mesenterialen Lymphknoten waren histologisch bis auf eine leichte lymphatische Hyperplasie unauffällig [vgl. H.3]. Detaillierte Beschreibungen zu den klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, H.2 und H.3]. C.3.3.4 Quantitative Organbelastung Am siebten Tag p.i. wurden Organe von insgesamt 16 Tieren auf den Wildtypstamm Y1 und die ΔinvA-Mutante YE21 untersucht. Die quantitativen Ergebnisse des ersten Koinfektionsversuchs wichen hinsichtlich der Belastung mit dem Wildtypstamm Y1 sehr stark von allen bisherigen Ergebnissen ab. Daher wurden sie in der statistischen Auswertung nicht erfasst und der Versuch wiederholt. Im ersten Versuch konnte die ΔinvA-Mutante YE21 ausschließlich aus den Tonsillen reisoliert werden. Abgesehen von dem Ileum und Caecum je eines von sieben Tieren konnte jedoch auch der Wildtypstamm Y1 nur in den Tonsillen quantitativ nachgewiesen werden. Eine 76 Ergebnisse Erklärung für diese Abweichung von den vorherigen Beobachtungen konnte nicht gefunden werden. Im zweiten Koinfektionsversuch war Wildtypstamm Y1 in allen neun Proben von Tonsillen, Ileum und Colon quantitativ nachweisbar. Ebenso in fünf der neun Jejunum-, acht Caecum-, einer Darmlymphknoten- und einer Milzprobe. Die ΔinvA-Mutante YE21 hingegen konnte insgesamt aus weniger Proben und in geringeren Zahlen reisoliert werden. So fand sie sich in acht Tonsillen-, einer Jejunum-, fünf Ileum- und je sieben Caecum- und Colonproben. In den extraintestinalen Organen konnte die ΔinvA-Mutante YE21 quantitativ nicht nachgewiesen werden. Die Belastung durch den Wildtypstamm Y1 schwankte in den Tonsillen zwischen 102 und 105 KBE/g Organ, die durch die ΔinvA-Mutante YE21 sogar zwischen 101 und 105 KBE/g. Das Jejunum war im Mittel mit 104 KBE/g des YeO:3 Wildtyps und nur in einer Probe sehr gering (38,5 KBE/g) mit der Mutante belastet. Das Ileum war auch in diesem Infektionsversuch wieder besonders hoch belastet mit bis zu 106 KBE/g des Wildtypstamms Y1 und 105 KBE/g der ΔinvAMutante YE21. Im Caecum lag die Belastung durch den Wildtypstamm Y1 um 104 KBE/g und durch die ΔinvA-Mutante YE21 um 103 KBE/g. Das Colon war durch den Wildtypstamm Y1 in etwa ebenso hoch belastet wie das Ileum (bis zu 106 KBE/g), die Belastung durch die ΔinvA-Mutante YE21 fiel wesentlich geringer aus (bis zu 103 KBE/g). In einer Probe der Lnn. jejunales konnte der Wildtypstamm Y1 mit 3,27x103 und in einer Milzprobe mit 1,59x105 KBE/g Organ nachgewiesen werden. Abgesehen von den Tonsillen lag die Belastung durch die ΔinvA-Mutante YE21 in allen Proben unterhalb der durch den Wildtypstamm Y1. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4]. Dennoch konnte bezüglich der KBE/g Organ im student’s t-Test kein signifikanter Unterschied zwischen der Belastung durch den Wildtypstamm Y1 und der durch die ΔinvA-Mutante YE21 festgestellt werden (Abb. 27). 77 Ergebnisse Abb. 27 7: Quantitattive Belastu ung der To onsillen und d der intes stinalen Org gane der einzelnen e Minipig--Ferkel mit YeO:3 Stam mm Y1 (YeO O:3 wt) und d der ΔinvA A-Mutante Y YE21 (YeO:3 3 ΔinvA). Untersuccht wurden insgesamt neun n koinfizie erte Ferkel. (Zeitpunkt der d Probenahhme am siebten Tag p.i., Angaben in log KBE/g K Organ n) Unter B Berücksich htigung des Anteils d der ΔinvA--Mutante am a Inokuluum (RVR) jedoch konnte in allen vier Darmabschnitten ein hoch signifikantter Unterscchied (stud dent’s tTest, P P<0,001) fe estgestellt werden w (A Abb. 28). Abb. 28 8: Quantitattive Belastu ung der To onsillen und d der intes stinalen Org gane der einzelnen e Minipig--Ferkel mit YeO:3 Y Stam mm Y1 (YeO :3 wt) und der d ΔinvA-M Mutante YE221 (YeO:3 ΔinvA) Δ im Verhältn nis zum An nteil des In nokulums. U Untersucht wurden w insg gesamt neunn koinfizierte e Ferkel. (Zeitpunkt der Probe enahme am siebten s Tag p p.i., Angaben n in log RVR (relative viruulence ratio)) 78 Ergebnisse Der Unterschied zeigte sich auch im „competitive index“ (CI), in dem die Belastung durch die ΔinvA-Mutante YE21 zu der durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres ins Verhältnis gesetzt wird (one sample t-Test, P<0.001) (Abb. 29). Abb. 29: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. Untersucht wurden insgesamt neun koinfizierte Ferkel. (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., Angaben als CI (competitive index)) C.3.3.5 Qualitative Organbelastung Die qualitative Untersuchung der Organproben vom siebten Tag p.i. mittels Kälteanreicherung ergab im ersten Koinfektionsversuch einen deutlichen Unterschied zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21. Der Wildtypstamm Y1 konnte in diesem Versuch aus fünf von sieben Tonsillen- und je vier Jejunum-, Ileum-, Caecum- und Colonproben reisoliert werden. Die ΔinvA-Mutante YE21 hingegen konnte zwar ebenfalls in fünf Tonsillenproben, jedoch nur in jeweils einer Ileum- und Caecumprobe und nicht in Proben von Jejunum und Colon nachgewiesen werden (Abb. 30 A). Im zweiten Koinfektionsversuch wurden alle neun Tonsillenproben mit positivem Ergebnis sowohl auf den Wildtypstamm Y1 als auch auf die ΔinvA-Mutante YE21 untersucht. Der Wildtypstamm Y1 konnte zudem aus sechs Jejunum-, allen neun Ileum-, je acht Caecum- und Colon-, drei Darmlymphknoten- und einer Milzprobe reisoliert werden. Die ΔinvA-Mutante YE21 war hingegen nur in einer der neun Jejunumproben nachweisbar. Sie konnte in sechs Ileum-, sieben Caecum- und, wie der Wildtypstamm Y1, in acht Colonproben nachgewiesen werden und wurde zudem 79 Ergebnisse auch in einer Probe der mesenterialen Lymphknoten gefunden (Abb. 30 B). Insgesamt stellte sich der Unterschied zwischen den beiden eingesetzten Stämmen in der qualitativen Organbelastung im zweiten Koinfektionsversuch weniger deutlich dar als im ersten Versuch. Fasst man die Ergebnisse der beiden Versuche zusammen, zeigt sich allerdings noch immer eine deutliche Attenuierung der ΔinvA-Mutante YE21 gegenüber dem Wildtypstamm Y1 hinsichtlich der Besiedlung der verschiedenen intestinalen und extraintestinalen Organe. Im McNemar’s Test konnte ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit der Organbesiedlung zwischen der invA-Mutante und dem Wildtyp festgestellt werden. Signifikante Unterschiede fanden sich in der qualitativen Belastung des Jejunums (P< 0,01), des Ileums (P< 0,05), des Caecums (P< 0,05) und des Colons (P<0,05) (Abb. 30 C). 80 Ergebnisse A B 81 Ergebnisse C Abb. 30: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) am siebten Tag p.i.. Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden in einem ersten Koinfektionsversuch (A) Organproben von sieben und in einem zweiten Versuch (B) von neun Tieren ausgewertet. In Teil C wurden die Ergebnisse aus beiden Versuchen zusammengefasst. C.3.3.6 Bakterielle Ausscheidung Vom ersten bis zum siebten Tag p.i. wurden Rektaltupfer von insgesamt 16 Tieren untersucht, auch hier werden allerdings zunächst die Ergebnisse der beiden Koinfektionsversuche getrennt betrachtet. Die bakterielle Ausscheidung der beiden Bakterienstämme zeigte, wie auch bei der qualitativen Organbelastung, im ersten Infektionsversuch größere Unterschiede als im zweiten. In ersterem konnte der Wildtypstamm Y1 mittels Kälteanreicherung am ersten Tag p.i. aus drei, am dritten Tag p.i. aus vier und am siebten Tag p.i. aus fünf von sieben Rektaltupfern reisoliert werden, die ΔinvA-Mutante YE21 hingegen nur am ersten Tag aus zwei, am dritten Tag aus einem und am siebten Tag p.i. aus keinem der sieben Rektaltupfer ( Abb. 31 A). Im zweiten Koinfektionsversuch konnten von den neun am ersten Tag p.i. genommenen Rektaltupfern sowohl der Wildtypstamm Y1, als auch die ΔinvA-Mutante YE21 aus je sieben Proben reisoliert werden. Am dritten Tag p.i. fand sich der Wildtypstamm Y1 erneut in sieben von neun Tupferproben. Die ΔinvA-Mutante YE21 konnte nur in vier Proben nachgewiesen werden. Am siebten Tag p.i. konnte der Wildtypstamm Y1 aus allen, die ΔinvAMutante YE21 aus acht der neun Rektaltupfer reisoliert werden ( Abb. 31 B). Auch diese Ergebnisse wurden zusätzlich aus beiden Versuchen zusammengefasst ( 82 Ergebnisse Abb. 31 C). Ein Nachteil der ΔinvA-Mutante YE21 gegenüber dem Wildtypstamm Y1 zeigte sich hinsichtlich der bakteriellen Ausscheidung in unterschiedlich starker Ausprägung in beiden Versuchen. Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte ein signifikanter Unterschied bezüglich der Ausscheidung zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der ∆invA-Mutante YE21 am dritten und am siebten Tag p.i. nachgewiesen werden (P<0,05). A 83 Ergebnisse B C Abb. 31 1: Bakteriellle Aussche eidung mit d den Faeces s nach Koin nfektion miit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und de er ΔinvA-Mu utante YE21 1 (YeO:3 ΔinvA). Δ Rektaltupfer vom m ersten, drritten und siebten T Tag p.i. wurd den mittels Kälteanreiche K erung auf Y.. enterocolitic ca untersuchht, die Isolate e wurden biochem misch differen nziert. Es wurden in einem m ersten Koinfektionsverrsuch (A) Reektaltupfer vo on sieben und in e einem zweite en Versuch (B) ( von neun n Tieren aus sgewertet. Zusätzlich Z wuurden die Errgebnisse aus beid den Versuche en zusamme engefasst (C)). 84 Ergebnisse Fazit: Die Ergebnisse der Koinfektionsversuche mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 zeigen eine deutlich geringere Kolonisation der Organe durch die ΔinvA-Mutante YE21 im Vergleicht mit dem Wildtypstamm Y1 und geben dadurch einen Hinweis darauf, dass der Virulenzfaktor Invasin bei der Kolonisation und Infektion von Schweinen durch Yersinia enterocolitica eine wichtige Rolle spielt. C.4 Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse aus Infektionsversuchen im Maus- und Minipig-Modell Abschließend wurde die Kolonisation und Infektion mit Y. enterocolitica in den beiden Wirtsspezies Schwein und Maus vergleichend betrachtet. Hierzu wurden die zuvor aus dem Minipigmodell gewonnenen Ergebnisse mit Daten aus Infektionsversuchen im Mausmodell verglichen. Im Rahmen der Kooperation mit Prof. Dr. Petra Dersch aus der Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie am Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (HZI) wurden parallel zu den Infektionsversuchen im Minipigmodell am HZI in Braunschweig vergleichbare Versuche im Mausmodell durchgeführt. Diese fanden im Rahmen des PhD-Projekts von Julia Schaake, M.Sc. statt. Die folgende Betrachtung beschränkt sich auf die quantitative Organbelastung.Eine qualitative Untersuchung mittels Kälteanreicherung wurde im Mausmodell nicht durchgeführt. Auch klinische, pathologische und serologische sowie Untersuchungen der bakteriellen Ausscheidung fanden im Mausmodell nicht statt. Da Mäuse natürlicherweise keine Tonsillen haben, konnten diese im Mausmodell nicht untersucht werden. Ein weiterer anatomischer Unterschied besteht zwischen Mäusen und Schweinen in der Morphologie des lymphatischen Gewebes im Ileum. Während die Peyerschen Platten bei der Maus etwa stecknadelkopfgroß und leicht herauszupräparieren sind, erstreckt sich das lymphatische Gewebe beim Schwein über die gesamte Länge des Ileums. Die Peyerschen Platten wurden daher im Mausmodell isoliert untersucht und fielen im Minipigmodell mit in die Untersuchung der Ileumproben. Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Tiermodellen bestand hinsichtlich der Art der Applikation der Bakteriensuspension. Während den Minipigs das Inokulum mithilfe einer Spritze direkt in die Maulhöhle appliziert wurde, bekamen die Mäuse 85 Ergebnisse ihre Infektionsdosis über eine Knopfkanüle in den Magen eingegeben. Außerdem bestanden die Minipig-Tiergruppen aus kastrierten männlichen und weiblichen Tieren, die Mausgruppen hingegen nur aus weiblichen Tieren. Die Sektion der Schweine fand am siebten Tag p.i. statt. Die Mäuse mussten aus Tierschutzgründen schon am dritten Tag p.i. euthanasiert und seziert werden, da sie – im Gegensatz zu den Ferkeln - nach einer Infektion mit YeO:8 Stamm 8081v sehr ausgeprägte klinische Symptome zeigten. C.4.1 Vergleich der Infektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 und O:8 Stämmen Die experimentellen Infektionen wurden mit YeO:3 Stamm Y1 und YeO:8 Stamm 8081v durchgeführt. Im Minipigmodell wurden in jeder Gruppe zehn Mini-LeweFerkel mit 109 KBE/Tier infiziert und am siebten Tag p.i. seziert [vgl. C.2]. Im Mausmodell wurden pro Gruppe zehn weibliche BALB/c-Mäuse mit je 5x108 KBE infiziert und am dritten Tag p.i. seziert. In der quantitativen Organbelastung wiesen die Ergebnisse aus den beiden Modellen große Unterschiede auf. Während der YeO:8 Stamm 8081v im Minipigmodell ausschließlich in den Tonsillen nachgewiesen werden konnte und unfähig schien, den Darmtrakt der Ferkel zu kolonisieren, war die Belastung aller untersuchten Darmabschnitte und der Peyerschen Platten im Mausmodell durch beide Serotypen in etwa gleich hoch (Abb. 32). 86 Ergebnisse Abb. 32: Quantitative Organbelastung mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v nach oraler Infektion im Minipig- (A) und Mausmodell (B). Die Probenahme am fand am dritten (B, Maus) bzw. siebten (A, Schwein) Tag p.i. statt. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder Infektionsgruppe wurden zehn Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Infektionsdosis: 109 KBE/Tier (A, Schwein) bzw. 5x108 KBE/Tier (B, Maus)) C.4.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invA-assoziierten Gendefekten Auch die Koinfektionsstudien wurden sowohl im Minipig- als auch im Mausmodell durchgeführt. Hierbei sollten wirtsspezifische Unterschiede hinsichtlich der Auswirkungen der invA-Expression auf die Fähigkeit zur Kolonisation und Infektion durch Y. enterocolitica untersucht werden. Die Ergebnisse aus dem Minipigmodell stammen aus der vorliegenden Arbeit, die Resultate aus Studien im Mausmodell hingegen aus dem Ph.D.-Projekt von Julia Schaake, M.Sc.. Die eingesetzten Bakterienstämme wurden im Abschnitt C.3. beschrieben. In jeder Koinfektionsstudie wurden acht Minipigs [vgl. C.3] bzw. zehn BALB/c-Mäuse infiziert. Die Infektionsdosis betrug bei den Schweinen insgesamt 109 KBE/Tier (je 5x108 KBE YeO:3 Wildtyp + Mutante) und bei den Mäusen 5x108 KBE (je 2,5x108 KBE YeO:3 Wildtyp + Mutante). 87 Ergebnisse C.4.2.1 Vergleich der Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante In den Koinfektionsversuchen, in denen der YeO:3 Wildtypstamm Y1 mit der RovAStabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) verglichen wurde, konnte sowohl im Minipig- als auch im Mausmodell ein signifikanter Unterschied in der Organbelastung nur im Ileum beobachtet werden. Dieser war nicht in Bezug auf die KBE/g Organ feststellbar, hinsichtlich der RVR (relative virulence ratio) im Schwein ausgeprägter als in der Maus, und im CI (competitive index) war nur im Minipigmodell ein signifikanter Unterschied zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der RovAStabilitätsmutante YE14 feststellbar (Abb. 33). Der signifikante Unterschied zwischen der RovA-Stabilitätsmutante und dem Wildtypstamm in der RVR war zudem gegensätzlich in den beiden Tiermodellen. Während die RovA-Mutante im Schwein einen Nachteil in der Besiedlung des Ileums zeigte [vgl. C.3.1], konnte im Mausmodell ein Vorteil der Mutante festgestellt werden. 88 Ergebnisse Abbildu ung 33: Forts setzung und d Beschriftu ung auf der folgenden Seite 89 Ergebnisse Fortsetzung Abbildung 33: Abb. 33: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). Es wurden insgesamt acht (Schwein) bzw. zehn Tiere (Maus) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Darstellung der quantitativen Organbelastung mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) als log KBE/g (A, B), log relative virulence ratio (C, D) und competitive index (E, F)) C.4.2.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvAΔIS1667-Mutante In Koinfektionsstudien mit dem YeO:3 Wildtypstamm YE13 und der PinvAΔIS1667Mutante YE15 konnte, wie auch in den zuvor beschriebenen Versuchen mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 , in Bezug auf die KBE/g Organ im student’s t-Test kein signifikanter Unterschied zwischen dem Wildtypstamm YE13 und der PinvAΔIS1667-Mutante YE15 nachgewiesen werden. In der RVR konnte ein Nachteil der RovA-Stabilitätsmutante YE14 gegenüber dem Wildtystamm YE13 im Minipigmodell im Ileum (P<0.01) und im Caecum (P<0.001), im Mausmodell nur im Caecum (P<0.05) gezeigt werden. Mithilfe des CI wurde im one sample t-Test im Schwein ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Stämmen im Jejunum, Ileum, Colon (P<0.05) und Caecum (P<0,001) nachgewiesen [vgl. C.3.2], während ein solcher in der Maus nicht zu beobachten war (Abb. 34). 90 Ergebnisse Abbildu ung 34: Forts setzung und d Beschriftu ung auf der folgenden Seite 91 Ergebnisse Fortsetzzung Abbild dung 34: Abb. 34 4: Vergleich der Organb belastungen n im Minipig g- (A, C, E) und Mausm modell (B, D, D F). Es wurden insgesamt acht a (Schwein) bzw. zeh hn Tiere (Ma aus) untersucht. Die Erggebnisse wurden aus zwei un Mausmodell wurden nabhängigen n Experimen nten zusam mmengefasstt. Alle Vers suche im M durchgefführt von Jullia Schaake, M.Sc.. (Darsstellung der quantitativen n Organbelasstung mit de em YeO:3 Wildtypsstamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvvAΔIS1667-M Mutante YE15 5 (YeO:3 ΔIS S1667) als lo og KBE/g (A, B), lo og relative virrulence ratio o (C, D) und ccompetitive index i (E, F)) C.4.2.3 3 Vergleich der Koinfekttionsstudien mit einem Serotyp p O:3 Wildtyps stamm und d einer ΔiinvA-Muta ante Der Ein nsatz der kompletten n ΔinvA-M utante YE E21 in Koin nfektionsveersuchen mit m dem YeO:3 Wildtypsta amm Y1 ze eigte in be eiden Tierm modellen eine Attenu ierung derr ΔinvAMutantte YE21. Im m Mausmodell konn nte ein signifikanter Unterschieed in Hinsicht auf die KB BE/g Organ n, die RVR R und den n CI in allen Organ nen beobaachtet werd den. Im Minipig g wurde ein n Signifika anzniveau nur in Bez zug auf die e RVR undd den CI erreicht. e Zudem konnte in den Tons sillen der S Schweine kein k Nachte eil der Δin vA-Mutantte YE21 gegenü über dem Wildtypsta amm Y1 fe estgestellt werden, während w siich ein solcher in den Da armabschn nitten übera aus deutlicch zeigte (A Abb. 35) [v vgl. C.3.3]. 92 Ergebnisse Abbildu ung 35: Forts setzung und d Beschriftu ung auf der folgenden Seite 93 Ergebnisse Fortsetzung Abbildung 35: Abb. 35: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). Es wurden insgesamt acht (Schwein) bzw. zehn Tiere (Maus) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Darstellung der quantitativen Organbelastung mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE15 (YeO:3 ΔinvA) als log KBE/g (A, B), relative virulence ratio (C, D) und competitive index (E, F)) Fazit: Es waren deutliche Unterschiede zwischen Ergebnissen aus dem Minipig- und dem Mausmodell zu beobachten. Die Serotypen O:3 und O:8 verhalten sich gegensätzlich in den beiden Wirtsspezies. Während YeO:8 in der Maus hoch virulent ist, verursachen beide Serotypen im Schwein keine klinisch manifeste Erkrankung. Allerdings findet durch YeO:3 eine Infektion, durch YeO:8 nur eine Kolonisation der Minipigs statt. Im Mausmodell konnten im Gegensatz zum Schwein keine Unterschiede in der Organbelastung durch die beiden Serotypen beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Virulenzfaktor Invasin für die Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 sowohl in der Maus als auch im Schwein eine wichtige Rolle spielt. Allerdings ergaben die Koinfektionsversuche auch Hinweise darauf, dass das stabilere RovA und das Insertionselement IS1667 des Serotyps O:3 im Schwein von größerer Bedeutung sind als in der Maus. 94 Diskussion D Diskussion Yersinia (Y.) enterocolitica spielt als ein durch Nahrungsmittel übertragbarer Zoonoseerreger eine nicht zu unterschätzende Rolle im Verbraucherschutz und in der Lebensmittelhygiene sowohl in Deutschland als auch in Europa, den USA, Kanada und Japan (Tauxe et al., 1987; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001b; Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Bhaduri et al., 2005). Die größte Bedeutung als Krankheitserreger hat der Bioserotyp 4/O:3 (Rosner et al., 2010; Batzilla et al., 2011a). Dieser ist nicht nur in humanen Patienten, sondern auch in Schweinebeständen der am häufigsten vorkommende Serotyp (Fukushima et al., 1983; Bottone, 1999; von Altrock et al., 2006). Das Schwein gilt als Reservoirwirt und rohes Schweinefleisch als Hauptinfektionsquelle für den Menschen (FredrikssonAhomaa et al., 2006b). Während die Yersinien Schweine symptomlos kolonisieren, kommt es im Gegensatz dazu beim Menschen zu einer klinisch manifesten Infektion. Die molekularen Grundlagen für das unterschiedliche Verhalten von Y. enterocolitica im Schwein und im Menschen sind weitgehend unbekannt. Für wissenschaftliche Untersuchungen dieser Mechanismen sind weitergehende Studien im natürlichen Wirtsorganismus erforderlich. Etablierung des Infektionsmodells Obwohl Schweine anatomisch dem Menschen in vielerlei Hinsicht ähneln, bestehen im Gastrointestinaltrakt auch Unterschiede, wie z.B. in der Ausprägung der Peyerschen Platten, die beim Schwein über die gesamte Länge des Ileums verlaufen, bei Menschen hingegen als einzeln umschriebene Ansammlungen von Lymphfollikeln vorkommen. Allerdings besitzen Schweine, wie auch Menschen, Tonsillen, die in der Maus natürlicherweise fehlen (Meurens et al., 2012). Inwiefern diese anatomischen Unterschiede sich auf die Kolonisation und Infektion durch Y. enterocolitica auswirken, ist noch nicht erforscht. Bisher im Schwein durchgeführte experimentelle Infektionen (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Thibodeau et al., 2001; Nielsen et al., 1996; Platt-Samoraj et al., 2009a) variieren methodisch stark bezüglich des Alters und Immunstatus der Versuchstiere, der Infektionsdosen, der 95 Diskussion eingesetzten Bakterienstämme sowie der kulturellen und molekularbiologischen Nachweismethoden. Vor diesem Hintergrund sollte im ersten Teil der vorliegenden Dissertation ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica in Minipigs etabliert werden. In einem ersten Vorversuch mit Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 wurden verschiedene orale Infektionsdosen getestet, um eine optimale Infektionsdosis zu ermitteln. Das Ziel war es, eine symptomlose Kolonisation der Tonsillen und des Darmtrakts zu initiieren, ohne eine klinisch manifeste Erkrankung auszulösen, da dieses dem natürlichen Vorgang in Schweinemastbeständen entspricht. Die drei getesteten Dosen von 108, 109 und 1010 KBE pro Tier wurden in Anlehnung an bereits publizierte Infektionsdosen und mit dem Kot ausgeschiedene Bakterienmengen ausgewählt (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Thibodeau et al., 2001; Nielsen et al., 1996; Platt-Samoraj et al., 2009a). Da ein fäkal-oraler Übertragungsweg und eine Persistenz in den Tonsillen angenommen werden, wurde der orale Infektionsweg mittels Applikation in die Maulhöhle gewählt. Um den natürlichen Infektionsvorgang zu simulieren, wurde auf eine zusätzliche Gabe von Bicarbonat, die nach Fukushima et al. (1984) die Ausscheidungsmenge mit den Faeces erhöht, verzichtet. Sowohl nach einer Infektion mit 1010 als auch nach einer solchen mit 109 oder 108 KBE des Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) Stamms Y1 konnte eine Kolonisierung der Tonsillen und der verschiedenen Darmabschnitte am siebten Tag p.i. beobachtet werden. Auch eine Ausscheidung der Bakterien mit den Faeces fand vom ersten bis zum siebten Tag p.i. statt. In der höchsten Dosisgruppe (1010 KBE) konnten die Bakterien zusätzlich zu Tonsillen und Darmproben auch aus Lymphknoten, Leber und Milz reisoliert werden. Daher wurden alle weiteren experimentellen Infektionsstudien mit einer oralen Infektionsdosis von 109 KBE durchgeführt, um das Risiko einer klinisch manifesten Erkrankung möglichst gering zu halten. Obwohl die Tierzahlen des Vorversuchs mit jeweils drei Tieren pro Gruppe zu gering waren, um eine statistisch absicherbare Aussage treffen zu können, geben sie zumindest Anhaltspunkte dafür, dass die Ausprägung einer generalisierten Infektion mit Y. enterocolitica abhängig von der Höhe der Infektionsdosis zu sein scheint [vgl. C.1.1]. Die rein qualitativ ermittelte Ausscheidung mit den Faeces zeigte allerdings keine deutlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Dosisgruppen [vgl. C.1.1.4]. 96 Diskussion Diese Ergebnisse stimmen mit Beobachtungen aus früheren Infektionsversuchen überein. So konnte eine Kolonisation der Tonsillen und des Darms festgestellt werden, ohne dass die Tiere klinische Symptome zeigten. Diese Beobachtungen machten auch Schiemann (1988), Nielsen (1996) und Thibodeau et al. (1999 und 2001). Robins-Browne et al. (1985) fanden pathologisch-anatomische Veränderungen im Darmtrakt und konnten ernste klinische Symptome bis hin zu einem letalen Verlauf in Abhängigkeit von der Infektionsdosis in gnotobiotischen Ferkeln beobachten. Diese Ergebnisse sind allerdings nicht auf Ferkel mit normalem Immunstatus übertragbar. Auch der von Brügmann et al. (2001) berichtete Fall einer letalen Septikämie bei einem Minipig-Ferkel ist eher als Einzelfall einzustufen. In einem weiteren orientierenden Vorversuch wurde der Infektionsverlauf nach einer oralen Infektion mit 109 KBE des YeO:3 Stamms Y1 über einen Zeitraum von 21 Tagen untersucht. Auch wenn die Tierzahlen (n=3) pro Untersuchungszeitpunkt zu gering für eine statistische Auswertung waren, so konnte dennoch ein deutlicher Rückgang der Organbelastung der Schweine mit YeO:3 Stamm Y1 im Verlauf der Infektion zwischen dem siebten und dem 21. Tag p.i. beobachtet werden. Dieser Rückgang zeigte sich in den Proben der Darmabschnitte und auch in denen der extraintestinalen Organe, in denen am 14. und 21. Tag p.i. keine Yersinien nachgewiesen werden konnten, jedoch nicht in den Tonsillen. Diese Beobachtung bestätigt die Annahme einer Persistenz der Bakterien in den Tonsillen (Thibodeau et al., 1999; Gürtler et al., 2005). Zudem wurde der siebte Tag p.i. als ein günstiger Untersuchungszeitpunkt identifiziert, da im weiteren Verlauf der Infektion die Organbelastung durch Y. enterocolitica stark nachließ. Die Ausscheidung mit dem Kot zeigte einen zum letzten Untersuchungszeitpunkt intermittierenden Verlauf, war aber vom ersten Tag bis zu drei Wochen nach der oralen Infektion nachweisbar. Ähnliches berichteten auch Fukushima et al. (1984), Schiemann (1988) und Nielsen (1996). Eine weitere Arbeitsgruppe berichtete sogar von einer Ausscheidung der Yersinien mit den Faeces bis zum 56. Tag p.i. (Thibodeau et al., 2001). Serologische Untersuchungen mit einem auf rekombinanten Yops basierenden ELISA-Testsystem (PIGTYPE®YOPSCREEN) [vgl. B.2.7] zeigten eine deutliche Serokonversion der mit YeO:3 Stamm Y1 infizierten Tiere zwischen dem siebten und dem 14. Tag p.i.. In einer früheren Studie, in der ein auf den Oberflächenantigenen 97 Diskussion (LPS) der Yersinien (Serovare O:3, O:5,27 und O:9) basierender ELISA eingesetzt wurde, konnte eine Serokonversion der Schweine erst zwischen dem 21. und 56. Tag p.i. festgestellt werden (Thibodeau et al., 2001). Die eingesetzten Versuchstiere waren mit fünf Wochen nicht wesentlich jünger als die Minipigferkel in der vorliegenden Untersuchung, daher ist eine Erklärung dieses Unterschieds eher im Hinblick auf die verschiedenen ELISA-Testverfahren zurückzuführen. In experimentellen Infektionen mit Y. enterocolitica in trächtigen Sauen konnten mit dem PIGTYPE®YOPSCREEN-ELISA hohe Antikörpertiter bei den Sauen innerhalb von zwei Wochen nach der Infektion festgestellt werden, die über mehrere Monate anhielten. Bei neugeborenen Ferkeln konnten nur niedrige Titer gemessen werden, die ab der sechsten Lebenswoche unter 20 OD % abfielen (Platt-Samoraj et al., 2009b). Diese Beobachtungen entsprechen den in der vorliegenden Arbeit bei nicht infizierten Ferkeln der Kontrollgruppe gemachten [vgl. C.1.1.4]. In den durchgeführten Infektionsversuchen zeigte keines der Minipigs ernste klinische Symptome, wie Diarrhoe, Fieber oder Veränderungen bezüglich Haltung und Verhaltens. Das Auftreten von leicht breiigem Kot kam selten sowohl vor als auch nach der Infektion mit Y. enterocolitica und auch bei nicht infizierten Kontrolltieren vor und scheint in keinem Zusammenhang mit der Infektion zu stehen. Auffällige hämatologische Befunde im roten und weißen Blutbild konnten regelmäßig erhoben werden, allerdings traten auch diese schon vor der Belastung der Tiere mit Y. enterocolitica auf. Da es sich bei den eingesetzten Ferkeln nicht um SPF-Tiere handelte, kommen vielerlei Ursachen für diese Befunde infrage. Virale Infektionen können eine Leukozytopenie, eine Neutropenie oder Lymphozytose hervorrufen. Auch nichtinfektiöse Einflüsse, wie Eisenmangel, zu geringe Flüssigkeitsaufnahme, erhöhte Umgebungstemperatur und Stress, führen zu Auffälligkeiten im Blutbild. So vermag Stress beispielsweise eine Leukozytose, Neutrophilie oder Lymphozytopenie zu verursachen. Erschwerend für die Beurteilung hämatologischer Parameter ist zudem das Fehlen von aktuellen Referenzwerten für die Rasse Mini-Lewe. Ob die für Mast- und Zuchtschweine der gängigen Rassen (Deutsche Landrasse, Deutsches Edelschwein, Pietrain, Hampshire, Duroc) geltenden Referenzwerte übertragbar sind, ist bislang nicht näher untersucht worden. In den vorliegenden Studien beziehen sich beschriebene Abweichungen jedoch auf diese „Normalwerte“. Deutliche Hinweise auf eine akute entzündliche Infektion (Kernlinksverschiebung) fanden sich in der hämatologischen Untersuchung nicht. 98 Diskussion Auch die erhobenen pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunde waren überwiegend von milder Ausprägung und für die Infektion mit Y. enterocolitica unspezifisch, da sie auch in den Tieren der Kontrollgruppe auftraten. Eine nur milde Ausprägung histopathologischer Befunde berichteten auch Thibodeau et al. (1999) nach einer oralen Infektion von Hybridschweinen mit 108 KBE Y. enterocolitica Serotyp O:3. Obwohl zwischen Minipigs und den üblicherweise zur Mast genutzten Hybridschweinen anatomische und physiologische Unterschiede bestehen (Meurens et al., 2012), lassen die vorliegenden Parallelen zwischen den Ergebnissen aus Infektionsversuchen in Mastschweinen und Minipigs eine Übertragbarkeit des Minipigmodells auf kommerzielle Schweinebestände vermuten. Insgesamt ist es gelungen, ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Minipig zu etablieren, das dazu geeignet ist, die Kolonisation und Infektion dieses Erregers im Schwein als natürlichem Wirtsorganismus weitergehend zu untersuchen. Vergleichende Untersuchung der Serotypen O:3 und O:8 im Minipigmodell Im zweiten Teil der vorliegenden wissenschaftlichen Arbeit wurde das Minipigmodell eingesetzt, um den in humanen Patienten und in Schweinebeständen am häufigsten vorkommenden Bioserotyp 4/O:3 mit dem bisher molekularbiologisch am besten untersuchten und im Mausmodell hoch virulenten Bioserotyp 2B/O:8 zu vergleichen. Hierzu wurden jeweils insgesamt zehn Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) Stamm Y1 oder Serotyp O:8 (YeO:8) Stamm 8081v infiziert. Die Versuche wurden zeitlich versetzt einmal mit vier und einmal mit sechs Tieren durchgeführt, wobei die Ergebnisse beider Versuche reproduzierbar waren. YeO:3 Stamm Y1 konnte wesentlich häufiger und in größerer Anzahl aus den Organen der Ferkel reisoliert werden als YeO:8 Stamm 8081v. Eine quantitative Bestimmung des Keimgehalts war bei YeO:8 Stamm 8081v ausschließlich in den Tonsillen möglich [vgl. C.2.4]. In der qualitativen Untersuchung mittels Kälteanreicherung konnte der Serotyp O:8 ebenfalls nur in den Tonsillen und dem Ileum nachgewiesen werden, während Serotyp O:3 sowohl aus intestinalen als auch aus extraintestinalen Organen (Lymphknoten, Milz, Niere) reisoliert wurde [vgl. C.2.5]. Auch in Kotproben bzw. Rektaltupfern konnte YeO:3 ab dem dritten Tag p.i. deutlich häufiger nachgewiesen werden als YeO:8, was für eine wesentlich längere Ausscheidung mit den Faeces spricht [vgl. C.2.6]. Letztlich zeigte sich auch hinsichtlich der Immunantwort auf die 99 Diskussion beiden Serotypen eine sehr unterschiedliche Reaktion der infizierten Tiere. Während bei Ferkeln, die mit Serotyp O:3 Stamm Y1 infiziert worden waren, eine deutliche Serokonversion zu beobachten war, trat diese nach Infektion mit Serotyp O:8 Stamm 8081v nicht auf [vgl. C.2.7]. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich Serotyp O:3 im Schwein wesentlich invasiver verhält und im Gegensatz zu Serotyp O:8 eine Infektion verursacht. Serotyp O:8 hingegen scheint ausschließlich die Tonsillen und nur minimal den Darm der Tiere zu kolonisieren. Da die eingesetzten Stämme Y1 und 8081v beide das Virulenzplasmid (pYV) beinhalten, das bei allen Biotypen von Y. enterocolitica bis auf Biotyp 1A vorhanden ist (Batzilla et al., 2011b), ist es wahrscheinlich, dass beide die gleichen Yops exprimieren können. Möglich ist allerdings eine unterschiedliche Regulation der Expression dieser virulenzassoziierten Proteine. Das Fehlen Yop-spezifischer Antikörper nach erfolgter Infektion mit YeO.8 ist aber eher durch die geringe Invasivität des Bakteriums begründet. Zusammenfassend konnte im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 im Gegensatz zu Serotyp O:8 Stamm 8081v in der Lage ist, im Schwein eine generalisierte Infektion zu zeigen und eine Serokonversion zu induzieren. Da die Tiere dennoch keine Klinik zeigten, ist YeO:3 Stamm Y1 mit großer Wahrscheinlichkeit besser an das Schwein angepasst als YeO:8 Stamm 8081v. Dieser Umstand könnte auch die weite Verbreitung und Verdrängung anderer Serotypen durch YeO:3 als Erreger der humanen Yersiniose begründen. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere Stämme desselben Serotyps ist anzunehmen, da insbesondere für Serotyp O:3 eine große Homogenität beschrieben wurde (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a); sie bedarf aber weiterer Untersuchungen. Auch andere humanpathogene Serotypen, wie O:9 und O:5,27, konnten, wenn auch selten, aus Mastschweinen isoliert werden (Thibodeau et al., 1999; Gürtler et al., 2005). Wie sich diese Serotypen im Schwein verhalten, ist allerdings bislang nur wenig untersucht worden. Fukushima et al. (1984) beobachteten in experimentellen Infektionen im Schwein, dass Ferkel anfälliger für Serotyp O:5,27 waren als adulte Tiere. Bei Serotyp O:3 fanden sie keine altersabhängigen Unterschiede. Robins-Browne et al. (1985) infizierten gnotobiotische Ferkel mit den Bioserotypen 4/O:3 und 1/O:5. Sie konnten feststellen, dass der Bioserotyp 1/O:5 weniger virulent und nicht invasiv war. Auch Schiemann 100 Diskussion (1988) beobachtete eine geringe Virulenz der Serotypen O:8, O:13 und O:21 in Ferkeln. Diese Studien unterstützen die Hypothese, dass der Serotyp O:3 an das Schwein adaptiert ist. Allerdings besteht der Bedarf nach weiteren Untersuchungen der verschiedenen humanpathogenen Bioserotypen im Schwein. Bedeutung des Invasins Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Frage nach den molekularen Grundlagen für den unterschiedliche Phänotyp der beiden Serotypen behandelt. YeO:3 und YeO:8 unterscheiden sich unter anderem in der Expression des Virulenzfaktors Invasin. In YeO:3 bewirkt eine Punktmutation im rovA-Gen eine größere Stabilität und verbesserte DNA-Bindungskapazität des RovA-Proteins. Bei YeO:8 hingegen verändert sich die Faltung des RovAs bei Temperaturen um 37°C (im Wirtsorganismus) und es unterliegt vermehrt einer Spaltung durch ATP-abhängige Proteasen (Uliczka et al., 2011). Da RovA die invA-Expression aktiviert, kommt es dadurch zu einer verminderten Bildung von Invasin in Serotyp O:8-Stämmen. Ein weiterer bekannter Unterschied liegt im Vorhandensein eines Insertionselements (IS1667) im invA-Promotorbereich bei Serotyp O:3, das einen zusätzlichen Promotor beinhaltet und dadurch ebenfalls zu einer vermehrten invA-Expression in YeO:3 führt. Im YeO:8 fehlt dieses Insertionselement (Uliczka et al., 2011). Um herauszufinden, inwieweit die genannten Unterschiede zwischen den beiden Serotypen einen Einfluss auf die Kolonisation und Infektion des Schweins haben, wurden Koinfektionsversuche mit verschiedenen Mutanten im Minipigmodell durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Mutanten des Serotyp O:3 Stamms Y1 eingesetzt, die eine absteigende Invasinbildung aufwiesen. Die RovA- Stabilitätsmutante YE14 exprimiert das weniger stabile RovA des YeO:8, der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invA-Promotorbereich und der ΔinvA-Mutante YE21 fehlt das gesamte invA (Uliczka et al., 2011). In den Koinfektionsversuchen wurden die Schweine jeweils mit einer der Mutanten und dem YeO:3 Wildtypstamm gleichzeitig infiziert. Auf diese Art konnten die beiden eingesetzten Stämme innerhalb eines Tieres miteinander verglichen und der Einfluss individueller Unterschiede zwischen den einzelnen Schweinen auf die Ergebnisse umgangen werden (Monk et al., 2008) [vgl. C.3]. In Koinfektionsversuchen mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 und dem Wildtypstamm Y1 konnte im Hinblick auf die Organbelastung nur im Ileum ein 101 Diskussion signifikanter Unterschied zwischen der Mutante und dem Wildtyp nachgewiesen werden. Allerdings war im competitive index eine leichte Tendenz zu beobachten, nach der die Mutante auch in anderen Darmabschnitten einen geringen Nachteil gegenüber dem Wildtyp aufwies. Bezüglich der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces konnte keine verringerte Ausscheidung der RovA-Stabilitätsmutante festgestellt werden [vgl. C.3.1]. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression eines stabileren RovAs allein nicht zu der erfolgreicheren Infektion des Schweins durch YeO:3 gegenüber dem YeO:8 führt. Vielmehr scheint die invA-Expression auch von weiteren Faktoren abhängig zu sein. Zudem beeinflusst RovA als globaler Regulator nicht nur die Invasinexpression, sondern aktiviert bzw. hemmt die Transkription von über 60 verschiedenen Genen (Cathelyn et al., 2007). Dube et al. (2003) konnten zeigen, dass eine YeO:8 rovAMutante in der Maus attenuiert war. Die molekularen Mechanismen, die dieser Attenuierung zugrunde liegen, sind allerdings noch größtenteils unbekannt. In der Untersuchung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in Koinfektionsversuchen mit einem YeO:3 Wildtypstamm zeigte sich eine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 deutlich signifikant unter Berücksichtigung des Anteils dieser am Inokulum (relative virulence ratio, RVR) und im individuellen Vergleich mit dem Wildtypstamm YE13 innerhalb desselben Tieres (competitive index, CI) [vgl. C.3.2]. Hinsichtlich der qualitativen Organbelastung und der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces konnte jedoch keine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante beobachtet werden. Auch im direkten Vergleich der quantitativen Organbelastung aller Tiere konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Diese Resultate bekräftigen wiederum die Hypothese, dass Invasin zwar eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen spielt (Miller und Falkow, 1988), die invAExpression allerdings von weiteren Faktoren zusätzlich zu RovA reguliert wird. Andererseits ist bekannt, dass Invasin für die Infektion in Mäusen nicht essentiell ist (Pepe und Miller, 1993) und die Invasion der Yersinien in die Wirtszellen auch durch andere Virulenzfaktoren vermittelt wird (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a; Pepe et al., 1995). Außerdem unterstreichen die Ergebnisse die Bedeutung von Koinfektionsstudien und der Auswertung dieser mittels RVR und CI für die Erkennung geringer Variationen in der Regulation von Virulenzgenen. 102 Diskussion Um den Einfluss des Invasins auf die Fähigkeit von Y. enterocolitica das Schwein zu infizieren besser einschätzen zu können, wurden anschließend Koinfektionsversuche mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 durchgeführt. In diesen zeigte sich eine deutlich geringere Belastung der Organe durch die ΔinvAMutante YE21 im Vergleicht mit dem Wildtypstamm Y1. Dieser Unterschied war sowohl in der quantitativen als auch in der qualitativen Organbelastung ersichtlich. Allerdings zeigten sich signifikante Unterschiede wiederum nur in der RVR und dem CI. Auch hinsichtlich der Ausscheidung der beiden Stämme mit den Faeces konnte ein signifikanter Nachteil der ΔinvA-Mutante gegenüber dem Wildtypstamm nachgewiesen werden [vgl. C.3.3]. Die Ergebnisse dieses Koinfektionsversuchs untermauern die Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin. Allerdings scheint die Kolonisation der Tonsillen invasinunabhängig zu sein. Auch eine Kolonisation des Darms durch die ΔinvAMutante war im Schwein möglich, wenn auch in geringerer Ausprägung. Zusammenfassend ist festzustellen, dass keine der eingesetzten Mutanten sich im Schwein verhielt wie der Serotyp O:8 Stamm 8081v, der fast ausschließlich die Tonsillen kolonisierte und dessen Ausscheidung mit den Faeces nach dem ersten Tag p.i. stark abnahm und ab dem 10. Tag p.i. nicht mehr nachweisbar war. Daher ist davon auszugehen, dass sich die beiden Serotypen YeO:3 und YeO:8 auch in der Regulation weiterer Virulenzfaktoren unterscheiden. YadA und Ail sind weitere bekannte Virulenzfaktoren, die mit der Adhäsion an und der Aufnahme von Y. enterocolitica in die Wirtszellen in Verbindung gebracht werden (El Tahir und Skurnik, 2001; Heise und Dersch, 2006). Uliczka et al. (2011) zeigten, dass auch die Koexpression von YadA und eine verminderte Expression des Oberflächen-Antigens bei 37°C für eine Internalisierung der Yersinien in die Wirtszellen von Bedeutung sind. Welche Rolle YadA oder die Oberflächenantigene für die Infektionsmechanismen des YeO:3 im Schwein spielen, ist bisher noch nicht untersucht worden. Die Beweglichkeit der Yersinien durch Flagellen stellt einen weiteren wichtigen Faktor für den Kontakt der Yersinien mit Wirtszellen und somit auch für die Invasion dar (Young et al., 2000). In Hinsicht auf die Beweglichkeit und die Ausbildung von Flagellen wiesen Uliczka et al. (2011) ebenfalls Unterschiede zwischen den beiden Serotypen O:3 und O:8 auf. 103 Diskussion Vergleichende Betrachtung der Infektion im Maus- und Minipigmodell Im letzten Abschnitt dieser Dissertation wurden die Ergebnisse der im Minipigmodell durchgeführten Infektions- und Koinfektionsversuche mit den Ergebnissen aus Mausinfektionsversuchen verglichen, die unter vergleichbaren Bedingungen von Julia Schaake, M.Sc. am HZI in Braunschweig durchgeführt wurden. Der Vergleich zeigte große Kontraste zwischen den beiden Modellen auf. Insbesondere der im Schwein so deutliche Unterschied in der Organbelastung durch YeO:3 und YeO:8 war im Mausmodell nicht feststellbar. In Koinfektionsversuchen mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 zeigten sich im competitive index unterschiedliche Tendenzen zwischen Maus- und Minipigmodell. Während die RovA- Stabilitätsmutante im Schwein eher einen Nachteil gegenüber dem Wildtyp zeigte, schien sie in der Maus einen geringen Vorteil in der Organbesiedlung aufzuweisen. Die PinvA∆IS1667-Mutante YE15, die im Schwein einen z.T. deutlichen Nachteil in der Besiedlung der Darmabschnitte zeigte, wies in der Maus nur einen geringen Nachteil in der Belastung des Ileums auf. Koinfektionsversuche mit der ΔinvA-Mutante hingegen ergaben vergleichbare Ergebnisse in beiden Tiermodellen. Nur die invasinunabhängige Kolonisation der Tonsillen konnte im Mausmodell aufgrund des Fehlens dieser Organe in Mäusen nicht beobachtet werden. In den Peyerschen Platten der Maus, wie auch im Ileum des Schweins und allen weiteren untersuchten Darmabschnitten beider Tierarten zeigte sich die ΔinvA-Mutante gegenüber dem Wildtypstamm deutlich abgeschwächt. In allen Versuchen fiel die Organbelastung der Mäuse höher aus als die der Schweine [vgl. C.4]. Der Vergleich zwischen den Ergebnissen aus dem Maus- und dem Minipigmodell legt die Vermutung nahe, dass Y. enterocolitica Serotyp O:3 möglicherweise besser an das Schwein als Wirt adaptiert ist. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Mechanismen aufzuklären, die eine unterschiedliche Regulation von Virulenzfaktoren in verschiedenen Wirtsspezies ermöglichen. Da sich Mäuse und Schweine in ihrer Körpertemperatur nur wenig unterscheiden (Maus: 36-37°C, Minipig-Ferkel: 38-40°C), sind vermutlich andere Faktoren als die Umgebungstemperatur zu berücksichtigen. Einen von vielen Einflussfaktoren könnte das Immunsystem des Wirts darstellen, ebenso wie die anatomische Verteilung lymphatischen Gewebes, die Zusammensetzung Umgebungsfaktoren im Gastrointestinaltrakt. 104 der Nahrung und Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Minipig etabliert. Der Vergleich mit dem Mausmodell zeigt, dass zwischen verschiedenen Wirtsspezies große Unterschiede bestehen können. Nutztiermodelle sind daher von großer Bedeutung für die Erforschung von durch Lebensmittel übertragbaren Zoonosen. Die serotypspezifische Anpassung von Y. enterocolitica an das Schwein, die in dieser Arbeit beobachtet wurde, stellt einen wichtigen Faktor für die epidemiologische Beurteilung dieses Erregers dar. Aus diesem Grund sollte sich die zukünftige Erforschung von Zoonoseerregern nicht auf das Mausmodell beschränken, sondern auch Untersuchungen in der natürlichen Wirtsspezies mit einbeziehen. Die Untersuchungen zur Bedeutung des Invasins für die Kolonisation und Infektion des Schweins stellen zudem einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Pathomechanismen enteropathogener Yersinien dar. Bisher ungeklärt und somit potentieller Gegenstand zukünftiger Forschungsprojekte ist die Frage, durch welche molekularen Grundlagen die Anpassung von Y. enterocolitica Serotyp O:3 an das Schwein bedingt ist. Die in dieser Arbeit untersuchten Unterschiede zwischen YeO:3 und YeO:8 (Stabilität des RovAs und das IS1667 im invA-Promoterbereich) konnten den verschiedenen Phänotyp der beiden Serotypen nicht ausreichend erklären. Auch die Immunantwort des Schweins kann von der der Maus oder des Menschen abweichen und so zu einem verschiedenen Krankheitsbild führen. Die Immunerkennung der Serotypen O:3 und O:8 zeigte ebenfalls Unterschiede im Schwein, wie genau die Immunantwort im Reservoirwirt verläuft ist allerdings bislang unbekannt. Auch diese Frage bedarf noch weiterer Untersuchungen. 105 Zusammenfassung E Zusammenfassung Anna Charlotte Drees Charakterisierung der Yersinia enterocolitica-Infektion im Minipigmodell In Nordeuropa ist Yersinia (Y.) enterocolitica der dritthäufigste bakterielle Erreger von Gastroenteritiden beim Menschen. Die Yersiniose kommt dabei gehäuft bei Kleinkindern vor und kann ernste immunogene Spätfolgen, wie eine reaktive Arthritis oder das Erythema nodosum, hervorrufen. Im Jahr 2011 wurden in Deutschland 3.397 Erkrankungsfälle gemeldet. Y. enterocolitica ist ein in erster Linie durch Lebensmittel übertragener Zoonoseerreger. Das Schwein gilt dabei als Reservoirwirt und rohes Schweinefleisch als Hauptinfektionsquelle für den Menschen. Sowohl in humanen Patienten als auch in Mastschweinebeständen kommt der Bioserotyp 4/O:3 am häufigsten vor. Dennoch konzentrierten sich bisherige Studien auf den Bioserotypen 1B/O:8 und experimentelle Infektionen fanden in erster Linie im Mausmodell statt. Vor diesem Hintergrund wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Minipig etabliert, das Studien zur Kolonisation und Infektion von Y. enterocolitica im Schwein ermöglicht. Dieses Minipigmodell zeichnete sich durch sehr gut reproduzierbare Ergebnisse und die Vorteile der Minipigs in Bezug auf Unterbringung und Handhabung der Tiere aus. Das Versuchsdesign und Vergleiche mit früheren Studien in Hybridschweinen lassen eine Übertragbarkeit auf das Infektionsgeschehen in Mastschweinebeständen als sehr wahrscheinlich annehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die beiden Serotypen O:3 und O:8 in dem zuvor etablierten Minipigmodell vergleichend untersucht. Dabei konnten deutliche Unterschiede bezüglich der quantitativen und qualitativen Organbelastung, der Ausscheidung mit den Faeces und der Immunantwort festgestellt werden. Während der Serotyp O:8 (YeO:8) Stamm 8081v nur die Tonsillen und, in minimaler Ausprägung, den Darmtrakt der Schweine kolonisierte, konnte der Serotyp O:3 (YeO:3) Stamm Y1 aus allen intestinalen und extraintestinalen Organen reisoliert werden. Zudem wurde YeO:3 von den Tieren länger und häufiger mit dem Kot ausgeschieden und führte zu einer spezifischen Immunantwort, die in mit YeO:8 infizierten Ferkeln ausblieb. 106 Zusammenfassung Eine mögliche Erklärung für diesen stark unterschiedlichen Phänotyp im Schwein stellt die unterschiedliche Expression des Virulenzfaktors Invasin der beiden Serotypen dar. Die invA-Expression wird durch den Transkriptionsfaktor RovA aktiviert. Im Gegensatz zu YeO:8 exprimiert YeO:3 ein stabileres RovA und verfügt zudem über ein Insertionselement (IS1667) im invA-Promotorbereich. Diese beiden Unterschiede führen zu einer vermehrten Invasinbildung in Y. enterocolitica Serotyp O:3. In Koinfektionsversuchen mit verschiedenen YeO:3-Deletionsmutanten wurden daher im dritten Teil der Arbeit die Auswirkungen der Invasinexpression auf die Infektion des Schweins durch Y. enterocolitica untersucht. Während eine YeO:3 RovA-Stabilitätsmutante, die das weniger stabile RovA des YeO:8 exprimierte, im Vergleich mit dem Wildtypstamm nur eine verminderte Besiedlung des Ileums aufwies, konnte bei einer YeO:3 PinvaΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im invA-Promotorbereich fehlte, eine Attenuierung gegenüber dem Wildtyp in allen Darmabschnitten gezeigt werden. Der Einsatz einer invasinA-Knockout-Mutante (ΔinvA) im Minipigmodell wies schließlich eine deutliche Attenuierung der ΔinvAMutante auf. Diese Beobachtungen zeigen, dass Invasin eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen von Y. enterocolitica spielt. Allerdings erklären sie nur teilweise die Unterschiede zwischen YeO:3 und YeO:8, weshalb weitere Unterschiede in der Regulation von Virulenzfaktoren der beiden Serotypen angenommen werden können. Im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse aus Infektionsversuchen im Minipig mit aus dem Mausmodell stammenden verglichen. Hierbei konnten große Unterschiede zwischen den beiden Wirtsspezies festgestellt werden. Insbesondere YeO:8 zeigte eine sehr unterschiedlich ausgeprägte Virulenz. Auch das Vorhandensein eines stabileren RovAs und des Insertionselements IS1667 bei YeO:3 scheint in der Maus von geringerer Bedeutung zu sein als im Schwein. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studien darauf hin, dass der Serotyp O:3 vermutlich besser an das Schwein als Wirtsspezies angepasst ist als YeO:8. Die Unterschiede zum Mausmodell unterstreichen die experimenteller Infektionen im natürlichen Wirt für die Zoonoseforschung. 107 Bedeutung Summary F Summary Anna Charlotte Drees Characterization of Yersinia enterocolitica in a Minipig infection model Yersinia (Y.) enterocolitica is the third most prevalent bacterial cause of human gastroenteritis in Northern Europe. Yersiniosis mainly appears in infants. It may cause severe sequelae such as reactive arthritis or erythema nodosum. In 2011 in Germany 3,397 cases of Yersiniosis have been reported. Y. enterocolitica is an important food-borne zoonotic pathogen. Swine are considered as a reservoir and raw pork as the main source of infection in humans. Bioserotype 4/O:3 is the most prevalent bioserotype in human patients as well as in fattening pigs. However, most experimental infection studies used bioserotype 1B/O:8 and were carried out in the mouse model. Therefore, in the first part of the present study an experimental infection model for Y. enterocolitica has been established in Minipigs. The established model was suitable for comparison of colonization and infection of Y. enterocolitica in pigs. It was characterized by reproducible results and the advantages of minipigs in handling and housing. The experimental design and comparable studies in cross-breed pigs suggest that the minipig model reflects natural infections in piggeries. In the second part of the study serotype O:3 and O:8 strains were investigated comparatively in the previously established model, revealing substantial differences concerning the quantitative and qualitative organ burden, fecal shedding and seroconversion. While serotype O:8 (YeO:8) strain 8081v colonized only the tonsils and, to a low extent, the gut, serotype O:3 (YeO:3) strain Y1 was reisolated from intestinal and extraintestinal organs. YeO:3 was shed for a longer time period and, in contrast to YeO:8, induced an adaptive immune response in the infected piglets. A possible explanation for the very different phenotypes of both serotypes in the pig might be a diverse expression of the virulence gene invA. The transcription factor RovA activates invA expression. YeO:3 expresses a more stable RovA due to one single point mutation and possesses an insertion sequence element (IS1667) in the invA promoter region, whereas YeO:8 carries a less stable RovA and lacks the IS1667. These differences lead to increased amounts of invasin synthesized by Y. enterocolitica serotype O:3. During the third phase of the study, the impact of 108 Summary different invA expression on pig infections by Y. enterocolitica was studied by experimental coinfections using different YeO:3 deletion mutant strains. A RovA stability mutant, expressing less stable RovA of YeO:8, showed only minor disadvantages in colonization of the ileum compared to the wildtype strain. In contrast, YeO:3 PinvaΔIS1667 lacking the IS element showed a reduced colonization of all gut parts. The invA knockout mutant strain (ΔinvA) showed a significantly attenuated phenotype in the minipig model, indicating that invasin plays an important role in the infection process of Y. enterocolitica . However, this only partially explains the differences observed between YeO:3 and YeO:8 in minipig infection. Therefore, so far unknown differences in regulation of virulence factors are assumed to contribute to Y. enterocolitica infections of swine. Finally, experimental results from the minipig infections were compared with those from a mouse model, revealing substantial differences between the two host species. The low organ burden of YeO:8 detected in pigs could not be observed in mice and expression of a stable RovA and possession of the IS1667 in YeO:3 seems to be of less importance in mice than in pigs. In conclusion, the results obtained from this work suggest that serotype O:3 might be better adapted to pigs than YeO:8. The differences between minipig and mouse model emphasize the importance of experimental infection studies in the natural host for zoonoses reseach. 109 Literaturverzeichnis G Literaturverzeichnis 1. Andersen,J.K., and N.A.Saunders. 1990. Epidemiological typing of Yersinia enterocolitica by analysis of restriction fragment length polymorphisms with a cloned ribosomal RNA gene. J. Med. Microbiol. 32:179-187. 2. Aulisio,C.C., W.E.Hill, J.T.Stanfield, and R.L.Sellers, Jr. 1983. Evaluation of virulence factor testing and characteristics of pathogenicity in Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 40:330-335. 3. 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Am Tag der Einstallung und am darauffolgenden Tag wurden Blutproben von insgesamt zwölf Minipigs untersucht. Von diesen zeigten drei eine Leukopenie, acht eine Lymphopenie und alle zwölf eine Hämokonzentration. Zwei Tiere mussten direkt nach der Blutentnahme Schnappatmung mit je aufgrund 0,6 ml von akutem Dexamethason- Kreislaufversagen Injektionslösung (4 und mg Dexamethason/ml, Vétoquinol) behandelt werden. Eines der beiden Tiere blieb auch am Tag nach der Blutentnahme zyanotisch und verstarb am folgenden Tag. Eine diagnostische Sektion ergab eine Blasenruptur als wahrscheinliche Todesursache. Beide Tiere wurden von der Auswertung des Infektionsversuchs ausgeschlossen, ebenso ein drittes Tier, bei dem am Tag der Einstallung mittels Kälteanreicherung Y. enterocolitica aus einem Rektaltupfer isoliert wurde. Dieser Wildstamm ließ sich biochemisch von dem eingesetzten Infektionsstamm Y1 unterscheiden und wurde während des Versuchs nicht erneut aus Proben der Minipigs isoliert [vgl. B.1.5]. Somit verblieben neun Tiere, drei in jeder Dosisgruppe. Am Tag der Sektion (Tag 7 p.i.) wiesen sieben von neun Tieren eine hyperchrome Anämie auf. Eines zeigte eine ggr., eines eine deutliche Lymphopenie, alle neun Ferkel zeigten eine Hämokonzentration. In Gruppe A (Infektionsdosis: 108 KBE/ Tier) zeigte keines der drei Ferkel vor und nach der oralen Infektion klinische Symptome, wie Fieber oder Diarrhoe. Zwei Tiere fielen am Tag der Einstallung und am Tag darauf durch eine leichte Untertemperatur auf. Auch in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) zeigten zwei der drei Tiere eine ggr. erniedrigte Körpertemperatur am Tag nach der Einstallung und ein Ferkel eine um ca. 1,5°C erhöhte Körpertemperatur am Abend des Infektionstags. Auch in dieser Gruppe wurden weder vor noch nach der Infektion Anzeichen von Diarrhoe bei den Minipigs beobachtet. In Gruppe C (Infektionsdosis: 121 Anhang 1010 KBE/ Tier) zeigten ebenfalls zwei von drei Tieren eine leichte Untertemperatur am Tag nach der Einstallung. Außerdem wurde breiiger Kot am Tag nach der Infektion im Stall gefunden und ein Tier wies einen kotverschmierten After auf. In den folgenden Tagen zeigten aber auch diese Ferkel keine weiteren Anzeichen einer Diarrhoe. Zu C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Bei der Einstallung der zwölf Minipigs sieben Tage vor der oralen Infektion wurden alle Tiere hämatologisch untersucht, eine Probe war nicht auswertbar. Von den elf Ferkeln zeigten sieben eine z.T. deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten und eines eine minimale Lymphopenie. Die Blutwerte der vier Kontrolltiere zeigten bei einem Tier eine deutliche Leukozytose, bei zwei Tieren eine ebenfalls deutlich ausgeprägte Lymphopenie und bei drei Tieren eine ggr. bis deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten. Die drei am dritten Tag p.i. sezierten Minipigs wiesen in der hämatologischen Untersuchung keine Auffälligkeiten auf. Am siebten Tag p.i. konnte eine von drei Blutproben nicht untersucht werden, da sie geronnen war, die anderen beiden Proben waren wieder unauffällig. Auch am 14. Tag p.i. waren zwei von drei untersuchten Blutproben ohne besonderen Befund, ein Ferkel zeigte jedoch deutlich erhöhte segmentkernige Granulozyten. Drei Wochen nach der Infektion war von drei Minipigs eines hämatologisch völlig unauffällig, eines zeigte eine normo- oder hyperchrome Anämie mit verringertem Hämoglobingehalt, Hämatokrit und verringerter Erythrozytenzahl bei unverändertem MCHC und das dritte wies ausschließlich eine verringerte Erythrozytenzahl auf. Am 21. Tag p.i. waren alle vier untersuchten Ferkel der Kontrollgruppe unauffällig bis auf zwei Tiere mit minimal verringerten Erythrozyten und ein Ferkel mit einer minimalen Leukopenie. Klinisch waren alle Tiere vor und nach der Infektion unauffällig, zeigten kein Fieber oder Diarrhoe. Nur ein Tier wies am Morgen nach der Infektion eine im Vergleich zum Vortag um 0,5- 1,0°C erhöhte Körpertemperatur von 40,1°C auf. Die elf weiteren Ferkel lagen zwischen 38,5°C und 39,7°C und wichen damit nicht von ihren vorherigen Werten ab. Die Kontrolltiere zeigten am 18. Tag p.i. vorübergehend breiigen Kot, der in den folgenden Tagen nicht wieder auftrat. Fieber konnte bei keinem Kontrolltier festgestellt werden. 122 Anhang Zu C.2. Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 Hämatologische Untersuchungen während der ersten Infektionsstudie: In den Die hämatologische Untersuchung aller 20 Tiere am Tag der Einstallung ergab eine ggr. bis deutlich ausgeprägte Leukozytopenie (Leukopenie) bei 17 Tieren, eine deutliche Lymphozytopenie (Lymphopenie) bei 18 Tieren und eine normo- bis hyperchrome Anämie mit verringertem Hämoglobin und Hämatokrit bei unverändertem MCHC bei allen Ferkeln. In vier Blutproben fanden sich zudem Howell Jolly Körper, die auf eine verstärkte Blutneubildung hinweisen. Auf Nachfrage stellte sich heraus, dass im Zuchtbetrieb die sonst übliche zweite Eisendextraninjektion der Ferkel unterlassen worden sei. Einen Tag nach der oralen Infektion zeigte sich in keiner der sieben untersuchten Blutproben aus Gruppe A (Infektion mit YeO:3 Stamm Y1) mehr eine Leukopenie. Vier Tiere wiesen allerdings noch eine Lymphopenie und alle sieben eine normo- oder hyperchrome Anämie auf, in zwei Proben wurden Howell Jolly Körper nachgewiesen. In Gruppe B (Infektion mit YeO:8 Stamm 8081v) zeigte einen Tag p.i. ebenfalls keines der Tiere mehr eine Leukopenie. Zwei von acht Tieren wiesen eine Lymphopenie und alle acht eine minimale bis ggr. normo- oder hyperchrome Anämie auf. Von den vier Minipigs der Kontrollgruppe zeigten zu diesem Zeitpunkt drei Tiere eine Leukopenie, drei eine normo- oder hyperchrome Anämie und zwei eine Lymphopenie. Am achten Tag p.i. wurden in den beiden Infektionsgruppen nur noch jeweils vier Tiere hämatologisch untersucht, da in jeder Gruppe vier Tiere am siebten Tag p.i. seziert wurden. In der Kontrollgruppe verendete eines der vier Ferkel am siebten Tag p.i. perakut. In der erfolgten diagnostischen Sektion wurden Anzeichen einer Blasenruptur gefunden (hgr. Uroperitoneum; hgr. vergrößerte Nieren; Blasenwand sulzig-verdickt, hgr. blutig infiltriert und mit einer dorsalen Zusammenhangstrennung). Kulturell wurde in der Blasenwand ein ggr. Keimgehalt an alpha-hämolysierenden Streptokokken, Pantoea agglomerans und Bacillus spp. nachgewiesen. Drei der vier Ferkel aus Gruppe A zeigten auch am achten Tag p.i. noch eine ggr. normo-/ hyperchrome Anämie, je ein Tier eine Leuko- und Lymphopenie und ein Tier wies ggr. erhöhte segmentkernige Granulozyten auf. In Gruppe B zeigten drei der vier Tiere ggr. verringerte Erythrozytenzahlen, eines eine ggr. Leukopenie und zwei eine Lymphopenie. Von den drei Kontrolltieren fielen zwei im Blutbild durch eine Leukopenie und alle drei durch eine Lymphopenie auf. Alle Kontrolltiere zeigten auch Anzeichen einer Anämie. 123 Anhang Am 14. Tag p.i. waren aus Gruppe A nur drei Blutproben auswertbar. Von diesen zeigten zwei eine ggr. Leukopenie, eine eine verringerte Erythrozytenzahl und eine eine Lymphopenie. In einer Probe fanden sich außerdem ggr. verringerte segmentkernige Granulozyten. In Gruppe B wies nur eines der vier Ferkel am 14. Tag p.i. eine minimale Leukopenie auf. Alle zeigten einen ggr. erhöhten MCHC bei verringerter Erythrozytenzahl und eines eine Lymphopenie. Die drei Kontrolltiere zeigten in zwei Blutproben eine Leukopenie, die bei einem Tier deutlich ausgeprägt war, und eine Lymphopenie. Auch in dieser Gruppe zeigten alle Tiere einen ggr. erhöhten MCHC bei verringerter Erythrozytenzahl. Am 21. Tag p.i. zeigten in Gruppe A von vier Tieren eines eine Leukopenie, drei Tiere eine Lymphopenie und zwei Ferkel Anzeichen einer Anämie. In Gruppe B zeigten drei von vier Ferkeln eine Leukopenie, Lymphopenie und verringerte Erythrozytenzahlen. Zwei der drei Minipigs der Kontrollgruppe zeigten am 21. Tag p.i. ebenfalls eine Leukopenie, alle drei wiesen verringerte Erythrozytenzahlen und eine Lymphopenie auf. Hämatologische Untersuchungen während der zweiten Infektionsstudie: Elf Tage vor der geplanten Einstallung wurden zehn Ferkel im Zuchtbetrieb hämatologisch untersucht. Je drei Tiere wiesen eine ggr. Leukopenie und minimal verringerte Erythrozytenzahlen auf, eines ggr. verringertes Hämoglobin und drei einen erhöhten MCV und MCH. Zwei Ferkel zeigten eine ggr. Lymphopenie. Am Tag der Einstallung zeigte von den 16 Minipigferkeln (je sechs Tiere in den beiden Infektionsgruppen und vier in der Kontrollgruppe) eines aus Gruppe A eine ggr. Leukozytose und alle wiesen eine deutliche Lymphopenie auf. Dabei zeigten allerdings in Gruppe A und B jeweils fünf Tiere eine z.T. deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten, in der Kontrollgruppe waren diese nur bei einem Tier minimal erhöht. Die stabkernigen Granulozyten waren in Gruppe A bei fünf und in Gruppe B bei vier Tieren erhöht, in der Kontrollgruppe blieb dieser Wert unauffällig. Klinisch fiel in Gruppe A (YeO:3) ein Ferkel ab dem achten Tag p.i. bis zum Versuchsende mehrfach durch schleimig-blutige, z.T. auch fibrinöse Beimengungen des Kots auf. In der pathologisch-anatomischen Untersuchung während der Sektion war dieses Tier (Nr. 16) allerdings nicht speziell auffällig. Ein weiteres Ferkel, das schon bei der Einstallung einen „Kümmerer“-Habitus aufwies, zeigte nach der Infektion keine klinischen Symptome. Fieber hatte nach der Infektion keines der Ferkel. Durchfall zeigten die Tiere nur für wenige Tage vor der oralen Infektion. 124 Anhang In Gruppe B (YeO:8) schieden mehrere Tiere sowohl vor als auch nach der Infektion breiigen Kot aus. An einigen Tagen nach der Infektion (Tag 4, 5 u. 10 p.i.) zeigten wenige Tiere vorübergehend Diarrhoe. Die Tiere der Kontrollgruppe zeigten im Verlauf des ersten Versuchs bis auf ein Ferkel, das perakut an einer Blasenruptur verendete, keine klinischen Symptome. Auch im zweiten Infektionsversuch waren die vier Kontrolltiere während der Studie klinisch unauffällig. Zu C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovAStabilitätsmutante Hämatologische Untersuchungen während der ersten Infektionsstudie: Bei der Einstallung sieben Tage vor der Infektion fiel von den insgesamt acht Minipigferkeln der Koinfektionsgruppe ein Tier durch einen minimal verringerten Hämatokrit auf. Zwei Ferkel zeigten eine ggr. Leukozytose, zwei weitere eine minimale bis ggr. Lymphopenie und fünf Tiere eine deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten. Die Blutwerte der vier Kontrolltiere zeigten bei einem Tier eine deutliche Leukozytose, bei zwei Tieren eine ebenfalls deutlich ausgeprägte Lymphopenie und bei drei Tieren eine ggr. bis deutliche Erhöhung der segmentkernigen Granulozyten. Am siebten und 21. Tag p.i. wiesen die je vier, am Sektionstag hämatologisch untersuchten, Ferkel der Koinfektionsgruppe keine Auffälligkeiten im Blutbild auf. Alle vier untersuchten Ferkel der Kontrollgruppe waren am 21. Tag p.i. unauffällig. Lediglich zwei Tiere zeigten minimal verringerte Erythrozyten und eines eine minimale Leukopenie. Hämatologische Untersuchungen während der zweiten Infektionsstudie: Elf Tage vor Einstallung wurden im Zuchtbetrieb zehn Ferkel stichprobenartig hämatologisch untersucht. Von diesen zeigten fünf Tiere Anzeichen einer ggr. Anämie, drei eine ggr. Leukopenie und zwei eine ggr. Lymphopenie. Am Tag der Einstallung, sieben Tage vor der Belastung, zeigten zwei der vier Ferkel der Infektionsgruppe eine ggr. hyperchrome Anämie, eines eine ggr. Thrombozytopenie, alle vier Ferkel eine deutliche Lymphopenie und eines erhöhte segmentkernige und stabkernige neutrophile Granulozyten. Von den vier Kontrolltieren zeigten bei der Einstallung ebenfalls alle Ferkel eine deutliche Lymphopenie, eines von ihnen wies auch ggr. vermehrt segmentkernige neutrophile Granulozyten auf. Am siebten Tag p.i. zeigten alle vier Ferkel der Infektionsgruppe eine normo- bis hyperchrome 125 Anhang Anämie, zwei Tiere eine ggr. Lymphopenie und eines minimal erhöhte segmentkernige neutrophile Granulozyten. Die vier Kontrolltiere zeigten am siebten Tag p.i. ebenfalls alle eine ggr. normo- bis hyperchrome Anämie. Drei von ihnen wiesen auch eine ggr. Leukopenie und eines eine ggr. Lymphopenie auf. Während beider Infektionsversuche zeigten die Minipigs kaum klinische Symptome. In dem ersten Koinfektionsversuch zeigte ein Ferkel ab dem 13. Tag p.i. mehrfach breiigen Kot bis milde Diarrhoe, ab dem 18. Tag p.i. konnte jedoch kein Durchfall mehr festgestellt werden. Keines der Ferkel zeigte Fieber oder eine um mehr als 0,5°C erhöhte Körpertemperatur nach der Infektion. Auch die Kontrolltiere zeigten am 18. Tag p.i. vorübergehend breiigen Kot, der in den folgenden Tagen nicht wieder auftrat. Während des zweiten Koinfektionsversuchs zeigten die Ferkel der Infektionsgruppe überhaupt keine Anzeichen von Diarrhoe oder Fieber. In der Kontrollgruppe konnte bei einem Tier sowohl vor als auch nach der „Pseudoinfektion“ breiiger Kot beobachtet werden. Dieses Tier wies auch eine, über die ganze Versuchsdauer wiederholt auftretende, leicht erhöhte Körpertemperatur von 40,0 bis 40,7°C auf, war aber in Bezug auf Futteraufnahme, Verhalten und Körpergewichtszunahme unauffällig. Zu C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante Hämatologische Untersuchungen während der ersten Infektionsstudie: Am Tag der Einstallung zeigten von den insgesamt acht Minipig-Ferkeln der Koinfektionsgruppe zwei Tiere eine deutliche Lymphopenie, fünf Tiere wiesen z.T. ebenfalls deutlich erhöhte segmentkernige Granulozyten auf und bei zwei Ferkeln konnten auch erhöhte Werte für stabkernige Granulozyten festgestellt werden. Am siebten Tag p.i. zeigte von vier infizierten Ferkeln eines einen minimal verringerten Hämoglobingehalt, eines eine ggr. Lymphopenie und zugleich erhöhte segmentkernige Granulozyten und ein weiteres Ferkel minimal erhöhte stabkernige Granulozyten und Monozyten. Am 21. Tag p.i. wies von drei untersuchten Minipigs nur eines Auffälligkeiten im Rahmen einer minimalen Anämie auf. Das Blutbild zeigte einen minimal verringerten Hämoglobingehalt und Hämatokrit sowie ggr. verringerte Erythrozyten. 126 Anhang Hämatologische Untersuchungen während der zweiten Infektionsstudie: Von den elf Tage vor Einstallung im Zuchtbetrieb stichprobenartig hämatologisch untersuchten zehn Ferkeln zeigten fünf Tiere Anzeichen einer ggr. Anämie, drei eine ggr. Leukopenie und zwei eine ggr. Lymphopenie. Am Tag der Einstallung wiesen drei der vier Tiere der Koinfektionsgruppe ggr. verringerte Erythrozyten bei leicht erhöhtem MCV auf. Ein Ferkel zeigte eine minimale Leukopenie, drei eine deutliche Lymphopenie und zwei von diesen wiesen auch stark erhöhte segmentkernige Granulozyten auf. Am siebten Tag p.i. fielen alle vier Minipigs durch eine Anämie (verringerte Erythrozyten, erniedrigter Hämoglobingehalt und Hämatokrit) auf. In der Koinfektionsgruppe des ersten Infektionsversuchs fiel bei der Einstallung ein Ferkel durch eine derbe Umfangsvermehrung im Nabelbereich auf. Im Verlauf des Versuchs zeigte sich der Nabel gerötet und blutig-krustig verändert. Am siebten Tag p.i. war er allerdings unauffällig. Vor und nach der oralen Infektion zeigten die acht Tiere keine klinischen Symptome wie Fieber oder Diarrhoe. Ein Ferkel verstarb perakut nach der Blutentnahme am ersten Tag p.i.. Auch während des zweiten Koinfektionsversuchs zeigten die vier infizierten Minipig-Ferkel keine klinischen Symptome. Zu C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invAMutante Auch in diesen Koinfektionsversuchen mit dem Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 zeigten die infizierten Minipig-Ferkel sowohl vor als auch nach der oralen Infektion wenig klinische Symptome. Während des ersten Koinfektionsversuchs wiesen drei der acht Ferkel am ersten Tag p.i. breiigen Kot auf, blieben aber an den folgenden Tagen klinisch unauffällig. Keines der Tiere zeigte eine erhöhte Körpertemperatur nach der Infektion. Während des zweiten Koinfektionsversuchs verstarb ein Ferkel am ersten Tag nach der Einstallung perakut nach erfolgter Blutentnahme. Von den verbliebenen neun Tieren wies eines noch vor der Infektion einmalig hellen, dünnbreiigen Kot auf. Bei einem weiteren Ferkel konnte an zwei aufeinanderfolgenden Tagen (dritter und vierter Tag p.i.) Husten beobachtet werden. Bis auf diese Ausnahmen waren alle Minipigs während des Versuchs klinisch unauffällig und zeigten keine erhöhte Körpertemperatur nach der Infektion. 127 Anhang H.2 Detaillierte pathologisch-anatomische Beurteilung Zu C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3 In der Sektion konnten bei einem Ferkel aus Gruppe B minimal vergrößerte Mandibularlymphknoten festgestellt werden. Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in Tabelle 3 dargestellt. Tab. 3: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten am siebten Tag p.i.. (Infektionsdosen: Gruppe A: 108 KBE/Tier; Gruppe B: 109 KBE/Tier; Gruppe C: 1010 KBE/Tier, Abkürzungen: derb=derbe Konsistenz, verh.=verhärtet, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich) Weitere Auffälligkeiten in der Sektion bei der Untersuchung der Nieren ließen den Verdacht auf geringgradige, multifokale Nekrosen der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt) bei fünf Tieren zu. Zu C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 In den Sektionen zeigte am dritten Tag p.i. ein Tier leicht vergrößerte Mandibularlymphknoten und ein weiteres Anzeichen einer ggr., multifokalen, subakuten Nekrose der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt). Am siebten Tag p.i. zeigten alle drei Tiere auffällige mesenteriale Lymphknoten, die bei einem Tier zystische Hohlräume aufwiesen. Alle drei Tiere wiesen Anzeichen eines älteren Niereninfarkts (s. oben) auf. In der Sektion am 14. Tag p.i. zeigten erneut alle drei Tiere leicht vergrößerte mesenteriale Lymphknoten, die bei einem Ferkel kleine zystenartige Hohlräume aufwiesen und bei einem weiteren insgesamt blasig-zystisch verändert waren. Von den drei Ferkeln, die am 21. Tag p.i. seziert wurden, zeigte 128 Anhang eines eine ausgeprägte fibroblastische Peri- und Epikarditis, die beiden anderen fielen durch Zysten auf den Ovarien auf. Hinweise auf einen älteren Niereninfarkt (s. oben) konnten bei einem der Ferkel beobachtet werden. Am 21. Tag p.i. fanden sich auch bei drei Kontrolltieren Anzeichen älterer Infarkte der Nierenrinde und bei einem ein Abszess im Bereich des rechten Unterkiefers. Aus dem Abszessinhalt konnten keine Yersinien isoliert werden. Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in Tabelle 4 dargestellt. Tab. 4: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten während der Sektionen zu vier verschiedenen Zeitpunkten p.i.. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich) Zu C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 Sowohl in Gruppe A (YeO:3) als auch in Gruppe B (YeO:8) und der Kontrollgruppe zeigten mehrere Tiere veränderte Darmlymphknoten und eine GALT-Hyperplasie. Eines der Ferkel aus Gruppe A fiel zudem durch leicht vergrößerte Lnn. hepatici und eines durch eine milde fibroblastische Peri-und Epikarditis auf. Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in Tabelle 5 dargestellt. 129 Anhang Tab. 5: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am 7. (A) und 21. (B) Tag p.i.. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert) A B Zu C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovAStabilitätsmutante Von den insgesamt acht am siebten Tag p.i. sezierten Ferkeln der Koinfektionsgruppen (oral infiziert mit je 5x108 KBE des Wildtypstamms Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) pro Tier) wiesen in der Sektion sieben Tiere veränderte mesenteriale Lymphknoten auf. Zwei Tiere zeigten zudem 130 Anhang Anzeichen einer ggr., multifokalen, subakuten Nekrose der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt) und eines wies deutlich vergrößerte Mandibularlymphknoten auf. Auch in der Kontrollgruppe konnten veränderte Darmlymphknoten und GALT-Hyperplasie beobachtet werden. Am 21. Tag p.i. konnte außerdem bei einem Ferkel eine deutlich vergrößerte Milz und bei zwei Tieren Ovarialzysten festgestellt werden. In der Kontrollgruppe fanden sich zudem bei drei Ferkeln Anzeichen älterer Infarkte der Nierenrinde und bei einem ein Abszess im Bereich des rechten Unterkiefers. Aus dem Abszessinhalt konnten keine Yersinien isoliert werden. Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in Tabelle 6 dargestellt. Tab. 6: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am siebten bzw. 21. Tag p.i.. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert) 131 Anhang Zu C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante Von den insgesamt acht Minipigs, die am siebten Tag nach erfolgter oraler Infektion mit YeO:3 Wildtypstamm YE13 und der PinvA∆IS1667- Mutante YE15 seziert wurden, wiesen sechs Tiere veränderte Darmlymphknoten und z.T. eine GALT-Hyperplasie auf. Zudem zeigte eines der Minipigs Zysten auf den Ovarien und ein weiteres einen etwa walnussgroßen Abszess im Unterkieferbereich. Aus dem Abszessinhalt konnten keine Yersinien isoliert werden. Auch am 21. Tag p.i. konnten Veränderungen der Lnn. jejunales und GALT-Hyperplasien in Tieren der Koinfektions- und der Kontrollgruppe beobachtet werden. Die Untersuchung der Nieren ließ bei einem Ferkel der Koinfektionsgruppe den Verdacht auf geringgradige, multifokale Nekrosen der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose (Verdacht auf älteren Infarkt) zu. Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in Tabelle 7 dargestellt. Tab. 7: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am siebten bzw. 21. Tag p.i.. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert) 132 Anhang Zu C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invAMutante Insgesamt zeigten sich die mit dem Wildtypstamm Y1 und der ΔinvA-Mutante YE21 koinfizierten Minipigs in der Sektion hinsichtlich der pathologisch-anatomischen Begutachtung sehr unauffällig. Bei der Untersuchung der Nieren fielen bei einem Ferkel geringgradige, multifokale Nekrosen der Nierenrinde mit perifokaler Fibrose auf. Dies ließ den Verdacht auf einen älteren Infarkt zu. Zwei Ferkel zeigten leicht vergrößerte und verhärtete Mandibularlymphknoten. Bei einem Tier waren sie nur minimal verhärtet und bei einem weiteren zystisch-blasig verändert. Yersinien konnten jedoch nicht aus diesen Lymphknoten isoliert werden. Die Veränderungen der Darmlymphknoten und des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) sind in Tabelle 8 dargestellt. 133 Anhang Tab. 8: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten (Lnn.) am siebten Tag p.i.. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: vergr.=vergrößert, derb=derbe Konsistenz, 0=unauffällig, 1=minimal, 2=mild/leicht, 3=ausgeprägt/deutlich, (Z)=zystisch verändert) H.3 Detaillierte histopathologische Beurteilung Zu C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Der Nachweis von Bakterienkolonien oder Granulationsgewebe im Ileum blieb bei allen Ferkeln aus, ebenso konnte keine Hyperplasie oder Depletion des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) beobachtet werden (Tab. 9A). In den mesenterialen Lymphknoten waren Bakterienkolonien und Entzündungszellinfiltrationen in keiner der Proben zu finden (Tab. 9B). 134 Anhang Tab. 9: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileum (A) und mesenterialen Lymphknoten (B) der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: (A) Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.= Zottenverkürzung; Z.fusion= Zottenfusion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; (B) Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.= lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; (A und B) NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.= Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) A B Zu C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 Eine histologische Untersuchung der Leber und Milz fand bei je vier Tieren pro Infektionsgruppe (YeO:3 bzw. YeO:8) am siebten und am 21. Tag p.i. statt. Die Leber- und Milzproben der drei Kontrolltiere wurden am 21. Tag p.i. gewonnen und ebenfalls histologisch untersucht. Ileum und mesenteriale Lymphknoten (Lnn. jejunales) wurden am siebten Tag nach der Infektion von insgesamt zehn Tieren pro Infektionsgruppe und vier Kontrolltieren untersucht. Am 21. Tag p.i. wurden 135 Anhang Ileumproben und mesenteriale Lymphknoten von je vier Ferkeln der beiden Infektionsgruppen und drei Kontrolltieren histologisch untersucht. Die Befunde der Leberproben sind in Tabelle 10 dargestellt. Die drei an Tag 21. p.i. sezierten Kontrolltiere wiesen keine Auffälligkeiten des Lebergewebes auf. Tab. 10: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Leberproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; Lymph=Lymphozyten; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) 136 Anhang In den Milzproben fand sich in der histologischen Untersuchung bei den infizierten und den Kontrolltieren eine ggr. bis mgr. lymphatische Hyperplasie. Von dieser abgesehen konnten in den Milzproben keine weiteren Veränderungen gefunden werden (Tab. 11). Tab. 11: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Milzproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) 137 Anhang Die histopathologischen zusammengefasst. In Befunde der der Ileumwand Ileumproben eines sind koinfizierten in Tabelle Tieres 12 konnten Bakterienkolonien nachgewiesen werden. Tab. 12: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; GALT-Hyperpl.=GALT-Hyperplasie; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) A B 138 Anhang Die Ergebnisse der histologischen Untersuchung der mesenterialen Lymphknoten sind in Tabelle 13 dargestellt. Am 21. Tag p.i. zeigte ein Tier der Gruppe B (YeO:8) einen kleinen, fibringefüllten Hohlraum im Lymphknoten. Tab. 13: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) A B 139 Anhang Zu C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovAStabilitätsmutante Ileum und mesenteriale Lymphknoten wurden am siebten Tag nach der Infektion von insgesamt acht infizierten Ferkeln und vier Kontrolltieren und am 21. Tag p.i. von je vier Tieren aus der Koinfektions- und Kontrollgruppe histologisch untersucht. Die histopathologischen Befunde der Ileumproben sind in Tabelle 14 zusammengefasst. Plasmazellen und Granulationsgewebe sowie eine GALTHyperplasie oder –Depletion konnten nicht nachgewiesen werden. Tab. 14: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) A B 140 Anhang Die histologische Untersuchung der mesenterialen Lymphknoten ergab sowohl am siebten als auch am 21. Tag p.i. so gut wie keine Auffälligkeiten. Bakterienkolonien, eine lymphatische Depletion oder Plasmazellen waren in keiner der Proben mesenterialer Lymphknoten vermehrt nachweisbar (Tab. 15). Tab. 15: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) Zu C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante Ileumproben und mesenteriale Lymphknoten wurden vom siebten und 21. Tag nach der Infektion untersucht. Am siebten Tag p.i. liegen Daten von sieben Ileumproben vor. Am 21. Tag p.i. fehlte in der Sektion ein Ferkel, das einen Tag p.i. nach der Blutentnahme verstorben war, somit wurden drei Ileumproben untersucht. Die mesenterialen Lymphknoten wurden am siebten Tag p.i. von acht und am 21. Tag p.i. von drei Tieren untersucht. Nachfolgend werden nur die Befunde der infizierten Ferkel erwähnt, die Kontrolltiere sind identisch mit den im Anhang zu C.3.1 beschriebenen. 141 Anhang Eine GALT-Hyperplasie oder –Depletion wurde ebenso wie Granulationsgewebe in keiner der Proben beobachtet. Die Befunde sind in Tabelle 16 aufgeführt. Tab. 16: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) A B Das histologische Bild der mesenterialen Lymphknoten zeigte sich wie auch in den anderen Versuchen als eher unauffällig. Die Befunde sind in Tabelle 17 zusammengefasst. 142 Anhang Tab. 17: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten (A) bzw. am 21. Tag p.i. (B); Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) A B 143 Anhang Zu C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invAMutante Ileumproben und mesenteriale Lymphknoten wurden von insgesamt sieben Tieren ausschließlich vom siebten Tag nach der Infektion untersucht. Eine GALT-Hyperplasie konnte nicht beobachtet werden, alle weiteren Befunde sind in Tabelle 18 dargestellt. Tab. 18: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten Tag p.i.; Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Nekr.=Nekrosen; Z.verkürzg.=Zottenverkürzung; Z.fusion=Zottenfusion; GALT-Depl=GALT-Depletion; Entzdg.allg.=Entzündung allgemeiner Score; Entzdg.LP=Entzündung Lamina propria; Entzdg.PP=Entzündung Peyersche Platten; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) Die mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales) der Minipigs waren bis auf eine lymphatische Hyperplasie völlig unauffällig (Tab. 19). Tab. 19: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. Grau hinterlegt sind die mit sterilem PBS pseudoinfizierten Kontrolltiere. (Sektion am siebten Tag p.i.; Abkürzungen: Bakt.kol.=Bakterienkolonien; Hypelpl.=lymphatische Hyperplasie; Depl.=lymphatische Depletion; Entzdg.=Entzündung allgemeiner Score; NGZ=Neutrophile Granulozyten; Makroph.=Makrophagen; Plasmaz.=Plasmazellen; 0=negativ; 1=geringgradig; 2=mittelgradig; 3=hochgradig) 144 Anhang H.4 Tabellarische Auflistung der quantitativen Organbelastung Zu C.1.1.2 Tab. 20: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1. Die Probenahme erfolgte am siebten Tag nach der Infektion mit 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw. 1010 (Gruppe C) KBE/Tier. (Angaben in KBE/g Organ) A B 145 Anhang Zu C.1.2.4 Tab. 21: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel. (Probenahme am dritten, siebten, 14. und 21. Tag p.i.; Angaben in KBE/g Organ) A B 146 Anhang Zu C.2.4 Tab. 22: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 oder Serotyp O:8 Stamm 8081v. (Zeitpunkt der Probenahme: sieben oder 21 Tage nach oraler Infektion mit 109 KBE/Tier; Angaben in KBE/g Organ) A Tabelle 22: Fortsetzung und Beschriftung auf der folgenden Seite 147 Anhang Fortsetzung Tab. 22 B Zu C.3.1.4 Tab. 23: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YE14(rovAP98)). (Zeitpunkt der Probenahme: sieben Tage p.i.; Angaben in KBE/g Organ) 148 Anhang Zu C.3.2.4 Tab. 24: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm YE13 (wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). (Probenahme am siebten (A) bzw. 21. Tag p.i.(B), Angaben in KBE/g Organ) A B Zu C.3.3.4 Tab. 25: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA). Die Tabellen zeigen die Differenz zwischen dem ersten (A) und dem zweiten (B) Koinfektionsversuch. (Probenahme am siebten Tag p.i., Angaben in KBE/g Organ) A B 149 Anhang H.5 Nährböden, Medien und Antibiotika H.5.1 Nährböden 1. Blutagar (Fleischextraktpeptonagar mit Zusatz von 3 % defibriniertem Schafblut, Oxoid Deutschland GmbH) 2. Gassneragar (Wasserblau-Metachromgelb-Laktose-Agar, Oxoid®) 3. CIN-Agar (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin-/ Yersinia-Agar nach Schiemann) A. dest: ............................................................................... 1000 ml Yersinia Selective Agar Base (Oxoid®):................................... 58 g - suspendieren, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren - im Wasserbad auf 50-55°C abkühlen lassen - Yersinia Selective Supplement (Oxoid®) in 4 ml 50 %iger Ethanollösung zugeben: (Cefsulodin 15 mg, Irgasan 4 mg; Novobiocin 2,5 mg) - Carbenicillin Dinatriumsalz (≥ 90 %, Carl Roth GmbH u. Co. KG): 100 mg ggf.: Kanamycinsulfat (≥750 I.E./mg, Carl Roth®): 50 mg 4. LB-Agar (Luria-Bertani-Agar) A. dest: ............................................................................... 1000 ml Bacto-Trypton (Becton-Dickinson GmbH): .............................. 10 g Hefeextrakt (DifcoTM): ................................................................ 5 g NaCl (Merck KGaA): ............................................................... 10 g Agar (Oxoid®): ......................................................................... 15 g - suspendieren, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren 150 Anhang H.5.2 (Nähr-) Medien: 1. LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) A. dest: ............................................................................... 1000 ml Bacto-Trypton (Becton-Dickinson®): ........................................ 10 g Hefeextrakt (Difco®):.................................................................. 5 g NaCl (Merck®): ........................................................................ 10 g - suspendieren, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren 2. PBS (phosphate buffered saline) A. dest: ............................................................................... 1000 ml NaCl (Merck®): ....................................................................... 8,5 g Na2HPO4 (Merck®): .............................................................. 1,28 g NaH2PO4 x 2H2O (Merck®): ................................................ 0,156 g - suspendieren, pH-Wert auf 7,2 einstellen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren H.5.3 „Bunte Reihe“ 1. H2S-Bildung (Kligler) A. dest: ............................................................................... 1000 ml Kligler Iron Agar (Becton-Dickinson®):..................................... 26 g - erhitzen bei 99,5°C bis Agar flüssig, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren 2. Urease (Harnstoff-Dextrose-Agar) A. dest. ............................................................................... 2000 ml Casein Pepton (Becton-Dickinson®) ....................................... 18 g gesättigte Köchsalzlösung......................................................40 ml K2HPO4 (Merck®) .................................................................... 2 g Glucose (Merck®) ................................................................... 10 g Bromthymolblau, alkoholisch (Merck®) ..................................20 ml - suspendieren, pH-Wert auf 6,8 einstellen, je 500 ml 6,5 g Agar (Oxoid®) zugeben bei 121°C für 15 Min.autoklavieren, auf 55°C abkühlen, 5 ml UreaseLösung auf 500ml zugeben, steril abfüllen 151 Anhang 3. Citrat-Agar A.dest (heiß): ......................................................................2000 ml Ammoniumphosphat (NH4H2PO4, Merck®) ............................... 2 g Dikaliumphosphat (K2HPO4, Merck®): ....................................... 2 g NaCl (Merck®): ........................................................................ 10 g Magnesiumsulfat (MgSO4 x 7H2O, Merck®): .......................... 0,4 g Bromthymolblau, alkoholisch: .................................................10 ml - erhitzen bei 99,5°C bis vollständig gelöst, mit 4 %iger NaOH auf pH 6,6 einstellen, je 500 ml 6,5 g Agar zugeben, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren, auf 55°C abkühlen, 5 ml Natriumcitrat-Lösung auf 500ml zugeben, steril abfüllen 4. Mannit Hottinger Bouillon mit 1 % Mannit (Merck®) - Zucker (Mannit) steril einwiegen, 1 g Zucker auf 100 ml Hottinger Bouillon 5. ODC (Ornithin nach Moeller) A. dest: .................................................................................500 ml Moeller Decarboxylase (Becton-Dickinson®): ....................... 5,25 g 1 % L-Ornithinmonohydrochlorid (Merck®): ............................... 5 g - suspendieren, pH-Wert auf 6,0 einstellen, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren - nach dem Beimpfen mit Paraffin (Merck®) überschichten 6. Indol (Hottinger Bouillon für Indolreaktion) A. dest: ............................................................................... 1000 ml NaCl (Merck®): ....................................................................... 2,5 g K2HPO4 (Merck®): ................................................................ 1,25 g Casein Pepton (Becton-Dickinson®): ....................................... 10 g - suspendieren, pH-Wert auf 7,2 – 7,4 einstellen, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren - zum Ablesen der Reaktion nach der Bebrütung einige Tropfen KovaczReagenz (KOVACS indole reagent (Merck®) zugeben 152 Anhang 7. O/F-Testbouillon A. dest: ............................................................................... 1000 ml OF Testbouillon (Merck®): ....................................................... 11 g Glucose (Merck®): ................................................................... 10 g HCl (Merck®): ........................................................................0,5 ml Paraffin (Merck®): .....................................................................1 ml - erhitzen bei 99,5°C bis vollständig gelöst, abfüllen, Hälfte der Röhrchen mit Paraffin überschichten (erwärmt), bei 121°C für 25 Min. autoklavieren 8. Inosit Hottinger Bouillon mit 1 % Inosit (Merck®) - Zucker (Inosit) steril einwiegen, 1 g Zucker auf 100 ml Hottinger Bouillon 9. Rhamnose Hottinger Bouillon mit 1 % Rhamnose (Merck®) - Zucker (Rhamnose) steril einwiegen, 1 g Zucker auf 100 ml Hottinger Bouillon 10. Äskulin A. dest: .................................................................................500 ml NaCl (Merck®): ....................................................................... 2,5 g Pepton (Oxoid®): ....................................................................... 5 g Fleischextrakt (Oxoid®):............................................................. 5 g NaOH (Merck®): ..................................................................0,75 ml - pH-Wert auf 7,2 – 7,4 einstellen Äskulin (Merck®): .................................................................... 0,5 g - suspendieren, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren - zum Ablesen der Reaktion nach der Bebrütung einen Tropfen 1 %ige Eisen(III)-Chlorid-Lösung (1 g Eisen-III-Citrat (Merck®) in 100 ml A. dest) zugeben 153 Anhang 11. Hottinger Bouillon für die „Bunte Reihe“: A. dest: .............................................................................. 1000 ml NaCl (Merck®): ...................................................................... 2,5 g K2HPO4 (Merck®): ............................................................... 1,25 g Proteose Peptone No.3 (Becton-Dickinson®): ........................ 10 g Bromthymolblau wässrig 0,1 %: ............................................40 ml NaOH (Merck®): ......................................................................5 ml - suspendieren, pH-Wert auf 8,4 einstellen, abfüllen, bei 121°C für 15 Min. autoklavieren H.5.4 Zusätze 1. Bromthymolblau-Lösung 1,5 %ig, alkoholisch A. dest (steril): ........................................................................24 ml Alkohol 96 %: .........................................................................76 ml Bromthymolblau (Merck®): ..................................................... 1,5 g 2. Bromthymolblau- Lösung 0,1 %ig, wässrig Alkohol 96 %: .........................................................................10 ml Bromthymolblau (Merck®): ......................................................... 1g - über Nacht stehen lassen bis Bromthymolblau ganz gelöst - A. dest (steril): 990 ml 3. Harnstofflösung A. dest: ...................................................................................50 ml Harnstoff (Merck®): .................................................................. 50 g 4. Na-Citrat-Lösung A. dest: ...................................................................................80 ml Na-Citrat (Merck®): .................................................................. 40 g - sterilfiltrieren 154 Anhang H.5.5 Verwendete Antibiotika 1. Gentamicin - 50 µg/ml in PBS, zur Inkubation der Tonsillen und der Darmproben 2. Carbenicillin - 100 mg/l im CIN- (Minipigversuche) und LB-Agar (Mausversuche) 3. Kanamycin - 50 mg/l im CIN- (Minipig) und LB-Agar (Maus) zusätzlich zu Carbenicillin in der Hälfte der Nährböden zur Unterscheidung der Stämme in Koinfektionsversuchen - 25 µg/ml im LB-Medium für die Übernachtkultur kanamycinresistenter Stämme (Herstellung der Infektionsdosen) H.6 Tabellenverzeichnis Tab. 1: Verwendete Y. enterocolitica Stämme und deren Herkunft. ..........................27 Tab. 2: Biochemische Reaktionen der eingesetzten Y. enterocolitica Stämme. ........29 Tab. 3: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten am siebten Tag p.i. .............................................128 Tab. 4: Makroskopisch-pathologische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten während der Sektionen zu vier verschiedenen Zeitpunkten p.i.. ............................................................................................129 Tab. 5: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten ...........................................................................130 Tab. 6: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten ............................................................................131 Tab. 7: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten ............................................................................132 Tab. 8: Pathologisch-anatomische Befunde der intestinalen Organe und der assoziierten Lymphknoten ............................................................................134 Tab. 9: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileum (A) und mesenterialen Lymphknoten (B) der Minipigs. ..............................................135 155 Anhang Tab. 10: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Leberproben der Minipigs...................................................................................................136 Tab. 11: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Milzproben der Minipigs. ........................................................................................................137 Tab. 12: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs...................................................................................................138 Tab. 13: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. ...........................................................................139 Tab. 14: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs...................................................................................................140 Tab. 15: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. ...........................................................................141 Tab. 16: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs...................................................................................................142 Tab. 17: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. ........................................................................... 143 Tab. 18: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von Ileumproben der Minipigs...................................................................................................144 Tab. 19: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung von mesenterialen Lymphknoten der Minipigs. ...........................................................................144 Tab. 20: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1. ....................................................................................................145 Tab. 21: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel. ...........................................................146 Tab. 22: Quantitative Belastung der intestinalen (A) und extraintestinalen (B) Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 oder Serotyp O:8 Stamm 8081v. .................................................147 Tab. 23: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der RovAStabilitätsmutante YE14 (YE14(rovAP98)). .....................................................148 Tab. 24: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm YE13 (wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). ...............................................149 156 Anhang Tab. 25: Quantitative Belastung der Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (wt) und der ΔinvAMutante YE21 (YeO:3 ΔinvA). ......................................................................149 H.7 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Zeitlicher Ablauf des Versuchs. ..................................................................... 32 Abb. 2: Quantitative Organbelastung in den drei Dosisgruppen.. .............................. 38 Abb. 3: Prozentualer Anteil der positiv getesteten Tiere in den drei Dosisgruppen. ................................................................................................. 39 Abb. 4: Prozentualer Anteil der Tiere in den drei Dosisgruppen, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden.. .............................................. 40 Abb. 5: Quantitative Organbelastung der Minipigs zu vier Zeitpunkten nach der Infektion. ......................................................................................................... 43 Abb. 6: Quantitative Belastung der intestinalen Organe (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon) im Verlauf der Infektion.. ...................................................... 44 Abb. 7: Prozentualer Anteil positiv getesteter Organproben im Bezug zum Zeitpunkt nach der Infektion. ........................................................................... 45 Abb. 8: Prozentualer Anteil der infizierten Tiere, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden. ...................................................................................... 46 Abb. 9: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA im Verlauf der Infektion.. ........................................................................................................ 47 Abb. 10: Quantitative Organbelastung der Minipigs am siebten Tag (A) bzw. am 21. Tag (B) p.i... .............................................................................................. 51 Abb. 11: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) oder Serotyp O:8 Stamm 8081v (YeO:8). ........................ 53 Abb. 12: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v.. ........................................................... 54 Abb. 13: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v. ............................................................ 55 Abb. 14: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA im Verlauf der oralen Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 bzw. YeO:8 Stamm 8081v. ................. 56 157 Anhang Abb. 15: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) ............. 60 Abb. 16: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) im Verhältnis zum Anteil des Inokulums. ...................................................................................... 61 Abb. 17: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. ............................................................................ 62 Abb. 18: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. ........................................... 64 Abb. 19: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98). ......................................................................................................... 65 Abb. 20: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA vor und nach oraler Infektion mit YeO:3 Stamm Y1 und der RovA-Stabilitätsmutante YE14. .............................................................................................................. 66 Abb. 21: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667). ................................................. 69 Abb. 22: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667) im Verhältnis zum Anteil des Inokulums........................................................................................................ 70 Abb. 23: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm YE13 innerhalb desselben Tieres. .................................................................. 70 Abb. 24: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAIS1667-Mutante YE15 (YeO:3ΔIS1667) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i.. ............................... 72 158 Anhang Abb. 25: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm YE13 (YeO:3 wt) und der PinvAΔIS1667-Mutante YE15 (YeO:3 ΔIS1667). ........................................................................................................ 73 Abb. 26: Bestimmung der Serumantikörper-Titer mittels ELISA vor und nach oraler Infektion mit YeO:3 Stamm YE13 und der PinvA∆IS1667-Mutante YE15. .............................................................................................................. 74 Abb. 27: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvAMutante YE21 (YeO:3 ΔinvA). ........................................................................ 78 Abb. 28: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvAMutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) im Verhältnis zum Anteil des Inokulums. ......... 78 Abb. 29: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. ............................................................................................ 79 Abb. 30: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA) am siebten Tag p.i.. ............................................................................. 82 Abb. 31: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE21 (YeO:3 ΔinvA).. ............ 84 Abb. 32: Quantitative Organbelastung mit YeO:3 Stamm Y1 oder YeO:8 Stamm 8081v nach oraler Infektion im Minipig- (A) und Mausmodell (B). ................... 87 Abb. 33: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). ......................................................................................................... 90 Abb. 34: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). ......................................................................................................... 92 Abb. 35: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). ......................................................................................................... 94 159 Danksagung Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand für die Überlassung des interessanten Themas, die fachliche Beratung und engagierte Unterstützung während des Projekts. Bei Frau Dr. Petra Grüning bedanke ich mich für die gute Betreuung und die vielen praktischen Tipps im Labor. Frau Prof. Dr. Petra Dersch, Julia Schaake, M. Sc., Tatjana Stolz und der gesamten Forschungsgruppe Molekulare Infektionsbiologie vom Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig danke ich ganz besonders für die gute Zusammenarbeit, die konstruktiven Gespräche und die Unterstützung an Infektionsund Sektionstagen. Dr. Alexandra von Altrock, Dr. Doris Höltig, Dunja Herfert, Klaus Schlotter und den Mitarbeitern des Labors der Klinik für kleine Klauentiere danke ich für die Durchführung der hämatologischen und serologischen Untersuchungen, die Archivierung der Proben und ganz besonders für die praktische Unterstützung bei Blutentnahmen, Sektionen und klinischen Notfällen. Dr. Frauke Seehusen aus dem Institut für Pathologie gilt mein Dank für die histopathologische Untersuchung der Organproben, die geduldige Beantwortung vieler Fragen und ihre Hilfe bei der korrekten Formulierung der Befunde. Ich danke Herrn Prof. Dr. Lothar Kreienbrock und Herrn Dr. Martin Beyerbach aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die Beratung und Unterstützung bei der statistischen Auswertung und die geduldige Einarbeitung in das Programm SAS®. Bei Dr. Stefanie Schmeiser, Günter Thiem und allen anderen Mitarbeitern des Referenzlabors der Europäischen Kommission für die Klassische Schweinepest (KSP) des Instituts für Virologie möchte ich mich ganz herzlich für die freundliche Unterstützung während der in der Isolierstation durchgeführten Tierversuche bedanken. Mein Dank gilt ausserdem Werner Scharnhorst, Florian Rögener, Jenny Pawlik, Dörte Krause, Katrin Hail, Henrike Eulenburg und Marina Behling für die Mitarbeit in den Tierversuchen und besonders für die zuverlässige und fürsorgliche Betreuung der Minipigs. Bei Herrn Jens-Oliver Minx vom Lehr- und Forschungsgut Ruthe bedanke ich mich für die nette und unkomplizierte Zusammenarbeit im Vorfeld der Tierversuche, die Ermöglichung von Blutentnahmen, Futterumstellungen und die Übermittlung von Geburtsdaten und Fotos. Allen Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie aus den verschiedenen Arbeitsgruppen und Abteilungen danke ich herzlich für die jederzeit von vielen Seiten erfahrene Hilfsbereitschaft und für das nette Arbeitsklima, dass mir viel Spaß an diesem Projekt bescherte. Den Mitgliedern des Forschungsverbunds FBI-Zoo danke ich für den regen Gedanken-, Ideen- und Ergebnisaustausch, die gute Kooperation und die ebenso informativen wie netten Treffen im Rahmen des Projekts. Mein besonderer Dank gilt Jörch Merkel für seine geduldige Hilfe bei diversen Computer- und sonstigen Problemen, für Ermunterung und Antrieb, wenn nötig, für nettes und lustiges Beisammensein und für Schokolade. Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihren Rückhalt und ihre Unterstützung in allen Lebenslagen, für Glück, Freude, Gelassenheit, Trost, Kraft und einen doppelten Boden.
