Neue Möglichkeiten der Charakterisierung von

Universität Ulm
Abteilung Analytische Chemie und Umweltchemie
Leiter: Prof. Dr. T. Welsch
DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
der Fakultät für Naturwissenschaften
der Universität Ulm
Neue Möglichkeiten der Charakterisierung von
Mikroorganismen mittels Kapillarelektrophorese
vorgelegt von
Alexander Pfetsch
aus Blaubeuren
Ulm, im April 1999
Amtierender Dekan: Prof. Dr. O. Marti
1. Gutachter:
Prof. Dr. T. Welsch
2. Gutachter:
Prof. Dr. H. Jones
Where no man has gone before....
(Gene Roddenberry)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung und Aufgabenstellung
1
1. Einleitung
3
2. Aufgabenstellung
6
II Theoretischer Teil
7
3.1 Die Zelle
9
3.1.1 Protocyten und Eucyten
9
3.1.2 Aufbau der prokaryotischen Zelle
10
3.1.2.1 Zellinhaltsstoffe
10
3.1.2.2 Zellmembran
11
3.1.2.3 Die Zellwand
12
3.1.2.4 Kapseln, Schleime und Geißeln
15
3.2 Transportvorgänge in der Zelle
15
3.2.1 (Freie) Diffusion
16
3.2.2 Erleichterte Diffusion
16
3.2.3 Aktiver Transport
17
3.3 Wachstum der Bakterien
18
3.4 Die elektrophoretische Mobilität
19
3.5 Ladungsdichteverteilung in der Zellhülle
21
3.5.1 Modell nach Smoluchowski
22
3.5.2 Modell der polymerbeschichteten Partikel
23
3.5.2.1 Das Donnan-Membranpotential
25
3.5.3 Doppelschichtmodell von Nakano et. al.
26
3.5.4 Dreischichtmodell nach Nakano et. al.
28
3.6 Zellspezifität
29
Inhaltsverzeichnis
3.7 Kapillarelektrophorese
30
III Experimenteller Teil
33
4.1 Verwendete Bakterienstämme
35
4.1.1 Beschreibung der Bakterien
35
4.1.1.1 Pseudomonas spezies (DSM 1749, 6708, 6537, 1110,
2583, 5536)
4.1.1.2 Pseudomonas putida (DSM 548, 50222)
35
36
4.1.1.3 Rhodococcus erythropolis (DSM 1069)
36
4.1.1.4 Micrococcus luteus (DSM 20030)
37
4.1.1.5 Serratia ficaria (DSM 4569)
37
4.1.1.6 Paracoccus denitrificans (DSM 65)
37
4.1.1.7 Sphingomonas spezies (DSM 6014)
38
4.1.2 Vermehrung der Bakterien
38
4.1.3 Herstellung der Zellsuspension
40
4.2 CE-Apparatur
42
4.2.1 Detektion
43
4.2.2 Kapillaren
45
4.2.2.1 Konditionierung
46
4.2.2.2 Thermostatisierung der Kapillaren
46
4.2.3 Injektion
4.3 Temperatureffekte in der CE
47
49
4.3.1 Wärmeerzeugung, Temperaturverteilung
49
4.3.2 Temperaturabhängigkeit der elektroosmotischen Mobilität
54
4.3.3 Temperaturabhängigkeit der elektrophoretischen Mobilität
55
4.4 Stabilität
4.4.1 Stabilität der Zellsuspension
4.4.1.1 Kühlung der Zellsuspension
57
57
57
Inhaltsverzeichnis
4.4.1.2 Einfluß der Pufferkonzentration
60
4.4.1.3 Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen Mobilität
61
4.4.2 Alterung der Kapillare
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
62
65
4.5.1 Pufferzusammensetzung
66
4.5.2 Einfluß der Pufferkonzentration
68
4.5.3 Einfluß der Feldstärke
72
4.5.4 Einfluß des Kapillardurchmessers
75
4.5.5 Einfluß des Gegendrucks
81
4.6 Elektrophoretische Mobilität
83
4.6.1 Charakterisierung von Bakterien
83
4.6.2 Einfluß des pH-Wertes
87
4.6.3 Einfluß der Pufferzusammensetzung
89
4.6.4 Einfluß der Pufferkonzentration
94
4.6.5 Einfluß der Nährlösung
96
4.7 Trennung von Bakterien
97
4.8 Fraktionierung von Bakterien
104
4.8.1 Vollständige Trennung von Bakterien ?!
104
4.8.2 Diskontinuierliche Fraktionierung
105
4.8.3 Anwendungsmöglichkeiten
112
IV Zusammenfassung und Literaturverzeichnis
115
5. Zusammenfassung
117
6. Literaturverzeichnis
120
7. Abkürzungen
125
I
Einleitung
und
Aufgabenstellung
1. Einleitung
1. Einleitung
Die historische Entwicklung der Mikrobiologie ist eng mit der Menschheitsgeschichte
verbunden. Das betrifft sowohl die Rolle der Mikroorganismen als Krankheitserreger,
als auch die unbewußte Nutzung bei der Herstellung von alkoholischen Getränken und
Nahrungsmitteln sowie deren Konservierung [1].
Die Erforschung der Mikroorganismen setzte erst in historisch jüngerer Zeit ein, da dazu
eine anspruchsvolle Methodik erforderlich war. Die Entdeckung der Mikroorganismen
gelang dem Niederländer Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) im Jahre 1684. Mit
Hilfe
eines
einfachen
Mikroskops
beschrieb
er
verschiedene
einzellige
Mikroorganismen, Protozoen, Hefen und Bakterien, die er als „kleine Tierchen“
ansprach. Aus seinen außerordentlich sorgfältigen Beobachtungen schloß er bereits, daß
sie sehr verbreitet sind. Seine Annahme, daß im Zahnbelag mehr Mikroorganismen als
Menschen im Königreich vorkommen, war völlig zutreffend. Allerdings blieben Wesen
und Herkunft dieser Organismen noch über ein Jahrhundert unklar. Noch herrschte die
Hypothese, daß sie durch Urzeugung aus toter Materie entstehen.
Erst im Jahre 1861 wurde diese Urzeugungshypothese von Lewis Pasteur (1822-1895)
widerlegt. In dieser Phase des 19. Jahrhunderts wurden nun Methoden zur Sterilisation
und Desinfektion unter anderem von L. Pasteur und I. Tyndall entwickelt. Gleichfalls
erforschte Pasteur das Wesen der Gärung und lieferte Beiträge zur medizinischen
Mikrobiologie, vor allem zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten.
Robert
Koch
(1843-1910)
zeigte
als
erster,
daß
bestimmte
Bakterienarten
Infektionskrankheiten verursachen. Die entscheidenden Versuche führte er 1876 als
Landarzt am Milzbranderreger der Rinder und Schafe durch. Zur Beweisführung stellte
er die vier “Koch´schen Postulate“ auf:
1. Bakterien müssen im erkrankten Organismus nachweisbar sein
2. Diese müssen isoliert und in Reinkultur gebracht werden
3. Durch Infektion mit einer Mikroorganismenart der Reinkultur wird die Krankheit bei
gesunden Wirtsorganismen hervorgerufen
4. Der gleiche Erreger ist erneut aus dem infizierten Wirtsorganismus isolierbar.
3
1. Einleitung
Koch entwickelte mikrobielle Nährmedien, die eine Isolierung von Einzelkolonien
ermöglichten. Ebenfalls führte er erste Färbemethoden für Bakterien ein.
Ende des 19. und Anfang des 20. Jahrhunderts wurden die Leistungen der
Mikroorganismen in den Stoffkreisläufen der Natur sowie die Einheit und
Mannigfaltigkeit des mikrobiellen Stoffwechsels erkannt. 1887 wurde von S.
Winogradsky (1856-1953) das Konzept der Chemoautotrophie aufgestellt.
Mit der Entdeckung des Penicillins im Jahre 1928 von A. Flemming wurde der Beginn
des Antibiotikazeitalters und der Biotechnologie eingeläutet. Hierbei wurde auf einem
langen Weg aus dem in äußerst geringer Menge gebildeten Antibiotikums die
Penicillinproduktion entwickelt, die 1940 zur Anwendung der ersten Präparate führte.
Durch
Einführung
der
Fermentationstechnik
wurde
die
Voraussetzung
der
Massenproduktion geschaffen. Aus dem Gärungsgewerbe entwickelte sich die
industrielle Mikrobiologie, deren methodisches Instrumentarium heute zur Gewinnung
eines breiten Spektrums von Produkten eingesetzt wird.
Das Adaptionsvermögen der Mikroorganismen, d.h. die Fähigkeit einer Art, auf
verschiedenen Nährstoffen zu wachsen, veranlaßte viele Wissenschaftler, dieses
Phänomen eingehend zu untersuchen. Dabei wurden die Grundprinzipien der
Stoffwechselregulation abgeleitet.
Die gute Handhabbarkeit mikrobieller Systeme, ihre schnelle Vermehrung und einfache
Struktur tragen maßgeblich zu den Erkenntnissen der Molekularbiologie und -genetik
bei. Dies stellt die Grundlage der Gentechnik dar, welche die Konstruktion neuer
mikrobieller Leistungen ermöglicht.
In den 80´er Jahren wurde der Ruf der Mikrobiologie vor allem im Bereich der
Gentechnologie in Mitleidenschaft gezogen. Schlagworte wie Genmanipulation und
gentechnisch veränderte Nahrung, verbunden mit mangelnder Aufklärung über deren
Bedeutung, erzeugte Angst und Ablehnung in breiten Bevölkerungsschichten gegenüber
dieser neuen Technologie. Erst innerhalb der letzten 2 Jahre hat sich dieses Bild deutlich
verändert. Heute stehen Begriffe wie Biotechnologie und Gentechnik als Synonym für
Innovation und Schaffung neuer Arbeitsplätze, was sich in einer Zeit, in der eine extrem
hohe Arbeitslosigkeit herrscht, positiv auf die Akzeptanz in der Bevölkerung auswirkt.
Durch
die
Entdeckung
bisher
unbekannter
Mikroorganismen
wird
deren
Anwendungsspektrum stetig erweitert. Durch immer bessere Verfahren zur Bestimmung
4
1. Einleitung
von Mikroorganismen steigt die Gesamtzahl an bekannten Arten. Gleichfalls wird der
Aufwand immer größer, ähnliche Arten voneinander zu unterscheiden. Bei vielen
„Unterarten“
versagen
herkömmliche
Charakterisierungsmethoden
und
eine
Unterscheidung bzw. Trennung/Isolierung ist nicht mehr ohne weiteres möglich.
Deshalb erfolgt oftmals nur eine Zuordnung zu einer bestimmten Bakterienspezies, da
eine genauere Charakterisierung nicht gelingt.
Jedoch ist in der Mikrobiologie das Arbeiten mit bekannten und isolierten Organismen
in den meisten Bereichen essentiell. Deshalb ist es unabdingbar, neue Methoden zur
Charakterisierung und Isolierung von Mikroorganismen zu entwickeln.
Diese Arbeit soll einen Beitrag liefern, den Wissensstand und die Möglichkeiten auf
diesem Gebiet zu erweitern.
5
2. Aufgabenstellung
2. Aufgabenstellung
Ziel dieser Arbeit war es, die Kapillarelektrophorese als neue Methode bei der
Charakterisierung von Mikroorganismen einzuführen.
Dazu mußten zuerst die apparativen Voraussetzungen untersucht werden, wie z.B.
Kapillarinnendurchmesser, Detektion und Thermostatisierung.
Als zweites sollten die idealen Rahmenbedingungen für das Arbeiten mit
Mikroorganismen in der CE bestimmt werden. Wichtige zu untersuchende Faktoren
waren dabei Temperatureffekte und Stabilität der Zellsuspension. Die beschränkte
Lebensdauer der Kapillaren auf Grund der Verwendung von biologischen Matrices
sollte ebenfalls untersucht werden.
Die elektrophoretische Mobilität sollte als ergänzendes Charakterisierungsmerkmal für
Bakterien eingeführt werden. Dabei waren die Einflüsse verschiedener Parameter, wie
zum Beispiel Zusammensetzung, Konzentration und pH-Wert des Puffers auf die
elektrophoretische Mobilität der Zellen zu untersuchen. Von den untersuchten Bakterien
sollte ein Charakterisierungskatalog erstellt werden.
Um eine Trennung von Bakteriengemischen zu ermöglichen, bzw. zu optimieren, sollte
der Einfluß verschiedener Parameter wie z.B. Zusammensetzung und Konzentration des
Puffers,
Wechselwirkungen
mit
der
Kapillarwand
und
Abhängigkeit
vom
Kapillardurchmesser auf die Bodenzahl untersucht werden. Im Anschluß sollten die
Anwendungsmöglichkeiten der Trennung von Bakterien erörtert werden.
Um die Bakterien nach deren Trennung weiter untersuchen zu können, sollten
Methoden zur Fraktionierung der getrennten Bakterien entwickelt werden.
6
II
Theoretischer
Teil
7
8
3. Theoretischer Teil
3.1 Die Zelle
3.1.1 Protocyten und Eucyten
Generell können die Zellen in 2 Gruppen aufgeteilt werden: Die eine Gruppe beinhaltet
Organismen mit einfacher Zellstruktur, welche als Prokaryoten und ihre Zellen als
Protocyten bezeichnet werden. Zu ihnen gehören die Bakterien einschließlich der
Cyanobakterien.
Abbildung 3.1: Schema einer pro- und eukaryotischen Zelle. Größenvergleich und
Kompartmentierung. Als Beispiel für die eukaryotische Zelle wurde eine junge
Pflanzenzelle gewählt [1].
Die andere Gruppe beinhaltet Organismen mit komplexer Zellstruktur. Sie werden als
Eukaryoten und ihre Zellen als Eucyten bezeichnet. Zu ihnen gehören die Protozoen,
Pilze, einschließlich der Hefen, sowie die Pflanzen und Tiere.
Wesentliche Unterscheidungsmerkmale sind die Zellkompartmentierung und der
genetische Informationsgehalt, wobei dieser bei den Eucyten das etwa 10-1000-fache
der Protocyten beträgt, vgl. Abb. 3.1.
Ein wesentliches Unterscheidungsmerkmal ist der Bau des Zellkerns. Der Kern der
Protocyten, der auch als Kernregion oder Nucleoid bezeichnet wird, ist ein zirkulär
9
3. Theoretischer Teil
geknäultes DNA Molekül, das nicht von einer Membran umgeben ist. Die Eucyten
besitzen einen „echten“ Kern, der von einer Membran umgeben ist. Zusätzlich enthalten
Eucyten sogenannte Organellen.
3.1.2 Aufbau der prokaryotischen Zelle
Vereinfacht kann die Zelle in 2 Kompartimente aufgeteilt werden: Die Zellhülle und das
Zellinnere bzw. der Zellinhalt. In den folgenden Ausführungen soll schwerpunktsmäßig
auf die Zellhülle eingegangen werden, da diese für vorliegende Arbeit von großer
Relevanz war.
3.1.2.1 Zellinhaltsstoffe
Der wohl wichtigste Bestandteil der Zelle ist der Kern, bzw. die Kernregion. Hierbei
handelt es sich um ein cyclisches DNA-Makromolekül, in dem sämtliche
Erbinformationen enthalten sind. Parallel gibt es noch kleine zirkuläre doppelsträngige
DNA Moleküle, sogenannte Plasmide, welche zusätzliche, für die Zelle wichtige
Informationen enthalten, wie z.B. Resistenz-, Abbau- oder Virulenz-Plasmide.
Der Kern ist in das Cytoplasma eingebettet, welches von der Zellmembran begrenzt
wird. Das Cytoplasma stellt keine homogene Proteinlösung dar, sondern kann in zwei
Fraktionen aufgetrennt werden:
1. Lösliche Fraktion: Enzymproteine, Ribonucleinsäure, niedermolekulare
Intermediären des Stoffwechsels
2. Unlösliche Fraktion: Ribosomen
10
3. Theoretischer Teil
3.1.2.2 Zellmembran
Das Cytoplasma wird von der Zell- oder Cytoplasmamembran umschlossen, welche aus
zwei Schichten von Phospholipidmolekülen gebildet wird. Diese bestehen aus einem
polaren und daher hydrophilen Kopfteil und einem lipophilen Schwanzteil, der durch
zwei Fettsäureketten gebildet wird (vgl. Abb. 3.2). In der typischen Einheitsmembran
sind die lipophilen Teile von beiden Seiten nach innen gerichtet, die hydrophilen Teile
nach außen (vgl. Abb. 3.3).
Abbildung 3.2: Bausteine der Lipiddoppelschicht der bakteriellen Zellmembran [1].
Abbildung 3.3: Aufbau der Cytoplasmamembran, PR = Proteinschicht, Lipidmolekül
mit polarem (PL) und nichtpolarem (NPL) Teil [1].
Hinzu kommen noch Proteine, die in der Membran verankert sind.
Die Membran erfüllt zwei wesentliche Funktionen: Auf Grund der Semipermeabilität
stellt sie eine Diffusionsbarriere dar, die den Stoffaustausch und die Transportprozesse
reguliert. Weiterhin sind in der Membran die Systeme der Energiegewinnung lokalisiert.
11
3. Theoretischer Teil
3.1.2.3 Die Zellwand
Die Zellwand bewirkt Festigkeit und Form der Zellen. Sie ist mit der Lederhülle eines
Fußballs vergleichbar, die Cytoplasmamembran würde der Gummiblase entsprechen.
Die der Zellwand an Festigkeit verleihende Komponente ist das Peptidoglykan oder
Murein. Es ist ein makromolekulares Heteropolymer, das aus Zuckerderivaten und
Peptiden besteht. In Varianten kommt diese Grundstruktur bei allen Eubakterien vor.
Die Archaebakterien haben einen davon abweichenden Zellwandaufbau. Die
Komponenten der Peptidoglykangrundstruktur sind in Abb. 3.4.a (Dreieck) dargestellt.
Abbildung 3.4a: Peptidoglycanstruktur der Zellwand Gram-positiver Bakterien
(Staphylococcus aureus). Die Grundeinheit ist von einem Dreieck umgeben [1].
Die Zuckerderivate sind in alternierender Folge aus N-Acetyl-Glucosamin und NAcetyl-Muraminsäure angeordnet, die β-1,4-glykosidisch miteinander verknüpft sind.
Die N-Acetyl-Muraminsäure ist mit einem Tetrapeptid verbunden. Diese Peptidkette ist
bei den Gram-negativen Bakterien direkt, bei den Gram-positiven Bakterien über eine
Peptidkette mit dem Tetrapeptid der nächsten Kette verknüpft. Die makromolekulare
12
3. Theoretischer Teil
Struktur des Mureins kommt durch zwei Arten der Verknüpfung zustande: Durch die
Glycosidbindungen zwischen den Zuckerderivaten und den Peptidbindungen zwischen
den Aminosäuren der Peptidseitenketten (vgl. Abb. 3.4.b).
Abbildung 3.4b: Peptidoglycanstruktur der Zellwand Gram-positiver Bakterien
(Staphylococcus aureus). Vernetzung der Grundeinheiten zum Makromolekül [1].
a) Gram-Färbung
Die Eubakterien lassen sich in zwei Gruppen differenzieren: In die Gram-positiven und
Gram-negativen Bakterien. Die Differenzierung beruht auf der von Gram (1884)
eingeführten Färbung. Die im folgenden behandelten Unterschiede im Wandaufbau
bewirken, daß beim Färben mit Kristallviolett und anschließender Iod-Fixierung ein
Komplex entsteht, der bei Gram-negativen Bakterien mit Ethanol auswaschbar ist, bei
den Gram-positiven nicht. Die Gram-negativen Bakterien werden durch das Waschen
mit Ethanol wieder farblos und können durch Gegenfärbung mit Fuchsin wieder sichtbar
gemacht werden.
b) Gram-positive Bakterien
Sie haben im Vergleich zu den Gram-negativen Bakterien einen relativ einfachen
Wandaufbau (vgl. Abb. 3.5). Die Wand besteht aus einer mehrschichtigen
Peptidoglycanstruktur, in die Teichonsäuren eingelagert sind. Die Zellwand besteht
insgesamt aus ca. 90 % Peptidoglycan.
13
3. Theoretischer Teil
Abbildung 3.5: Vergleich des Aufbaus der Zellwand Gram-positiver und Gramnegativer Bakterien[1].
c) Gram-negative Bakterien
Wie bereits erwähnt, haben sie eine komplexere Wandstruktur (vgl. Abb. 3.5 und 3.6).
Über der meist einschichtigen Peptidoglycanschicht liegt eine zweite, äußere Membran,
welche sich stark von der Inneren, der Cytoplasmamembran unterscheidet: Die nach
innen gerichtete Schicht der äußeren Membran besteht im wesentlichen aus
Phospholipiden, die äußere Schicht aus Lipopolysacchariden. Gleichfalls sind auch in
der äußeren Membran Proteine eingebaut.
Abbildung 3.6: Schema des Zellwandaufbaus Gram-negativer Bakterien (Salmonella
typhimurium)[1].
14
3. Theoretischer Teil
3.1.2.4 Kapseln, Schleime und Geißeln
Bei vielen Bakterien liegt über der Zellwand eine Schleimschicht. Ist sie scharf
abgegrenzt, so wird sie als Kapsel bezeichnet. Geht das Kapselmaterial in das
umgebende Medium über, so spricht man von Schleimen. Ihre chemische
Zusammensetzung ist sehr vielfältig. Zum überwiegenden Teil sind es Polysaccharide,
aber auch Polypeptide werden gebildet.
Ebenso können Bakterien sogenannte Geißeln besitzen. Hierbei handelt es sich um 1020 µm lange helikale Gebilde, die in der Cytoplasmamembran verankert sind. Die
Geißeln erlauben den Bakterien eine aktive Fortbewegung.
3.2 Transportvorgänge in der Zelle
Mit der Aufnahme eines Stoffes durch die Zelle beginnt in der Regel der Stoffwechsel.
Bei der Aufnahme kann man mehrere, sich grundsätzlich unterscheidende Prozesse
voneinander trennen:
• Bindung eines Stoffes durch die Zelloberfläche, z.B. durch Adsorption oder Bindung
von Ionen an geladene Gruppen der Zelloberfläche.
• Durchtritt (Permeation) eines Stoffes durch die Membran
• Einbau eines Stoffes in die Membran
Wichtigstes Zellorganell für diese Prozesse ist die Cytoplasmamembran. Sie stellt eine
osmotische Barriere dar und ermöglicht einen selektiven Stoffaustausch mit der
Umgebung. Im Allgemeinen nimmt man an, daß die Zellwand der Mikroorganismen
keine Permeabilitätsschranke für niedermolekulare, gelöste Stoffe darstellt [2].
Der Umfang des Transports eines Stoffes durch die Membran ist abhängig
− von der Konzentration des Stoffes auf beiden Seiten der Membran
− von der Beweglichkeit des Stoffes in der Membran
− von der Treibkraft für den betreffenden Stoff, einer thermodynamischen Größe, deren
Gradient über die Membran die Bewegung der Teilchen verursacht und die Richtung
der Bewegung bestimmt.
15
3. Theoretischer Teil
Vom Mechanismus des Transportvorganges und seinem kinetischen Verhalten
unterscheidet man:
− die Diffusion
− die erleichterte Diffusion
− den aktiven Transport
3.2.1 (Freie) Diffusion
Bei der Diffusion hängt die Transportgeschwindigkeit v ausschließlich vom
Konzentrationsgradienten des Stoffes auf beiden Seiten der Membran ab.
v = KD([Sa] - [Si])
(1)
[Sa]: Konzentration des Stoffes
außerhalb der Membran
[Si]: Konzentration des Stoffes
in der Zelle
KD: Diffusionskonstante
Im Gleichgewicht sind die beiden Konzentrationen gleich. Dies bedeutet, daß die
Zusammensetzung an niedermolekularen Zellinhaltsstoffen stark vom umgebenden
Medium abhängt.
Die freie Diffusion setzt die Existenz von Poren oder Löchern in der Membran voraus.
3.2.2 Erleichterte Diffusion
Hier wird der Transport von Substraten durch die Cytoplasmamembran mittels
sogenannten Träger (carrier) erleichtert, bzw. ermöglicht. Durch Kontakt des Substrats
mit dem Träger werden die physikalischen Eigenschaften verändert und so ein
Durchtritt durch die Membran erleichtert. Allerdings ist auch hier nur ein Transport
infolge eines Konzentrationsgefälles, analog der freien Diffusion, möglich.
16
3. Theoretischer Teil
3.2.3 Aktiver Transport
Die wesentlichste Transportform überhaupt ist der aktive Transport (Bergauftransport).
Die meisten Substrate gelangen auf diesem Weg in die Zelle. Das hervorstechende
Merkmal des aktiven Transports ist die Fähigkeit zur Akkumulation des betreffenden
Substrates
gegen
den
Konzentrationsgradienten.
Dies
kann
zu
sehr
hohen
Verteilungsquotienten führen.
Der aktive Transport ist stets mit einer Energietransformation verbunden und daher von
einem intakten Energiestoffwechsel der Zelle abhängig.
Entfällt diese Energiebereitstellung, so bleibt lediglich die Diffusion als Transportmittel
übrig. Selbst bei abgestorbenen Zellen erfolgt dieser Diffusionsaustausch, sofern die
Membran noch intakt ist.
Wird die Umgebungslösung verändert, so entstehen Konzentrationsgefälle, worauf ein
Durchtritt derjenigen Substanzen durch die semipermeable Membran stattfindet, die zur
Diffusion befähigt sind (niedermolekuare Verbindungen). Dabei erfolgt nicht nur ein
Substrataustausch entlang des Konzentrationsgefälles, sondern in begrenztem Umfang
auch ein Wasseraustausch, wodurch ein Angleichen der Konzentrationen erreicht
werden kann. Bei starkem Konzentrationsgefälle in Richtung Zelle-Umgebung ist es
möglich, daß so viel Wasser in die Zelle diffundiert, daß der osmotische Druck zu stark
wird und die Zellwand reißt: Die Zelle platzt.
17
3. Theoretischer Teil
3.3 Wachstum der Bakterien
Wachstum ist die irreversible Zunahme der lebenden Substanz. Bei Mikroorganismen
erfolgt es sowohl auf der Ebene der individuellen Zelle als auch der Zellpopulation.
Nach der Vergrößerung teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen. Die mit dem
Wachstum der individuellen Zelle verbundene Zellteilung führt zum Anstieg der
Zellzahl und damit zur Vergrößerung der Zellpopulation. Das Wachstum erfolgt dabei
exponentiell. In Abb. 3.7 ist ein solcher Wachstumsverlauf dargestellt, der jedoch nur
bei idealen Bedingungen zu erwarten ist. Grundbedingung ist ein ausreichendes
Substratangebot.
Zellzahl
arithmetische Auftragung
logaritmische Auftragung
0
1
2
3
4
5
Zeit [h]
Abbildung 3.7: Exponentielles Wachstum. Arithmetische und halblogarithmische
Auftragung der Zellzahl
In der Praxis verläuft die Vermehrung der Bakterien in verschiedenen Wachstumphasen
(vgl. Abb. 3.8). Nach der Beimpfung erfolgt in einer Anlauf- oder lag-Phase zunächst
eine Anpassung an das Milieu, bevor das exponentielle Wachstum beginnt. Ihre Dauer
ist vom Alter der Population der eingeimpften Zellen und der Zusammensetzung des
Mediums der vorhergehenden Kultur abhängig. Die Zellen synthetisieren in der
Anlaufphase Ribosomen und Enzyme, welche für die Verwertung der vorliegenden
Nährstoffe notwendig sind. Ist dieser Vorgang abgeschlossen, so beginnt die
exponentielle Phase. Durch Verbrauch der Nährstoffe kommt es schließlich zur
Beendigung des Wachstums und die Zellen gehen in den stationären Zustand über.
18
3. Theoretischer Teil
Allerdings sind sie immer noch stoffwechselaktiv und können weiterhin Produkte
synthetisieren. Nach einer gewissen Zeit beginnen die Bakterien abzusterben, wodurch
die Gesamtzellzahl verringert wird.
Abbildung 3.8: Wachstumsverlauf einer Bakterienkultur [2]
3.4 Die elektrophoretische Mobilität EM
Ein Teilchen mit der Ladung q erfährt in einem elektrischen Feld der Stärke E eine Kraft
FE., wodurch das Teilchen beschleunigt wird [3].
FE = q ⋅ E
(2)
Befindet sich dieses Teilchen nicht im Vakuum, so erfährt es zusätzlich eine durch
Reibung verursachte Bremskraft, die vom Radius r des Teilchens, dessen
Geschwindigkeit v und der Viskosität η des umgebenden Mediums abgängig ist:
FR = 6 π ⋅ r ⋅ η ⋅ v
(3)
19
3. Theoretischer Teil
Nach kurzer Zeit stellt sich ein Kräftegleichgewicht ein, wobei sich das Teilchen nun
mit konstanter Geschwindigkeit v bewegt:
FE = FR
⇒
q ⋅ E = 6 π ⋅ r ⋅ η⋅ v
(4)
(5)
Somit ergibt sich für die Geschwindigkeit:
v=
q⋅E
6π⋅r⋅η
(6)
Da die Geschwindigkeit von der elektrischen Feldstärke abhängig ist, wurde die
feldstärkeunabhängige elektrophoretische Beweglichkeit/Mobilität EM eingeführt:
µ=
v
q
=
E 6π⋅r ⋅η
(7)
Diese Gleichung läßt sich prinzipiell auch auf Zellen anwenden. Die EM läßt sich
experimentell durch Bestimmung der Geschwindigkeit der Zelle im elektrischen Feld
ermitteln. Um sie theoretisch berechnen zu können, müssen Radius und Ladung der
Zelle, sowie die Viskosität der umgebenden Lösung bekannt sein. Die Viskosität und
die Zellgröße sind relativ einfach zu bestimmen. Schwieriger wird die Bestimmung der
Ladung der Zelle, da hierbei nicht nur die Ladung selbst, sondern auch dessen
Verteilung eine Rolle spielt. Zudem wird eine Verallgemeinerung erschwert, da die
Zellen ein und derselben Art nicht exakt identisch sind. Daher ist es bisher nicht
möglich, die Ladung von Zellen mathematisch exakt zu erfassen.
Aus diesem Grund entstanden zahlreiche Versuche, die Ladung bzw. die
Ladungsverteilung von Zellen semiquantitativ zu beschreiben.
20
3. Theoretischer Teil
3.5 Ladungsdichteverteilung in der Zellhülle
Damit „Zelladungen“ entstehen können, sind ionische Verbindungen - oder Gruppen,
die Ionen erzeugen können - notwendig, welche fest in der Zelle verankert sind. Das
entsprechende Gegenion muß dabei frei beweglich sein und die Zelle verlassen können,
da nur so die elektrische Ladung als „Zelladung“ in Erscheinung treten kann. Somit sind
nur die äußeren Regionen der Zelle, also Zellwand und Zellmembran von Relevanz. Die
im Zellinneren befindlichen Ionen liefern keinen Beitrag zur Gesamtladung, da sich das
entsprechende Gegenion in unmittelbarer Nähe aufhalten muß (elektrostatische
Anziehung) und sich die Ladungen beim Betrachten der gesamten Zelle gegenseitig
aufheben.
Wie in den Kapiteln 3.1.2.2 und 3.1.2.3 beschrieben, besteht die Zellhülle größtenteils
aus Zuckerderivat- und Aminosäurebausteinen, sowie Phospho-Verbindungen, die
verschiedene funktionelle Gruppen enthalten. Diese unterliegen der Protolyse, wobei
ionische Verbindungen entstehen können.
Typische Vertreter sind [4]:
Carbonsäuren
-COOH
Sulfinsäuren
-SO2H
Phosphorsäureester
-OPO3H
Durch die Abspaltung eines Protons wird die Gesamtladung der Zelle verändert. Die
funktionellen Gruppen ermöglichen nicht nur die Bildung von negativen Ladungen,
sondern können u.a. durch Protonierung von Aminen zum Ammoniumion positive
Ladungen erzeugen. Die Gesamtladung der Zelle ergibt sich aus der Summe der
positiven und negativen Ladungen, d.h. durch einen hohen Anteil an Aminen bzw.
Ammoniumionen kann die negative Zelladung stark vermindert werden.
In den folgenden Kapiteln werden nun einige Modelle diskutiert, die die resultierende
Ladungsverteilung quantitativ zu beschreiben versuchen.
21
3. Theoretischer Teil
3.5.1 Modell nach Smoluchowski
Experimentelle
Untersuchungen
von
kolloidalen
Partikeln
ergaben,
daß
die
Geschwindigkeit der Partikel proportional zum angelegten elektrischen Feld ist.
Man erhält somit die Formel:
v = µ ep ⋅ E
(8)v: Geschwindigkeit
E: Elektrische Feldstärke
wobei µep die elektrophoretische Mobilität der Partikel darstellt. Sie ist das Bindeglied
zwischen Geschwindigkeit und der elektrischen Feldstärke.
Zellen mit einer elektrischen Ladung bilden zwischen sich und der Lösung ein Potential
aus, das sogenannte Zeta-Potential ζ. Daraus folgt, daß ein Zusammenhang zwischen µep
und ζ besteht.
Smoluchowski erkannte, daß es sich hierbei um ein der elektroosmotischen
Beweglichkeit ähnlich gelagerten Problems handelt.
Daraus leitete er für die Geschwindigkeit v der Partikel in einem elektrischen Feld der
Stärke E folgenden Zusammenhang ab:
v=
ε0 εr ζ
η
E
(9)
εr: relative Dielektrizitätskonstante
η: Viskosität der Lösung
ζ: Zetapotential
beziehungsweise für die elektrophoretische Beweglichkeit:
µep =
22
ε 0 εr ζ
η
=
εζ
η
(10)
3. Theoretischer Teil
Diese Gleichungen gelten jedoch nur unter sehr idealisierten Bedingungen und basieren
auf folgenden Vereinfachungen [ 5 ] :
.
Das Partikel ( die Zelle ) ist kugelförmig, starr und nichtleitend.
.
Sein Radius ist größer als die Debye-Länge.
.
Die umgebende Flüssigkeit geht keinerlei Wechselwirkungen ein.
.
Das Zeta-Potential ist auf der ganzen Partikeloberfläche gleich.
Diese Bedingungen haben zur Folge, daß bei einem nichtleitenden, starren Partikel die
Ladung auf der Oberfläche lokalisiert sein muß. Dies ist jedoch für eine Zelle sehr
unwahrscheinlich, da es sich bei der Zellmembran um ein dynamisches System handelt,
welches sich laufend verändert, wodurch diese einfache Theorie unrealistisch wird.
3.5.2 Modell der polymerbeschichteten Partikel
Verschiedene Versuche wurden unternommen, um das klassische starre Kugelmodell
(Kapitel 3.5.1 ) zu verbessern [6-9]. In diesen Studien besteht eine Oberflächenschicht
aus einem geladenen Polymer, welches mit der Oberfläche eines festen Partikels
verbunden ist. Dieses Polymer ist ionendurchlässig, wodurch sich ein verbessertes
Modell für eine Zellstruktur ableiten läßt, da Zellen für ihre Permeabilität für Ionen und
Wasser bekannt sind. Hier beschränkt sich die Ladung nicht mehr auf die Oberfläche,
sondern befindet sich innerhalb einer Oberflächenschicht mit einer bestimmten Dicke dc
(vgl. Abb. 3.9).
Die Ladungen sollen gleichmäßig in der Membranschicht verteilt sein. Es entsteht somit
ein Potentialgefälle von der Oberflächenladungsschicht zur Lösung hin, welches
qualitativ der Form von Abb. 3.10 entspricht [5].
23
3. Theoretischer Teil
Abbildung 3.9
Abbildung 3.10
Bei Berücksichtigung dieser Eigenschaften des neuen Modells ergibt sich nach H.
Ohshima und T. Kondo [10] folgender
Zusammenhang zwischen Potential und
elektrophoretischer Beweglichkeit:
µep =
ε 0εr
η
ψDON
λ
km +
1 +1
λ
km
ψ( 0)
+
zeN
ηλ2
(11)
µep:
Elektrophoretische
Beweglichkeit
εr:
relative
Dielektrizitätskonstante
ε0:
mit
λ =
γ
η
Dielektrizitätskonstante
des Vakuums
km: 1 Debye Hückel Parameter
der Oberflächenladungsschicht
24
γ:
Reibungskoeffizient
η:
Viskosität
Ψ(0):
Grenzpotential Zelle-Lösung
ΨDON:
Donnanpotential
3. Theoretischer Teil
Für λ gegen unendlich erhält man als Grenzwert wieder die Smoluchowski-Gleichung:
µ = εrε0Ψ(0)/η
(12)
Für diesen Grenzfall wird die Reibung in der Oberflächenschicht unendlich groß, so daß
ein Lösungsmittelfluß innerhalb dieser Schicht bezüglich des Partikelkerns zu
vernachlässigen ist. Der Vorteil dieses Modells gegenüber dem von Smoluchowski liegt
darin, daß es durch die Einbeziehung einer ionischen Membran einer Zelle ähnlicher ist.
3.5.2.1 Das Donnan-Membranpotential [11]
Beim Donnan-Membran-Modell wird eine für kleine Ionen ( zum Beispiel Na+ und Cl- )
durchlässige
aber
für
undurchlässige
Proteine
Membran
angenommen (vgl. Abb. 3.11 ).
Beim
Modell
polymerbeschichteten
entspricht
diese
Grenzfläche
der
Partikel
Membran
der
Lösung-Oberflächen-
schicht und die undurchlässigen
Proteine
den
fest
gebundenen
funktionellen Gruppen.
Abbildung 3.11
Betrachtet man nun ein Beispiel mit durchlässigen Ionen, so erhält man ein
Gleichgewicht zwischen beiden Seiten: Die Natrium- und Chloridkonzentrationen
müssen auf beiden Seiten gleich sein:
c+´= c-´= c+´´ = c-´´
(13)
Am Voltmeter ist keine Potentialdifferenz zu messen.
25
3. Theoretischer Teil
Gibt man nun auf einer Seite ein Protein hinzu, so verändert sich die Situation
grundlegend: Das Produkt der permeablen Kationen und Anionen auf beiden Seiten
muß gleich sein:
c+´c-´= c+´´c-´´
(14)
(Donnan Gleichung)
In der Lösung ohne Protein gilt: c+´= c-´
(15)
Aus Gleichung 13 folgt somit:( c´ )2 = c+´´c-´´
(16)
Hat das Protein die Ladung zp und die Konzentration cp, so ergibt sich für die linke Seite
von Gleichung 16:
c-´´= zpcp + c+´´
(17)
Das daraus resultierende Membran-Donnanpotential E lautet nun :
E = Φ´- Φ´´ = RTln(c+´´/c´)/F = - RTln( c-´´/c´)/F
(18)
F: Faradaykonstante
T: Temperatur
R: Gaskonstante
3.5.3 Doppelschichtmodell von Nakano et. al. [12]
Das Modell nach Kapitel 3.5.2.1 setzt eine gleichmäßige Ladungsverteilung innerhalb
einer ionendurchlässigen Oberflächenschicht mit definierter Dicke voraus.
26
3. Theoretischer Teil
Untersuchungen von menschlichen roten Blutzellen bei verschiedenen Ionenstärken und
pH-Werten haben ergeben, daß mit diesem Modell eine gute Übereinstimmung der
theoretisch berechneten Werte und den Meßergebnissen im neutralen und basischen
Bereich erzielt wird [13]. Im sauren Bereich nimmt jedoch die elektrophoretische
Beweglichkeit mit abnehmender Ionenstärke des Puffers wieder ab (vgl. Abb. 3.12)
[12].
Dieser Effekt kann durch das Vorhanden
sein
von
protonierten
basischen
Gruppen im Inneren der Zellmembran
erklärt
werden
,
ungleichmäßige
verursachen.
welche
eine
Ladungsverteilung
Ähnliche
Ergebnisse
erhielt man bei Untersuchungen von
Lymphocyten bei Ratten [14] und von
polymorphonuclearen Leucocyten bei
Meerschweinchen [15].
Abbildung 3.12
Um dies befriedigend erklären zu können, muß man die äußere Zellschicht gedanklich
aufteilen: In eine Schicht mit negativer ( außen ) und eine Schicht mit positiver ( innen )
Gesamtladung.
Die
daraus
resultierende
Formel
für
die
elektrophoretische
Beweglichkeit [12] bestätigt die praktischen Ergebnisse für alle pH-Werte. Berechnet
man aber die Ladungsdichte im negativ geladenen Teil der Zellschicht, so stellt man
fest, daß diese laut Aussage des Modells mit zunehmendem pH-Wert abnehmen müßte,
was jedoch im krassen Gegensatz zur Praxis steht, da der Dissoziationsgrad der
Gruppen (unter anderem Carbonsäuren) mit steigendem pH Wert zunimmt:
Dissoziationsgleichgewicht.
27
3. Theoretischer Teil
3.5.4 Dreischichtmodell nach Nakano et. al. [12]
Um diesen Widerspruch zu beseitigen, hat Nakano et. al. [12] das Dreischichtmodell
entwickelt. Die Autoren gehen davon aus, daß sich zwischen der positiven und
negativen Schicht eine dritte befindet, die gleich viele positiv und negativ geladene
funktionelle Gruppen enthält, wodurch sie nach außen hin neutral ist (vgl. Abb. 3.13).
Die daraus resultierende Formel für die elektrophoretische Beweglichkeit [ 12 ] bestätigt
die experimentellen Daten im alkalischen,
neutralen, sowie auch im sauren Bereich
( analog zu 3.5.3 ). Zusätzlich stimmt nun die
Forderung, daß mit steigendem pH-Wert die
Ladungsdichte
in
der
negativen
Schicht
ansteigen muß, mit den theoretisch ermittelten
Werten
überein.
Weitere
Untersuchungen
haben ergeben, daß die innere positive Schicht,
bestehend
aus
basischen
Gruppen,
keine
gleichmäßige Ladungsverteilung hat, sondern
die basischen Gruppen abnehmen, je tiefer man
in die Zellmembran eindringt.
Abschließend
kann
gesagt
Abbildung 3.13
werden,
daß
zumindest
bei
Erythrocyten
das
Dreischichtmodell die beste Näherung zur Erklärung der Ladungsdichteverhältnisse für
die äußere Zellschicht darstellt, da dieses Modell selbst über einen großen pH- und
Ionenstärkebereich hinweg die Ladungsverteilung ausreichend beschreibt..
28
3. Theoretischer Teil
3.6 Zellspezifität
Zellen haben für ihren Zelltyp spezifische biophysikalische Eigenschaften [4], die auf
den unterschiedlichen Aufbau der Zellmembran zurückzuführen sind. Einer Änderung
dieser Eigenschaften geht eine Änderung der Zellmembran und deren Aufbau voraus,
was Auswirkungen auf die funktionellen Gruppen hat. Somit lassen sich zum Beispiel
erkrankte Zellen erkennen und elektrophoretisch isolieren.
Diese Anwendungsmöglichkeit ist unter anderem ein wichtiger Aspekt in der
Krebsforschung [16], sowie bei Erkennung von Krankheiten wie zum Beispiel
”Multiple Sklerose” [17-19].
Für eine erfolgreiche Bekämpfung von Krankheiten ist es notwendig, kranke Zellen
beziehungsweise Erregerzellen zu isolieren und zu analysieren. Die Elektrophorese ist
dabei ein geeignetes Instrument, welche beide Aufgaben verknüpfen kann.
Die Anwendung der Elektrophorese läßt sich im Prinzip auf jede Art von Zelltyp
erweitern, wie zum Beispiel Bakterien [20] und Viren [21]. Auf diesem Gebiet liegen
jedoch erst wenige Untersuchungen vor, da diese Applikationen bisher nur von
geringem Interesse waren.
29
3. Theoretischer Teil
3.7 Kapillarelektrophorese
Die Innenwand von Quarzkapillaren trägt wie fast alle Oberflächen eine Ladung.
Ähnlich wie in Kapitel 3.5 entsteht diese Ladung durch Deprotonierung von
oberflächengebundenen Gruppen, hier endständige Silanolgruppen. Die Oberfläche der
Kapillarinnenseite lädt sich also negativ auf, während sich die Lösung in der näheren
Umgebung der Oberfläche durch das Gegenion positiv auflädt: Es bildet sich eine
elektrische Doppelschicht aus. Auf Grund der räumlichen Trennung der Ladungen bildet
sich ein Potential (ζ-Potential) aus. Legt man nun ein elektrisches Feld an, so werden
die freien Gegenionen der deprotonierten Silanolgruppen nach Gleichung 2 zur
Kathode gezogen. Da die negative Ladung auf der Oberfläche fixiert ist, erfolgt eine
Effektivwanderung von positiven Ladungsträgern zur Kathode. Da die Protonen sehr
stark solvatisiert sind, wandern nicht nur die Protonen allein, sondern das
solvatisierende Wasser, sprich der komplette Puffer wandert Richtung Kathode:
Elektroosmotischer Fluß EOF [22,23].
Für die elektroosmotische Geschwindigkeit gilt die Helmholtz-Gleichung [23,24]:
v eo =
ε ⋅ E ⋅ζ
4 π⋅η
(19)
veo : elektroosmotische Geschwindigkeit
ε
: Dielektrizitätskonstante des Puffers
η : Viskosität des Puffers
E : Feldstärke
Anders wie bei geladenen Teilchen geht hier also nicht direkt die Ladung in die
Geschwindigkeitsgleichung ein, s. 3.4, sondern das daraus resultierend Potential ζ. Es
ist also nicht unbedingt eine konkrete Oberflächenladung notwendig, um einen EOF zu
erhalten, sondern es genügt ein Potential, wie z.B. die Oberflächenspannung. Deshalb ist
es nicht weiter verwunderlich, daß selbst Teflon-Kapillaren einen EOF besitzen, obwohl
hier keine endständigen funktionellen Gruppen vorhanden sind, welche durch
Dissoziation eine Ladung erzeugen können [25].
30
3. Theoretischer Teil
Der von der elektrischen Feldstärke unabhängige Term nennt sich elektroosmotische
Beweglichkeit. Man erhält ihn, indem die elektroosmotische Fließgeschwindigkeit
durch die elektrische Feldstärke dividiert wird:
µ eo =
v eo ε ⋅ζ
=
E 4π ⋅η
(19a)
Gegenüber herkömmlichen Elektrophoresemethoden hat die Kapillarelektrophorese CE
den Vorteil, daß durch den geringen Kapillardurchmesser eine gute Ableitung der
erzeugten Joul´schen Wärme erfolgt. Dies ermöglicht ein Arbeiten mit starken
elektrischen Feldern, was sich in einer deutlich verkürzten Analysenzeit manifestiert.
Hinzu kommt, daß durch den EOF ein stempelförmiges Strömungsprofil, das
sogenannte „plug“ Profil entsteht. Dadurch wird die durch das Strömungsprofil
verursachte Bandenverbreiterung minimiert. Deshalb lassen sich in der CE Bodenzahlen
erreichen, die ein bis zwei Größenordnungen höher sein können als bei der HPLC
(parabolisches Strömungsprofil).
31
III
Experimenteller
Teil
34
4.1 Verwendete Bakterienstämme
4.1 Verwendete Bakterienstämme
4.1.1 Beschreibung der Bakterien
4.1.1.1 Pseudomonas spezies (DSM 1749, 6708, 6537, 1110,
2583, 5536) [26,27]
Pseudomonas stammt aus dem Griechischen und heißt übersetzt soviel wie "falsche
Einheit/Monade".
Die Pseudomonaden stellen eine große und wichtige Gruppe in der Natur dar.
Mitglieder aus ihrer Gruppe sind in Boden, Trinkwasser, der marinen Umgebung und
vielen anderen natürlichen Materialien zu finden. Sie zeichnen sich durch die Fähigkeit
aus, organische Materie abzubauen und in Mineralstoffe umzuwandeln. Sie sind
ebenfalls Bestandteil der Mikroflora, welche für das Verderben von Nahrung
verantwortlich ist.
Die Pseudomonaden gehören zur Gruppe der Gram-negativen Bakterien.
Sie sind aerob und atmungsaktiv, das heißt, sie verbrauchen Sauerstoff. Ein
Metabolismus, welcher auf Gärung basiert, ist nicht vorhanden. Ihr Temperaturbereich,
in dem Wachstum zu verzeichnen ist, erstreckt sich von 4 - 42 oC. Ebenso benötigen sie
einen pH-Bereich, der im alkalischen oder im neutralen liegt. Im sauren Medium erfolgt
kein Wachstum.
Die Pseudomonaden bilden gerade oder leicht gebogene Stäbchen mit einem
Durchmesser von 0,5-1,0 µm und einer Länge von 1,5-5,0 µm.
Eine oder mehrere polare Geißeln ermöglichen ihnen eine gewisse Beweglichkeit.
Als Nahrungsquelle können diverse C-Quellen dienen. Ein Ruhestadium ist nicht
existent.
Die Bezeichnung "spezies"
bedeutet, daß diese Bakterien zur Gruppe der
Pseudomonaden gehören. Eine Zuordnung zu einer bestimmten Pseudomonadenart ist
jedoch nicht möglich.
35
4.1 Verwendete Bakterienstämme
4.1.1.2. Pseudomonas putida (DSM 548, 50222)
Hierbei handelt es sich um eine Untergruppierung der Pseudomonaden. Der Name
"putida" stammt aus dem Lateinischen und heißt übersetzt so viel wie “stinkend”. Die
Bakterien heißen also wörtlich übersetzt "stinkende, unechte Einheit". Sie wurden unter
anderem in Blut und bei postoperativen Infektionen entdeckt. Ihre idealen
Wachstumsbedingungen erstrecken sich über einen Temperaturbereich von 25-32 oC .
Sie besitzen mindestens zwei polare Geißeln. Ihr Hauptunterschied zu den anderen
Unterarten der Pseudomonaden beruht auf den unterschiedlichen physiologischen und
ernährungsbedingten Eigenschaften. Diese unterschiedlichen Verhaltensweisen werden
unter anderem zur Identifizierung einer Bakterienart verwendet.
4.1.1.3 Rhodococcus erythropolis (DSM 1069)
"Rhodococcus" stammt aus dem Griechischen und heißt soviel wie „rotes Korn“.
"Erythropolis", ebenfalls aus dem Griechischen, bedeutet "rote Stadt".
Wie aus dem Namen hervorgeht, bilden die Rhodococcen auf Glukose-HefeextraktAgarböden orange bis rote Kolonien. Sie kommen im Boden vor und haben eine
optimale Wachstumsrate bei 30oC.
Die Zellen können sowohl rund als auch gering stäbchenförmig sein. Sie bilden lange,
stark verzweigte faserartige Ketten. Die runden Zellen können lediglich zu Stäbchen
werden. Diese bilden dann die Fasern mit seitlichen Verzweigungen. Die nächste
Generation der kugel- bzw. stäbchenförmigen Zellen entsteht durch Spaltung der
Stäbchen bzw. der Fasern. Im Gegensatz zu den obigen Stämmen sind die Rhodococcen
Gram-positiv und unbeweglich aber ebenfalls aerob.
36
4.1 Verwendete Bakterienstämme
4.1.1.4 Micrococcus luteus (DSM 20030)
Micrococcus stammt aus dem Griechischen und heißt soviel wie „kleines Korn“.
Wie der Name schon andeutet handelt es sich hier um kleine “Kugeln” mit einem
Innendurchmesser von 0,9-1,8 µm. Sie bilden keine Sporen und sind unbeweglich. Es
handelt sich hierbei um eine Gram-positive, aerobe Bakterienart. Sie bilden gelbe,
glänzende und konvexe Kolonien. Ihre optimale Wachstumstemperatur beträgt 25-37°
C.
Sie kommen im Boden, Sand, Staub, Meer- und Frischwasser, in Pflanzen, Fleisch- und
Milchprodukten und auf der Haut von Säugetieren vor. Sie sind bei etwa 90 % aller
Menschen auf der Hautoberfläche zu finden.
Teilweise werden Micrococcen zu Fleischprodukten zugesetzt, um deren Farbe,
Geschmack und Haltbarkeit zu verbessern (“Micrococcus varians”)
“Micrococcus luteus“ wurde zur Erforschung von Antibiotika verwendet, wie z.B.
Penicillin G, Novobiocin und Chlortetracyclin.
4.1.1.5 Serratia ficaria (DSM 4569)
Hierbei handelt es sich um Gram-negative Stäbchen. Peritriche Geißeln ermöglichen
den Zellen eine gewisse Beweglichkeit. Sie gehören zu der Familie der
Enterobacteriaceae und bilden farblose Kolonien. Isoliert wurden sie aus dem Boden
und kommen auch im menschlichen Darm vor.
4.1.1.6 Paracoccus denitrificans (DSM 65)
Der Name Paracoccus stammt ebenfalls aus den Griechischen und bedeutet soviel wie
“wie ein Korn”.
Diese Bakterien bilden kleine “Kugeln” mit einem Durchmesser von 1,1-1,3 µm, treten
einzeln oder paarweise auf, sind Gram-negativ, aerob und nicht beweglich. Zudem
besitzen sie weder eine Rastphase noch Pigmente. Paracoccen bilden 2-3mm große,
runde, glatte, an der Oberfläche glänzende, weißlich trübe Kolonien.
37
4.1 Verwendete Bakterienstämme
Die Zellen sind zu anaerobem Wachstum auf Nitratböden befähigt, daher der Name
“denitrificans”. Zudem sind sie fakultativ methylotroph.
Besonders bemerkenswert ist ihr Vermögen, sich sehr gut an die Umweltbedingungen
anzupassen.
4.1.1.7 Sphingomonas spezies (DSM 6014)
Auf Grund ihrer großen Ähnlichkeit mit den Pseudomonaden. wurden sie oftmals mit
diesen verwechselt. Da sie teilweise erst sehr spät entdeckt wurden, kam es in den
letzten Jahren immer wieder zu Umbenennungen der einzelnen Spezies.
Die Sphingomonaden bilden kurze Stäbchen mit einer Länge von 1-3 µm. Entgegen
mancher Pseudomonaden sind sie unbeweglich.
4.1.2 Vermehrung der Bakterien [28]
a) Vollmedium
Pepton, aus tryptisch verdautem Sojamehl
Hefeextrakt
0,1 g
mit Wasser auf 100 mL auffüllen
pH = 7
38
3g
4.1 Verwendete Bakterienstämme
b) Mineralmedium für Pseudomonaden
Na2HPO4
2,44 g
KH2PO4
1,52 g
(NH4)2SO4
0,5 g
MgSO4*7 H2O
0,2 g
CaCl2*2 H2O
0,005 g
Spurenelementlösung SL-4
10,0 mL
Destilliertes Wasser
ad
1000,0 mL
Anschließend wird der pH mit 1 M NaOH auf 6,9 eingestellt.
Spurenelementlösung SL-4:
EDTA
0,5 g
FeSO4*7 H2O
0,2 g
Spurenelementlösung SL-6
100,0 mL
Destilliertes Wasser
900,0 mL
Spurenelementlösung SL-6:
ZnSO4*7 H2O
0,1 g
MnCl2*4 H2O
0,03 g
H3BO3
0,3 g
CoCl2*6 H2O
0,2 g
CuCl2*2 H2O
0,01 g
NiCl2*6 H2O
0,02 g
Na2MoO4*2 H2O
0,03 g
Destilliertes Wasser
ad
1000,0 mL
39
4.1 Verwendete Bakterienstämme
c) Nährmedium für Rhodococcus erythropolis
KH2PO4
0,4 g
K2HPO4
1,6 g
NH4NO3
0,5 g
MgSO4* 7H2O
0,2 g
FeCl3*6 H2O
0,025 g
Hefeextrakt
0,1 g
Destilliertes Wasser
ad
900,0 mL
Eine eventuell trübe Lösung wurde filtriert.
Die Nährmedien wurden bei 120oC 20 Minuten sterilisiert. Medium b) und c) wurde
1mg Glucose auf 1mL Nährlösung als C-Quelle zugesetzt. Nach dem Beimpfen der
Medien mit Reinkulturen wurden diese 2-3 Tage bei 30oC unter ständigem Schütteln
hochgezüchtet.
Anschließend wurden sie bis zur weiteren Verarbeitung bei 4oC im Kühlschrank
aufbewahrt.
Außer “Rhodococcus erythropolis” wurden alle Bakterien, soweit nicht anders
angegeben, mit dem Vollmedium angezüchtet.
4.1.3 Herstellung der Zellsuspension
1 mL der Bakterien-Nährsuspension wurde in ein 10 mL Zentrifugenglas überführt und
mit Puffer auf 5 mL aufgefüllt, durchmischt und bei ca. 8000 U/min zentrifugiert (4
Minuten). Der Überstand wurde verworfen und zu den Bakterien weitere 5 mL Puffer
zugegeben. Sehr wichtig war hierbei die anschließende Resuspendierung der Bakterien.
Einfaches Schütteln genügte nicht, da die Bakterien durch die Zentrifugation ein relativ
festes Konglomerat bildeten. Als sehr praktisch hat sich hierbei die Resuspendierung
mittels Pasteurpipette erwiesen. Dabei wurde das Bakterien-Puffer Gemisch durch
wiederholtes Einsaugen in die Pasteurpipette und anschließendem Herausdrücken sehr
40
4.1 Verwendete Bakterienstämme
gut homogenisiert. Gebildeter Schleim wurde dabei von den Zellen entfernt. Die
Suspension wurde wiederum zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen in 2
mL Puffer aufgenommen und resuspendiert. Die so entstandene Suspension enthält in
etwa 109 Zellen/mL Puffer.
41
4.2 CE-Apparatur
4.2 CE-Apparatur
Für diese Arbeit wurde ein Gerät eigener Konstruktion verwendet.
Besonders von Vorteil ist hierbei die Möglichkeit, Kapillaren mit verschiedenen
Durchmessern zu verwenden. Vor allem dickere Kapillaren bereiten kommerziell
erhältlichen Geräten Probleme, da diese in der Regel nur für relativ geringe
Kapillarinnendurchmesser ausgelegt sind (50-75 µm).
Von Vorteil ist auch die Flexibilität und leichte Handhabbarkeit des Aufbaus, um
schnell
Kapillaren
und
Puffergemische
wechseln
zu
können.
Durch
die
Höhenverstellbarkeit der einzelnen Vorratsgefäße, können kleine hydrostatische Drucke
relativ einfach und genau erzeugt werden (vgl. Abb. 4.1).
Die Konditionierung der Kapillare erfolgt durch Anlegen von Druck auf die
Vorratsgefäße. Während des CE-Betriebs dienen die Anschlüsse als Druckausgleich.
-
+
Abb.4.1: Schematische Darstellung der CE-Anlage [29]
Als Spannungsversorgung wurde ein High Voltage Power Supply Gerät Typ 890-CE der
Firma Jasco verwendet.
Als Schreiber diente ein Merck-Integrator.
42
4.2 CE-Apparatur
4.2.1 Detektion
Als Detektor wurde ein UV/VIS Detektor des Typs CE-975 der Firma Jasco verwendet.
Standardmäßig wird in der Mikrobiologie zur Bestimmung der Zellzahl (Zelltrübung)
eine Detektion bei einer Wellenlänge von ca. 600 nm durchgeführt. Dabei wird die
durch Streueffekte verursachte Lösungstrübung bestimmt. Bei dieser Wellenlänge findet
keine Lichtabsorption statt. Allerdings ist diese Methode bei Verwendung von
Kapillaren viel zu unempfindlich (zu geringe Schichtdicke der Lösung).
Bei sämtlichen optischen Meßverfahren, in der die Absorption eine Rolle spielt, gilt das
Lambert Beersche Gesetz [30]:
E = ε ⋅l⋅c
(20) E: Extinktion
ε: Extinktionskoeffizient
l: Schichtdicke
c: Konzentration
Da in der CE die Schichtdicke sehr gering ist (l = Schichtdicke der Kapillare), muß der
Extinktionskoeffizient nach Möglichkeit maximiert werden. Um eine ausreichende
Absorption der Zellen zu gewährleisten, sollte die Detektionswellenlänge im
Absorptionsmaximum der Bakterien liegen. Hierzu wurden für die verschiedenen
Bakterienarten UV-Spektren im Bereich von 190-600 nm angefertigt. Die Spektren der
einzelnen Bakterien sind nahezu identisch: Sie besitzen bei 205-210 nm ein Maximum
und bei ca. 260 nm eine kleine Schulter. Mit zunehmender Wellenlänge nimmt die
Absorption kontinuierlich ab. Das Maximum kommt durch Absorption des Lichts durch
Peptidbindungen, welche u.a. Bausteine der Zellwand sind, s. Kapitel 3.1.2.3, zustande.
Je nach Zusammensetzung der Zellen mit verschiedenen Peptideinheiten, kann sich das
Maximum um ein paar Wellenlängeneinheiten verschieben. Um jedoch alle Zellen
möglichst nahe am Absorptionsmaximum zu detektieren, erfolgt die Detektion im
gemittelten Maximum bei 208 nm. Eine Detektion bei dieser Wellenlänge stellt große
Anforderungen
an
die
"Reinheit"
der
verwendeten
Lösungen.
Kleinste
Verunreinigungen können starke Störungen bei der Detektion verursachen, da bei dieser
Wellenlänge eine Vielzahl von Komponenten Licht absorbieren. Abb. 4.2 zeigt
43
4.2 CE-Apparatur
stellvertretend für die verwendeten Bakterien das UV-Spektrum von “Pseudomonas
spezies” DSM 5536.
Abbildung 4.2: UV-Spektrum von “Pseudomonas spezies” DSM 5536
Vergleiche von Bakterien mit und ohne UV-Detektion haben ergeben, daß die
Bestrahlung der Bakterien mit UV-Licht während der Detektion keine meßbar negativen
Auswirkungen auf die Zellen erzeugt.
44
4.2 CE-Apparatur
4.2.2 Kapillaren
Verwendet wurden fused-silica Kapillaren der Firma MicroQuarz.
Nach
Lambert
Beer
sollte
für
eine
empfindliche
Detektion
der
Kapillarinnendurchmesser möglichst groß sein, siehe Gleichung 20. Andererseits führt
dies zu einer verstärkten Joul´schen Erwärmung, bzw. zu einer schlechteren Ableitung
der Wärme über die Kapillarwand nach außen, s. Kapitel 4.3.
AU
50 µm i.D.
75 µm i.D.
100 µm i.D.
Zeit
Abbildung 4.3: Vergleich der Peakform der Spezies “Pseudomonas spezies DSM 6537” in Abhängigkeit
des Kapillardurchmessers, bei gleicher Zellkonzentration.
Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mMol, Injektion I = 10 kV*5s .
Deshalb muß eine Optimierung des Kapillarinnendurchmessers als Kompromiß
hinsichtlich Extinktion und Erwärmung erfolgen. Allerdings ist der Durchmesser nicht
beliebig reduzierbar, da bei den Zellen zusätzlich zum Lambert Beer`schen Gesetz ein
weiterer Effekt von Relevanz ist.
45
4.2 CE-Apparatur
Zhu und Chen beschrieben diesen Effekt am Beispiel von Erythrocyten (Durchmesser 8
µm) [25]: Eine Detektion war nur bei Verwendung von ≥ 0,45 mm i.D. Kapillaren
möglich.
Aus unseren Untersuchungen wird deutlich, daß bei verwendeten Bakterien mit einem
Durchmesser von ca. 1 µm ein Kapillardurchmesser von 75 µm oder größer notwendig
ist, um eine Detektion der Zellen zu ermöglichen. Bei Verwendung von Kapillaren mit
einem Innendurchmesser von 50 µm ist keine Detektion mehr möglich (vgl. Abb4.3).
Die Ursache hierfür ist noch unklar. Eine Wechselwirkung der Bakterien mit der
Kapillaroberfläche ist jedoch sehr wahrscheinlich.
4.2.2.1 Konditionierung
Vor jeder Messung mußte die Kapillare konditioniert werden, um möglichst
reproduzierbare Ausgangsbedingungen zu gewährleisten: Die Kapillare wurde jeweils 3
Minuten mit 0,2 M Natronlauge und anschließend mit Puffer gespült. Der dazu
verwendete Spüldruck wurde in Abhängigkeit des Kapillarinnendurchmessers und der
Kapillarlänge variiert. Der Fluß wurde dabei in etwa auf eine Kapillarlänge pro Minute
eingestellt. Zur Konditionierung einer Kapillare der Länge 111 cm und 75 µm I.D. war
ein Druck von 1,5 bar notwendig.
Da überwiegend sehr verdünnte Puffersysteme verwendet wurden, wurde der Puffer
nach jeder Messung komplett erneuert.
4.2.2.2 Thermostatisierung der Kapillaren
Bei einigen Untersuchungen wurde mittels Preßluft ein Luftstrom innerhalb der CEApparatur erzeugt, wodurch eine verbesserte Wärmeableitung von der Kapillare erreicht
werden konnte. Dabei handelt es sich allerdings um keine echte Thermostatisierung,
sondern es wurde jeweils bei der entsprechenden Raumtemperatur gearbeitet.
46
4.2 CE-Apparatur
4.2.3 Injektion
Die Injektion kann auf 2 Methoden erfolgen:
• Hydrodynamische Injektion durch Anheben des Inlet-Vials
• Elektrokinetische Injektion
Bei elektrokinetischer Injektion ist mit einer Diskriminierung der Zellen zu rechnen, da
diese bei angelegter Spannung eine Eigenbewegung in Richtung Kathode aufweisen und
somit dem Injektionsfluß entgegenwirken. Da allerdings keine Quantifzierungen
durchgeführt wurden ist dieser Effekt vernachlässigbar.
Die hydrodynamische Injektion erfolgt manuell, die elektrokinetische Injektion wird
automatisch mittels Timer durchgeführt. Bei einer elektrokinetischen Injektion ist die
Länge des Injektionspfropfens bei konstanten Injektionsbedingungen unabhängig vom
Kapillarinnendurchmesser bei gleicher Kapillaroberflächenbeschaffenheit. Bei der
hydrodynamischen Injektion ist allerdings die Länge des Injektionspfropfens bei
gleichen Injektionsbedingungen (Injektionszeit, hydrodynamischer Druck) stark
abhängig vom Kapillarinnendurchmesser: Je größer der Querschnitt, desto geringer ist
der Reibungswiderstand und desto länger wird der Injektionspfropfen. Um eine gute
Reproduzierbarkeit der Injektion zu gewährleisten, wurde eine elektrokinetische
Injektion der hydrodynamischen vorgezogen.
Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Injektion elektrokinetisch bei 10 kV * 5s
Um die Probe zu injizieren, muß zuvor das Puffervorratsgefäß von der Kammer
entfernt, das Vial ausgetauscht und das Vorratsgefäß wieder befestigt werden.
Das hierzu verwendete Gewinde schließt bereits nach ca. 2 Umdrehungen luftdicht ab.
Ein Luftvolumen im Innenraum von ca 7 mL muß nun verdrängt werden, da das
Puffervorratsgefäß wie ein Stempel nach oben drückt. Die Luft kann allerdings lediglich
über den Gasanschluß entweichen. Da die Bohrung nur etwa 1mm beträgt, kann die Luft
selbst beim Entfernen des Gasanschlusses nicht schnell genug entweichen. Die Folge ist
ein kurzfristiger Überdruck, der sich in der Kammer aufbaut, wodurch vorzeitig Probe
in die Kapillare injiziert wird.
Die dadurch injizierte
Menge beträgt ungefähr das 10-fache des sonst üblichen
Injektionsvolumens.
47
4.2 CE-Apparatur
Ist der Flüssigkeitsspiegel im Vial so niedrig, daß zu Beginn des Anschraubens die
Kapillare noch nicht in die Flüssigkeit eintaucht, so wird sogar Luft injiziert, wodurch
eine Versuchsdurchführung unmöglich wird. Umgekehrt entsteht beim Abschrauben ein
Unterdruck wodurch eine bereits injizierte Probe wieder aus der Kapillare
herausgezogen wird. Deshalb wurde an der Kammer seitlich eine zusätzliche,
verschließbare Bohrung mit einem Durchmesser von 6 mm angebracht, damit ein
nahezu ungehinderter Druckausgleich stattfinden kann.
48
4.3 Temperatureffekte in der CE
4.3 Temperatureffekte in der CE
4.3.1 Wärmeerzeugung, Temperaturverteilung
Fließt in einem elektrischen Leiter Strom, so erwärmt sich dieser. Ursache dafür ist der
innere Widerstand, welcher elektrische Energie in Wärme umwandelt. Für eine nicht
gepackte, mit Puffer gefüllte Kapillare läßt sich die erzeugte Wärmemenge nach
folgender Gleichung berechnen:[31]
Q=E 2 ⋅λ⋅c
(21)
Q: Wärmemenge pro Volumeneinheit
E: Elektrische Feldstärke
λ: Molare Leitfähigkeit des Puffers
c: Konzentration des Puffers
Für E = 54450 V/m (U = 30 kV, L = 66 cm) λ = 0,015 m2/mol Ω und c = 10 mM ergibt
sich somit eine erzeugte Wärmemenge von Q = 300 W/cm3. Diese Wärme wird nun
über die Kapillarwand nach außen abgegeben [31-33]. In Abb. 4.4 ist ein solcher
Temperaturabfall schematisch dargestellt. Im Inneren der Kapillare ist ein parabolisches
Temperaturprofil zu erkennen. Der Temperaturabfall selbst ist hier jedoch relativ gering
und liegt in der Regel unterhalb von 1 Kelvin. Der Temperaturabfall innerhalb der
Kapillarwand aus Quarz ist ebenfalls sehr gering. Erst in der Luft ist ein starker
Temperaturabfall zu beobachten, da Luft eine deutlich geringere Wärmeleitfähigkeit als
die beiden anderen Phasen besitzt und somit eine rasche Ableitung der Wärme
verhindert.
Es kommt also zu einem Wärmestau innerhalb der Kapillare, wodurch sich die
Innentemperatur erhöht. Diese Temperaturerhöhung Θ läßt sich quantitativ nach Knox
berechnen [31]:
log(Θ / K) = 1,70 log(d c / µm) + log(Q /
W
) − 4,2
cm 3
(22)
49
4.3 Temperatureffekte in der CE
Abbildung 4.4: Halbquantitative Darstellung des Temperaturprofils quer zur Kapillare, dessen
Pufferinhalt durch einen elektrischen Stromfluß erwärmt wurde.
Abbildung 4.5: Abhängigkeit des Temperaturanstiegs im Inneren einer Kapillare
Kapillarinnendurchmesser für verschiedene Wärmemengen mit natürlicher Konvektion [31].
50
vom
4.3 Temperatureffekte in der CE
Dabei hängt die Temperaturerhöhung sowohl von der erzeugten Wärmemenge Q als
auch vom Kapillarinnendurchmesser dc ab. In Abb. 4.5 ist der Temperaturanstieg in
Abhängigkeit
des
Kapillarinnendurchmessers
für
verschiedene
Wärmemengen
dargestellt [31].
Dabei wird deutlich, daß Temperaturerhöhungen von 50 K sehr schnell erreicht werden
können. Da die erzeugte Joul´sche Wärme proportional zum Quadrat der Feldstärke ist,
erfolgt im Vergleich zur Feldstärke auch ein überproportionaler Anstieg der Temperatur
im Kapillarinneren.
In Abb. 4.6 ist der Temperaturanstieg in Abhängigkeit der Feldstärke für eine Kapillare
mit 0,25 mm I.D. bei verschiedenen Pufferkonzentrationen dargestellt.
35
35
2 mM
Temperaturerhöhung [K]
30
5 mM
25
30
25
10 mM
20
20
15
1 mM
15
10
10
5
5
0
0
0
100
200
300
400
Feldstärke [V/cm]
Abbildung 4.6:Temperaturerhöhung in der Kapillare in Abhängigkeit der Feldstärke bei verschiedenen
Pufferkonzentrationen. Kapillare: 250 µm I.D., L = 66 cm,
Puffer: Phosphat pH 7
Der gut erkennbare parabelförmige Anstieg der Temperatur geht mit Gleichung 21 und
22 konform. Wie bereits erwähnt, kann hier ein relativ schneller Temperaturanstieg im
zweistelligen Bereich erreicht werden. Dies kann vor allem auf Bakterien, welche sich
im Inneren der Kapillare befinden, gravierende Auswirkungen haben. Wie in Kapitel 4.4
gezeigt werden wird, sind Bakterien in der Pufferzellsuspension stark thermolabil.
Durch Erwärmen der Kapillare kann es vermehrt zur Zerstörung der Zellen kommen.
51
4.3 Temperatureffekte in der CE
Einen ähnlichen Kurvenverlauf wie in Abb. 4.6 erhält man bei Betrachtung der
Stromstärke in Abhängigkeit der Feldstärke (vgl. Abb. 4.7).
200
200
Stromstärke [µA]
10 mM
5 mM
2 mM
150
150
100
100
50
50
1 mM
0
0
0
100
200
300
400
Feldstärke [V/cm]
Abbildung 4.7: Abhängigkeit der Stromstärke von der Feldstärke
Pufferkonzentrationen. Kapillare: 250 µm I.D., L = 66 cm, Puffer: Phosphat pH 7
bei
verschiedenen
Der klassische lineare Verlauf des ohm´schen Gesetzes (Gleichung 23) hat nur bei sehr
geringen Feldstärken Gültigkeit. Mit steigender Feldstärke steigt die Stromstärke
überproportional an.
Ohm´sches Gesetz:
U = R⋅I
(23)
Durch die Erwärmung wird die Diffusionskonstante der Puffer-Ionen erhöht, woraus
eine höhere Stromstärke resultiert (vgl. Diffusionsgrenzstrom beim Polarogramm [30]).
Eine erhöhte Stromstärke verursacht eine verstärkte Erwärmung. Diese wiederum wirkt
sich auf die Stromstärke aus, usw.. Daraus resultierend nimmt die Stromstärke mit
zunehmender Feldstärke immer schneller zu.
Wird nun die Temperaturerhöhung in Relation zur Stromstärke gesetzt, erhält man einen
nahezu linearen Verlauf (vgl. Abb. 4.8). Dies verdeutlicht den bereits beschriebenen
Effekt und den engen Zusammenhang zwischen Erwärmung und Stromanstieg.
52
4.3 Temperatureffekte in der CE
Gleichzeitig wird deutlich, daß für Gleichung 23 der Widerstand R keine Konstante
(lineares U-I-Diagramm), sondern eine Funktion in Abhängigkeit der Temperatur ist.
35
35
2 mM
Temperaturerhöhung [K]
30
25
30
25
1 mM
5 mM
20
20
10 mM
15
15
10
10
5
5
0
0
50
100
150
0
200
Stromstärke [µA]
Abbildung 4.7: Temperaturanstieg in der Kapillare in Abhängigkeit der Stromstärke bei verschiedenen
Pufferkonzentrationen. Kapillare: 250 µm I.D., L = 66 cm,
Puffer: Phosphat pH 7
Wird der Kapillardurchmesser und die elektrische Feldstärke verringert, so verringert
sich automatisch auch die Erwärmung der Kapillare. Wird eine Kapillare mit L = 111
cm und 75 µm I.D. und ein Phosphatpuffer (c = 10 mM) verwendet, so beträgt der
Temperaturanstieg nach Gleichung 21 und 22 bei einer angelegten Spannung von 30
kV ca. 10 K.
Bei einem Innendurchmesser von 250 µm würde die Temperaturerhöhung bei gleichen
Bedingungen 82 K betragen, was jedoch nur noch von theoretischer Bedeutung ist, da
diese Messung nicht mehr durchführbar wäre.
Voraussetzung für diese quantitativen Betrachtungen ist eine Wärmeableitung auf
Grund der natürlichen Konvektion. Durch Belüftung kann die Erwärmung der Kapillare
vermindert werden (Thermostatisierung).
53
4.3 Temperatureffekte in der CE
4.3.2 Temperaturabhängigkeit der elektroosmotischen
Mobilität
Die elektroosmotische Mobilität sollte definitionsgemäß von der elektrischen Feldstärke
unabhängig sein (Gleichung 19a). Betrachtet man Abb. 4.9, so ist eine deutliche
Zunahme der Mobilität bei ansteigender Spannung bzw. elektrischer Feldstärke zu
µeo [10 -4cm 2/Vs]
erkennen.
11,0
11,0
10,5
10,5
10,0
10,0
9,5
9,5
9,0
9,0
8,5
8,5
8,0
8,0
15
20
25
30
Spannung [kV]
Abbildung 4.9: Zunahme der elektroosmotischen Mobilität in Abhängigkeit der angelegten Spannung.
Kapillare: 150 µm, Lges = 111 cm, Leff = 100 cm,
Puffer: Phosphat pH 7, c = 5 mM
Ursache ist wiederum die Wärmeentwicklung: Die Erwärmung des Puffers führt zu
einer Verringerung der Viskosität. Diese verhält sich jedoch nach Gleichung 19a
umgekehrt proportional zur elektroosmotischen Mobilität. Dies hat zur Folge, daß bei
einer Verringerung der Viskosität zwangsläufig die Mobilität zunehmen muß. Dieser
Effekt kann durch Verwendung von Kapillaren mit geringen Innendurchmessern und
zusätzlicher Thermostatisierung der Apparatur minimiert werden. In Abb. 4.10 ist
deutlich der Einfluß der Thermostatisierung auf den oben beschriebenen Effekt zu
erkennen: Wird die Kapillare thermostatisiert, so verringert sich deutlich der Einfluß der
angelegten Spannung auf die Mobilität. In diesem Beispiel war unterhalb einer
54
4.3 Temperatureffekte in der CE
Spannung von 20 kV (E = 180 V/cm) die elektroosmotische Mobilität konstant, wie es
11
11
10
10
9
9
8
8
7
7
-4
2
µeo [10 cm /Vs]
nach Gleichung 19a der Fall sein sollte.
6
6
10
15
20
25
30
Spannung [kV]
Abbildung 4.10: Vergleich der Zunahme der elektroosmotischen Mobilität in Abhängigkeit der
angelegten Spannung für natürliche Konvektion (.....) und Thermostatisierung (_____).
Kapillare: 150 µm, Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, Puffer: Phosphat pH 7, c = 5 mM
4.3.3 Temperaturabhängigkeit der elektrophoretischen
Mobilität
Analog zur elektroosmotischer Mobilität wird die EM von der Viskosität des Puffers
beeinflußt. Vor allem bei großen Kapillarinnendurchmessern steigt die EM mit
zunehmender Pufferkonzentration wieder an [34]. Dieser Effekt konnte bei dünnen
Kapillaren nicht beobachtet werden und ist daher sehr wahrscheinlich auf eine verstärkte
Erwärmung des Puffers in der Kapillare zurückzuführen. In Abb. 4.11 ist deutlich zu
erkennen, daß dieser Effekt durch Belüftung der Apparatur minimiert werden kann.
55
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
-4
2
µem [10 cm /Vs]
4.3 Temperatureffekte in der CE
2,0
2,0
0
1
2
3
4
5
Konzentration [mM]
Abbildung 4.11: Vergleich der elektrophoretischen Mobilität von “Pseudomonas spezies 6537” in
Abhängigkeit der Pufferkonzentration für natürliche Konvektion
(.....) und Thermostatisierung (____).
Kapillare: 150 µm, Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, Puffer: Phosphat pH 7; U = 30 kV
56
4.4 Stabilität
4.4 Stabilität
4.4.1 Stabilität der Zellsuspension
Die Stabilität der Zellen im Meßpuffer ist stark begrenzt. Auf Grund der geringen
Pufferkonzentration wirken starke Kräfte, verursacht durch den osmotischen Druck, an
der Zellwand, so daß mit abnehmender Pufferkonzentration vermehrt Zellen zerstört
werden. Andererseits verursachen erhöhte Pufferkonzentrationen eine verstärkte
Wärmeentwicklung. Der daraus resultierende Temperaturanstieg kann sich ebenfalls
negativ auf die Stabilität der Zelle auswirken. Daher galt es, zusätzlich zur
Konzentrationsabhängigkeit auch den Einfluß der Lagertemperatur der Zellsuspension
zu untersuchen.
4.4.1.1 Kühlung der Zellsuspension
Auf Grund der geringen Stabilität der Zellen im Meßpuffer war die Herstellung frischer
Zellsuspensionen
erforderlich.
Abb.
4.12
zeigt
den
zeitlichen
Verlauf
der
Destabilisierung der Zellsuspension, bzw. die daraus resultierenden Peakveränderungen.
Erste Anzeichen einer Destabilisierung der Zellsuspension werden durch das Auftreten
von schmalen Begleit- bzw. “Geisterpeaks” deutlich. Diese treten im Laufe der Zeit
verstärkt auf und führen zur Verzerrung der Peakform der Bakterien. Das
Peakmaximum verringert sich. Mit fortschreitender Destabilisierung ist nach einer
gewissen Zeit keine deutliche Maximumsbestimmung bzw. Peakabgrenzung mehr
möglich.
Der Zersetzungsprozeß kann durch Eiskühlung der Zellsupension verlangsamt werden
(vgl. Abb. 4.13).
57
4.4 Stabilität
AU
2,5 h
2h
1,5 h
1h
Migrationszeit
Abbildung 4.12: Destabilisierung der Zellsuspension am Beispiel von “Pseudomonas sp. 6537” in
Abhängigkeit der Standzeit der Suspension bei Raumtemperatur (20°C).
Kapillare: 75 µm, Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM
U = 30 kV
Die so stabilisierte Suspension ist im Gegensatz zu der bei Raumtemperatur gelagerten,
welche nach spätestens 2 Stunden nicht mehr verwendbar ist, bis zu mehreren Stunden
haltbar.
58
4.4 Stabilität
AU
6h
5h
3h
1h
Migrationszeit
Abbildung 4.13: Destabilisierung der Zellsuspension am Beispiel von “Pseudomonas sp. 6537” in
Abhängigkeit der Standzeit der Suspension bei Eiskühlung (0°C).
Kapillare: 75 µm, Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM
U = 30 kV
59
4.4 Stabilität
4.4.1.2 Einfluß der Pufferkonzentration
Wie bereits erwähnt beeinflußt die Pufferkonzentration die Haltbarkeit der Zellen.
Deshalb wurden Stabilitätsreihen bei verschiedenen Pufferkonzentrationen mit und ohne
Eiskühlung der Probe vermessen:
Generell waren die gekühlten Proben immer deutlich länger stabil als die ungekühlten,
unabhängig von der Pufferkonzentration. In Abb. 4.14 ist die mittlere “Lebensdauer”
Stabilität der Zellsuspension [h]
der Zellsuspension in Abhängigkeit der Konzentration des Puffers dargestellt.
9
9
8
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
0
2
4
6
8
10
Pufferkonzentration [mM]
Abbildung 4.14: “Mittlere” Lebensdauer der Zellsuspension in Abhängigkeit der Pufferkonzentration;
Probe eisgekühlt (________) und bei Raumtemperatur (__ __ __), Bakterien: “Pseudomonas spezies 6537”,
Kapillare: 75 µm, Lges = 111 cm,
Leff = 100 cm, Puffer: Phosphat pH 7; U = 30 kV
60
4.4 Stabilität
Allerdings muß an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß es sich bei den
Haltbarkeitszeiten nur um grobe Richtwerte handelt. Die Reproduzierbarkeit der
Stabilitätsreihe ist gering. Es können jederzeit starke Abweichungen von diesen Zeiten
auftreten (bis zu mehreren Stunden). Die Ursache hierfür ist unbekannt. Vernünftige
Kriterien, ab wann eine Zellsuspension nicht mehr zur Verwendung geeignet ist,
konnten nicht festgelegt werden, zumal selbst die Peakqualität aus frisch hergestellter
Suspension schwanken kann. Eine sinnvolle Entscheidung kann daher nur auf
Erfahrungswerten basieren.
Deshalb sollen die Werte in Abb. 4.14 nur als grobe Anhaltspunkte dienen. Ein
Stabilitätsmaximum ist allerdings deutlich bei einer Konzentration von 1-2 mM zu
erkennen. Extrem negativ macht sich eine erhöhte Pufferkonzentration bemerkbar. So
war bei Verwendung von 5 und 10 mM Puffern jeweils nur eine Messung (1/2 h)
möglich.
Die Zeitangaben beziehen sich auf den Beginn des ersten Waschvorgangs.
Um ein Maximum an Stabilität zu erreichen wurden daher, soweit nicht anders erwähnt,
die Proben bei allen Untersuchungen eisgekühlt.
4.4.1.3 Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen Mobilität
Um Mobilitäten verschiedener Bakterienarten vergleichen zu können, muß eine gute
Reproduzierbarkeit gewährleistet sein. Daher wurden bei obiger Stabilitätsreihe die
Standardabweichungen der EM für die einzelnen Pufferkonzentrationen berechnet (vgl..
Abb. 4.15). In die Berechnung wurden nur die Elektropherogramme verwendet, bei
denen noch keine deutliche Destabilisierung der Zellsuspension erkennbar war. Auch in
Abb. 4.15 ist ein Optimum (Minimum) bei 1-2 mM Phosphatpuffer zu erkennen. Die
Standardabweichung für die ungekühlten Proben ist nahezu immer größer als die der
eisgekühlten.
Um die Ausgangsbedingungen zu optimieren, ist es unabdingbar, die zu vermessende
Probe (Puffer-Zellsuspension) in Eis zu kühlen. Es hat sich gezeigt, daß im
Konzentrationsbereich von 1-2 mM Phosphatpuffer ein Optimum sowohl hinsichtlich
61
4.4 Stabilität
der Zellstabilität, als auch der Reproduzierbarkeit der EM erreicht werden kann. Daher
Standardabweichung [%]
wurde bei weiteren Untersuchungen 2 mM Phosphatpuffer verwendet.
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
2
4
6
8
10
Pufferkonzentration [mM]
Abbildung 4.15: Standardabweichung der elektrophoretischen Mobilität von “Pseudomonas spezies
6537” in Abhängigkeit der Pufferkonzentration.
Probe eisgekühlt (_______) und bei Raumtemperatur (__ __ __), n = 7
Kapillare: 75 µm, Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, Puffer: Phosphat pH 7; U = 30 kV
4.4.2 Alterung der Kapillare
In unregelmäßigen Abständen konnte ein spontaner Zusammenbruch des EOF innerhalb
weniger Messungen beobachtet werden. Eine Regeneration der Kapillare war nicht
mehr möglich. Als Ursache wurden Ablagerungen von Zellfragmenten an der
Kapillaroberfläche vermutet, welche die Oberfläche deaktivieren und somit das
Ausbilden eines ζ-Potenial einschränken. Normalerweise ist die Kapillaroberfläche
durch die Deprotonierung der Silanolgruppen negativ geladen. Durch die Ablagerungen
werden diese Stellen bedeckt und das ζ-Potential wird abgeschwächt.
Elektronenmikroskopische
Aufnahmen
einer
solchen
Kapillare
haben
diese
Vermutungen bestätigt. In Abb. 4.16 sind diese Ablagerungen deutlich in Form von
dunklen Flecken zu erkennen.
62
4.4 Stabilität
Abbildung 4.16: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Kapillarquerschnitts nach dem
Zusammenbruch des EOF
63
4.4 Stabilität
Diese Ablagerungen erwiesen sich als nahezu irreversibel. Selbst längeres Spülen mit
Natriumdodecylsulfatlösung (SDS) ergab keine regenerative Wirkung. Ein Austausch
der Kapillare war somit erforderlich.
Die Bestimmung der Haltbarkeit von Kapillaren ist im Voraus nicht möglich. Je
nachdem wie viele Messungen innerhalb eines bestimmten Zeitraums durchgeführt und
welche Bakterienarten verwendet wurden, schwankte die Lebensdauer zwischen 50 und
bis zu mehreren hundert Messungen.
64
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
Jorgenson hat gezeigt, daß in der CZE mit einem pfropfenförmigen Strömungsprofil im
„open tube“ Modus die Bodenhöhe nur von der Axialdiffusion abhängt [35].
Dies bedeutet, daß sich die ursprüngliche Van-Deemter-Gleichung (Gleichung 24)
entsprechend vereinfacht.
H = A+
B
+C ⋅u
u
(24)
Da es sich um keine gepackte Kapillare handelt, entfällt der A-Term. Eine stationäre
Phase ist nicht vorhanden, so daß die radiale Diffusion keinen Beitrag zur
Bandenverbreiterung liefert, wodurch der C-Term entfällt.
Die kleinstmögliche Trennstufenhöhe H ergibt sich somit aus
H=
2 Dm
u
(25)
Dm: Diffusionskoeffizient
u: Fließgeschwindigkeit
Dies bedeutet, daß für Verbindungen mit geringem Diffusionskoeffizient, was vor allem
bei Makromolekülen der Fall ist, eine hohe Bodenzahl erreicht werden kann. Da
keinerlei Stoffaustauschvorgänge stattfinden, ist die Diffusion nur von Nachteil.
In der Praxis hat Gleichung 25 nur theoretische Bedeutung, da weitere
bandenverbreiternde Effekte hinzukommen können:
• Temperatureffekte: durch die Joul´sche Erwärmung geht das pfropfenförmige
Flußprofil zum Teil verloren, da sich ein parabolisches Temperaturprofil und damit
auch ein parabolisches Flußprofil ausbildet.
• Wandadsorptionseffekte: Substanzen können zum Teil an der Kapillarwand
adsorbieren und werden im Vergleich zu den sich in Lösung befindlichen
Komponenten stärker zurückgehalten. Die Folge ist meist ein auftretendes Tailing.
65
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
• Elektrodispersion: Unterscheidet sich die Leitfähigkeit der Pufferionen von denen der
Probe, so erfolgt eine Verzerrung der ursprünglich Gauß-förmigen Peaks. Je
nachdem, ob die Leitfähigkeit in der Probe stärker oder geringer ist, kann ein Tailing
bzw. Fronting beobachtet werden [36].
• Isotachophoretischer Effekt: Unterscheiden sich die Konzentrationen des Puffers und
der Probe, so entstehen fokusierende bzw. defokusierende Effekte.
• Injektion: Bei identischen Injektionsparametern bleibt dieser Einfluß bei allen
Verbindungen gleich und geht somit lediglich als konstanter Faktor ein.
Werden nun keine Moleküle betrachtet, sondern Zellen, so kommt noch ein weiterer
Effekt hinzu: Im Gegensatz zu Molekülen besitzen Bakterien der gleichen Art natürliche
Unterschiede in ihrer Größe und Oberflächenladung. Dadurch kommen zu den bisher
beschriebenen
Beiträgen
zur
Bandenverbreiterung
sogenannte
zellspezifische
Bandenverbreiterungen hinzu, welche durch die natürliche Inhomogenität der Bakterien
verursacht werden.
Es wurde bereits gezeigt [17], daß die Bakterien
eine deutlich
stärkere
Bandenverbreiterung aufweisen als herkömmliche Moleküle. Mögliche Ursachen hierfür
sollen in den folgenden Kapiteln diskutiert werden.
4.5.1 Pufferzusammensetzung
Ein Einfluß des Puffers auf die Bandenverbreiterung ist nur zu erwarten, wenn der
Puffer die Bakterien direkt beeinflußt oder eine Beeinflussung eventueller
Wechselwirkungen der Bakterien mit anderen Komponenten wie z.B. Kapillarwand
stattfindet.
In Abb. 4.17 ist der bandenverbreiternde Einfluß der Pufferzusammensetzung bei
gleicher
Pufferkonzentration
(10mM)
dargestellt.
Auf
Grund
der
geringen
Reproduzierbarkeit der Bodenzahl sind die Werte relativ ungenau und es muß ein
relativer Fehler von bis zu 20 % einkalkuliert werden.
66
200000
200000
150000
150000
100000
100000
50000
50000
Borat
pH 9,5
0
Schleimsäure
pH 7,2
Glucose-1phosphat
pH 8,5
Phosphat
pH 7
0
Glutardialdehydbis(natriumhydrogensulfit)
pH 7
Bodenzahl
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
Abbildung 4.17: Bodenzahl in Abhängigkeit der Pufferzusammensetzung bei gleicher
Konzentration (c = 10 mM) für „Micrococcus luteus“ (schwarz), „Pseudomonas
spezies 1749“ (grau) und „Pseudomonas spezies 6537“ (weiß).
Kapillare: 75 µmI.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm; U = 30 kV, I = 50 kVs
Bei den Spezies „Micrococcus luteus“ und „Pseudomonas spezies 6537“ ist der Verlauf
der Bodenzahl in Abhängigkeit von der Art des Puffers nahezu identisch. Lediglich die
Verwendung des Phosphatpuffers läßt eine deutlich höhere Bodenzahl erkennen (Faktor
2 größer). Beide Spezies besitzen nahezu dieselbe elektrophoretische Mobilität.
Wird nun die dritte Spezies zur Betrachtung hinzugezogen, so verändert sich der
Verlauf: Die Bodenzahl ist bei „Pseudomonas spezies 1749“ deutlich größer als bei den
beiden anderen Spezies. Die elektrophoretische Mobilität ist deutlich geringer, s.
Kapitel 4.6.
Auffallend ist die geringe Bodenzahl der Spezies „1749“ bei Verwendung von
Boratpuffer. Offenbar unterscheidet sich die Wirkungsweise dieses Puffers auf diese
Spezies deutlich von den anderen: Der Boratpuffer scheint auf die Zellen der Spezies
„1749“ einen direkten Einfluß auszuüben, was zu einer deutlichen Verschlechterung der
Bodenzahl führt.
67
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
Bei der Betrachtung dieser drei Spezies ist die Verwendung des Phosphatpuffers zu
bevorzugen, da bei ihm mit allen drei Spezies eine gute Bodenzahl erreicht werden
kann. Generell hängt die Wahl des Puffers jedoch von den jeweiligen Anforderungen
und den verwendeten Bakterien ab.
4.5.2 Einfluß der Pufferkonzentration
Nach Jorgenson (s. Gleichung 25) dürfte die Bodenzahl lediglich von der
Diffusionskonstante und der linearen Fließgeschwindigkeit (entspricht hier dem EOF)
abhängen [35]. Da die Diffusionskonstante ein stoffspezifischer Wert ist, kann dieser
bei Verwendung wässriger Puffer genügender Verdünnung als konstant angesehen
werden.
Anders sieht dies für die Fließgeschwindigkeit bzw. den EOF aus. Dieser resultiert aus
dem ζ-Potential, welches durch die Deprotonierung der Silanolgruppen an der
Kapillaroberfläche entsteht. Diese Dissoziation ist reversibel und unterliegt einem
dynamischen Gleichgewicht zwischen Dissoziation und Assoziation. Die Lage des
Gleichgewichts wird nicht nur von den Protonen, sondern auch durch die Kationen, die
sich im Puffer befinden, beeinflußt [5,20].
Daher ist zu erwarten, daß der EOF von der Pufferkonzentration abhängt. Abb. 4.18
bestätigt den erwarteten Verlauf: Mit zunehmender Pufferkonzentration nimmt der EOF
bzw. die elektroosmotische Mobilität deutlich ab.
Nach Jorgenson müßte sich also mit zunehmender Pufferkonzentration die Bodenzahl
der Bakterien verringern, da der Diffusionskoeffizient konstant bleibt.
In Abb. 4.19 und 4.20 ist genau das Gegenteil zu sehen: Bei allen drei Spezies sowie bei
allen verwendeten Puffersystemen nimmt die Bodenzahl mit steigender Konzentration
deutlich zu. Zusätzlich zu den bekannten bandenverbreiternden Effekten muß hier also
mindestens ein weiterer fokusierender Effekt auftreten.
68
elektroosmotische Mobilität
[10 -4 cm 2/Vs]
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
10,0
10,0
9,5
9,5
9,0
9,0
8,5
8,5
8,0
8,0
7,5
7,5
7,0
7,0
0
2
4
6
8
10
Pufferkonzentration [mmol/L]
Bodenzahl
Abbildung 4.18: Abhängigkeit der elektroosmotischen Mobilität
Pufferkonzentration. Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm;
Puffer: Glucose-1-phosphat pH 8,5; U = 30 kV
von
200000
200000
175000
175000
150000
150000
125000
125000
100000
100000
75000
75000
50000
50000
25000
25000
0
der
0
0
2
4
6
8
10
Pufferkonzentration [mmol/L]
Abbildung 4.19: Abhängigkeit der Bodenzahl von der Pufferkonzentration am Beispiel
von „Pseudomonas spezies 1749“. Puffer: Borat pH 9,5 ( - .. - .. - ), Phosphat pH 7
( - . - .), Glutardialdehydbis(natriumhydrogensulfit) pH 7( . . . . ), Glucose-1-phosphat
pH 8,5 (- - - - ) und Schleimsäure pH 7,2 (_____ ); Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm,
Leff = 100 cm, U = 30 kV, I = 50 kVs
69
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
120000
100000
100000
80000
80000
60000
60000
40000
40000
20000
20000
Bodenzahl
120000
0
0
0
2
4
6
8
10
Pufferkonzentration [mmol/L]
Abbildung 4.20: Abhängigkeit der Bodenzahl von der Pufferkonzentration im Vergleich
der drei Spezies „Pseudomonas spezies 6537“ (∆), „Micrococcus luteus“ (❑) und
„Pseudomonas spezies 1749“ (O). Puffer: Phosphat pH 7;
Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, U = 30 kV, I = 50 kVs
Die Erklärung dieses Effektes macht eine genauere Betrachtung des Systems notwendig:
Die verwendeten Bakteriensuspensionen enthielten in etwa 109 Zellen/mL. Geht man
vereinfacht von einer Bakterienart mit einheitlichen Zellen der Länge l = 1 µm und dem
Durchmesser d = 0,5 µm aus, so ergibt sich ein Volumenanteil der Bakterien von 0,19
mL/mL Suspension. Dies bedeutet, daß in etwa 20 % des zur Verfügung stehenden
Volumens von den Zellen eingenommen werden. Rechnet man den Zellen noch eine
Solvathülle zu, wird dieser Anteil noch erhöht. Wird davon ausgegangen, daß die Zellen
während der Elektrophorese im Vergleich zum Puffer nur sehr wenig zum
Stromtransport beitragen, so verursachen die Bakterien in ihrem Abschnitt der Kapillare
eine Erhöhung des elektrischen Widerstandes. Da nach dem Kirchhoff´schen Gesetz der
Stromfluß in jedem Abschnitt des elektrischen Leiters (hier: Kapillarinhalt) gleich groß
sein muß, erhöht sich automatisch nach dem Ohm´schen Gesetz die elektrische
Feldstärke E (vgl. Abb. 4.21). Man erhält also einen Feldstärkesprung längs der
Kapillare entlang des Bakterienpfropfens. In axialer Richtung bleibt die Feldstärke stets
homogen.
70
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
Bakterienzone
Kapillare
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
+
B
B
B
B
B
B
B
-
EOF
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
E
Abbildung 4.21: Schematische Darstellung des Feldstärkeverlaufs entlang der
Kapillare
Auf Grund der höheren Feldstärke innerhalb der Bakterienzone erhöht sich automatisch
deren
Wanderungsgeschwindigkeit
in
Richtung
Anode.
Es
erfolgt
eine
Aufkonzentrierung der Bakterienzone auf der Anodenseite (Fokusierung). Analog
müßten allerdings die Zellen, die sich auf der Kathode zugewandten Seite der
Bakterienzone
befinden,
dispergieren,
verbunden
mit
einer
insgesamten
Bandenverbreiterung: Elektrodispersion. Genau dies ist jedoch nicht der Fall. Es ist
keine Dispersion beobachtbar (vgl. Abb. 4.22).
Bakterienzone
Kapillare
B
B
B
B
B
B
B
B
B
+
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
EOF
B
B
-
B
B
B
B
B
B
B
E
Abbildung 4.22: Fokusierung der Bakterien in Richtung Anode ohne Dispergierung in
Richtung Kathode und die daraus resultierende Feldstärkeverteilung
Die genaue Ursache für diese Fokusierung läßt sich allein über den Feldstärkesprung
nicht erklären. Als weitere Ursache könnten Veränderungen der Zellen im elektrischen
71
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
Feld in Betracht kommen. Das Zellinnere besteht aus einem Elektrolyt, dessen Ionen
durch das elektrische Feld beeinflußt werden. Daher liegt die Vermutung nahe, daß
innerhalb der Zelle eine Art Polarisierung stattfindet (vgl. Abb. 4.23). In wieweit sich
dies auf die Bandenverbreiterung auswirken kann und ob dies parallel durch die
Pufferkonzentration beeinflußt wird, ist unklar. Zudem ist nicht auszuschließen, daß
sich die Bakterien selbst im elektrischen Feld gegenseitig beeinflussen.
Zellinhalt
Zellwand
-
+
-
- - -
+
- - + - +
- + --- +
- - +
+
- - - - +
+
+ - +
+
- - -
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+ +
+
+
-
-
-
+
+
-
-
Abbildung 4.23: Schematische Darstellung eines Zellquerschnitts und die Polarisierung
der Zelle im elektrischen Feld
4.5.3 Einfluß der Feldstärke
Aus Gleichung 25 läßt sich die Gleichung zur Bestimmung der Bodenzahl in der
Elektrophorese ableiten:
N=
µ EM UL eff µ EM EL eff
=
2DL ges
2D
(26)
µEM: elektrophoret. Mobilität
U: Spannung
E: elektrische Feldstärke
D: Diffusionskonstante
72
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
Leff: Effektive Kapillarlänge
Lges: Gesamte Kapillarlänge
Wird mit denselben Bakterien sowie demselben Puffer gearbeitet, so sind die
elektrophoretische Mobilität der Zellen und deren Diffusionskonstante konstante
Faktoren. Daher hängt nach Gleichung 26 die Bodenzahl direkt von der angelegten
Spannung bzw. von der elektrischen Feldstärke ab. Demnach müßte die Bodenzahl mit
zunehmender Spannung proportional ansteigen. Dies ist jedoch nicht der Fall.
Bodenzahl
In Abb. 4.24 ist der beobachtete Verlauf der Bodenzahl dargestellt.
24000
24000
22000
22000
20000
20000
18000
18000
16000
16000
14000
14000
12000
12000
10
15
20
25
30
Spannung [kV]
Abbildung 4.24: Abhängigkeit der Bodenzahl von der angelegten Spannung am Beispiel
„Pseudomonas spezies 6537“. Puffer: Phosphat pH 7, c = 2mM;
Kapillare: 150 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, I = 50 kVs
Anstatt einer Zunahme der Bodenzahl mit steigender Spannung ist genau der
umgekehrte Vorgang zu beobachten: Die Bodenzahl nimmt ab. Da als einziger
Parameter die Spannung verändert wurde, liegt die Vermutung nahe, daß es sich hier um
einen Temperatureffekt handelt: Mit zunehmender Feldstärke steigt die Stromstärke
bzw. die erzeugte Joul´sche Erwärmung. Das daraus resultierende parabolische
Temperatur- bzw. Strömungsprofil wird mit zunehmender Feldstärke immer deutlicher
73
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
ausgeprägt, was eine verstärkte Bandenverbreiterung und somit eine abnehmende
Bodenzahl zur Folge hat.
Werden die fokusierenden Effekte aus dem vorherigen Kapitel mit in die Betrachtungen
einbezogen, so ändern sich die Verhältnisse aus Abb. 4.21 grundlegend: Die
Erwärmung der Kapillare hat eine Verringerung der Viskosität zur Folge. Zudem
verändert sich die Leitfähigkeit der Ionen. Dies bedeutet, daß mit steigender Erwärmung
der elektrische Widerstand abnimmt. Dies hat zur Folge, daß der Feldstärkesprung bei
der
Bakterienzone
verringert
wird.
Allerdings
ist
nun
auf
Grund
des
Temperaturgradienten die Feldstärke in axialer Richtung nicht mehr homogen. In der
Mitte der Kapillare ist die Erwärmung am stärksten und somit die elektrische Feldstärke
geringer als im äußeren Bereich (vgl. Abb. 4.25).
Kapillare
Bakterienzone
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Abbildung 4.25: Schematische Darstellung des Feldstärkeprofils entlang der Kapillare
(hell: geringe Felstärke, dunkel: hohe Feldstärke) und der daraus resultierenden
Peakverzerrung.
Dadurch nimmt die fokusierende Wirkung in der Mitte der Kapillare ab, wodurch
zusätzlich eine Verzerrung des Peaks erfolgt.
Deshalb wäre prinzipiell ein Arbeiten mit geringeren Feldstärken von Vorteil.
Allerdings verlängert sich die Analysenzeit durch eine Verringerung der Feldstärke
enorm, wodurch die Problematik der Zellstabilität wieder an Bedeutung gewinnt. Der
Einfluß der Feldstärke auf die Bodenzahl konnte durch Verwendung von Kapillaren mit
75 µm I.D. verringert werden. Daher wurde bei weiteren Versuchen auf eine
Reduzierung der Feldstärke verzichtet.
74
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
4.5.4 Einfluß des Kapillardurchmessers
Eine Vergrößerung des Kapillarinnendurchmessers hat eine verstärkte Erwärmung der
Kapillare zur Folge, s. Kapitel 4.3. Parallel zur Erwärmung entsteht ein parabolisches
Temperaturprofil (vgl. Abb. 4.4). Die unterschiedliche Temperaturverteilung führt zu
einer unterschiedlichen Viskositätsverteilung, woraus ein parabolisches Strömungsprofil
resultiert. Ein solches Strömungsprofil trägt zur Bandenverbreiterung bei. Es ist daher
zu erwarten, daß mit zunehmendem Kapillardurchmesser die Bodenzahl abnimmt.
Entsprechendes
wurde
bei
niedermolekularen
Verbindungen,
wie
z.B.
p-
Toluolsulfonsäure beobachtet. In Abb. 4.26a ist dieser lineare Zusammenhang zwischen
Kapillardurchmesser und Bodenzahl zu erkennen. Er ist für alle Verbindungen zu
Bodenzahl
erwarten (vgl. Kapitel 4.2.2).
290000
290000
280000
280000
270000
270000
260000
260000
250000
250000
75
100
125
150
Kapillarinnendurchmesser [µm]
Abbildung 4.26a: Abhängigkeit der Bodenzahl von Kapillardurchmesser am Beispiel
von „p-Toluolsulfonsäure“. Puffer: Phosphat pH 7, c = 2mM; U = 30 kV
Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm; I = 50 kVs
Die Wandadsorption stellt einen weiteren Effekt dar, der zur Bandenverbreiterung
beitragen kann. Albumin z.B. weist bei Verwendung von fused-silica Kapillaren starke
Wandadsorptionseffekte auf. Sehr deutlich ist dies an auftretendem Peak-Tailing zu
erkennen. Wird der Kapillardurchmesser variiert, so verändert sich der Beitrag der
75
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
Wandadsorption zur Gesamtbandenverbreiterung: Das Verhältnis Volumen zur
Oberfläche der Kapillare ist proportional zum Innendurchmesser der Kapillare. Dies
bedeutet, daß mit zunehmendem Durchmesser die Wandadsorptionseffekte an Einfluß
auf die Bandenverbreiterung verlieren: Bei theoretisch unendlich großem Durchmesser
wird der Einfluß der Adsorption gleich Null.
Diese beiden gegenläufigen Effekte, Adsorption und Temperaturprofil, überlagern sich,
wodurch
kein
linearer
Zusammenhang
mehr
zwischen
Bodenzahl
und
Bodenzahl
Kapillardurchmesser zu erwarten ist (vgl. Abb. 4.26b).
30000
30000
25000
25000
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
75
100
125
150
Kapillarinnendurchmesser [µm]
Abbildung 4.26b: Abhängigkeit der Bodenzahl von Kapillardurchmesser am Beispiel
von „Albumin“. Puffer: Phosphat pH 7, c = 2mM; I = 50 kVs; U = 30 kV
Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm;
Bei größeren Kapillardurchmessern
haben
die Adsorptionseffekte nur einen
untergeordneten Einfluß: Die Bodenzahl steigt mit abnehmendem Durchmesser. Bei
kleineren Durchmessern gewinnt der adsorptive Effekt an Gewicht und übertrifft den
thermischen: Die Bodenzahl sinkt mit abnehmendem Durchmesser.
Das Beispiel Albumin macht deutlich, daß die Verwendung von Kapillaren mit
geringem Innendurchmesser nicht immer von Vorteil ist. Eine Kapillare mit einem
Innendurchmesser von 100 µm wäre hier zu bevorzugen.
76
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
Vergleicht man Abb. 4.26a und b, so erkennt man zwei unterschiedliche
Kurvenverläufe, deren Unterschiede aus der Wandadsorption resultieren.
Somit ergibt sich ein einfaches Testverfahren, um eventuelle Wandadsorptionseffekte
nachzuweisen.
Exemplarisch wurde „Pseudomonas spezies 6537“ diesem Test unterzogen (vgl. Abb.
Bodenzahl
4.26c).
35000
35000
30000
30000
25000
25000
20000
20000
15000
15000
10000
10000
75
100
125
150
Kapillarinnendurchmesser [µm]
Abbildung 4.27c: Abhängigkeit der Bodenzahl von Kapillardurchmesser am Beispiel
von „Pseudomonas spezies 6537“. Puffer: Phosphat pH 7, c = 2mM; I = 50 kVs
Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm; U = 30 kV
Analog zur p-Toluolsulfonsäure konnte hier ein linearer Verlauf zwischen Bodenzahl
und Kapillarinnendurchmesser beobachtet werden. Es kann daher davon ausgegangen
werden, daß bei dieser Spezies keine bedeutenden Wandadsorptionseffekte aufgetreten
sind. Diese Aussage kann nicht verallgemeinert werden, sondern muß für jede Spezies
überprüft werden.
Für bestimmte Bakterienspezies, konnte nach Durchlaufen des elektrophoretischen
Systems kein Peak erhalten werden (vgl. Abb. 4.27).
77
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
AU
Totzeit
t [min]
Abbildung 4.27: Elektropherogramm von „Pseudomonas spezies 1110“; U = 30 kV
Puffer: Phosphat pH 7, c = 2mM; I = 50 kVs; Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm;
Dafür gibt es zwei mögliche Erklärungen:
• Die Zellen besitzen so stark unterschiedliche Mobilitäten, daß sich dadurch
die Zellen entlang eines größeren Kapillarabschnitts verteilen. Dies ist jedoch
unwahrscheinlich.
• Die Zellen weisen eine starke Wechselwirkung mit der Kapillarwand auf und
werden zum teil adsorbiert: Die Zellen verteilen sich über die komplette
Kapillare.
78
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
Ein solch starker adsorptiver Effekt kann natürlich nicht mehr mittels obiger Methode
nachgewiesen werden.
Deshalb wurden die Bakterien hydrodynamisch durch die Kapillare (L = 111 cm; 75 µm
I.D.) gedrückt, p = 500 mbar. Die Injektionsparameter betrugen I = 10 s 500 mbar. Zur
Bestimmung der Totzeit wurde Thioharnstoff injiziert (vgl. Abb. 4.28a).
Bakterien, welche nach obiger Methode keine Adsorption an der Kapillarwand zeigten,
eluierten deutlich früher als der Thioharnstoff. Dies ist auf einen hydrodynamischen
Effekt zurückzuführen (vgl. Abb. 4.29).
AU
AU
AU
Zeit
Zeit
a)
b)
Zeit
c)
Abbildung 4.28a-c: Hydrodynamische Elution von a) Thioharnstoff, b) „Micrococcus
luteus“ und c) „Pseudomonas spezies 1110“; Kapillare: L = 111 cm, 75 µm I.D. ;
p = 500 mbar, I = 10 s 500 mbar; Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM
Größere Partikel halten sich durchschnittlich mehr in der Mitte der Kapillare auf, als am
Rand. Nicht so jedoch Moleküle, welche auf Grund ihrer geringen Größe gleichmäßig
entlang des Kapillarquerschnitts verteilt sind. Deshalb werden Zellen im Durchschnitt
schneller transportiert, da in der Mitte der Kapillare auf Grund des parabolischen
79
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
Strömungsprofils eine höhere Fließgeschwindigkeit herrscht [38]. Die Zellen eluieren
daher vor der Totzeit.
Während Thioharnstoff einen symmetrischen Peak ergab, war bei den Zellen ein starkes
Tailing beobachtbar, was auf gewisse Adsorptionseffekte schließen läßt (vgl. Abb.
4.28b).
Fließrichtung
Abbildung 4.29: Flußprofil in einer offenen Kapillare unter hydrodynamischen
Bedingungen
„Pseudomonas spezies 1110“, die bei der Elektrophorese keinen Peak ergaben (vgl.
Abb. 4.27), zeigt hier einen unerwarteten Effekt: Ein Teil der Zellen eluiert analog wie
die anderen Spezies vor der Totzeit. Zusätzlich ist deutlich nach der Totzeit ein zweites
Signal sichtbar (vgl. Abb. 4.28c). Dies läßt sich nur bedingt auf eine Wandadsorption
zurückführen, da dieser Effekt bei identischen Zellen lediglich ein verstärktes Tailing
verursachen würde. Somit ergibt sich die Vermutung, daß zwei verschiedene Formen
derselben Spezies vorliegen, von denen eine Form verstärkt mit der Kapillarwand
wechselwirkt und daher später eluiert. Diese These der zweierlei Zellarten bzw.
Zellformen wird durch eine weitere Beobachtung unterstützt: Das Verhältnis der beiden
Peakflächen bleibt in etwa identisch, unabhängig von der Zellkonzentration im
injizierten Probepuffer. Die Ursache hierfür bleibt allerdings unklar. Die Vermutung
liegt jedoch nahe, daß ein enger Zusammenhang zwischen dem Doppelpeakphänomen
im hydrodynamischen Modus und den fehlenden Peaks bei der Elektrophorese besteht.
80
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bakterien in der CE
4.5.5 Einfluß des Gegendrucks
Ist eine Weiterverarbeitung der kapillarelektrophoretisch getrennten Bakterien gefordert,
muß die Gesamtzahl der injizierten Zellen erhöht werden. Diese präparative
Arbeitsweise wird durch Verwendung von Kapillaren mit größerem Innendurchmesser,
sowie einer Verlängerung der Injektionszeit erreicht. Der resultierende Verlust an
Bodenzahlen muß dafür in Kauf genommen werden. Ausgehend von einer
Zellsuspension mit 109 Zellen/mL werden bei einer Standardkapillaren (L = 111 cm, 75
µm I.D.) bei I = 50 kVs 17000 Zellen injiziert. Bei Verwendung einer Kapillare mit I.D.
150 µm (L = 111 cm) und I = 5 mbar 60s werden bereits 335000 Zellen injiziert, also
die 20-fache Menge.
Vor allem bei größeren Kapillardurchmessern macht sich das parabolische
Strömungsprofil, welches durch die Erwärmung der Kapillare verursacht wird,
bemerkbar. Es sollte nun untersucht werden, ob durch Anlegen eines geringen
Bodenzahl
Gegendrucks dem Temperaturprofil ein gleichförmig entgegengesetztes Profil überlagert
1500
1500
1250
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
250
0
0
-4
-2
0
2
4
Druck [mbar]
Abbildung 4.30: Abhängigkeit der Bodenzahl vom Gegendruck. Druckangabe in
Fließrichtung positiv, gegen die Fließrichtung negativ. Kapillare: L = 111 cm, 150 µm
I.D. ; Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM; U = 30 kV, I = 5 mbar 60s (hydrodynamisch)
81
4.5 Bandenverbreiternde Effekte bei Bekterien in der CE
werden kann. Durch die Überlagerung sollten sich die beiden Profile zum Teil
kompensieren, wodurch eine Abschwächung des Temperatureffekts erreicht werden
soll.
In Abb. 4.30 ist der Einfluß dieses Gegendrucks auf die Bodenzahl der Bakterien zu
erkennen. Ein Maximum bei -1 bis -2 mbar ist deutlich erkennbar. Hier schwächen sich
also tatsächlich beide Strömungsprofile gegenseitig maximal ab. Bei Verwendung von
kleinem Kapillardurchmesser ist der thermische Effekt nur sehr gering. In Abb. 4.31 ist
kein Einfluß des Gegendrucks auf die Bodenzahl beobachtbar. Daraus folgt, daß die
Bodenzahl
thermische Beeinflussung der Bandenverbreiterung vernachlässigbar klein ist.
20000
20000
17500
17500
15000
15000
12500
12500
10000
10000
7500
7500
-4
-2
0
2
4
Druck [mbar]
Abbildung 4.31: Abhängigkeit der Bodenzahl vom Gegendruck. Druckangabe in
Fließrichtung positiv, gegen die Fließrichtung negativ. Kapillare: L = 111 cm, 75 µm
I.D. ; Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM; U = 30 kV, I = 50 kVs
82
4.6 Elektrophoretische Mobilität
4.6 Elektrophoretische Mobilität
4.6.1 Charakterisierung von Bakterien
Generell gibt es viele Wege, Bakterien zu charakterisieren. Die einfachste Methode ist
die Untersuchung der morphologischen Eigenschaften, wie z.B. Größe und Form der
Bakterien, sowie Größe, Form und Farbe der Kolonien. Mit dieser Methode ist in der
Regel lediglich eine Grundzuordnung möglich, z.B. in Stäbchen oder Kokken etc..
Eine genauere Charakterisierung erfolgt bei Standardverfahren mittels bestimmten
differentialdiagnostisch wichtigen Stoffwechselleistungen. Vielfach wird das gesamte
Besteck aller dazu vorgelegter Substrate und Substanzen als „Bunte Reihe“ bezeichnet
[2]. Der Nachweis erfolgter Reaktionen ist u.a. an Farbumschlägen verschiedener
Indikatoren zu erkennen, wodurch ein „buntes“ Bild entsteht.
Jedoch ist auch diese Methode zur Identifizierung und Charakterisierung der Bakterien
relativ ungenau oder zumindest nicht immer erfolgreich. Deshalb wurden ständig neue
Methoden entwickelt, um eine genauere Zuordnung der Bakterien zu ermöglichen. Dies
hat dazu geführt, daß v.a. in den letzten 20 Jahren viele Spezies umbenannt wurden, da
sie auf Grund von unzureichenden Untersuchungsmethoden zur falschen Gattung
zugeordnet worden waren.
Ein Beispiel solcher Methoden ist die Bestimmung der Ribosomen der Zelle über die
Sedimentationsgeschwindigkeit. Ebenso lassen sich durch Untersuchungen des
Zellaufbaus Rückschlüsse auf die Bakterie ziehen. So gehört die Bestimmung des
Guanin- und Cytosinanteils in der DNS zur Standarduntersuchung [26,27].
Ein weiteres charakteristisches Merkmal von Bakterien ist der Aufbau der Zellhülle. So
variieren die Anteile an bestimmten Zuckerbausteinen oder Fettsäuren zum Teil
erheblich: Chemotaxonomie.
Eine weitere und sehr einfache Methode ist die Charakterisierung der Zellen mittels
Kapillarelektrophorese:
Ein einfaches, allerdings unspezifisches Unterscheidungsmerkmal kann hier bereits die
Peakform der Zellen sein. Neben „normalen“ symmetrischen Peaks gibt es eine Vielzahl
an Peakformen. In Abb. 4.32 sind hierzu ein paar Beispiele aufgeführt.
83
4.6 Elektrophoretische Mobilität
AU
"fronting"
"Schulter"
"Begleitpeaks"
Zeit
Abbildung 4.32: Beispiele verschiedener Peakformen: „Fronting“ (Serratia ficaria),
„Schulter“ (Pseudomonas spezies 6708) und „Begleitpeaks“ (Pseudomonas spezies
6537); Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM; Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm,
75 µm I.D. ; U = 30 kV, I = 50 kVs
Ebenso kann die Peakbreite bzw. die Bodenzahl unter identischen Versuchsbedingungen
ein charakteristisches Unterscheidungsmerkmal der einzelnen Spezies sein (vgl. Abb.
4.34).
Es sei an dieser Stelle jedoch darauf hingewiesen, daß nicht alle Zellen mittels
Kapillarelektrophorese bestimmbar waren (vgl. Kapitel 4.5.4).
Ein
weitaus
wichtigeres
Charakterisierungsmerkmal
von
Bakterien
ist
die
elektrophoretische Mobilität. Sie ist wie Form und Größe der Zellen ein relativ einfach
zu bestimmender Wert, jedoch mit großer Aussagekraft. In Tabelle 4.1 wurde ein EMKataolg für die untersuchten Bakterien zusammengestellt.
84
4.6 Elektrophoretische Mobilität
AU
a
b
Zeit
Abbildung 4.33: Peakbreite als Charakteristikum der Bakterien: Beide Peak besitzen in
etwa dieselbe EM.
a: „Serratia ficaria“ (31500 Böden); b: „Sphingomonas spezies 6014“ (903 Böden)
Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM; Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm,
75 µm I.D. ; U = 30 kV, I = 50 kVs
Die EM ist vom Aufbau der Zellwand abhängig und daher im weiteren Sinne mit der
Chemotaxonomie verwandt.
Betrachtet man die Mobilitätsverteilung in Tab.4.1, so ergeben sich wesentliche
Merkmale: Prinzipiell wäre zu erwarten gewesen, daß ähnliche Bakterien, wie z.B.
sämtliche „Pseudomonas spezies“ eine ähnliche Mobilität besitzen, oder daß sich
generell Gram-positive und Gram-negative Bakterien unterscheiden lassen. Dies ist
allerdings nicht der Fall. Somit resultiert nachteilig, daß die alleinige Bestimmung der
EM nicht für eine generelle Zuordnung in übergeordnete Gruppen geeignet ist. Der
große Vorteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß sich scheinbar identische, bzw.
sehr ähnliche Kulturen, welche sowohl morphologisch als auch stoffwechselspezifisch
nicht unterscheidbar sind, mittels der EM differenzieren lassen.
85
4.6 Elektrophoretische Mobilität
Daher stellt diese Methode eine Ergänzung der bisher bekannten Charakterisierungen
dar, welche zusätzliche und wichtige Informationen über die entsprechende Spezies
liefern kann.
Spezies
DSM Nr.
µem[104
Bodenzahl
Besonderheiten
cm2/Vs]
Pseudomonas putida
548
0,41
20614
Pseudomonas spezies
1749
0,82
24700
Pseudomonas spezies
5536
0,99
9300
„Schulter“
Pseudomonas spezies
6708
1,16
2560
Peak verrauscht
Rhodococcus erythropolis
1069
2,52
1060
Peak verrauscht
Arthrobacter agilis
20550
2,68
810
Pseudomonas spezies
6537
2,86
20700
Micrococcus luteus
20030
2,98
12800
65
3,47
690
Pseudomonas putida
50222
3,48
1210
Serratia ficaria
4569
4,02
31500
Sphingomonas spezies
6014
4,12
903
Xanthobacter autotrophicus
3874
---
---
kein Peak
Pseudomonas spezies
1110
---
---
kein Peak
Pseudomonas spezies
2583
---
---
kein Peak
Paracoccus denitrificans
„Fronting“
Tabelle 4.1: EM der untersuchten Bakterien und deren Peakform
Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM; Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm,
75 µm I.D. ; U = 30 kV, I = 50 kVs
Um entsprechende EM sinnvoll vergleichen zu können, müssen sämtliche Parameter
konstant gehalten werden, bzw. die Beeinflussung der EM der Zellen durch
Veränderung gewisser Parameter bekannt sein.
Ausschlaggebend für die Änderung der Mobilität sind hier hauptsächlich die Ladungen
der Zellen, also die funktionellen Gruppen. Aber auch die Zelle selbst kann über ihre
Größe und Form die Mobilität beeinflussen.
86
4.6 Elektrophoretische Mobilität
4.6.2 Einfluß des pH-Wertes
Die funktionellen Gruppen, die für die Ladungserzeugung der Zelle verantwortlich sind,
stellen
überwiegend
schwache
organische
Säuren,
bzw.
Basen
dar.
Deren
Protolysegleichgewicht hängt stark vom pH-Wert des Puffers ab:
R fG − H
→
←
R fG
−
+ H+
(27)
RfG: funktionelle Gruppe
der Zelle
Mit fallendem pH-Wert verschiebt sich die Lage des Gleichgewichtes nach links, d.h.
der Anteil an deprotonierten funktionellen Gruppen nimmt ab. Dies bedeutet eine
Verminderung der Ladung auf der Zelloberfläche. Für die Mobilität in Abhängigkeit des
pH-Wertes ist ein Verlauf analog dem der Dissoziationskurve einer schwachen
organischen Säure zu erwarten (vgl. Abb. 4.34).
100 %
Dissoziationsgrad
0%
pH
Abb.4.34: Typischer Dissoziationsverlauf einer schwachen organischen Säure in
Abhängigkeit des pH-Wertes
87
4.6 Elektrophoretische Mobilität
In unseren Untersuchungen wurde dieser Verlauf experimentell bestätigt (vgl. Abb.
3,2
3,2
3,0
3,0
2,8
2,8
2,6
2,6
2,4
2,4
-4
2
(10 cm /Vs)
Elektrophoretische Mobilität
4.35) [37].
4
5
6
7
8
9
10
pH
Abb.4.35: EM von "Pseudomonas spezies 6537" in Abhängigkeit des pH-Wertes
einer Kochsalzlösung der Ionenstärke 5 mM
U = 30 kV; Lges = 144,5cm; Leff = 116,5cm; Injektion: 0,3mbar*min
Bei pH-Werten zwischen 6 und 10 bleibt die EM nahezu konstant. Hier ist die
Protonenkonzentration so gering, daß nach Gleichung 27 das Gleichgewicht vollständig
auf der rechten Seite liegt. Erst bei pH-Werten unter 6 ist eine deutliche Verschiebung
des Gleichgewichts und somit eine Abnahme des Dissoziationsgrades beobachtbar. Bei
genügend geringem pH-Wert wäre ein Rückgang der Mobilität auf Null zu erwarten
gewesen: Alle funktionellen Gruppen sind protoniert. Rein theoretisch ist eine Umkehr
der Mobilität möglich, da basische funktionelle Gruppen vorhanden sein können, die bei
der Protonierung eine positive Ladung erzeugen. Dies konnte experimentell nicht
bestimmt werden, da bei diesen niedrigen pH-Werten ein Arbeiten mit diesen Bakterien
88
4.6 Elektrophoretische Mobilität
nicht mehr möglich war: Bereits beim Waschvorgang erfolgte eine Koagulation der
Zellen, die inhomogene Suspensionen zur Folge hatte.
Von praktischer Relevanz ist allerdings hauptsächlich die pH-Konstanz im Bereich von
6-10 (vgl. Abb. 4.36). Daraus ergibt sich die Möglichkeit, Puffer verschiedener pH-
0,8
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
-4
2
[10 cm /Vs]
Elektrophoretische Mobilität
Werte miteinander vergleichen zu können.
0,0
0,0
7
8
9
10
11
pH
Abbildung 4.36: Mobilitätskonstanz im neutralen und schwach alkalischen Bereich am
Beispiel von „Pseudomonas spezies 1749“; Puffer: Phosphat pH 7, c = 2 mM;
Kapillare: Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, 75 µm I.D. ; U = 30 kV, I = 50 kVs
4.6.3 Einfluß der Pufferzusammensetzung
Nicht nur der pH-Wert vermag die Lage des Gleichgewichts von Gleichung 27 zu
beeinflussen, sondern auch andere Kationen:
R fG − K
→
←
R fG
−
+ K+
(28)
K: Kation
Je nach vorhandenen Kationen erhält man unterschiedliche Gleichgewichtskonstanten,
wodurch die Lage des Gleichgewichts und somit die Gesamtladung der Zellen
89
4.6 Elektrophoretische Mobilität
beeinflußt wird. [5,20] Deshalb wurde beim Vergleich verschiedener Puffer jeweils Na+
als Gegenion, bzw. NaOH zur Einstellung des pH-Wertes verwendet.
Geht man vereinfacht von einer kugelförmigen Zelle mit dem Radius 0,5 µm und einer
Mobilität von 10-4 cm2/Vs aus, so läßt sich die effektive Ladung der Zelle berechnen.
Die Viskosität des Puffers beträgt in etwa η = 10-3 Ns/m2. Ausgehend von Gleichung 7
läßt sich mit diesen Daten die Ladung ermitteln:
q = 6 π⋅ µ ⋅r ⋅η
⇒
q = 6 π ⋅10 −8
(7a)
m2
Ns
⋅ 0,5 ⋅10 −6 m ⋅10 −3 2
V ⋅s
m
= 9,4 ⋅10 −17 C
Die Elementarladung beträgt e =1,6 ⋅10 −19 C
Daraus ergibt sich eine effektive negative Gesamtladung der Zelle von:
q
n = = 589
e
Bei Verwendung eines 2 mM Phosphatpuffers wurden mit Gleichung 7 für die Spezies
„Pseudomonas spezies 6537“ die Ladung q = 2,7 ⋅10 −16 C ermittelt, was ca. 1700
Elementarladungen entspricht. Für „Pseudomonas spezies 1749“ ergibt dies
entsprechend 500 Ladungen. Berücksichtigt man die Größe der Zelle, so erscheint diese
Zahl doch eher gering. Es stellt sich daher die Frage, ob sich die Zahl an Ladungsträgern
erhöhen läßt. Die natürliche Zahl der funktionellen Gruppen auf der Oberfläche ist
begrenzt. Eine gezielte spezifische Änderung der Ladung läßt sich durch Zugabe von
Immunoreagenzien erreichen [40,41]. Diese Reagenzien heften sich spezifisch an
entsprechende Zellen, wodurch die Oberflächenbeschaffenheit und somit die Ladung der
Zelle verändert wird. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, daß im Prinzip für jede
Bakterienart ein eigenes Reagenz benötigt wird. Dieses aufwendige Verfahren ist
sicherlich nur in Einzelfällen als sinnvoll zu betrachten, da die Reaktion zudem
irreversibel verläuft, so daß die Zellen im Anschluß meist nicht mehr verwendbar sind.
90
4.6 Elektrophoretische Mobilität
Hieraus resultiert die Forderung nach einem unspezifischen Puffer, bzw. Zusatz, der
reversibel in Form einer Gleichgewichtseinstellung mit der Zelloberfläche reagiert, bzw.
wechselwirkt.
Dabei sollte es sich um Verbindungen handeln, die zum einen Ladungen tragen und zum
anderen „zellophil“ sind, d.h. mit der Zelloberfläche in Wechselwirkung treten. Die
Zelloberfläche besteht größtenteils aus Peptid- und Zuckerbausteinen. Es sind daher
hauptsächlich Verbindungen von Interesse, die Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden
können.
Bei den folgenden Untersuchungen wurden 5 verschiedene Puffer getestet:
• Phosphatpuffer pH 7
• Glucose-1-phosphat pH 8,5
• Glutardialdehydbis(natriumhydrogensulfit) pH 7
• Schleimsäure pH 7,2
• Borsäure pH 9,5
In den Darstellungen wurde bewußt auf die Angabe der Konzentration in Form der
Ionenstärke verzichtet. Vor allem bei Boratpuffer ist es nahezu unmöglich, diese zu
bestimmen, da dem Borat keine exakten Strukturformeln zugrunde gelegt werden
können und somit ein direkter Vergleich über die Ionenstärke wenig sinnvoll wird.
In Abb. 4.37 ist die EM in Abhängigkeit der Pufferzusammensetzung exemplarisch für
drei Spezies dargestellt.
Mit Ausnahme des Boratpuffers sind für jede der drei Spezies die EM bei allen
Puffersystemen nahezu identisch, so daß der Art des Puffers keine signifikante Rolle
zukommt. Daraus läßt sich folgern, daß keine relevanten Wechselwirkungen zwischen
Zelloberfläche und Pufferion stattfinden. Die Ausnahmestellung des Boratpuffers zeigt
sich in einem deutlichen Anstieg der EM bei „Pseudomonas spezies 1749“. Diese
Erhöhung der Mobilität von 0,3 auf 0,78 10-4 cm2/Vs resultiert aus einer entsprechenden
Zunahme der Anzahl effektiver Ladungen. Unter der Voraussetzung, daß die Größe der
Zelle in allen Puffersystemen identisch ist, sind in etwa 280 neue Ladungen pro Zelle
entstanden.
Borat ist in der Lage, reversibel mit vicinalen OH-Gruppen u.a. in Zuckermolekülen
unter Ausbildung einer neuen negativen Ladung zu reagieren:
91
4.6 Elektrophoretische Mobilität
OH
HO B OH
OH
+
O - OH
B
O
OH
OH
OH
+ 2 H2O
Diese Zunahme der EM konnte weder bei den anderen beiden Spezies noch bei
Verwendung der anderen genannten Puffersysteme beobachtet werden.
Weshalb diese Reaktion nur bei „Pseudomonas spezies 1749“ stattfindet ist unklar.
Um dies hinreichend aufzuklären, wäre eine genaue strukturelle Untersuchung der
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
Borat
pH 9,5
4,5
Schleimsäure
pH 7,2
4,5
Glutardialdehydbis(natriumhydrogensulfit)
pH 7
5,0
Glucose-1phosphat
pH 8,5
5,0
Phosphat
pH 7
-4
2
[10 cm /Vs]
Elektrophoretische Mobilität
Zellhüllen aller verwendeten Spezies notwendig.
Abbildung 4.37: EM in Abhängigkeit der Pufferzusammensetzung bei gleicher
Konzentration (c = 10 mM) für „Micrococcus luteus“ (schwarz), „Pseudomonas
spezies 1749“ (grau) und „Pseudomonas spezies 6537“ (weiß).
Kapillare: 75 µmI.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm; U = 30 kV, I = 50 kVs
Parallel mit der Erhöhung der Mobilität bei „Pseudomonas spezies 1749“ durch den
Boratpuffer ist ein Einbruch der Bodenzahl zu beobachten (vgl. Abb. 4.17). Erfolgt die
Reaktion des Borations relativ ungleichmäßig mit den Zellen, so verursacht dies eine
92
4.6 Elektrophoretische Mobilität
größere Streuung der Oberflächenladung. Eine verstärkte Bandenverbreiterung ist die
Folge.
93
4.6 Elektrophoretische Mobilität
4.6.4 Einfluß der Pufferkonzentration
Wie bereits in Kapitel 4.6.3 erwähnt, können im Puffer befindliche Kationen die Anzahl
der Zelladungen beeinflussen (vgl. Geichung 28). Die Lage des Gleichgewichts ist
konzentrationsabhängig. Es ist daher zu erwarten, daß sich mit abnehmender
Pufferkonzentration die Ladung bzw. die EM
erhöht, da sich die Lage des
Gleichgewichts aus Gleichung 28 nach rechts verlagert.
In Abb. 4.38 ist der konzentrationsabhängige Verlauf der EM für verschiedene
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
-4
2
[10 cm /Vs]
Elektrophoretische Mobilität
Bakterienspezies dargestellt.
0,0
0,0
0
2
4
6
8
10
Pufferkonzentration [mmol/L]
Abbildung 4.38: EM-Verlauf in Abhängigkeit der Pufferkonzentration für
„Micrococcus luteus“ (O), „Pseudomonas spezies 1749“ (!) und „Pseudomonas
spezies 6537“ (∆); Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm;
Puffer: Phosphat; U = 30 kV, I = 50 kVs
Es ist deutlich zu erkennen, daß die Bakterien bei sehr geringen Konzentrationen eine
relativ große EM besitzen. Diese nimmt mit zunehmender Konzentration des Puffers ab:
Die Kurve geht in eine Parallele zur x-Achse (Pufferkonzentrationsachse) über. Die EM
zeigt oberhalb einer bestimmten Konzentration (hier in etwa 5 mM) keine signifikante
Veränderung mehr. Dieser Kurvenverlauf geht mit den Ergebnissen, die aus Gleichung
28 resultieren, konform. Der extreme Anstieg der Mobilität im niedrigen
Konzentrationsbereich bleibt dabei zunächst ungeklärt. Geht man davon aus, daß sich
94
4.6 Elektrophoretische Mobilität
die Form der Zelle nicht gravierend verändert (bei geringeren Konzentrationen wird die
Zelle unter Umständen auf Grund des osmotischen Drucks „aufgebläht“, was zu einer
Verringerung der EM nach Gleichung 7 führen müßte), so muß sich die effektive
Ladung erhöhen. Da an der Oberfläche nur begrenzt Ladungsträger vorhanden sind, ist
es denkbar, daß bei geringen Konzentrationen tiefere Schichten der Zellhülle zur
Ladungserzeugung beitragen, indem die „gebundenen“ mobilen Gegenionen aus der
Zelle wandern. Y. Nakano berichtet von einem Abschirmeffekt der Elektrolytionen
gegenüber in tieferen Zellschichten gelegenen funktionellen Gruppen [12]. Dieser
Abschirmeffekt verringert sich mit abnehmender Konzentration des Puffers, wodurch
die Gesamtladung der Zelle zunimmt.
Sehr gut ist in Abb. 4.38 zu erkennen, daß dieser Effekt bei Zellen mit geringer
Mobilität stärker ausgeprägt ist. Durch Variation der Pufferkonzentration läßt sich somit
2,5
2,5
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
-4
2
[10 cm /Vs]
Elektrophoretische Mobilität
die EM gezielt verändern.
0,0
0,0
0
10
20
30
40
Pufferkonzentration [mmol/L]
Abbildung 4.39: EM-Verlauf in Abhängigkeit der Pufferkonzentration von
„Pseudomonas spezies 1749“ für Puffer aus Borat pH 9,5(!), Phosphat pH 7 (O),
Glutardialdehyd(bisnatriumhydrogensulfit) pH 7 ( ∇), Glucose-1-phosphat pH 8,5 (∆)
und Schleimsäure pH 7,2 ( ); Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm;
U = 30 kV, I = 50 kVs
95
4.6 Elektrophoretische Mobilität
Abb. 4.39 bestätigt die Vermutung aus dem Kapitel 4.6.3, daß die Puffersysteme
Phosphat,
Glucose-1-phosphat,
Glutardialdehydbis(natriumhydrogensulfit)
und
Schleimsäure keine Wechselwirkungen mit der Zelle eingehen. Der Kurvenverlauf ist
bei allen 4 identisch.
Somit ist also nur das Gegenion (Na+) für die Änderung der Mobilität verantwortlich.
Boratpuffer zeigt einen ähnlichen Kurvenverlauf wie die anderen 4 Puffersysteme.
Allerdings ist die Kurve sowohl entlang der x- als auch y-Achse verschoben. Sehr
deutlich ist zu erkennen, daß der Grenzwert für die EM bei zunehmender
Pufferkonzentration deutlich höher liegt. Da dies nicht auf das Gegenion
zurückzuführen ist (bei allen gleich: Na+), muß das Borat-Ion für die veränderte
Mobilität verantwortlich sein (vgl. Kapitel 4.6.3).
4.6.5 Einfluß der Nährlösung
Da die EM direkt abhängig vom Aufbau der Zellwand ist, galt es zu untersuchen, ob
eine Veränderung der EM bzw. des Zellwandaufbaus durch Variation der
Nahrungsquelle der Bakterien erreicht werden kann. Deshalb wurde „Pseudomonas
spezies 6537“ zum einen mit Vollmedium und zum anderen mit speziellem
Mineralmedium angezüchtet. Beim letzteren sind nur die für das Wachstum absolut
notwendigen Komponenten enthalten.
Vergleiche der beiden Elektropherogramme ergaben allerdings keinen signifikanten
Unterschied, weder bei der EM noch bei der Bodenzahl.
Es war daher kein meßbarer Einfluß der Nährlösung auf die elektrophoretischen
Eigenschaften der Zellen zu erkennen.
96
4.7 Trennung von Bakterien
4.7 Trennung von Bakterien
Die Isolierung bzw. Trennung von Mikroorganismen hat in der Bakteriologie und
Mikrobiologie eine große Bedeutung. Bisher konnte der Versuch, Zellen zu isolieren,
prinzipiell in zwei Kategorien eingeteilt werden, die "Einzelzell"- und die
Fraktionierungsmethode.
Die "Einzelzell-Methode" schließt Techniken wie das Aufbringen der Zellen auf
Nährplatten, Zellsortierungen sowie Mikroverfahren ein. Hierbei werden die einzelnen
Organismen aus einer Zellmischung räumlich getrennt und anschließend zu einzelnen
Kolonien herangezogen. Obwohl hierbei eine hohe Auflösung erreicht werden kann,
eignen sich diese Techniken lediglich zur Abtrennung einzelner spezifischen Zelltypen,
während ein mögliches Übergewicht an anderen Organismen in der Probe ignoriert
wird.
Fraktionierungstechniken, wie unterschiedliche Zentrifugations-, Filtrations- und
Adsorptionsmethoden, werden in der Wachstumsphase der Zellen angewendet. Hierbei
werden Mischungen in Untergruppierungen aufgetrennt, welche unterschiedliche
biologische, chemische und/oder physikalische Eigenschaften besitzen. Die Auflösung
ist jedoch stark begrenzt und es existieren nur sehr wenige Zelltypen, die sich auf diese
Weise von einem komplexen Gemisch abtrennen lassen.
Bisher ermöglichen weder die "Einzelzell"- noch die Fraktionierungsmethode eine
zuverlässige Quantifizierung von mikrobiologischen Untergruppen in einer komplexen
Mischung.
Die elektrophoretische Trennung von Zellen ist schon seit einigen Jahrzehnten eine
interessante analytische und präparative Technik, der vor allem in medizinischen,
mikrobiologischen und biotechnologischen Bereichen große Bedeutung zukommt.
Es existieren eine Vielzahl von Verfahren zur Erfassung einzelner Zelltypen, sowohl im
präparativen als auch im nichtpräparativen Maßstab. [41-57]
Mit der Entwicklung der Kapillarelektrophorese entstand nun eine Methode, bei der das
Problem der Wärmeerzeugung und des hohen Zeitaufwandes minimiert werden konnte
[25,58].
97
4.7 Trennung von Bakterien
Unterscheiden sich Bakterien ausreichend in ihrer EM, so müßten sich diese theoretisch
mittels CE trennen lassen (vgl. Abb. 4.40).
Durch Variation der Pufferkonzentration ist eine Veränderung der Mobilitäten innerhalb
gewisser Grenzen möglich (vgl. Kapitel 4.6.4).
AU
3
2
1
1
5
8
10
12
14 Zeit [min]
Abbildung 4.40: Elektropherogramm eines einfachen Bakteriengemisches:
1= Thioharnstoff, 2 = „Rhodococcus erythropolis“, 3 = „Sphingomonas spezies“
Puffer: Phosphat pH 7, c = 2mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, I
= 50 kVs, U = 30 kV
Abb. 4.38 zeigt, daß die Differenz der EM der beiden Spezies „Pseudomonas spezies
6537“ und „Micrococcus luteus“ mit steigender Konzentration des Phosphatpuffers
zunimmt. Um diese beiden Spezies voneinander trennen zu können, ist die Verwendung
eines höher konzentrierten Puffers notwendig.
Jedoch ist nicht nur die EM-Differenz allein ausschlaggebend, auch die Peakbreite bzw.
Bodenzahl der Bakterien sind von Bedeutung. Als Maß für die Trennqualität zweier
Peaks wurde in der Analytik die Auflösung R eingeführt. Sie hängt direkt von der
Bodenzahl und der Differenz der Mobilität ab [36]:
98
4.7 Trennung von Bakterien
1 1 ∆µ
R= N 2 ( )
4
µ
(29)
N: Bodenzahl
µ : Gemittelte EM
Mit steigender Pufferkonzentration nimmt die Bodenzahl zu (vgl. Kapitel 4.5.2). Dies
bedeutet, daß mit zunehmender Konzentration die Trennqualität steigen muß. In Abb.
4.41 und 42 ist dieser Effekt zu erkennen: Bei einer Konzentration von c = 2 mM ist
keine Trennung der beiden Bakterienarten möglich. Man erhält lediglich einen Peak
dessen Maximum zwischen den Mobilitäten der zu trennenden Spezies liegt. Erst bei
einer Konzentration von c = 10 mM ist eine vollständige Trennung möglich (vgl. Abb.
4.42).
AU
2
1
1
5
8
10
12
14 Zeit [min]
Abbildung 4.41: Elektropherogramm eines dimeren Gemisches; 1 = Thioharnstoff,
2 = Gemisch aus „Pseudomonas spezies 6537“ und „Micrococcus luteus“
Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, I
= 50 kVs, U = 30 kV
99
4.7 Trennung von Bakterien
AU
3
1
2
1
5
8
10
12
Zeit [min]
Abbildung 4.42: Elektropherogramm eines dimeren Gemisches; 1 = Thioharnstoff,
2 = „Pseudomonas spezies 6537“ und 3 = „Micrococcus luteus“
Puffer: Phosphat pH 7 c = 10 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm,
I = 50 kVs, U = 30 kV
Die Verwendung des konzentrierteren Puffers ist nicht immer von Vorteil. Durch die
erhöhte Pufferkonzentration verringert sich der EOF, d.h. die Analysenzeit nimmt zu.
Dies wird zum Teil durch die abnehmende EM der Bakterien kompensiert.
Durch die verstärkte Wärmeerzeugung nimmt jedoch die Stabilität der Zellen ab. Dies
ist v.a. bei Bakterien mit einer großen Mobilität problematisch, da diese der Belastung
über längere Zeit ausgesetzt sind. Zusätzlich wird durch die Verringerung der EM
automatisch das Detektionszeitfenster verringert. Auch bei Bakterien mit einer geringen
EM ist die Verwendung konzentrierter Puffer von Nachteil, da die EM-Differenzen
absolut gesehen sehr gering werden.
Für Bakteriengemische, wie in Abb. 4.43 dargestellt, ist ein höher konzentrierter Puffer
notwendig: c = 10 mM. Eine geringe Konzentration des Puffers würde zu keiner
vollständigen Trennung der Bakterien 3 und 4 führen (vgl. Abb. 4.41 und 42).
100
4.7 Trennung von Bakterien
2
AU
1
3
1
5
8
10
4
12
5
14
16
Zeit [min]
Abbildung 4.43: Trennung eines Bakteriengemisches mittels CE; 1 = Thioharnstoff,
2 = „Pseudomonas spezies 1749“ und 3 = „Pseudomonas spezies 6537“,
4 =„Micrococcus luteus“, 5 = „Serratia ficaria“
Puffer: Phosphat pH 7 c = 10 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm,
I = 50 kVs, U = 30 kV
In Abb. 4.43 ist eine verschlechterte Auflösung im vorderen Bereich des
Elektropherogramms (Peak 1 und 2) zu erkennen. Dies resultiert aus der starken
Verringerung der Mobilität dieser Zellen.
Oftmals ist zu beobachten, daß sich die gemessenen Mobilitäten der Bakterien aus
Gemischen von denen der Reinkulturen unterscheiden: Die Zellen behindern sich
vermutlich gegenseitig (Wechselwirkungen untereinander), so daß eine Auftrennung
erschwert wird. Die gemessene EM ist scheinbar erniedrigt. Zusätzlich findet eine
Beeinflussung der Bodenzahl der Bakterien statt. So werden für „Pseudomonas spezies
1749“ anstatt 120000 nur noch 33000 Böden erreicht.
Bei einer verbleibenden EM von etwa 0,18 anstatt 0,32 10-4 cm2/Vs für „Pseudomonas
spezies 1749“ und einer verbleibenden Bodenzahl von 33000, läßt sich aus Abb. 4.43
ableiten, daß z.B. eine Trennung der Bakterien „Pseudomonas spezies 1749“ und
101
4.7 Trennung von Bakterien
„Pseudomonas putida 548“ oder Bakterien ähnlicher Mobilität unter diesen
Bedingungen nicht möglich ist.
Wird die Konzentration des Puffers erniedrigt, so nimmt zwar die Bodenzahl wieder ab,
dafür die EM aber zu. Bei einer Pufferkonzentration von 2 mM (vgl. Abb. 4.44) wurden
die beiden Spezies „Pseudomonas putida 548“ und „Pseudomonas spezies 5536“
vollständig getrennt, während dies bei c = 10 mM nicht möglich gewesen wäre.
1
AU
5
3
4
2
2
4
6
8
10
12
14 Zeit [min]
Abbildung 4.44: Trennung eines Bakteriengemisches mittels CE; 1 = Thioharnstoff,
2 = „Pseudomonas putida 548“ und 3 = „Pseudomonas spezies 5536“,
4 =„Pseudomonas spezies 6537“, 5 = „Paracoccus denitrificans 65“
Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, Leff = 100 cm, I
= 50 kVs, U = 30 kV
102
4.7 Trennung von Bakterien
Ausschlaggebend für die Wahl des Puffers bzw. dessen Konzentration ist daher das
jeweilige Trennproblem. Es ist dabei gut möglich, daß nicht alle Bakterien eines
Gemisches gleichzeitig getrennt werden können. In diesem Fall muß man sich auf die
Trennung von Teilen des Bakteriengemisches beschränken.
Für die Auswahl des Puffers lassen sich folgende generelle Regeln formulieren:
• Bakterien mit geringer EM: Verwendung eines Puffers mit geringer Konzentration
• Bakterien mit mittlerer EM: Verwendung eines Puffers mit erhöhter Konzentration
• Bakterien mit hoher EM: Verwendung eines Puffers mit geringer Konzentration
Wie aus den Abb. 4.43 und 44 hervorgeht, ist die Zahl möglicher Peaks stark begrenzt.
Sie beträgt in etwa 8-10. Durch Variation des Puffers und durch „splitten“ der Analyse,
läßt sich die Zahl der trennbaren Bakterienarten sicherlich etwas erhöhen. Eine
vollständige Auftrennung komplexer Bakteriengemische mittels CE ist dagegen nicht
möglich. Jedoch können durch geschickte Wahl der Parameter einzelne Arten aus einem
solchen Gemisch abgetrennt werden. In jedem Fall ist eine Vortrennung möglich,
wodurch die Gesamtzahl an Kulturen pro Volumeneinheit (s. auch Kapitel 4.8) stark
verringert und weiteres Bearbeiten mit herkömmlichen Methoden erleichtert wird.
103
4.8 Fraktionierung von Bakterien
4.8 Fraktionierung von Bakterien
Zusätzlich zur Charakterisierung von Mikroorganismen über die EM können die
Bakterien mittels CE getrennt und fraktioniert werden. Daraus ergibt sich die
Möglichkeit, die isolierten Bakterien zusätzlich mit herkömmlichen Methoden zu
untersuchen.
4.8.1 Vollständige Trennung von Bakterien ?!
Wird die Gaußverteilung zu Grunde gelegt, so wird rein mathematisch niemals eine
vollständige Trennung erreicht, d.h. ein Teil einer Verbindung kommt immer als
Verunreinigung im Peak der anderen Verbindung vor (vgl. Abb. 4.45).
Abbildung 4.45: Auflösung zweier Peaks
Dabei gibt die Auflösung das Ausmaß an, in dem Peaks bei einer chromatographischen
Trennung aufgelöst werden. In der Regel spricht man in der Analytik von vollständiger
Trennung bei einer Auflösung von R > 1,5. Dies bedeutet eine Verunreinigung der
Peakflächen von kleiner als 0,1 %. Bei einer Injektion von 10 000 Zellen einer Spezies
bedeutet dies, daß 10 Zellen als Verunreinigung im Peak der anderen Spezies
vorkommen.
104
4.8 Fraktionierung von Bakterien
Es wird somit deutlich, daß eine vollständige Trennung (100%) der Bakterien nur sehr
schwer erreichbar ist. Daher ist es sinnvoll, mit relativ wenig Zellen zu arbeiten, da
dadurch die Wahrscheinlichkeit abnimmt, daß eine Zelle als Verunreinigung in einer
anderen
Fraktion
enthalten
ist.
Die
Wahrscheinlichkeit
der
Existenz
von
Verunreinigungen durch eine unvollständige Trennung kann allerdings nie gleich Null
gesetzt werden.
4.8.2 Diskontinuierliche Fraktionierung
Die diskontinuierliche Fraktionierung ist denkbar einfach: Das Outlet-Vial wird in
bestimmten Zeitabständen ausgetauscht. Dazu ist jeweils eine Unterbrechung des
Stromflusses und somit der Elektrophorese notwendig. Es werden also Fraktionen über
einen gewissen Zeitraum gesammelt. Zur Bestimmung der Zellzahl in den einzelnen
Fraktionen wird ein definierter Volumenanteil der Fraktion auf Agarplatten
(Vollmedium - Kapitel 4.1 - mit 1,2 % Agar) ausgestrichen und nach einer gewissen
Wachstumszeit erfolgt die Auszählung der Kolonien. Hierbei können lediglich die im
Eluat befindlichen, lebenden und teilungsfähigen Zellen bestimmt werden.
Experimentelle Bedingungen:
Für die Probensuspension wurden 700 µL Phosphatpuffer (2mM) mit Thioharnstoff als
Totzeitmarker steril vorgelegt und, soweit nicht anders angegeben, mit jeweils 10 µL
der Nährbakteriensuspension versetzt. Dies ergibt eine Verdünnung der Zellsuspension
um den Faktor 71.
Konditionierung:
Die Kapillare (Lges= 111 cm, Leff= 100 cm, 75 µm I.D.) wurde
• 3 Minuten bei 1,5 bar mit 0,2 N Natronlauge
• 3 Minuten bei 1,5 bar mit 2 mM Phosphatpuffer steril
• 3 Minuten bei 1,5 bar mit 2 mM Phosphatpuffer steril (frisches Vial)
konditioniert.
105
4.8 Fraktionierung von Bakterien
Zur Fraktionierung wurden im Outlet-Vial jeweils 600 µL steriler Phosphatpuffer (2
mM) vorgelegt. Nach verstreichen der Totzeit wurden die Vials in bestimmten
Zeitintervallen gewechselt.
Von jeder Fraktion wurden 100 µL entnommen und auf Agarplatten ausgebracht. Je
nach Wachstumsgeschwindigkeit wurden die Kolonien auf den Platten nach 18 bis 32
Stunden ausgezählt (vgl. Abb. 4.46).
Da bei der Bestimmung nur das Verhältnis der Zellen zwischen den einzelnen
Fraktionen von Bedeutung ist, wurde in Abb. 4.47 und 48 nicht die Gesamtzellzahl als
Funktionsparameter verwendet, sondern die gezählten Kolonien bzw. „Zellen“ - aus
jeder teilungsfähigen Zelle entsteht eine Kolonie - auf eine bestimmte Sammelzeit
normiert und entsprechend aufgetragen. Daher wurde der Begriff „relative Zellzahl“
verwendet.
Für eine Quantifizierung sind die entsprechenden Verdünnungen bzw. Arbeitsschritte zu
berücksichtigen.
Bei der Durchführung der Fraktionierung sind folgende Punkte zu beachten:
• Die Zellzahl der Bakterien ist zu gering als daß eine UV-Detektion möglich wäre
• Die Migrationszeiten unterscheiden sich von den bisherigen, da die „Elution“ nicht
mehr beim Erreichen des Detektionsfensters, sondern erst beim Erreichen des
Kapillarendes erfolgt. Bei Verwendung obiger Kapillare erhöhen sich die vom UVDetektor bestimmten Migrationszeiten um den multiplikativen Faktor F =
L ges
L eff
= 1,11 .
Beträgt die gemessene Totzeit 7 Minuten, so beträgt die tatsächliche Totzeit
7,77 Minuten.
• Die Fraktionierung wird nach Erreichen der tatsächlichen Totzeit begonnen.
In Abb. 4.47a ist das Ergebnis einer solchen Fraktionierung graphisch dargestellt.
Wichtig bei der Diskussion dieser Darstellung ist, sich stets bewußt zu sein, daß es sich
um eine diskontinuierliche Fraktionierung handelt: Die aufgetragenen Werte stellen nur
Mittelwerte über einen definierten Zeitraum dar. Erst bei infinitesimal kleinen
Zeitabschnitten würde die diskontinuierliche in eine kontinuierliche Fraktionierung
übergehen. Es ist daher sinnvoll, das Ergebnis im Balkenformat darzustellen (vgl. Abb.
4.47b).
106
4.8 Fraktionierung von Bakterien
1
2
3
5
4
6
Abbildung 4.46: Fraktionierung von „Serratia ficaria“: 6 Fraktionen von je 0,7 min.
107
relative Zellzahl
4.8 Fraktionierung von Bakterien
500
500
400
400
300
300
200
200
100
100
0
0
6
8
10
12
14
16
M igrationszeit [min]
relative Zellzahl
Abbildung 4.47a: Fraktionierung von „Pseudomonas spezies 1749“ und „Serratia
ficaria“ nach der elektrophoretischen Trennung; Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM;
Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, I = 50 kVs, U = 30 kV; Fraktionen: ∆t: 0,5 min, t0
= 6,86 min
500
500
400
400
300
300
200
200
100
100
0
0
6
8
10
12
14
16
M igrationszeit [min]
Abbildung 4.47b: Fraktionierung von „Pseudomonas spezies 1749“ und „Serratia
ficaria“ nach der elektrophoretischen Trennung (Säulendiagramm);
Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm,
I = 50 kVs, U = 30 kV; Fraktionen: ∆t: 0,5 min, t0 = 6,86 min
108
4.8 Fraktionierung von Bakterien
Dadurch
wird
allerdings
ein
Direktvergleich
mit
einem
entsprechenden
Elektropherogramm erschwert.
Ein wesentlicher Unterschied zwischen Elektropherogramm und der Bestimmung der
relativen Zellzahl nach erfolgter Fraktionierung basiert auf der Detektion. Der UVDetektor erkennt unspezifisch alle Zellen unabhängig von ihrem Zustand. Bei der
Zellfraktionierung werden allerdings nur die lebenden noch teilungsfähigen Zellen
erfaßt. Es lassen sich daher Vergleiche zwischen den teilungsfähigen Zellen und der
Gesamtzellzahl bezüglich EM und Bodenzahl anstellen.
In Abb. 4.48 und 49a ist das Elektropherogramm bzw. die Fraktionierung eines
trimeren Bakteriengemisches dargestellt.
AU
2
1
4
3
1
5
7
9
11
13
Zeit [min]
Abbildung 4.48: Trennung eines Bakteriengemisches mittels CE; 1 = Thioharnstoff,
2 = „Pseudomonas spezies 1749“, 3 =„Pseudomonas spezies 6537“, 4 = „Serratia
ficaria“; Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm,
Leff = 100 cm, I = 50 kVs, U = 30 kV
109
4.8 Fraktionierung von Bakterien
Die injizierten Zellmengen unterscheiden sich bei den beiden Versuchsdurchführungen
auf Grund der Detektionsprobleme erheblich (Faktor 23). Das Verhältnis der Zellzahl
zueinander ist jedoch identisch.
Es ist deutlich zu erkennen, daß die Bodenzahl der „Peaks“ durch die Fraktionierung
deutlich verringert wurde. Dies ist allerdings wie bereits erwähnt, auf die relativ große
Sammelrate der einzelnen Fraktionen zurückzuführen. Die Peakformen der Bakterien
sind in beiden Abbildungen in etwa vergleichbar. Beide „Serratia ficaria“-Signale
weisen ein Fronting auf. Ebenso ist das Verhältnis der Peakhöhen in den beiden
Abbildungen vergleichbar.
Das Elektropherogramm ist über mehrere Wochen hinweg reproduzierbar, selbst wenn
keine teilungsfähigen Zellen mehr vorhanden sind.
Der direkte Vergleich der teilungsfähigen Zellen mit der Gesamtzellzahl hat gezeigt, daß
kein Unterschied zwischen den Zellen besteht, welcher die Elektrophorese in
irgendeiner Art beeinflussen könnte.
Die Fraktionierung hat gegenüber der UV-Detektion einen großen Vorteil:
Der UV-Detektor ist lediglich in der Lage, die Zellen unspezifisch zu erfassen. Er ist
nicht in der Lage, einzelne Spezies zu unterscheiden. Bei Verwendung von Agarplatten
in
der
Fraktionierung
haben
Bakterienarten
in
der
Regel
unterschiedliche
Wachstumsgeschwindigkeiten. Viele Bakterien lassen sich daher anschließend durch
Form, Farbe und Größe der Kolonien unterscheiden. Werden zusätzlich SelektivAgarplatten verwendet, so wird dieser Effekt noch verstärkt. Man erhält somit eine
selektive Detektion. Während in Abb.4.49a nur die Summe aller Zellen aufgetragen
wurde, kann nun für jede Bakterienart die Zellverteilung angegeben werden, wodurch
eventuelle Überschneidungen bzw. Verunreinigungen deutlich sichtbar werden (vgl.
Abb. 4.49b).
110
relative Zellzahl
4.8 Fraktionierung von Bakterien
400
400
350
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0
0
6
8
10
12
14
16
18
20
M igrationszeit
relative Zellzahl
Abbildung 4.49a: Fraktionierung von „Pseudomonas spezies 1749“,“Pseudomonas
spezies 6537“ und „Serratia ficaria“ nach der elektrophoretischen Trennung;
Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, I = 50 kVs,
U = 30 kV; Fraktionen: ∆t: 0,75 min, t0 = 7,50 min
400
400
350
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0
0
6
8
10
12
14
16
18
M igrationszeit [min]
Abbildung 4.49b: Fraktionierung von „Pseudomonas spezies 1749“(____),
“Pseudomonas spezies 6537“(- - - ) und „Serratia ficaria“(. . . .) nach der elektrophoret.
Trennung; Puffer: Phosphat pH 7 c = 2 mM; Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm,
I = 50 kVs, U = 30 kV; Fraktionen: ∆t: 0,75 min, t0 = 7,50 min
111
4.8 Fraktionierung von Bakterien
4.8.3 Anwendungsmöglichkeiten
Durch Kombination der CE mit der anschließenden Fraktionierung und der Verwendung
von Selektiv-Agarplatten entsteht eine Methode mit hoher Auflösung und Selektivität.
Zusätzlich zeichnet sich diese Methode durch einen relativ geringen Zeitaufwand und
vernachlässigbarer Diskriminierung einzelner Bakterienarten aus. Daher ergeben sich
eine Reihe von Anwendungsgebieten:
• Auftrennung, Identifizierung und Isolierung von Bakterien aus einfachen Gemischen
zur Erhaltung von Reinkulturen.
• Identifizierung und Abtrennung von Verunreinigungen aus kontaminierten
Reinkulturen. Hierbei ist die hohe Selektivität und die fehlende Diskriminierung von
großem Nutzen. Selbst geringste Verunreinigungen können erkannt werden. In Abb.
4.50 wurde eine 0,43 %ige Verunreinigung der Spezies „Pseudomonas spezies 1749“
mit „Serrtia ficaria“ simuliert.
• Es existieren Bakterienarten, die mit anderen Bakterienspezies in Symbiose leben.
Eine Isolierung mit herkömmlichen Methoden war bisher meist nicht möglich, da
diese Kulturen nur in Kombination mit ihrem Symbionten leben bzw. sich vermehren
können. Es ist daher nicht möglich eine Reinkultur zu erhalten. Durch die Trennung
dieser Zellen mittels CE kann nun eine größere Zahl dieser Zellen relativ einfach
isoliert werden.
112
4.8 Fraktionierung von Bakterien
1
2
3
Abbildung 4.50: Abtrennung einer simulierten Kontamination von 0,43 % „Serratia
ficaria“ in „Pseudomonas spezies 1749“: t0 = 7,3 min; 1. Fraktion: „Pseudomonas
spezies 1749“ (∆t = 3 min), 2. Fraktion: Leer (∆t = 2 min), 3. Fraktion: Verunreinigung
„Serratia ficaria“(∆t = 4 min). Phosphat pH 7 c = 2 mM;
Kapillare: 75 µm I.D., Lges = 111 cm, I = 50 kVs, U = 30 kV
113
114
IV
Zusammenfassung
und
Literaturverzeichnis
115
116
5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
In dieser Arbeit sollte die Kapillarelektrophorese als neue Methode bei der
Charakterisierung von Mikroorganismen eingeführt werden.
Dazu mußte eine Apparatur angefertigt werden, die den speziellen Anforderungen
gerecht wurde. Flexibilität und leichte Handhabbarkeit ermöglichten einen raschen
Wechsel von Kapillaren und Puffersystemen.
Um eine optimale Detektion zu gewährleisten, war eine Bestimmung des
Absorptionsmaximums der Zellen notwendig, da eine Streulichtmessung für dieses
System keine ausreichende Empfindlichkeit zeigte. Alle untersuchten Bakterienstämme
wiesen nahezu identische UV-Spektren mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 208
nm auf.
Durch
Variation
des
Kapillardurchmessers
konnte
eine
Abhängigkeit
der
Detektierbarkeit der Bakterien vom Durchmesser der Kapillare beobachtet werden. Bei
kleineren Durchmessern als 75 µm (z.B. 50 µm) ließ sich keine Detektion der Zellen
mehr realisieren.
Die Wärmeerzeugung in der Kapillare, die Temperaturerhöhungen von bis zu 50 K
bedingen kann, stellte einen problematischen Parameter dar.
Durch die Erwärmung der Kapillare wird die elektroosmotische Mobilität stark
beeinflußt: Mit zunehmender Feldstärke steigt die Mobilität an, obwohl nach Definition
diese feldstärkeunabhängig sein sollte.
Zudem erhöht sich die EM der Bakterien mit zunehmender Erwärmung der Kapillare.
Um diesen Temperatureinfluß zu minimieren, wurden Kapillaren mit geringem
Innendurchmesser (75 µm) und Puffer in geringer Konzentration (2mM) verwendet.
Die geringe Stabilität der Zell-Puffersuspension erforderte weitere Optimierungsschritte:
Durch Kühlung der Suspension konnte der Zersetzungsprozeß im Vorfeld verlangsamt
werden.
In 1-2 mM Phosphatpuffern ließ sich sowohl ein Stabilitätsoptimum der Zellen, als auch
ein Optimum der Reproduzierbarkeit ihrer EM erzielen.
Die Lebensdauer der Kapillaren wurde durch die Verwendung von biologischen
Matrices begrenzt: Ablagerungen von Zellfragmenten verringerten den EOF gravierend.
117
5. Zusammenfassung
Vergleiche mit niedermolekularen Verbindungen zeigten, daß Bakterien eine starke
Bandenverbreiterung
aufweisen.
Deshalb
wurden
die
Einflüsse
der
Pufferzusammensetzung und Konzentration auf die Bodenzahl untersucht. Mit einer
Ausnahme konnte kein signifikanter Einfluß des Puffers auf die Bodenzahl festgestellt
werden. Mit Zunahme der Pufferkonzentration war ein Anstieg der Bodenzahl
beobachtbar. Als mögliche Ursache wurden sowohl polarisierende Effekte im
Zellinneren als auch isotachophoretische Effekte diskutiert.
Variationen des Kapillarinnendurchmessers ermöglichten ein Testverfahren zur
Überprüfung von Wandadsorptionseffekten. Bei „Pseudomonas spezies 6537“ ließ sich
keine Wandadsorption nachweisen.
Für präparative Arbeiten wurden größere Kapillardurchmesser (150 µm) verwendet.
Dabei zeigte sich, daß durch Erzeugen eines geringen Gegendrucks der Einfluß des
entstehenden Temperaturprofils minimiert wurde.
Die kapillarelektrophoretische Bestimmung der Bakterien hat sich als wichtige
Ergänzung für ihre Charakterisierung erwiesen. Dabei liefern Peakform, Peakbreite und
die elektrophoretische Mobilität wichtige Informationen über die Bakterien.
Eine Relation der Spezies zur EM war nicht festzustellen: Ähnliche Spezies haben nicht
zwangsläufig ähnliche Mobilitäten. Dadurch ist es möglich, nahezu identische Kulturen
mittels EM zu differenzieren. Durch Erstellung eines Mobilitätskatalogs für Bakterien
wird die Charakterisierung von Mikroorganismen erleichtert.
Des weiteren wurde der Einfluß verschiedener Parameter auf die EM untersucht: Im
Bereich von pH 6-10 ist die EM unabhängig vom pH-Wert. Erst bei Unterschreiten
dieses Bereichs nimmt die Mobilität ab.
4 von 5 getesteten Puffern zeigten keinerlei Einfluß auf die EM der Bakterien. Eine
Wechselwirkung des Puffers konnte somit ausgeschlossen werden. Lediglich in
Boratpuffer wurde ein Anstieg der EM für „Pseudomonas spezies 1749“ beobachtet.
Paralell zu diesem Anstieg der Mobilität verringerte sich die Bodenzahl. Borat ist in der
Lage, mit vicinalen OH-Gruppen unter Bildung eines Fünfrings zu reagieren, wodurch
eine weitere negative Ladung an der Bakterienoberfläche entsteht. Dadurch wird die
Gesamtladung und somit die EM der Zelle erhöht.
Mit zunehmender Pufferkonzentration nimmt die EM der Zellen zunächst stark ab und
strebt mit steigender Konzentration gegen einen Grenzwert. Als Ursache wurde ein
118
5. Zusammenfassung
Abschirmeffekt der Elektrolytionen gegenüber in tieferen Zellschichten gelegenen
funktionellen Gruppen diskutiert.
Variationen der Nährlösung ergaben keine signifikanten Änderungen der EM.
Bakterien, welche sich in ihrer EM unterscheiden, ließen sich mittels CE trennen. Durch
Variation
der
Pufferkonzentration
konnten
je
nach
Anforderungen
die
Trenneigenschaften optimiert werden. Für Bakterien mit geringer und sehr großer
Mobilität sind verdünnte Puffer von Vorteil. Für Bakterien mittlerer Mobilität haben
sich höhere Pufferkonzentrationen vorteilig erwiesen.
Die Zahl möglicher trennbarer Peaks beträgt in etwa 8-10 und kann durch „Splitten“ der
Analyse noch erhöht werden. Bei komplexen Gemischen ist eine Vor- bzw.
Teiltrennung möglich, wodurch weitere Untersuchungen mit herkömmlichen Methoden
erleichtert werden.
Um die Bakterien nach der Trennung weiter verwenden zu können, wurde eine
Fraktionierungsmethode entwickelt.
Mit der Fraktionierung und anschließendem Ausplattieren auf Nährböden können nur
die noch teilungsfähigen Zellen bestimmt werden. Vergleiche mit Elektropherogrammen
mit nicht mehr teilungsfähigen Bakterien haben gezeigt, daß diese Eigenschaften das
Trennverhalten der Bakterien nicht beeinflussen.
Durch Verwendung von Selektivagar wurde ein selektives Detektionsverfahren
entwickelt, welches neben der reinen Bestimmung der Gesamtzellzahl (unspezifisch)
eine Differenzierung der Zellen ermöglichte.
Durch die Kombination der CE mit dieser Fraktionierungstechnik entstand eine
Methode mit hoher Auflösung und Selektivität, wodurch sich eine Reihe von
Anwendungsgebieten erschließen lassen.
119
6. Literaturverzeichnis
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7. Abkürzungen
7. Abkürzungen
Abb.
Abbildung
b0,5
Peakbreite auf halber Höhe
c
Konzentration
CE
Kapillarelektrophorese
E
Elektrische Feldstärke
EM
Elektrophoretische Beweglichkeit
EOF
Elektroosmotischer Fluß
I
Injektionsvolumen
I.D.
Innendurchmesser
N
Trennstufenzahl oder Bodenzahl
U
Spannung
UV
Ultraviolett
125
Danksagungen
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Thomas Welsch für die sehr
interessante und vor allem nicht alltägliche Aufgabenstellung. Er gab mir die
Möglichkeit,
fächerübergreifend
ein
bis
dahin
nahezu
unbekanntes
Gebiet
kennenzulernen und zu erforschen. In dieser Zeit habe ich sehr viel im
wissenschaftlichen wie auch im persönlichen Bereich von ihm gelernt. Sein großes
Engagement, sein Ideenreichtum wie auch seine stete Diskussionbereitschaft haben
maßgeblich zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen. Ganz besonders möchte ich mich bei
ihm dafür bedanken, daß ich an einigen wissenschaftlichen Tagungen im In- und
Ausland teilnehmen durfte, was mir zusätzlicher Anreiz für die tägliche Arbeit war.
Herrn Prof. Dr. H. Jones danke ich für die Erstellung des zweiten Gutachtens.
Herrn Dr. Reuter, Herrn Dr. Buchert, Frau Schlunck und Frau Wenning danke ich für
ihre Hilfe bei kleineren und größeren alltäglichen Problemen.
Ein besonderer Dank gilt meinen Laborkollegen Stefan Kolb, Fred Bäuml, Daniela
Michalke und Martin Schmid für die angenehme Zeit im Labor, mit denen es nie
langweilig wurde. Die wöchentlichen Sitzungen am Freitag nachmittag im kleinen Kreis
werde ich vermissen.
Allen Mitgliedern der Abteilung danke ich für die nette Zeit, viele schöne
Erinnerungen und die gute Zusammenarbeit.
Besonderer Dank gilt Prof. Dr. P. Dürre und Frau Petra Dangel (Abt. Angewandte
Mikrobiologie der Universität Ulm) für ihren fachlichen Rat und die Bereitstellung
mikrobiologischer Ausrüstung.
Zum Schluß möchte ich mich bei meiner Freundin Eva und meinen Eltern bedanken,
die mir stets hilfreich zur Seite gestanden haben.