Diplomarbeit - Universität Wien

Phytochemische Untersuchung von Hypericum irazuense Kuntze und Clusia valerioi Standley (Clusiaceae) Diplomarbeit Zur Erlangung des akademischen Grades einer Magistra der Pharmazie an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl‐Franzens‐Universität Graz eingereicht am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften Bereich Pharmakognosie Betreuer: Dipl. Chem. Dr. Wolfgang Schühly vorgelegt von Marianne Eberhardt Graz, Juni 2009
Die vorliegende Diplomarbeit entstand am Institut für pharmazeutische Wissenschaften der Karl‐Franzens‐Universität im Bereich Pharmakognosie. Bei Univ.‐Ass. Dr. Wolfgang Schühly bedanke ich mich sehr herzlich für die Betreuung meiner Arbeit, für seine versierten Anleitungen und Ratschläge, sowie für die Sammlung und Bereit‐
stellung des Drogenmaterials. Auch möchte ich Ass.‐Prof. Dr. Olaf Kunert für die Durchführung der NMR‐Messungen und für die Hilfe bei den Auswertungen danken. Ein Dankeschön auch an Dr. Sara Crockett für die Sammlung des Pflanzenmaterials und die hilfreichen Ratschläge. Danke auch an Salomé Gachet für die hilfreiche Unterstützung. An dieser Stelle möchte ich noch erwähnen, dass Prof. Anton Weber (Institut für Botanik, Wien) die Anregung zur näheren Beschäftigung mit Clusia gab und im Vorfeld dieser Arbeit mit seinem Rat zur Seite stand. Auch möchte ich hervorheben, dass ohne die biologische Station „La Gamba“ (Costa Rica) diese Diplomarbeit nicht zustande gekommen wäre. Besonders möchte ich mich bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die mich in der Zeit meines Studiums unterstützt haben. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ............................................................................................................................ 1 2. Allgemeiner Teil .................................................................................................................. 2 2.1 Die Familie der Clusiaceae ........................................................................................... 2 2.1.1 Systematische Gliederung .................................................................................... 2 2.1.2 Verbreitung .......................................................................................................... 3 2.1.3 Morphologie ......................................................................................................... 3 2.1.4 Inhaltsstoffe ......................................................................................................... 5 2.1.5 Nutzwert ............................................................................................................... 7 2.2 Die Gattung Hypericum L. ............................................................................................ 7 2.2.1 Der Name Hypericum ........................................................................................... 7 2.2.2 Morphologie ......................................................................................................... 8 2.2.3 Inhaltsstoffe ......................................................................................................... 9 2.3 Die Sektion Brathys .................................................................................................... 10 2.3.1 Verwandtschaftsverhältnis der Sektion Brathys ................................................ 10 2.3.2 Verbreitung ........................................................................................................ 11 2.3.3 Morphologie ....................................................................................................... 11 2.4 Hypericum irazuense Kuntze ..................................................................................... 12 2.4.1 Taxonomie .......................................................................................................... 12 2.4.2 Verbreitung ........................................................................................................ 13 2.4.3 Abstammung ...................................................................................................... 13 2.4.4 Morphologie ....................................................................................................... 13 2.5 Die Gattung Clusia ..................................................................................................... 15 2.5.1 Der Name Clusia ................................................................................................. 15 2.5.2 Verbreitung ........................................................................................................ 15 2.5.3 Morphologie ....................................................................................................... 16 2.5.4 Inhaltsstoffe ....................................................................................................... 17 2.6 Clusia valerioi Standley .............................................................................................. 18 2.6.1 Taxonomie .......................................................................................................... 18 2.6.2 Verbreitung ........................................................................................................ 19 2.6.3 Morphologie ....................................................................................................... 19 2.6.4 Blütenentwicklung und Blütenanatomie ........................................................... 20 2.6.4.1 Die Entwicklung der männlichen Blüten ..................................................... 20 2.6.4.2 Die Entwicklung der weiblichen Blüten ...................................................... 22 2.6.5 Blütenbesucher .................................................................................................. 22 2.6.6 Bemerkenswertes ............................................................................................... 23 3. Spezieller Teil mit Ergebnissen ......................................................................................... 24 3.1 Hypericum irazuense ................................................................................................. 24 3.1.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes ....................................................... 24 3.1.2 Überblick über die aufgearbeiteten Fraktionen und Isolierschema .................. 24 3.1.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der isolierten Substanzen ................... 26 I Inhaltsverzeichnis 3.1.3.1 Fraktion HL_V1 ............................................................................................ 27 3.1.3.2 Fraktion HL_V2 ............................................................................................ 28 3.1.3.3 Fraktion HL_V3 ............................................................................................ 29 3.1.3.4 Fraktion HL_V4 ............................................................................................ 30 3.1.3.5 Fraktion HL_V5 ............................................................................................ 30 3.1.3.6 Fraktion HL_V5_S2_H3 und HL_V5_S2_H5 ................................................ 31 3.1.3.7 Fraktion HL_V8_2MeOH_S1_BS ................................................................. 31 3.1.3.8 Fraktion HL_V8_2MeOH_S2_NS ................................................................. 32 3.1.3.9 Fraktion HL_V10_S1_H3 ............................................................................. 35 3.1.3.10 Fraktion HL_V10_S1_H6 ............................................................................. 38 3.1.3.11 Fraktion HL_V11_S1_H2 ............................................................................. 42 3.1.3.12 Fraktion HL_V11_S1_H3 ............................................................................. 45 3.1.4 Diskussion und Schlussfolgerung ....................................................................... 50 3.2 Clusia valerioi ............................................................................................................. 51 3.2.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes ....................................................... 51 3.2.2 Überblick über die aufgearbeiteten Fraktionen und Isolierschema .................. 51 3.2.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der isolierten Substanzen ................... 53 3.2.3.1 Fraktion CV_V1 ............................................................................................ 53 3.2.3.2 Fraktion CV_V4_C3/K .................................................................................. 54 3.2.3.3 Fraktion CV_V6_K2_Acetylierung ............................................................... 54 3.2.3.4 Fraktion CV_V8_Acetylierung ..................................................................... 56 3.2.3.5 Fraktion CV_V9_S3_P1 ................................................................................ 58 3.2.4 Diskussion und Schlussfolgerung ....................................................................... 59 4. Experimenteller Teil .......................................................................................................... 60 4.1 Hypericum irazuense ................................................................................................. 60 4.1.1 Pflanzenmaterial ................................................................................................ 60 4.1.2 Extraktion ........................................................................................................... 60 4.1.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes ........................................................ 61 4.1.4 Aufarbeitung einzelner Fraktionen des Dichlormethanextraktes ..................... 62 4.1.4.1 Fraktion HL_V1 ............................................................................................ 62 4.1.4.2 Fraktionen HL_V2 bis HL_V5 ....................................................................... 62 4.1.4.3 Fraktion HL_V8_2MeOH ............................................................................. 63 4.1.4.4 Fraktion HL_V10 .......................................................................................... 64 4.1.4.5 Fraktion HL_V11 .......................................................................................... 64 4.2 Clusia valerioi ............................................................................................................. 65 4.2.1 Pflanzenmaterial ................................................................................................ 65 4.2.2 Extraktion ........................................................................................................... 65 4.2.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes ........................................................ 66 4.2.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen ............................................................. 67 4.2.4.1 Fraktion CV_V1 ............................................................................................ 67 4.2.4.2 Fraktion CV_V4 ............................................................................................ 68 4.2.4.3 Fraktion CV_V6 ............................................................................................ 68 II Inhaltsverzeichnis 4.2.4.4 Fraktion CV_V8 ............................................................................................ 69 4.2.4.5 Fraktion CV_V9 ............................................................................................ 70 4.2.5 Aufarbeitung des Methanolextraktes ................................................................ 71 4.3 Geräte, Material und Methoden ............................................................................... 71 4.3.1 Säulenchromatographie ..................................................................................... 71 4.3.2 Dünnschichtchromatographie (DC) .................................................................... 71 4.3.2.1 Analytische Dünnschichtchromatographie ................................................. 71 4.3.2.2 Präparative Dünnschichtchromatographie ................................................. 72 4.3.3 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ................................................... 72 4.3.3.1 Analytische HPLC ......................................................................................... 72 4.3.3.2 Semipräparative HPLC ................................................................................. 73 4.3.3.3 Präparative HPLC......................................................................................... 73 4.3.4 Reversed Phase (RP‐)‐Festphasenextraktion (SPE) ............................................ 73 4.3.5 Flüssigchromatographie‐Massenspektrometrie (LC‐MS) .................................. 74 4.3.6 Gaschromatographie‐Massenspektrometrie (GC‐MS) ...................................... 74 4.3.7 Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) ............................................. 74 5. Zusammenfassung ............................................................................................................ 75 6. Anhang .............................................................................................................................. 77 6.1 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 77 6.2 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... 81 6.3 Tabellenverzeichnis ................................................................................................... 84 III Einleitung 1. Einleitung Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden die oberirdischen Organe von Hypericum irazuense Kuntze und die Blätter von Clusia valerioi Standley, zwei Arten die zur Familie der Clusiaceae gehören, untersucht. Beide Arten stammen von ökologisch sehr unterschiedlichen Standorten in Costa Rica. Hypericum irazuense wurde in der Cordillera de la Talamanca (Gebirgszug zwischen Costa Rica und Panamá) gesammelt. In diesem Gebiet trifft man auf die Páramo‐Vegetation, eine Hochgebirgsvegetation, die in Costa Rica oberhalb ca. 3200 m vorliegt. Typisch für diese Hochgebirgslage innerhalb des Tropengürtels ist die hohe Luftfeuchtigkeit am Tag und deren Absinken nach Sonnenuntergang für einige Stunden. Niederschläge kommen in Form von feinem Sprühregen oder in Schauern begleitet von Wind, in der siebenmonatigen Regenzeit, vor. Die Wachstumsphase der Pflanzen fällt in die Trockenzeit von November bis Mai, in welcher die Temperaturen höher sind. [Int01] Es bildet sich eine Niederstrauchvegetation aus, diese ist gekennzeichnet durch ein reiches Vorkommen an endemischen Pflanzen. Pflanzen aus diesem Gebiet sind chemisch bislang wenig untersucht, deshalb ist die Unter‐
suchung auf Inhaltsstoffe von Pflanzen dieses Standortes besonders reizvoll. Auch ist das Interesse an der Gattung Hypericum hoch, da Hypericum perforatum (echtes Johanniskraut) als pflanzliches Arzneimittel in der heutigen Phytomedizin große Bedeutung erlangt hat und derzeit in Europa und den USA zu den zehn wichtigsten Arzneipflanzen zählt. Clusia valerioi wurde im Esquinas‐Regenwald von Costa Rica gesammelt. Der Verein „Regenwald der Österreicher“ widmet sich seit 1991 dem Freikauf von Regenwaldparzellen im Süden Costa Ricas. In diesem Wald wachsen ca. 3000 verschiedene Gefäßpflanzen, somit zählt dieser Wald zu den artenreichsten Wäldern dieser Erde. Die Tropenstation „La Gamba“ befindet sich in diesem Gebiet, dieser kommt große Bedeutung in der wissenschaftlichen Erforschung des Regenwaldes zu. Auch diese Pflanze wurde bisher nicht oder wenig phyto‐
chemisch untersucht. [Int02] [Int03] Pflanzen aus der Familie der Clusiaceae bieten ein ideales Forschungsobjekt für phyto‐
chemische Untersuchungen, da die Familie über eine große Palette an zum Teil biologisch hochaktiven Inhaltsstoffen verfügt. Bekannte Inhaltsstoffe sind Phloroglucide aber auch Xan‐
thone. Außerdem sind Flavonoide, α‐ und γ‐Phenylpyrone, diverse Glykoside, organische Säuren und Triterpene in der Familie bekannt. [Heg89] Der Schwerpunkt der phyto‐
chemischen Untersuchung von Pflanzen liegt auf der Isolierung von Stoffen des Sekundär‐
stoffwechsels. Diese Stoffe sind auf Grund folgender Merkmale von Interesse: Die Palette an Sekundärstoffen ist von Art zu Art verschieden. Die Produktion von Sekundärstoffen hat im Laufe der Evolution den Pflanzen einen Selektionsvorteil verschafft. Die Pflanze bildet sie oft nur in bestimmten Entwicklungsstadien und bei höheren Pflanzen werden sie an ganz be‐
stimmten Stellen eingelagert und gespeichert. Außerdem ist die Mannigfaltigkeit ihrer chemischen Strukturen sehr groß. [Hän99] 1 Allgemeiner Teil 2. Allgemeiner Teil 2.1 Die Familie der Clusiaceae Die Familie der Clusiaceae umfasst nach Heywood 36 Gattungen und 1630 Arten. [Hey07] 2.1.1 Systematische Gliederung Die Einteilung in drei Unterfamilien nach Stevens ist eine neue Einteilung, die sich von frü‐
heren Gliederungen unterscheidet. Diese Einteilung basiert auf dem Bau des Fruchtknotens, des Andrözeums, der Frucht und der Samen. Die Unterfamilie Kielmeyeroideae wird unterteilt in zwei ungleiche Tribus, nämlich in Calophylleae und Endodesmieae. Die Blüten sind meist zwittrig, die Staubblätter frei, der Griffel lang und vollständig verwachsen. Der Embryo besitzt dünne Keimblätter. Hypericoideae ist die zweite Unterfamilie, unterteilt wird diese in drei Tribus (Vismieae, Hypericeae und Cratoxyleae). Die Blüten sind auch zwittrig, der äußere Staubblattkreis ist unfruchtbar oder fehlt und der Griffel ist lang, frei oder verwachsen. Der Embryo besitzt ebenfalls dünne Keimblätter. Die dritte Unterfamilie trägt den Namen Clusioideae. Diese wird wiederum in drei Tribus unterteilt. Innerhalb der Tribus Clusieae stößt man auf vier Gattungen, die Tribus Garcinieae wird in zwei Gattungen (Garcinia und Allanblackia) unterteilt und die dritte Tribus Symphonieae weist sieben Gattungen auf. Die Blüten sind eingeschlechtig oder selten zwittrig, der äußere Staubblattkreis ist fruchtbar, unfruchtbar oder fehlt und der Griffel ist kurz oder nicht vorhanden. Die Kotyledonen sind meist sehr reduziert oder fehlen. [Hey07] [Hey82] Unterteilt wurde die Familie früher in sechs Unterfamilien: [Heg66] I.
II.
Kielmeyeroideae: Hypericoideae: III.
Calophylloideae: IV.
Clusioideae: V.
Moronobeoideae: VI.
Lorostemonoideae: Caraipa, Haploclathra, Kielmeyera, Mahurea und Marila Ascyrum, Cratoxylon, Eliaea, Haronga (=Harungana), Hypericum, Psorospermum, Sanidophyllum und Vismia Calophyllum, Endodesmia, Kayea, Lebrunia, Mammea, Mesua, Nouhuysia, Ochrocarpus und Poeciloneuron 21 Genera, zB.: Allanblackia, Clusia, Garcinia und Rheedia Moronobea, Montrouziera, Platonia, Pentadesma und Symhonia nur Lorostemon 2 Allgemeiner Teil 2.1.2 Verbreitung Das Verbreitungsgebiet der Clusiaceen ist in der Regel auf tropische Gebiete beschränkt. Eine Ausnahme bilden die Hypericoideae‐Hypericeae, vor allem die Gattung Hypericum, welche auch in temperierten Gebieten weitverbreitet ist. Sie ist besonders auf der nörd‐
lichen Halbkugel zu finden. Triadenum ist in Asien und Nordamerika verbreitet. Die Familie ist im Tiefland aber auch im Hochland von tropischen Gebieten anzutreffen. [Hey07] [Hey82] Abb. 1 Verbreitungsgebiet Clusiaceae [Hey07] 2.1.3 Morphologie Zur Familie der Clusiaceae zählen hauptsächlich Bäume, Sträucher daneben auch mehr‐
jährige oder einjährige Kräuter. Epiphyten sind auch in der Familie anzutreffen. Die Pflanzen sind immergrün oder sommergrün und besitzen Drüsen oder Kanäle in den meisten Teilen der Pflanze. Die Pflanzen sind unbehaart oder mit einzelligen oder vielzelligen Haaren ver‐
sehen. Die Blätter sind einfach gebaut und besitzen keine Nebenblätter. Die Blattstellung ist gegen‐
ständig, selten wechselständig oder wirtelig. Außerdem sind die Blätter ganzrandig oder selten gefranst. Am Blattgrund sind manchmal gepaarte Drüsen zu finden. Die Blüten sind aktinomorph, zwittrig oder eingeschlechtlich (zweihäusige Pflanzen), end‐
ständig, einzeln oder in Zymen oder Thyrsen angeordnet. Die Pflanzen besitzen 2‐20, ge‐
wöhnlich 4‐5 freie oder verwachsene Kelchblätter und diese sind persistent oder hinfällig nach der Blüte. In der Knospenanlage werden die Blütenblätter dachziegelartig angelegt. Es sind (3)4‐5(‐8) Kronblätter vorhanden, die frei sind jedoch auch fehlen. Sie sind ebenfalls persistent oder laubwerfend. Epipetale Blatthäute (Ligula) findet man manchmal bei Cratoxylum und Hypericum. 3 Allgemeiner Teil Grundsätzlich besteht das Andrözeum aus 2 Wirteln. Jeder besitzt 5 Staubblattbündel (Faszikel) mit freien Filamenten, welche fast bis zum Ansatz frei sind. Der äußere, vor den Kelchblättern stehende Kreis ist gewöhnlich steril, frei und mit dem Faszikel mehr oder weniger verbunden oder kann auch nicht vorhanden sein. Der innere Wirtel ist immer fruchtbar (außer in weiblichen Blüten) und kann modifiziert sein durch eine Fusion von Faszikeln (meist 2+2+1) und/oder Staubblättern. Bei Hypericum gentianoides ist jedes Staubblattbündel auf ein einziges Staubblatt reduziert. Der Fruchtknoten ist oberständig und besteht gewöhnlich aus 2‐5(‐20) verwachsenen Fruchtblättern. Jedes enthält ein bis mehrere Samenanlagen an zentralwinkelständigen oder parietalen Plazenten. Die Narbenanzahl ent‐
spricht der der Plazenten und der Griffel ist frei, verwachsen oder fehlt gänzlich. Ein Nektarium ist nicht vorhanden. Die Faszikelkörper an der Basis des Fruchtknotens schwellen manchmal an (ähnlich wie die Lodicula bei Gräsern), um die Blüte auszudehnen. Die Frucht ist oft eine wandständige Kapsel, kann aber auch eine trockene oder fleischige Beere oder eine Steinfrucht sein. Die Samen sind manchmal geflügelt oder haben einen Samenmantel (Arillus) oder sind selten mit einer Karunkula (Samenwarze) versehen. Oft fehlt das Endosperm in der Reife und gewöhnlich ist ein gerader Embryo vorhanden. Die Kotyledonen sind gut entwickelt und frei oder verbunden, können auch manchmal redu‐
ziert sein und werden in ihrer Funktion durch ein erweitertes Hypokotyl ersetzt. In Stamm, Blättern und Blütenorganen befinden sich Sekretbehälter. Diese sondern ätherische Öle, Harze, Fette und Anthocyanine ab und lagern sie auch ein. [Hey07] [Hey82] [Kub07] Abb. 2 Laubzweig mit endständigem Blütenstand (Symphonia globulifera) [Hey07] Abb. 3 Staubblattröhre (Symphonia globulifera) [Hey07] Abb. 4 Beere (Symphonia globulifera) [Hey07] Abb. 5 Trieb mit kreuzweise gegenständigen Blättern und Endblüte (H. calycinum) [Hey07] Abb. 6 halbierte Blüte (H. calycinum) [Hey07] 4 Abb. 7 Kapsel (H. calycinum) [Hey07] Allgemeiner Teil Abb. 8 Spross mit Blütenständen (Calophyllum inophyllum) [Hey07] Abb. 9 Gynözeum (Calophyllum inophyllum) [Hey07] Abb. 10 Staubblatt (Calophyllum inophyllum) [Hey07] 2.1.4 Inhaltsstoffe Für die gesamte Familie charakteristische Verbindungen sind die mono‐ bis pentahydroxy‐
lierten Xanthone. Die Synthese erfolgt normalerweise über Maclurin. Das Substitutions‐
muster wird durch Elimination und/oder Hinzufügung von Hydroxylgruppen und durch O‐
Methylierung bestimmt. Hingegen sind O‐Glykosylierte Xanthone und Xanthone mit Methylendioxygruppen bei den Clusiaceae äußerst selten anzutreffen. Komplexe Xanthone welche prenyliert und/oder geranyliert sind, sind zahlreich vorhanden. Man findet zB. Xanthone vom Typ des Jacareubins, Mangostins, Macluraxanthone, Osajaxanthone, Kayeaxanthone und Pyrifolins. Durch Polyisoprenylierungen und darauffolgende Zyklisierungen können sehr komplex gebaute Verbindungen vom Typ der Gambogesäure entstehen. [Heg89] O
O
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OH Abb. 12 Maclurin Abb. 11 Xanthon Grundstruktur Flavonoide Heteroside wie Hyperin (=Hyperosid oder Quercetin‐3‐galaktosid), Rutin, Quercitrin und Chlorogensäure kommen vor allem in den Hypericum‐Arten reichlich vor. [Heg66] OH
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Abb. 13 Hyperin (=Hyperosid, Quercetin‐3‐galaktosid) 5 Allgemeiner Teil Neoflavanoide (Neoflavonoide) wie 4‐Phenyl‐ und 4‐Alkylcumarine, ihre 3,4‐Dihydroderivate und ihre nichtlactonisierten Vorläufer, die sogenannten „Rindensäuren“, werden vor allem in Holz, Rinden, Früchten, Samen und/oder Blättern der Calophylloideae gebildet. Diese werden durch β‐Verknüpfung von Zimtsäure oder α‐ungesättigten C4, C6 oder C8‐Fettsäuren mit acylierten Phlorogluciden gebildet. Phloroglucide und α‐ungesättigte Säuren sind Bau‐
steine der Neoflavanoide von Clusiaceen. OH
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Abb. 14 Phloroglucinol Weitere Subtypen und Stoffklassen von phenolischen Clusiaceae‐Inhaltsstoffen sind: [Heg89] ™ Xanthone, nämlich Synthonolignoide oder Xanthonolignane vom Typ des Kielcorins ™ Neoflavanoide und Neoflavonoide, nämlich insektizide 4‐Alkylcumarine der Gattung Mammea ™ Anthrachinonoide ™ Prenylierte und geranylierte Biphenyle vom Typus der Pentaphalangium‐Biphenyle und des Clusianons aber auch 9,10‐Dihydrophenanthrene wie das Paralycolin‐A. ™ Benzophenone ™ Phloroglucide ™ Biflavonoide ™ α‐ und γ‐Phenylpyrone Die Familie enthält PA (Proanthocyanidine), K‐(Kämpferol) und Q‐(Quercetin)‐3‐Glykoside, außerdem noch C‐Glykoflavone und die bereits genannten Biflavonoide mit Flavanonen, Flavanonolen und Flavonen als Bausteine. Catechin, Epicatechin, kondensierte Gerbstoffe und Gallussäure konnten auch nachgewiesen werden. [Heg89] Weitere Inhaltsstoffe Organische Säuren wie die Garciniasäure wurden gefunden. Samenöle konnten auch nach‐
gewiesen werden. Auch viele freie Triterpene sind in der Familie bekannt. Oleanan‐Derivate und/oder von diesen abgeleitete Vertreter aus der Taraxeran‐, Glutinan‐ oder Friedelan‐
Reihe oder auch Lupan‐Derivate (zB Betulinsäure) werden produziert. Auch Ursan‐Baueran‐
Derivate, Hopan‐Adianan‐Derivate und tetracyclische Dammaran‐ und Lanostan‐Derivate wurden nachgewiesen. [Heg89] 6 Allgemeiner Teil 2.1.5 Nutzwert Die Familie Clusiaceae liefert hartes, dauerhaftes und auch leicht zu bearbeitendes Holz. Außerdem liefert sie Heilmittel, Farbstoffe, Gummi, Harze, Pigmente, Kosmetika, Fette und Öle. [Hey82] 2.2 Die Gattung Hypericum L. Die Gattung Hypericum umfasst 450 Arten. Innerhalb dieser Gattung trifft man auf Bäume, Büsche und krautige Pflanzen, welche in allen Klimazonen und Teilen der Welt zu finden sind. Hypericum gehört zur Familie der Clusiaceae (alternativ Guttiferae‐Hartheugewächse und Hypericaeae). Diese Gattung teilt sich mit den anderen Gattungen der Familie folgende Merkmale: gegenständige Laubblätter, keine Nebenblätter, Drüsensekretion, freie Blüten‐
blätter (Kronblätter), Staubblätter in Bündeln angeordnet und Samen ohne Endosperm. [Ern03] 2.2.1 Der Name Hypericum Der Name ύπέρεικογ oder lateinisch Hypericum wurde von den alten Griechen für eine Pflanze oder Pflanzen vergeben, die böse Geister abwehren sollten. Diese Pflanze wurde oberhalb von Götterfiguren aufgehängt. Der Name dieser Pflanze ist aus den Wörtern hyper=über und eikon=bild zusammengesetzt. Welche Art genau verwendet wurde, ist nicht bekannt, es wird vermutet das H. empetrifolium Willd. oder H. triquetrifolium Turra ver‐
wendet wurden. Dioskorides erwähnt den Namen Askyron (ασκυρον), dabei besteht die Möglichkeit, dass es sich um H. triquetrifolium oder H. perforatum L. handelt. Den Ausdruck Androsaimon bezieht er auf Arten, die durch ihren roten Saft oder durch ihre Drüsensekretion Finger färben und diesen das Aussehen geben, als ob sie bluten würden. In diesem Zusammenhang kann man vor allem die Art H. androsaemum L. sehen, welche sich durch ihre fleischigen Kapseln und ihren roten Saft auszeichnet aber auch die Blütenblätter des H. perforatum, die beim Zer‐
reiben durch Hypericin tief rot gefärbt werden. Das Johanniskraut wurde auch beim Sonnwendfest zu Ehren des Geburtstags (24. Juni) von Johannes dem Täufer verwendet. Heiligenbilder wurden mit dem H. empetrifolium ge‐
schmückt. In Regionen abseits der Ägäis wurden andere Arten zur Dekoration verwendet, vor allem das H. perforatum, das bekannteste Johanniskraut Europas. Hypericum hatte seinen Platz in der Volkskunde über Jahrhunderte hinweg, so ist es keine Überraschung, dass es sich auch in der heutigen Medizin sich bewährt hat. [Ern03] [Tsc04] 7 Allgemeiner Teil 2.2.2 Morphologie Die Gattung Hypericum weist eine große Anzahl an Lebensformen auf, man findet baum‐
artige aber auch sehr kurzlebige Pflanzen. Manche Arten der Sektion 1. Campylosporus bringen Bäume (besitzen einen echten, einzelnen Stamm) hervor, welche bis zu 12 m hoch werden können. H. gentianoides (Sektion 30. Spachium) ist ein einjähriges Kraut, bei diesem sind die Blätter zu Schuppen reduziert. Echte Bäume sind selten anzutreffen und kommen nur in den primitivsten Sektionen (1. Campylosporus, 3. Ascyreia, 29. Brathys) vor. Mehr‐
jährige Kräuter breiten sich am Boden oder in Bodennähe durch Ausläufer aus. Diese wachsen eine bestimmte Strecke horizontal, bevor sie sich aufrichten, ihre Nodi produzieren häufig Wurzeln. Die einjährigen Gattungen verfügen über ein Pfahlwurzelsystem. Die Blattstellung ist immer gegenständig‐gekreuzt oder 3‐4 wirtelig. Bei Sträuchern und Baumarten der Gattung Hypericum bilden sich die Internodien eventuell zylindrisch aus. Der junge Stamm (Sprossachse) kann grün oder weinrot gefärbt sein. Der etwas Ältere ist glatt und rötlich oder rötlichbraun bis zimtfarbig und hat zuerst keine erkennbaren Lentizellen. Die Epidermis der Sprossachse der krautigen Arten innerhalb der Gattung enthält manchmal kleine, runde oder etwas gestreckte Drüsen, man kann sie mit jenen ver‐
gleichen, die bei den Blättern zu finden sind. Die primitivsten Arten von Hypericum besitzen gestielte Blätter. Wo ein Blattstiel ausgebildet ist, ist er vollständig von der Blattspreite abgegrenzt. Alle Arten haben eine komplette Hauptader und die primitivsten Campylosporus und Brathys haben eine parallel verlaufende Aderung. Das Drüsenmodell der Blätter ist teilweise eng verknüpft mit der Aderung. Zwei Typen von Drüsen sind charakteristisch für Hypericum. 1. Typ: bilden schwärzliche oder rote Cluster von Zellen, welche Wachs beinhalten und Hypericin oder gelegentlich Pseudohypericin enthalten. 2. Typ: sind schizogene interzellulare Räume welche von Zellen umgeben sind, diese erzeugen ein transparentes ätherisches Öl. Die letzteren werden auch „blasse“ Drüsen genannt und sind in allen Arten zu finden. Die „dunklen“ Drüsen (Typ 1) fehlen manchmal vollständig oder sind auf andere Organe der Pflanze beschränkt. Diese werden zur Klassifizierung der Gattung verwendet. Der Übergang von der gegenständig‐gekreuzten Phyllotaxis der Blätter zur fünfblättrigen spiralen Blattstellung des Blütenkelches taucht relativ plötzlich auf und ist in den meisten Arten vorhanden, insofern das Oberblatt und das Tragblatt gewöhnlich gegenständig sind. Gelegentlich sind die Vorblätter oder Oberblätter nicht genau gegenständig angeordnet oder eines der Tragblätter kann fehlen. Eine generelle Tendenz zur Ungleichheit der Kelchblatt‐
größe ist in Teilen der Gattung anzutreffen. Die Kelchblätter weisen den gleichen Typ von Drüsen auf wie die Laubblätter. Die Anzahl der Kronblätter ist meist 4, 5 oder 6 (anomal), die Knospendeckung ist immer gewunden. Die Farben der Kronblätter sind meist gelb aber auch Übergänge nach weiß, grün oder rosa wurden beobachtet. Hypericum besitzt 1‐nervige Kronblätter. Bei größeren 8 Allgemeiner Teil Kronblättern können sich Gabelungen bilden, die eine schmale Hauptader und zwei dickere Adern hervorbringen, welche wiederum Gabelungen formen. Diese bilden weitere Reihen von Adern, welche eine annähernd gleiche Breite aufweisen. Bei kleineren Blättern gibt es weniger Verzweigungen. Die Kronblätter von einigen Kräutern haben 3 unverzweigte Adern. Die Drüsen der Kronblätter sind mit jenen der Kelchblätter vergleichbar. Generell ist die Blütenkrone radiär, d. h. die Kronblätter breiten sich aus oder werden zu‐
rückgebogen. Meist sind (4)5 Faszikeln von Staubblättern vorhanden, welche frei oder antipetal sein können. Die Samenanlagen sind anatrop. Bei den meisten Arten findet man holzige oder ledrige Deckkapseln als Früchte. Die Samen sind klein und schmal‐zylinderartig bis eiförmig oder elliptisch, größere Kerne sind leicht gekrümmt. Gefärbt sind sie gelbbraun bis dunkel purpurbraun. [Rob81] 2.2.3 Inhaltsstoffe Bei Hypericum enthalten spezielle Exkretlücken der Blütenorgane, Stängel und Blätter rote, photosensibilisierend wirkende Pigmente. Diese treten bei vielen Arten auf. Als Hauptver‐
treter kann Hypericin genannt werden. Brockmann und seine Mitarbeiter haben die Struktur von Hypericin im Jahre 1952 aufgeklärt. Außerdem beschäftigten sie sich mit der Biosynthese des Moleküls. OH
O
OH
HO
CH3
HO
CH3
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Abb. 15 Hypericin Die folgenden Komponenten von ätherischen Ölen konnten nachgewiesen werden: ™
™
™
2‐Methyloctan (Isononan), n‐Nonan, n‐Undecan, n‐Octanal (Capryaldehyd), n‐
Decanal (Caprinaldehyd) Myrcen, Geraniol, α‐Pinen, β‐Pinen, Limonen, α‐Terpineol Caryophyllen Für die Gattung Hypericum ist die Bildung von ätherischen Ölen mit größeren Mengen von aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Aldehyden (Nonan, Undecan, Octanal, Decanal, Dodecanal) sehr typisch. [Heg66] 9 Allgeme
einer Teil Weiteree Inhaltssto
offe, die in der Gattu
ung Hypericcum zu find
den sind, ssind Flavanole (PA; Catechine), Flavon
nole, Flavo
one und Xanthone,
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außerdem wurden C
Cumarine wie w das Scopoleetin und Um
mbelliferon ggefunden. O
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Abb. 16 Flavo
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Abb. 17 Favono
ol Abb. 18 Cu
umarin Grundsttruktur Von Xaanthonen wurden w
folggende Verttreter isolie
ert, nämlich
h mono‐, d
di‐, tri‐ und tetra‐
hydroxyylierte Xanthone und isopreenylierte Xanthone. X
Außerdem
m wurden
n noch Xanthon
nolignane wie w das Kieelcorin, Cadensin‐C und D und au
uch das Hypercorin ge
efunden. Auch diie Gruppe der d Phlorogglucinole istt vertreten durch pren
nylierte Phloroglucide (welche antibiottisch wirken
n), Albaspidin iBiB und Filixsäure B
BBB. Zu den Flavonoiden ist zu saggen, dass Q‐‐3‐Glykoside
e am häufiggsten erfassst wurden u
und dass die Flavvonolglykoside manchm
mal von Ap‐ und Lu‐7‐‐Glykosiden
n und von FFlavon‐C‐Glyykosiden begleiteet werden. A
Auch Biflavo
onoide kom
mmen in derr Gattung vo
or, wie das 3,8“‐Biapiggenin. Antihäm
morrhagisch
h wirkendee Substanzeen wie We
edelolacton
n und Dem
methylwede
elolacton kommen auch in d
der Gattungg vor. Außerdem auch Betulinsäure, α‐Terpineol, tetraccyclische Cycloartenyylacetat und
d Octacosan
nol. [Heg89]] Triterpeene wie Cyccloartenol, C
2.3 Die Sekt
D
ion Brathys 2.3.1 Verwand
V
dtschaftssverhältn
nis der Se
ektion Brathys Abb. 19 Ausscchnitt Verwand
dtschaftsverhälltnis Sektion Brrathys [Rob90] 10 Allgemeiner Teil 2.3.2 Verbreitung Die Sektion Brathys ist von Belize über die Großen Antillen bis nach Peru und Bolivien ver‐
breitet. [Rob87] Abb. 20 Verbreitungsgebiet der Sektion Brathys [Gar08] 2.3.3 Morphologie In der Sektion Brathys stößt man auf kleine Bäume, die eine Größe von bis zu 4 m erreichen können, niederliegende Sträucher und drahtige Kräuter. Allen Arten fehlen gänzlich die dunklen Drüsen und sie besitzen außerdem keine Harzdrüsen am Unterblatt (letztere kommen in der Sektion Ascyreia aber nicht in der Sektion Campylosporus vor). Worauf man stößt, ist eine geringe Anzahl an punktförmigen Blattdrüsen, diese sind oft sehr klein. Punktförmig sind außerdem immer die Drüsen der Blattspreite der Laubblätter. Die Blattspreitendrüsen der Kelch‐ und Kronblätter sind allerdings entweder länglich oder punktförmig. Die Nervatur der Blätter ist parallel und offen, die Drüsen der Blattspreite sind punktförmig. Die primäre Nervatur ist offen in nahezu allen holzigen Arten, eine Reduktion zu einer 1‐
nervigen Aderung tritt in einigen Arten der Sektion auf. Nur in einigen primitiven Arten sieht man eine tertiäre Netzaderung. In den meisten primitiven Arten sind die Blätter frei, völlig sommergrün und weisen eine rautenförmige Blattnarbe auf. In allen anderen Arten sind die Blätter gänzlich oder teilweise überdauernd. Der Blütenstand der holzigen Arten ist meist 1‐blütig. Nur in einigen der primitivsten Arten sieht man eine Entwicklung zum zymösen Blütenstand. Der Blütenstand der holzigen Arten weist immer verschiedene Variationen von verschiedenen Typen und Aggregationen von 1‐
blütigen Ästen auf. Das Perianth ist meist fünfblättrig und die Kelchblätter sind an die Kronblätter gedrückt. Die Kronblätter sind länger als die Kelchblätter und gewöhnlich aus‐
gebreitet, aber in kleineren Blüten können sie aufsteigend bleiben. Die Kelchblätter variieren in ihrer Breite und daher auch in der Anzahl der Nerven. Variationen der Kronblattform und 11 Allgemeiner Teil ihrer Größe können helfen, verwandte Arten zu unterscheiden. Die Anzahl und Größe der Staubblätter entspricht im Allgemeinen der Blütengröße, jedoch haben die holzigen Arten mit den wenigsten Staubblättern nicht die kleinsten Blüten. Die Anzahl der Griffel variiert von 5‐3. Der Hauptteil der Arten hat 3 Griffel aber in drei höher entwickelten Arten ist diese Tendenz aufgehoben und die Anzahl der Griffel steigt auf 4‐5, verbunden mit sehr kleinen Blüten. Die Form der Griffel ist für die Taxonomie hilfreich. Wenige zytologische Untersuchungen wurden für Arten innerhalb der Sektion Brathys durchgeführt. Die einzige Aufzeichnung einer Chromosomenzahl (n=12) ist für die holzige Art Hypericum irazuense gemacht worden. Das ist die kleinste Zahl für die gesamte Gattung. Die Zahlen n=6, 12, 24 sind für krautige Arten gefunden worden. Hybriden sind sehr rar. Die einzige Art, welche einer Hybride ähnelt, wurde in Costa Rica gesammelt und sieht nach H. irazuense x H. costaricense aus. [Rob87] 2.4 Hypericum irazuense Kuntze Abb. 21 oberirdische Organe Abb. 22 Zweige Abb. 23 Blüten 2.4.1 Taxonomie Reich Unterreich Abteilung Unterabteilung Klasse Unterklasse Ordnung Familie Unterfamilie Tribus Gattung Sektion Art Plantae Tracheobionta Spermatophyta Magnoliophytina Magnoliopsida Dilleniidae [Cron] Theales [Cron] Clusiaceae Hypericoideae Hypericeae Hypericum L. Brathys Hypericum irazuense Kuntze 12 Allgemeiner Teil Als Synonym kann man Hypericum silenoides sensu R. Keller in Engler & Prantl (1893) nennen. [Bru92] [Sch93] [Rob87] 2.4.2 Verbreitung Verbreitet ist Hypericum irazuense in Costa Rica und Panama. H. irazuense ist auf offenen Hochebenen oder unter Bambus zu finden, in einer Höhe von 2700‐3730 m. [Rob87] Abb. 24 Verbreitungsgebiet von Hypericum irazuense 2.4.3 Abstammung Hypericum irazuense ist offenbar abgeleitet von H. phellos subsp. oroqueanum, in einer ähnlichen Weise wie H. stenopetalum von H. phellos subsp. phellos eine Abstammung auf‐
weist. Die Pflanze unterscheidet sich jedoch von H. stenopetalum in der Morphologie und der geographischen Verbreitung. [Rob87] 2.4.4 Morphologie Hypericum irazuense tritt als Strauch oder kleiner Baum auf und kann 0,4‐5 m hoch werden. H. irazuense ist aufrecht und flachkronig. Die Äste sind lateral, manchmal auch pseudo‐
dichotom. Der Stamm (Sprossachse) ist gelbbraun gefärbt, vierkantig und zweischneidig bei jungen Sträuchern oder Bäumen. Der Stamm entwickelt sich länglich rund mit querver‐
laufenden korkigen Auswüchsen. Die Rinde schält sich in Streifen ab. Das Internodium ist 1,5‐4 mm lang. Die Blätter sind zuerst ungestielt, dachziegelartig und vierzeilig bei ihrer Ausbreitung. Später stehen sie angedrückt und werden nach dem Welken nahe dem Blattgrund abgeworfen. Sie können auch überdauernd sein. Die Lamina hat eine Größe von 10‐15 x 1,5‐3,5 mm und ist schmal‐elliptisch bis verkehrt lanzettlich, eben bis umgebogen, nicht gekielt, hat durch‐
13 Allgemeiner Teil gehend dieselbe Farbe und ist nicht gräulich. Außerdem sind die Blätter ledrig und an der Spitze der Spreite zugespitzt. Der Blattgrund ist keilförmig. 3‐5 basale Blattnerven sind vor‐
handen, welche parallel verlaufen, innere Paare bilden (5) und oberhalb verzweigt sind. Ein tertiäres Netzwerk ist nicht sichtbar. Der Blütenstand ist 1‐blütig, terminal und weist kurze laterale Triebe mit verlängerten Trieben von 2‐3 Knoten auf. Der Blütenstiel ist 2,5‐4 mm lang. Die oberen Blätter sind häufig vergrößert, die Blüten haben einen Durchmesser von 25‐30 mm und sind sternförmig. Die Kelchblätter haben eine Größe von 7,5‐9 x 1,5‐2 mm, sind linear lanzettförmig und spitz. Sie weisen 5 Blattnerven auf, welche unverzweigt sind. Die Hauptader ist nicht hervortretend, Drüsen sind meist linear‐punktförmig und nahe der Spitze anzufinden. Die Kronblätter sind strahlend gelb bis orangegelb gefärbt. Sie haben eine Größe von 13‐18 x 7‐10 mm, ca. die Größe von 2 Kelchblättern. Die Form ist verkehrt lanzettlich bis verkehrt eiförmig, mit feiner Spitze, die Drüsen sind linear und eine distale Unterbrechung ist vorhanden. Die Anzahl der Staubblätter beträgt ca. 100, die längsten sind 6‐9 mm lang. Der Fruchtknoten hat eine Größe von 1,5‐2,5 x 1‐1,5 mm und ist eiförmig. Der Griffel ist 3,9‐10 mm lang, frei, aus‐
gebreitet und eiförmig gebogen. Die Narben sind klein. Eine Kapsel hat eine Größe von 6‐7 x 4‐5 mm, im Allgemeinen ist sie eiförmig oder elliptisch bis kugelförmig und kleiner als die Kelchblätter. Der Same ist 1‐1,3 mm lang, kaum gekielt. Die Samenschale ist leiterförmig; 2n=12 [Rob87] Abb. 25 Habitus [Rob87] Abb. 26 Sprossachse mit Blättern [Rob87] Abb. 28 Kelchblatt und Kronblatt [Rob87] Abb. 27 Blatt [Rob87] Abb. 29 Staubblatt und Fruchtknoten [Rob87] 14 Abb. 30 Kapsel [Rob87] Allgemeiner Teil 2.5 Die Gattung Clusia Die Gattung Clusia umfasst ca. 300 Arten. [Ber98] Synonyme: Androstylium Havetia Oxystemon Renggeria Cochlanthera Havetiopsis Pilosperma Rengifa Decaphalangium Oedematopus Quapoya [Int04] 2.5.1 Der Name Clusia Der Name Clusia ist auf den Botaniker Charles de l’Ecluse (lat.: Carolus Clusius) zurückzu‐
führen, dieser lebte von 1526 bis 1609. Aufgrund seiner Reisen durch Europa war er sehr gut vertraut mit der europäischen Flora und entdeckte viele neue Arten, welche er beschrieb und ausführlich bildlich darstellte. Er führte die Tulpen in die Niederlande ein und war auch an der Einführung der Kartoffel nach Europa beteiligt. Clusius verfasste Beschreibungen über die alpine Vegetation und eine der schönsten alpinen Pflanzen, nämlich Gentiana clusii Perr. et Song ist nach ihm benannt (auch Potentilla clusiana Jacq. und Achillea clusiana Tausch). Die Gattung Clusia wurde geprägt vom Franzosen Charles Plumier (1646‐1704). Plumier war ein herausragender Forscher seiner Zeit. Er reiste durch Amerika und Westindien und sammelte Clusia. Linnaeus übernahm den Namen für die Gattung von Plumier. Er charakterisierte zwei Arten von Clusia, nämlich C. major mit drei „Varietäten“ und C. minor. [Lüt07] 2.5.2 Verbreitung Die Gattung Clusia ist in den Tropen und Subtropen der Neuen Welt verbreitet. 80 Arten sind in Venezuela heimisch. Die größte Anzahl der Taxa findet man in Kolumbien. Clusia ist auch mit einer bedeutenden Anzahl von Arten am Guyana‐Schild vertreten. [Ber98] Abb. 31 Verbreitungsgebiet der Gattung Clusia [Lüt07] 15 Allgemeiner Teil 2.5.3 Morphologie In der Gattung Clusia sind Sträucher oder Bäume anzufinden, freistehend, epiphytisch, epipetrisch und hemiepiphytisch. Der Latex ist durchscheinend, weiß, cremeweiß, gelb oder orangegelb gefärbt. Die Blätter sind kreuzgegenständig und können über auffallende Latexkanäle verfügen. Der Blattstiel ist meist mit kleinen basalen adaxialen begrenzten Tüpfeln versehen. Der Blütenstand ist terminal oder weist laterale Rispen von Zymen auf. Er kann pyramidal sein oder auch nicht. Selten sind einzelne Blüten vorhanden. Die Blüten sind meist einge‐
schlechtlich (zweihäusige Pflanzen), selten sind sie zweigeschlechtlich oder steril. 2‐8 Kelch‐
blätter sind vorhanden, meist sind sie kreuzgegenständig. Die Anzahl der Kronblätter beträgt 4‐12, sie sind verschieden angeordnet, manchmal kreuzgegenständig oder basal ver‐
wachsen. Die Staubblätter sind frei, konvergierend oder basal an den Filamenten ver‐
wachsen. Die Anzahl kann vier bis zahlreich sein. Die Filamente sind unterschiedlicher Form, manchmal fehlen sie auch. Die Antheren sind ebenfalls unterschiedlicher Form, oft sind sie kurz oder abgestumpft, sie können aufspringen durch eine Vielfalt an Spalten und Poren. Das Staminodium ist meist kleiner als das Staubblatt, mit oder ohne Antheren, manchmal auch früh abwerfend. Der Stempel verfügt über 4‐8(‐21) Fruchtblätter. Der Griffel ist kurz oder rudimentär. Die Narben sind frei und strahlenförmig wegführend oder zueinander geneigt und groß. Pro Fruchtblatt trifft man auf eine bis viele Samenanlagen. Die Frucht ist eine aufspringende Kapsel mit persistenten Stigmata. Der Same besitzt einen rötlichen, nicht gefäßbildenden Samenmantel. Die Keimblätter sind winzig. [Ber98] Abb. 32 Clusia rosea (weibliche und männliche Blüte, Anthere) [Ber98] 16 Allgemeiner Teil 2.5.4 Inhaltsstoffe Als Inhaltsstoffe für die Gattung Clusia können Xanthone genannt werden. Aus den frischen Blüten von Clusia insignis wurde ein Xanthon (Cluson) isoliert. Dabei handelt es sich um das 1,3,4,5,6‐Pentamethoxy‐9H‐xanthen‐9‐on. [Kyo98] O
7
6
8a
8
OCH3
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9
1
2
B
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5
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O
OCH3
OCH3
OCH3
Abb. 33 1,3,4,5,6‐Pentamethoxy‐9H‐xanthen‐9‐on [Kyo98] Benzophenone zählen ebenfalls zu den Inhaltsstoffen. Aus den Früchten von Clusia torresii wurden Clusianon und 7‐epi‐Clusianon (=polyisoprenylierte Benzophenone mit einem Bicyclononan‐Ringgerüst) isoliert. In Clusia congestiflora (Wurzeln) wurde Clusianon 1976 erstmals entdeckt. Außerdem wurde es aus den Früchten von Clusia sandinensis und aus dem Blütenharz von Clusia spiritu‐santensis isoliert. [Pic05] Aus Clusia obdeltifolia konnten außerdem polyisoprenylierte Benzophenone isoliert werden. In C. plukenetii wurde Plukenetion E‐Acetat nachgewiesen. [Rib05] Ebenfalls konnten aus dem Latex von Clusia grandiflora polyisoprenylierte Benzophenone, nämlich Chamones I und II isoliert werden. Außerdem fand man das Nemoroson II im Harz der weiblichen Blüten der gleichen Pflanze. [Lok00] Aus den Früchten von Clusia plukenetii wurden die prenylierten Benzophenone Plukenetione B‐G und das Xerophenon A isoliert. [Hen99] In den Früchten von Clusia havetiodes var. stenocarpa wurden die prenylierten Benzophenonderivate 28,29‐Epoxyplukenetion A, 33‐Hydroperoxyisoplukenetion C, 15,16‐
Dihydro‐16‐hydroperoxyplukenetion F, Plukenetion C, F, G und Sampsonion G nachge‐
wiesen. [Chr01] 13
31
33
30
32
10
29
8
O
19
9
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31
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OH
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22
5
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7
10
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22
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O
OH
O
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O
17
19
25
15
18
Abb. 34 Clusianon [Pic05] Abb. 35 7‐epi‐Clusianon [Pic05] Abb. 36 Plukenetion F [Hen99] Triterpene sind in der Gattung Clusia auch anzutreffen. Aus den Früchten und der Rinde von Clusia ellipticifolia konnten Friedelin, Friedelinole, Sitosterin, Aplotaxen und Oleanolsäure 17 Allgemeiner Teil nachgewiesen werden. Aus Clusia rosea ist C17H28 bekannt. Das Holz einer brasilianischen Clusia‐Art enthält β‐Amyrin und Betulinsäure. [Heg89] Bei Untersuchungen mittels GC‐MS konnte festgestellt werden, dass die Arten C. uvitana, C. pratensis, C. cylindrica, C. divaricata und Clusia valerioi einen hohen Anteil an C31/C29 Alkanen in ihrer epikutikularen Wachsschicht aufweisen. Auch C28/30/32/33 Alkane konnten nachgewiesen werden. Triterpene wie β‐Amyrine (Friedelin, Friedolane, Squalene) konnten ebenfalls in der epikutikularen Wachsschicht von C. liesneri nachgewiesen werden. Weiters konnte in C. multiflora Lupeol, in C. osseocarpa Betulin und Sitosterole und in C. stenophylla Taraxerol detektiert werden. Charakteristische Triterpene des epikutikularen Wachs von C. coclensis sind Friedolane und Verticiol und bei C. cretosa Friedelin und Verticiol. [Med06] 2.6 Clusia valerioi Standley Abb. 37 Blüte und Blätter Abb. 38 Blüte 2.6.1 Taxonomie Reich Unterreich Abteilung Unterabteilung Klasse Unterklasse Ordnung Familie Unterfamilie Tribus Gattung Sektion Art Plantae Tracheobionta Spermatophyta Magnoliophytina Magnoliopsida Dilleniidae [Cron] Theales [Cron] Clusiaceae Clusioideae Clusieae Clusia Omphalanthera Clusia valerioi Standley [Bru92] [Sch93] [Lüt07] Als häufiges Synonym ist Clusia valerii Standl. zu finden. [Int05] 18 Allgemeiner Teil 2.6.2 Verbreitung Clusia valerioi ist von Zentralamerika bis Südamerika weitverbreitet. Das Verbreitungsgebiet der Pflanze erstreckt sich von Costa Rica bis nach Bolivien. [Hoc04] Abb. 39 Verbreitungsgebiet von Clusia valerioi 2.6.3 Morphologie Die Lebensform ist epiphytisch, die Pflanzen wachsen auf einer Höhe von über 30 m auf ihren Wirtsbäumen. Clusia valerioi ist ein Baum und kann eine Größe von 8 m erreichen. Der Baumstamm erreicht einen Durchmesser von 10 cm und die Krone einen Durchmesser von 4 m. Die Borke ist graubraun gefleckt. Die Pflanze verfügt über einige Luftwurzeln. Die Blätter sind lederartig, ganzrandig, eiförmig bis elliptisch, haben eine Länge von 10‐24 cm und eine Breite von 5‐12 cm. Außerdem haben sie seitlich unauffällige Adern und sind latexgelblich gefärbt. Clusia valerioi ist zweihäusig. Blüten und Früchte werden mehr oder weniger das ganze Jahr produziert. Die männlichen Blüten treten entweder einzeln oder rispenförmig mit 3‐9 Blüten auf, teil‐
weise sind die Blütenstände in der Gestalt von Triaden. Die weiblichen Blüten sind auch ent‐
weder einzeln oder in Blütenständen mit 3‐7(‐9) Blüten angeordnet. Am Ende der Zweige werden die Blütenstände gebildet. Nachdem die Blüten und die Blütenstandsachse abge‐
worfen wurden, setzen die Zweige ihr monopodiales Wachstum fort. Männliche und weibliche Blüten weisen eine abwärts gerichtete Position auf. Die männlichen Blüten haben einen Durchmesser von 3,5‐4 cm. Bräunlich‐grüne, fleischige Tragblätter sind in 2 bis 3 Paaren vorhanden. Die freien Kelchblätter (5) sind 1,2 cm lang, 0,8 cm breit und weiß gefärbt. Die 5 Kronblätter sind 1,6 cm lang, haben eine Breite von 1,6 cm und sind im Unterschied zu den Kelchblättern weiß mit einem rosafarbenen Zentrum. Kelch‐ und Kronblätter sind spiralförmig angeordnet. Die zwei inneren Kronblätter weisen immer einen Abdruck des Staubblattkomplexes auf. Daraus kann man schließen, dass die frühen 19 Allgemeiner Teil Kronblätter während der Knospenentwicklung den Staubblattkomplex sehr dicht um‐
schließen. Das Andrözeum besteht aus 55‐58 Staubblättern. Diese sind an der Basis verwachsen. Die Stamina bilden ein fünfeckiges Kissen. Die Pollen sind in einem kleinen Gebiet an der Spitze des Staubblatts angeordnet. Sie weisen eine zentrale, hemisphärische Kuppel auf und sind von einem kranzförmigen Ring umgeben. Das Filamentgewebe, welches die zwei Pollensäcke umgibt, ist sechseckig geformt. Am Beginn der Anthese sondert das Filamentgewebe ein gelbes viskoses Harz ab, welches über die Pollensäcke fließt und eine Decke bildet. Das harz‐
absondernde Gewebe ist dunkelbraun gefärbt und unterscheidet sich somit von den hell‐
braunen Pollensäcken. Die weiblichen Blüten sind ein bisschen größer als die männlichen Blüten (Durchmesser 5,5‐
5,8 cm). Die Tragblätter und das Perianth unterscheiden sich, bis auf die Größe, nicht von den männlichen Blüten. Sie weisen wiederum fünf weiße Kelchblätter (1,4‐1,6 cm, 1,3‐1,6 cm) und fünf weiße Kronblätter (2,3 cm, 2,3‐2,8 cm) mit rosafarbenem Zentrum auf. Die zwei inneren Kronblätter zeigen einen Abdruck des Stigmalappens. Das Gynözeum ist oberständig und besteht aus 5 Fruchtblättern, jedes enthält ca. 25 anatrope Samenanlagen. Die Narben sind festsitzend. Sie sind grün gefärbt und sind um ein weißes Gewebe im Zentrum angeordnet. Das Gynözeum ist von zwei Wirteln Staminodien umgeben (bilden Pentagon). Die Staminodien weisen die gleiche Struktur auf wie die Staub‐
blätter, aber ab und zu wird nur der kranzförmige Pollensack ausgebildet und der zentrale Pollensack fehlt. Während der Anthese wird ein gelbes viskoses Harz abgesondert. Die Früchte sind Kapseln mit fünf Fächern. Die Kelchblätter und Kronblätter verbleiben am Grund der Frucht. Die Früchte weisen eine Länge von 3‐4,2 cm auf und haben einen Durch‐
messer von 3,1‐3,7 cm. [Hoc04] 2.6.4 Blütenentwicklung und Blütenanatomie Im Zuge der Diplomarbeit von Heidrun Hochwallner (Botanisches Institut Wien, 2004) wurden blütenökologische Untersuchungen von Clusia valerioi gemacht. Diese Unter‐
suchungen wurden in der Tropenstation „La Gamba“ (Österreichische Forschungsstation im Regenwald von Costa Rica) durchgeführt. 2.6.4.1 Die Entwicklung der männlichen Blüten Die Tragblätter (2 oder 3 Paare) sind gegenständig und die Kelchblätter sind in einer Spirale angeordnet. Wegen der dicken Struktur der Tragblätter ist das apikale Meristem dicht in der Knospe eingeschlossen. Das zweite und das dritte Paar der Tragblätter sind nicht genau 20 Allgemeiner Teil gegenständig, sie bilden aber einen Übergang zur Spirale der Kelchblätter. (Abb. 40) Die Spirale kann gegen oder mit dem Uhrzeigersinn laufen. Abb. 40 Querschnitt Knospe (SEM), Anordnung Blütenorgane [Hoc06] Die 5 Kronblätter sind wie die Kelchblätter ebenfalls in einer Spirale angeordnet. Sie zeigen eine dachziegelartige Knospendeckung. (Abb. 41) Ein pentagonal geformtes apikales Meristem bildet die 5 primordialen Kronblätter. (Abb. 42) Abb. 42 apikales Meristem (SEM) [Hoc06] Abb. 41 fünf Kronblätter (SEM) [Hoc06] In den männlichen Blüten bildet das apikale Meristem einen meristematischen Haufen aus fünf Teilen (ursprüngliche Staubblätter), der um das pentagonale apikale Meristem in epipetaler Stellung angeordnet ist. (Abb. 43) Von diesem Haufen entwickeln sich die Primordia der echten Staubgefäße in 3‐5 Wirteln. Die Richtung ist zentrifugal. Abb. 43 apikales Meristem mit Haufen (SEM) [Hoc06] Im Zentrum entstehen 5 hemisphärische Wülste die sich zum primordialen Fruchtblatt ent‐
wickeln. Diese beenden das Wachstum allerdings, bleiben rudimentär und werden durch die Staubblätter der vollentwickelten männlichen Blüte versteckt. Die reifen Staubblätter be‐
stehen aus einer dicken eckigen Filamentröhre, während die 2 Antheren an der abgeflachten Spitze sehr klein sind. Eine Anthere ist eckig und umgibt eine andere hemisphärisch im Zentrum. Zwei Pollensäcke sind von ringartigen Bögen der Filamente in der Peripherie um‐
geben. Die Harzkanäle sind am Randgebiet der Filamente angeordnet. In der Blütezeit wird das Harz von den ringartigen Bögen der Filamente, durch Aufbrechen der einschichtigen Epidermis freigesetzt. [Hoc06] 21 Allgemeiner Teil 2.6.4.2 Die Entwicklung der weiblichen Blüten Die Kelch‐ und Kronblätter der weiblichen Blüten entwickeln sich in der gleichen Art wie die männlichen Blüten. Die meristematische Spitze formt 5 Haufen. Von diesen Haufen werden in der männlichen Blüte Primordia der Staubblätter und in der weiblichen Blüte die staminodialen Primordia angelegt, welche sich nicht in Größe und Form unterscheiden. In der weiblichen Blüte werden nur zwei Wirtel von staminodialen Primordia ausgebildet. (Abb. 44) An der Spitze jedes Staminodiums entsteht ein Pollensack. Ein ringförmiger Pollensack umgibt einen zentralen hemisphärischen, außer bei einigen Staminodien, welche nur einen äußeren ring‐
förmigen Pollensack besitzen und bei denen der zentrale fehlt. Abb. 44 staminodiale Primordia (SEM) [Hoc06] Im Zentrum werden 5 hemisphärische Wülste gebildet, welche das primordiale Fruchtblatt bilden. Diese Primordia weiten sich aus und wachsen in einer hufeisenartigen Form zusammen. Diese vereinigen sich und biegen sich über die zwei Wirtel der primordialen Staminodien. (Abb. 45) In der Folge wachsen diese Scheiben zu einem dreieckigen, fest‐
sitzenden Narbenlappen zusammen. (Abb. 46) Die Samenanlagen verfügen über einen Arillus an der Basis, der den Samen während der Reifung völlig umhüllt. (Abb. 47) [Hoc06] Abb. 45 Fruchtblatt Primordia (SEM) [Hoc06] Abb. 46 Narbenlappen (SEM) [Hoc06] Abb. 47 Arillus (SEM) [Hoc06] 2.6.5 Blütenbesucher Die Blüten werden ausschließlich von Bienen besucht. Es gibt keine Vorliebe zu weiblichen oder männlichen Blüten. Bienen besuchen die Blüten meist in den frühen Morgenstunden aber auch am Nachmittag. Verschiedene stachellose Bienen (Familie Apidae, Stamm Meliponini) zB. Trigona fuliventris, Trigona corvina und Partamona cupira zählen zu den Blütenbesuchern. Diese Arten sammeln das Harz der Blüten. Tetragona dorsalis und Trigona amalthea sammeln den Latex der Wunden aber nicht das Harz. [Hoc04] 22 Allgemeiner Teil 2.6.6 Bemerkenswertes Interessant ist die Ähnlichkeit zwischen dem Harz der Blüten und dem Latex der vegetativen Teile der Pflanze. Wird die Pflanze verletzt, strömt der weiße Latex aus Blättern und dem Stamm heraus. Dieser wird durch den Kontakt mit Luft nach 10‐15 Minuten viskos und klebrig. In dieser Beschaffenheit entspricht der Latex dem Harz der Blüten und zwar in Farbe und Konsistenz. Melipona‐Bienen wurden bei der Sammlung dieses Latex beobachtet. Sie sammeln es in gleicher Weise wie das Harz der Blüten. Auch sammeln sie den Latex, der von den Nähten der reifen Kapseln tropft. [Hoc04] Abbildungen von Blütenbesuchern und Clusia valerioi Die Abbildungen 48‐51 stellte Prof. em. Dr. Anton Weber, Institut für Botanik in Wien, zur Verfügung. Abb. 48 Trigona sp. (Clusia peninsulae sp. ined, männliche Blüte) Abb. 49 Blütenbesucher Abb. 50 weibliche Blüte Clusia valerioi Abb. 51 männliche Blüte Clusia valerioi 23 Spezieller Teil 3. Spezieller Teil mit Ergebnissen 3.1 Hypericum irazuense 3.1.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes Die oberirdischen Teile der Pflanze (Zweige) wurden gemahlen und mit Methanol in der Kälte extrahiert (Perkolation). Der erhaltene eingeengte MeOH‐Extrakt wurde in ein MeOH/H2O‐Gemisch (1:9) aufgenommen und gegen Dichlormethan ausgeschüttelt. Dabei wurde ein Dichlormethanextrakt erhalten und die MeOH/H2O‐Phase nochmals gegen Butanol (Butanolextrakt) ausgeschüttelt. Der Dichlormethanextrakt wurde zur Grob‐
fraktionierung auf eine Kieselgelsäule aufgebracht. Mit jeder erhaltenen Fraktion wurde eine DC‐Untersuchung durchgeführt und schließlich wurden die Fraktionen mit ähnlichen oder identischen Banden vereinigt. Erhalten wurden 15 Fraktionen. Danach wurde von den ver‐
einigten Fraktionen erneut ein Dünnschichtchromatogramm angefertigt und diese wurden auch mit HPLC untersucht. Von interessanten Fraktionen wurde auch gleich ein 1H‐NMR‐
Spektrum aufgenommen. 3.1.2 Überblick über die aufgearbeiteten Fraktionen und Isolierschema HL_V1 bis HL_V5 wurden mit GC‐MS untersucht, da auf Grund des wohlriechenden Geruchs auf flüchtige Verbindungen wie ätherische Öle zu schließen war. HL_V1 hatte eine ölige Konsistenz und war transparent. HL_V2 bis HL_V5 waren orangerot gefärbt, wiesen einen angenehmen Geruch auf und hatten eine teilweise harzartige Konsistenz. Fraktion HL_V2 wurde auch über eine kleine offene Kieselgelsäule aufgetrennt und an‐
schließend erfolgte mit Fraktion HL_V2_C2‘ eine Trennung mit Hilfe semipräparativer HPLC. Diese recht unpolaren Substanzen konnten nicht gut getrennt werden. Wahrscheinlich sind nach der semipräparativen HPLC‐Trennung eine Hauptkomponente und zwei bis drei weitere Substanzen in der Fraktion HL_V2_C2‘_P1 enthalten. Über NMR‐Spektroskopie konnten die Substanzen nicht aufgeklärt werden. Es kann aber vermutet werden, dass es sich bei den Substanzen um Phloroglucinole handelte, da sich einige für die Phloroglucinole charakteristische Protonensignale (δ=18 ppm) zeigten. Diese Signale zeigen bei Phloroglucinolen Protonen in Wasserstoffbrücken an. HL_V5 wurde auch über präparative HPLC aufgetrennt. Zuerst wurde versucht eine Vor‐
trennung und Reinigung mit SPE zu erreichen. Fünf Fraktionen wurden erhalten und mit Hilfe der analytischen HPLC untersucht. Von HL_V5_S1 und der HL_V5_S3 wurde ein 1H‐Spektrum 24 Spezieller Teil angefertigt. HL_V5_S1 erwies sich als interessant, wegen der geringen Menge wurde aber HL_V5_S2 für die präparative HPLC‐Trennung herangezogen, da sie wahrscheinlich dieselben Peaks enthielt und eine größere Menge zur Verfügung stand. Nach der präparativen Trennung wurden sechs Fraktionen erhalten. Diese wurden wiederum mit analytischer HPLC untersucht. Von HL_V5_S2_H3 und HL_V5_S2_H5 wurden Protonenspektren angefertigt. Da die Ausbeute jedoch sehr gering war, konnten keine 2D‐Messungen durchgeführt werden. Bei HL_V8_2MeOH wurde schon nach der Grobfraktionierung vermutet, dass es sich um Betulinsäure handeln könnte, dies bestätigte sich auch nach der NMR‐Auswertung. Auf‐
getrennt wurde diese Fraktion mittels Festphasenextraktion, mehrere kleine Fraktionen ent‐
standen, die nach DC‐Analyse vereinigt wurden. Nach weiteren kurzen Reinigungsschritten konnten anschließend 2D‐NMR‐Messungen gemacht werden. Außerdem wurde auch ein Xanthon gefunden. HL_V10 erwies sich als interessant, da nach dem analytischen HPLC Lauf eine ansprechende Menge an Peaks zu sehen war, die sich gut trennen lassen sollten. Zur Reinigung wurde die Fraktion einer Festphasenextraktion unterzogen. Vier Fraktionen entstanden nach der Reinigung. Diese wurden mit Hilfe der analytischen HPLC untersucht. HL_V10_S1 enthielt die interessanten Peaks und wurde mittels präparativer HPLC aufgetrennt. Erhalten wurden sieben Fraktionen. Von diesen Fraktionen wurden 1H‐Spektren angefertigt und wiederum analytische HPLC‐Untersuchungen durchgeführt. In weiterer Folge wurden zwei Fraktionen, nämlich HL_V10_S1_H3 und HL_V10_S1_H6 identifiziert. Mit Fraktion HL_V11 wurde ungefähr gleich verfahren wie mit Fraktion HL_V10. Der analytische HPLC‐Lauf zeigte interessante Peaks. Gereinigt wurde sie mittels Festphasen‐
extraktion (Elutionsmittel Methanol). Drei Fraktionen wurden erhalten. Mit HL_V11_S1 wurde gleich weitergearbeitet und eine präparative HPLC‐Trennung durchgeführt. Auf‐
getrennt wurde HL_V11_S1 in vier Fraktionen, diese wurden wiederum mit Hilfe der analytischen HPLC untersucht. Von HL_V11_S1_H2 bis HL_V11_S1_H4 wurden 1H‐Spektren aufgenommen. HL_V11_S1_H1 wurde nicht weiter untersucht, da laut analytischer HPLC drei bis vier Substanzen in der Fraktion enthalten waren und eine Aufklärung über NMR schwierig gewesen wäre. Zwei Fraktionen wurden identifiziert, nämlich HL_V11_S1_H2 und HL_V11_S1_H3. 25 Spezieller Teil Abb. 52 Isolierschema Hypericum irazuense 3.1.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der isolierten Substanzen Die Strukturaufklärung der Substanzen erfolgte über die NMR‐Spektroskopie. Von interessanten Substanzen bzw. Fraktionen wurde zuerst ein 1H‐Spektrum aufgenommen. Für die Aufklärung der Reinsubstanzen wurde ein 13C‐Spektrum angefertigt und auch die zwei‐
dimensionale (2D) NMR‐Spektroskopie kam zur Anwendung. Aufgenommen wurden HSQC‐, HMBC‐ und H, H‐COSY‐Spektren. Die Voraussetzung um die NMR‐Spektroskopie anzuwenden ist, dass ein Atom ein magnetisches Moment besitzt. Die Probe befindet sich in einem Röhrchen mit deuteriertem Lösungsmittel und wird in ein homogenes Magnetfeld eingebracht. [Bec04] Im 1H‐Spektrum wird die Anordnung der Wasserstoffatome untersucht, die chemische Ver‐
schiebung (ppm) der Protonen wird angezeigt. Das 13C‐Spektrum gibt Auskunft über die An‐
zahl der Kohlenstoffatome und deren chemische Verschiebung. Im HSQC wird ersichtlich, welches Proton an welches Kohlenstoffatom gebunden ist. Die Wechselbeziehung zwischen Wasserstoffatomen und den benachbarten C‐Atomen (über mehrere Bindungen, bis zu vier) wird im HMBC‐Spektrum angezeigt. Das H, H‐COSY liefert Hinweise über die H/H Kopplung und dadurch auch Informationen über benachbarte Gruppen, die Protonen aufweisen. 26 Spezieller Teil Zur Bestimmung der Masse wurde die Flüssigchromatographie‐Massenspektrometrie (LC‐
MS) durchgeführt und die Reinheit wurde über ein HPLC‐Chromatogramm bestimmt. Durch einen Dioden‐Array‐Detektor (DAD) wurde das UV‐Spektrum der Substanzen aufgenommen. Auch die Gaschromatographie wurde für die Identifizierung der Substanzen zur Hilfe ge‐
nommen. Mit Hilfe der GC werden die Substanzen in einen gas‐ oder dampfförmigen Zu‐
stand überführt und durch Adsorptions‐ oder Verteilungschromatographie untersucht. Bei der Adsorptionschromatographie adsorbiert die gasförmige Substanz auf Sorbentien als stationäre Phase. Die mobile Phase besteht aus einem Inertgas (Trägergas). Bei der Ver‐
teilungschromatographie verteilt sich die Substanz zwischen einer flüssigen stationären Phase und einer gasförmigen mobilen Phase. [Rüc92] Das verwendete GC ist mit einem Massenspektrometer gekoppelt, dadurch wird die Masse des Moleküls bestimmt. Mit Hilfe von Datenbanken erfolgte die Identifizierung der Substanzen. 3.1.3.1 Fraktion HL_V1 Diese Fraktion enthielt mehrere Komponenten wie aus dem aufgenommenen 1H‐Spektrum und dem angefertigten DC ersichtlich war. Daraufhin wurde die Gaschromatographie einge‐
setzt und mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten zwei Substanzen identifiziert werden. 1
2
Abb. 53 Gaschromatogramm HL_V1 27 Spezieller Teil CH3
E
Pr-i
R
E
E
H3C
Z
CH3
Abb. 54 Peak 1: α‐trans‐Bergamoten, 96 % Abb. 55 Peak 2: Cembren, 95 % Für die Identifizierung der Peaks wurden die Datenbanken HPCH2205 [Ada07], Nistos 05 und Wiley Aetherolea 8NO5 zur Hilfe genommen. Die angegebenen Prozentzahlen geben Aus‐
kunft über die Wahrscheinlichkeit der Peakidentifikation. 3.1.3.2 Fraktion HL_V2 Auch diese Fraktion wurde der Gaschromatographie (aromatischer Geruch) unterzogen und durch die Massenspektrometrie konnten wiederum zwei Substanzen identifiziert werden. 2
1
Abb. 56 Gaschromatogramm HL_V2 H 3C
(CH2)28
CH3 Abb. 57 Peak 1: α‐Pinen, 94 % Abb. 58 Peak 2: Triacontan, 91 % 28 Spezieller Teil 3.1.3.3 Fraktion HL_V3 Fraktion HL_V3 wurde ebenfalls mittels Gaschromatographie aufgetrennt und die Substanzen konnten durch Massenspektroskopie identifiziert werden. HL_V4 und HL_V5 wurden auf Grund des angenehmen Geruchs auch mit GC‐MS untersucht. 1
4
2
3
5
Abb. 59 Gaschromatogramm HL_V3 CH2
Abb. 60 Peak 1: α‐Pinen, 94 % Abb. 61 Peak 2: β‐Pinen, 96 % CH3
CH2
H2 C
H2 C
CH3
E
CH3
CH3
S
Pr-i
S
R
E
H 3C
R
E
H3C
Z
CH3
Abb. 62 Peak 3: Limonen, 95 % Abb. 63 Peak 4: Cembren, 99 % 29 H3 C
CH2
Abb. 64 Peak 5: β‐Elemen, 93 % Spezieller Teil 3.1.3.4 Fraktion HL_V4 Diese Fraktion enthielt ebenfalls α‐Pinen (Peak 1: 94 %)und β‐Pinen (Peak 2: 95 %). 1
2
Abb. 65 Gaschromatogramm HL_V4 3.1.3.5 Fraktion HL_V5 Auch hier waren α‐Pinen (Peak 1: 94 %) und β‐Pinen (Peak 2: 95 %) enthalten. 1
2
Abb. 66 Gaschromatogramm HL_V5 30 Spezieller Teil 3.1.3.6 Fraktion HL_V5_S2_H3 und HL_V5_S2_H5 Von diesen Fraktionen wurde nur ein 1H‐NMR‐Spektrum aufgenommen. Aufgrund der geringen Ausbeute und Zeitmangel konnte eine Aufklärung nicht erfolgen. 3.1.3.7 Fraktion HL_V8_2MeOH_S1_BS Diese Fraktion bestand aus einem Gemisch, nämlich aus einem Xanthon und einer Triterpen‐
säure (2:1). Aufgeklärt wurde die Triterpensäure, es handelte sich um Betulinsäure (3β‐
Hydroxy‐lup‐20(29)‐en‐28‐säure). Die 13C‐NMR‐Werte wurden mit Literaturwerten [Sch00] verglichen, so konnte die Substanz identifiziert werden. Beim Vergleich der Werte wurde eine Abweichung von ± 0,1 ppm festgestellt. Die Carbonylgruppe bei 178,8 wurde als Referenzpunkt genommen, gemessen wurde in Pyridin‐d5 bei 298 K. 29
30
20
19
H
18
21
22
OH
25
26
Summenformel: C30 H48 O3 Masse: 456,71 H
O
H
3
27
HO
Abb. 67 Strukturformel Betulinsäure 13
Tab. 1 C‐NMR‐Daten von Betulinsäure in Pyridin‐d5 δ 13C Lit. [ppm]
Position δ 13C [ppm] 39.27
28.26
78.10
39.49
55.90
18.76
34.81
41.08
50.94
37.55
21.18
26.08
38.57
42.82
30.25
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 31 39.20
28.17
78.04
39.42
55.81
18.68
34.72
41.01
50.84
37.48
21.10
26.00
38.51
42.74
30.17
Spezieller Teil 32.85
56.59
49.60
47.72
151.27
31.19
37.49
28.64
16.31
16.39
16.39
14.89
178.80
109.93
19.46
C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 32.77
56.53
49.65
47.68
151.24
31.09
37.41
28.56
16.25
16.32
16.32
14.79
178.80
109.87
19.37
Der Name Betulinsäure (Triterpencarbonsäure) stammt vom entsprechenden Alkohol Betulin, welcher aus der Birkenrinde (Betula pendula und andere Arten) gewonnen wird. Betulinsäure kommt in der Birkenrinde nur in Spuren vor. Die wichtigsten Wirkungen, welche in Screening‐Programmen untersucht wurden, sind: •
•
•
Durch Betulinsäureamide wird die Vermehrung des AIDS‐Virus gehemmt, wahr‐
scheinlich wird das Eindringen des Virus in die Zellen verhindert. Betulinsäure kann Melanomzellen spezifisch abtöten. Ebenfalls können Neuroblastomzellen und Zellen aus malignen Gehirntumoren mit Hilfe von Betulinsäure abgetötet werden. [Int06] 3.1.3.8 Fraktion HL_V8_2MeOH_S2_NS In dieser Fraktion konnte das Xanthon 1,5‐Dihydroxy‐9H‐xanthen‐9‐on (1,5‐Dihydroxy‐
xanthon) identifiziert werden. Die Probe war nicht ganz sauber, wahrscheinlich ist noch ein Triterpen/Triterpensäure enthalten. Die Probe wurde zuerst auf Grund der Löslichkeit in Pyridin‐d5 gemessen. Dann wurde nochmals in Aceton‐d6 vermessen um einen einheitlichen Datensatz zu bekommen (vier weitere Xanthone wurden gefunden, diese wurden ebenfalls in Aceton‐d6 gemessen). O
8
8a
9
OH
9a
1
7
2
6
3
5
10a
O
4a
Summenformel: C13 H8 O4 Masse: 228,20 4
OH
Abb. 68 Strukturformel 1,5‐Dihydroxyxanthon 32 Spezieller Teil *DAD1, 16.781 (1365 mAU, - ) Ref=16.435 & 44.955 of HL_V8_2MEOH_S2_NS_090209.D
mAU
1200
1000
800
600
400
200
0
250
300
350
400
450
Abb. 69 UV‐Spektrum HL_V8_2MeOH_S2_NS Abb. 70 1H‐NMR‐Spektrum von 1,5‐Dihydroxyxanthon (Aceton‐d6, 298K, TMS) 33 nm
Spezieller Teil Abb. 71 HSQC‐Spektrum von 1,5‐Dihydroxyxanthon Tab. 2 NMR‐Daten von 1,5‐Dihydroxyxanthon in DMSO‐d6 Lit. und Aceton‐d6 Position C1 C2 C3 C4 C4a C5 C6 C7 C8 C8a C9 C9a C10a δ 13C Lit. [ppm] 160.9 109.8 137.2 107.2 155.5 146.5 121.0 124.2 114.4 120.8 182.0 108.1 145.2 δ 1H Lit. [ppm]
12.54
6.81
7.28
7.08
‐
‐
7.58
7.37
7.73
‐
‐
‐
‐
δ 13C [ppm]
162.9 111.0 138.0 107.9 157.0 147.3 122.0 125.1 116.3 122.3 183.4 109.5 146.5 δ 1H [ppm]
12.72
6.81
7.71
7.02
‐
‐
7.42
7.33
7.73
‐
‐
‐
‐
Die Nummerierung erfolgte laut Literatur, verglichen wurden die Daten von 1,5‐Dihydroxy‐
xanthon (in Aceton‐d6) mit Literaturdaten (in DMSO‐d6). [Roc94] 1,5‐Dihydroxyxanthon wurde schon auf dem Kernholz von Mesua ferrea isoliert. [Cho68] Aus dem Stamm und den Wurzeln von Hypericum brasiliense wurde es auch isoliert und zeigte antimykotische Wirkung gegen Cladosporium cucumerinum. [Roc94] 34 Spezieller Teil 3.1.3.9 Fraktion HL_V10_S1_H3 Identifiziert wurde die Substanz über die zweidimensionalen Spektren HMBC, HSQC und H, H‐COSY und ein 13C‐Spektrum. HL_V10_S1_H3 wurde zuerst in Chloroform‐d1 gemessen. Um die Position der Seitenkette zu bestimmen, wurde nochmals in Aceton‐d6 vermessen. Die 13
C‐Werte von C1 und C3 waren sich sehr ähnlich. Aus dem Vorhandensein eines, durch eine Wasserstoffbrücke verschobenen Signals, bei 13.6 ppm konnte die Position von C1‐OH be‐
stimmt werden. Somit ergab sich als einzig mögliche Position für O‐CH3 die Position C3. HL_V10_S1_H3 wurde als 4‐(1,1‐Dimethyl‐2‐propen‐1‐yl)‐1,5,6‐trihydroxy‐3‐methoxy‐
xanthen‐9‐on oder Isocudraniaxanthon B (anderer Name) identifiziert. O
8
8a
9
OH
9a
1
7
2
3
6
5
HO
10a
O
4
4a
O
CH3
11
12
OH
16
Summenformel: C19 H18 O6 Masse: 342,35 H3 C
13
14
H3C
15
H
H
Abb. 72 Strukturformel Isocudraniaxanthon B *DAD1, 22.568 (677 mAU, - ) Ref=0.001 & 40.955 of HL_V10_S1_H3_120109.D
mAU
600
500
400
300
200
100
0
250
300
350
400
450
Abb. 73 UV‐Spektrum HL_V10_S1_H3 (Isocudraniaxanthon B) 35 nm Spezieller Teil 1
Abb. 74 H‐NMR‐Spektrum von Isocudraniaxanthon B (Aceton‐d6, 298K, TMS) Abb. 75 HMBC‐Spektrum von Isocudraniaxanthon B 36 Spezieller Teil Abb. 76 HSQC‐Spektrum von Isocudraniaxanthon B Tab. 3 NMR‐Daten von Isocudraniaxanthon B in Aceton‐d6 Position C1 C2 C3 C4 C4a C5 C6 C7 C8 C8a C9 C9a C10a C11 C12 C13 C14 C15 3‐OCH3 δ 13C Lit. [ppm] 163.4 96.3 166.3 114.4 155.9 133.6 151.8 113.6 117.2 114.4 181.9 103.7 147.0 42.0 29.8 29.8 153.0 106.8 56.2 δ 1H Lit. [ppm]
13.60
6.43
‐
‐
‐
‐
‐
6.99
7.61
‐
‐
‐
‐
‐
1.71
1.71
6.49
4.86; 4.98
3.91
37 δ 13C [ppm]
163.4 96.2 166.3 114.4 155.9 133.6 151.8 113.6 117.3 114.4 181.9 103.7 147.4 42.0 30.1 30.1 153.0 106.8 56.2 δ 1H [ppm]
13.59
6.44
‐
‐
‐
‐
‐
7.00
7.62
‐
‐
‐
‐
‐
1.71
1.71
6.49
4.86; 4.98
3.91
Spezieller Teil Durch den Vergleich der NMR‐Daten mit Literaturdaten konnte die Substanz identifiziert werden. Nummeriert wurde die Substanz anhand der Literaturdaten. [Kob97] Durch die LC‐
MS‐Messung (positiver Ionenmodus) wurde das Ergebnis bestätigt mit [M+H]+ = 343. Isocudraniaxanthon B wurde bereits in den Wurzeln von Maclura cochinchinensis gefunden. [Kob97] Außerdem wurde die Substanz aus der Wurzelrinde von Cudrania tricuspidata isoliert. Isocudraniaxanthon B (besitzt 5,6‐Dihydroxygurppe) wurde gegen das DPPH‐Radikal getestet und zeigte einen starken Effekt zur Beseitigung des Radikal, jedoch nicht so stark wie Xanthone mit einer 6,7‐Dihydroxygruppe im B‐Ring. Überdies zeigte es auch zytotoxische Aktivität gegen die folgenden Krebszelllinien: HAT‐29, HL‐60, SK‐OV3, AGS und A549. [Lee05] 3.1.3.10
Fraktion HL_V10_S1_H6 Die Identifizierung fand auch hier mit Hilfe der NMR‐Spektroskopie statt. HL_V10_S1_H6 wurde zuerst (auf Grund der Löslichkeit) in Pyridin‐d5 gemessen. Um die Position der Seiten‐
kette zu bestimmen, wurde nochmals in Aceton‐d6 vermessen. HL_V10_S1_H6 enthielt eine Mischung aus zwei Substanzen. Die Hauptkomponente war 5,9,10‐Trihydroxy‐2,2‐dimethyl‐12‐(3‐methyl‐2‐buten‐1‐yl)‐pyrano[3,2‐b]xanthen‐9‐on, die Substanz wird auch als Xanthon V1 bezeichnet, dieses zeichnet sich durch eine weitere Isoprengruppe aus, welche mit der OH‐Gruppe an Position 3 einen Ringschluss ausgebildet hat. Die Nebenkomponente wurde als 4‐(1,1‐Dimethyl‐2‐propen‐1‐yl)‐1,3,5,6‐tetrahydroxy‐
2‐(3‐methyl‐2‐buten‐1‐yl)‐xanthen‐9‐on oder auch Gerontoxanthon I identifiziert. Die Haupt‐
komponente war im Verhältnis 4:3 zur Nebenkomponente vorhanden. O
8
8a
9
OH
9a
1
11
7
2
6
3
5
HO
OH
5a
O
4a
12
15
13
4
CH3
14
O
CH3
16
17
18
H3 C
20
CH3
19
Abb. 77 Strukturformel von Xanthon V1 (Hauptkomponente) 38 Summenformel: C23 H22 O6 Masse: 394,42 Spezieller Teil *DAD1, 26.439 (351 mAU, - ) Ref=0.006 & 30.679 of HL_V10_S1_H6_120109.D
mAU
300
250
200
150
100
50
0
250
300
350
400
450
nm
Abb. 78 UV‐Spektrum HL_V10_S1_H6 (Xanthon V1) 1
Abb. 79 H‐NMR‐Spektrum Mischung Xanthon V1 und Gerontoxanthon I (Aceton‐d6, 298K, TMS) 39 Spezieller Teil Abb. 80 HMBC‐Spektrum Mischung Xanthon V1 (rot) und Gerontoxanthon I (grün) Abb. 81 HSQC‐Spektrum Mischung Xanthon V1 und Gerontoxanthon I 40 Spezieller Teil Tab. 4 NMR‐Daten von Xanthon V1 in Aceton‐d6 Position C1 C2 C3 C4 C4a C5a C5 C6 C7 C8 C8a C9 C9a C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 δ 13C Lit. [ppm] 158.2 104.6 154.5 108.0 156.3 146.8 133.0 151.9 114.3 117.2 113.0 181.1 102.9 115.3 127.1 79.2 29.1 29.1 21.6 123.3 131.0 25.7 17.9 δ 1H Lit. [ppm]
13.45
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
6.95
7.60
‐
‐
‐
6.66
5.66
‐
1.47
1.47
3.52; 3.52
5.30
‐
1.65
1.85
δ 13C [ppm]
156.8 105.0 158.6 108.4 155.0 147.4 133.5 152.6 113.5 117.6 113.4 181.7 103.3 116.2 128.4 78.8 28.4 28.4 21.9 123.5 131.6 25.9 18.2 δ 1H [ppm]
13.56
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
7.00
7.64
‐
‐
‐
6.70
5.72
‐
1.48
1.48
3.55; 3;55
5.31
‐
1.65
1.86
Der Vergleich der NMR‐Daten mit den Literaturdaten ergab eine gute Übereinstimmung. (Die Primärdaten sind korrekt). Nummeriert wurde die Substanz anhand der Literaturdaten. [Bot86] Die LC‐MS‐Messung (positiver Ionenmodus) bestätigte das Ergebnis mit [M+H]+ = 395. Xanthon V1 wurde aus der Wurzelrinde von Vismia guineensis isoliert. [Bot86] Aus den Wurzeln von Cratoxylum formosum ssp. pruniflorum und aus den Samen von Vismia laurentii wurde es auch isoliert. In der letztgenannten Untersuchung war es aktiv gegen das gram‐
positive Bakterium Bacillus megaterium. [Cha05] [Wab07] Die Nebenkomponente dieser Fraktion war in der Fraktion HL_V11_S1_H3 zu finden (s. HL_V11). 41 Spezieller Teil 3.1.3.11
Fraktion HL_V11_S1_H2 HL_V11_S1_H2 und HL_V11_S1_H3 sahen auf Grund der hohen chemischen Verschiebung (über 14 ppm) im Protonenspektrum am vielversprechendsten aus. Beide wurden einer 2D‐
NMR‐Messung unterzogen. Da sich die Substanzen in Chloroform‐d1 nicht vollständig lösten wurden sie in Pyridin‐d5 vermessen. Um wiederum die eindeutige Position der Seitenketten zu bestimmen, wurde die Messung in Aceton‐d6 wiederholt. Identifiziert werden konnten wiederum Substanzen aus der Gruppe der Xanthone. HL_V11_S1_H2 enthielt das 1,3,5,6‐Tetrahydroxy‐2,4‐bis(3‐methyl‐2‐buten‐1‐yl)‐xanthen‐9‐
on, das auch die Bezeichnung Xanthon V1a trägt. 5'
CH3
3'
O
2'
OH
4'
CH3
1'
8
8a
9
9a
1
7
2
Summenformel: C23 H24 O6 Masse: 396,44 3
6
5
HO
10a
O
4a
4
OH
1''
OH
2''
3''
H3C
5''
CH3
4''
Abb. 82 Strukturformel von Xanthon V1a *DAD1, 24.196 (80.9 mAU, - ) Ref=0.023 & 29.210 of HL_V11_S1_H2_30409.D
mAU
80
70
60
50
40
30
20
10
0
250
300
350
400
Abb. 83 UV‐Spektrum HL_V11_S1_H2 (Xanthon V1a) 42 450
nm
Spezieller Teil 1
Abb. 84 H‐NMR‐Spektrum von Xanthon V1a (Aceton‐d6, 298K, TMS) Abb. 85 HMBC‐Spektrum von Xanthon V1a 43 Spezieller Teil Abb. 86 HSQC‐Spektrum von Xanthon V1a Tab. 5 NMR‐Daten von Xanthon V1a in Aceton‐d6 Position C1
C2
C3
C4
C4a
C5
C6
C7
C8
C8a
C9
C9a
C10a
C1‘
C2‘
C3‘
C4‘
C5‘
C1‘‘
C2‘‘
C3‘‘
C4‘‘
C5‘‘
δ 1H Lit. [ppm]
13.42
‐
‐
‐
‐
‐
‐
6.93
7.80
‐
‐
‐
‐
3.45; 3.45
5.05
‐
1.68
1.77
3.65; 3.65
5.40
‐
1.68
1.86
44 δ 13C [ppm]
159.5
111.0
161.1
107.3
153.7
133.6
152.7
113.4
117.5
114.8
181.6
103.2
147.6
22.2
123.2
132.4
25.9
18.0
22.4
123.4
132.6
26.0
18.1
δ 1H [ppm]
13.57
‐
‐
‐
‐
‐
‐
7.00
7.64
‐
‐
‐
‐
3.46; 3.46
5.25
‐
1.66
1.79
3.67; 3.67
5.30
‐
1.65
1.85
Spezieller Teil Vergleichsdaten für das 1H‐Spektrum konnten gefunden werden, diese stimmen auch gut überein. [Bot86] Außerdem wurde die Masse durch die LC‐MS‐Messung (positiver Ionen‐
modus) bestätigt mit [M+H]+ = 397. Xanthon V1a wurde ebenfalls aus der Wurzelrinde von Vismia guineensis isoliert. [Bot86] Ebenso wurde die Substanz in den Wurzeln von Cudrania tricuspidata und der Rinde von Garcinia lancilimba gefunden. [Yan07] [Zou04] 3.1.3.12
Fraktion HL_V11_S1_H3 HL_V11_S1_H3 enthielt das 4‐(1,1‐Dimethyl‐2‐propen‐1‐yl)‐1,3,5,6‐tetrahydroxy‐2‐(3‐
methyl‐2‐buten‐1‐yl)‐xanthen‐9‐on, welches auch als Gerontoxanthon I (=offenkettige Version von Xanthon V1) bezeichnet wird. 14
O
CH3
OH
11
8
8a
9
9a
7
15
CH3
12
2
6
HO
13
1
3
5
4b
O
4
4a
19
OH
Summenformel: C23 H24 O6 Masse: 396,44 OH
16
H3C
H3C
17
20
H
18
H
Abb. 87 Strukturformel von Gerontoxanthon I *DAD1, 26.502 (1000 mAU, - ) Ref=24.783 & 30.863 of HL_V11_S1_H3_070109.D
mAU
800
600
400
200
0
250
300
350
400
450
Abb. 88 UV‐Spektrum HL_V11_S1_H3 (Gerontoxanthon I) 45 nm
Spezieller Teil 14
12
10
8
6
4
2
‐0
ppm Abb. 89 1H‐NMR‐Spektrum von Gerontoxanthon I (Aceton‐d6, 298K, TMS) 13
Abb. 90 C‐NMR‐Spektrum von Gerontoxanthon I (Aceton‐d6, 298K, TMS) 46 Spezieller Teil Abb. 91 HMBC‐Spektrum von Gerontoxanthon I Abb. 92 HMBC‐Spektrum von Gerontoxanthon I (Seitenketten) 47 Spezieller Teil Abb. 93 HSQC‐Spektrum von Gerontoxanthon I 1
1 Abb. 94 H, H‐COSY‐Spektrum von Gerontoxanthon I 48 Spezieller Teil Tab. 6 NMR‐Daten von Gerontoxanthon I in Aceton‐d6 Position C1 C2 C3 C4 C4a C4b C5 C6 C7 C8 C8a C9 C9a C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 δ 13C Lit. [ppm] 160.4 112.5 161.9 111.9 155.4 147.5 134.2 152.1 113.9 117.7 115.2 182.3 104.1 22.8 123.8 132.5 18.4 26.3 42.7 151.8 112.8 29.2 29.2 δ 1H Lit. [ppm]
13.86
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
7.01
7.63
‐
‐
‐
3.37; 3.37
5.22
‐
1.78
1.66
‐
6.60
5.35; 5.47
1.81
1.81
δ 13C [ppm]
159.8 111.9 161.3 111.2 154.8 146.9 133.7 151.7 113.4 117.1 114.5 181.7 103.6 22.2 123.2 131.9 17.9 25.8 42.0 151.2 112.3 28.4 28.4 δ 1H [ppm]
13.86
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
7.01
7.62
‐
‐
‐
3.36; 3.36
5.23
‐
1.78
1.65
‐
6.60
5.33; 5.47
1.81
1.81
Wieder konnte die Position C1 anhand der Ausbildung einer Wasserstoffbrücke an der Carbonylgruppe C9 bestimmt werden, obwohl die 13C‐Werte von C1 und C3 sich ähnlich waren. Durch den Vergleich der NMR‐Daten mit Literaturdaten konnte die Substanz identifiziert werden. Nummeriert wurde die Substanz anhand der Literaturdaten. [Cha89] Durch die LC‐MS‐Messung wurde das Ergebnis bestätigt mit [M+H]+ = 397. Gerontoxanthon I wurde aus der Rinde von Cudrania cochinchinensis isoliert. [Cha89] Auch aus den Wurzeln von Cudrania cochinchinensis wurde die Substanz isoliert und zeigte Aktivität gegen Staphylococcus aureus subsp. aureus, Micrococcus luteus und Bacillus subtilis. [Fuk05] Weiters wurde Gerontoxanthon I aus der Rinde und den Wurzeln von Cratoxylum formosum ssp. pruniflorum isoliert. [Boo06] [Boo06*] [Boo07] 49 Spezieller Teil 3.1.4 Diskussion und Schlussfolgerung Aus dem Dichlormethanextrakt der oberirdischen Organe von Hypericum irazuense konnten fünf Xanthone sowie auch Betulinsäure isoliert und identifiziert werden. Die Grundstruktur der Xanthone ist das 9H‐Xanthon. Xanthone sind aromatische Oxover‐
bindungen und zählen in manchen Pflanzen zu den farbgebenden Verbindungen. Die ge‐
fundenen Xanthone wurden bereits aus anderen Arten der Familie aber auch aus der Familie der Moraceae (Maulbeergewächse) isoliert. Die drei Ringe der Struktur sind koplanar [Boo06*]. Das aus Fraktion HL_V10_S1_H3 identifizierte Isocudraniaxanthon B trägt am A‐Ring eine Methoxygruppe und eine Seiten‐
kette (1,1‐Dimethyl‐2‐propen‐1‐yl‐Substituent). Xanthon V1 (Hauptkomponente) aus Fraktion HL_V10_S1_H6 trägt am A‐Ring einen Prenylrest und einen Pyranring mit zwei Methylgruppen. In Fraktion HL_V11_S1_H2 konnte das Xanthon V1a gefunden werden, welches am A‐Ring zwei Prenylreste trägt. Gerontoxanthon I (auch Nebenkomponente von HL_V10_S1_H6) wurde in der Fraktion HL_V11_S1_H3 identifiziert. Am A‐Ring trägt es eine Prenylgurppe und die gleiche Seitenkette wie das Isocudraniaxanthon B. Das fünfte Xanthon, das identifiziert worden ist, ist einfacher gebaut. Es besteht aus der Grundstruktur und zwei OH‐Gruppen, eine OH‐Gruppe befindet sich am A‐Ring und die andere am B‐Ring. Betulinsäure konnte aus der Fraktion HL_V8_2MeOH_S1_BS identifiziert werden. Diese Substanz ist im Pflanzenreich weit verbreitet und wird meist nur in geringen Mengen in der Pflanze produziert. Bei Betulinsäure handelt es sich um ein pentazyklisches Triterpen vom Lupantyp. Einige flüchtige Verbindungen wie Monoterpene, Sesquiterpene und Diterpene konnten mittels GC‐MS identifiziert werden. Gefunden wurden: α‐Pinen, β‐Pinen, Limonen, α‐trans‐
Bergamoten, β‐Elemen, Cembren und Triacontan, ein höheres Alkan. Diese Substanzen ent‐
stehen aus Isoprenoiden. Phloroglucinole, welche auch eine typische Inhaltsstoffgruppe der Clusiaceae darstellen, konnte leider nicht mit ausreichender Sicherheit identifiziert werden. Möglicherweise sind sie in HL_V2 vorhanden gewesen. 50 Spezieller Teil 3.2 Clusia valerioi 3.2.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes Von Clusia valerioi wurden die pulverisierten Blätter für die Extraktion verwendet. Als Extraktionsmittel diente Dichlormethan. Die Extraktion wurde in der Kälte durchgeführt (Perkolation). Nachdem das Material wieder getrocknet war, wurde eine Extraktion mit Methanol vorgenommen. Zur Grobfraktionierung wurde der Dichlormethanextrakt auf eine Kieselgelsäule auf‐
gebracht. Die einzelnen Fraktionen wurden mit DC untersucht. Fraktionen, die ähnliche oder identische Banden aufwiesen, wurden vereinigt. Von diesen Fraktionen wurde erneut ein DC angefertigt und auch HPLC‐Untersuchungen durchgeführt. Auch wurden wiederum 1H‐NMR‐
Spektren von vielversprechenden Fraktionen angefertigt. 3.2.2 Überblick über die aufgearbeiteten Fraktionen und Isolierschema Von CV_V1 einer weißen, wachsartigen Fraktion wurde zuerst ein Protonenspektrum aufge‐
nommen. Daraus konnte man schließen, dass es sich um ein Gemisch aus ungesättigten Fettsäuren und Sterolen handelte. Eine präparative Dünnschichtchromatographie wurde außerdem angewendet. Eine scharfe Trennung konnte jedoch nicht erreicht werden. Des‐
halb wurden die Substanzen mit Hilfe der GC aufgetrennt und durch Massenspektrometrie identifiziert. CV_V2 wurde auch mittels GC‐MS untersucht. Jedoch konnten keine Substanzen mit aus‐
reichender Wahrscheinlichkeit identifiziert werden. CV_V4 wurde über eine kleine offene Kieselgelsäule aufgetrennt. Daraus entstanden sieben Fraktionen. In der Fraktion CV_V4_C3 waren Kristalle zu sehen. Von den aufgereinigten Kristallen wurde ein Protonenspektrum aufgenommen und ein analytischer HPLC‐Lauf ge‐
macht. Von CV_V6 wurde ein Niederschlag (Kristalle) aufgereinigt. Dabei entstanden zwei Fraktionen, die im Protonenspektrum identisch aussahen. Von der zweiten Fraktion dieser Reinigung wurde ein Teil acetyliert und anschließend über GC‐MS aufgetrennt. CV_V8 stellte wohl die Hauptkomponente der Blätter von Clusia valerioi dar, da aus 10 g Extrakt über 2 g von dieser Fraktion erhalten wurden. Versucht wurde eine Trennung über eine kleine Kieselgelsäule und präparative DC, jedoch konnte keine Trennung erreicht werden. Ein 13C‐Spektrum zeigte 90 Signale, dadurch war ersichtlich das es sich wahr‐
scheinlich um das Gemisch dreier Triterpene handelte. Durch eine Acetylierung und an‐
51 Spezieller Teil schließende GC‐MS‐Messung unter Verwendung einer geeigneten GC‐Methode (s. 4.6.3) konnten die Substanzen getrennt werden. CV_V9 wurde über SPE aufgetrennt. Die dritte der vier Fraktionen wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC aufgetrennt. Von den entstandenen zwei Fraktionen wurde von der ersten Fraktion ein 1H‐Spektrum aufgenommen. Abb. 95 Isolierschema Clusia valerioi 52 Spezieller Teil 3.2.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der isolierten Substanzen 3.2.3.1 Fraktion CV_V1 Mit Hilfe des GC‐MS konnten fünf Substanzen identifiziert werden. 1
4
2
3
5
Abb. 96 Gaschromatogramm CV_V1 H
H3C
H
Pr-i
CH3
CH3
R
E
S
H3C
CH3
Abb. 97 Peak 1: α‐Copaen, 99 % H
CH2
Abb. 98 Peak 2: E‐Caryophyllen, 96 % H3C
CH3
CH3
H
Pr-i
E
E
CH3
R
E
S
S
CH3
CH3
Abb. 99 Peak 3: α‐Humulen, 98 % Abb. 100 Peak 4: β‐Selinen, 99 % CH3
S
S
S
CH3
H
CH2
CH3
Abb. 101 Peak 5: α‐Selinen, 95 % 53 Spezieller Teil Für die Identifizierung der Peaks wurden wieder die Datenbanken HPCH2205 [Ada07], Nistos 05 und Wiley Aetherolea 8NO5 zur Hilfe genommen. Die angegebenen Prozentzahlen geben Auskunft über die Wahrscheinlichkeit der Peakidentifikation. 3.2.3.2 Fraktion CV_V4_C3/K Laut Protonenspektrum könnte es sich hier um ein Triterpen handeln. Eine genauere Auf‐
klärung wurde nicht vorgenommen. Abb. 102 1H‐NMR‐Spektrum CV_V4_C3/K (Chloroform‐d1, 298K, TMS) 3.2.3.3 Fraktion CV_V6_K2_Acetylierung Nach Acetylierung dieser Fraktion konnte eine GC‐MS‐Analyse gemacht werden. Ebenfalls wurde ein Protonenspektrum aufgenommen. Dieses wurde mit dem vor der Acetylierung verglichen. Eine wesentliche Veränderung im NMR‐Spektrum war nicht ersichtlich. Aufgrund der GC‐MS‐Analyse wurden Triterpene mit der Summenformel C30H52O oder C29H48O2 vermutet. Die Masse aus dem Massenspektrum betrug jedoch nur 410. Dies wurde folgendermaßen gedeutet: Im NMR‐Spektrum wurde ein Signal einer Methylgruppe bei 2.05 ppm nach Acetylierung angezeigt. Dennoch war im 1H‐NMR durch die Acetylierung keine Protonenverschiebung ersichtlich. Dies ließ den Schluss zu, dass eine tertiäre OH‐Gruppe, die im Protonenspektrum nicht sichtbar ist, acetyliert wurde. Diese tertiäre OH‐Gruppe ist sehr instabil und hält die hohe Injektionstemperatur bei der GC‐MS‐Analyse nicht aus. Dies würde erklären, dass die Masse nach der Analyse [M‐H20]+ = 410 betrug. Die eigentliche Masse der Verbindung wäre dann [MAc‐CH3COOH]+ = 428. 54 Spezieller Teil Abb. 103 1H‐NMR‐Spektrum CV_V6_K2 (Pyridin‐d5, 298K, TMS) Abb. 104 1H‐NMR‐Spektrum CV_V6_K2_Acetylierung (Pyridin‐d5, 298K, TMS) 55 Spezieller Teil Abb. 105 Gaschromatogramm CV_V6_K2_Acetylierung 3.2.3.4 Fraktion CV_V8_Acetylierung Die Trennung erfolgte auch hier wieder mit Hilfe des GC‐MS. Die Masse aus dem Massen‐
spektrum ergab 468 [MAc]+. Die Masse [MAc‐CH3CO]+ ergibt 426 (425). Vermutlich handelt es sich um ein Triterpengemisch (3 Substanzen) mit der Summenformel C30H50O, mit sekundärer OH‐Gruppe. Um Triterpensäuren kann es sich nicht handeln, da im 13
C‐Spektrum keine Signale um 180 bis 200 ppm ersichtlich sind. Im Protonenspektrum ist die Acetylierung der Substanzen ersichtlich. Das Signal bei 3.2 ppm ist im Protonenspektrum nach Acetylierung nach ca. 4.5 ppm verschoben, die übrigen Signale sind praktisch ident. Dass diese Verbindungen auch eine oder mehrere Doppel‐
bindungen haben müssen, ist aus den Signalen bei 5‐5.5 ppm ersichtlich. Der starke Shift des Signals von 3.2 ppm nach 4.5 ppm erklärt sich aus der Nähe der elektronenziehenden Acetylgruppe. Das Signal bei 3.2 ist charakteristisch für das Protonensignal an Position 3 bei Triterpenen, die dort eine OH‐Gruppe tragen. Damit einher gehen die entsprechenden Signale im 13C‐Spektrum bei 78‐79 ppm. Interessant ist auch die Tatsache, dass dieses Triterpengemisch in Methanol und Acetonitril sehr schwerlöslich war. Die Löslichkeit in Toluol, Benzol und Chloroform (allerdings hier nicht so leicht wie in den aromatischen Lösungsmitteln) war gut. 56 Spezieller Teil Abb. 106 1H‐NMR‐Spektrum CV_V8 (Chloroform‐d1, 298K, TMS) Abb. 107 1H‐NMR‐Spektrum CV_V8_Acetylierung (Chloroform‐d1, 298K, TMS) 57 Spezieller Teil Abb. 108 Gaschromatogramm CV_V8_Acetylierung 3.2.3.5 Fraktion CV_V9_S3_P1 Diese Fraktion wurde nicht genauer aufgeklärt, wahrscheinlich ist eine Verbindung ent‐
halten, die zu den Fetten gehört. 58 Spezieller Teil 3.2.4 Diskussion und Schlussfolgerung Aus dem Dichlormethanextrakt konnten mittels GC‐MS fünf Sesquiterpene identifiziert werden. Gefunden wurden: α‐Copaen, E‐Caryophyllen, α‐Humulen, β‐Selinen und α‐Selinen. Diese Verbindungen weisen eine C15‐Terpenoid‐Struktur auf und sind Bestandteile von ätherischen Ölen. Caryophyllen, ein aromatischer Inhaltsstoff von Gewürzen, ist in Nelken, Pfeffer und Zimt anzutreffen. Caryophyllen ist ein Derivat des Humulans (C11), dieses ist auch das Grundgerüst im Humulen (typischer Inhaltsstoff des Hopfens). α‐Selinen und β‐Selinen sind Aromastoffe und in Artischocken anzutreffen. [Ric96] Die Fraktionen CV_V6_K2 und CV_V8 wurden nach Acetlylierung auch mit GC‐MS unter‐
sucht. Eine genaue Aufklärung der Substanzen konnte nicht erfolgen. Auch die zuvor ver‐
suchten Trennmethoden (offene Kieselgelsäule, präparative DC) brachten keinen Erfolg. Aus dem Massenspektrum war ersichtlich, dass es sich in der Fraktion CV_V6_K2_Acetylierung wahrscheinlich um Triterpene mit der Summenformel C30H52O oder C29H48O2 handelte. Das Gaschromatogramm zeigte drei Peaks. CV_V8_Acetylierung zeigte im Gaschromatogramm auch 3 Peaks. Das Massenspektrum ließ vermuten, dass es sich hier um ein Triterpengemisch mit der Summenformel C30H50O handelte. Eine genaue Identifizierung der Substanzen wäre sicher wünschenswert, da CV_V8 mit 20 % Ausbeute des Extraktgewichts wohl die Hauptkomponente der Pflanze darstellte. Aufgrund der Unlöslichkeit der Substanzen in Methanol und Acetonitril war eine präparative HPLC‐
Trennung (Reversed‐Phase) nicht möglich. Eine Option zur Trennung der Substanzen wäre möglicher Weise über Normalphasenchromatographie. Gute Löslichkeit war in unpolaren Lösungsmitteln, wie Benzol, Toluol und Chloroform, gegeben. Die Trennung über eine Hypercarb‐Säule (Graphit‐Säule) wurde auch versucht, jedoch wurden bei dieser Methode keine Peaks am Chromatogramm angezeigt. 59 Experimenteller Teil 4. Experimenteller Teil 4.1 Hypericum irazuense 4.1.1 Pflanzenmaterial Von Hypericum irazuense wurden die oberirdischen Organe (Zweige) der Pflanze verwendet. Gesammelt und identifiziert wurde das Pflanzenmaterial von Dr. Wolfgang Schühly und Dr. Sara Crockett im Jahr 2007 in der Cordillera de la Talamanca (Costa Rica), oberhalb der Forschungsstation Villa Mills, ca. 1 km von der Panamericana, in der Páramo‐Vegetation auf 3100 m. Der Herbarbeleg ist am INBio (Instituto Nacional de Biodiversidad) in San José (Costa Rica) zu finden. Unterstützt wurde diese Sammlung von der Österreichischen Forschungsgemeinschaft (ÖFG). Abb. 109 Cordillera de la Talamanca [Gar08] 4.1.2 Extraktion Der Methanolextrakt von Hypericum irazuense wurde durch Perkolation des pulverisierten Pflanzenmaterials (ca. 500 g) bei Raumtemperatur hergestellt. Die Extraktion wurde 4‐mal durchgeführt mit ca. 1 ½ l Methanol. Der erhaltene Methanolextrakt wurde in ein Methanol/Wasser‐Gemisch aufgenommen (10 % MeOH → 100 ml, 90 % Wasser → 900 ml). Danach wurde 6‐mal gegen Dichlormethan ausgeschüttelt (je 500 ml DCM). Die DCM‐Phase wurde eingeengt und auf 20 g Kieselgel (Korngröße 0,063 ‐0,200 mm) aufgezogen. Ca. 17,5 g DCM‐Extrakt wurden erhalten. Die Methanol/Wasser‐Phase wurde nochmals gegen Butanol 60 Experimenteller Teil ausgeschüttelt (ca. 500 ml) und mit Wasser (ca. 100 ml) gewaschen. Der Butanolextrakt wurde mit Wasser 1:1 gemischt und dann am Rotavapor bei 100‐60 mbar eingeengt. Butanol hat einen hohen Siedepunkt (117°C), durch die Mischung mit Wasser bildet sich ein azeotropes Gemisch und es kommt zu einer Siedepunkterniedrigung (ca. 89°C), so kann das Lösungsmittel schneller und besser entfernt werden. Ca. 13 g Butanolextrakt wurden er‐
halten. Abb. 110 Hypericum irazuense (oberirdische Organe, getrocknet) Abb. 111 Hypericum irazuense (Pulver) 4.1.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes Die Auftrennung des Dichlormethanextraktes erfolgte durch eine offene Säulen‐
chromatographie. Der Extrakt wurde wie bereits erwähnt auf 20 g Kieselgel (Korngröße 0,063‐0,200 mm) aufgezogen. Danach wurde der Dichlormethanextrakt auf eine mit 150 g Kieselgel (Korngröße 0,040–0,063 mm) gefüllte Säule (l=30 cm, d=8 cm) aufgebracht. Eluiert wurde mit n‐Hexan, Ethylacetat und Methanol. Tab. 7 Grobfraktionierung des Dichlormethanextraktes von Hypericum irazuense Menge (ml) 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 n‐Hexan (%) 100 96,7 93,3 90 85 80 70 65 50 50 0 Ethylacetat (%)
0
3,3
6,7
10
15
25
30
35
50
50
0
Methanol (%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+5
100
Fraktionsgröße (ml)
200 200 200, 60, 25
25 25 25 25 25 25 25 300 Fraktionen, die bei der Untersuchung mit DC ähnliche oder gleiche Banden auswiesen, wurden vereinigt. Insgesamt wurden 15 Fraktionen mit Unterfraktionen erhalten. 61 Experimenteller Teil Tab. 8 Fraktionen des Dichlormethanextraktes von Hypericum irazuense Fraktion HL_V1 HL_V2 HL_V3 HL_V4 HL_V5 HL_V6 HL_V7 HL_V7_1MeOH (von HL_V7) HL_V7_2MeOH (von HL_V7) HL_V8 HL_V8_K (von HL_V8) HL_V8_2MeOH (von HL_V8) HL_V9 HL_V10 HL_V11 HL_V12 HL_V13 HL_V14 HL_V15 Vereinigte Fraktionen
1‐3
4‐12
13‐23
24‐29
30‐36
37‐46
47‐52
‐
‐
53‐64
‐
‐
65‐72
73‐78
79‐84
85‐91
92‐99
100‐104
105
Ausbeute (g) 0,467 1,583 0,885 0,594 0,517 0,559 0,336 0,007 0,0164 0,729 0,067 0,061 0,582 0,418 0,471 0,620 0,661 2,610 6,220 Von den Fraktionen wurde wieder ein DC angefertigt und diese wurden auch mittels HPLC untersucht. Auch der gesamte Dichlormethanextrakt, der Butanolextrakt und die Methanol/Wasser‐Phase wurden einer HPLC‐Untersuchung unterzogen. 4.1.4 Aufarbeitung einzelner Fraktionen des Dichlormethanextraktes 4.1.4.1 Fraktion HL_V1 Diese transparente, ölige Fraktion wurde mittels Gaschromatographie aufgetrennt. Die Substanzen wurden durch den Einsatz eines Massenspektrometers identifiziert, welches mit dem GC‐Gerät gekoppelt ist. Zur Aufklärung wurden die Datenbanken HPCH2205 [Ada07], Nistos 05 und Wiley Aetherolea 8NO5 verwendet. Jene Peaks, die eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 90 % aufwiesen, wurden als Ergebnisse aufgeführt. Eine Beschreibung des Geräts und der verwendeten Methode findet sich unter 4.6.3. 4.1.4.2 Fraktionen HL_V2 bis HL_V5 Diese orangeroten, leicht öligen bis gelartigen Fraktionen mit sehr angenehmem Geruch, wurden ebenfalls wie bei HL_V1 beschrieben, einer GC‐MS Analyse unterzogen. 62 Experimenteller Teil Von HL_V5 wurde eine präparative Trennung vorgenommen. Zuerst wurde die Fraktion mit Hilfe der Festphasenextraktion gereinigt. Zweimal ca. 230 mg der Fraktion wurden in je 1 ml Methanol gelöst und auf zwei konditionierte SPE Säulchen aufgebracht. Eluiert wurde gleich mit 100 % Methanol (unter Vakuum), dabei entstanden drei Methanolfraktionen (je 5 ml, 15 ml und 10 ml). Zwei weitere Fraktionen wurden mit Dichlormethan und Aceton erhalten (je 2‐mal 25 ml). Gleiche Fraktionen der zwei Säulchen wurden vereint und eine analytische HPLC‐Untersuchung wurde durchgeführt. HL_V5_S2 (315 mg) wurde in Methanol gelöst (c=40 mg/ml) und einer präparativen HPLC unterzogen. Sechs Läufe wurden durchgeführt (dritter Lauf fehlgeschlagen, da die Säule leckte). Folgende Methode wurde verwendet. Tab. 9 präp. HPLC‐Methode HL_V5_S2 Zeit (min)
0 10 20 45 Acetonitril (%)
75
75
100
100
Wasser (%)
25
25
0
0
Eingespritzt wurden 0,5‐1,0 ml. Detektiert wurde bei 210 nm und die Flussrate betrug 20 ml/min. Es entstanden sechs Fraktionen. Wiederum wurden diese einer analytischen HPLC‐
Analyse unterzogen. HL_V5_S2_H3 (8 mg) und HL_V5_S2_H5 (3 mg) waren die interessanten Fraktionen, wegen der geringen Menge konnte nur ein Protonenspektrum angefertigt werden. 4.1.4.3 Fraktion HL_V8_2MeOH 66 mg wurden in 2,2 ml Methanol (schwerlöslich in MeOH, Ultraschallbad) gelöst. Diese Lösung wurde dann auf ein konditioniertes SPE‐Säulchen aufgebracht und in kleinen Schritten mit Methanol fraktioniert. Es entstanden 17 Fraktionen (Fraktionsgröße 5‐10 ml). Die Fraktionen 12‐17 entstanden durch einen Methanol‐Dichlormethan‐Gradient (90:10, 80:10, 70:10, 50:50 und 100 % DCM). Zum Schluss wurde das Säulchen noch mit 100 % Aceton gespült. Diese Fraktionen wurden nach einer DC‐Analyse zu drei Fraktionen vereinigt. Tab. 10 Fraktionen von HL_V8_MeOH Fraktion Vereinigte Fraktionen
1‐2 S1
3‐8 S2
9‐16 S3
17 verworfen
Ausbeute (g)
0,036
0,023
0,005
‐
HL_V8_2MeOH_S1 wirkte noch nicht ganz rein im DC. Von HL_V8_2MeOH_S2 wurde auch ein DC gemacht, man konnte einen Fleck erkennen (UV 254, Vanilin‐H2SO4‐Reagenz). Von Fraktion HL_V8_2MeOH_S1 wurde nach dem Trocknen der Bodensatz in ein neues Gläschen überführt, da dieser sauber wirkte und am Rand des Gläschens sich wahrscheinlich die Ver‐
unreinigung abgesetzt hatte. Bei Fraktion HL_V8_2MeOH_S2 hatte sich nach dem Trocknen 63 Experimenteller Teil ein weißer Niederschlag am Rand des Gläschens abgesetzt. Dieser wurde in Chloroform:Toluol:Methanol (3:3:1) gelöst und in ein neues Gläschen überführt. Der Rest der Fraktion wurde als Überstand benannt. Die DC‐Kontrolle zeigte bei der Fraktion HL_V8_2MeOH_S2_NS einen gelben Fleck nach dem Besprühen. Von HL_V8_2MeOH_S1_BS und HL_V8_2MeOH_S2 wurden 1H‐Spektren und 2D‐NMR‐Messungen gemacht, von HL_V8_2MeOH_S1_BS auch ein 13C‐Spektrum. 4.1.4.4 Fraktion HL_V10 Von dieser dunkelgrün gefärbten Fraktion wurde alles aufgearbeitet. 212 mg und 206 mg wurden in je 1 ml Methanol gelöst (Ultraschallbad) und auf zwei konditionierte SPE‐Säulchen (2 g) aufgebracht. Eluiert wurde gleich mit 100 % Methanol (unter Vakuum), dieser Vorgang sollte zur Reinigung und Vorbereitung für die präparative HPLC dienen. Erhalten wurden vier Fraktionen, die ersten drei Fraktionen mit Methanol (je 2‐mal 15 ml) und die letzte mit Dichlormethan (je 2‐mal 25 ml). Anschließend wurden analytische HPLC‐Läufe gemacht. Fraktion HL_V10_S1 (378 mg) enthielt die interessanten Peaks und wurde in Methanol gelöst (c=40 mg/ml). Neun präparative HPLC‐Läufe wurden durchgeführt, wobei sich die nach‐
stehende Methode am geeignetsten erwies. Eingespritzt wurden 0,3‐0,6 ml. Tab. 11 präp. HPLC Methode HL_V10_S1 Zeit (min)
0 10 15 20 25 50 Acetonitril (%)
75
75
80
85
100
100
Wasser (%)
25
25
20
15
0
0
Detektiert wurde bei 254 nm und die Flussrate betrug 20 ml/min. Erhalten wurden sieben Fraktionen, die mit analytischer HPLC untersucht wurden. HL_V10_S1_H3 (13 mg) und HL_V10_S1_H6 (50 mg) wurden daraufhin mit NMR‐Spektroskopie und LC‐MS identifiziert. 4.1.4.5 Fraktion HL_V11 Mit dieser ebenfalls dunkelgrün gefärbten Fraktion wurde ähnlich verfahren wie mit HL_V10. 269 mg wurden in 1 ml Methanol am Ultraschallbad gelöst und mit Hilfe eines konditionierten SPE‐Säulchens gereinigt (Methanol 100 %). Erhalten wurden drei Fraktionen zu 30 ml MeOH, 20 ml MeOH und 50 ml Aceton. Die erhaltenen 227 mg der Fraktion HL_V11_S1 wurden für die weitere präparative HPLC‐Trennung in Methanol gelöst (c=40 mg/ml). Wiederum wurden neun präparative HPLC‐Läufe durchgeführt (nachstehende Methode am geeignetsten), eingespritzt wurden 0,2‐1,0 ml. 64 Experimenteller Teil Tab. 12 präp. HPLC Methode HL_V11_S1 Zeit (min)
0 10 18 40 Acetonitril (%)
60
60
100
100
Wasser (%)
40
40
0
0
Detektiert wurde bei 254 nm und die Flussrate betrug 20 ml/min. Erhalten wurden vier Fraktionen, die mit analytischer HPLC untersucht wurden. HL_V11_S1_H2 (16 mg) und HL_V11_S1_H3 (63 mg) wurden daraufhin mit NMR‐Spektroskopie und LC‐MS identifiziert. 4.2 Clusia valerioi 4.2.1 Pflanzenmaterial Die Blätter von Clusia valerioi wurden, ebenfalls von Dr. Wolfgang Schühly und Dr. Sara Crockett im Esquinas‐Regenwald von Costa Rica (Golfo dulce) im Februar 2007 gesammelt und identifiziert. Auch dieser Herbarbeleg ist am INBio in San José, Costa Rica, zu finden. Abb. 112 Esquinas‐Regenwald [Gar08] 4.2.2 Extraktion Die pulverisierten Blätter von Clusia valerioi wurden 3‐mal mit 1 ½ l Dichlormethan in der Kälte extrahiert (Perkolation). Der erhaltene Extrakt wurde eingeengt und auf Kieselgel (Korngröße 0,063‐0,200 mm) aufgezogen. Für die Grobfraktionierung wurden 10 g des er‐
haltenen Dichlormethanextraktes verwendet. 65 Experimenteller Teil Nachdem das Pflanzenmaterial wieder getrocknet war, wurde auch mit Methanol extrahiert. 98 g Methanolextrakt wurden erhalten. Abb. 113 Clusia valerioi (Blätter, getrocknet) Abb. 114 Clusia valerioi (Pulver) 4.2.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes Für die Grobfraktionierung wurde wiederum mit einer offenen Säule gearbeitet. Auf die Säule wurden 10 g Extrakt aufgebracht, die zuvor mit ca. 15 g Kieselgel (Korngröße 0,063‐
0,200 mm) zum Trocknen vermengt wurden. Die Säule (l=61 cm, d=4,5 cm) wurde mit 200 g Kieselgel (Korngröße 0,040‐0,063 mm) gefüllt. Die Elution erfolgte wiederum mit n‐Hexan, Ethylacetat und Methanol. Tab. 13 Grobfraktionierung des Dichlormethanextraktes von Clusia valerioi Menge (ml) 500 700 300 600 600 300 600 300 300 300 300 300 650 n‐Hexan (%) 100 96,7 93,3 90 87,5 85 80 75 70 65 50 50 0 Ethylacetat (%)
0
3,3
6,7
10
12,5
15
20
25
30
35
50
50
0
Methanol (%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+5
100
Fraktionsgröße (ml)
250 250 250 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30, 200
Diese Fraktionen wurden auch einer Untersuchung mit DC unterzogen, vereinigt wurden wiederum Fraktionen mit ähnlichen oder gleichen Banden. Gesamt wurden 16 Fraktionen mit Unterfraktionen erhalten. Tab. 14 Fraktionen des Dichlormethanextraktes von Clusia valerioi Fraktion CV_V1 CV_V2 CV_V3 Vereinigte Fraktionen
2‐6
7‐11
12‐13
66 Ausbeute (g) 0,388 0,083 0,159 Experimenteller Teil CV_V4 CV_V5 CV_V6 CV_V6_K (von CV_V6) CV_V7/K CV_V7_Ü (von CV_V7) CV_V8 CV_V9 CV_V10 CV_V11 CV_V12 CV_V13 CV_V14 CV_V15/1 CV_V15/2 CV_V15/3 CV_V16 14‐15
16‐20
21‐26
‐
27‐33
‐
34‐52
53‐70
71‐84
85‐97
98‐118
119‐126
127‐135
136‐148
‐
‐
149‐160
0,198 0,162 0,215 0,100 0,238 1,014 2,843 0,234 0,290 0,360 0,456 0,234 0,181 0,325 0,821 0,614 0,095 Als weitere Vorgehensweise wurden die Fraktionen mit einem Dünnschichtchromatogramm untersucht und auch eine HPLC‐Analyse wurde von den einzelnen Fraktionen gemacht. 4.2.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen 4.2.4.1 Fraktion CV_V1 CV_V1 wurde mit Hilfe einer präparativen Dünnschichtchromatographie aufgearbeitet. 60 mg der Fraktion wurden in 1,6 ml eines Gemischs aus Methanol, Chloroform und Hexan (1:1:1) gelöst. Aufgetragen wurde die gelöste Substanz auf eine präparative DC‐Platte 20 x 20 (Laufstrecke 15 cm, 1,5 cm Abstand vom unteren Rand, 1 cm Abstand von beiden Seiten). Als Laufmittel wurde Hexan (ca. 50 ml) verwendet. Nach der Elution wurde die Platte gut getrocknet. Die Platte wurde geteilt und ein dünner Streifen zum Besprühen mit Vanillin‐
H2SO4‐Reagenz entnommen (da keine UV‐ oder Vis‐Detektion möglich war). Drei Banden wurden angezeichnet und abgeschabt. Als Elutionsmittel diente n‐Hexan und Ethylacetat (3‐
mal, je 10 ml). Das Kieselgel mit Substanz wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, mit Elutionsmittel versetzt, ein paar Minuten am Ultraschallbad gelassen und dann ab‐
zentrifugiert (5 min, 40 rpm). Der Überstand wurde abgenommen und eingedampft. Von CV_V1_D1 und CV_V1_D2 wurden Protonenspektren aufgenommen. Mit Hilfe des GC‐MS konnten 5 Substanzen identifiziert werden. Zur Aufklärung wurden die Datenbanken HPCH2205 [Ada07], Nistos 05 und Wiley Aetherolea 8NO5 verwendet. Jene Peaks, die eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 90 % aufwiesen, wurden als Ergebnisse aufgeführt. Eine Beschreibung des Geräts und der verwendeten Methode findet sich unter 4.6.3. 67 Experimenteller Teil 4.2.4.2 Fraktion CV_V4 198 mg der Fraktion wurden über eine kleine offene Kieselgelsäule (h=23,5 cm, d=2 cm) auf‐
getrennt. Diese wurde in 1 ml n‐Hexan gelöst und auf die Kieselgelsäule aufgebracht (20 mg Kieselgel 60; Korngröße 0,063‐0,200 mm). Eluiert wurde mit n‐Hexan/Ethylacetat. Tab. 15 Fraktionierung von CV_V4 Menge (ml) 300 180 180 60 60 60 120 60 60 n‐Hexan (%) 100 99,5 99 98,5 97 96 95 90 50 Ethylacetat (%)
0
0,5
1
1,5
3
4
5
10
50
Fraktionsgröße (ml)
75 40, 8 8 8 8 8 8 8 50 Von den einzelnen Fraktionen wurde ein DC angefertigt und Fraktionen mit ähnlichen oder identischen Banden vereinigt. Tab. 16 Fraktionen von CV_V4 Fraktion verworfen C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 Vereinigte Fraktionen
1‐19
20‐39
40‐52
53‐64
65‐93
94‐101
102‐108
109
Ausbeute (g) ‐ 0,006 0,109 0,021 0,042 0,05 0,009 0,006 In der Fraktion CV_V4_C3 waren Kristalle zu sehen. Der Überstand wurde abgenommen, die Kristalle lösten sich nicht in Methanol, somit lösten sich die Verunreinigungen in dieses Lösungsmittel. Aus dieser Fraktion entstanden die Fraktionen CV_V4_C3/K und CV_V4_C3/Ü. Von den Kristallen wurde ein Protonenspektrum aufgenommen und ein analytischer HPLC‐
Lauf gemacht. 4.2.4.3 Fraktion CV_V6 Diese Fraktion wurde mit Hilfe von Methanol und Aceton gereinigt. Immer wieder wurden kleine Mengen des Lösungsmittels zugegeben und leicht gerührt, damit sich die Ver‐
unreinigungen lösen konnten. Der Überstand wurde abgenommen. Mit analytischer DC wurde der Fortgang der Reinigung überprüft. Zwei Fraktionen entstanden: CV_V6_K1 (122 mg) und CV_V6_K2 (5 mg). Ein Protonenspektrum wurde aufgenommen, anhand dessen 68 Experimenteller Teil konnte festgestellt werden, dass diese Fraktionen wahrscheinlich identisch sind. Eine Acetylierung wurde mit CV_V6_K2 durchgeführt. 3 mg der Substanz wurden mit 400 µl Pyridin und 400 µl Essigsäureanhydrid versetzt und einen Tag bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wurde der Ansatz in 2 ml Wasser aufgenommen und gegen Hexan (2‐mal, je 2 ml) ausgeschüttelt. Danach wurde 1 Minute bei 40 rpm abzentrifugiert. Die Hexanphase wurde eingetrocknet und für die GC‐MS verwendet. Außerdem wurde ein 1H‐Spektrum ver‐
messen. Die Ausbeute betrug 2,8 mg (CV_V6_K2_Acetylierung). CV_V6_K1 sollte mit NMR‐Spektroskopie vermessen werden, aber diese Probe löste sich in keinem geeigneten Lösungsmittel (Keine Lösung in: Pyridin, Chloroform, Methanol, Aceton und Toluol). 4.2.4.4 Fraktion CV_V8 Das analytische DC (Laufmittel: Hexan:Ethylacetat 75:25) von CV_V8 zeigte zwei Banden, eine leicht violette und eine dunkel‐violette, ovale Bande. Die leicht hellgrünliche Fraktion löste sich nicht in Methanol und Acetonitril, deshalb kam eine präparative HPLC (Reversed Phase) nicht in Frage. Das analytische HPLC‐Chromatogramm (Methode Standard_Lang 70) zeigte bei 43‐45 min zwei bis drei Peaks (diese waren nicht gut getrennt). 200 mg der Fraktion wurden über eine kleine offene Kieselgelsäule (h=23,5 cm, d=2 cm) auf‐
getrennt. Diese wurde in 1 ml Toluol gelöst und auf die Kieselgelsäule aufgebracht (20 mg Kieselgel 60; Korngröße 0,063‐0,200 mm). Eluiert wurde mit Toluol und Methanol. Tab. 17 Fraktionierung von CV_V8 Menge (ml) 200 300 150 25 Toluol (%)
100
97 95 0 Methanol (%)
0
3
5
100
Fraktionsgröße (ml)
50 5 5 5 Fraktionen mit identischen Banden wurden nach der DC‐Analyse vereint. Tab. 18 Fraktionen von CV_V8 Fraktion verworfen C1 C2 verworfen Vereinigte Fraktionen
1‐9
10‐26
27‐35
36‐61
Ausbeute (g) ‐ 0,116 0,081 ‐ CV_V8_C1 erwies sich am DC als fast rein, jedoch am analytischen HPLC‐Chromatogramm waren wieder drei Peaks zu erkennen und wahrscheinlich Verunreinigungen oder Abbau‐
produkte des Toluols. 69 Experimenteller Teil CV_V8_C2 wurde noch mit präparativer DC aufgetrennt. 60 mg wurden in 500 µl Toluol ge‐
löst und strichförmig auf die Platte aufgetragen, getrocknet und in einer gesättigten Kammer mit dem Laufmittel Toluol/Methanol (9:1; ca 100 ml) laufen gelassen. Nach dem Trocknen wurden zwei Banden (D1 rotorange, D2 blaugrün) angezeichnet (UV 366 nm). Diese wurden abgeschabt und mit Toluol eluiert (5‐mal, je 65 ml, Ultraschallbad). Danach wurde ab‐
zentrifugiert (5 min, 40 rpm) und der Überstand abfiltriert. Zwei Fraktionen entstanden (CV_V8_C2_D1 (13 mg) und CV_V8_C2_D2 (21 mg)). Die Protonenspektren zeigten aber, dass die Trennung noch nicht gut erfolgt war. Eine Trennung dieser Fraktion über eine Hypercarb‐Säule (Graphit‐Säule) wurde auch ver‐
sucht, jedoch ohne Erfolg, das Chromatogramm zeigte keine Peaks an. Deshalb wurde ein GC‐MS versucht. Zuvor wurde eine Acetylierung durchgeführt. 57 mg der Fraktion wurden mit 10 ml Pyridin und 2 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Dieser Ansatz wurde einen Tag bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wurde der Ansatz in 50 ml Wasser aufgenommen und gegen Dichlormethan (3‐mal, je 20 ml) ausgeschüttelt. Die Dichlormethanphase wurde getrocknet und für die GC‐MS und das Protonenspektrum ver‐
wendet. Die DC‐Analyse und das HPLC‐Chromatogramm zeigten den Erfolg der Acetylierung. 4.2.4.5 Fraktion CV_V9 Ein Teil dieser Fraktion wurde mit SPE in vier Fraktionen aufgetrennt. Die gelöste Fraktion wurde auf ein konditioniertes SPE‐Säulchen aufgebracht und mit folgenden Gradienten eluiert: 80:20 Methanol:Wasser, 90:10 Methanol:Wasser, 100 % Methanol und 50:50 Methanol:Dichlormethan. Analytische HPLC‐Chromatogramme wurden gemacht und von CV_V9_S3 wurde ein Protonenspektrum aufgenommen. Diese Fraktion wurde mit semipräparativer HPLC aufgetrennt. 36 mg wurden in 1 ml Methanol gelöst. Folgende Methode wurde verwendet: Tab. 19 semipräp. HPLC‐Methode CV_V9_S3 Zeit (min)
5 10 40 Acetonitril (%)
80
100
100
Wasser (%)
20
0
0
Die Flussrate betrug 2,4‐2,5 ml/min. Detektiert wurde bei 205, 220, 254 und 280 nm. Ein‐
spritzvolumen 25‐80 µl. 2 Fraktionen wurden erhalten. Von CV_V9_S3_P1 (7 mg) wurde ein Protonenspektrum aufgenommen. 70 Experimenteller Teil 4.2.5 Aufarbeitung des Methanolextraktes Vom Methanolextrakt wurde ein analytischer HPLC‐Lauf gemacht. 214 mg und 204 mg wurden in je 0,5 ml Methanol gelöst und auf zwei konditionierte SPE‐Säulchen aufgebracht. Im Säulchen wurden noch 0,5 ml Wasser zugefügt. Mit folgenden Gradienten wurde eluiert: 50:50 Methanol:Wasser, 60:40 Methanol:Wasser, 70:30 Methanol:Wasser, 80:20 Methanol:Wasser, 90:10 Methanol:Wasser, 100 % Methanol und 100 % Aceton. Die jeweils erhaltenen Fraktionen von jedem Säulchen wurden vereint, insgesamt entstanden sieben Fraktionen, die einer HPLC‐Analyse unterzogen wurden. Eine weitere Auftrennung wurde nicht gemacht, da die Chromatogramme viele Peaks zeigten und eine Trennung schwierig gewesen wäre. 4.3 Geräte, Material und Methoden 4.3.1 Säulenchromatographie Stationäre Phase: Kieselgel 60 (Korngröße 0,040‐0,063 mm) Fa. Merck Kieselgel 60 (Korngröße 0,063‐0,200 mm) Fa. Merck Das erste Kieselgel wurde für die Grobfraktionierung der Extrakte von Hypericum irazuense und Clusia valerioi verwendet. Auf das zweite genannte Kieselgel wurden die Extrakte für die Grobfraktionierung aufge‐
zogen und dann auf die Säule aufgebracht. Außerdem wurde es auch für die kleinen Kiesel‐
gelsäulen verwendet. Mobile Phase: Fließmittelgradienten n‐Hexan, Ethylacetat Methanol und Toluol 4.3.2 Dünnschichtchromatographie (DC) 4.3.2.1 Analytische Dünnschichtchromatographie Stationäre Phase: Mobile Phase: Detektion: DC‐Alufolie, 20 x 20 cm, Kieselgel 60 F254; Fa. Merck Laufmittelgemische von n‐Hexan/Ethylacetat wurden im Ver‐
hältnis 95:5, 75:25 und 50:50 verwendet. (Toluol/Methanol 9:1) Detektiert wurde im UV (Fluoreszenzlöschung bei 254 nm, Eigenfluoreszenz bei 366 nm und im Vis‐Bereich). Die DCs wurden außerdem mit Vanillin‐H2SO4‐Reagenz besprüht und 71 Experimenteller Teil anschließend auf der Heizplatte (100 °C) kurz erhitzt. Diese Auswertung erfolgte im Vis‐Bereich. 4.3.2.2 Präparative Dünnschichtchromatographie Stationäre Phase: Mobile Phase: Detektion: PSC‐Platte 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254 +366, 2 mm; Fa. Merck Hexan, Toluol:Methanol (9:1) Vanillin‐H2SO4‐Reagenz, UV 4.3.3 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) 4.3.3.1 Analytische HPLC Gerät: Stationäre Phase: Mobile Phase: Agilent 1100 Series Agilent, Zorbax SB‐C18; 3,5µm; 2,1 x 150 mm Acetonitril/Wasser Fließmittelgradienten: Tab. 20 Methode Standard_Lang 40 Tab. 21 Methode Standard_Lang 45 Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 10
90
30 100 0 40 100 0 41 10
90
Zeit (min)
0
25
30
45
Acetonitril (%) Wasser (%)
10
90 90
10 100
0 100
0 Tab. 22 Methode Standard_Lang 70 (CV_V8) Tab. 23 Methode Standard_Lang 60 Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 50
50
20 90
10
30 100 0 70 100 0 Zeit (min)
0
20
30
60
Acetonitril (%) Wasser (%)
50
50 90
10 100
0 100
0 Detektor: Diodenarraydetektor (DAD); Mit diesem Detektor kann gleich‐
zeitig bei mehreren Wellenlängen detektiert werden. Detektiert wurde bei 205 nm, 220 nm, 254 nm und bei 280 nm. Fließgeschwindigkeit: Einspritzvolumen: Probenvorbereitung: 0,3 ml/min 10‐15 µl Eine Spatelspitze der Probe wurde in 400 µl Methanol gelöst. 72 Experimenteller Teil 4.3.3.2 Semipräparative HPLC Gerät: Stationäre Phase: Agilent 1100 Series LiChroCart 250‐10 HPLC‐Kartusche Lichrosorb RP‐18 (7µm); Fa. Merck Mobile Phase: Acetonitril/Wasser, unterschiedliche wurden verwendet. Detektor: Detektiert wurde mit einem Diodearraydetektor (DAD) bei den Wellenlängen 205 nm, 220 nm, 254 und 280 nm. Fließmittelgradienten Fließgeschwindigkeit: 2,2 ml/min Einspritzvolumen: 25‐80 µl Probenvorbereitung: Die vorgesehene Probe wurde mit SPE aufgereinigt und mit Methanol in Lösung gebracht (c=40 mg/ml). 4.3.3.3 Präparative HPLC Gerät: Stationäre Phase: Mobile Phase: Detektion: Fließgeschwindigkeit: Einspritzvolumen: Probenvorbereitung: Varian R PrepStar Model SD‐1 Dynamax R Solvent Delivery System Model SD‐1 Dynamax R Absorbance Detector Model UV‐1 VDSpher 100 C18, 10 µm, 250 x 25 mm Acetonitril/Wasser, unterschiedliche wurden verwendet. Fließmittelgradienten Detektiert wurde bei den Wellenlängen 210 nm und 254 nm. 20 ml/min 0,2‐1 ml Die durch SPE gereinigte Probe wurde in Methanol gelöst (c=40 mg/ml). 4.3.4 Reversed Phase (RP‐)‐Festphasenextraktion (SPE) Säule: Elutionsmittel: ISOLUTE SPE Columns, 2 g, C18 (EC) 6 ml; Biotage Methanol/Wasser‐Gemische/Dichlormethan/Aceton 73 Experimenteller Teil 4.3.5 Flüssigchromatographie‐Massenspektrometrie (LC‐MS) Gerät: Stationäre Phase: Mobile Phase: Fließmittelgradient: Fließgeschwindigkeit: Einspritzvolumen: Probenvorbereitung: Thermo Finnigan Surveyor Liquid Chromatograph LCQ DECA XP ThermoFinigan: Autosampler Surveyor ThermoQuest: MS‐Pump Surveyor ThermoQuest: PDA Detector Surveyor Agilent, Zorbax SB‐C18; 3,5 µm; 2,1 x 150 mm Acetonitril/Wasser (Zusatz 0,1% Ameisensäure) Entspricht der analytischen HPLC 0,3 ml/min 10 µl Eine Spatelspitze der Probe wurde in 400 µl Methanol gelöst. 4.3.6 Gaschromatographie‐Massenspektrometrie (GC‐MS) Gerät: Stationäre Phase: Agilent Technologies 7890A GC‐System Agilent Technologies 7683B Series Injector Agilent Technologies 5975C VL MSD Agilent 19091S‐433: 325°C: 30 m x 250 µm x 0,25 µm HP‐5MS 5 % Phenyl Methyl Silox: 208.58019 Mobile Phase: Helium Temperaturprogramm: 45 °C für 2 min, mit 4 °C/min auf 250 °C für 2 min (ätherische Öle) 45 °C für 2 min, mit 6 °C/min auf 300 °C für 20 min (Sterole) Injektionsvolumen: Injektortemperatur: Druck: Modus: Split Ratio: Probenvorbereitung: 1 µl 240 °C bzw. 280 °C 6,2295 psi (ätherische Öle) bzw. 11,403 (Sterolmethode) Split 80:1 bzw. 50:1 Eine Spatelspitze der Probe wurde in 1 ml Hexan gelöst. 4.3.7 Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) Gerät: Messfrequenz: Lösungsmittel: Interner Standard: Varian Unitylnova 600 MHz und 400 MHz Spectrometer 599 MHz, 399 MHz Chloroform‐d1, Pyridin‐d5, Aceton‐d6 TMS‐Tetramethylsilan 74 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Diese Diplomarbeit beschäftigte sich mit der phytochemischen Untersuchung der ober‐
irdischen Organe (Zweige) von Hypericum irazuense Kuntze und den Blättern von Clusia valerioi Standley. Beide Arten zählen zur Familie der Clusiaceae. Für die Isolierung und Trennung der Substanzen wurden verschiedene chromatographische Methoden eingesetzt. Die Aufklärung erfolgte durch NMR‐Spektroskopie, LC‐MS und den Vergleich von Massen‐
spektren über Datenbanken (GC‐MS). Hypericum irazuense zählt zur Gattung Hypericum L. und ist in die Sektion Brathys ein‐
gegliedert. Man trifft die Art als Strauch oder kleinen Baum an, der 0,4‐5 m hoch werden kann. Die Blätter sind ledrig und an der Spitze der Spreite zugespitzt. Der Blütenstand ist 1‐
blütig. Charakteristisch für alle Arten der Sektion Brathys ist, dass ihnen die dunklen Drüsen gänzlich fehlen und sie besitzen außerdem keine Harzdrüsen am Unterblatt. Diese Art ist in Costa Rica und Panama verbreitet, sie ist in der Páramo‐Vegetation auf einer Höhe von ca. 3200 m anzutreffen. Das Pflanzenmaterial von Hypericum irazuense wurde in der Cordillera de la Talamanca (Costa Rica) auf 3100 m gesammelt. Von diesem Material wurde ein Methanolextrakt her‐
gestellt. Dieser Extrakt wurde in eine Methanol/Wasser‐Phase aufgenommen und gegen Dichlormethan ausgeschüttelt. Die Methanol/Wasser‐Phase wurde nochmals gegen Butanol ausgeschüttelt. Weitergearbeitet wurde mit dem Dichlormethanextrakt. Dieser wurde auf eine Kieselgelsäule aufgebracht und grobfraktioniert. Die erhaltenen Fraktionen wurden daraufhin weiter mit Hilfe von DC und HPLC untersucht. Die ersten fünf Fraktionen wurden mittels GC‐MS untersucht. Einige Komponenten von ätherischen Ölen konnten nachgewiesen werden. Die Monoterpene α‐Pinen, β‐Pinen und Limonen konnten gefunden werden. Auch die Sesquiterpene β‐Elemen und α‐trans‐
Bergamoten konnten identifiziert werden. Außerdem wurde das Diterpen Cembren nach‐
gewiesen. Mit Hilfe der Festphasenextraktion konnten 1,5‐Dihydroxyxanthon und Betulinsäure rein gewonnen werden. Durch präparative HPLC‐Trennung konnten vier weitere Xanthone isoliert werden. Die gefundenen Xanthone Isocudraniaxanthon B, Xanthon V1, Xanthon V1a und Gerontoxanthon I wurden schon aus anderen Arten der Familie und aus der Familie der Moraceae isoliert. Sie unterscheiden sich in ihrer Struktur vor allem im A‐Ring, am B‐Ring tragen sie zwei OH‐Gruppen an Position 5 und 6, nur das 1,5‐Dihydroxyxanthon trägt eine OH‐Gruppe an der 5. Position. Der A‐Ring ist auch mit zwei OH‐Gruppen substituiert, nämlich in Position 1 und 3, die Verbindung Isocudraniaxanthon B weicht etwas davon ab, sie trägt in Position 3 eine Methoxygruppe. Außerdem ist diese Substanz mit einer offenen Seitenkette (1,1‐Dimethyl‐2‐propen‐1‐yl) substituiert. Xanthon V1 trägt in Position 4 einen Prenylrest und ist auch mit einem Pyranring substituiert. Xanthon V1a trägt in Position 2 und 4 und 75 Zusammenfassung Gerontoxanthon I in Position 2 den Prenylrest. Gerontoxanthon I trägt in Position 4 auch einen 1,1‐Dimethyl‐2‐propen‐1‐yl Substituenten. Xanthone weisen ein breites Wirkungs‐
spektrum an biologischen Aktivitäten auf, in weiterer Folge stehen die gefundenen Xanthone für die Testung auf biologische Aktivität zur Verfügung. Die gefundene Betulinsäure kommt im Pflanzenreich recht häufig vor. Sie zählt zu den Triterpenen (Lupantyp), die Substanz besitzt eine exozyclische CH2‐Gruppe. Diese Substanz ist auch für einige biologische Aktivitäten bekannt. Clusia valerioi zählt zur Gattung Clusia und wird in die Sektion Omphalanthera eingeordnet. Die Pflanze ist in tropischen Gebieten von Zentralamerika bis Südamerika weitverbreitet. Bei Clusia valerioi handelt es sich um einen Epiphyten. Ihre Blätter sind lederartig, ganzrandig und eiförmig bis elliptisch. Clusia valerioi ist zweihäusig. Blüten und Früchte werden das ganze Jahr produziert. Während der Anthese sondern die Blüten ein gelbes viskoses Harz ab. Die Blätter von Clusia valerioi wurden im Esquinas‐Regenwald von Costa Rica gesammelt. Das Material wurde gemahlen und ein Dichlormethanextrakt hergestellt, auch ein Methanolextrakt wurde gewonnen. Über eine offene Säulenchromatographie (Kieselgel) wurde der Dichlormethanextrakte grobfraktioniert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf verschiedene Weise aufgearbeitet. Durch GC‐MS‐Analyse konnten folgende Sesquiterpene gefunden werden: α‐Copaen, E‐
Caryophyllen, α‐Humulen, α‐Selinen und β‐Selinen. Triterpengemische der Summenformeln C30H52O, C29H48O2 und C30H50O waren in großen Mengen in den Blättern von Clusia valerioi vorhanden. Eine Trennung mit präparativer HPLC (Reversed‐Phase) war aufgrund der Unlöslichkeit der Substanzen in Methanol und Acetonitril nicht möglich, so konnte keine genaue Identifizierung der Substanzen stattfinden. Die ge‐
nannten Summenformeln ergaben sich nach Bestimmung der Masse. Zuerst wurden die Substanzen acetyliert. Die Masse wurde mit Hilfe des GC‐MS bestimmt. In Zukunft wäre es sicher interessant die genaue Struktur dieser Triterpene aufzuklären, da sie wohl die Hauptkomponente des Dichlormethanextraktes der Blätter darstellen. Eine Option zur Trennung der Substanzen wäre eventuell die Normalphasenchromatographie. 76 Anhang 6. Anhang 6.1 Literaturverzeichnis [Ada07] Adams, Robert P.: Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatographie, Mass Spectrometry, 4th edition, (2007) [Bec04] Heinz G. O. Becker et al.: Organikum. Wiley‐VCh Verlag GmbH, Weinheim, (2004) [Ber98] Berry Paul E., Holst Bruce K. and Yatskievych Kay: Flora of the Venezuelan Guayana. Volume 4, Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, (1998) [Boo06] Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai, Suchada Chantrapromma, Chanita Ponglimanont, Hoong‐Kun Fun, Akkharawit Kanjana‐Opasc and Surat Laphookhieod: Bioactive prenylated xanthones and anthraquinones from Cratoxylum formosum ssp. pruniflorum. Tetrahedron 62 8850‐8859, (2006) [Boo06*] Nawong Boonnak, Suchada Chantrapromma and Hoong‐Kun Fun: 4‐(1,1‐
Dimethylprop‐2‐enyl)‐1,3,5,6‐tetrahydroxy‐2‐(3‐methylbut‐2‐enyl)‐9H‐
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Endblüte (H. calycinum) [Hey07].. 4 Abb. 6 halbierte Blüte (H. calycinum) [Hey07] ........................................................................... 4 Abb. 7 Kapsel (H. calycinum) [Hey07] ........................................................................................ 4 Abb. 8 Spross mit Blütenständen (Calophyllum inophyllum) [Hey07] ....................................... 5 Abb. 9 Gynözeum (Calophyllum inophyllum) [Hey07] ............................................................... 5 Abb. 10 Staubblatt (Calophyllum inophyllum) [Hey07] .............................................................. 5 Abb. 11 Xanthon Grundstruktur ................................................................................................. 5 Abb. 12 Maclurin ........................................................................................................................ 5 Abb. 13 Hyperin (=Hyperosid, Quercetin‐3‐galaktosid) ............................................................. 5 Abb. 14 Phloroglucinol ............................................................................................................... 6 Abb. 15 Hypericin ....................................................................................................................... 9 Abb. 16 Flavon .......................................................................................................................... 10 Abb. 17 Favonol ........................................................................................................................ 10 Abb. 18 Cumarin Grundstruktur ............................................................................................... 10 Abb. 19 Ausschnitt Verwandtschaftsverhältnis Sektion Brathys [Rob90] ............................... 10 Abb. 20 Verbreitungsgebiet der Sektion Brathys [Gar08] ....................................................... 11 Abb. 21 oberirdische Organe [Crockett] .................................................................................. 12 Abb. 22 Zweige [Schühly] ......................................................................................................... 12 Abb. 23 Blüten [Crockett] ......................................................................................................... 12 Abb. 24 Verbreitungsgebiet von Hypericum irazuense ............................................................ 13 Abb. 25 Habitus [Rob87] .......................................................................................................... 14 Abb. 26 Sprossachse mit Blättern [Rob87] .............................................................................. 14 Abb. 27 Blatt [Rob87] ............................................................................................................... 14 Abb. 28 Kelchblatt und Kronblatt [Rob87] ............................................................................... 14 Abb. 29 Staubblatt und Fruchtknoten [Rob87] ........................................................................ 14 Abb. 30 Kapsel [Rob87] ............................................................................................................ 14 Abb. 31 Verbreitungsgebiet der Gattung Clusia [Lüt07] .......................................................... 15 Abb. 32 Clusia rosea (weibliche und männliche Blüte, Anthere) [Ber98] ................................ 16 Abb. 33 1,3,4,5,6‐Pentamethoxy‐9H‐xanthen‐9‐on [Kyo98] ................................................... 17 81 Anhang Abb. 34 Clusianon [Pic05] ......................................................................................................... 17 Abb. 35 7‐epi‐Clusianon [Pic05] ............................................................................................... 17 Abb. 36 Plukenetion F [Hen99] ................................................................................................ 17 Abb. 37 Blüte und Blätter [Crockett] ........................................................................................ 18 Abb. 38 Blüte [Schühly] ............................................................................................................ 18 Abb. 39 Verbreitungsgebiet von Clusia valerioi ....................................................................... 19 Abb. 40 Querschnitt Knospe (SEM), Anordnung Blütenorgane [Hoc06] ................................. 21 Abb. 41 fünf Kronblätter (SEM) [Hoc06] .................................................................................. 21 Abb. 42 apikales Meristem (SEM) [Hoc06] .............................................................................. 21 Abb. 43 apikales Meristem mit Haufen (SEM) [Hoc06] ........................................................... 21 Abb. 44 staminodiale Primordia (SEM) [Hoc06] ...................................................................... 22 Abb. 45 Fruchtblatt Primordia (SEM) [Hoc06] ......................................................................... 22 Abb. 46 Narbenlappen (SEM) [Hoc06] ..................................................................................... 22 Abb. 47 Arillus (SEM) [Hoc06] .................................................................................................. 22 Abb. 48 Trigona sp. (Clusia peninsulae sp. ined, männliche Blüte) ......................................... 23 Abb. 49 Blütenbesucher ........................................................................................................... 23 Abb. 50 weibliche Blüte Clusia valerioi .................................................................................... 23 Abb. 51 männliche Blüte Clusia valerioi ................................................................................... 23 Abb. 52 Isolierschema Hypericum irazuense............................................................................ 26 Abb. 53 Gaschromatogramm HL_V1 ........................................................................................ 27 Abb. 54 Peak 1: α‐trans‐Bergamoten, 96 % ............................................................................. 28 Abb. 55 Peak 2: Cembren, 95 % ............................................................................................... 28 Abb. 56 Gaschromatogramm HL_V2 ........................................................................................ 28 Abb. 57 Peak 1: α‐Pinen, 94 % ................................................................................................. 28 Abb. 58 Peak 2: Triacontan, 91 % ............................................................................................. 28 Abb. 59 Gaschromatogramm HL_V3 ........................................................................................ 29 Abb. 60 Peak 1: α‐Pinen, 94 % ................................................................................................. 29 Abb. 61 Peak 2: β‐Pinen, 96 % .................................................................................................. 29 Abb. 62 Peak 3: Limonen, 95 % ................................................................................................ 29 Abb. 63 Peak 4: Cembren, 99 % ............................................................................................... 29 Abb. 64 Peak 5: β‐Elemen, 93 % ............................................................................................... 29 Abb. 65 Gaschromatogramm HL_V4 ........................................................................................ 30 Abb. 66 Gaschromatogramm HL_V5 ........................................................................................ 30 Abb. 67 Strukturformel Betulinsäure ....................................................................................... 31 Abb. 68 Strukturformel 1,5‐Dihydroxyxanthon ....................................................................... 32 Abb. 69 UV‐Spektrum HL_V8_2MeOH_S2_NS ........................................................................ 33 Abb. 70 1H‐NMR‐Spektrum von 1,5‐Dihydroxyxanthon (Aceton‐d6, 298K, TMS) .................... 33 Abb. 71 HSQC‐Spektrum von 1,5‐Dihydroxyxanthon .............................................................. 34 Abb. 72 Strukturformel Isocudraniaxanthon B ........................................................................ 35 Abb. 73 UV‐Spektrum HL_V10_S1_H3 (Isocudraniaxanthon B) .............................................. 35 Abb. 74 1H‐NMR‐Spektrum von Isocudraniaxanthon B (Aceton‐d6, 298K, TMS) .................... 36 Abb. 75 HMBC‐Spektrum von Isocudraniaxanthon B .............................................................. 36 82 Anhang Abb. 76 HSQC‐Spektrum von Isocudraniaxanthon B ............................................................... 37 Abb. 77 Strukturformel von Xanthon V1 (Hauptkomponente) ............................................... 38 Abb. 78 UV‐Spektrum HL_V10_S1_H6 (Xanthon V1) ............................................................... 39 Abb. 79 1H‐NMR‐Spektrum Mischung Xanthon V1 und Gerontoxanthon I (Aceton‐d6, 298K, TMS) ......................................................................................................................................... 39 Abb. 80 HMBC‐Spektrum Mischung Xanthon V1 (rot) und Gerontoxanthon I (grün) ............. 40 Abb. 81 HSQC‐Spektrum Mischung Xanthon V1 und Gerontoxanthon I ................................. 40 Abb. 82 Strukturformel von Xanthon V1a ................................................................................ 42 Abb. 83 UV‐Spektrum HL_V11_S1_H2 (Xanthon V1a) ............................................................. 42 Abb. 84 1H‐NMR‐Spektrum von Xanthon V1a (Aceton‐d6, 298K, TMS) ................................... 43 Abb. 85 HMBC‐Spektrum von Xanthon V1a ............................................................................. 43 Abb. 86 HSQC‐Spektrum von Xanthon V1a .............................................................................. 44 Abb. 87 Strukturformel von Gerontoxanthon I ........................................................................ 45 Abb. 88 UV‐Spektrum HL_V11_S1_H3 (Gerontoxanthon I) ..................................................... 45 Abb. 89 1H‐NMR‐Spektrum von Gerontoxanthon I (Aceton‐d6, 298K, TMS) ........................... 46 Abb. 90 13C‐NMR‐Spektrum von Gerontoxanthon I (Aceton‐d6, 298K, TMS) .......................... 46 Abb. 91 HMBC‐Spektrum von Gerontoxanthon I ..................................................................... 47 Abb. 92 HMBC‐Spektrum von Gerontoxanthon I (Seitenketten) ............................................ 47 Abb. 93 HSQC‐Spektrum von Gerontoxanthon I ...................................................................... 48 Abb. 94 1H, 1 H‐COSY‐Spektrum von Gerontoxanthon I ........................................................... 48 Abb. 95 Isolierschema Clusia valerioi ....................................................................................... 52 Abb. 96 Gaschromatogramm CV_V1 ....................................................................................... 53 Abb. 97 Peak 1: α‐Copaen, 99 % .............................................................................................. 53 Abb. 98 Peak 2: E‐Caryophyllen, 96 % ...................................................................................... 53 Abb. 99 Peak 3: α‐Humulen, 98 % ............................................................................................ 53 Abb. 100 Peak 4: β‐Selinen, 99 % ............................................................................................. 53 Abb. 101 Peak 5: α‐Selinen, 95 % ............................................................................................. 53 Abb. 102 1H‐NMR‐Spektrum CV_V4_C3/K (Chloroform‐d1, 298K, TMS) ................................. 54 Abb. 103 1H‐NMR‐Spektrum CV_V6_K2 (Pyridin‐d5, 298K, TMS) ............................................ 55 Abb. 104 1H‐NMR‐Spektrum CV_V6_K2_Acetylierung (Pyridin‐d5, 298K, TMS) ...................... 55 Abb. 105 Gaschromatogramm CV_V6_K2_Acetylierung ......................................................... 56 Abb. 106 1H‐NMR‐Spektrum CV_V8 (Chloroform‐d1, 298K, TMS) ........................................... 57 Abb. 107 1H‐NMR‐Spektrum CV_V8_Acetylierung (Chloroform‐d1, 298K, TMS) .................... 57 Abb. 108 Gaschromatogramm CV_V8_Acetylierung ............................................................... 58 Abb. 109 Cordillera de la Talamanca [Gar08] .......................................................................... 60 Abb. 110 Hypericum irazuense (oberirdische Organe, getrocknet) ......................................... 61 Abb. 111 Hypericum irazuense (Pulver) ................................................................................... 61 Abb. 112 Esquinas‐Regenwald [Gar08] .................................................................................... 65 Abb. 113 Clusia valerioi (Blätter, getrocknet) .......................................................................... 66 Abb. 114 Clusia valerioi (Pulver) .............................................................................................. 66 83 Anhang 6.3 Tabellenverzeichnis Tab. 1 13C‐NMR‐Daten von Betulinsäure in Pyridin‐d5 ............................................................. 31 Tab. 2 NMR‐Daten von 1,5‐Dihydroxyxanthon in DMSO‐d6 Lit. und Aceton‐d6 ...................... 34 Tab. 3 NMR‐Daten von Isocudraniaxanthon B in Aceton‐d6 .................................................... 37 Tab. 4 NMR‐Daten von Xanthon V1 in Aceton‐d6 .................................................................... 41 Tab. 5 NMR‐Daten von Xanthon V1a in Aceton‐d6 .................................................................. 44 Tab. 6 NMR‐Daten von Gerontoxanthon I in Aceton‐d6 .......................................................... 49 Tab. 7 Grobfraktionierung des Dichlormethanextraktes von Hypericum irazuense ............... 61 Tab. 8 Fraktionen des Dichlormethanextraktes von Hypericum irazuense ............................. 62 Tab. 9 präp. HPLC‐Methode HL_V5_S2 .................................................................................... 63 Tab. 10 Fraktionen von HL_V8_MeOH ..................................................................................... 63 Tab. 11 präp. HPLC Methode HL_V10_S1 ................................................................................ 64 Tab. 12 präp. HPLC Methode HL_V11_S1 ................................................................................ 65 Tab. 13 Grobfraktionierung des Dichlormethanextraktes von Clusia valerioi ......................... 66 Tab. 14 Fraktionen des Dichlormethanextraktes von Clusia valerioi....................................... 66 Tab. 15 Fraktionierung von CV_V4 ........................................................................................... 68 Tab. 16 Fraktionen von CV_V4 ................................................................................................. 68 Tab. 17 Fraktionierung von CV_V8 ........................................................................................... 69 Tab. 18 Fraktionen von CV_V8 ................................................................................................. 69 Tab. 19 semipräp. HPLC‐Methode CV_V9_S3 .......................................................................... 70 Tab. 20 Methode Standard_Lang 40 ........................................................................................ 72 Tab. 21 Methode Standard_Lang 45 ........................................................................................ 72 Tab. 22 Methode Standard_Lang 70 (CV_V8) .......................................................................... 72 Tab. 23 Methode Standard_Lang 60 ........................................................................................ 72 84