Vergleichende Darstellung der DNA

Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleichende Darstellung der DNA-Methyltransferase 1 und 3a
mittels Immunzytochemie in frühen bovinen Embryonalstadien (Tag 1 - 7) aus
In-vivo- und In-vitro-Produktion
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
-Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Sonja Drallmeyer
aus Lüdenscheid
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.- Prof. Dr. Christine Wrenzycki
(Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken,
Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule
Hannover)
Apl.- Prof. Dr. H. Niemann
(Institut für Nutztiergenetik, FLI, Mariensee)
1. Gutachterin:
Univ.- Prof. Dr. Christine Wrenzycki
2. Gutachterin:
Univ.- Prof. Dr. Sabine Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung:
10. November 2008
Die vorliegende Arbeit wurde durch die
gefördert.
H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung.................................................................................1
2
Schrifttum ................................................................................4
2.1
Verfahren zur Gewinnung früher Embryonalstadien ............................ 4
2.1.1
Gewinnung uteriner Embryonalstadien.................................................. 4
2.1.2
Gewinnung tubaler Embryonalstadien ................................................... 5
2.2
In-vitro-Produktion von Embryonen ....................................................... 8
2.3
Qualität von Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft............... 13
2.3.1
Genexpression in präimplantatorischen Rinderembryonen .............. 15
2.3.2
Abweichungen im mRNA-Expressionsmuster bei Rinderembryonen
unterschiedlicher Herkunft.................................................................... 17
2.4
Epigenetische Modifikationen in der frühen Embryonalentwicklung 18
2.4.1
DNA-Methylierung in der präimplantatorischen
Embryonalentwicklung .......................................................................... 19
2.4.2
Beeinflussung der Methylierung spezieller Gene während der
Embryonalentwicklung .......................................................................... 25
2.4.3
DNA-Methyltransferase-Familie (DNMTs)............................................. 28
2.4.3.1
DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) ....................................................... 29
2.4.3.2
DNA-Methyltransferasen 3a/3b/3L (DNMT3a/3b/3L) ............................ 34
2.4.3.2.1 DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a) ................................................... 35
2.4.3.2.2 DNA-Methyltransferase 3b (DNMT3b)................................................... 37
2.5
Immunzytochemie .................................................................................. 39
2.5.1
Grundlagen der Immunzytochemie ...................................................... 39
2.5.2
Grundlagen der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie ................. 43
2.6
Untersuchungen auf Proteinebene in präimplantatorischen
Embryonen.............................................................................................. 46
3
Material und Methoden ......................................................... 52
3.1
In-vitro-Produktion von Rinderembryonen (IVP) ................................. 52
3.1.1
Gewinnung und In-vitro-Maturation (IVM) von Kumulus-OozytenKomplexen (KOKs)................................................................................. 52
I
Inhaltsverzeichnis
3.1.2
In-vitro-Fertilisation boviner Embryonen (IVF) .................................... 53
3.1.3
In-vitro-Kultur boviner Embryonen (IVC).............................................. 54
3.2
Gewinnung von In-vivo-Embryonen ..................................................... 54
3.2.1
Verwendete Tiere und deren vorherige und anschließende Nutzung 54
3.2.2
Brunstsynchronisation und Superovulation der Tiere........................ 55
3.2.3
Medien zur Embryonengewinnung ....................................................... 56
3.2.4
Gewinnung früher Embryonalstadien (Tag 1 - 4 der Entwicklung) aus
dem Eileiter des Rindes ......................................................................... 57
3.2.4.1
Instrumente zur transvaginalen endoskopischen Eileiterspülung .... 57
3.2.4.2
Instrumente zur Uterusspülung ............................................................ 59
3.2.4.3
Durchführung der transvaginalen endoskopischen Eileiterspülung. 60
3.2.5
Gewinnung früher Embryonalstadien (Tag 4,5 - 8 der Entwicklung)
aus dem Uterus des Rindes .................................................................. 64
3.3
Morphologische Beurteilung boviner Embryonen .............................. 65
3.4
Immunzytochemische Darstellung der Proteine DNAMethyltransferase 1 (DNMT1) und DNA-Methyltransferase 3a
(DNMT3a) in präimplantatorischen Embryonen .................................. 66
3.4.1
Verwendete Antikörper .......................................................................... 66
3.4.1.1
Primäre Antikörper ................................................................................. 66
3.4.1.2
Sekundäre Antikörper ............................................................................ 67
3.4.1.2.1 Fluorochrom-gekoppelte Antikörper .................................................... 67
3.4.1.2.2 Peroxidase-gekoppelter Antikörper...................................................... 68
3.4.2
Durchführung der Immunzytochemie................................................... 69
3.4.2.1
Vorbehandlung der Embryonen (Pretreatment) .................................. 69
3.4.2.1.1 Fixation.................................................................................................... 70
3.4.2.1.2 Permeabilisation..................................................................................... 70
3.4.2.1.3 Entfernen der Zona pellucida ................................................................ 70
3.4.2.2
Inkubation in den spezifischen anti-DNMT1 bzw. anti-DNMT3a
Antikörpern ............................................................................................. 71
3.4.2.3
Markierung der Ag-Ak-Komplexe mit dem sekundären Antikörper ... 71
3.4.2.4
Zellkernfärbung ...................................................................................... 71
II
Inhaltsverzeichnis
3.4.2.5
Einbettung der Embryonen ................................................................... 72
3.4.2.6
Übersicht der Immunzytochemie .......................................................... 73
3.5
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie .............................................. 74
3.5.1
Konfigurationen...................................................................................... 74
3.5.1.1
Mikroskopeinstellungen ........................................................................ 74
3.5.1.2
Eingesetzte Laser und Laser-Intensität................................................ 74
3.5.1.3
Verwendete Filter ................................................................................... 75
3.5.1.4
Pinhole und Detektor-Sensitivität ......................................................... 75
3.5.2
Erstellung von Bildern und Bilderreihen.............................................. 76
3.6
Auswertung der Bilder mit ImageJ ....................................................... 76
3.7
Statistische Auswertung........................................................................ 77
3.8
Allgemeiner Versuchsaufbau ................................................................ 78
3.8.1
Versuchsanordnung............................................................................... 78
3.8.1.1
Gewinnung der Embryonen................................................................... 78
3.8.1.2
Etablierung der Immunzytochemie ....................................................... 78
4
Ergebnisse............................................................................. 85
4.1
Gewinnung boviner präimplantatorischer In-vivo-Embryonen .......... 85
4.1.1
Gewinnung von Zygoten - 16-Zell-Embryonen mittels transvaginaler
Endoskopie ............................................................................................. 85
4.1.2
Gewinnung von Morulae und Blastozysten mittels Uterusspülung .. 87
4.2
Erstellung boviner In-vitro-Embryonen ................................................ 89
4.3
Immunzytochemische Darstellung des Proteingehalts an DNAMethyltransferase 1 und 3a in frühen (Tag 1-7) bovinen
Embryonalstadien aus In-vivo- und In-vitro-Produktion..................... 90
4.3.1
DNMT1 ..................................................................................................... 91
4.3.2
DNMT3a ................................................................................................... 95
4.4
Lokalisation der Proteine DNMT1 und DNMT3a im Verlauf der
präimplantatorischen Embryonalentwicklung bei in vivo und in vitro
generierten Embryonen ......................................................................... 99
4.4.1
Lokalisation der DNMT1......................................................................... 99
III
Inhaltsverzeichnis
4.4.2
Lokalisation der DNMT3a..................................................................... 103
5
Diskussion ........................................................................... 107
5.1
Transvaginale Endoskopie .................................................................. 108
5.2
Immunzytochemie ................................................................................ 110
5.2.1
DNMT1 ................................................................................................... 111
5.2.2
DNMT3a ................................................................................................. 117
5.3
Zusammenhang zwischen mRNA-Expression und Proteingehalt in
präimplantatorischen Embryonen ...................................................... 119
5.4
Schlussfolgerungen............................................................................. 122
6
Zusammenfassung.............................................................. 124
7
Summary.............................................................................. 128
8
Anhang: Medienrezepte und Einzeldaten.......................... 131
8.1
Zusammensetzung der Medien ........................................................... 131
8.2
Einzeldaten ........................................................................................... 139
9
Verzeichnisse ...................................................................... 142
9.1
Literaturverzeichnis ............................................................................. 142
9.2
Abkürzungsverzeichnis ....................................................................... 171
9.3
Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen ....................................... 176
IV
Einleitung
1 Einleitung
Die In-vitro-Produktion (IVP) boviner Embryonen bietet sowohl für die biologische
Grundlagenforschung, als auch in Kombination mit anderen Biotechnologien, wie
zum Beispiel der transvaginalen Follikelpunktion („Ovum pick up“ = OPU) oder dem
Klonen durch somatischen Kerntransfer („somatic cell nuclear transfer“ = SCNT),
vielfältige Möglichkeiten.
Obwohl es in den vergangenen Jahren viele Verbesserungen der Kulturmedien
gegeben hat, zeigen die in vitro produzierten Stadien weiterhin Abweichungen
gegenüber den in vivo erzeugten Embryonen (LONERGAN et al. 2003a, 2006;
RIZOS et al. 2003; CORCORAN et al. 2005). Diese Veränderungen bestehen sowohl
auf morphologischer Ebene (GREVE et al. 1995), ersichtlich an Unterschieden in
Farbe, Kompaktierung und Gesamtzellzahl, als auch auf biochemischer Ebene. So
besitzen in vitro produzierte Embryonen eine verminderte Kryotoleranz (POLLARD u.
LEIBO
1994),
eine
erhöhte
Temperatursensitivität
und
einen
veränderten
Metabolismus (KHURANA u. NIEMANN 2000b). Neben diesen Unterschieden gibt es
aber auch Abweichungen auf molekularer Ebene. So konnten mehrfach signifikante
Unterschiede im mRNA-Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene nachgewiesen werden (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; LONERGAN et al. 2001;
NIEMANN et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2005b). Davon betroffen sind unter
anderem die Gene für die DNA-Methyltransferase1 (DNMT1) und die DNAMethyltransferase3a (DNMT3a; HÖFFMANN et al. 2006), die im Rahmen der
epigenetischen Reprogrammierung eine wichtige Rolle in der präimplantatorischen
Embryonalentwicklung spielen. Die DNMT1 ist überwiegend für den Erhalt der
Methylierung bei der Zellteilung verantwortlich, während die DNMT3a eher der Denovo-Methylierung dient. Gemeinsam sind sie unter anderem an der Regulation
geprägter (imprinted) und nicht geprägter (non-imprinted) Gene, der X-ChromosomInaktivierung und der Aufrechterhaltung der Telomerlänge beteiligt.
Die DNA-Methyltransferasen (DNMTs) übertragen eine Methylgruppe von der
Aminosäure S-Adenosyl-L-Methionin auf die 5´-Position in CG-Dinukleotiden der
DNA, wodurch in den meisten Fällen die Genexpression gehemmt wird (BIRD u.
1
Einleitung
WOLFFE 1999; AVNER u. HEARD 2001). Da das korrekte Genexpressionsmuster
für eine ungestörte Embryonalentwicklung essentiell ist, kommt der richtigen DNAMethylierung
eine
besondere
Bedeutung
zu.
Aberrationen
vom
regulären
Expressionsmuster können zu einer gestörten Embryonalentwicklung führen und
werden unter anderem mit der Entstehung des „Large Offspring Syndrome“ (LOS) in
Zusammenhang gebracht (LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2004; FARIN et
al. 2006) .
Bisherige Untersuchungen über die Unterschiede zwischen in vivo und in vitro
produzierten bovinen Embryonen wurden überwiegend an Morulae und Blastozysten
durchgeführt, da die Gewinnung von frühen tubalen Embryonalstadien beim Rind
sehr aufwendig war. Entweder wurden sie aus den exenterierten Eileitern
geschlachteter Kühe gespült (HAFEZ u. SUGIE 1963) oder operativ über einen
lateralen oder ventralen Zugang gewonnen (ROWSON et al. 1969; WOLFE et al.
1990; LAURINCIK et al. 1993; VAN SOOM et al. 1997). Erst mit der Etablierung der
minimal-invasiven transvaginalen Endoskopie (BESENFELDER u. BREM 1998;
HAVLICEK et al. 1999) wurde eine Methode entwickelt, die eine wiederholte
Gewinnung tubaler Embryonalstadien ohne nachteilige Effekte für das Spendertier
ermöglicht (HAVLICEK et al. 1999). Seit Einführung dieser Methode werden
vermehrt auch frühe tubale Embryonalstadien aus In-vivo-Produktion mit den
entsprechenden IVP-Embryonen verglichen. Dabei standen bisher überwiegend
Untersuchungen der Genexpression im Vordergrund (TESFAYE et al. 2004;
HÖFFMANN et al. 2006), während vergleichende Darstellungen auf Proteinebene
beim Rind kaum vorhanden sind.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern sich die Unterschiede
der mRNA-Expression bei präimplantatorischen Rinderembryonen verschiedener
Herkunft auch auf der Proteinebene wiederspiegeln. Dazu wurde das Auftreten der
DNMT1 und der DNMT3a in frühen Embryonalstadien (Zygote – Blastozyste)
untersucht, wobei der Schwerpunkt auf einem Vergleich in vivo und in vitro
produzierter Embryonen lag. Die In-vivo-Stadien wurden bis zum 16-Zeller mittels
transvaginaler endoskopischer Eileiterspülung generiert, wohingegen die späteren
Stadien (Morulae und Blastozysten) durch alleinige uterine Spülung gewonnen
2
Einleitung
wurden. Parallel dazu erfolgte die routinemäßige Produktion von IVP-Embryonen.
Nach der immunzytochemischen Markierung der Proteine erfolgte die Darstellung
über die Immunfluoreszenz am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Dabei wurden
zum einen Untersuchungen zum Proteingehalt als auch zur Proteinlokalisation der
DNMT1 und DNMT3a in den frühen Embryonalstadien aus In-vivo- und In-vitroProduktion durchgeführt.
3
Schrifttum
2 Schrifttum
2.1
Verfahren zur Gewinnung früher Embryonalstadien
2.1.1 Gewinnung uteriner Embryonalstadien
Für die Gewinnung präimplantatorischer Embryonalstadien beim Rind stehen
verschiedene Verfahren zur Verfügung. Seit Mitte der 1970er Jahre besteht die
Möglichkeit, uterine Embryonalstadien unblutig am stehenden Tier zu gewinnen
(BAKER u. JILLELLA 1978; BOUTERS et al. 1978; HAHN 1978). Dazu wird ein
flexibler Ballonkatheter mittels eines Mandrins versteift und unter manueller rektaler
Kontrolle durch die Scheide, den Gebärmutterhals und -körper in eines der
Gebärmutterhörner eingeführt. Bei Erreichen der großen Kurvatur wird der Mandrin 8
bis 10 cm zurückgezogen und die flexible Katheterspitze vorsichtig weiter nach
cranial bis in das vordere Horndrittel vorgeschoben. Dort wird der Katheter durch das
Aufblasen des Ballons fixiert und das Horn zum Uterus hin abgedichtet (HAY et al.
1990). Anschließend kann die Hornspitze ohne Flüssigkeitsverlust fraktioniert gespült
werden, wobei als Medium meistens körperwarme phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS) mit 1-2% hitzeinaktiviertem Serum eingesetzt wird. Die zurückgewonnene
Spülflüssigkeit wird in Glasgefäßen aufgefangen. Für die Spülung des zweiten
Uterushorns muss der Katheter in das entsprechende Horn umgelegt werden. HAY
et al. (1990) beschrieben die Möglichkeit, den Ballon direkt nach der Passage der
Zervix im Corpus uteri zu fixieren und auf diese Weise beide Hörner gleichzeitig zu
spülen. Dabei besteht jedoch die Gefahr, dass der aufgeblasene Ballon je nach
Größe des Uteruskörpers eines der Hörner verschließt, wodurch die komplette
Spülung des Uterus verhindert wird.
Im Durchschnitt können fünf bis acht transfertaugliche Embryonen je Spendertier
gewonnen werden. Das entspricht einer Gewinnungsrate (Anzahl gewonnener
Embryonen pro Anzahl an Gelbkörpern) von ca. 60-80% (KELLY et al. 1997; KIM et
al. 2001). Die Menge der Embryonen wird durch das Alter (CAMP 1989), den
Ernährungsstatus, die Rasse und die reproduktive Vergangenheit des Donors, sowie
die
Auswirkungen
wiederholter
Superovulationsbehandlungen
(MAPLETOFT et al. 2002).
4
beeinflusst
Schrifttum
2.1.2 Gewinnung tubaler Embryonalstadien
Da die Embryonen erst am Tag 4,5 bis 5 in den Uterus gelangen (WOLFE et
al.1990), ist es nicht möglich, frühere Stadien durch die oben beschriebene unblutige
Spülung der Gebärmutterhörner zu gewinnen.
HAFEZ und SUGIE (1963) beschrieben die Gewinnung früher Stadien mittels
Schlachtung der Donortiere. Dazu wurde bei superovulierten und besamten Färsen 3
bis 5 Tage nach rektal diagnostizierter Ovulation die Gebärmutter inklusive der
Eileiter bei der Schlachtung entnommen und mit warmem autologen Blutserum und
einer Kochsalzlösung gespült.
Für die Gewinnung früher Stadien beim lebenden Spendertier entwickelten
ROWSON et al. (1969) einen ventromedianen Zugang zum Eileiter. Hierfür wurden
die Tiere unter Allgemeinanästhesie in Rückenlage verbracht und der Uterus mitsamt
den Ovarien und Eileitern durch eine 15 cm lange Schnittinzision in der Linea alba
vorverlagert. Die Uterushörner wurden mittels Klemmen nahe des Uteruskörpers
verschlossen. Im Anschluß erfolgte über eine sterile Nadel die Spülung der Eileiter in
Richtung Uterus. Eine zusätzliche Spülung erfolgte durch die Injektion von Medium
an der Basis der Uterushörner nahe der Klemmen. Über ein Glasröhrchen, dass in
die
Gebärmutterhornspitze
inseriert
wurde,
konnte
die
Spülflüssigkeit
zurückgewonnen werden. Alternativ erfolgte eine kombinierte Uterus-Eileiterspülung
aus Richtung Uterushornbasis, wobei das Medium durch einen über das Infindibulum
in den Eileiter eingefädelten Plastikschlauch abfloss. NEWCOMB und ROWSON
(1975) beschrieben eine leichte Modifizierung dieser Technik. Dazu wurde ein
Ballonkatheter durch die Uteruswand auf die utero-tubale Verbindung zu geschoben
und im Lumen des Uterus aufgepumpt. Dadurch konnte das Horn zum Corpus uteri
hin abgedichtet werden. Anschließend wurde ein Nylonschlauch über den
Fimbrientrichter in den Eileiter eingeführt und von einer zweiten Person mit Daumen
und Zeigefinger fixiert. Das Spülmedium wurde nahe der Uterushornspitze in
Richtung uterotubaler Verbindung in die Gebärmutter injiziert, um die dort
vorhandenen
Embryonen
zu
mobilisieren,
wobei
der
Abfluss
durch
den
Ballonkatheter erfolgte. Für die anschließende Eileiterspülung wurde das Uterushorn
an seiner Spitze direkt kaudal der Punktionsstelle mit den Fingern abgedichtet, so
5
Schrifttum
dass das injizierte Medium bei steigendem Druck in der Hornspitze durch den
Salpinx abfloss. Gelegentlich musste dazu der Widerstand an der uterotubalen
Verbindung durch wiederholte manuelle Kompression der geblähten Hornspitze
überwunden werden. Das Medium wurde über den Ballonkatheter bzw. über die
Nylonkanüle im Eileiter zurückgewonnen und in Glasgefäßen aufgefangen
(BRACKETT et al. 1980). Nach erfolgter Spülung musste die Wunde für den
Ballonkatheter in der Uteruswand wieder verschlossen werden. Diese Technik führte
im Vergleich zu der zuvor beschriebenen Methode seltener zu Uterusrupturen
(ELLINGTON 1990a). Als Nachteil des ventralen Zuganges wurden Adhäsionen der
Ovarien, des Ovidukts und der Gebärmutterhörner beschrieben, die die Anzahl der
möglichen Spülungen und die weitere reproduktive Nutzung der Spendertiere stark
limitierten (DROST 1974; DROST et al. 1976).
WOLFE et al. (1990) beschrieben einen Zugang über die caudale Flanke. Dazu
wurden die Kühe vor der Allgemeinanästhesie in rechte Seitenlage verbracht und
anschließend die oben liegende linke Gliedmaße nach caudal ausgebunden.
Anschließend erfolgte eine 20 cm lange Schnittinzision 5 cm cranial und parallel zu
dem Musculus quadriceps femoris. Durch diesen Schnitt konnte die linke Hornspitze
mit Eileiter und Arterie durch Zug am Ligamentum uteri vorverlagert werden. Die
Spülung entsprach der bei ROWSON et al. (1969), jedoch ohne das Uterushorn
abzuklemmen. Für die Spülung der rechten Seite musste das Tier auf die andere
Seite umgelagert werden. LAURINCIK et al. (1993) und VAN SOOM et al. (1997)
beschrieben ebenfalls die Gewinnung tubaler Embryonalstadien über einen Zugang
in der Flanke. Sie exzisierten jedoch den Eileiter inclusive Uterushorn am lebenden
Tier und führten die Spülung anschließend im Labor durch.
Den ersten transvaginalen Zugang zum Eileiter entwickelten ROMMEL et al. (1980).
Sie durchstießen die Vagina dorsal der Portio vaginalis uteri mit einem Perforator
und erweiterten die Öffnung anschließend stumpf mit der Hand. Dann wurden beide
Uterushörner zusammen mit den Eileitern und Ovarien nahe des Corpus uteri mittels
eines Ovariotoms abgesetzt und im Labor gespült.
Auch BESENFELDER und BREM (1998) beschrieben einen transvaginalen Zugang
zum Eileiter. Über die transvaginale Endoskopie beim Rind zur Gewinnung früher
6
Schrifttum
Embryonalstadien wurde erstmals 1999 berichtet (HAVLICEK et al. 1999). Seitdem
wurde diese Methode in verschiedenen Versuchen eingesetzt (BESENFELDER et al.
2001; MÖSSLACHER et al. 2001, 2003; HAVLICEK 2002; HÖFFMANN et al. 2006).
Bei diesem Verfahren wird unter Epiduralanästhesie zunächst ein Uterusspülkatheter
in das linke Horn gelegt und anschließend das Vaginaldach mittels eines
transvaginal
eingeführten
Trokars
durchstoßen.
Über
den
eingeführten
Universalschaft wird dann das Endoskop in die Bauchhöhle bis zu den Eileitern
vorgeschoben. Danach kann eine Spülkanüle in den linken Eileiter eingeführt und der
Inhalt des Eileiters mit wenigen Millilitern Spülflüssigkeit in das linke Uterushorn
gespült werden. Die Gewinnung der Embryonen erfolgt anschließend durch eine
Spülung der Hornspitze über den Uterusspülkatheter. Nach Umlegen des Katheters
kann der Vorgang für die andere Seite wiederholt werden. Der Vorteil dieser minimal
invasiven Methode liegt in der geringen Manipulation der Geschlechtsorgane und der
geringen Belastung des Spendertieres (HAVLICEK 2002).
Die Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Spülergebnisse der verschiedenen
Methoden zur Gewinnung früher Embryonalstadien aus dem Eileiter lebender Rinder.
Tabelle 1: Ergebnisse der Eileiterspülungen an lebenden Tieren
Autoren
Wiederfindungsrate (%) Intakte Embryonen (%)
BRACKETT et al. 1980
71
-
ELLINGTON et al. 1990a
83(Kühe)/110(Färsen)
89(Kühe)/98 (Färsen)
ELLINGTON et al. 1990b
74
89
WOLFE et al. 1990
80
69
LAURINCIK et al. 1993
75
71
HAVLICEK et al. 1999
31 Embryonen aus 4 Tieren
100
Unilaterale Spülung, keine SO
72
92
Unilaterale Spülung, SO (FSH)
100
97,5
Bilaterale Spülung, SO (FSH)
105
96,5
MÖSSLACHER et al. 2001
89
85
HÖFFMANN et al. 2006
58
78
BESENFELDER et al. 2001
SO=Superovulationsbehandlung
7
Schrifttum
2.2
In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen ist die Reifung und Befruchtung von
Oozyten und die anschließende Kultivierung der entstandenen Embryonen
außerhalb des mütterlichen Organismus. Über die erste In-vitro-Fertilisation (IVF)
beim Kaninchen und bei der Maus wurde durch CHANG (1968) sowie durch
WHITTINGHAM (1968) berichtet. Die erste In-vitro-Fertilisation einer in vitro gereiften
Rindereizelle beschrieben IRITANI und NIWA (1977) und die Geburt des ersten IVFKalbes wurde von BRACKETT (1982) veröffentlicht. Die Hauptanwendung der IVP
liegt heute beim Rind und beim Menschen, jedoch wird diese Methode auch bei
vielen anderen Säugetieren eingesetzt. Dabei bildet die IVP einerseits die Grundlage
weiterer Biotechnologien, wie z.B. der transvaginalen Follikelpunktion („Ovum pick
up“ = OPU) und dem somatischen Kerntransfer, wird andererseits aber auch schon
vielfach in der Praxis angewendet (FABER et al. 2003). So verzeichnete die IETS
(International Embryo Transfer Society) für das Jahr 2006 eine weltweite Produktion
von mehr als 440.000 transfertauglichen, kommerziell in vitro erstellten Embryonen,
sowie einen neuen Rekord bei dem Transfer von knapp 292.000 IVP-Embryonen
(THIBIER 2006).
Die In-vitro-Produktion von Rinderembryonen setzt sich aus den drei Teilschritten der
Oozytenreifung („in vitro maturation“), der Befruchtung („in vitro fertilisation“) und der
In-vitro-Kultur („in vitro culture“) der befruchteten Eizelle zusammen (BAVISTER
2005; SIRARD u. COENEN 2006). Die Abbildung 1 gibt einen schematischen
Überblick über die Schritte der In-vitro-Produktion von Rinderembryonen (mod. nach
NIEMANN u. MEINECKE 1993b).
8
Schrifttum
Unbefruchtete
Eizellen
Spermien
In-vitro-Reifung
18-27 Stunden
In-vitro-Kapazitation
In-vitro-Befruchtung
6-24 Stunden
In-vitro-Kultivierung
6-8 Tage
Morulae/Blastozysten
Abbildung 1:
Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion [mod. nach
NIEMANN u. MEINECKE 1993b]]
Die Gewinnung der bovinen Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) erfolgt in der Regel
aus den Ovarfollikeln von Schlachttieren, wobei verschiedene Methoden verwendet
werden können: so erfolgt die Isolierung der Eizellen z.B. durch Aspiration der
Follikel mittels Kanüle und Spritze oder durch die Schneidemethode mit einem
Vielklingenmesser (slicing; ECKERT u. NIEMANN 1995), wobei die Ovaroberfläche
mehrfach längs und quer einige Millimeter tief eingeschnitten wird. Des weiteren
können Oozyten von lebenden Tieren durch OPU gewonnen werden, wobei mit Hilfe
einer in eine Ultraschallsonde integrierten Aspirationsnadel die Follikel durch die
Vaginalwand hindurch punktiert werden (CALLESEN et al. 1987). Anschließend
erfolgt anhand der Morphologie eine Selektion der isolierten KOKs. Für die In-vitroProduktion werden nur solche Komplexe verwendet, die ein homogenes Ooplasma
besitzen
und
mindestens
3-6
Lagen
Kumuluszellen
aufweisen,
da
die
Wahrscheinlichkeit der erfolgreichen In-vitro-Entwicklung bis zur Blastozyste mit der
zunehmenden Zahl der Kumuluszellschichten ansteigt (KHURANA u. NIEMANN
2000a; KELLY et al. 2007).
9
Schrifttum
Nach der Selektion werden die KOKs gewaschen und für 18-27 Stunden in ein
Reifungsmedium verbracht (NAGAI 2001; LANE u. GARDNER 2004; SIRARD u.
COENEN 2006). Die Reifung der Oozyten (Maturation) ist die Vorraussetzung für
eine erfolgreiche Fertilisation und gliedert sich in die Kernreifung (nukleäre
Maturation) und die Reifungsvorgänge im Ooplasma (Zytoplasmatische Reifung). Im
Reifungsmedium wird die Meiose fortgesetzt, in der die Oozyten zuvor arretiert
waren (SIRARD u. COENEN 2006). Die In-vitro-Maturation wird in komplexen
Medien durchgeführt, die Puffer, Aminosäuren, organische Verbindungen, Serum,
Hormone und Wachstumsfaktoren sowie Antibiotika enthalten (SAGIRKAYA et al.
2007). Je nach der Morphologie der KOKs und der Kulturbedingungen können
Maturationsraten (Kernreifung) von 85-95% erreicht werden (ADONA et al. 2008).
Nach
der
Reifung
werden
die
Eizellen
für
6-24
Stunden
in
einem
Fertilisierungsmedium mit motilen Spermien koinkubiert. Da nur vitale Spermien zur
Befruchtung befähigt sind, wird zunächst die bewegliche Fraktion der aufgetauten
Spermien isoliert. Dazu wird meistens eine Dichtegradientenzentrifugation in
Silikaten durchgeführt, wobei sich die vitalen Spermien in der dichteren Fraktion
anreichern (PARRISH et al. 1995). Lange Zeit wurde dazu Isopercoll verwendet, das
jedoch inzwischen aufgrund fehlender klinischer Prüfung keine Zulassung mehr für
die In-vitro-Produktion von Embryonen in der Human- und Veterinärmedizin besitzt.
Alternativen stellen andere kommerzielle Silikat-Medien dar (z.B. PureSperm,
Nidacon; BoviPure, Nidacon; Spermfilter, CryoBioSystem; etc). Früher wurde
auch häufig die Swim-up-Technik eingesetzt. Bei dieser Methode schwimmen die
vitalen Spermien in einem speziellen Medium nach oben und können dort
abgenommen werden (PARRISH et al. 1995). Insgesamt können bei der In-vitroFertilisation Befruchtungsraten von 80-90% erzielt werden (WRENZYCKI 2007).
Nach der Befruchtung kommen die vermeintlichen Zygoten in ein Kulturmedium
(LANE u. GARDNER 2004), in dem sie bis zum gewünschten Entwicklungsstadium
verbleiben. Beim Rind erreichen etwa 25-40% der Embryonen zwischen dem 6-8
Tag post inseminationem das kompaktierte Morula- bzw. Blastozystenstadium
(KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; KRISHER et al. 1999; RIZOS et al. 2002b).
Diese Embryonen können anschließend unblutig auf Empfängertiere übertragen
10
Schrifttum
werden, wobei in der Regel Trächtigkeitsraten von 50% erzielt werden (HASLER et
al. 1995).
Seit Etablierung der In-vitro-Produktion wurden verschiedene Kulturmedien für
Embryonen entwickelt. Zu Beginn wurden am häufigsten komplexe Medien wie das
Tissue Culture Medium-199 (TCM-199; EYESTONE u. FIRST 1989) mit einer KoKultur von Zellen verwendet. Diesem Medium wurden zusätzlich undefinierte
Komponenten wie Serum oder Serumersatzstoffe (Bovines Serumalbumin (BSA),
semi-definiert; Polyvinylalkohol (PVA), definiert) zugesetzt (BAVISTER 1995). Mit
diesem Medium konnten erfolgreich Embryonen produziert werden, die nach einem
Transfer auf Empfängertiere auch zu Trächtigkeiten führten. Trotzdem wurden
weitere Kultursysteme entwickelt, um höhere Entwicklungsraten und bessere
Embryonenqualitäten zu erzielen (FARIN et al. 2001). Viele davon sind einfache
Medien, die auf Modifikationen des SOF-Mediums (Synthetic Oviductal Fluid)
beruhen (TERVIT et al. 1972; KESKINTEPE et al. 1995). Dazu wurde unter anderem
das BSA im SOF durch andere Makromoleküle wie PVP (Polyvinylpyrrolidon) oder
PVA ersetzt, um ein definiertes Medium zu erhalten (KESKINTEPE u. BRACKETT
1996). Ein weiteres einfaches Medium stellt das Hamster Embryo Culure Medium
(HECM; KRISHER et al. 1999) dar. Werden diese aufgeführten Medien (TCM-199,
SOF, HECM) in den Kultursystemen eingesetzt, können Blastozystenraten von über
40% erzielt werden (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; KRISHER et al. 1999).
Dabei liegen die Entwicklungsraten in definierten Medien in der Regel unter denen in
semi-definierten (BSA) oder undefinierten (Serum) Medien (ECKERT u. NIEMANN
1995; KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; WRENZYCKI et al. 1999, 2001).
Auf der Suche nach den optimalen Kulturbedingungen in vitro produzierter
Embryonen wurden auch verschiedene Verfahren zur In-vivo-Kultur im Eileiter
entwickelt. Dabei wurden die Embryonen sowohl auf Tiere der gleichen Spezies
(homolog) als auch auf Empfänger einer anderen Spezies (heterolog) übertragen.
Die Bedingungen des Eileiters sind optimal auf die Embryonalentwicklung
abgestimmt
und
können
das
Wachstum
der
Embryonen
bis
zum
Blastozystenstadium unterstützen. Dies gilt auch speziesübergreifend. So wurden
häufig ligierte Kanincheneileiter verwendet, um die Embryonen von Schafen
11
Schrifttum
(AVERILL et al. 1955; LAWSON et al. 1972), Rindern (BOLAND 1984; ECTORS et
al. 1993), Schweinen und Pferden (ALLEN et al. 1976) zu kultivieren. Für
Rinderembryonen wurden ausserdem Eileiter von der Maus verwendet (SHARIF et
al. 1991; KIM et al. 2000). Es konnte gezeigt werden, dass ligierte Schafeileiter einen
positiven Effekt auf das Wachstum von Rinder- und Schweineembryonen haben
(EYESTONE et al. 1987; PRATHER et al. 1991; GALLI u. LAZZARI 1996; ENRIGHT
et al. 2000). Auch LONERGAN et al. (2001) beschrieben den positiven Einfluss der
heterologen Kultur in ligierten Schafeileitern auf die Qualität von Rinderembryonen.
Dabei zeigte sich, dass von den in vivo kultivierten Embryonen signifikant mehr
Embryonen die Vitrifikation überlebten und anschließend schlüpften als in der SOFKultur Gruppe. JIMENEZ et al. (2001) beschrieben eine identische Blastozystenrate
bei Embryonen aus dem ligierten Schafeileiter zu Embryonen aus der In-vitro-Kultur.
Jedoch verringerte sich diese Rate, wenn der Eileiter nicht ligiert wurde und die
Embryonen in den Uterus wandern konnten (JIMENEZ et al. 2001).
SCHMIDT et al. (1997) führten einen Transfer von in vitro produzierten
Rinderembryonen in den Eileiter von Färsen durch. Dazu wurde über eine
Schnittinzision in der Mittellinie ein 80 cm langer elastischer Katheter im Eileiter
verankert. Das Ende des Katheters wurde anschließend dorsolateral der Cervix
durch die Vaginalwand geführt und gelangte über die Vagina und Vulva nach außen,
wo es am Schwanz fixiert wurde. Bei dieser Methode konnten von 383 übertragenen
Embryonen 31 Embryonen zurückgewonnen werden (8,1%), von denen lediglich 2
bis zum Blastozystenstadium entwickelt waren (6,4%).
Einen laparoskopischen Zugang zu den Eileitern für die Kultur in vitro produzierter
Embryonen beschrieben FAYRER-HOSKEN et al. (1989). Dazu wurde in der rechten
Paralumbargrube
unter
Lokalanästhesie
ein
Bronchoskop
vorgeschoben.
Anschließend wurde der Fimbrientrichter und das Mesovarium mit atraumatischen
Semm´s Klemmen festgehalten. Danach konnte der Katheter zwischen die
Fimbrienblätter geschoben und 2,5-5 cm tief in das Eileiterlumen inseriert werden.
Auf diese Weise konnte eine Trächtigkeit erzielt werden (Ultraschall-Untersuchung
am 30. Tag), die jedoch bei der rektalen Untersuchung am 60. Tag nicht mehr
bestand.
12
Schrifttum
HAVLICEK et al. (2005a, 2005b) und WETSCHER et al. (2005) beschrieben eine
Methode zur transvaginal-endoskopischen Übertragung von präimplantatorischen
Embryonen in den homologen Eileiter von Rindern. Dazu wurden in vitro produzierte
Embryonen verschiedener Stadien mittels transvaginaler Endoskopie mit einer
gebogenen Glaskapillare 3-5 cm tief in den Eileiter eingeführt. Die Färsen wurden
synchronisiert und der Eileiter nicht ligiert, um die physiologischen Abläufe des
Eileitertransportes zu ermöglichen. Anschließend wurden die Embryonen mittels
transvaginaler Endoskopie nach BESENFELDER und BREM (1998) in Kombination
mit einer Uterusspülung zurückgewonnen. Dabei konnte bei allen Tieren mindestens
ein transferierter Embryo zurückgespült werden. Insgesamt wurden von 461
übertragenen
Embryonen
208
(45%)
zurückgewonnen.
Dabei
betrug
die
Blastozystenrate 25%. Auffällig war, dass die höchste Blastozystenrate bei dem
Transfer
von
16-Zell-Embryonen
gegenüber
dem
Transfer
früherer
Entwicklungsstadien (Zygoten - 8-Zell-Embryonen) beobachtet werden konnte
(HAVLICEK et al. 2005b).
2.3
Qualität von Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft
Die Entwicklung boviner IVP-Embryonen wird stark durch die Bedingungen während
der Oozytenreifung, Fertilisation und Embryonenkultur beeinflusst. Es konnte gezeigt
werden, dass die Oozytenqualität der Hauptfaktor für die Entwicklung der ungereiften
Eizelle zur Blastozyste darstellt (RIZOS et al. 2002b). Dagegen wird die Qualität der
resultierenden Embryonen, gemessen an der Kryotoleranz und der relativen Menge
spezifischer Gentranskripte, hauptsächlich durch die Kulturbedingungen nach der
Fertilisation bestimmt (RIZOS et al. 2002b, 2003). Obwohl die Medien zur In-vitroKultur immer weiter verbessert wurden, zeigen in vitro produzierte Embryonen nach
wie vor Abweichungen im Vergleich zu in vivo gewonnenen Embryonen. Das zeigt
sich sowohl auf morphologischer und biochemischer, aber auch auf molekularer
Ebene (Tab. 2).
13
Schrifttum
Tabelle 2: Abweichungen zwischen in vivo und in vitro produzierten
Embryonen [mod. nach WRENZYCKI 2007]]
In-vivo-Embryonen
In-vitro-Embryonen
Morphologie
•
Farbe
hell
hell - dunkel
•
Perivitelliner Raum
groß
klein
•
Kompaktierung
deutlich ausgeprägt
schwächer ausgeprägt
•
Gesamtzellzahl
140-160
erhöht, ähnlich, erniedrigt
ICM-Zellen
40
weniger
Gefriertauglichkeit
gut
vermindert
Temperatursensitivität
gering
erhöht
(exp. Blastozyste)
Trächtigkeitsraten
erhöhte fetale Verluste im
letzten Trächtigkeitsdrittel
Metabolismus
•
ATP-, O2-, Glukose-
gesteigerte Glykolyse und
u. Pyruvataufnahme
Laktatproduktion
Chromosomale Aberrationen
31%
42%
ungestört
erhöht, ähnlich, erniedrigt
(d5-Embryo)
Expressionsmuster
entwicklungsrel. Gene
In vitro produzierte Embryonalstadien zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber der
Kryokonservierung (POLLARD u. LEIBO 1994) und besitzen ein dunkleres, zu in vivo
produzierten Embryonen proportional erhöhtes Zytoplasmavolumen, sowie einen
erhöhten Lipidgehalt (CROSIER et al. 2000). Zudem können bei einem Vergleich mit
präimplantatorischen In-vivo-Embryonen Unterschiede im Energiemetabolismus
nachgewiesen werden (KHURANA u. NIEMANN 2000b). VIUFF et al. (1999)
berichteten über ein erhöhtes Auftreten von chromosomalen Aberrationen. Darüber
hinaus gibt es Abweichungen im mRNA-Expressionsmuster entwicklungsrelevanter
14
Schrifttum
Gene (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; RIZOS et al. 2002a, 2003; WRENZYCKI et
al. 2005b).
LONERGAN et al. (2001) beschrieben den positiven Einfluß der In-vivo-Kultur im
ligierten Schafeileiter auf die Blastozystenqualität von Embryonen aus In-vitroReifung und In-vitro-Fertilisation. Sie konnten zeigen, dass die Embryonen aus dem
Schafeileiter eine signifikant höhere Kryotoleranz, gemessen an der Überlebens- und
Schlupfrate nach dem Auftauen, als die Embryonen aus der In-vitro-Kultur besaßen.
Diese Beobachtung wird gestützt durch Untersuchungen von HAVLICEK et al.
(2005a). Sie konnten zeigen, dass die Kryotoleranz von bovinen Embryonen aus
temporärer In-vivo-Kultur im nicht ligierten homologen Eileiter zwischen der der
Embryonen aus reiner In-vitro-Kultur und der von In-vivo-Embryonen nach
Superovulation liegt. LONERGAN et al. (2004) beschrieben eine signifikant geringere
Inzidenz der Mixoploidie bei Embryonen aus einer temporären In-vivo-Kultur im
ligierten Schafeileiter im Vergleich zu der In-vitro-Kultur mit Serum.
2.3.1 Genexpression in präimplantatorischen Rinderembryonen
In den ersten 5-6 Tagen nach der Fertilisation durchläuft der Embryo mehrere für die
Entwicklung entscheidende Phasen: (1) es erfolgen die ersten Furchungen, (2) es
kommt zur (Haupt-) Aktivierung des embryonalen Genoms, (3) es findet die
Kompaktierung zur Morula und (4) schließlich die Blastozystenbildung mit der
Ausbildung
des
Embryonalknotens
(Innere
Zellmasse,
ICM)
und
des
Trophektoderms (TE) statt. Diese Ereignisse der frühen präimplantatorischen
Entwicklung stellen einen komplexen Vorgang dar, der auf einer korrekten
Umsetzung des genetischen Programms der Zygote beruht. Dabei steht der Embryo
zunächst unter der Kontrolle der maternalen genetischen Information (maternale
mRNA und Proteine), die während des Oozytenwachstums synthetisiert und
akkumuliert wurde (TELFORD et al. 1990). Aber auch die paternale mRNA, die
während der Fertilisation in die Eizelle gelangt, trägt zu der frühen Entwicklung bei
(OSTERMEIER et al. 2004). Die Aktivierung des embryonalen Genoms erfolgt dann
in zwei Schritten. Bereits in der Zygote kann eine „minor activation“ („kleine“
Aktivierung) des bovinen embryonalen Genoms beobachtet werden (MEMILI u.
15
Schrifttum
FIRST 2000), wohingegen die „major activation“ (Hauptaktivierung) beim Rind erst im
8- bis 16-Zell-Stadium erfolgt (Abb. 2). Dieser Übergang
der Kontrolle vom
maternalen zum embryonalen Genom wird als „maternal-embryonic transition“ =
MET bezeichnet. In dieser kritischen Zeit der Umstellung von der maternalen auf die
embryonale Expression ist der Embryo besonders anfällig gegenüber externen
Faktoren (DEAN et al. 2001).
Abbildung 2:
Transkriptionsverläufe während der frühen
Embryonalentwicklung des Rindes [nach WRENZYCKI 2007]]
Die meisten Gene werden zeit- und stadienabhängig, dem alIgemeinen maternalen
und/oder embryonalen Expressionsmuster folgend, transkribiert (NIEMANN u.
WRENZYCKI 2000) und suboptimale Kulturbedingungen in diesem Zeitraum können
diese
Abläufe
nachteilig
beeinflussen
Blastozystenqualität führen.
16
und
zu
einer
herabgesetzten
Schrifttum
2.3.2 Abweichungen im mRNA-Expressionsmuster bei Rinderembryonen
unterschiedlicher Herkunft
Es konnte nachgewiesen werden, dass die In-vitro-Produktion (IVP) und der
somatische Kerntransfer (somatic cell nuclear transfer = SCNT) einen großen
Einfluß auf die mRNA-Expressionsmuster in präimplantatorischen Rinderembryonen
haben (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; LONERGAN et al. 2001; NIEMANN et al.
2002; WRENZYCKI et al. 2004). Dabei konnten signifikante Hoch- und
Runterregulierungen, De novo-Induktionen und Stilllegungen von Genen beobachtet
werden, die an der ungestörten Embryonal-, Fetal- und Neonatalentwicklung beteiligt
sind (WRENZYCKI et al. 2005b). Das betrifft unter anderem Gene, die an der
Apoptose und am oxidativem Stress mitwirken, wie z.B. Bax (Bos taurus apoptosis
regulator box-α), SOD (superoxide dismutase) und SOX (sarcosine oxidase), aber
auch Gene, die Auswirkungen auf die Kommunikation durch gap junctions haben,
wie Cx31 (Connexin 31) und Cx43 (Connexin 43). Ebenfalls betroffen sind Gene, die
mit dem Differenzierungsprozess und der Implantation in Zusammenhang stehen,
wie bLIF (bovine leukemia inhibitory factor) und bLR-ß (bovine leukemia inhibitory
factor-receptor-ß;
RIZOS
et
al.
2002a).
Diese
Abweichungen
im
mRNA-
Expressionsmuster können besonders bei Trächtigkeiten nach SCNT aber auch
nach dem Transfer von In-vitro-Embryonen zu abnormalen Entwicklungen führen, die
unter dem Begriff „Large Offspring Syndrome“ (LOS) zusammengefasst werden
(LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2004, 2005a). Dazu zählen verlängerte
Trächtigkeiten, ein Anstieg des Geburtsgewichts, Hydrops fetalis, ein verändertes
Organwachstum, Defekte der Plazenta, des Skeletts und des Immunsystems, sowie
eine erhöhte Abort- und perinatale Sterblichkeitsrate (WALKER et al. 1996; KRUIP u.
DEN DAAS 1997; YOUNG et al. 1998; RENARD et al. 1999; NIEMANN u.
WRENZYCKI 2000; SINCLAIR et al. 2000). Aufgrund der starken Heterogenität der
auftretenden Symptome und der unterschiedlichen Auswirkungen der IVP und des
SCNT bei den verschiedenen Spezies führten FARIN et al. (2006) den Begriff
„Abnormal Offspring Syndrome“ (AOS) ein, der alle Abweichungen der Embryonal-,
Fetal- und Neonatalentwicklung erfasst. CONSTANT et al. (2006) sprechen von
einem „Large Placenta Syndrome“, da über 50% der späten Trächtigkeiten nach
17
Schrifttum
SCNT eine vergrößerte Plazenta aufweisen. Die Veränderungen der Plazenta
werden als mögliche Ursache für fetale Abnormalitäten, wie ein vergrößertes Herz,
vergrößerte Nabelgefäße und Ascites angesehen (CONSTANT et al. 2006).
Bisherige Untersuchungen über den Einfluß der In-vitro-Produktion auf das mRNAExpressionsmuster entwicklungsrelevanter Gentranskripte im Vergleich zu In-vivoEmbryonen wurden überwiegend an Morulae und Blastozystenstadien durchgeführt
(WRENZYCKI et al. 2005b), wohingegen vergleichende Untersuchungen des mRNAMusters bei früheren präimplantatorischen Stadien nur in geringem Umfang
vorhanden sind (TESFAYE et al. 2004; HÖFFMANN et al. 2006). Dennoch beruhen
Abweichungen in der relativen Transkriptmenge bei Blastozysten in vielen Fällen auf
einer gestörten Transkription in der frühen Entwicklung. Dabei können diese
Unterschiede je nach Transkript bereits eine (KNIJN et al. 2005) bis zehn Stunden
nach Kulturbeginn auftreten (LONERGAN et al. 2003b). Die endoskopische
transvaginale Endoskopie ermöglicht als minimal invasiver Eingriff die routinemäßige
Gewinnung früher Embryonalstadien, wodurch vergleichende Untersuchungen
zwischen
in
vivo
und
in
vitro
produzierten
Embryonen
in
der
frühen
präimplantatorischen Phase der Embryonalentwicklung möglich sind (HÖFFMANN et
al. 2006).
2.4
Epigenetische Modifikationen in der frühen Embryonalentwicklung
Schon seit langer Zeit ist bekannt, dass nicht allein die DNA-Sequenz eines Embryos
den Phänotyp bestimmt. Inzwischen werden epigenetische Modifikationen der DNA
für die Plastizität des Entwicklungspotentials des embryonalen und fetalen Genoms
verantwortlich gemacht (THURSTON et al. 2007).
Dabei sind epigenetische Modifikationen vererbbare, reversible Änderungen der
Genexpression, die nicht auf einer Veränderung der DNA-Sequenz beruhen (SHI et
al. 2003). Sie beinflussen neben den genetischen Mechanismen die Genexpressionsmuster und dienen dazu, den regulatorischen Zustand der Gene und die
Genexpression aufrechtzuerhalten oder zu unterdrücken. Die epigenetische Kontrolle
der Genexpression ist für die normale Entwicklung eines Organismus von
essentieller Bedeutung, da viele Gene nur zu bestimmten Zeitpunkten in einem
18
Schrifttum
spezifischen Zelltyp aktiviert sein dürfen. Die epigenetischen Mechanismen bleiben
über die Zellteilung hinweg erhalten und werden an die nächste Generation
weitergegeben (SANTOS u. DEAN 2004).
Von großer Bedeutung sind die DNA-Methylierung und die Histon-Modifikationen
während der frühen Embryonal- und Gametenentwicklung. Diese Mechanismen
führen zu einer Beeinflussung der lokalen Struktur, der Komposition und des
„Remodellings“ des Chromatins (WOLFFE u. MATZKE 1999) und dienen als eine
Erweiterung des Informationsgehaltes, der vorgibt, wie der zugrunde liegende
genetische Code interpretiert und umgesetzt werden soll (SANTOS u. DEAN 2004).
Beim Menschen konnten epigenetische Fehler nachgewiesen werden, die mit
verschiedenen Erkrankungen, wie Beckwith-Wiedemann Syndrom (BWS), Angelman
Syndrom (AS), Retinoblastomen (RB), Rett Syndrom, ATR-X Syndrom (Alpha
Thalassemia/Mental
Retadation
Syndrome,
X-linked)
und
ICF
Syndrom
(Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies), sowie mit
verschiedenen Krebsformen (DEAN et al. 2005) im Zusammenhang stehen.
2.4.1 DNA-Methylierung in der präimplantatorischen Embryonalentwicklung
Die DNA-Methylierung ist ein Mechanismus, der bei diversen Organismen von der
Pflanze über das Bakterium bis hin zum Säugetier verwendet wird. Dabei ist sie an
der Kontrolle vieler zellulärer Prozesse bei Eukaryonten beteiligt, wie z.B. der
Transkription, dem genomischen Imprinting, der X-Chromosominaktivierung, der
Regulation der Entwicklung, der Mutagenese, der Transposition, der DNA-Reparatur
und der Chromatin-Organisation (KLIMASAUSKAS et al. 1994). Laut YODER et al.
(1997) liegt die primäre Funktion der Cytosin-Methylierung in der Suppression
parasitischer Sequenzelemente, wie endogenen Retroviren und Transposons.
Bei der DNA-Methylierung katalysieren DNA-Methyltransferasen (DNMTs) den
Transfer einer Methylgruppe vom Coenzym S-Adenosyl-L-Methionin auf die 5´Position des Cytosinrings in CpG-Dinukleotiden (Abb. 3; ROBERTSON et al. 1999).
19
Schrifttum
+
Abbildung 3:
Verlauf der DNA-Methylierung [mod. nach STRATHDEE u.
BROWN (2002) und ROBERTSON (2004)]]
Diese CpG-Dinukleotide liegen nicht gleichmäßig verteilt im Genom vor. In 98% des
Genoms treten sie lediglich einmal alle 80 Basenpaare auf, wohingegen sie in den so
genannten CpG-Islands fünfmal häufiger als im gesamten übrigen Genom
auftauchen. Das Genom der Säugetiere enthält 30.000 - 45.000 CpG-Islands
(ANTEQUERA u. BIRD 1993), die zum großen Teil an den Promotoren der
Haushaltsgene liegen, aber auch mit gewebespezifischen Genen assoziiert sind
(ANTEQUERA 2003). Unter normalen Umständen und in den meisten Genen sind
diese CpG-Islands an den Promotorregionen unmethyliert (ANTEQUERA u. BIRD
1993; MEEHAN u. STANCHEVA 2001). Ausnahmen bilden die CpG-Islands von
geprägten und von X-Chromosom-gekoppelten Genen. Insgesamt sind ca. 70% der
CpG-Domänen methyliert (ROBERTSON u. WOLFFE 2000).
Um ein korrektes Genexpressionsmuster für eine ungestörte Embryonalentwicklung
zu erhalten, ist die richtige DNA-Cytosin-Methylierung in den CpG-Islands von
entscheidender Bedeutung. So ist sie unter anderem essentiell für das genomische
20
Schrifttum
Imprinting, ein Mechanismus, bei dem in Abhängigkeit von der elterlichen Herkunft
nur ein Allel eines Gens exprimiert wird (mono-allelische Expression). Dazu werden
das aktive und das inaktive Allel durch eine unterschiedliche DNA-Methylierung in
den entsprechenden regulatorischen Regionen (differentiell methylierte Regionen =
DMRs) markiert (BARLOW 1997), wodurch in somatischen Zellen entweder nur das
väterliche (paternale) oder nur das mütterliche (maternale) Allel eines Gens
exprimiert wird. Diese DMRs bestehen zumeist aus CG-reichen Sequenzen oder
CpG-Islands und befinden sich häufig innerhalb von Promotorregionen (BIRD 1986;
TILGHMAN 1999; REIK et al. 2001b). Interessanterweise sind auf dem maternalen
Allel unproportional viele geprägte Gene methyliert (REIK u. WALTER 2001).
Meistens wird infolge der DNA-Methylierung die Transkription gehemmt (RAZIN u.
CEDAR 1994; BIRD u. WOLFFE 1999; AVNER u. HEARD 2001; SHI et al. 2003).
Dabei verhindert die angehängete Methylgruppe das „Andocken“ der RNAPolymerase II. Bei einigen Genen, die dem Imprinting unterliegen und die DMRs
besitzen, wurde jedoch gezeigt, dass sie sich auf einem transkriptionell aktiven Allel
befinden (REIK u. WALTER 2001). Somit kann die Methylierung bei Genen, die dem
Imprinting unterliegen, sowohl zu einer Aktivierung als auch zu einer Stilllegung der
Genexpression führen (BARLOW 1997; REIK u. WALTER 2001).
Auch wenn einige Methylierungsmuster von den Eltern an die Nachkommen weiter
vererbt werden, so wird der größte Teil doch durch De-novo-Methylierung kurz nach
der Implantation des Embryos erstellt (YODER u. BESTOR 1998).
Die Entwicklung der Säugetiere ist durch zwei Phasen charakterisiert, in denen das
DNA-Methylierungsmuster reprogrammiert wird. Die erste Reprogrammierung erfolgt
während der Entwicklung der Primordialkeimzellen und die zweite während der
Präimplantation (REIK u. WALTER 2001). Während der normalen KeimzelllinienEntwicklung unterliegt die DNA-Methylierung dynamischen Veränderungen (REIK et
al. 2001b), um die Vererbung von zwei inaktiven Allelen zu vermeiden. Dazu findet
eine erste große Demethylierung statt, sobald die Primordialkeimzellen in die
Keimleiste eingewandert sind. Zu diesem Zeitpunkt verlieren viele Sequenzen ihre
Methylierung und das inaktivierte X-Chromosom wird reaktiviert (DAVIS et al. 2000;
LEES-MURDOCK et al. 2003). Diese Reprogrammierungsphase geht mit einem
21
Schrifttum
essentiellen
Zurücksetzen
der
elternspezifischen
(parent-of-origin
specific)
Methylierung der geprägten differential methylierten Regionen (DMRs) einher. Am
Tag der maximalen Demethylierung bleiben die Keimzellen in ihrer Entwicklung
stehen (die weiblichen in der meiotischen Prophase und die männlichen in der
Mitose; HAJKOVA et al. 2002). Anschließend wird die Methylierung während der
Gametogenese entsprechend des Geschlechts des entstehenden Organismus
wiederhergestellt. Dabei erfolgt die De-novo-Methylierung von Wiederholungssequenzen in den Prospermatogonien bei männlichen Mäusen zwischen Tag 15,5
und
17,5
der
Embryonalentwicklung
(LEES-MURDOCK
et
al.
2003).
Die
Remethylierung der geprägten Gene beginnt an Tag 15,5 der Embryonalentwicklung
und wird erst nach der Geburt vollendet (DAVIS et al. 2000). Bei weiblichen Tieren
wird die Methylierung der geprägten Gene der Keimzellen in der postnatalen
Wachstumsphase während der Oogenese wiederhergestellt (BOURC´HIS et al.
2001b). Auf diesem Wege sind die reifen Gameten beider Geschlechter hoch
methyliert.
Die zweite Phase der Reprogrammierung der DNA-Methylierung findet zwischen der
Fertilisation und der Blastozystenbildung statt. Nach der Fertilisation kommt es bei
fast allen untersuchten Säugetieren (Maus, Schwein, Rind, Rhesus-Affe und
Mensch) zu einer raschen asymmetrischen Demethylierung des paternalen Genoms
(ROUGIER et al. 1998; MAYER et al. 2000; OSWALD et al. 2000; DEAN et al. 2001).
Ausnahmen davon zeigen nur das Kaninchen und das Schaf (SHI et al. 2004,
YOUNG u. BEAUJEAN 2004). Die Demethylierung erfolgt aktiv, d.h. in Abwesenheit
von
DNA-Replikation
und
unterliegt
speziesspezifischen
Variationen.
Diese
Unterschiede zwischen den verschiedenen Arten werden mit unterschiedlichen
Zeitpunkten der embryonalen Genomaktivierung in den verschiedenen Spezies in
Zusammenhang gebracht (YOUNG u. BEAUJEAN 2004). Bei der Maus und beim
Rind beginnt die aktive Demethylierung bereits im Vorkernstadium und auch beim
Menschen setzt sie kurz nach der Fertilisation ein. Im Gegensatz zur Maus konnte
beim Menschen jedoch nicht festgestellt werden, dass der paternale Pronukleus
nahezu keine Methylierung mehr aufweist. Daraus ergibt sich die Vermututng, dass
die Intensität der Demethylierung beim Menschen geringer ist, als bei der Maus
22
Schrifttum
(FULKA et al. 2004). Beim Kaninchen und beim Schaf bleibt die DNA im männlichen
Vorkern hoch methyliert (SHI et al. 2004, YOUNG u. BEAUJEAN 2004). Das Rind
und der Mensch nehmen eine Zwischenstellung zwischen der Maus mit einer nahezu
vollständigen Demethylierung des paternalen Genoms und dem Kaninchen mit einer
fehlenden Demethylierung ein (FULKA et al. 2004).
In den nachfolgenden Furchungsstadien kommt es bei den meisten Säugern zu einer
replikationsabhängigen Demethylierung des maternalen Genoms, indem die DNMT1
aus dem Zellkern ausgeschlossen wird (HOWELL et al. 2001). Dadurch können die
neu gebildeten Replikationsstränge nicht methyliert werden und der Gehalt an
methyliertem Cytosin nimmt ab. Dieser Vorgang wird als passive Demethylierung
bezeichnet (ROUGIER et al. 1998). Interessanterweise bleiben die DMRs geprägter
Gene und einige bestimmte Wiederhohlungssequenzen von dieser Demethylierung
verschont (REIK u. WALTER 2001). Auch bei der passiven Demethylierung gibt es
speziesspezifische Unterschiede. So erfolgt sie bei der Maus, bei Wiederkäuern und
beim Rhesus-Affen zwischen dem 2- und 8-Zell-Stadium (YANG et al. 2007, YOUNG
u. BEAUJEAN 2004), während beim Menschen lediglich eine Demethylierung
zwischen dem 4- und 8-Zell-Stadium festgestellt werden kann (FULKA et al. 2004).
Beim Schaf setzt zwischen dem 4- und 8-Zell-Stadium nur eine geringe
Demethylierung ein, die im Gegensatz zu der nahezu vollständigen Demethylierung
des maternalen Genoms bei der Maus, beim Schaf wesentlich sequenz-spezifischer
verläuft (YOUNG u. BEAUJEAN 2004). Beim Kaninchen setzt die Demethylierung
erst nach dem 16-Zell-Stadium ein (SHI et al. 2004).
Später findet eine De-novo-Methylierung der DNA statt. Dieser Vorgang beginnt beim
Rind zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium (BOURC´HIS et al. 2001a; DEAN et al.
2001; SHI et al. 2003) und bei der Maus sowie beim Menschen ab der Morula (DEAN
et al. 2001). Dabei kommt es bei der Maus zu einer deutlich asymmetrischen
Methylierung, wobei die DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse (ICM)
hypermethyliert wird, wohingegen die DNA der Zellen des Trophektoderms (TE) eine
Hypomethylierung aufweist (DEAN et al. 2001; SANTOS et al. 2002). Diese
Asymmetrie ist beim Rind schwächer ausgeprägt (vgl. Abb. 4) und beim Menschen
liegt eine stärkere Methylierung der DNA der Zellen des Trophektoderms gegenüber
23
Schrifttum
der DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse vor (FULKA et al. 2004). Auch beim
Schaf kann eine asymmetrische Verteilung der Methylierung in voll expandierten
Blastozysten beobachtet werden. Im Gegensatz zur Maus beruht diese Asymmetrie
jedoch nicht auf einer verstärkten Remethylierung in den Kernen der ICM, sondern
auf einer selektiven Demethylierung der DNA im TE (YOUNG u. BEAUJEAN 2004).
Bei geklonten bovinen Blastozysten konnte eine deutliche Hypermethylierung der
ICM und des Trophektoderms nachgewiesen werden, die mit plazentaren
Dysfunktionen in Zusammenhang stehen könnten, die bei SCNT-Embryonen
auftreten (KANG et al. 2002; SANTOS et al. 2003). Bei diesen Untersuchungen
dienten IVP-Embryonen als Kontrollgruppe, jedoch konnte in bovinen Blastozysten
ein Einfluß der In-vitro-Kultur und des Klonens sowohl auf die Aufrechterhaltung als
auch auf die De-novo-Methylierung nachgewiesen werden (WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003).
Maternales Genom
Innere Zellmasse
Trophektoderm
Paternals Genom
Abbildung 4:
Anteil des methylierten Genoms boviner Embryonen in
Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums [mod. nach DEAN et
al. 2001]]
24
Schrifttum
Die Abbildung 4 zeigt ein Schema der Demethylierung und der De-novoMethylierung des Genoms während der präimplantatorischen Entwicklung boviner
Embryonen nach In-vitro-Produktion. Dabei kommt es direkt nach der Fertilisation zu
einer aktiven Demethylierung des paternalen Genoms, welches bereits im
Vorkernstadium nahezu ohne Methylierung vorliegt. Zeitlich versetzt findet eine
passive Demethylierung des maternalen Genoms statt, die etwa im 8-Zell-Stadium
abgeschlossen ist. Bei der anschließenden De-novo-Methylierung des Genoms
kommt es zu einer asymmetrischen Verteilung, wobei die DNA der inneren
Zellmasse
hypermethyliert
und
die
DNA
der
Zellen
des
Trophektoderms
hypomethyliert wird.
2.4.2 Beeinflussung
der
Methylierung
spezieller
Gene
während
der
Embryonalentwicklung
Für eine ungestörte Embryonalentwicklung ist die Methylierung spezieller Gene zu
bestimmten Zeitpunkten erforderlich. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass
Umwelteinflüsse wie die Ernährung des tragenden Muttertieres oder verschiedene
Kulturbedingungen einen entscheidenden Einfluss auf das Methylierungsmuster der
Nachkommen haben können (FAQUE et al. 2007; LILLYCROP et al. 2007). Da für
die korrekte Methylierung eine ausreichende alimentäre Zufuhr an Methylgruppen
erfolgen muß, kann es bei der Verfütterung von protein-, methionin- und Vitamin Barmen Diäten während der Trächtigkeit bei den Nachkommen zu Störungen der
Methylierung der Promotoren spezifischer Gene und zu einem veränderten
metabolischen Phänotyp kommen (LILLYCROP et al. 2007). Davon betroffen ist
unter anderem der hepatische Glukokortikoid-Rezeptor (GR). LILLYCROP et al.
(2007) konnten zeigen, dass die proteinreduzierte Ernährung tragender Ratten zu
einer Abnahme der Methylierung am GR-Promotor und zu einer signifikant erhöhten
Expression des entsprechenden Rezeptors bei den Nachkommen führt. Gleichzeitig
sinkt die DNMT1- (DNA-Methyltransferase 1)- Expression, während bei der DNMT3a
und DNMT3b (DNA-Methyltransferase 3a/3b) keine Veränderungen der Expression
auftreten.
Aus
Hypomethylierung
diesen
am
Ergebnissen
kann
GR-Promotor
auf
25
geschlossen
einer
werden,
verminderten
dass
die
Methylierung
Schrifttum
hemimethylierter DNA während der Mitose, verursacht durch einen Mangel an
DNMT1, und nicht auf einer fehlgeschlagenen De-novo-Methylierung beruht
(LILLYCROP et al. 2007).
Auch eine Kultivierung mit Insulin beeinflusst die Methylierung und die Expression
von geprägten Genen. Das kann bei Mäuse-Feten beobachtet werden, denen als
Embryo vor der Implantation Insulin in die Kultur zugesetzt wurde (SHAO et al.
2007). Dabei kommt es bei der Insulin-exponierten Gruppe zu einer erhöhten
Blastozystenrate und einem erhöhten Geburtsgewicht gegenüber der Kontrollgruppe.
Gleichzeitig
ist
die
mRNA-Transkription
der
geprägten
Gene
für
die
Wachstumsfaktoren IGF-2 (insulin-like growth factor 2) und H19 in 14 Tage alten
Feten signifikant erhöht. Dieser Anstieg der Transkripte geht einher mit einer
verminderten
Methylierung
Insulinexposition
der
geprägten
präimplantatorischer
Kontrollregion
Embryonen
dieser
beeinflusst
Gene.
Die
demnach
die
Genexpression und die fetale Entwicklung (SHAO et al. 2007).
Schon allein die In-vitro-Kulturbedingungen und die In-vitro-Fertilisation beeinflussen
die Methylierung der geprägten Kontrollregion (Imprinting Control Region = ICR) von
H19 und des H19-Promoters in Abhängigkeit des verwendeten Kulturmediums
(FAQUE et al. 2007). Diese Abweichungen der Methylierung entwicklungsrelevanter
Gene werden im Zusammenhang mit Veränderungen des Imprinting-Musters bei
Kindern gesehen, die mittels assistierter Reproduktionstechnologien (ART) gezeugt
wurden (FAQUE et al. 2007).
Ebenso werden einige Erkrankungskomplexe bei erwachsenen Menschen auf
epigenetische Abweichungen während der Embryonalentwicklung zurückgeführt.
Bereits
1990
beschrieb
BARKER
den
Zusammenhang
zwischen
der
Embryonalentwicklung und chronischen Erkrankungen im Erwachsenenalter, wie
erhöhtem Blutdruck, koronaren Herzerkrankungen und Diabetes (BARKER 1990). Er
formulierte die „Fetal origins of adult disease“-Hypothese (FOAD), die die Ursache
einiger
chronischer
Erkrankungen
im
Erwachsenenalter
in
fetalen
Anpassungsmechanismen an schädliche Gegebenheiten im Uterus sieht. Da diese
Anpassungsreaktionen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Trächtigkeit auftreten
können, spricht man auch von den „Developmental origins of adult disease“ (DOAD)
26
Schrifttum
oder der Barker-Hypothese. Inzwischen hat sich der Begriff „Developmental Origins
of Health and Disease“ (DOHaD) durchgesetzt (SILVEIRA et al. 2007). Dabei können
bereits vor der Implantation Abweichungen beobachtet werden, die später gehäuft
zum Auftreten bestimmter Erkrankungen führen. So konnten KWONG et al. (2000)
an Ratten zeigen, dass eine proteinarme Ernährung des Muttertieres während der
Präimplantation zu einer Abnahme der Zellzahl im Blastozystenstadium und zu
Nachkommen mit vermindertem Geburtsgewicht und Bluthochdruck führt. In einer
Studie wurde ein Zusammenhang zwischen niedrigen Geburtsgewichten, späterem
kompensatorischem
Wachstum
und
einem
gehäuften
Auftreten
von
Herzerkrankungen, Bluthochdruck, Typ 2 Diabetes mellitus, Insulinresistenz und
Hyperlipidämie beschrieben (DE BOO u. HARDING 2006), während eine andere
Studie
über
das
gehäufte
Auftreten
von
polyzystischen
Ovarien
und
hormonabhängigen Tumoren infolge eines erhöhten Geburtsgewichts berichtet
(SAMARAS et al. 2003). Als Ursache wird die fetale Programmierung als Antwort auf
Ernährungsstimuli oder eine starke fetale Glukokortikoid-Exposition gesehen. Der
Embryo oder Fetus reagiert auf die entsprechenden Stimuli mit einer physiologischen
Adaptation, die vermutlich über epigenetische Modifikationen der Genexpression
hervorgerufen wird (DE BOO u. HARDING 2006) und die die Physiologie und den
Metabolismus dauerhaft verändert. So wurden in einem Tierversuch an tragenden
Schafen bei einer Vitamin B- und methioninarmen Diät Nachkommen mit normalen
Geburtsgewichten geboren, die im Erwachsenenalter aber deutlich schwerer als die
Kontrollgruppe waren (SINCLAIR et al. 2007). Bei diesen Tieren aus der restriktiven
Fütterung stieg die Häufigkeit an Immuninsuffizienzen, Insulinresistenzen und
Blutdruckveränderungen deutlich an. Dabei zeigten 4% der untersuchten CpGIslands in den fetalen Lebern ein abweichendes Methylierungsmuster, das für die
auftretenden Phänotypen verantwortlich gemacht wird (SINCLAIR et al. 2007). Auch
WOLFF et al. (1998) konnten bei einem Versuch an Mäusen nachweisen, dass das
Methylierungsmuster der Nachkommen durch den Gehalt an Methyldonoren in der
Futterration der tragenden Tiere beeinflusst werden kann. Bei der Ratte wird die
Methylierung in der Leber durch eine proteinarme Futterration verändert (REES et al.
2000). Laut WATERLAND u. JIRTLE (2004) führt eine Veränderung der intrauterinen
27
Schrifttum
Umgebung infolge einer epigenetischen Modifizierung zu einer veränderten
Genexpression, die das Risiko für chronische Erkrankungen im Erwachsenenalter
erhöht.
2.4.3 DNA-Methyltransferase-Familie (DNMTs)
DNA-Methyltransferasen (DNMTs)
katalysieren den Transfer einer Methylgruppe
von der Aminosäure S-Adenosyl-L-Methionin auf die 5´-Position des Cytosinrings in
5´-CpG-3`-Dinukleotiden. Dabei wird die Methylgruppe in die große Kurve des DNADoppelstranges eingefügt, ohne Einfluß auf die Basenpaarung der Nukleotide zu
nehmen.
Es gibt drei Familiengruppen an DNMTs, die in der Reihenfolge ihrer Entdeckung
benannt wurden (BESTOR 2000): DNMT1, DNMT2, und DNMT3 mit DNMT3a, 3b
und 3L. Ihre Aufgaben sind die De-novo-Methylierung, d. h. die Übertragung einer
Methylgruppe auf zuvor nicht modifizierte DNA (OKANO et al. 1998a), und die
anschließende Aufrechterhaltung dieser Information durch Weitergabe an die
Tochterstränge während der Replikation (LEI et al. 1996; OKANO et al. 1999). Die
DNMTs besitzen zwei funktionelle Domänen: Die N-terminale Endung besitzt
regulatorische Eigenschaften, während die C-terminale Endung katalytische
Aufgaben ausführt (BESTOR 2000; ROBERTSON 2002). Die katalytische Domäne
beinhaltet zehn kleine konservierte Motive, die allen DNMTs gemeinsam sind und
einen gemeinsamen evolutionären Ursprung vermuten lassen (KUMAR et al. 1994).
Abgesehen von einigen Übereinstimmungen in der Sequenz bestimmt der
funktionelle Aufbau die Aufgabenverteilung innerhalb der Familie. Die DNMT1 dient
überwiegend der Aufrechterhaltung der Methylierung, während die DNMT3-Familie
für die De-novo-Methylierung verantwortlich ist. Die DNMT2 ist in Eukaryonten hoch
konserviert und wird in den meisten humanen und murinen Geweben in geringem
Maße exprimiert. OKANO et al. (1998b) konnten zeigen, dass die DNMT2 für die Denovo-Aktivität in embryonalen Stammzellen keine essentielle Bedeutung besitzt.
Mäuse mit einer homozygoten DNMT2 null-Mutation sind überlebensfähig und
zeigen ein normales Methylierungsmuster in endogenen Sequenzen (OKANO et al.
1998b). In vitro kann das Enzym keine DNA methylieren (OKANO et al. 1998b),
obwohl es die für die DNMTs typischen konservierten Motive besitzt, die eine
28
Schrifttum
funktionelle Aktivität vermuten lassen. LIU et al. (2003) berichteten über eine
schwache aber reproduzierbare Methyltransferase-Aktivität in vivo in Zelllinien des
Säugetiers und laut DONG et al. (2001) bindet die DNMT2 an die DNA und bildet
einen gegenüber Denaturierung resistenten Komplex. Die genaue Rolle der DNMT2
bei Säugern ist noch nicht geklärt, jedoch scheint ein Zusammenhang mit der
Aufrechterhaltung zentromerer Strukturen zu bestehen (BESTOR 2000).
Die große Bedeutung der DNMTs zeigt sich besonders darin, dass Störungen von
einem oder mehreren Mitgliedern der DNMT-Familie zu verschiedenen Defekten in
der Entwicklung führen können (EHRLICH 2003).
2.4.3.1 DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1)
Diese Gruppe der DNMTs wurde als erste entdeckt und ist das bei weitem am
häufigsten exprimierte Mitglied der DNMT-Familie. Sie besitzt eine große N-terminale
regulatorische und eine kleinere C-terminale Domäne (BESTOR et al.1988), wobei
die regulatorische Domäne verschiedene funktionelle Bereiche besitzt: ein Signal zur
Zellkernlokalisation, ein proliferatives Zellkern-Antigen (PCNA; CHUANG et al. 1997),
einen
interagierenden
Bereich
und
einen
Bereich
zum
Auffinden
der
Replikationsgabel (LEONHARDT et al. 1992). Die C-terminale Region ist bei der
DNMT1 im Gegensatz zur DNMT3a und 3b katalytisch inaktiv. DNMT1 methyliert
DNA speziell an CpG-Dinukleotiden und hat in vitro eine deutliche (5-30-fach
erhöhte) Präferenz für hemimethylierte Substrate gegenüber unmethylierten
Substraten (PRADHAN et al. 1997, 1999). Aus dieser Vorliebe ergibt sich ihre
Aufgabe
als
Erhaltungsmethyltransferase,
wobei
sie
die
vorhandenen
Methylierungsmuster nach der Replikation aufrecht erhält. Jedoch ist die DNMT1
auch in die De-novo-Methylierung involviert und übernimmt die Mehrheit der Denovo-Methylierungsaktivitäten in Embryo-Lysaten (YODER et al. 1997). Die Cterminale Endung zeigt eine Präferenz für unmethylierte DNA, während die
methylierte DNA durch die N-terminale Domäne gebunden wird (BACOLLA et al.
1999, 2001). Die Inaktivierung von DNMT1 führt zu einer globalen Demethylierung
des Genoms (LI et al. 1992) und führt so zu einer prämaturen Aktivierung vieler
Gene (JAENISCH u. BIRD 2003).
29
Schrifttum
Innerhalb
der
Gruppe
der
DNMT1
konnten
bei
der
Maus
verschiedene
geschlechtsspezifische Isoformen identifiziert werden, die sich in der Anzahl ihrer
Aminosäuren
unterscheiden
(BESTOR
et
al.
1988).
Es
gibt
eine
kurze
oozytenspezifische Isoform (DNMT1o) die im Zytoplasma von Oozyten und in frühen
Embryonen gefunden werden kann. Sie ist 118 Aminosäuren kürzer als die
somatische Isoform (DNMT1s) und beruht auf einem gegenüber dem somatischen
mRNA-Transkript verkürzten oozytenspezifischen mRNA-Transkript (MERTINEIT et
al. 1998). Die DNMT1s ist in embryonalen Stammzellen und in somatischen Zellen
nachweisbar und ersetzt die DNMT1o nach der Implantation (TRASLER et al. 1996).
Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass auch die DNMT1s zu jeder Zeit in den
präimplantatorischen Embryonen nachgewiesen werden kann (CIRIO et al. 2008).
So kann in gereiften Oozyten, Zygoten und 2-Zellern eine maternale DNMT1s
gefunden werden, während ab dem 2-Zeller eine zygotische DNMT1s gebildet wird.
Als dritte Variante existiert ein pachytänes mRNA-Transkript. Dieses Transkript,
welches in pachytänen Spermatozyten vertreten ist, besitzt 800 Nukleotide mehr als
das somatische Transkript und wird nicht in ein Protein translatiert (MERTINEIT et al.
1998).
Auch beim Menschen können oozytenspezifische und somatische Transkripte
nachgewiesen werden. Die oozytenspezifischen DNMT1-Transkripte werden im
Germinalvesikelstadium der Oozyten gebildet und bleiben während der frühen
präimplantatorischen Entwicklung bestehen (HUNTRISS et al. 2004).
Für
das
Rind
existiert
oozytenspezifischen
bisher
kein
DNMT1-Transkripten.
Nachweis
Statt
von
dessen
somatischen
deuten
und
neueste
Untersuchungen darauf hin, dass keine oozytenspezifische Form der DNMT1 beim
Rind existiert (RUSSELL u. BETTS 2008). So konnten RUSSELL und BETTS (2008)
zwar eine neue Variante der DNMT1 nachweisen (DNMT1b), die jedoch wie die
bisher bekannte DNMT1 ubiquitär in allen Geweben exprimiert wird. Diese neue
DNMT1b-Variante ist nur in geringen Mengen in ungereiften Oozyten, in etwas
höheren Mengen in fetaler Leber und fetalen Gonaden und in den höchsten Mengen
in fetalen Muskelpräparaten nachzuweisen (RUSSELL u. BETTS 2008). Dagegen
konnte kein Hinweis auf einen alternativen Promotor oder ein alternatives erstes
30
Schrifttum
Exon gefunden werden, wie es bei der Maus für die DNMT1o existiert (RUSSELL u.
BETTS 2008).
Bei der Maus besteht eine ungewöhnliche Beziehung zwischen DNMT1-Proteinen
und mRNA-Gehalten. So treten in präimplantatorischen Embryonen hohe DNMT1oProteingehalte
kombiniert
mit
niedrigen
DNMT1o-mRNA-Gehalten
auf.
In
pachytänen Spermatozyten liegt dagegen die umgekehrte Form vor. Hier werden
große Mengen an pachytänem mRNA-Transkript gebildet, es findet sich jedoch kein
Protein in den Zellen (MERTINEIT et al. 1998).
Ähnliche Beobachtungen können auch beim Rind gemacht werden. Hier kann auf
mRNA-Ebene eine Akkumulation der DNMT1-Transkripte bis zur Metaphase II in
wachsenden bovinen Oozyten festgestellt werden. Nach der Fertilisation nimmt die
mRNA-Menge deutlich ab, bleibt dann aber bis zum 16-Zellstadium konstant.
Anschließend erfolgt eine weitere Abnahme der Transkripte. Die dabei erreichte
mRNA-Menge wird schließlich bis zum Blastozystenstadium konstant gehalten
(RUSSEL
u.
BETTS
2005).
Gleichzeitig
sind
in
bovinen
Oozyten
und
präimplantatorischen Embryonen niedrige Mengen an DNMT1-Protein nachweisbar.
Eine Ausnahme bilden das 16-Zell- und das Morula-Stadium, in denen es trotz
geringer mRNA-Transkripte zu einem deutlichen Anstieg des Proteingehaltes kommt
(RUSSEL u. BETTS 2005). Die geringe Transkriptzahl ab dem Morulastadium deutet
laut RUSSEL und BETTS (2005) darauf hin, dass andere Methyltransferasen für die
Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung während der Blastozystenformierung und
Blastozystenexpansion verantwortlich sind, während der erhöhte Proteingehalt im
16-Zell- und Morula-Stadium auf eine bedeutende Rolle der DNMT1 bei der
Aktivierung des embryonalen Genoms boviner Embryonen hindeutet (RUSSEL u.
BETTS 2005).
Einen Überblick über die mRNA- und Proteingehalte der DNMT1 in den
verschiedenen Entwicklungsstadien am Beispiel der Maus gibt die Tabelle 3.
31
Schrifttum
Tabelle 3: Darstellung der mRNA- und Proteingehalte der DNMT1 in
verschiedenen Entwicklungsstadien am Beispiel der Maus
DNMT1p
DNMT1o
DNMT1s
Keimzellen:
mRNA
Pachytäne
Wachsende Oozyten:
Spermatozyten: ↑↑↑
↑↑↑
Spermatogonien/
Spermatozyten: ↑↑↑
pachytäne Spermatozyten: −
Spermatogonien/
Wachsende Oozyten:
Protein
↑ bis ↑↑↑ (zp)
−
Ovulierte Oozyten:
↑↑↑ (zp)
Spermatozyten: ↑↑ (Kern)
pachytäne Spermatozyten: −
Wachsende Oozyte: ↑ (Kern)
Ovulierte Oozyte: ↑ (Kern)
Präimplantatorische Embryonen:
mRNA
−
nur in Zygoten
ansteigend von
Zygote-Blastozyste
2-Zeller – 8-Zeller:
alle Stadien :
Protein
↑↑ bis ↑↑↑ (zp);
−
8-Zell-Embryo:
↑ (zp, Kern)
Blastozysten:
↑↑ (zp, Kern)
Zygote + 2-Zeller: maternal
↑↑↑ (Kern)
ab 2-Zeller: zygotisch
Postimplantatorische Embryonen:
mRNA
−
−
somatische Zellen: ↑↑
Protein
−
−
somatische Zellen: ↑↑ (Kern)
−
keine Expression,
Expression;
↑
schwache Expression,
↑↑ starke Expression, ↑↑↑ sehr starke
zp: zytoplasmatisch
(Quelle: MERTINEIT et al. 1998, RATNAM et al. 2002 ; CIRIO et al. 2008)
32
Schrifttum
Bei der Maus wird die kurze oozytenspezifische Isoform (DNMT1o) während der
frühen präimplantatorischen Entwicklung aus dem Zellkern ausgeschleust und aktiv
im Zytoplasma zurück gehalten (CARDOSO u. LEONHARDT 1999). Dadurch kann
die Methylierung in den frühen Furchungsstadien nicht aufrecht erhalten werden und
es kommt zu einer passiven Demethylierung des maternalen Genoms (HOWELL et
al. 2001). Nur während des Oozytenwachstums und im 8-Zell-Stadium ist die
DNMT1o bei der Maus im Nukleus zu finden (vgl. Tab. 3; BESTOR 2000). Erst nach
der Implantation der Mäuseembryonen gelangt die DNMT1o aus dem Zytoplasma
wieder in den Zellkern und wird dort von der längeren somatischen Isoform ersetzt
(CARLSON et al. 1992; TRASLER et al. 1996). Die Bindung der DNMT1o im
Zytoplasma der Zygoten ist sehr fest, kann aber mittels Salzextraktion gelöst werden.
Zudem ist die Motilität dieses Proteins im Zytoplasma gegenüber der Motilität im
Zellkern stark herabgesetzt (GROHMANN et al. 2005).
Die DNMT1s ist in geringen Mengen in allen präimplantatorischen Embryonalstadien
sowohl zytoplasmatisch als auch im Kern nachzuweisen (CIRIO et al. 2008). Eine
Ausnahme bildet das pronukleäre 1-Zell-Stadium, in dem das Protein lediglich im
Zytoplasma vorliegt. Im 2- und 4-Zell-Stadium kommt es gegenüber den gereiften
Oozyten und Zygoten zu einer deutlichen Abnahme des Proteingehaltes.
Anschließend nimmt der DNMT1s-Gehalt wieder zu und erreicht ein Maximum im
Blastozystenstadium (CIRIO et al. 2008).
Bei bovinen Oozyten und in vitro produzierten präimplantatorischen Embryonen ist
die DNMT1 in fast allen Stadien im Zytoplasma zu finden, wo sie mit dem
endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien assoziiert ist. Eine Ausnahme
bildet das 16-Zellstadium, in dem das Enzym im Zellkern auftritt (RUSSEL u. BETTS
2005).
In Abhängigkeit der Herkunft und des Entwicklungsstadiums konnten bei Rindern für
die DNMT1 in verschiedenen Versuchen unterschiedliche mRNA-Gehalte festgestellt
werden. WRENZYCKI u. NIEMANN (2003) beschrieben die DNMT1-mRNAExpression in maturierten Eizellen sowie in Embryonen verschiedener Herkunft
(parthenogenetisch, IVP, SCNT). Dabei war in identisch erstellten Embryonen im 8-
33
Schrifttum
Zellstadium ein signifikanter Abfall des mRNA-Gehaltes im Vergleich zu Zygoten der
gleichen Herkunft nachweisbar. Im Blastozystenstadium konnte jedoch ein
signifikanter Anstieg der Transkriptmenge bei den Embryonen aus SCNT und IVP im
Vergleich zu in vivo gewonnenen Embryonen beobachtet werden.
Bei einem Vergleich früher präimplantatorischer boviner Embryonen aus IVP und Invivo-Gewinnung kann ein signifikanter Unterschied der DNMT1 mRNA-Expression
bei Embryonen verschiedener Herkunft festgestellt werden. So ist die relative
Transkriptmenge in in vivo gewonnenen Morulae- und Blastozystenstadien geringer
als in Embryonen aus In-vitro-Kultur (HÖFFMANN et al. 2006).
2.4.3.2 DNA-Methyltransferasen 3a/3b/3L (DNMT3a/3b/3L)
DNMT3a und DNMT3b sind zwei eng miteinander verwandte Enzyme. Sie werden
durch unterschiedliche Gene codiert, teilen aber ihre Vorliebe für unmethylierte CpGDinukleotide. Diese Präferenz kennzeichnet sie als De-novo-Methyltransferasen
(OKANO et al. 1998a). Sie werden in postimplantatorischen Mäuseembryonen zu der
Zeit der De-novo-Methylierung des somatischen Gewebes exprimiert (OKANO et al.
1998a, 1999).
DNMT3a und 3b scheinen sich durch leichte Unterschiede in der katalytischen
Domäne zu unterscheiden. Die DNMT3b spielt eine entscheidende Rolle in der
frühen Embryonalentwicklung und methyliert ein breites Spektrum an DNASequenzen in CpG-reichen Regionen des Genoms (HERMANN et al. 2004),
während die DNMT3a Methylierungen an spezifischen Stellen wiederherstellt und
damit eine De-novo-Methylierung an einzelnen Gen-Loci durchführt (HERMANN et
al. 2004). Dabei sind besonders Gene oder Sequenzen betroffen, die während der
Embryonalentwicklung und/oder nach der Geburt von Bedeutung sind (OKANO et al.
1999). Laut LI et al. (2007) sind die DNMT3a und 3b Hauptkomponenten eines
Komplexes, der aus embryonalen Mäuse-Stammzellen isoliert wurde. Dabei
interagieren die beiden Enzyme direkt miteinander und stimulieren sich sowohl in
vitro als auch in vivo gegenseitig. Dieser stimulatorische Effekt ist unabhängig von
der katalytischen Aktivität der Enzyme. In postimplantatorischen Mäuseembryonen
und in embryonalen Stammzellen kommt es zu einem synergistischen Effekt bei der
Methylierung der Promotorregionen der Gene Oct4 und NANOG (LI et al. 2007).
34
Schrifttum
Das dritte Enzym der DNMT3-Familie ist die DNMT3L. Dabei handelt es sich um ein
stark degeneriertes Protein, das deutliche Übereinstimmungen mit der DNMT3a und
DNMT3b zeigt, welches selbst aber keine katalytische Aktivität besitzt. Es wird bei
Mäusen zusammen mit der DNMT3a und 3b während der Gametogenese und
Embryogenese exprimiert (BORC´HIS et al. 2001b; HATA et al. 2002). DNMT3a und
3L sind beide essentiell für die Etablierung geprägter Regionen auf dem Genom in
Oozyten (HATA et al. 2002), wobei der genaue Mechanismus noch nicht geklärt ist.
Jedoch
scheint
die
DNMT3a
einen
Aktivator
zu
benötigen,
um
die
sequenzspezifische Funktion genau zu erreichen. In diesem Fall besäße die
DNMT3L eine Aktivatorfunktion für die Methylierung einzelner Gene. Laut GOWHER
et al. (2005) kann die DNMT3L die katalytische Aktivität der DNMT3a und 3b bis um
das 15fache verstärken.
Die Proteine der DNMT3-Familie können nach LEES-MURDOCK et al. (2005)
lediglich zu solchen Zeitpunkten im Zellkern nachgewiesen werden, zu der eine
Methylierung stattfindet (LEES-MURDOCK et al. 2005). Der einzige Zeitraum, zu
dem DNMT3a, DNMT3b und DNMT3L gemeinsam im Zellkern von Keimzellen
vorliegen, ist die kurze Spanne der De-novo-Methylierung (LEES-MURDOCK et al.
2005). Bei immunozytochemischen Untersuchungen an Mäuseembryonen konnten
KO et al. (2005) die DNMT3a im Zellkern und/oder in perinukleären Regionen von
Zygoten, 2- und 4-Zell-Embryonen nachweisen, wohingegen das Enzym in 8-ZellEmbryonen, Morulae- und Blastozystenstadien hauptsächlich im Zytoplasma und nur
in sehr geringem Maße im Zellkern vorliegt.
2.4.3.2.1 DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a)
Bei der Maus und beim Menschen konnten zwei Isoformen des Proteins DNMT3a
identifiziert werden. Die DNMT3a und die DNMT3a2 werden durch unterschiedliche
Promotoren produziert, wobei der Promotor für die DNMT3a2 in einem Intron
innerhalb des DNMT3a Promotors liegt (CHEN et al. 2002). Beide Formen zeigen
eine deutliche De-novo-Methylierungsaktivität, wobei die DNMT3a und die DNMT3a2
scheinbar unterschiedliche DNA-Sequenzen bevorzugen und unterschiedliche
Funktionen in der Entwicklung einnehmen (CHEN et al. 2002). Während die
DNMT3a2 hauptsächlich in embryonalen Stammzellen und in Karzinomzellen, zum
35
Schrifttum
Teil aber auch in Hoden, Ovarien, Thymus und Milz auftritt, wird die DNMT3a
ubiquitär in allen Geweben in geringen Mengen exprimiert (CHEN et al. 2002).
Welche Bedeutung die DNMT3a in der Embryonalentwicklung besitzt, zeigt sich
besonders bei mutanten Tieren. So enden Störungen in der DNMT3a-Expression
letal für Mäuse (OKANO et al. 1999). Bei knockout-Mutationen des DNMT3a-Gens
auf dem paternalen oder maternalen Allel kommt es zu Störungen der Reproduktion,
der Embryonalentwicklung und der Erstellung geprägter Gene (Imprinting). Bei einer
Kreuzung weiblicher Wildtyp-Mäuse mit DNMT3a-mutanten männlichen Mäusen war
es nicht möglich, eine Trächtigkeit zu etablieren. Das zeigt, dass die DNMT3a auch
bei der Spermatogenese eine entscheidende Rolle spielt (KANEDA et al. 2004).
Bei einem Vergleich der relativen Menge an DNMT3a-mRNA-Transkripten bei
verschiedenen Säugetierspezies in frühen präimplantatorischen Embryonalstadien
können unterschiedliche Expressionsmuster bei den verschiedenen Spezies
beobachtet werden. So liegen hohe mRNA-Gehalte in murinen Oozyten und frühen
Embryonen vor, wobei ein signifikanter Anstieg während der Oozytenmaturation
sowie zwischen dem 8-Zell- und Morula-Blastozysten-Stadium festgestellt werden
kann (VASSENA et al. 2005). Auch beim Rhesus-Affen werden die höchsten
Mengen an DNMT3a mRNA in Oozyten und frühen Embryonen exprimiert. Hier
kommt es jedoch zu einer Abnahme der Expression vom Germinalvesikelstadium zur
Metaphase II und zu einer weiteren signifikanten Verringerung der mRNA-Gehalte
vom 2-Zell- bis zum Morula-Stadium (VASSENA et al. 2005). Bei Menschen ist die
DNMT3a-Expression durchgängig von Metaphase II-Oozyten bis hin zu Blastozysten
zu beobachten (HUNTRISS et al. 2004), während beim Rind mRNA-Gehalte vom 2Zell- bis zum Blastozystenstadium nachgewiesen werden können (GOLDING u.
WESTHUSIN 2003).
Bei bovinen Embryonen aus dem somatischen Kerntransfer kann ein signifikanter
Anstieg der DNMT3a-mRNA-Expression im Vergleich zu in vivo gewonnenen,
parthenogenetischen und IVP-Blastozysten beobachtet werden (WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003). Auch DE CAMARGO et al. (2005) berichteten über einen
signifikanten Unterschied zwischen bovinen In-vivo-Blastozysten und Blastozysten
36
Schrifttum
aus IVP und SCNT. Dabei zeigen die in vivo generierten Embryonen eine niedrigere
DNMT3a-mRNA-Expression als die Blastozysten aus IVP und SCNT.
Bei einem Vergleich früher in vivo gewonnener bzw. mittels IVP erstellter
präimplantatorischer Embryonalstadien beim Rind kann ebenfalls ein signifikanter
Unterschied in der relativen Transkriptmenge des DNMT3a-Gens bei den
verschiedenen Herkünften festgestellt werden. Der mRNA-Gehalt in 10-16-Zellern
und in Blastozysten ist dabei in vivo geringer als in vitro, während im Morulastadium
ein gegenteiliger Effekt auftritt (HÖFFMANN et al. 2006).
2.4.3.2.2 DNA-Methyltransferase 3b (DNMT3b)
Bei der DNMT3b wurden sechs verschiedene Varianten mit gewebespezifischer
Genexpression entdeckt (ROBERTSON et al. 1999). Alle bekannten Isoformen der
DNMT3b werden durch unterschiedliches Herausschneiden der Exons 10, 21 oder
22 in verschiedenen Kombinationen gebildet. DNMT3b1 besitzt die volle Länge
während bei der DNMT3b2 das Exon 10 herausgeschnitten wurde. Für diese beiden
Isoformen konnte eine DNA-Methylierungsaktivität in vitro nachgewiesen werden
(OKANO et al. 1998a; AOKI et al. 2001). Den verbleibenden vier Isoformen fehlt das
Exon 22 oder Exon 21 und 22. Diese zwei Methyltransferase-Motive sind essentiell
für die C-terminale katalytische Domäne, weshalb diese Varianten veränderte
katalytische Aktivitäten besitzen (ROBERTSON et al. 1999; CHEN et al. 2003).
BESTOR (2000) beschrieb Demethylierungen spezieller Familien wiederholter
Sequenzen und von CpG-Islands auf dem inaktiven X-Chromosom, wenn eine
DNMT3b-Aktivität fehlt. Das legt nahe, dass die DNMT3b auf die Methylierung von
bestimmten Kompartimenten des Genoms spezialisiert ist. Durch die Mutation des
DNMT3b-Gens kann es zu einem humanen Gendefekt namens ICF-Syndrom
(Immunodeficiency,
Centromere
instability and
Facial abnomalies) kommen
(BESTOR 2000). Ausserdem ist eine Überexpression von DNMT3b in Tumorzellen
zu beobachten (ROBERTSON et al. 1999).
Wie bei der DNMT3a können auch bei einem Vergleich der DNMT3b-mRNATranskripte unterschiedliche Expressionsmuster bei verschiedenen Säugetierspezies
beobachtet werden. Bei der Maus und beim Rhesusaffen liegen dabei zu der
DNMT3a reziproke Muster vor. Hier sind in Oozyten und frühen Embryonalstadien
37
Schrifttum
nur wenige DNMT3b-Transkripte nachzuweisen, wobei es zu einem deutlichen
Anstieg der Expression im Blastozystenstadium kommt (VASSENA et al. 2005).
Dagegen berichten HUNTRISS et al. (2004) über eine kontinuierliche DNMT3bExpression beim Menschen.
DE CAMARGO et al. (2005) konnten zwischen bovinen In-vivo-Blastozysten und
Blastozysten aus IVP und SCNT einen signifikanten Unterschied in der DNMT3bExpression feststellen. Dabei zeigten die in vivo generierten Embryonen eine
niedrigere Expression als die Blastozysten aus den beiden anderen Gruppen.
WRENZYCKI u. NIEMANN (2003) konnten bei einem Vergleich der Expression von
DNMT3b bei in vivo bzw. in vitro generierten sowie geklonten Embryonen keinen
signifikanten Unterschied feststellen. Auch HÖFFMANN et al. (2006) konnte keine
signifikanten Abweichungen der DNMT3b-Expression bei einem Vergleich zwischen
frühen in vivo und in vitro generierten Embryonen beim Rind nachweisen.
38
Schrifttum
2.5
Immunzytochemie
Die Immunzytochemie ist eine etablierte Standardmethode zum Nachweis der
Genexpression auf Proteinebene. Mit ihrer Hilfe können Proteine spezifisch in Zellen,
Zellkulturen oder Geweben nachgewiesen werden. Bei der Verwendung von
histologischen Schnitten wird auch oft der Begriff Immunhistochemie verwendet. Im
Gegensatz zu anderen Immunoassays (z.B. dem Westernblot) können die Proteine
mit der Immunzytochemie auf morphologischer Ebene in ihrer physiologischen Lage
dargestellt werden und so Hinweise auf physiologische Zusammenhänge und
Funktionen geben. Aus diesem Grund hat diese Nachweismethode besonders im
Bereich der Genetik, der Entwicklungs- und der Zellbiologie große Bedeutung
erlangt. Über die ersten erfolgreich durchgeführten Untersuchungen mit der
Immunzytochemie wurde in den Jahren 1950 und 1955 berichtet (COONS u.
KAPLAN 1950; COONS et al. 1955).
Untersuchungen, die nicht an Schnittpräparaten sondern an ganzen Zellverbänden
durchgeführt
werden
bezeichnet
man
als
“Whole-mount”-Immunzytochemie
(CLAYTUS 1993; LUQUE et al. 2001). Diese Methode gewinnt besonders durch die
Möglichkeit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie an Bedeutung, da hierbei in
einem intakten Organismus verschiedene optische Schnittebenen dargestellt werden
können.
2.5.1 Grundlagen der Immunzytochemie
Bei der Immunzytochemie wird ein Präparat mit spezifischen Antikörpern inkubiert.
Diese
Antikörper
sind
gegen
ein
bestimmtes
Protein
(Antigen)
in
dem
entsprechenden Präparat gerichtet. Bei der Inkubation kommt es zu einem Anlagern
der Antikörper an die Bindungsstellen des nachzuweisenden Proteins. Je nachdem,
ob die verwendeten Antikörperseren nur ein oder verschiedene Epitope eines
Antigens binden, werden monoklonale und polyklonale Antikörper unterschieden
(BESSLER 1988).
Bei polyklonalen Antiseren sind die Antikörper gegen unterschiedliche antigene
Determinanten des gleichen Antigens gerichtet. Auf Grund der Vielfalt der
enthaltenen Antikörper sind die polyklonalen Antiseren für Veränderungen an einem
39
Schrifttum
Epitop (z.B. durch Fixierung) weniger anfällig als monoklonale Antikörper, jedoch
kann
es
auch
eher
zu
unerwünschten
Kreuzreaktionen
mit
ähnlichen
Antigenstrukturen oder zu unspezifischen Hintergrundfärbungen durch andere
tierische Serumproteine bei nicht chromatografisch aufgereinigten Antiseren
kommen. Ein weiterer Nachteil ist die wechselnde Zusammensetzung und die
schlechte Standardisierbarkeit der polyklonalen Antikörper (BESSLER 1988).
Je nachdem, ob dieser Antikörper selbst bereits sichtbar gemacht werden kann oder
ein zweiter markierter Antikörper verwendet werden muß, werden direkte oder
indirekte Nachweisverfahren unterschieden (NOLL u. SCHAUB-KUHNEN 2000).
Bei der direkten Markierung wird das Präparat mit einem spezifischen, markierten
Antikörper inkubiert und kann unmittelbar im Anschluß an diese Inkubation sichtbar
gemacht werden. Dieses Verfahren ist die einfachste immunzytochemische Methode
und wird auch als „One-Step-Verfahren“ bezeichnet, da die Markierung direkt mit der
Bindung des ersten Antikörpers an dem entsprechenden Protein erfolgt. Diese
Variante wurde bei den ersten immunzytochemischen Versuchen durch COONS u.
KAPLAN (1950) eingesetzt. Im Gegensatz zur indirekten Markierung ist diese
Methode jedoch nicht sehr sensitiv, da es nicht möglich ist, den primären Antikörper
zu multiplizieren. Aus diesem Grund bleibt der Einsatz dieses Verfahrens auf
Material mit einer hohen Antigendichte beschränkt (NOLL u. SCHAUB-KUHNEN
2000).
Bei der indirekten Markierung wird ein zweiter Antikörper eingesetzt, der spezifisch
auf die Bindung am ersten Antikörper ausgerichtet ist. Da nur dieser zweite
Antikörper markiert ist, kann die Detektion erst dach dem zweiten Inkubationsschritt
erfolgen. Durch dieses Verfahren kann die Sensitivität erheblich gesteigert werden,
da mehrere markierte Sekundärantikörper an einem Primärantikörper binden können.
Auf diese Weise wird das Signal im Verhältnis zu dem Antigen verstärkt (NOLL u.
SCHAUB-KUHNEN 2000). Eine schematische Darstellung der Nachweisverfahren
zeigt die Abbildung 5.
40
Schrifttum
Direktes Nachweisverfahren Indirektes Nachweisverfahren
Abbildung 5:
Darstellung des direkten „One-Step“-Verfahrens bei dem der
primäre
Antikörper
direkt mit einem
Markierungssystem
ausgestattet ist und des indirekten „Sandwich“- Verfahrens
(mod. nach NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000).
Für die Sichtbarmachung der gebildeten Ag-Ak-Komplexe können verschiedene
Verfahren eingesetzt werden. In der Regel kommen dabei Fluoreszenz- oder Enzymgekoppelte Marker zum Einsatz (CLAYTUS 1993). Andere Möglichkeiten sind
kolloidales Gold (FAULK u. TAYLOR 1971; HOLGATE et al. 1983) oder radioaktive
Elemente (LARSSON u. SCHWARTZ 1977).
Bei der enzymatischen Markierung kommen hauptsächlich die Meerrettichperoxidase
(HRP; NAKANE u. PIERCE 1967) und die alkalische Phosphatase (MASON u.
SAMMONS 1978; BULMAN u. HEYDERMANN 1981) zum Einsatz. Seltener finden
die Galaktosidase (O´SULLIVAN et al. 1978, 1979) oder die Glukoseoxidase
(RATHLEV et al. 1981; RATHLEV u. FRANKS 1982) Verwendung. Für die
verwendeten Enzyme stehen unterschiedliche Substrate zur Verfügung, die
verschiedenfarbige Endprodukte erzeugen können.
Das erste Fluorochrom, das bei der Immunzytochemie Verwendung fand, war das
FIC (Fluorescein-Isocyanat; COONS et al. 1941, 1955). Da FIC relativ instabil ist,
wurde es später durch das stabilere Fluorescein-Isothiocyanat (FITC; RIGGS et al.
1958) ersetzt. Später wurden weitere Fluorochrome entdeckt, die für die
41
Schrifttum
Antikörpermarkierung geeignet sind. Sie alle haben unterschiedliche Anregungs- und
Emissionswellenlängen und erzeugen unterschiedliche Farbsignale. Neben dem
grün leuchtenden FITC (RIGGS et al. 1958) finden heute besonders das rote TRITC
(Tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat; SMITH et al. 1962), das ebenfalls rote
Texasred (TITUS et al. 1982), das orangefarbene Phycoerythrin (PE; OI et al. 1982)
und das blaue AMCA (7-Amino-4-Methyl-Cumarin-3-Acid; KHALFAN et al.1986)
Verwendung. Da die meisten Fluorochrome bei der Bestrahlung unter UV-Licht
ausbleichen, wurden spezielle Medien für das Einbetten der Präparate entwickelt, die
das Ausbleichen verhindern sollen (LANGANGER et al. 1983; LOGIN et al. 1993;
BERRIOS et al. 1999). Seit einigen Jahren sind weitere Fluorochrome entwickelt
worden, die auch bei längerer Bestrahlung nicht ausbleichen. Zu diesen
fotostabileren
Fluorochromen
gehören
das
Oregon
greenTM,
AlexaTM
und
verschiedene Cyanine (CyDyesTM), die jeweils in unterschiedlichen FluoreszenzFarbtönen erhältlich sind.
In der Regel geht der Inkubation in den Antikörpern eine Vorbehandlung
(Pretreatment) der Präparate vorraus. Dabei wird die entsprechende Probe zunächst
fixiert, um die morphologischen Strukturen des Gewebes aufrecht zu erhalten.
Anschließend folgt die Permeabilisierung der Zellmembranen und die Absättigung
unspezifischer Bindungsstellen in den Präparaten (Blocken).
Verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung wurden von LARSSON (1988),
CLAYTUS (1993) sowie von POLAK und VAN NOORDEN (1997) beschrieben.
Der letzte Arbeitsschritt der Immunozytochemie ist die Detektion der Ag-AkKomplexe, die in der vorliegenden Arbeit an einem konfokalen Laser-ScanningMikroskop (LSM) durchgeführt wurde.
42
Schrifttum
2.5.2 Grundlagen der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie
Die konfokale Mikroskopie wurde von Marvin Minsky im Jahr 1955 entwickelt
(beschrieben durch MINSKY 1988) und hat sich seit dem als etabliertes und weit
verbreitetes Nachweisverfahren in vielen Bereichen durchgesetzt. Besonders in der
Medizin und Biologie, wo fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen weit verbreitet
sind, wird das Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) häufig verwendet (SCHATTEN u.
PAWLEY 1988; SHOTTON u. WHITE 1989). Die Vorteile gegenüber einem
konventionellen Lichtmikroskop sind dabei vielfältig.
Bei der Verwendung eines konventionellen Lichtmikroskops wird das gesamte
Gesichtsfeld eines Präparates zur selben Zeit beleuchtet, weshalb die gesamte
Region zurückstrahlt. Zwar ist die Intensität der Exzitation im Fokusbereich am
stärksten, jedoch fluoreszieren auch die übrigen Bereiche des Präparates (PRASAD
2007). Damit ist es schwierig, dickere biologische Präparate (z.B. Zellen in ihrem
Zellverbund)
scharf
abzubilden,
da
die
scharfe
Bildinformation
aus
der
interessierenden Objektebene durch unscharfe Bildinformationen aus außerfokalen
Ebenen überlagert wird. Zusätzlich kann es bei einem simultanen Betrachten von
Mehrfachfärbungen in einem Präparat zu farblichen Durchmischungen der
Bildinformation aus den verschiedenen Kanälen kommen (WILHELM et al. 1998).
Im Gegensatz dazu erfolgt die Bestrahlung im LSM punktweise oder seriell und die
Fluoreszenz aus der bestrahlten Objektebene wird ebenso punktweise gemessen.
Dabei muss das vom Präparat zurück kommende Licht eine zweite Blende (Pinhole
= PH) passieren, durch die die Strahlen aus den außerfokalen Bereichen
ausgeblendet werden (MINSKY 1988). Diese Blende ist in einer zur Zwischenbildund Objektebene konjugierten Ebene angebracht. Der Detektor kann nur Licht
erfassen, dass diese Blende passiert hat, wodurch Streustrahlung von Gebieten
ausserhalb der Fokusebene ausgeblendet und das Bild kontrastreicher wird
(SHOTTON u. WHITE 1989).
Das Erstellen eines Bildes mit mikroskopischer Auflösung entsteht rechnerisch aus
einer Reihe der vorgenommenen Punktmessungen. Dadurch ist es möglich, in einem
dicken Präparat (bis ca. 100 µm) einzelne optische Schnitte ohne die oben
beschriebenen Nachteile darzustellen und zu einem dreidimensionalen Bild
43
Schrifttum
zusammenzufügen. Auf diese Weise kann die zelluläre Struktur von biologischen
Präparaten und ihre funktionale Bedeutung besser beurteilt werden, als mit der
herkömmlichen Lichtmikroskopie (SHOTTON u. WHITE 1989; WRIGHT u.
SCHATTEN 1991). Ein weiterer Vorteil liegt in der Möglichkeit der Kanaltrennung.
Dabei können Mehrfachfärbungen in verschiedenen Kanälen simultan aufgenommen
und dargestellt werden. Das Ergebnis kann durch das sogenannte „Multitracking“
noch erhöht werden. Bei diesem Verfahren erfolgt eine sequentielle Aufnahme der
einzelnen
Kanäle,
wodurch
eine
vollständige
Kanaltrennung
in
der
Gesamtdarstellung erreicht wird. Auf diese Weise entfällt das sogenannte
Durchbluten, bei dem ein Laser mehrere Fluoreszenzfarbstoffe mit überlappenden
Absorptionsspektren anregt und so zu Verfälschungen des Signals führt (WILHELM
et al. 1998).
Am Rechner kann für jede Probe das niedrigste und das stärkste Signal bestimmt
werden, das aus einem Präparat aufgenommen und dargestellt werden soll. Dazu
wird zunächst der „Amplifier-offset“ eingestellt, der festlegt, welche Intensität als
minimales Signal aufgenommen werden soll. Über den „Detector-gain“ kann
anschließend das stärkste Signal festgelegt werden. Auf diese Weise kann ein
Verlust an Information (Fluoreszenzsignal) aus der Probe vermieden werden
(WILHELM et al. 1998).
In Abbildung 6 ist der Aufbau und der Strahlengang in einem konfokalen LaserScanning-Mikroskop schematisch dargestellt.
44
Schrifttum
Detektor
Emissionsfilter
Konfokale Blende
Strahlaufweitung
Farbteiler
Laser
Linse
Mikroskop-Objektiv
Fokusebene
Hintergrund
Detektionsvolumen
Abbildung 6:
Schematische Darstellung eines konfokalen Laser-ScanningMikroskops (mod. nach WILHELM et al. 1998)
45
Schrifttum
2.6
Untersuchungen auf Proteinebene in präimplantatorischen Embryonen
Für die Untersuchung von Proteinen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung.
So kann der Proteingehalt mittels Westernblot oder mithilfe immunzytologischer
Verfahren (Fluoreszenzintensität) nachgewiesen werden. Die Darstellung der
Proteinlokalisation in einem Gewebe erfolgt mittels Immunzytologie.
In
präimplantatorischen
Embryonen
wurden
diverse
Untersuchungen
zu
verschiedenen Proteinen durchgeführt. Diese Untersuchungen betrafen zum einen
den Proteingehalt in Embryonen (Tabelle 4a), zum andern aber auch die
Proteinlokalisation (Tabelle 4b). Dabei konnten auf Proteinebene auch Unterschiede
bei Embryonen verschiedener Herkunft (In-vivo-Gewinnung, In-vitro-Produktion,
SCNT) sichtbar gemacht werden. Diese Aberrationen können sowohl die Menge an
exprimiertem Protein als auch die Lokalisation der Proteine in der Zelle bzw. im
Embryo betreffen (Tabelle 4c).
46
Schrifttum
Tabelle 4a: Untersuchungen des Proteingehalts mittels Westernblot/
Immunfluoreszenzintensität (IF) in präimplantatorischen
Embryonen
Spezies Herkunft der
Embryonen
Rind
Oozyten und
IVP-Embryonen
Betroffenes Protein Beschriebene Ergebnisse und
(Nachweisverfahren) Autoren
• DNMT1
• Niedrige Proteingehalte in
(Westernblot)
Oozyten und Embryonen
• Signifikanter Anstieg in 16-ZellEmbryonen und Morulae
(RUSSEL u. BETTS 2005)
Maus
MII-Oozyten und
• DNMT1s
• Keine Detektion der DNMT1s
in vivo fertilisierte/
• DNMT1o
• Deutliche Detektion der DNMT1o
in vitro kultivierte
(Westernblot)
Embryonen
(MERTINEIT et al. 1998;
HOWELL et al. 2001;
RATNAM et al. 2002)
Maus
MII-Oozyten und
In-vivo-Embryonen
• DNMT1s
• Abfall des DNMT1s-Gehaltes im
(Westernblot)
2- und 4-Zell-Stadium
• Maximaler Proteingehalt in
(Zygoten - 8-Zeller,
Blastozysten)
Blastozysten
• Mat. DNMT1s in Zygoten 2-Zellern
• Zygotische DNMT1s ab
2-Zeller
(CIRIO et al. 2008)
Maus
Oozyten und In-
• GLUT1
• GLUT1-Detektion in Oozyten und
vivo-Embryonen
• GLUT2
präimplantatorischen Embryonen
• GLUT2-Detektion zuerst in
• GLUT4
(Westernblot)
Blastozysten
• Keine GLUT4-Detektion in
Oozyten oder Embryonen
(AGHAYAN et al. 1992)
47
Schrifttum
Tabelle 4a: Untersuchungen des Proteingehalts mittels Westernblot/
Immunfluoreszenzintensität (IF) in präimplantatorischen
Embryonen (Fortsetzung)
Spezies Herkunft der
Embryonen
Maus
Kumulus-OozytenKomplexe in vitro
Betroffenes Protein Beschriebene Ergebnisse und
(Nachweisverfahren) Autoren
• Protease Adamts1 • In vivo gereifte KOKs:
• Hyaluronan
Deutliche Adamts1 und
gereift mit epidermal
bindendes
Versican-Protein-
growth factor und/
Proteoglykan
Expression
oder FSH vs.
Versican
In vivo gereifte
(Westernblot)
• In vitro gereifte KOKs: Weder
KOKs
Adamts1 noch Versican
detektierbar
(DUNNING et al. 2007)
Maus
Oozyten und
• Fas
In-vivo-Embryonen
• Fas L
• Ovulierte Oozyten 2-Zell-Embryonen:
Keine Proteinexpression
(IF)
• 8-16-Zell-Stadium - Blastozyste:
Deutlich zunehmende
Proteinexpression
(KELKAR et al. 2003)
48
Schrifttum
Tabelle 4b: Untersuchungen zur Proteinlokalisation mittels Immunfluoreszenz
in präimplantatorischen Embryonen
Spezies Herkunft der
Embryonen
Rind
Oozyten und IVP-
Betroffenes Protein
• DNMT1
Embryonen
Beschriebene Ergebnisse und
Autoren
• Zytoplasmatisch in Oozyten und
Embryonen
• Nukleär in 16-Zell-Embryonen
und frühen Blastozysten
• Nukleär/zytoplasmatisch in ICM
und zytoplasmatisch in TE
expandierter Blastozysten
(RUSSEL u. BETTS 2005)
Maus
MII-Oozyten und in
• DNMT1s
• Keine Detektion der DNMT1s
vivo fertilisierte
• DNMT1o
• DNMT1o zytoplasmatisch in
Embryonen (vom 2-
Oozyten und Embryonen
• Nukleär in 8-Zell-Embryonen
Zell-Embryo –
Blastozyste in vitro
(MERTINEIT et al. 1998;
kultiviert)
HOWELL et al. 2001;
RATNAM et al. 2002)
Maus
MII-Oozyten und in
• DNMT1s
• Maternale DNMT1s in 2-Zell-
vivo Embryonen
Embryonen: Zytoplasma und Kern
• Zygotische DNMT1s ab dem 2-
(Zygote - 8-Zeller,
Blastozysten)
Zell-Stadium: Zytoplasma und
Kern
(CIRIO et al. 2008)
49
Schrifttum
Tabelle 4b: Untersuchungen zur Proteinlokalisation mittels Immunfluoreszenz
in präimplantatorischen Embryonen (Fortsetzung)
Spezies Herkunft der
Betroffenes Protein
Embryonen
Maus
In-vivo-Blastozysten • Oct-4
Beschriebene Ergebnisse und
Autoren
• Maus: In der ICM
Schwein der Maus vs.
• Schwein: In der ICM und im TE
Rind
• Rind: In der ICM und im TE
In-vivo-/In-vitroBlastozysten des
(KIRCHHOF et al. 2000)
Schweins vs.
In-vivo-/In-vitroBlastozysten des
Rindes
Maus
Oozyten und
• GLUT1
• GLUT1: In der ICM und im TE
In-vivo- Embryonen
• GLUT2
• GLUT2: Auf TE-Membranen
• GLUT4
rund um die Blastozysten-Höhle
(AGHAYAN et al. 1992)
Rind
Oozyten und
• MATER
• GV-Oozyten: Im Zytoplasma
• Gereifte Oozyten:
In-vitro-Embryonen
Im Zytoplasma
• Zygoten - 8-Zell-Embryo:
Im Zytoplasma;
zunehmende Färbung im
Bereich des Chromatins
• Expandierte Blastozysten:
Gleichmäßig in ICM/TE
• Geschlüpfte Blastozysten:
Starke Abnahme
(PENNETIER et al. 2006)
50
Schrifttum
Tabelle 4c: Untersuchungen zu Aberrationen bei präimplantatorischen
Embryonen aus unterschiedlicher Produktion mittels Westernblot oder
Immunfluoreszenz (IF)
Spezies Herkunft der
Embryonen
Maus
in vivo fertilisierte
Zygoten aus
In-vitro-Kultur
Betroffenes Protein Beschriebene Ergebnisse und
(Nachweisverfahren) Autoren
• DNMT1s
• Abnormale Expression der
• DNMT1o
somatischen Isoform (DNMT1s)
bei geklonten Embryonen
(IF)
• Fehlende nukleäre Translokation
vs. Embryonen aus
SCNT
der oozytenspezifischen Isoform
(DNMT1o) in geklonten 8-ZellEmbryonen
(CHUNG et al. 2003)
Maus
in vivo fertilisierte
• TRP53
• Erhöhte TRP53 Expression in in
Zygoten aus
(Proteinexpr. :
vitro kultivierten Morula-
In-vitro-Kultur
Westernblot)
/Blastozysten-Stadien
vs. ex vivo
(Lokalisation: IF)
• Verstärkte Anreicherung von
gewonnene
TPR53 im Nukleus in in vitro
Embryonen
kultivierten Blastozysten
(CHANDRAKANTHAN
et al. 2006)
Pferd
Embryonen aus IVP • OC-1 (Kapsel-
• Fehlende Kapselbildung bei IVP-
vs. ex vivo
Glyko-Protein)
Embryonen aufgrund fehlender
gewonnene
(IF)
Glykoproteinaggregation
Embryonen
(TREMOLEDA et al. 2003)
51
Material und Methoden
3 Material und Methoden
Die Zusammensetzung und Herstellung aller verwendeten Medien, sowie die
Herkunft der eingesetzten Chemikalien ist, soweit nicht anderweitig beschrieben, im
Anhang (Kap.8) aufgeführt.
3.1
In-vitro-Produktion von Rinderembryonen (IVP)
Die In-vitro-Produktion von Rinderembryonen setzt sich aus den drei Teilschritten der
Eizellreifung (In-vitro-Maturation), der Befruchtung (In-vitro-Fertilisation) und der
Kultur (In-vitro-Kultur) zusammen. Im Rahmen dieses Versuches wurden von März
2006 bis Februar 2008 routinemäßig ca. einmal die Woche In-vitro-Embryonen
produziert.
3.1.1 Gewinnung
und
In-vitro-Maturation
(IVM)
von
Kumulus-Oozyten-
Komplexen (KOKs)
Die Ovarien für die Gewinnung der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) wurden am
Schlachthof Lübbecke unabhängig von Alter, Zyklusstand oder Rasse der Tiere von
Schlachthofmitarbeitern gesammelt und während des Transports nach Mariensee
(1h) in Thermobehältern mit 30°C warmer 0,9%iger Na Cl-Lösung gelagert. Vor der
Isolierung der Oozyten wurden anhaftende Gewebereste an den Ovarien entfernt
und zystische Eierstöcke aussortiert. Anschließend wurden die übrigen Ovarien
dreimal mit je 300ml 30°C warmer 0,9%iger NaCl-Lösung mit 0,06g/l Penicillin und
0,1g/l Streptomycin gewaschen. Die Isolierung der Oozyten erfolgte durch die
Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995), wobei die Oberfläche der Ovarien in
einem Medium aus PBS + Heparin (2 I.E./500mL) + 0,1% BSA (Fraktion V) mittels
eines Vielklingenmessers angeritzt und die Oozyten in das entsprechende Medium
überführt wurden. Nach zehnminütiger Sedimentation in einem Becherglas wurden
die KOKs mit Hilfe eines Stereomikroskops bei 20-facher Vergrößerung aus dem
Sediment herausgesucht und in TCM air gesammelt. Bei der anschließenden
Selektion der KOKs fanden nur Oozyten mit mindestens drei Lagen Cumulus
oophorus und homogenem, dunklen und gleichmäßig granulierten Zytoplasma
(KOKs der Klasse 1) oder solche mit stellenweise weniger als drei Kumuluszelllagen
52
Material und Methoden
und homogenem, dunklen Zytoplasma (Klasse 2) Verwendung. Diese KOKs wurden
anschließend
dreimal in TCM + BSA (0,1%) gewaschen und danach für 22-24
Stunden in mit Silikonöl (SERVA, DC200 fluid) überschichteten 100µl großen Tropfen
TCM + BSA (0,1%) + eCG (10 I.E./ml; Suigonan, Intervet) + hCG (5 I.E./ml;
Suigonan, Intervet) im Inkubator bei 39°C und 5% CO2 gereift.
3.1.2 In-vitro-Fertilisation boviner Embryonen (IVF)
Vierundzwanzig Stunden nach der IVM fand die Befruchtung der gereiften Oozyten
mit Tiefgefriersperma eines IVF-tauglichen Bullen statt (Zauberer 414382, Masterrind
2002). Die Spermaprobe wurde zunächst ca. eine Minute bei 30°C im Wasserbad
aufgetaut und anschließend mittels ISO-Percoll-Verfahren auf die anschließende Invitro-Fertilisation vorbereitet. Dazu wurde das Sperma auf 750 µl 90%iges ISOPercoll gegeben und 16 Minuten zentrifugiert (0,4 rcf), wobei die intakten Spermien
durch das Percoll im Eppendorf-Cup nach unten wanderten. Anschließend wurde der
Überstand aus Percoll, Gefrierschutzmittel und toten bzw. geschädigten Spermien
abgenommen. Danach fand eine weitere Zentrifugation (0,4 rcf) des Sediments mit
750µl Fert.-Talp für drei Minuten statt. Zum Schluß wurde das daraus resultierende
Sediment erneut drei Minuten mit 750µl Fert.-Talp + HHE (0,1 I.E./ml Heparin, Serva
Cat. Nr.24590, 177 I.E./mg; 10µM Hypotaurin, Sigma H 1384, MG 109,1; 1µM
Epinephrin, Sigma E 4250, MG 183,2) zentrifugiert (0,4 rcf). In der Zwischenzeit
wurden die KOKs dreimal in 100 µl Tropfen Fert.-Talp gewaschen und in 100µl
Tropfen Fert.-Talp + HHE-Medium unter Silikonöl umgesetzt. Nach der letzten
Zentrifugation der Spermien wurde der Überstand bis auf 100µl abgenommen und
die Spermiendichte des Sediments bei einer 1:50 Verdünnung mit Wasser durch
Auszählen in der Thoma- oder Neubauer-Kammer bestimmt. Anschließend erfolgte
die Zugabe der errechneten Spermiensuspension (ca. 1,2 µl; Soll-Dichte von 1 x 106
Spermien/ml) zu den Oozyten in dem Fert.-Talp + HHE-Medium. Für die Befruchtung
wurden die Gameten für 18 Stunden bei 39°C und 5% C O2 koinkubiert.
53
Material und Methoden
3.1.3 In-vitro-Kultur boviner Embryonen (IVC)
Die Kumuluszellen der entstandenen Zygoten wurden 18 Stunden nach der IVF
durch Schütteln in 37°C warmem TCM-air mit Hilfe ei nes Mini-Shakers mechanisch
entfernt. Anschließend wurden die Embryonen in SOFaa (m)-Kulturmedium (HOLM
et al. 1999) gewaschen und in 30 µl SOFaa-Tropfen unter Öl kultiviert. Diese
Kultivierung fand in modularen Inkubator-Kammern (ICN Biomedicals Inc., Aurora,
No. 615300, Ohio) unter reduzierter Sauerstoff-Atmosphäre bei 5% O2, 5% CO2 und
90% N2 statt, wobei die Temperatur 39°C betrug. Die Dauer der IVC richtete sich
nach dem Auftreten der gewünschten Stadien (Tab. 5, Kap. 3.3).
3.2
Gewinnung von In-vivo-Embryonen
3.2.1 Verwendete Tiere und deren vorherige und anschließende Nutzung
Für die Versuche wurden insgesamt 76 Färsen aus der Herde des Friedrich-LoefflerInstituts (FLI), Institut für Nutztiergenetik in Mariensee, im Alter von 13 - 25 Monaten
verwendet.
Während des Vorversuches wurden von April 2006 bis Dezember 2006 insgesamt 26
Tiere zum Erlernen der Technik der transvaginalen Endoskopie verwendet. Der
Hauptversuch fand von Januar 2007 bis Februar 2008 statt. In diesem Rahmen
wurden insgesamt 50 Rinder eingesetzt und zum Teil mehrfach (bis zu dreimal)
zyklussynchronisiert und superovuliert. Von diesen Tieren dienten 40 Färsen
ausschließlich der Gewinnung von Embryonen mittels transvaginaler Endoskopie, 5
Rinder kamen sowohl bei der transvaginalen Endoskopie als auch bei den alleinigen
Uterusspülungen zum Einsatz und bei 5 Tieren wurde ausschließlich eine
Uterusspülung durchgeführt. Von den 40 ausschließlich endoskopisch genutzten
Färsen wurden 3 Tiere doppelt und ein Tier dreimal endoskopiert.
Die Färsen wurden überwiegend im Stall gehalten und mit einer Mischung aus
Grassilage und Mineralfutter gefüttert. Von Mai bis November befand sich ein Teil
der Tiere auf der Weide. Für die Zyklussynchronisation und Superovulation wurden
die Färsen aufgestallt. Im Alter von 7-10 Monaten wurden bei denselben Tieren
bereits andere Versuche durchgeführt (OPU bei Kälbern). Die Rinder der
54
Material und Methoden
Vorversuche wurden nach Beendigung der Endoskopieexperimente besamt oder
gingen in andere Versuche ein. Von den 50 Rindern aus dem Hauptversuch wurden
41 Tiere für einen weiteren endoskopischen Versuch (Transfer von Zygoten in den
Eileiter und temporäre Eileiterkultur) eingesetzt. Im Anschluß an diese Experimente
wurden die Tiere in einem der folgenden Zyklen besamt. Im März 2008 hatten von
den 50 Färsen aus dem Hauptversuch bereits drei Tiere ohne Komplikationen
abgekalbt. Ausserdem waren 33 Rinder tragend und 9 Tiere besamt. Ein Rind wurde
aufgrund einer hochgradigen Lahmheit geschlachtet und ein Tier verstarb zwei
Wochen nach dem zweiten endoskopischen Versuch in Folge eines Genickbruchs.
3.2.2 Brunstsynchronisation und Superovulation der Tiere
Vor Beginn der Versuche fand eine Untersuchung der Färsen auf ihre Allgemein- und
Geschlechtsgesundheit hin statt. Tiere mit Anomalien im Genitalbereich wurden von
den Versuchen ausgeschlossen. Zunächst wurde bei den Rindern unabhängig von
ihrem Zyklusstadium eine Luteolyse mit 2,5 ml eines Prostaglandinanalogons
(PGF2α, Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate®, Essex Tierarznei) intramuskulär
(i.m.) ausgelöst. Eine Injektion von 2 ml eines GnRH-Analogons (Buserelinacetat,
Receptal®, Intervet) erfolgte 48 Stunden später intravenös (i.v.). Daraufhin zeigte der
überwiegende Teil der Rinder 24-48 Stunden nach der zweiten Injektion deutliche
Brunstsymptome. Dieser Tag wurde für alle Tiere als Tag 1 des neuen Zyklus
genommen. Am Tag 12 des neuen Zyklus erfolgte eine weitere Gabe von 2,5 ml
Estrumate® i.m. und
48 Stunden später die intravenöse Injektion von 2 ml
Receptal®. Wiederum 24-48 Stunden später kamen die Tiere in Brunst. An Tag 9
dieses neuen Zyklus wurden bei allen Tieren die Follikel mit einem Durchmesser von
über 0,5 cm mit Hilfe einer ultraschallgeleiteten Sonde abpunktiert. Beginnend 48
Stunden nach der Follikelpunktion wurden die Tiere vier Tage lang 2 mal täglich
mittels eines FSH/LH-Präparates i.m. (Pluset®, Laboratorios Calier S.A., Spanien)
superovuliert (Gesamtdosis 500 I.U. pro Tier). Dabei wurde die Menge an
eingesetztem Pluset® von 2 ml (entspr. 100 I.U. Follitropin und 100 I.U. Lutropin) am
ersten Tag über 1,5 ml am zweiten Tag und 1 ml am dritten Tag auf 0,5 ml am
vierten Tag der Superovulation reduziert. Bei der sechsten und siebten Injektion
erfolgte zeitgleich auch eine Injektion von je 2 ml Estrumate®. Nahezu alle Färsen
55
Material und Methoden
zeigten 24 Stunden nach der letzten Injektion äusserlich deutliche Brunstsymptome.
Zu diesem Zeitpunkt fand sowohl bei den sichtbar brünstigen als auch bei den
stillbrünstigen Tieren bereits die erste Besamung mit Tiefgefriersperma des selben
Bullen wie bei der IVF (Zauberer 414382, Masterrind 2002) und gleichzeitig eine
Injektion von 4
ml Receptal® i.v. zur Auslösung der Ovulation statt. Jeweils im
Abstand von 12 Stunden folgten zwei weitere Besamungen.
E
R
E
R
E
R
-3 -2 -1 0 1 2 ... 12 13 14 0 1 2 ... 9 10 11 12 13 14 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Pluset

E: Estrumate

KB: künstliche Besamung
Punktion
der dom.
Follikel
Abbildung 7:
Darstellung
R: Receptal

Schematische
EmbryonenSpülungen
KB
der
Synchronisation
und
Superovulation
3.2.3 Medien zur Embryonengewinnung
Für die Eileiter- und Uterusspülungen wurde PBS-Lösung (Phosphate buffered
Saline) mit einem Zusatz von 1% NBCS (New born calf serum) verwendet. Die PBSLösung wurde max. 2 Tage vor den geplanten Spülungen aus tiefgefrorenen
Stocklösungen frisch angesetzt und bis zu ihrer Verwendung bei 4°-6°C gelagert.
Das NBCS war in 10 ml Aliquots tiefgefroren und wurde unmittelbar vor der Spülung
aufgetaut und dem PBS zugegeben. Für die Spülung wurde die fertige Lösung im
Wasserbad auf 37°C erwärmt.
56
Material und Methoden
3.2.4 Gewinnung früher Embryonalstadien (Tag 1 - 4 der Entwicklung) aus
dem Eileiter des Rindes
3.2.4.1 Instrumente zur transvaginalen endoskopischen Eileiterspülung
•
Universalschaft mit Hahn zur Luftinsufflation (STORZ 66016 EA, ∅12,5 mm,
Länge 49,5 cm; vgl. Abb. 8a, b)
•
Stumpfer Obturator (STORZ 66016 EB, ∅ 12,5 mm, Länge 49,5 cm;
Abb. 8a, b)
•
Obturator mit Dreikantspitze (STORZ 66016 EB, ∅ 12,5 mm, Länge 49,5 cm;
Abb 8a, b)
•
Innenschaft mit Arbeitskanal für Transferkatheter (Storz 66016 B; Abb. 8a, b)
•
Eileiterspülkanüle „Modell Mariensee“ aus Metall mit aufgesetztem ca. 70 cm
langem Kunststoffschlauch (Original-Perfusor, B. Braun, Mellsungen 8722960;
Abb. 8c)
•
HOPKINS Geradeausblick-Optik 0° ( ∅ 5,5 mm) mit eingebauter FiberglasLichtleitung (Storz 61015 A; Abb. 8a)
•
KARL STORZ Endovision TELECAM DX, Farbsystem PAL (STORZ
69232001), mit
o 400A Netzkabel
o TELECAM C-Mount Kamerakopf (STORZ 20212034; Abb. 8d)
o TELECAM DX Kamera-Kontrolleinheit (CCU; STORZ 20232020)
o C-Mount Objektiv, einlegbar (STORZ 20200042)
o BNC-Verbindungskabel (STORZ 536 MK)
o S-VHS (Y/C)-Verbindungskabel (STORZ 547 S)
o 2 Verbindungskabel zur Ansteuerung von Video-Printern oder VideoRecordern (STORZ 20221070)
•
Kaltlicht-Fontäne HALOGEN 250twin (STORZ 20113301) einschließlich 400A
Netzkabel (Abb. 8d)
•
Fiberglas-Lichtkabel (STORZ 69495 NA, ∅ 3,5 mm; Abb. 8d)
•
36 cm Farbmonitor (Panasonic MV-CM 1480)
•
DVD-Recorder (Panasonic DMR-E 100)
57
Material und Methoden
Im Anschluß an jede Endoskopie wurden die Instrumente unter fließendem Wasser
vorgereinigt und anschließend in eine 4 %ige Desinfektionslösung (Korsolex plus,
Bode Chemie, Hamburg) gelegt. Nach 60 Minuten wurden die Geräte mit sterilem
H20bidest abgespült.
Universalschaft
Stumpfer Obturator
Spitzer Obturator
Innenschaft
Endoskop
Abbildung 8a: Übersicht über die Instrumente zur transvaginalen Endoskopie
(ca. 7-fache Verkleinerung)
Universalschaft
Stumpfer Obturator
Abbildung 8b: Detailaufnahmen
Spitzer Obturator
der
Instrumente
Innenschaft
zur
transvaginalen
Endoskopie (Originalgröße)
Abbildung 8c: Spülkanüle Modell Mariensee (ca. 1,3-fache Verkleinerung)
58
Material und Methoden
Kameraeinheit
Lichtquelle
Lichtkabel
Abbildung 8d: Bildgebende Geräte
Abbildungen 8a- 8d:
Instrumente zur transvaginalen Endoskopie beim Rind
3.2.4.2 Instrumente zur Uterusspülung
Für die Spülung des Uterus wurden Uterusspülkatheter (Minitüb 19005/0016; Abb. 9)
verwendet, die anschließend an eine Spülsystempumpe (Fa. VETEC, Rostock; Abb.
9 links) angeschlossen wurden.
Spülsystempumpe
Abbildung 9:
Uterusspülkatheter
Instrumente zur Uterusspülung
59
Material und Methoden
3.2.4.3 Durchführung der transvaginalen endoskopischen Eileiterspülung
Der Zeitpunkt der Eileiter-Spülungen ergab sich aus dem erwarteten Zeitpunkt des
Auftretens der gewünschten Embryonalstadien (Tab. 5, Kap. 3.3). Als Vorbereitung
wurden die Tiere ca. 12 Stunden vor der Endoskopie genüchtert, um einen größeren
Lufteinstrom in die Bauchhöle und dadurch mehr Platz für die transrektale
Manipulation während der Endoskopie zu erhalten. Für die Versuchsdurchführung
wurden die Rinder in einen Zwangsstand gebracht. Dort erhielten sie eine
Epiduralanästhesie mit 4 ml Procainhydrochlorid (Procasel 2%, Selectavet)
zwischen dem letzten Kreuz- und dem ersten Schwanzwirbel, um eine Relaxierung
des Enddarms und eine Anästhesie im Bereich der Beckenorgane zu erreichen.
Nach Eintritt der Wirkung wurde der Schwanz der Tiere zur Seite gebunden und das
Rektum manuell entleert. Anschließend wurden Vulva und Perineum zunächst
trocken
gereinigt
und
danach
mit
einem
Schleimhautdesinfektionsmittel
(Octenisept, Schülke&Mayr) besprüht. Dann wurde der Uterusspülkatheter durch
Scheide und Zervix zunächst in das linke Uterushorn eingeführt und durch Aufblasen
des Ballons mit ca. 15 ml Luft in der Spitze des Horns fixiert.
Für die transvaginale Endoskopie wurde das Endoskop mit der linken Hand geführt,
während die Manipulationen im Tier transrektal mit der rechten Hand vorgenommen
wurden. Für die eigentliche Eileiter-Spülung und das Anreichen der Instrumente war
eine Hilfsperson erforderlich.
Für den transvaginalen Zugang wurde zunächst der Universalschaft mit dem
stumpfen Trokar von der Hilfsperson in die Scheide eingeführt und das Trokarset
anschließend unter rektaler Kontrolle vom Operateur nach cranial bis zur Fornix
vaginae vorgeschoben. Etwa 3 cm caudodorsal der Zervix ist die Vaginalwand
lediglich wenige Millimeter dick und lässt sich an dieser Stelle gut durchstoßen.
Nachdem mit dem stumpfen Trokar die entsprechende Stelle am Vaginaldach
aufgesucht und der Universalschaft dort manuell fixiert wurde, erfolgte der Austausch
des stumpfen Trokars gegen den Trokar mit Dreikantspitze. Danach führte der
Operateur transrektal eine Kontrolle des Bereiches vor der Trokarspitze durch, um
eine Verletzung von Becken- und Bauchhöhlenorganen (u.a. Arteria iliaca, Blase,
Rektum, Pansen, Niere, knöchernes Becken) beim Vorstoßen des Trokars zu
60
Material und Methoden
vermeiden. Für das Durchstoßen des Scheidendaches wurde die Trokarspitze leicht
nach rechts cranioventral geneigt und das Rektum durch die darin liegende Hand zur
linken Seite gezogen, damit es zu keiner Perforation des Darmes kam. Anschließend
wurde das Vaginaldach und das Bauchfell mit einem Ruck perforiert, wobei der
Trokar ca. 5 cm weit in die Beckenhöhle vorgeschoben wurde. Dabei war ein rasches
Vorgehen notwendig, um ein großflächiges Ablösen des Peritoneums von der
Bauchwand zu vermeiden. Nach der Entfernung des spitzen Trokars aus dem
Universalschaft kam es zu einem deutlich vernehmbaren passiven Einstrom von Luft
in die Bauchhöhle, wodurch Raum für die Manipulationen während der Endoskopie
geschaffen wurde. Danach wurde der Innenschaft mit der sich im Arbeitskanal
befindlichen Spülkanüle mit aufgesetztem Kunststoffschlauch und dem Endoskop in
den Universalschaft eingeführt (vgl. Abb. 10).
Abbildung 10: Innenschaft mit Eileiter-Spülkanüle und Endoskop (links),
Spülkanüle mit flexiblem Schlauch (Mitte) und Innenschaft mit
Endoskop (rechts)
Nach der Befestigung des Lichtkabels und der Kamera am Endoskop konnte das
endoskopische Bild auf einen Monitor übertragen und gleichzeitig auf DVD
aufgenommen werden.
Als erster Schritt der Endoskopie erfolgte die Beurteilung der Ovarien und die
Erfassung der Anzahl an Corpora lutea. Anschließend wurde das linke Ovar in seiner
physiologischen Lage von der Bauchwand abgehoben und im Urzeigersinn um 180°
gedreht, um den Eileiter sichtbar zu machen. Dazu wurde das Ovar zwischen
Daumen und Mittelfinger in der rechten Hand gehalten, wobei die Hand des
Operateurs in Pronation zur Medianen hin abgewinkelt wurde. Dadurch lagen das
Infundibulum sowie die Ampulle des linken Eileiters über dem Zeigefinger. In dieser
Lage konnten die Blätter des Infundibulums mit der Spülkanüle soweit ausgestrichen
61
Material und Methoden
werden, dass der Übergang zwischen Trichter und Eileiterampulle gut sichtbar
wurde. Als nächster Schritt musste dann die Spülkanüle zwischen die Blätter des
Trichters eingefädelt und über die Ampulle anschließend ca. 3-5 cm weit in den
Eileiter vorgeschoben werden. Nach der erfolgreichen Insertion der Spülkanüle
wurde der linke Eileiter langsam mit 20-40 ml Spülflüssigkeit orthograd gespült,
wodurch die
gelangten.
Stadien aus dem Eileiter in die Spitze des linken Uterushorns
Anschließend
konnten
die
Embryonen
mittels
Spülung
der
Uterushornspitze mit 500 ml Spülflüssigkeit über den Uterusspülkatheter gewonnen
werden (vgl. Kap. 3.2.5). Um den rechten Eileiter zu spülen, wurde zunächst der
Innenschaft mit Endoskop und Spülkanüle entfernt und anschließend der
Uterusspülkatheter in die rechte Hornspitze umgesetzt. Danach wurden die
Instrumente für die Endoskopie erneut in den Universalschaft eingeführt und das
rechte Ovar aufgesucht. Auf dieser Seite wurde der Eierstock mit dem Zeigefinger
und Daumen in seiner physiologischen Lage angehoben und diesmal entgegen dem
Uhrzeigersinn um 180° gedreht. Dadurch kamen das In fundibulum und die Ampulle
des rechten Eileiters auf dem Ring- und und dem kleinen Finger der rechten Hand zu
liegen. In dieser Position konnte der Trichter wieder mit der Spülkanüle soweit
ausgestrichen werden, dass die Ampulle deutlich sichtbar wurde. Im weiteren wurde
wie auf der linken Seite vorgegangen. Im Anschluß an die Spülungen wurden die
Instrumente aus dem Universalschaft entfernt und die eingeströmte Luft über eine
mit dem Schaft verbundene Vakuumleitung vorsichtig abgesogen. Anschließend
wurde der Universalschaft rasch herausgezogen. Um einer Endometritis nach der
Endoskopie vorzubeugen, wurden anschließend 20 ml einer 5%igen jodhaltigen
Lösung (Lugolsche Lösung konzentriert, WDT) in die Uterushörner gegeben.
Im Labor wurde die bei der Uterus-Spülung zurück gewonnene Flüssigkeit durch ein
Metallsieb mit einer Porengröße von 50 µm (Jürgens, Hannover) gefiltert und der
Inhalt des Siebes mit frischem Medium in eine Petrischale gespült. Unter einem
Stereomikroskop (Nikon SMZ-2B) konnten die Embryonen anschließend bei
20facher Vergrößerung aus dem Sediment in der Schale herausgesucht und für die
weiteren Untersuchungen in 3,7%igem PFA (Paraformaldehyd, Sigma) in PBS fixiert
werden.
62
Material und Methoden
Ampulle
Trichter
Eileiter
Trichter und Ampulle des rechten Eileiters
Spülkanüle
Eileiter
Trichter
In die Ampulle inserierte Spülkanüle
Eileiter
Trichter
Spülung des Eileiters
Abbildung 11: Durchführung der endoskopischen Eileiterspülung
63
Material und Methoden
3.2.5 Gewinnung früher Embryonalstadien (Tag 4,5 - 8 der Entwicklung) aus
dem Uterus des Rindes
Für die Gewinnung der Embryonen aus dem Uterus wurde ein Uterusspülkatheter
verwendet, der unter rektaler Kontrolle vaginal eingeführt und anschließend durch
den Zervikalkanal bis in das vordere Drittel des Uterushorns vorgeschoben wurde.
Anschließend konnte der Katheter in der richtigen Lage fixiert werden, indem der
sich in der Spitze befindliche Ballon mit einer Spritze mit ca. 15 ml Luft aufgeblasen
wurde (vgl. Abb 12). Über den Uteruskatheter konnte dann mit Hilfe einer speziellen
Pumpe die Spülflüssigkeit in die Uterushornspitze gepumpt werden. Durch das
System der kommunizierenden Röhren kam es anschließend über die Löcher im
Katheter zu einem passiven Zurücklaufen der eingegebenen Flüssigkeit, wobei die
Embryonalstadien aus der Hornspitze mit herausgespült wurden. Im Anschluß
konnten die Embryonen wie bei der transvaginalen Endoskopie aus der
zurückgewonnenen Flüssigkeit heraus gesucht werden.
Abbildung12:
Querschnitt
durch
eine
Uterusspülkatheter
64
Gebärmutter
mit
inseriertem
Material und Methoden
3.3
Morphologische Beurteilung boviner Embryonen
Für die anschließenden immunzytochemischen Untersuchungen wurden die
Embryonen anhand ihres Alters und Entwicklungsstadiums (gemessen an Zellzahl
und Erscheinungsbild) eingeteilt. Für die weiteren Versuche wurden nur solche
Embryonen verwendet, bei denen das Stadium dem zu dem jeweiligen Zeitpunkt
erwarteten
Stadium
entsprach.
Degenerierte,
retardierte
Embryonen
und
unbefruchtete Eizellen wurden von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen.
Dementsprechend traten die Embryonalstadien zu folgenden Zeitpunkten auf (vgl.
Tab. 5):
Tabelle 5: Definition und Auftreten der für die weiteren Untersuchungen
erwünschten Stadien
Stadium
Morphologie
IVP
Spülung
Zygoten:
Einzeller mit 2 Polkörpern/Vorkernen;
ca. 18h
d 1-2
befruchtete Eizelle
nach IVF
Embryonen mit 2 Blastomeren
ca. 30h
2-Zeller:
d 1,5-2
nach IVF
4-Zeller:
Embryonen mit 4 Blastomeren
ca. 40h
d 1,5-2
nach IVF
8-Zeller:
Embryonen mit 8 Blastomeren
ca. 76h
d 2-4
nach IVF
10-16-Zeller:
Embryonen mit 10-16 Blastomeren
4-tägige IVC
d 3-4
Kompaktierte Embryonen mit mehr als 16 Zellen,
5-tägige IVC
d 5-6
7-tägige IVC
d 7-8
Morulae:
verschwommenen Blastomerengrenzen,
vergrößertem perivitellinen Raum
Blastozysten: Embryonen mit deutlichem Blastozoel,
Ausbildung der ICM (Inner Cell Mass) und
des Trophektoderms, verdünnte Zona
pellucida, durch die Ausdehnung des
Embryos nahezu kein perivitelliner Raum
erkennbar
65
Material und Methoden
Für die Beurteilung der Embryonen wurden die Vorgaben der IETS (ROBERTSON u.
NELSON 1998) verwendet. In die anschließenden Versuche gingen nur Embryonen
ein, deren Qualität als gut oder exzellent (Code 1) eingestuft wurde. Diese
Embryonen
zeichneten
sich
durch
eine
symmetrische
und
sphärische
Blastomerenverteilung aus. Bis zum 16-Zeller sollten individuelle Blastomeren
vorhanden sein, die in Größe, Farbe und Dichte uniform sein sollten. Leichte
Abweichungen wurden akzeptiert, wenn der Embryo ansonsten intakt und die Zona
pellucida glatt, unbeschädigt und ohne konkave oder abgeflachte Stellen war.
3.4
Immunzytochemische Darstellung der Proteine DNA-Methyltransferase1
(DNMT1) und DNA-Methyltransferase3a (DNMT3a) in präimplantatorischen
Embryonen
Der Nachweis der Proteine DNMT1 und DNMT3a erfolgte in dieser Arbeit mit einer
indirekten Immunzytochemie. Dazu wurden primäre Antikörper eingesetzt, die
Bindungsstellen für die entspechenden Proteine besaßen. Dann wurde ein
Sekundärantikörper mit Bindungsstellen für die primären Antikörper verwendet, der
anschließend durch die Laser-Anregung mit einer Wellenlänge von 633 nm sichtbar
gemacht werden konnte. Über das dabei entstandene Signal wurden die Proben
ausgewertet.
3.4.1 Verwendete Antikörper
3.4.1.1 Primäre Antikörper
Für den Nachweis der DNMT1 wurde ein im Kaninchen erzeugter polyklonaler IgG
Antikörper (anti-Dnmt 1, ab4870, Abcam) verwendet, dessen Aminosäuresequenz
korrespondierend zu den letzten 100 Aminosäuren der humanen Dnmt 1 war. Diese
100 Aminosäuren stimmen zu 98% mit den Aminosäuren der bovinen DNMT1 an
den Stellen 1513 - 1611 überein. Die einzigen Abweichungen stellen eine
ausgewechselte Aminosäure an der Stelle 1590 und eine fehlende Aminosäure bei
1608 dar. Die Auswahl des Antikörpers erfolgte auf Grund dieser Homologie des
66
Material und Methoden
Aminosäuremusters an der Bindungsstelle, wodurch eine Kreuzreaktion mit der
DNMT1
des
Rindes
erwartet
werden
konnte.
Der
Vergleich
der
Aminosäuresequenzen erfolgte anhand von Angaben der NCBI (GI:32880212 [Bos
taurus], GI:1632819 [Homo sapiens]).
Bei dem Antikörper handelte es sich um einen Protein G gereinigten Antikörper, der
in einer Konzentration von 0.25 mg/ml vorlag.
Der Nachweis der DNMT3a erfolgte ebenfalls durch einen im Kaninchen erzeugten
polyklonalen IgG Antikörper (anti-Dnmt3a, ab4897, Abcam), der korrespondierend zu
den Aminosäuren 469 - 483 der humanen Dnmt3a war. Diese Sequenz entspricht
den Aminosäuren der bovinen DNMT3a an den Stellen 448 - 462 (NCBI:
GI:32350981 [Bos taurus], GI:18033253 [Homo sapiens]). Aufgrund der 100%igen
Übereinstimmung der Aminosäuresequenz im Bindungsbereich des primären
Antikörpers konnte auch hier mit einer Kreuzreaktion mit der bovinen Dnmt3a
gerechnet werden. Wie die anti-DNMT1 handelte es sich auch bei der anti-DNMT3a
um einen Protein G gereinigten Antikörper in einer Konzentration von 0.25 mg/ml.
Beide primären Antikörper wurden direkt nach dem Erhalt als 5 und 10µl Aliquots bei
- 80°C eingefroren und bis zum Gebrauch dort gelage rt.
3.4.1.2 Sekundäre Antikörper
Als sekundäre Antikörper wurden solche ausgewählt, die an der IgG-Struktur von aus
dem Kaninchen stammenden primären Antikörpern binden. Dabei kamen zwei
Fluorochrom-gekoppelte und ein Peroxidase-gekoppelter Antikörper zum Einsatz.
3.4.1.2.1 Fluorochrom-gekoppelte Antikörper
Zur Darstellung der DNMT1 und DNMT3a mittels Fluoreszenz wurde der Zenon
Alexa Fluor 647 Rabbit IgG Labeling-Kit (Molecular Probes) verwendet. Dabei
handelt es sich um ein Fluorophor-gebundenes Fab-Fragment, das aufgrund der
Reinigung während der Präparation selektiv nur an der Fc-Region von intakten
primären Antikörpern aus dem Kaninchen bindet. Durch die hohe Immunoselektivität
ist es nicht notwendig, Fremdproteine wie Serumalbumin aus den verwendeten
Puffersubstanzen zu entfernen. Ursprünglich dient dieser Kit der Herstellung von
67
Material und Methoden
Antikörperkomplexen ausserhalb der Probe. In dem hier dargestellten Versuch
wurden die Embryonen nach einer Inkubation im primären Antikörper zu den FabFragmenten gegeben. Bei der anschließenden Anregung mit einem Laser bei 633nm
kam es zu einer maximalen Emission von Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von
668nm, die mit entsprechenden Filtern am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop
(LSM 510, Zeiss) dargestellt werden konnte.
Während der Optimierungsversuche der immunzytochemischen Methode wurde
noch ein zweiter Zenon Rabbit IgG Labeling-Kit verwendet (Zenon Alexa Fluor 555
Rabbit IgG Labeling-Kit, Molecular Probes), dessen Absorptionsmaximum bei 550nm
und Emissionsmaximum bei 575nm liegt. Dieser Antikörper wurde jedoch nicht für
die in der Auswertung analysierten Embryonen verwendet, da es bei dem Zenon
Alexa Fluor 555 und der Zellkernfärbung (SYTOXgreen, Molecular Probes) zu
einer Überlappung der Absorptions- und Emissionsspektren kam, die sich störend
auf die Auswertung ausgewirkt hat.
Beide Fluorochrom-gekoppelten Antikörper wurden von der Ankunft bis zum
jeweiligen Gebrauch bei 4°C gelagert.
3.4.1.2.2 Peroxidase-gekoppelter Antikörper
Als Peroxidase-gekoppeltes Detektionssystem wurde ein DAKO EnVision-Kit (DAKO
REALTM EnVisionTM Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse) eingesetzt,
der mit primären Antikörpern vom Kaninchen kompatibel und zudem sehr sensitiv ist.
Dabei handelt es sich um ein „Zwei-Stufen-Visualisierungs-System“, wobei der Probe
zunächst nach der Inkubation im primären Antikörper ein Peroxidase-gekoppeltes
Polymer zugegeben wird, das an einen sekundären Antikörper gebunden ist.
Anschließend wird ein chromatisches Substratsystem mit Diaminobenzidine (DAB+)
zugegeben. Durch die enzymatische Umsetzung des Substrats kommt es zu einem
braunen Niederschlag in der Probe.
Dieser Antikörper wurde im Rahmen der Optimierungsversuche eingesetzt, um die
Funktionsfähigkeit der primären anti-DNMT1- und anti-DNMT3a-Antikörper zu
prüfen, fand aber bei den in die Auswertung eingegangenen Embryonen keine
Verwendung.
68
Material und Methoden
3.4.2 Durchführung der Immunzytochemie
Die immunzytochemische Methode setzt sich aus vier Teilstücken zusammen:
•
Vorbehandlung (Pretreatment) der Embryonen
•
Inkubation im primären Antikörper (anti-DNMT1, anti-DNMT3a)
•
Inkubation im markierten Zweitantikörper
•
Darstellung und Auswertung der Farbreaktion
Alle Schritte der Immunzytochemie fanden mit Ausnahme der Inkubation im primären
Antikörper (4°C) und dem RNase Verdau (37°C) bei Ra umtemperatur statt. Für die
Inkubationen und die Waschschritte wurden 5-well-Kulturschälchen (MiniTüb,
Tiefenbach, Deutschland) verwendet und die Embryonen mit einer Mund-Pipette mit
ausgezogenem Schmelzpunktbestimmungsröhrchen umgesetzt. Ab der Präparation
für die Zellkernfärbung wurden silikonisierte Blockglasschälchen (Mikroskopiernapf,
40x40mm, ∅ 32 mm) und silikonisierte Pipetten (E.T.-Pipetten, Wörrlein) eingesetzt.
Alle Schritte ab der Inkubation im sekundären Antikörper wurden im Dunklen
durchgeführt. In jedem Durchgang lief eine Negativkontrolle ohne primären und
sekundären
Antikörper
mit,
um
eine
Eigenfluoreszenz
der
Embryonen
auszuschließen. Zudem wurde jeweils eine Kontrolle nur mit dem sekundären
Antikörper durchgeführt, um unspezifische Bindungen erkennen zu können. Bei
jedem Durchgang wurden gleichzeitig in vivo und in vitro erstellte Embryonen
verwendet, um einen optimalen Vergleich zu ermöglichen.
3.4.2.1 Vorbehandlung der Embryonen (Pretreatment)
Das Protokoll für das Pretreatment entstand in Anlehnung an SANTOS (2004,
persönliche Mitteilung via E-mail). Während der Vorbehandlung wurden die
Embryonen zunächst fixiert, ehe sie durch eine Permeabilisierung der Membranen
und eine Entfernung der Zona pellucida für die Inkubation in den Antikörpern
vorbereitet wurden. Sofern nicht anderweitig erwähnt fanden alle diese Schritte in 5well-Kulturschälchen statt.
69
Material und Methoden
3.4.2.1.1 Fixation
Nach der Gewinnung der Embryonen durch die Spülungen bzw. aus der IVP wurden
die Stadien zunächst eine Minute in 200 µl PBS gewaschen. Anschließend wurden
sie in 3,7%iger PFA-Lösung (Paraformaldehyd, Sigma) für 15 Minuten bei
Raumtemperatur in Glasblockschälchen fixiert. Diese Lösung wurde jeweils direkt vor
der Fixierung aus einer 25%igen PFA-Stocklösung hergestellt. Dazu wurden 148 µl
der 25%igen PFA-Stocklösung zu 852µl PBS gegeben. Die Stocklösung wurde in
einer Braunglasflasche luftdicht verschlossen bei 4-6°C gelagert und alle zwei
Monate frisch angesetzt. Nach der Fixierung wurden die Embryonen bis zu zwei
Wochen in 70%igem Ethanol in silikonisierten Eppendorf-Cups bei 4°C gelagert, um
Gruppengrößen von mindestens 10 Embryonen zu erhalten.
3.4.2.1.2 Permeabilisation
Im Anschluß an die Fixierung bzw. Lagerung wurden die Embryonen 3x in je 200 µl
0,05%iger Tween-20-Lösung in PBS gewaschen (Tween20, Roth). Danach erfolgte
die Permeabilisierung mit 1%igem Triton X-100 (Merck) in PBS für 15 Minuten bei
Raumtemperatur. Anschließend wurden die Embryonen erneut 3x in je 200 µl
0,05%iger Tween-20-Lösung in PBS gewaschen.
3.4.2.1.3 Entfernen der Zona pellucida
Für die Entfernung der Zona pellucida wurden die Embryonen zunächst für etwa eine
Minute in 100 µl 4N HCl in 0,1%igem Triton X-100 gelagert. Anschließend wurden sie
2x in 200 µl Tropfen PBS mit 0,05% Tween-20 gewaschen und für max. 10
Sekunden in 200 µl 0,5%ige Pronase in PBS gegeben (Protease Typ XXV, Pronase
E, 5.5 units/mg solid, Sigma). Sobald die Zona begann, sich vom Embryo zu lösen,
wurden die Embryonen erneut 3x in 200 µl PBS mit 0,05% Tween-20 gewaschen.
Während dieser Waschschritte löste sich die Zona vollständig vom Embryo. Im
Anschluß an die Waschungen wurden die zonafreien Stadien für max.10 Sekunden
in einem 200 µl großen Tropfen mit 100mM Tris/HCl-Puffer mit einem pH-Wert von
8,5 neutralisiert. Danach erfolgten wieder drei Waschungen in je 200 µl mit 0,05%
Tween-20 in PBS.
70
Material und Methoden
3.4.2.2 Inkubation
in
den
spezifischen
anti-DNMT1
bzw.
anti-DNMT3a
Antikörpern
Vor der Inkubation in den primären Antikörpern wurden die Embryonen zunächst
eine Stunde in einem Blocker aus Tris/HCl-Puffer mit 1% BSA und einem pH-Wert
von 7,2-7,6 gelagert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Anschließend
wurden die Embryonen in Antikörperverdünnungen von 1:50 (anti-DNMT1) bzw. 1:25
(anti-DNMT3a) in der Blocker-Lösung aus Tris/HCl mit BSA über Nacht bei 4°C
inkubiert. Dazu wurden 50µl Tropfen gebildet, die in 5-well Kulturschälchen mit
Silikonöl überschichtet wurden. In dieser Zeit kam es zu einer spezifischen
Anlagerung der primären Antikörper an die DNA-Methyltransferasen1 bzw. 3a und
dadurch zu einer Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen (Ag-Ak-Komplexe).
Nach der Inkubation wurden die Embryonen 3x mit der Blocker-Lösung gewaschen,
wobei der zweite Waschschritt mindestens 30 Minuten dauerte.
3.4.2.3 Markierung der Ag-Ak-Komplexe mit dem sekundären Antikörper
Nach dem Auswaschen der nicht gebundenen primären Antikörper erfolgte die
Markierung der gebildeten Ag-Ak-Komplexe durch den Fluorochrom-gekoppelten
sekundären Antikörper (Alexa Fluor 647). Dazu wurde für die DNMT1 eine
Antikörper-Verdünnung von 1:100 und für die DNMT3a von 1:50 eingesetzt. Auch
diese Verdünnung fand mit der Blocker-Lösung aus Tris/HCl mit BSA statt. Die
Inkubation erfolgte für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 50µl Tropfen unter Öl.
Anschließend wurden die Embryonen für fünf Minuten in das mitgelieferte
Blockermedium aus unspezifischem IgG umgesetzt, um die nicht gebundenen FabFragmente zu neutralisieren. Dazu wurde der Blocker in derselben Verdünnung wie
der sekundäre Antikörper verwendet. Darauf folgte wiederum ein dreimaliges
Waschen, wobei der zweite Waschschritt erneut mindestens 30 Minuten dauerte.
3.4.2.4 Zellkernfärbung
Für die Darstellung des Zellkerns wurde die SYTOX Green Nukleinsäure-Färbung
(Cytological Nuclear Counterstain Kit SYTOX Green, Molecular Probes) verwendet.
Das SYTOX Green besitzt Excitations- und Emissionsmaxima, die mit Fluorescein
71
Material und Methoden
vergleichbar sind (Excitation: 502 nm, Emission: 523nm). Aufgrund der effizienten
Excitation bei 488nm wird es in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie mit dem
Argon-Ionen Laser eingesetzt.
Die für diese Färbung notwendigen Schritte wurden in silikonisierten Glasschälchen
mit silikonisierten Glaspipetten (E.T.-Pipetten, Wörrlein) durchgeführt.
Für die Färbung wurden die fixierten und in Triton X-100 permeabilisierten
Embryonen zunächst kurz in 2X SSC äquilibriert. Anschließend erfolgte für 45
Minuten eine Inkubation in 37°C warmer DNase-freier RNase (Ribonuclease A 71
Kunitz units/mg solid, Sigma) mit einer Konzentration von 100µg/ml in 2X SSC, um
eine unspezifische RNA-Anfärbung des Zytoplasmas zu vermeiden. Im folgenden
Schritt wurden die Embryonen wiederum 3x je 5 Minuten in 2X SSC gewaschen.
Danach erfolgte die 10-minütige Inkubation im SYTOX Green in einer Verdünnung
von 1:2000 bei Raumtemperatur. Im Anschluß an die Färbung wurden die
Embryonen erneut 3x je 5 Minuten in 2X SSC gewaschen.
3.4.2.5 Einbettung der Embryonen
Für die Einbettung der Embryonen wurde das SlowFade Antifade Reagenz
(Molecular Probes) als Mounting-Medium verwendet. Dafür wurden die Stadien
zunächst 5 Minuten in einem Äquilibrierungspuffer gelagert und anschließend in das
Mounting-Medium auf dem Objektträger verbracht. Dazu wurden silikonisierte
Objektträger verwendet, die mit einem Lochverstärker-Ring versehen waren. In
diesen Ring wurde 1µl Mounting-Medium gegeben. Nachdem jeweils maximal drei
Embryonen in diesen Tropfen verbracht wurden, konnte vorsichtig ein Deckglas
aufgelegt und der Rand mit Nagellack versiegelt werden.
Die Untersuchung der Proben fand bis maximal sieben Stunden nach Abschluß der
Färbung statt. Während dieses Zeitraumes wurden die Objektträger im Dunkeln bei
4°C gelagert.
72
Material und Methoden
3.4.2.6 Übersicht der Immunzytochemie
•
Waschen der Embryonen in PBS (1 Minute)
•
Fixieren in 3,7% PFA in PBS für 15 Minuten (min.) bei Raumtemperatur (RT)
•
3x Waschen in 0,05%iger Tween-20 in PBS
•
Permeabilisieren in 1%igem Triton X-100 in PBS für 15 min. bei RT
•
3x Waschen in 0,05%iger Tween-20 in PBS
•
Entfernen der Zona:
o Lagern in 4N HCl in 0,1% Triton X-100 für max. 1 min.
o Waschen in 0,05%iger Tween-20 in PBS
o Lagern in 0,5%iger Pronase für max. 10 Sekunden (sec.)
o 3x Waschen in 0,05%iger Tween-20 in PBS
o Neutralisieren in Tris/HCl pH 8,5 für max. 10 sec.
o 3x Waschen in 0,05%iger Tween-20 in PBS
•
Blocken unspezifischer Bindungsstellen in Tris/HCl + 1% BSA pH 7,2-7,6
(Blocker) für 1 Stunde (h) bei RT
•
Inkubation in 1:50 anti-DNMT1 bzw. 1:25 anti-DNMT3a im Blocker über Nacht
(8 h) bei 4°C
•
3x Waschen im Blocker (2. Waschschritt mindestens 30 min.)
•
Inkubation in 1:100 AlexaFluor 647 (DNMT1) bzw. 1:50 AlexaFluor 647
(DNMT3a) im Blocker für 30 min. bei RT (ab hier im Dunklen)
•
3x Waschen im Blocker (2. Waschschritt mindestens 30 min.)
•
Äquilibrieren in 2X SSC
•
Inkubation in DNase freier RNase 100µg/ml in 2X SSC für 45 min. bei 37°C
•
3x Waschen in 2X SSC für je mind. 5 min.
•
Inkubation in 1:2000 SYTOX Green in 2X SSC für 10 min. bei RT
•
3x Waschen in 2X SSC für je mind. 5 min.
•
Einbetten von bis zu drei Embryonen in 1µl Slow Fade Antifade Mounting
Medium auf silikonisierten Objektträgern mit Lochverstärkerring
•
Auflegen des Deckglases und Versiegeln mit Nagellack
•
Lagerung max. 7h bei 4°C im Dunkeln
73
Material und Methoden
3.5
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde das Laser-Scanning-Mikroskop
LSM 510 von Zeiss verwendet. Nach der Optimierung wurden alle analysierten
Embryonen mit identischen Einstellungen untersucht, um einen Vergleich zwischen
in
vivo
und
in
vitro
produzierten
Embryonen
sowie
der
verschiedenen
Entwicklungsstadien innerhalb einer Herkunft durchführen zu können.
3.5.1 Konfigurationen
3.5.1.1 Mikroskopeinstellungen
Für das Aufsuchen und Fokussieren der Embryonen wurde das zur Einheit des
konfokalen
Mikroskops
gehörige
Lichtmikroskop
mit
einem
20x/0.75
Plan-
Apochromat Objektiv verwendet. Anschließend wurde von der direkten Observation
auf das Laser-Scanning umgeschaltet. Dazu wurde das Licht ausgeblendet und die
Laser aktiviert.
3.5.1.2 Eingesetzte Laser und Laser-Intensität
Für den Fluorochrom-gekoppelten Sekundär-Antikörper Alexa Fluor 647 wurde ein
Helium-Neon Laser verwendet, der eine Anregung bei 633nm bewirkt. Die Intensität
des Lasers betrug 30.3%. Das SYTOX Green wurde durch einen Argon-IonenLaser bei 488nm angeregt. Hier betrug die Intensität 25,8%. Für die Analysen wurde
das Multi-Track-Verfahren gewählt, bei dem ein sequentielles Scannen der
verschiedenen
Ak-gekoppelten
Fluorochrome
erfolgt.
Dadurch
entsteht
ein
sequentiell aufgenommenes Mehrkanalbild, bei dem es jeweils nur zur Anregung
eines Lasers kommt, während der andere über AOTF (akusto-optischer Filter)
abgeschaltet wird. Durch diese Methode kann eine Überschneidung („bleed through“)
bei der Anregung oder Detektion der Fluorochrom-Signale (Cross-Talk) deutlich
reduziert werden. Die Erfassung des Alexa Fluor 647 erfolgte im Kanal 1, das
SYTOX Green wurde im Kanal 2 angeregt und detektiert.
74
Material und Methoden
3.5.1.3 Verwendete Filter
Im Kanal 1 wurde für das Alexa Fluor 647 ein Long Pass-Filter eingesetzt, der
Licht ab einer Wellenlänge von 650nm erfasst (LP 650). Weiter wurde ein
Hauptfarbteiler für UV-Licht und die Wellenlängen 488, 543 und 633 verwendet (HFT
UV/488/543/633). In der ersten Spiegelposition wurde ein Nebenfarbteiler (NFT 635
VIS) eingesetzt. An der zweiten und dritten Spiegelposition befand sich jeweils ein
Plate.
Im Kanal 2 für das SYTOX Green wurde ein Band Pass-Filter verwendet, der nur
das Licht zwischen den angegebenen Wellenlängen erfasst (BP 505-530). Auch hier
wurde der Hauptfarbteiler für UV-Licht und die Wellenlängen 488, 543 und 633
eingesetzt (HFT UV/488/543/633). In den Spiegelpositionen 1 und 2 befand sich
jeweils ein Spiegel und an der Position 3 ein Plate.
3.5.1.4 Pinhole und Detektor-Sensitivität
Das Pinhole dient dazu Streustrahlung auszublenden, die ausserhalb der
Fokusebene entstanden ist. Bei der Konfiguration wurde das Pinhole so eingestellt,
dass beide Kanäle den gleichen optischen Schnitt besitzen, also das detektierte
Signal jeweils aus dem gleichen Schnittfeld stammt. Dazu betrug die Pinhole-Größe
im Kanal 1 0.85 Airy units mit einem optischen Schnitt von <2.0 µm und im Kanal 2
1.18 Airy units mit <2.0 µm.
Anschließend wurden die minimalen und maximalen Signalstärken eingestellt, die
von dem Detektor erfasst werden sollten.
Dabei bestimmt Detector gain die Sensitivität des Detektors, indem das maximale
Limit angegeben wird. Im Kanal 1 betrug es 868 und im Kanal 2 618. Durch Amplifier
offset wird das Limit für die minimale Intensität angezeigt. Im Kanal 1 lag das Limit
bei 0 und im Kanal 2 bei –0.152. Mit Amplifier Gain kann das gesamte Signal
angehoben werden, wobei dann das Limit für die minimale Intensität herabgesetzt
werden muss. Das Amplifier Gain betrug in beiden Kanälen 1.
75
Material und Methoden
3.5.2 Erstellung von Bildern und Bilderreihen
Für die Erstellung der Bilder wurde ein Scan-Zoom von 2 und eine ScanGeschwindigkeit von 2.56 µs Pixel Time verwendet. Die Aufnahmengröße betrug 8
bit. Die Rahmengröße der aufgenommenen Bilder betrug 512x512 Pixel.
Für die Bilderreihen wurden die einzelnen Schnitte so eingestellt, dass sie sich zur
Hälfte ihrer Dicke überlappten, um keine Information zu verlieren. Dabei wurde aber
nur eine minimale Anzahl an Schnitten verwendet, um die Zeit in der die Embryonen
den Lasern ausgesetzt sind, so gering wie möglich zu halten. Dadurch wurde
versucht, ein Ausbleichen des Präparates zu vermeiden. Mit Hilfe der RangeIndikator-Einstellung konnte von jedem Embryo die Ober- und Unterseite aufgesucht
werden, um die Anfangs- und Endpunkte der Z-Ebene in der Rasteraufnahme
festzulegen. Je nach Dicke des Präparates wurden von jedem Embryo 55 bis 131
Schnitte dargestellt. Die Dimensionen jedes Schnittes betrugen in der X-Ebene
230.34 µm, in der Y-Ebene 230.34 µm und in der Z-Ebene 1.01 µm. Die Bilderreihen
wurden mit dem LSM Image Browser gespeichert.
3.6
Auswertung der Bilder mit ImageJ
Die Auswertung der mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommenen
Bilder erfolgte mit der ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Die erzeugten Bilder wurden hinsichtlich der räumlichen Verteilung der Fluoreszenz
und damit der Ag-Ak-Komplexe in den Embryonen untersucht, wobei die Lokalisation
der Zellkerne durch die grüne Fluoreszenz des SYTOXgreen zu ermitteln war.
Zudem wurde die Intensität der Fluoreszenz als Parameter für die Anzahl an
Fluorochromen und damit an Ag-Ak-Komplexen herangezogen, d.h. anhand der
emittierten Lichtmenge konnte ein Rückschluss auf das Vorhandensein und die
Quantität der Proteine DNMT1 und DNMT3a gezogen werden.
Da es ab einer Tiefe von 10-15µm zu einem signifikanten Verlust des Signals kommt
und es aufgrund verschiedener optischer Voraussetzungen in verschiedenen
Geweben keine einfache Möglichkeit zur Tiefenkorrektur gibt (DAMLE et al. 2006),
erfolgte die Auswertung semi-quantitativ. Dazu wurden die Bilderreihen in die ImageJ
76
Material und Methoden
Software importiert und in einen grünen, einen roten und einen blauen Kanal
aufgetrennt. Der blaue Kanal wurde verworfen. Der grüne Kanal zeigte die
Zellkernfärbung mit SYTOX Green und diente dem Nachweis der Kolokalisation.
Für die Auswertung wurde von jedem Embryo ein zentraler optischer Schnitt im roten
Kanal verwendet. Dazu wurde die Fläche umfahren, die von den Blastomeren
eingenommen wurde und anschließend die Intensität aller Pixel dieser Fläche
erfasst. Für den Vergleich der Fluoreszenz-Intensität des AlexaFluor 674 bei den
individuellen Embryonen wurde dann der Meridianwert der erfassten Pixel berechnet.
Von diesem Wert wurde anschließend die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz
abgezogen. Dazu wurde ein Feld ausserhalb des Embryos umfahren und auch hier
der Meridianwert der Pixelintensitäten errechnet und von dem ersten Meridianwert
abgezogen. Zudem erfolgte eine Korrektur der durchschnittlichen Autofluoreszenz
der Embryonen. Dazu wurde ebenfalls ein zentraler Schnitt der Negativkontrolle
verwendet und wie bei der eigentlichen Probe verfahren. Der dabei errechnete
Meridianwert wurde dann ebenfalls vom Meridianwert der Probe abgezogen. Der so
korrigierte Wert wurde anschließend für den Vergleich der in vivo und in vitro
produzierten Embryonen und der Entwicklungsstufen innerhalb einer Herkunft
verwendet.
3.7
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Untersuchungen erfolgte mit Hilfe der SigmaStat 2.0
Software (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Dazu wurden zunächst alle Daten eines
Proteins auf ihre Normalverteilung mittels des Kolmogorov-Smirnov-Tests hin
untersucht und anschließend eine Varianzanalyse mit dem Levene Median Test
durchgeführt. Im Anschluß daran erfolgte sowohl für die DNMT1 als auch die
DNMT3a eine Two way ANOVA mit den Faktoren Herkunft (in vivo und in vitro) und
Entwicklungsstadium (Zygote – Blastozyste). Dabei wurden Unterschiede von P ≤
0,05 als statistisch signifikant angesehen.
77
Material und Methoden
3.8
Allgemeiner Versuchsaufbau
Die experimentellen Untersuchungen gliederten sich in folgende Schritte:
•
In-vivo- und In-vitro-Produktion von bovinen präimplantatorischen Embryonen
•
Etablierung der Immunozytochemie und der konfokalen Laser-ScanningMikroskopie für die semi-quantitative Analyse des relativen Proteingehalts und
Lokalisationsbestimmungen der Proteine DNA-Methyltransferase1 und 3a
3.8.1 Versuchsanordnung
3.8.1.1 Gewinnung der Embryonen
Die Gewinnung der präimplantatorischen bovinen In-vivo-Embryonen erfolgte mittels
transvaginaler Endoskopie und Uterusspülung. Zum Erlernen der Technik wurden 26
nicht synchronisierte und nicht superovulierte Tiere im Alter von 13-25 Monaten
endoskopiert. Nach der erfolgreichen Aneignung der Methode wurden nach
Synchronisation, Superovulation und Besamung 45 Färsen insgesamt 50x
endoskopisch gespült. Zusätzlich wurde bei insgesamt 10 Tieren lediglich der Uterus
zur Gewinnung von uterinen Stadien gespült. Parallel dazu erfolgte zwei- bis dreimal
pro Woche die routinemäßige Produktion von In-vitro-Embryonen.
3.8.1.2 Etablierung der Immunzytochemie
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte die Darstellung der Proteine DNAMethyltransferase1 und 3a bei präimplantatorischen bovinen Embryonen mittels
Immunzytochemie und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei wurde eine
semi-quantitative Analyse des relativen Proteingehaltes und eine Untersuchung zur
Lokalisation der Proteine in den Blastomeren bei Embryonen verschiedener
Entwicklungsstadien (Zygote – expandierte Blastozyste) und verschiedener Herkunft
(in vivo und in vitro) durchgeführt. Dazu wurde sowohl der relative Proteingehalt bei
den Embryonen der verschiedenen Herkünfte miteinander verglichen, als auch der
Verlauf der Proteinmenge innerhalb einer Herkunft während der präimplantatorischen
Embryonalentwicklung dargestellt.
78
Material und Methoden
Zur Etablierung der Technik wurden über einen Zeitraum von 11 Monaten
verschiedene
Protokolle
mit
unterschiedlichen
Antikörperkonzentrationen,
Inkubationszeiten, Blockerzusammensetzungen und Versuche mit und ohne Zona
pellucida durchgeführt (Tab. 6). Der Test der primären Antikörper erfolgte mittels
eines Peroxidase-gekoppelten Antikörpers, ehe die Optimierung des Protokolls mit
dem Fluorochrom-gekoppelten Antikörper durchgeführt wurde.
79
Material und Methoden
Tabelle 6: Etablierung der Immunzytochemie
Protokoll
Protokoll 1
•
Fixation 4% PFA 15 min.
AkKonzentrationen
Primär Sekundär
(Vorgaben
•
Permeabilisation in
1:50
1:50
1% Triton X-100
1:100
1:100
1:500
1:500
1:1000
1:1000
1:5000
1:5000
anti DNMT1 mit Alexa
1:100
1:50
Fluor 555 und anti
1:100
1:1000
mit/ohne Zona
Primär
Sekundär
pellucida
1:50
1:50
silikonisierte
1:100
1:100
1:500
1:500
1:1000
1:1000
1:5000
1:5000
1:100
1:50
1:100
1:1000
von Molecular
Probes)
•
Modifikationen
Blocken in 10% normal
goat serum (NGS)
•
Herstellung der
Labelingkomplexe aus
DNMT3a mit Alexa
Fluor 647
•
Inkubation der
Embryonen in den
Labelingkomplexen
•
Färbung mit SYTOX
green
Protokoll 2
•
(mod. nach
BARAN et al.
•
Fixation in 3,7% PFA
50-60 min. (4°C)
•
2004)
•
Blocken freier
Aldehydgruppen in 50
Objektträger
•
mM Ammoniumchlorid
•
Permeabilisation in
Blocker
•
0,5% Triton X-100
•
Preinkubation in 2%
BSA 10-15h (4°C)
Inkubation im prim. Ak
10h (4°C)
•
1% BSA in
Blocker
NGS in PBS + 0,25%
•
5% NGS in
Inkubation im sek. Ak
1h (RT)
80
Material und Methoden
Tabelle 6: Etablierung der Immunzytochemie (Fortsetzung)
Protokoll
Modifikationen
Protokoll 3
•
Fixation in 4% PFA (RT)
•
(mod. nach
•
Preinkubation in 3% BSA
KO et al.
in 0,5% Triton X-100 1h
2005)
(RT)
•
•
mit/ohne Zona
AkKonzentrationen
Primär Sekundär
pellucida
1:100
1:100
silikon.
1:200
1:200
Objektträger
1:300
1:300
1:500
1:500
•
Ak Inkubation in Blocker
•
Inkubation im prim. Ak
0,25% BSA in
•
Inkubation im sek. Ak
Blocker
•
5% NGS +
1:1000 1:1000
0,05% Tween20 als Blocker
Protokoll 4
•
(mod. nach
SANTOS,
•
Fixation in 4% PFA 15
•
mit/ohne Zona
min. (RT)
•
silikon.
Permeabilisation in 0,2%
persönl.
Triton X-100
Mitteilung)
(RT)
•
Objektträger
•
30 min.
Blocker
Waschen in 0,05% Tween20
•
Tween-20 + 1% BSA
Inkubation im prim. Ak
•
Inkubation im sek. Ak
•
3% BSA in
Blocker
Preinkubation in 0,05%
•
5% NGS in
81
Primär
1:100
Sekundär
1:100
Material und Methoden
Tabelle 6: Etablierung der Immunzytochemie (Fortsetzung)
Protokoll 5
Protokoll
Modifikationen
•
•
(DAKO
EnVision-Kit,
Fixation in 4% PFA
15 min. (RT)
•
nach DAKO)
•
Permeabilisieren
mit/ohne Zona
AkKonzentrationen
Primär Sekundär
pellucida
1:50
mit Epitopen-
1% Triton X-100
Demaskierung:
Peroxidaseblock in
Citrat pH6(x10)
3% Hydrogenperoxid
1:10 verdünnt
•
Blocken in 10% NGS 1h
20 min. bei
•
Inkubation im prim. Ak
95°C
•
•
(anti DNMT1/anti
DNMT3a) in 0,05% mol/l
in 0,5% Triton-
Tris/HCl-Puffer pH 7.2-
X 100
•
7.6 + 1% BSA
•
Inkubation im
primärer Ak
10h (4°)
Peroxidase gekoppelten
Polymer (unverdünnt)
30 min. (RT)
•
Block in 10%
NGS 10h (4°C)
30 min (RT)
•
Preinkubation
Inkubation in
Chromogenverdünnung
5min. (RT)
82
Unverdünnt
Material und Methoden
Tabelle 6: Etablierung der Immunzytochemie (Fortsetzung)
Protokoll
Protokoll 6
(mod. nach
SANTOS,
persönl.
Mitteilung)
Modifikationen
• Fixation in 3,7% PFA
15 min. (RT)
• Waschen in 0,05%
Tween-20
• Permeabilisation in 1%
Triton X-100 15 min. (RT)
• Entfernen der Zona
pellucida mit 4N HCl 0,
1% Triton X-100;
Ak-Konzentrationen
Primär
Sekundär
1:25
1:50
1:50
1:50
1:50
1:100
1:50
1:250
1:50
1:500
1:100
1:100
1:100
1:500
Primär
Sekundär
0,5% Pronase
• Neutralisation mit Tris/HClPuffer pH 8,5
• Preinkubation in Tris/HClPuffer mit 1% BSA
(pH 7,2-7,6)
• Inkubation im prim. Ak
8h (4°C)
• Inkubation im sek. Ak
(Alexa Fluor 647)
30 min. (RT)
• SYTOX green-Färbung
Für die
• Protokoll 6: s.o.
Versuche
DNMT1
verwendetes
1:50
Protokoll
1:100
DNMT3a
1:25
83
1:50
Material und Methoden
In-vitro-Produktion von
Rinderembryonen
Transvaginale Endoskopie und
Eileiterspülung beim Rind
In vivo gewonnene präimplantatorische
Rinderembryonen (Zygoten - exp. Bla.)
In vitro gewonnene präimplantatorische
Rinderembryonen (Zygoten – exp. Bla.)
Pretreatment:
Fixation, Permeabilisation und Entfernen
der Zona pellucida
Blocken unspezifischer Bindungsstellen
Inkubation in spezifischen anti-DNMT1
und anti-DNMT3a-Antikörpern
Inkubation im Fluorochrom-gekoppelten
Antikörper Alexa Fluor 647
Zellkernfärbung mit SYTOX green
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Semiquantitative Analyse des
Proteingehaltes an DNMT1 und 3a
Untersuchungen zur Lokalisation
Abbildung 13: Schematische Darstellung der Versuchsanordnung
84
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1
Gewinnung boviner präimplantatorischer In-vivo-Embryonen
4.1.1 Gewinnung von Zygoten - 16-Zell-Embryonen mittels transvaginaler
Endoskopie
Die Gewinnung der Tag 1 - 4,5 Embryonen erfolgte mittels transvaginalendoskopischer Eileiterspülung in Kombination mit einer Uterusspülung. Dazu
wurden insgesamt 76 Färsen im Alter von 13 - 25 Monaten endoskopiert.
Im Rahmen der Vorversuche wurden zur Erlernung der Technik im Zeitraum April
2006 - Dezember 2006 26 Tiere ohne Superovulation unabhängig von ihrem
Zyklusstadium endoskopiert.
In den Hauptversuchen wurden von Januar 2007 - Februar 2008 nach
Superovulation insgesamt 50 Spülungen bei 45 Färsen durchgeführt. Dabei wurden
3 Tiere doppelt und ein Tier dreimal endoskopiert. Bei 43 Rindern konnten beide
Eileiter erfolgreich gespült werden, bei 3 Rindern konnte die Spülkanüle lediglich auf
einer Seite inseriert werden und bei 4 Rindern war keine Insertion möglich.
Probleme, die bei den Spülungen auftraten, waren unter anderem durch das Tier
bzw. die Superovulation aber auch durch das eingesetzte Material bedingt. Auf der
Tierseite kamen Verwachsungen im Bereich der Ovarien vor, durch die die
erforderliche Manipulation eingeschränkt und eine Insertion der Spülkanüle
verhindert wurde. Ein ähnlicher Effekt trat auch bei einer sehr starken Reaktion der
Superovulation und der daraus resultierenden großen Ovarien oder bei zu kurzen
Bändern (Ligamentae latae uteri) auf. Einige Färsen besaßen im Ampullenbereich
stark gewundene Eileiter, so dass die Spülkanüle nicht weit genug in den Eileiter
inseriert werden konnte. In diesen Fällen kam es häufig zu einem Zurücklaufen der
Spülflüssigkeit in den Bauchraum. Bei einem Teil der Rinder waren lediglich
zystische Gebilde auf den Ovarien jedoch keine Ovulationsstellen oder keine
Reaktion auf die Superovulation zu finden. In seltenen Fällen war keine
ausreichende Wirkung der Epiduralanästhesie vorhanden, wodurch die Manipulation
stark erschwert wurde.
85
Ergebnisse
Auf Seiten des Materials kamen ein geplatzter Schlauch an der Uterusspülpumpe
und defekte Spülkatheter vor. Bei drei Tieren kam es zu einem Platzen des Ballons
am Spülkatheter, wodurch die Spülflüssigkeit am Katheter vorbei entweichen konnte.
Bei den 50 kombinierten Eileiter- und Uterusspülungen konnten insgesamt 419
Entwicklungsstadien gewonnen werden. Davon waren 301 (72%) intakte Embryonen,
von denen 258 den für die weiteren immunzytochemischen Untersuchungen
erwünschten Stadien (Zygote, 2-Zell-, 4-Zell-, 8-Zell, 10-16-Zell-Embryo und
kompaktierte Morula) entsprachen. Insgesamt lag die Wiederfindungsrate (Anzahl
gefundener Embryonen zu gezählten Gelbkörpern am Ovar) bei 68%. Je Spülung
konnten im Durchschnitt 8 Embryonen, davon 6 intakte, gewonnen werden.
Die genaue Auflistung der erspülten Stadien in Abhängigkeit der Spülmethode sind in
Tabelle 7 zusammengefasst.
Die Abbildung 14 zeigt die prozentuale Verteilung der Entwicklungsstadien an den
jeweiligen Spültagen.
Zygoten
%70
2-Zeller
60
3-Zeller
50
4-Zeller
40
5-6-Zeller
30
8-Zeller
20
10-16-Zeller
10
>16-Zeller
0
Morulae
D1
D1,5
D2
D3
D4
UFO, Deg.
UFO: Unbefruchtete Oozyten; Deg.: Degenerierte Embryonen, leere Zonae
Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der verschiedenen Entwicklungsstadien
zum Zeitpunkt der endoskopischen Spülung
86
Ergebnisse
4.1.2 Gewinnung von Morulae und Blastozysten mittels Uterusspülung
Für die Gewinnung von Morulae und Blastozysten wurde bei 10 Färsen nach
vorausgegangener Superovulation am Tag 7 bzw. Tag 8 der Uterus gespült. Fünf der
verwendeten
Tiere
waren
zuvor
bereits
in
den
endoskopischen
Versuch
eingegangen.
Bei den 10 reinen Uterusspülungen konnten 75 Stadien gespült werden. Davon
waren 47 (63%) intakte, transfertaugliche Embryonen, die auch den für die weiteren
Untersuchungen erwünschten Stadien (kompaktierte Morula und expandierte
Blastozyste) entsprachen. Die Wiederfindungsrate lag bei 76%. Dabei konnten je
Spülung 7,5 Embryonen gewonnen werden, von denen im Schnitt 5,0 intakt und
transfertauglich waren.
Tabelle 7 stellt die Spülergebnisse der alleinigen Uterusspülung dar.
87
Ergebnisse
Kombinierte Eileiter- Reine
gesamt
und Uterusspülung
Uterusspülung
Anzahl an Spülungen:
50
10
60
Wiederfindungsrate:
68%
76%
69%
Gespülte Stadien, davon:
419
75
494
Zygoten
62
62
2-Zell-Embryonen
53
53
3-Zell-Embryonen
11
11
4-Zell-Embryonen
31
31
5-Zell-Embryonen
9
9
6-Zell-Embryonen
18
18
8-Zell-Embryonen
67
67
10-Zell-Embryonen
7
7
12-Zell-Embryonen
2
2
14-Zell-Embryonen
4
4
16-Zell-Embryonen
12
12
>16-Zell-Embryonen
5
5
Kompaktierte Morulae
20
Blastozysten
12
32
35
35
Unbefruchtete Oozyten
79
9
88
Degenerierte Embryonen
31
11
42
Leere Zonae
8
8
16
Intakte Embryonen:
301 = 72%
47 = 63%
348 = 70%
Tabelle 7: Auflistung der erspülten Stadien in Abhängigkeit der verwendeten
Spülmethode
88
Ergebnisse
4.2
Erstellung boviner In-vitro-Embryonen
Die Erstellung der In-vitro-Embryonen erfolgte im Labor routinemäßig zwei- bis
dreimal pro Woche. Dabei wurden durchschnittliche Teilungsraten von 78,6%±9,2%
erreicht. Die Blastozystenrate betrug im Durchschnitt 31,1%±4,3%.
in vivo
in vitro
in vivo
Zygote
in vivo
2-Zeller
in vitro
in vivo
4-Zeller
in vivo
in vitro
8-Zeller
in vitro
in vivo
10-16-Zeller
in vivo
in vitro
in vitro
Morula
in vitro
Blastozyste
Abbildung 15: Exemplarische Darstellung verschiedener Entwicklungsstadien
in vivo und in vitro (ca. 160-fache Vergrößerung)
89
Ergebnisse
4.3
Immunzytochemische
Darstellung
des
Proteingehalts
an
DNA-
Methyltransferase 1 und 3a in frühen (Tag 1-7) bovinen Embryonalstadien
aus In-vivo- und In-vitro-Produktion
Bei insgesamt 174 In-vivo- und 179 In-vitro-Embryonen von exzellenter oder guter
Qualität wurde von Februar 2007 bis Februar 2008 mittels Immunzytochemie der
relative Gehalt der Proteine DNMT1 bzw. DNMT3a bestimmt. Dazu wurde die
Fluoreszenzintensität der Embryonen gemessen, die als Parameter für das Vorliegen
von Ag/Ak-Komplexen dient und damit ein Maß für den Proteingehalt darstellt.
Untersucht wurde sowohl der Einfluss der Herkunft als auch die Bedeutung des
Entwicklungsstadiums, wobei für beiden Kriterien signifikante Unterschiede für die
DNMT1 und DNMT3a festgestellt werden konnten.
90
Ergebnisse
4.3.1 DNMT1
Bei der DNMT1 konnten nach der immunzytologischen Färbung 97 in vivo generierte
und 89 in vitro produzierte Embryonen ausgewertet werden. Dabei wurden je
Entwicklungsstadium und Herkunft 9 - 18 Embryonen je Gruppe analysiert, wobei
sowohl ein signifikanter Einfluss der Herkunft als auch des Entwicklungsstadiums
festgestellt werden konnte.
Abbildung 16 zeigt einige Beispiele präimplantatorischer In-vivo- und In-vitroEmbryonen nach der Immunzytochemie.
Zygoten
2-Zeller
4-Zeller
8-Zeller
10-16-Zell.
Morulae
Blastozysten
In vivo generierte Embryonen
In vitro produzierte Embryonen
Grün: Zellkerne, dargestellt mit SYTOX green
Rot: Verteilung der DNMT1
Abbildung 16: Beispielhafte Darstellung von mit anti-DNMT1 und Alexa
 647 markierten in vivo und in vitro generierten
Fluor
Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien (ca. 125fache Vergrößerung).
91
Ergebnisse
Abbildung 17 zeigt die Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an
DNMT1 in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums bei in vivo und in vitro
generierten Embryonen. Dabei kann ein signifikanter Einfluss der Herkunft im 4-Zell-
Fluoreszenz-Intensität
und im 10-16-Zell-Stadium, sowie bei Morulae und Blastozysten beobachtet werden.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
In vitro
In vivo
n= n=
18 12
Zygoten
n= n=
16
*
*
10
2-Zeller
*
*
n= n=
n= n=
n= n=
n= n=
n= n=
9
17 15
14 16
14
14 10
8-Zeller
10-16-
Morulae
15
4-Zeller
15
Blastozysten
Zeller
Abbildung 17: Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an DNMT1
in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen (* P ≤ 0.05). Die Zahlen im unteren Bereich
der Säulen geben die Anzahl der untersuchten Embryonen je
Gruppe (n) an.
92
Ergebnisse
In Abbildung 18 ist der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensität und damit des
Proteingehaltes in frühen in vivo generierten bovinen Embryonen dargestellt. Dabei
kann ein signifikanter Unterschied der Fluoreszenzintensität zwischen Morulae
gegenüber Zygoten, 2- und 8-Zell-Embryonen nachgewiesen werden. Eine weitere
statistisch signifikante Abweichung der Fluoreszenzintensität besteht zwischen
Fluoreszenz-Intensität
Blastozysten gegenüber Zygoten und 8-Zell-Embryonen.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
A
AC
AB
AB
B
Zygoten
BC
B
2-Zeller
4-Zeller
8-Zeller
10-16-
Morulae
Blastozysten
Zeller
Abbildung 18: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt
an
DNMT1
in
Embryonalstadien in vivo (A:B:C P ≤ 0.05)
93
präimplantatorischen
Ergebnisse
Abbildung 19 zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt in frühen in vitro produzierten bovinen Embryonen. Hier ist eine
signifikant stärkere Fluoreszenz bei den Morulae gegenüber den 4-Zell-Embryonen
Fluoreszenz-Intensität
und den Blastozysten zu erkennen.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
ab
ab
a
ab
ab
b
Zygoten
2-Zeller
4-Zeller
b
8-Zeller
10-16-
Morulae
Blastozysten
Zeller
Abbildung 19: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt
an
DNMT1
in
Embryonalstadien in vitro (a:b P ≤ 0.05)
94
präimplantatorischen
Ergebnisse
4.3.2 DNMT3a
Im Anschluss an die immunozytologische Färbung wurde für die DNMT3a die
Fluoreszenzintensität von 77 in vivo generierten und 90 in vitro produzierten
Embryonen ausgewertet. Je Entwicklungsstadium und Herkunft konnten dabei 8 - 19
Embryonen je Gruppe analysiert werden. Wie bei der DNMT1 ist auch für die
DNMT3a
sowohl
ein
signifikanter
Einfluss
der
Herkunft
als
auch
des
Entwicklungsstadiums nachweisbar.
Abbildung 20 zeigt einige Beispiele präimplantatorischer In-vivo- und In-vitroEmbryonen nach der Immunzytochemie.
Zygoten
2-Zeller
4-Zeller
8-Zeller
10-16-Zell. Morulae
Blastozysten
In vivo generierte Embryonen
In vitro produzierte Embryonen
Grün: Zellkerne, dargestellt mit SYTOX green
Rot: Verteilung der DNMT1
Abbildung 20: Beispielhafte Darstellung von mit anti-DNMT3a und Alexa
Fluor
 647 markierten in vivo und in vitro generierten
Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien (ca. 125fache Vergrößerung)
95
Ergebnisse
Abbildung 21 zeigt die Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an
DNMT3a in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums bei in vivo und in vitro
generierten Embryonen. Dabei kann ein signifikanter Einfluss der Herkunft im 2- und
Fluoreszenz-Intensität
4-Zell-Stadium, sowie bei Blastozysten beobachtet werden.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
*
In vitro
In vivo
*
n= n=
n= n=
10 13
11 13
Zygoten
2-Zeller
*
n= n=
n= n=
n= n=
n= n=
n= n=
9
13 19
11 10
15 11
9
11
4-Zeller
13
8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten
Abbildung 21: Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an DNMT3a
in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen (* P ≤ 0.05). Die Zahlen im unteren Bereich
der Säulen geben die Anzahl der untersuchten Embryonen je
Gruppe (n) an.
96
Ergebnisse
Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensität und damit des Proteingehaltes an
DNMT3a in in vivo gewonnenen frühen bovinen Embryonen ist der Abbildung 22 zu
entnehmen. Dabei ist ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität im
Fluoreszenz-Intensität
Blastozystenstadium im Vergleich zu den übrigen Embryonalstadien zu verzeichnen.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
A
B
B
B
B
Zygoten
2-Zeller
4-Zeller
B
8-Zeller
10-16-
B
Morulae
Blastozysten
Zeller
Abbildung 22: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt
an
DNMT3a
in
Embryonalstadien in vivo (A:B P ≤ 0.05)
97
präimplantatorischen
Ergebnisse
Die Abbildung 23 stellt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität und damit
des Proteingehaltes an DNMT3a in frühen in vitro produzierten Embryonen dar.
Dabei konnte ein signifikanter Unterschied der Fluoreszenzintensität bei 2-Zell-
Fluoreszenz-Intensität
Embryonen gegenüber den 4-Zell-Embryonen festgestellt werden.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
a
ab
Zygoten
ab
ab
ab
ab
Morulae
Blastozysten
b
2-Zeller
4-Zeller
8-Zeller
10-16Zeller
Abbildung 23: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt
an
DNMT3a
in
Embryonalstadien in vitro (a:b P ≤ 0.05)
98
präimplantatorischen
Ergebnisse
4.4
Lokalisation
der
Proteine
DNMT1
und
DNMT3a
im
Verlauf
der
präimplantatorischen Embryonalentwicklung bei in vivo und in vitro
generierten Embryonen
In allen untersuchten präimplantatorischen Embryonen konnten die Proteine DNMT1
bzw. DNMT3a im Zytoplasma der Blastomeren nachgewiesen werden. Unterschiede
in der Lokalisation gab es lediglich im Bereich des Zellkerns. Hier konnten drei
unterschiedliche Muster beobachtete werden: (1) deutlich schwächere bis keine
Färbung des Nukleus im Vergleich zum Zytoplasma, (2) gleichmäßige Färbung von
Zytoplasma und Kern und (3) Kernfärbung deutlich stärker als die des Zytoplasmas.
Dabei konnten sowohl Unterschiede bei Embryonen aus unterschiedlicher Herkunft
als auch im Verlauf der Embryonalentwicklung festgestellt werden.
4.4.1 Lokalisation der DNMT1
Bei einer Untersuchung der Lokalisation des Proteins DNMT1 war in den meisten
Zygoten bis 4-Zell-Embryonen unabhängig von der Herkunft eine gleichmäßige
Färbung des Zytoplasmas und des Kerns zu beobachten. Allerdings war bei vier von
18 In-vivo-Zygoten der Kernbereich deutlich schwächer gefärbt, als das Zytoplasma.
Das gleiche Phänomen trat bei einem von zehn 2-Zell-Embryonen und bei drei von
14 4-Zell-Embryonen aus in vitro Produktion auf. Bei den 2- und 4-Zellern war zum
Teil eine stärkere Färbung im äußeren Randbereich der Blastomeren zu erkennen.
Im 8-Zell-Stadium zeigten vier von 15 untersuchten IVP-Embryonen und einer von 16
in vivo generierten Embryonen eine gegenüber dem Zytoplasma verstärkte
Kernfärbung. Bei den 10 – 16-Zell-Stadien lag bei acht von 14 In-vivo-Embryonen
und bei 6 von 15 IVP-Embryonen eine deutliche Färbung des Zellkerns vor. Die
gleiche Beobachtung konnte bei dem überwiegenden Teil der In-vivo-Morulae (9 von
14) gemacht werden. Bei den in vitro produzierten Morulae zeigten lediglich 6 von 15
Embryonen eine gegenüber dem Zytoplasma verstärkte Kernfärbung. Bei den
Blastozysten konnte bei den In-vivo-Embryonen eine unterschiedliche Verteilung
zwischen ICM und TE festgestellt werden. Dabei konnte das Protein in der ICM
gleichmäßig im Zytoplasma und im Kern nachgewiesen werden, während der
Kernbereich im TE gegenüber dem Zytoplasma schwächer gefärbt war. Bei den In-
99
Ergebnisse
vitro-Embryonen war dagegen in einem Großteil der Blastozysten (7 von 10) der
Kern im TE ähnlich gefärbt, wie das Zytoplasma, während ein Embryo eine fehlende
Färbung des Zellkerns in der ICM aufwies.
Die Abbildung 24 zeigt Aufnahmen mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops. Darauf
ist die Proteinlokalisation der DNMT1 in den verschiedenen Embryonalstadien und
bei den unterschiedlichen Herkünften zu erkennen. Die einfarbig rote Seite stellt die
Färbung mit dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 647 dar. Je nach Stadium und
Herkunft ist dabei ein freier Kern, ein leicht gefärbter Kern oder ein deutlich gefärbter
Kern zu sehen. Auf der zweifarbigen Seite (merge) ist in rot der sekundäre Antikörper
und in grün die Zellkernfärbung mit SYTOX Green dargestellt (Abb.24).
In-vitro-Zygote
merge
In-vivo-Zygote
merge
In-vitro-2-Zeller
merge
In-vivo-2-Zeller
merge
In-vitro-4-Zeller
merge
In-vivo-4-Zeller
merge
Abbildung 24: Subzelluläre
Lokalisation
präimplantatorischen
der
Entwicklung
DNMT1
in
vitro
in
und
in
der
vivo
generierter Embryonen (ca. 200-fache Vergrößerung). Rot:
Verteilung der DNMT1; Grün: Zellkernfärbung
100
Ergebnisse
In-vitro-8-Zeller
merge
In-vivo-8-Zeller
merge
In-vitro-16-Zeller
merge
In-vivo-16-Zeller
merge
In-vitro-Morula
merge
In-vivo-Morula
merge
In-vitro-Blastozyste merge
Abbildung 24: Subzelluläre
In-vivo-Blastozyste merge
Lokalisation
präimplantatorischen
der
Entwicklung
DNMT1
in
vitro
in
und
in
der
vivo
generierter boviner Embryonen (ca. 200-fache Vergrößerung).
Rot:
Verteilung
der
(Fortsetzung)
101
DNMT1;
Grün:
Zellkernfärbung
Ergebnisse
Einen Überblick über das Verhältnis der Kernfärbung im Vergleich zu der Färbung
des Zytoplasmas bei den unterschiedlichen Entwicklungsstadien in vivo und in vitro
produzierter Embryonen zeigt die Tabelle 8. Dabei gibt die Intensität der Färbung
Auskunft über die subzelluläre Lage der DNMT1 im Zytoplasma oder im Zellkern.
Tabelle 8: Intensität der Kernfärbung im Vergleich zu der Färbung des
Zytoplasmas in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums der
Embryonen
Zygote
2-Zell-
4-Zell-
8-Zell-
10-16-Zell-
Embryo
Embryo
Embryo
Embryo
Morula
Blastozyste
DNMT1
ICM: o/−
In vitro
o
o/−
o/−
o/+
o/+
o/+
n=12
n=9/1
n=11/3
n=11/4
n=9/6
n=9/6
n=9/1
TE: o/−
n=7/3
ICM: o
In vivo
o/−
o
o
o/+
+/o
+/o
n=14
n=14/4
n=16
n=9
n=16/1
n=8/6
n=9/5
TE: −
n=14
o : Intensität der Kernfärbung identisch mit Färbung des Zytoplasmas
+: Intensität der Kernfärbung deutlich stärker als die des Zytoplasmas
− : Intensität der Kernfärbung schwächer als die des Zytoplasmas
102
Ergebnisse
4.4.2 Lokalisation der DNMT3a
Ähnlich wie bei der DNMT1 ist auch bei der Beurteilung der Lokalisation der
DNMT3a in dem überwiegenden Anteil der frühen Embryonen bis zum 8-ZellStadium eine gleichmäßige Farbverteilung zwischen Zellkern und Zytoplasma zu
beobachten. Allerdings ist bei der Hälfte der In-vivo-Zygoten (5 von 5) und bei drei
von
13
Zygoten
aus
IVP
eine
fehlende
Färbung
des
Zellkernbereiches
nachzuweisen. Das gleiche Phänomen zeigt auch einer von 11 in vivo gewonnenen
2-Zell-Embryonen, sowie einer von 19 in vitro produzierten 8-Zell-Embryonen. Im 10
- 16-Zell-Stadium liegt ein deutlicher Unterschied der Proteinlokalisation bei
Embryonen der unterschiedlichen Herkünfte vor. Während sechs (ausschließlich 16Zeller) der 11 in vivo generierten Embryonen eine gegenüber dem Zytoplasma
deutlich verstärkte Kernfärbung zeigen, ist dieses Phänomen bei den Embryonen
aus IVP nicht zu beobachten. Statt dessen liegt bei drei (davon zwei 16-Zeller) der
10 Embryonen eine deutlich schwächere Färbung im Kernbereich verglichen mit dem
Zytoplasma vor. Im Morula-Stadium zeigen sowohl die In-vivo- als auch die In-vitroEmbryonen eine gleichmäßige Verteilung zwischen Kern und Zytoplasma. Lediglich
bei zwei von 11 in vitro produzierten Morulae ist eine abgeschwächte Kernfärbung zu
erkennen. Bei den Blastozysten beider Herkünfte ist eine deutlich herabgesetzte
Färbung des Kernbereiches gegenüber dem Zytoplasma sowohl in der ICM als auch
im TE zu beobachten.
103
Ergebnisse
Die
subzelluläre
Proteinlokalisation
der
DNMT3a
in
den
verschiedenen
Embryonalstadien und bei den unterschiedlichen Herkünften zeigt die Abbildung 25.
Die einfarbig rote Seite eines Paares stellt nur den sekundären Antikörper Alexa
Fluor 647 dar. Je nach Stadium und Herkunft ist dabei ein freier Kern, ein leicht
gefärbter Kern oder ein deutlich gefärbter Kern zu erkennen. Die zweifarbige Seite
eines Paares (merge) zeigt den sekundären Antikörper zusammen mit der
Zellkernfärbung mit SYTOX Green (Abb. 25).
In-vitro-Zygote
merge
In-vivo-Zygote
merge
In-vitro-2-Zeller
merge
In-vivo-2-Zeller
merge
In-vitro-4-Zeller
merge
In-vivo-4-Zeller
merge
Abbildung 25: Subzelluläre
Lokalisation
präimplantatorischen
der
Entwicklung
DNMT3a
in
vitro
und
in
in
der
vivo
generierter boviner Embryonen (ca. 200-fache Vergrößerung).
Rot: Verteilung der DNMT1; Grün: Zellkernfärbung
104
Ergebnisse
In-vitro-8-Zeller
merge
In-vivo-8-Zeller
merge
In-vitro-16-Zeller
merge
In-vivo-16-Zeller
merge
In-vitro-Morula
merge
In-vivo-Morula
merge
In-vitro-Blastozyste
merge
Abbildung 25: Subzelluläre
In-vivo-Blastozyste merge
Lokalisation
präimplantatorischen
der
Entwicklung
DNMT3a
in
vitro
und
in
in
der
vivo
generierter boviner Embryonen (ca. 200-fache Vergrößerung).
Rot:
Verteilung
der
(Fortsetzung)
105
DNMT1;
Grün:
Zellkernfärbung
Ergebnisse
In Tabelle 9 ist eine Übersicht der Kernfärbung im Vergleich zur Zytoplasmafärbung
für die DNMT3a bei in vivo und in vitro generierten Embryonen unterschiedlicher
Entwicklungsstadien dargestellt.
Tabelle 9: Intensität der Kernfärbung im Vergleich zu der Färbung des
Zytoplasmas in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums der
Embryonen
Zygote
2-Zell-
4-Zell-
8-Zell-
10-16-Zell-
Embryo
Embryo
Embryo
Embryo
Morula
Blastozyste
DNMT3a
ICM: −
In vitro
o/−
o
o
o/−
o/−
o/−
n=13
n=10/3
n=13
n=11
n=18/1
n=7/3
n=9/2
TE: −
n=13
ICM: −
In vivo
o/−
o/−
o
o
+/o
o
n=5/5
n=10/1
n=9
n=13
n=6/5
n=15
n=9
TE: −
n=9
o : Intensität der Kernfärbung identisch mit Färbung des Zytoplasmas
+: Intensität der Kernfärbung deutlich stärker als die des Zytoplasmas
− : Intensität der Kernfärbung schwächer als die des Zytoplasmas
106
Diskussion
5 Diskussion
Zwischen in vivo generierten und in vitro produzierten Embryonen bestehen
qualitative und quantitative Unterschiede. Diese Unterschiede zeigen sich sowohl auf
morphologischer und biochemischer (GREVE et al. 1995; KHURANA u. NIEMANN
2000b) als auch auf molekularer Ebene (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000;
LONERGAN et al. 2001; NIEMANN et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2005b). Davon
betroffen
sind
unter
anderem
die
DNA-Methyltransferasen,
die
in
der
Transkriptionsregulation und der epigenetischen Reprogrammierung des Genoms in
der frühen Embryonalentwicklung eine entscheidende Rolle spielen (HÖFFMANN et
al. 2006). Bisherige vergleichende Studien zu der DNMT1 und DNMT3a, in denen
frühe bovine in vivo und in vitro produzierte Embryonen untersucht wurden, bezogen
sich auf die mRNA-Expression (HÖFFMANN et al. 2006). Auf Proteinebene liegt
dagegen für das Rind bisher nur eine Studie vor, in denen die DNMT1 in den
verschiedenen
präimplantatorischen
Entwicklungsstadien
von
IVP-Embryonen
miteinander verglichen wurde (RUSSELL u. BETTS 2005). Ziel der vorliegenden
Arbeit war deshalb die vergleichende Darstellung der Proteine DNMT1 und DNMT3a
in frühen in vivo generierten und in vitro produzierten präimplantatorischen
Embryonen des Rindes. Dabei dienten die in vivo gewonnenen Embryonalstadien im
Vergleich zu den IVP-Embryonen als sogenannter „Goldener Standard“, da nur die
physiologische Umgebung die optimalen Bedingungen für eine ungestörte
Embryonalentwicklung bietet (LAZZARI et al. 2002, LONERGAN et al. 2003,
WRENZYCKI et al. 2005a). Es gilt jedoch zu beachten, dass die In-vivo-Embryonen
nach einer Superovulation gewonnen wurden. So beschrieben ERTZEID und
STORENG (2001) eine gestörte Entwicklung bei durch Superovulation erzeugten
Mäuse- und Hamsterembryonen.
Im
ersten
Teil
der
vorliegenden
Arbeit
wurden
die
bovinen
tubalen
präimplantatorischen Embryonalstadien mittels transvaginaler Endoskopie bzw. Invitro-Produktion gewonnen. Im zweiten Teil wurde die Immunzytochemie zur
Darstellung der Proteine DNMT1 und DNMT3a etabliert. Dabei wurde die
Fluoreszenz-Intensität als Maß für den Proteingehalt und die Proteinlokalisation in
107
Diskussion
den in vivo und in vitro produzierten Embryonalstadien von der Zygote bis zur
Blastozyste vergleichend untersucht.
5.1
Transvaginale Endoskopie
Die transvaginale Endoskopie ist eine minimalinvasive Methode zur Gewinnung
tubaler Embryonalstadien (HAVLICEK et al. 1999; BESENFELDER et al. 2001). Sie
stellt ein sehr schonendes Verfahren dar, da im Vergleich zu laparoskopischen oder
konventionell
chirurgischen
Verfahren
lediglich
das
dorsale
Scheidendach
durchstoßen werden muss, welches an der entsprechenden Stelle nur wenige mm
dick und sehr regenerationsfähig ist. Bei einer späteren Schlachtung der
endoskopierten Tiere kann die Zugangsstelle im Fornix vaginae nur in wenigen
Fällen als kleine Einziehung im Schleimhautrelief dargestellt werden (MÖSSLACHER
et al. 2001). Bei dem transvaginalen Zugang ist lediglich eine sehr geringgradige
Manipulation der Geschlechtsorgane notwendig, da der Eingriff in situ durchgeführt
werden kann, ohne die Geschlechtsorgane vorzuverlagern. Aus diesem Grund kann
diese Methode wiederholt und ohne nachteilige Effekte auf die spätere Nutzung der
Tiere angewendet werden. Ein Großteil der Tiere aus dem Hauptversuch war nach
zum Teil wiederhohlter endoskopischer Nutzung im März 2008 tragend (28 von 45)
oder besamt (9 von 45) und auch die drei bereits stattgefundenen Kalbungen
verliefen komplikationslos (vgl. Kap. 3.2.1). Diese Zahlen zeigen, dass die
transvaginale Endoskopie nur eine sehr geringe Belastung für die Tiere darstellt und
die spätere Nutzung der Tiere nicht beeinträchtigt.
Der einzige kritische Moment bei dieser Methode ist das blinde ruckartige
Vorschieben des scharfen Trokars, mit dem das dorsale Vaginaldach durchstoßen
und die Bauchhöhle eröffnet wird. Dabei kann es zu einer Verletzung von diversen
Organen in der Becken- und Bauchhöhle kommen (z.B. A. iliaca, Blase, Darm,
Pansen, knöchernes Becken etc.), weshalb eine manuelle rektale Kontrolle des
Operationsbereiches vor der Trokarierung notwendig ist.
108
Diskussion
Im Rahmen der Hauptversuche wurden in dieser Arbeit 50 endoskopische
Spülungen bei 45 Tieren durchgeführt. Dabei konnten bei 43 Tieren beide Seiten
erfolgreich gespült werden. Bei drei Tieren konnte die Spülkanüle nur auf einer Seite
inseriert werden, bei vier Tieren war keine Insertion möglich. Bei drei Spülungen
entwich die Spülflüssigkeit durch defekte Spülkatheter. Insgesamt konnten bei 43
erfolgreichen Spülungen 419 Embryonalstadien gewonnen werden.
Im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, insbesondere der
Arbeitsgruppe um Prof. U. Besenfelder in Wien, sind sowohl die Wiederfindungsrate
mit 68% als auch die Zahl der intakten Embryonen, also Embryonen von exzellenter
oder guter Qualität, mit 72% geringer als bei anderen Veröffentlichungen. So
berichteten BESENFELDER et al. (2001) über Wiederfindungsraten von 72-105%,
wobei der Anteil an intakten Embryonen 92-97,5% betrug. MÖSSLACHER et al.
(2001) hatten bei einer Wiederfindungsrate von 89% einen Anteil an intakten
Embryonen von 85% zu verzeichnen.
Die niedrigere Wiederfindungsrate kann auf verschiedenen Ursachen beruhen. So
verwendet die Arbeitsgruppe um Prof. U. Besenfelder eine verbesserte Spülkanüle
(BESENFELDER et al. 2001), durch die der Rückfluss der Spülflüssigkeit in den
Bauchraum verhindert wird, zum anderen ist aber auch zusätzlich der Routine des
Operateurs Rechnung zu tragen. Eine weitere Möglichkeit stellt die Genauigkeit des
Zählens der Corporea lutea dar. So ist bei nah beieinander liegenden Gelbkörpern
und frischen Ovulationsstellen auf dem Ovar die korrekte Zahl der Gelbkörper nicht
immer eindeutig festzustellen. Dies gilt besonders für die alleinige rektale
palpatorische Zählung. Da bei der verwendeten Methode die Gelbkörper jedoch
zusätzlich optisch mit dem Endoskop dargestellt werden können, kann die korrekte
Anzahl mit größerer Genauigkeit festgestellt werden.
Für die im Vergleich zu BESENFELDER et al. (2001) und MÖSSLACHER et al.
(2001) geringere Anzahl an intakten Embryonen (72% gegenüber 92-97,5%)
kommen verschiedene Gründe in Frage. So wurde in den oben genannten
Versuchen
reines
aufgereinigtes
FSH
(Folltropin-V,
Vetrepharm)
für
die
Superovulation verwendet, während in der vorliegenden Arbeit das Pluset
eingesetzt wurde. Darin ist neben FSH auch LH enthalten, das laut MAPLETOFT et
109
Diskussion
al. (2006) besonders in hohen Dosen zu einer prämaturen Aktivierung der Oozyten
und zu einer schlechteren Embryonenqualität führen soll. Des weiteren spielen die
unterschiedlichen Rassen (Holstein Frisian vs. Fleckvieh) und die vorausgegangene
Nutzung der Tiere eine Rolle. So wurde der Großteil der in dieser Arbeit verwendeten
Rinder (38 von 45) bereits als präpuberale Kälber für einen anderen Versuch (OPU)
mit Pluset superstimuliert, was laut MAPLETOFT et al. (2002) ebenfalls die Zahl
der Embryonen beeinflussen kann.
5.2
Immunzytochemie
In dieser Arbeit wurde die Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an
DNMT1 und DNMT3a bei bovinen präimplantatorischen in vivo und in vitro
generierten Embryonen nach immunzytochemischer Markierung am konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskop gemessen. Gleichzeitig wurden Untersuchungen zur
Proteinlokalisation
im
Zytoplasma
und
Zellkern
bei
den
verschiedenen
Embryonalstadien durchgeführt. Ähnliche Untersuchungen zur Quantifizierung von
Immunfluoreszenz in Embryonen wurden bereits durch verschiedene Arbeitsgruppen
beschrieben (KELKAR et al. 2003; BEAUJEAN et al. 2004; YANG et al. 2007;
ZAITSEVA et al. 2007). Dabei untersuchten BEAUJEAN et al. (2004) und YANG et
al. (2007) die globale DNA-Methylierung in frühen Schaf- und RhesusaffenEmbryonen. Dazu wurden die Zellkerne manuell umrandet und die nukleäre
Intensität
der
Fluoreszenzintensität
gemessen.
Nach
Abzug
der
Hintergrundfluoreszenz wurde die Intensität mittels ImageJ ermittelt. Eine
Quantifizierung der Immunfluoreszenz von kompletten Embryonen wurde von
KELKAR et al. (2003) durchgeführt. Dazu wurde der Gehalt an Fas-Protein mittels
indirekter Immunzytochemie in frühen Mäuse-Embryonen mit der Biovis Image
Analysis Software bestimmt. Eine einfache Methode zur Untersuchung der
Kolokalisationen von nukleären Proteinen mittels Immunfluoreszenz am konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskop beschrieben CARMONA et al. (2007). Die am konfokalen
Mikroskop erstellten Bilder können dabei mittels ImageJ-Software in verschiedene
Kanäle aufgesplittet werden. Aus den nichtschwarzen Pixeln, die in beiden Kanälen
110
Diskussion
auftreten, kann dann ein neues Bild erstellt werden. Auf diese Weise kann ein Bild
ohne extranukleäre Färbung und ohne Hintergrundfluoreszenz erzeugt werden, das
als Grundlage für Vergleiche und Quantifizierungen herangezogen werden kann
(CARMONA et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kombination der
beschriebenen Methoden verwendet, wobei die konfokalen Bilder in ImageJ in
verschiedene Kanäle aufgesplittet, die Embryonen manuell umrandet und die
Hintergrundfärbung abgezogen wurde.
Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass neben der quantitativen Untersuchung
des Proteingehalts gleichzeitig eine Untersuchung zur Proteinlokalisation in
denselben Embryonen vorgenommen werden kann. Dadurch reduziert sich die Zahl
der für die Untersuchungen benötigten Embryonen. Ein großer Nachteil dieser
Methode ist der Verlust der Fluoreszenzintensität mit zunehmender Tiefe des
Präparates. So kommt es ab einer Tiefe von 10-15µm zu einem signifikanten Verlust
des Signals und es besteht aufgrund verschiedener optischer Voraussetzungen in
unterschiedlichen Geweben keine einfache Möglichkeit der Tiefenkorrektur (DAMLE
et al. 2006). Aus diesem Grund erfolgte in der vorliegenden Arbeit eine semiquantitative Auswertung, wobei jeweils ein zentraler Schnitt durch den Embryo für die
Beurteilung herangezogen wurde.
5.2.1 DNMT1
Für die DNMT1 konnten sowohl signifikante Unterschiede der Fluoreszenzintensität
zwischen den verschiedenen Herkünften als auch innerhalb einer Herkunft im Verlauf
der Embryonalentwicklung festgestellt werden.
Innerhalb der in vivo gewonnenen Gruppe zeigten die Morulae gegenüber den
Zygoten, 2- und 8-Zellern eine signifikant erhöhte Fluoreszenzintensität. Ebenso war
in den Blastozysten eine signifikant stärkere Fluoreszenz als in Zygoten und 8-ZellEmbryonen nachweisbar. Dabei war zunächst ein relativ konstanter Proteingehalt mit
einem leichten Anstieg im 4-Zell-Stadium gefolgt von einem Minimum im 8-ZellStadium zu beobachten. Danach nahm der Proteingehalt ab dem 10-16-Zell-Stadium
zu und erreichte schließlich im Morula-Stadium sein Maximum. In den Blastozysten
111
Diskussion
war ein leichter Abfall der Fluoreszenzintensität gegenüber den Morulae zu
beobachten, wobei die Fluoreszenz jedoch gegenüber den Zygoten und 8-Zellern
signifikant erhöht blieb. Bei der Untersuchung der Proteinlokalisation war während
der frühen Embryonalentwicklung eine gleichmäßige Färbung des Zytoplasmas und
des Kerns zu erkennen. Lediglich in einigen In-vivo-Zygoten war der Kern frei von
DNMT1-Protein. Im 10-16-Zell-Stadium und bei den Morulae lag bei den In-vivoEmbryonen eine deutlich ausgeprägte Kernfärbung vor.
Dieser Verlauf des Proteingehaltes und der Proteinlokalisation wurde in ähnlicher
Form auch von RUSSEL und BETTS (2005) beschrieben. Dabei konnte bei in vitro
produzierten präimplantatorischen bovinen Embryonen mittels Westernblotanalysen
ein niedriger Proteingehalt mit einem signifikanten Anstieg im 16-Zell- und MorulaStadium
nachgewiesen
werden.
Gleichzeitig
konnten
die
Autoren
mittels
Immunzytochemie ebenfalls eine Proteinlokalisation im Zellkern der 16-ZellEmbryonen beobachten. Der Anstieg des Proteingehalts und die Kernlokalisation der
DNMT1 im 16-Zell-Stadium deutet laut RUSSEL und BETTS (2005) auf eine Rolle
der DNMT1 während der sogenannten großen embryonalen Genomaktivierung hin,
die beim Rind im 8-16-Zell-Stadium einsetzt (TELFORD et al. 1990, MEMILI u.
FIRST 2000).
Im Vergleich zu den Ergebnissen von RUSSEL und BETTS (2005), die
ausschließlich
in
vitro
produzierte
präimplantatorische
Rinderembryonen
untersuchten, konnte in dieser Arbeit ein abweichender Verlauf des Proteingehaltes
bei IVP-Embryonen beobachtet werden. Wie bei den In-vivo-Embryonen konnte auch
hier ein Maximum an Fluoreszenz im Morula-Stadium beobachtet werden, jedoch
war die Intensität gegenüber den In-vivo-Morulae signifikant vermindert. Das
Minimum an Fluoreszenz lag bei den IVP-Embryonen im 4-Zell-Stadium vor,
während im 8-Zell-Stadium bereits eine erneute Zunahme des Proteingehaltes
beobachtet werden konnte. Zudem war bei den In-vitro-Blastozysten ein signifikanter
Abfall der Fluoreszenzintensität gegenüber den Morulae nachzuwiesen.
Bei einem Vergleich der beiden Herkünfte war die Fluoreszenz-Intensität bei den 4und 10-16-Zellern, sowie bei Morulae und Blastozysten in vitro gegenüber den in vivo
112
Diskussion
produzierten Stadien signifikant vermindert. Diese Unterschiede zwischen den
verschiedenen Herkünften könnten weitreichende Folgen für die embryonale
Entwicklung
haben.
Da
die
DNMT1
als
Erhaltungsmethyltransferase
die
Methylierungsmuster der DNA bei der Zellteilung aufrecht erhält, könnten aus diesen
in vitro signifikant verringerten Proteingehalten Störungen der Transkriptionsregulation entwicklungsrelevanter Gene abgeleitet werden. In den meisten Fällen
kommt es in Folge der Methylierung zu einer Transkriptionshemmung, so dass ein
verminderter Gehalt an DNMT1-Protein zu einer verstärkten Transkription führen
könnte. Für verschiedene entwicklungsrelevante Gene konnte eine erhöhte
Transkription bei Embryonen aus IVP festgestellt werden. Davon betroffen sind unter
anderem Gene, die mit Apoptose und oxidativem Stress in Zusammenhang stehen
(Bax, SOX), Gene, die an der interzellulären Kommunikation beteiligt sind (Cx31),
sowie Gene für die Differenzierung und Implantation (LIF, LR-ß; RIZOS et al. 2002a,
LONERGAN et al. 2003a; WRENZYCKI et al. 2005b).
Die unterschiedlichen Verläufe des Proteingehaltes bei Embryonen aus IVP
zwischen der Arbeit von RUSSEL und BETTS (2005) und der hier durchgeführten
Untersuchung können unter anderem in der Verwendung unterschiedlicher IVPProtokolle und dem Einsatz einer abweichenden Proteinsupplementation (Serum,
BSA, PVA) liegen. So beschrieben FARIN et al. (2004), dass für Embryonen des
gleichen Entwicklungsstadiums häufig abweichende Genexpressionsprofile zwischen
verschiedenen Laboratorien beobachtet werden können. WRENZYCKI et al. (2001)
beschrieben eine variierende Genexpression bei der Verwendung des gleichen
Mediums mit verschiedenen Protein-Zusätzen (Serum, BSA, PVA), die jedoch bei
einer Standardisierung durch PVA-Zusatz aufgehoben werden kann. Solche
Abweichungen,
wie
sie
bei
der
Genexpression
auftreten,
könnten
auch
Auswirkungen auf die Proteingehalte haben.
Neben signifikanten Unterschieden im Proteingehalt zwischen In-vivo- und in vitro
produzierten Embryonen konnten auch Abweichungen der Proteinlokalisation
festgestellt werden. Dabei zeigten mehrere IVP-Embryonen bereits im 8-Zell-Stadium
eine verstärkte Kernfärbung, während die in vivo produzierten Embryonen mit einer
113
Diskussion
Ausnahme lediglich eine gleichmäßige Färbung von Zytoplasma und Kern
aufwiesen. Dagegen war in der Mehrzahl der in vitro produzierten 10-16-Zeller keine
verstärkte Fluoreszenz-Intensität im Zellkern zu beobachten. Diese Ergebnisse
weichen von den Beobachtungen in der In-vivo-Gruppe ab, wo im 10-16-ZellStadium und bei Morulae eine deutliche Fluoreszenz im Zellkern beobachtet werden
konnte.
Bei der Maus konnte nachgewiesen werden, dass die Translokation der DNMT1o in
den Zellkern, die bei der Maus im 8-Zell-Stadium stattfindet, zeitgesteuert verläuft
(DOHERTY et al. 2002). So zeigten Untersuchungen von DOHERTY et al. (2002),
dass der Mechanismus der Translokation unabhängig von der Kompaktierung, der
DNA-Replikation, der Protein-Synthese oder dem Zellkontakt ist, die DNMT1o jedoch
zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Fertilisation in den Zellkern gelangt. Sofern
der gleiche Mechanismus auch für das Rind gilt, könnte die nukleäre Lokalisation der
DNMT1 im 8-Zell-Stadium auf eine verzögerte Furchung in den in vitro produzierten
Embryonen hindeuten. So befänden sich die betroffenen Embryonen zu einem
Zeitpunkt, in dem sie schon als 10-16-Zeller vorliegen sollten, noch im 8-ZellStadium. Auch der geringe Proteingehalt an DNMT1 im 4-Zell-Stadium der IVPEmbryonen, der bei den In-vivo-Stadien erst im 8-Zeller zu beobachten ist, deutet auf
eine solche Möglichkeit hin. Gestützt wird diese These durch eine Untersuchung von
GUTIÉRREZ-ADÁN et al. (2004), die eine Korrelation zwischen Furchungsgeschwindigkeit und mRNA-Expressionsmustern bei in vivo und in vitro produzierten
Embryonen beschreiben. Dabei konnte gezeigt werden, dass In-vitro-Embryonen und
Embryonen mit einer langsamen Entwicklungsgeschwindigkeit für bestimmte Gene
eine
abweichende
mRNA-Expression
gegenüber
In-vivo-Embryonen
oder
Embryonen mit einer hohen Entwicklungsgeschwindigkeit aufweisen. Ähnliche
Beobachtungen konnten auch WRENZYCKI et al. (2001) für das stressinduzierte
HSP-Gen
machen.
Diese
Abweichungen
könnten
durch
ein
verändertes
Methylierungsmuster entstehen, das auf einer nukleären Lokalisation der DNMT1 im
falschen Zellstadium beruht.
Die in den übrigen Stadien beobachtete gleichmäßige Färbung von Zellkern und
Zytoplasma deutet auf eine gleichmäßige Verteilung der DNMT1 in den Blastomeren
114
Diskussion
präimplantatorischer boviner Embryonen hin. Lediglich einige In-vivo-Zygoten weisen
eine fehlende Kernfärbung auf. Dieses Färbemuster könnte das Resultat einer
ähnlichen Proteinverteilung wie bei der Maus sein.
Aufgrund der im Vergleich zur oozytenspezifischen Isoform (DNMT1o) geringen
Menge an somatischer DNMT1 (DNMT1s) und der Verwendung verschieden
sensitiver Antikörper konnte in den präimplantatorischen Embryonen der Maus lange
Zeit nur die kurze oozytenspezifische Isoform DNMT1o nachgewiesen werden
(KURIHARA et al. 2008). Sie ist maternalen Ursprungs und befindet sich mit
Ausnahme
des
8-Zell-Stadiums
ausschließlich
im
Zytoplasma.
Neuere
Untersuchungen zeigen dagegen, dass auch die somatische Isoform DNMT1s in
sehr geringem Umfang in den frühen Embryonalstadien vorhanden ist (CIRIO et al.
2008; KURIHARA et al. 2008). Ihre Konzentration erreicht einen Tiefstand im 2- und
4-Zell-Stadium, nimmt dann jedoch wieder zu und erreicht ein Maximum im
Blastozysten-Stadium. Laut CIRIO et al. (2008) deuten diese Unterschiede im
Proteingehalt auf eine kombinierte maternale und embryonale Proteinsynthese hin.
Mit
Ausnahme
des
pronukleären
1-Zell-Stadiums,
wo
die
DNMT1s
rein
zytoplasmatisch auftritt, ist das Protein hauptsächlich im Zellkern zu finden. Die
Aufgabe der DNMT1s im Zellkern präimplantatorischer Embryonen sehen CIRIO et
al.
(2008)
und
KURIHARA
et
al.
(2008)
in
der
Aufrechterhaltung
der
Methylierungsmuster geprägter Gene in der frühen Embryonalentwicklung, während
die DNMT1o für die Vererbung der genomischen Imprints im 8-Zell-Stadium bei der
Maus verantwortlich ist. Dabei scheinen die Oozyten-synthetisierte DNMT1o und die
zygotische (embryonale) DNMT1s unterschiedliche Funktionen bei der Erhaltung der
Methylierungsmuster geprägter Gene zu besitzen, wobei sie jedoch gemeinsam die
korrekte Vererbung der geprägten Gene sichern (CIRIO et al. 2008).
Diese beiden Isoformen, die neben der Maus auch beim Menschen nachgewiesen
werden konnten (HAYWARD et al. 2003), könnten möglicherweise auch beim Rind
existieren. Der in dieser Arbeit verwendete Antikörper ist gegen die letzten 100
Aminosäuren der menschlichen DNMT1 gerichtet. Diese Sequenz stimmt zu 98% mit
den Aminosäuren der bovinen DNMT1 an den Stellen 1513-1611 überein und könnte
sowohl die DNMT1o als auch die DNMT1s markieren. Dadurch wäre der Zellkern
115
Diskussion
aufgrund eines geringen DNMT1s-Gehaltes leicht gefärbt, während die DNMT1o im
Zytoplasma nachweisbar wäre. Die starke Kernfärbung im 10-16-Zell-Stadium und in
den Morulae würde dann auf der Translokation der DNMT1o in den Zellkern
beruhen. Laut CIRIO et al. (2008) weisen pronukleäre 1-Zell-Embryonen der Maus
keine Kernlokalisation der DNMT1s auf. In der vorliegenden Arbeit zeigten einige
Rinder-Zygoten eine fehlende Kernlokalisation, was durch die Abwesenheit der
DNMT1s-Form, ähnlich wie bei der Maus, zu erklären wäre. Die Lokalisation der
DNMT1 im Zellkern anderer Zygoten könnte dann möglicherweise ein Hinweis auf
ein fortgeschrittenes 1-Zell-Stadium kurz vor der Furchung zum 2-Zeller sein. Bislang
ist es allerdings nicht gelungen, eine oozytenspezifische Isoform der DNMT1 beim
Rind nachzuweisen. Statt dessen deuten neueste Untersuchungen darauf hin, dass
keine oozytenspezifische Variante von DNMT1 beim Rind existiert (RUSSELL u.
BETTS 2008). So konnten RUSSELL und BETTS (2008) zwar eine neue Variante
der DNMT1 nachweisen (DNMT1b), die jedoch wie die bisher bekannte DNMT1
ubiquitär in allen Geweben exprimiert wird. Diese neue DNMT1b-Variante ist nur in
geringen Mengen in ungereiften Oozyten, in etwas höheren Mengen in fetaler Leber
und fetalen Gonaden und in den höchsten Mengen in fetalen Muskelpräparaten
nachzuweisen (RUSSELL u. BETTS 2008). Dagegen konnte kein Hinweis auf einen
alternativen Promotor oder ein alternatives erstes Exon gefunden werden, wie es bei
der Maus für die DNMT1o existiert (RUSSELL u. BETTS 2008).
Bei in vivo generierten Blastozysten war die DNMT1 überwiegend im Kern der
Blastomeren der ICM zu finden, während die Kerne des TE weitgehend frei von
Protein waren. Diese Ergebnisse könnten Untersuchungen zum globalen DNAMethylierungsmuster in präimplantatorischen Embryonen erklären. So beschrieben
SANTOS et al. (2003) eine Hypermethylierung der DNA in der ICM, während die
DNA im TE hypomethyliert ist. Die Hypomethylierung im TE wäre durch die
zytoplasmatische Lage der DNMT1 in den Blastomeren des TE zu erklären. Dabei
könnte die Methylierung im TE bei der Zellteilung nicht aufrecht erhalten werden und
es käme zu einer im Vergleich zu den Zellen der ICM verminderten Methylierung des
Genoms. Bei einigen untersuchten IVP-Blastozysten war auch in den Kernen des TE
116
Diskussion
eine deutliche Fluoreszenz nachweisbar. Das Vorhandensein der DNMT1 im Zellkern
der Blastomeren des TE könnte zu einer verstärkten Methylierung des Genoms des
Trophektoderms und damit zu einer veränderten Transkriptionsregulation führen.
SANTOS et al. (2003) beschrieben eine deutliche Methylierung der DNA im TE bei
geklonten Embryonen, wobei allerdings in vitro produzierte Embryonen als Kontrolle
dienten. Die Asymmetrie der Methylierung könnte bei einem Vergleich mit in vivo
generierten Blastozysten noch deutlicher ausfallen. So konnten ZAITSEVA et al.
(2007) nachweisen, dass der Anteil methylierter DNA bei Ratten und Mäusen aus Invitro-Produktion gegenüber In-vivo-Embryonen signifikant erhöht ist.
Durch eine veränderte Methylierung aufgrund der nukleären Lokalisation der DNMT1
im TE von IVP-Embryonen könnten Störungen der Genexpression erklärt werden,
die in IVP-Blastozysten auftreten (WRENZYCKI et al. 2004). Laut FARIN et al.
(2006) können durch inadäquate Kulturbedingungen inkorrekte epigenetische Muster
entstehen, die die Gen-Expression beeinflussen. Diese veränderte Expression
geprägter
und
nicht-geprägter
Gene,
die
für
die
Wachstums-
und
Entwicklungsregulation verantwortlich sind, können schließlich zum „Large Offspring
Syndrome“ führen (LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2004; FARIN et al.
2006).
5.2.2 DNMT3a
Für die DNMT3a konnten bei den In-vivo-Embryonen signifikante Unterschiede der
Fluoreszenzintensität
zwischen
frühen
präimplantatorischen
Embryonen
und
Blastozysten nachgewiesen werden. Dabei war die Intensität und damit der
Proteingehalt bei den In-vivo-Blastozysten signifikant höher als in den übrigen
Stadien.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, das der DNMT3a eine besondere Bedeutung im
Blastozystenstadium zukommt. Interessanterweise ist das Protein gerade zu diesem
Zeitpunkt ausschließlich im Zytoplasma sowohl der ICM als auch des TE zu finden,
scheint also in den Blastozysten keine De-novo-Methylierungsaktivität zu verrichten.
Jedoch könnte die DNMT3a eine entscheidende Rolle bei der Gewebedifferenzierung einnehmen. OKANO et al. (1999) beschrieben die Möglichkeit, dass
117
Diskussion
die DNMT3a für die Organisation und Einteilung des Genoms während der
Gewebedifferenzierung und für die Etablierung gewebespezifischer Genexpressionsmuster verantwortlich ist. Das könnte bedeuten, dass dass in den Blastozysten
verstärkt gebildete DNMT3a-Protein erst während der Gewebediffernzierung in den
Kern gelangt und dort aktiv wird.
Im Gegensatz zu den Blastozysten kann die DNMT3a bei in vivo generierten 16-ZellEmbryonen verstärkt im Zellkern nachgewiesen werden. Zu diesem Zeitpunkt findet
die De-novo-Methylierung des Genoms bei bovinen Embryonen statt. Dies entspricht
der These von LEES-MURDOCK et al. (2005), dass die DNMT3a nur im Zellkern
nachgewiesen werden kann, wenn eine Methylierung stattfindet. Obwohl also der
Proteingehalt zu diesem Zeitpunkt signifikant niedriger als im Blastozystenstadium
ist, scheint die DNMT3a dennoch von großer Bedeutung für die Wiederherstellung
der Methylierung zu sein. Laut HERMANN et al. (2004) führt die DNMT3a nur eine
Methylierung an speziellen Gen-Loci durch, wobei besonders Gene betroffen sind,
die während der Embryonalentwicklung und/oder der Geburt von Bedeutung sind
(OKANO et al. 1999), wohingegen die DNMT3b für die Methylierung CG-reicher
DNA-Sequenzen verantwortlich ist. Das könnte der Grund sein, weshalb schon
geringe Mengen an DNMT3a-Protein für die spezielle De-novo-Methylierungsaktivität
ausreichend sind, sofern sie zum richtigen Zeitpunkt an die entsprechenden GenLoci gelangt. Bei den in vitro produzierten 10-16-Zellern ist diese Translokation in
den Zellkern nicht zu beobachten. Hier lag entweder eine gleichmäßige Verteilung
der Fluoreszenz im Kern und Zytoplasma oder eine ausschließliche ZytoplasmaFärbung vor. Das deutet auf eine gestörte De-novo-Methylierung an den
entsprechenden Gen-Loci und eine gestörte Transkriptionsregulation bei den IVPEmbryonen hin. In Folge der fehlenden De-novo-Methylierung müsste in den IVPEmbryonen eigentlich eine Hypomethylierung zu beobachten sein. Das wiederspricht
der Beobachtung von ZAITSEVA et al. (2007), die bei Ratten und Mäusen aus IVP
gegenüber den In-vivo-Kontrollen einen signifikant erhöhten Anteil methylierter DNA
beschreiben. Jedoch ist die DNMT3a laut HERMANN et al. (2004) nur für die
Methylierung spezieller Gen-Loci verantwortlich, während die CG-reichen DNASequenzen von der DNMT3b methyliert werden sollen. In der vorliegenden Arbeit
118
Diskussion
wurden keine Untersuchungen zu dem Proteingehalt und der Lokalisation der
DNMT3b gemacht. Jedoch wurde für die DNMT3b kein signifikanter Unterschied der
mRNA-Transkription zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen
nachgewiesen (HÖFFMANN et al. 2006). Bei einer ungestörten DNMT3b-ProteinTranslation würde damit der Großteil der De-novo-Methylierung ungestört verlaufen.
Bei der Untersuchung des Proteingehaltes bei in vitro produzierten Embryonen
konnten signifikante Unterschiede zwischen 2- und 4-Zell-Embryonen nachgewiesen
werden. Dabei war die Fluoreszenzintensität der 2-Zeller gegenüber den 4-Zellern
signifikant erhöht. Zudem lagen auch signifikante Unterschiede im Vergleich mit den
In-vivo-Embryonen vor. Während die IVP-Embryonen im 2-Zell-Stadium signifikant
höhere Proteingehalte als die In-vivo-Embryonen besaßen, war im 4-Zell-Stadium ein
gegenteiliger Effekt nachweisbar. Diese signifikanten Unterschiede könnten auf eine
Störung der Transkriptionsregulation zum Zeitpunkt der „kleinen“ embryonalen
Genomaktivierung („minor activation“) hindeuten.
5.3
Zusammenhang
zwischen
mRNA-Expression
und
Proteingehalt
in
präimplantatorischen Embryonen
Vergleicht man die DNMT1 und DNMT3a-Proteingehalte der verschiedenen In-vivoStadien mit der relativen Häufigkeit der mRNA-Transkripte (HÖFFMANN et al. 2006),
fällt eine deutliche Diskrepanz auf.
Obwohl bei der DNMT1 von der Zygote bis zum 4-Zeller zunächst viele mRNATranskripte vorliegen, ist der Proteingehalt in diesen Stadien gering. Im 8-ZellStadium kommt es zu einem signifikanten Abfall der mRNA, wohingegen der
Proteingehalt leicht verzögert nach einem Minimum im 8-Zell-Stadium ab dem 10-16Zell-Stadium zunimmt und ein Maximum in den Morulae erreicht. Zu diesem
Zeitpunkt sind aber kaum Transkripte nachweisbar (HÖFFMANN et al. 2006).
Bei Untersuchungen zur DNMT3a konnten bei den in vivo generierten Embryonen in
den frühen Stadien nur geringe Mengen an mRNA nachgewiesen werden, während
es bei den Blastozysten zu einem signifikanten Anstieg der Transkriptmenge kam
(HÖFFMANN et al. 2006). Ein ähnlicher Verlauf konnte auch bei der Bestimmung
119
Diskussion
des Proteingehaltes nachgewiesen werden. Daraus kann der Schluss gezogen
werden,
dass
Transkriptgehaltes
bei
im
den
In-vivo-Embryonen
Blastozystenstadium
der
auch
Anstieg
zu
einem
des
relativen
Anstieg
des
Proteingehaltes führt. Bei den in vitro produzierten Embryonen lag dagegen ein
abweichender Verlauf vor. Obwohl bei den IVP-Blastozysten ein signifikant höherer
mRNA-Gehalt gegenüber den In-vivo-Blastozysten nachgewiesen werden konnte
(HÖFFMANN et al. 2006), fehlt dieser Anstieg auf der Proteinebene.
Für diese Abweichungen zwischen mRNA und Protein-Expression könnte es
verschiedene Ursachen geben.
1. Anhäufung maternaler mRNA und Proteine in den Oozyten und Übertragung
in die transkriptionell inaktiven frühen Embryonalstadien
2. Schutz der (maternalen) mRNA vor einer vorzeitigen Translation bzw. einem
Abbau z.B. durch die Bildung von messenger Ribonukleoprotein-Komplexen
(mRNPs)
3. Lange Halbwertszeit der Proteine aufgrund einer hohen Proteinstabilität
4. Fehlende Translation
Bei der Maus konnte nachgewiesen werden, dass sowohl die mRNA für die DNMT1o
als auch das DNMT1o-Protein in den reifenden Oozyten akkumuliert wird
(MERTINEIT et al. 1998) und auch das DNMT1s-Protein ist bei der Maus zunächst
maternalen Ursprungs (CIRIO et al. 2008). Erst ab dem 1-Zell-Stadium wird die
somatische Isoform der DNMT1s vom Embryo selbst gebildet (CIRIO et al. 2008),
während die DNMT1o ausschließlich maternalen Ursprungs ist (MERTINEIT et al.
1998). Ähnliches könnte auch für das Rind gelten. Derzeit liegen keine
Untersuchungen zu der Herkunft der DNMT1 in frühen Rinderembryonen vor, jedoch
ist es wahrscheinlich, dass die mRNA für die DNMT1 vor der großen
Genomaktivierung maternalen Ursprungs ist. Dabei käme es wie bei der Maus
(MERTINEIT et al. 1998) zu einer Akkumulation von mRNA und Protein in den
reifenden Oozyten, um einen Vorrat in den frühen Embryonen zur Verfügung zu
120
Diskussion
haben. Diese mRNA müsste dann jedoch durch einen Mechanismus vor der
vorzeitigen Translation oder einem Abbau geschützt werden. Bei der Maus wurde
diese Funktion unter anderem für ein Mitglied der Y-box-Familie, MSY2 (Y-Box
Protein 2), nachgewiesen. Dieses Protein stellt eine Hauptkomponente der
messenger Ribonukleoprotein-Komplexe (mRNP) dar, welcher in Oozyten gefunden
werden kann (YU et al. 2001) und der dem Schutz maternaler mRNA in frühen
Embryonen dient (YU et al. 2004). MSY2 bindet dabei an die maternale mRNA und
schützt so vor einem Abbau, verhindert aber auch eine vorzeitige Translation (YU et
al. 2002). Die mRNA für das MSY2-Protein konnte auch in bovinen Embryonen
nachgewiesen werden (VIGNEAULT et al. 2004), so dass ein vergleichbarer
Mechanismus auch für das Rind vorstellbar wäre. In diesem Fall würde dann die
maternale mRNA für die DNMT1 in den frühen Embryonalstadien gespeichert, ohne
translatiert zu werden. Ebenso könnten die niedrigen Proteingehalte wie bei der
Maus (MERTINEIT et al. 1998) maternalen Ursprungs sein bzw. auf einer geringen
Translation der maternalen mRNA beruhen. Im Rahmen des Austauschs der
maternalen durch embryonale Transkripte (MET, maternal to embryonal transition)
käme es dann im 8-16-Zeller zu einem Abbau der maternalen mRNA, was sich in
dem Absinken des relativen Transkriptgehalts wiederspiegeln würde. Der Anstieg
des Proteingehaltes ab dem 16-Zeller könnte auf einer embryonalen Transkription
und einer unverzüglichen Translation in das entsprechende Protein hindeuten. So
würde der Proteingehalt ansteigen, obwohl kaum mRNA nachweisbar wäre.
Ein weiterer Punkt, der Abweichungen zwischen Proteinen und mRNA erklären
könnte, ist die Proteinstabilität. So konnten PENNETIER et al. (2006) bei
Untersuchungen von Rinder-Embryonen auf MATER-Protein und MATER-mRNA
hohe MATER-Proteingehalte bis hin zum Schlupf der Blastozysten nachweisen,
obwohl bereits in Morulae und Blastozysten kein mRNA-Transkript mehr festgestellt
werden konnte. PENNETIER et al. (2006) sehen dabei die hohe Stabilität des
MATER-Proteins als Ursache für die hohen Proteingehalte in Morulae und
Blastozysten an. Auch bei der Maus konnten hohe Gehalte an DNMT1o-Protein bis
zum Blastozystenstadium nachgewiesen werden, obwohl der Transkriptgehalt ab
dem 1-Zell-Stadium deutlich absinkt, wobei dieser Effekt laut CIRIO et al. (2008)
121
Diskussion
ebenfalls auf einem extrem stabilen Protein beruht. Als stabiles Protein wird die
DNMT1o bei der Maus von DING und CHAILLET (2002) beschrieben, die darin auch
den Sinn für ihren Einsatz als maternales Protein sehen. Dabei sollen die stabilen
Speicher im Ooplasma die Translokation der DNMT1o in den Zellkern im 8-ZellEmbryo der Maus ermöglichen, um die Methylierungsmuster geprägter Gene in
dieser Furchungsphase aufrecht zu erhalten (DING u. CHAILLET 2002).
Der abweichende Gehalt an DNMT3a-Protein in den IVP-Blastozysten kann durch
eine fehlende Translation der vorhandenen mRNA erklärt werden. Durch die
fehlende Umsetzung in das entsprechende Protein käme es in den in vitro
produzierten Embryonen zu einer Akkumulation der entsprechenden Transkripte.
Dies
würde
zu
dem
signifikant
erhöhten
Gehalt
an
DNMT3a-mRNA
im
Blastozystenstadium führen, wie er von HÖFFMANN et al. (2006) beschrieben
wurde.
Insgesamt kann aus den abweichenden Ergebnissen abgeleitet werden, dass in
frühen Embryonalstadien nicht wie in somatischen Zellen von der mRNA auf den
Proteingehalt geschlossen werden kann, da eine veränderte Proteinstabilität, der
Schutz vor Abbau oder Translation, eine hohe Anzahl akkumulierter maternaler
mRNA und Proteine, sowie eine fehlende Translation zu deutlichen Abweichungen
führen können.
5.4
Schlussfolgerungen
Erstmals
wurden
in
der
vorliegenden
Arbeit
die
Proteingehalte
und
die
Proteinlokalisation der DNA-Methyltransferasen DNMT1 und DNMT3a in bovinen
präimplantatorischen Embryonen unterschiedlicher Herkunft (in vivo vs. in vitro)
mittels Immunzytochemie untersucht.
Die signifikanten Unterschiede des Proteingehaltes sowie Unterschiede in der
Proteinlokalisation bei der DNMT1 und DNMT3a deuten darauf hin, dass die IVP
sowohl die Erhaltungsmethylierung als auch die De-novo-Methylierung vor, während
und nach der Aktivierung des embryonalen Genoms beeinflusst. Inwiefern die
nachgewiesenen Proteine auch enzymatisch aktiv sind, müsste durch weiterführende
122
Diskussion
Untersuchungen festgestellt werden. Für die Darstellung der DNA-MethyltransferaseAktivität könnten Lysate der entsprechenden Embryonen in einem Mikroassay
untersucht werden (MONK et al. 1991). Weiteren Aufschluss könnte auch eine
vergleichende Darstellung des globalen DNA-Methylierungsmusters in frühen
bovinen
Embryonen
aus
In-vivo-
und
In-vitro-Produktion
geben.
Durch
Abweichungen des Methylierungsmusters könnte eine gestörte Transkriptionsregulation hervorgerufen werden, die die beschriebenen veränderten Transkriptgehalte entwicklungsrelevanter Gene bei Embryonen aus In-vivo- und In-vitroProduktion erklären könnte. Diese Abweichungen könnten schließlich zum „Large
Offspring Syndrome“ führen, dass bei geklonten, mitunter aber auch bei Embryonen
aus IVP beobachtet werden kann (FARIN et al. 2006).
Da bereits die die Superovulation die Qualität von Embryonen negativ beeinflussen
kann (ERTZEID u. STORENG 2001), wäre eine weitere Studie an In-vivoEmbryonen, die nicht der Superovulation entstammen, sinnvoll.
123
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Sonja Drallmeyer
Vergleichende Darstellung der DNA-Methyltransferase1 und 3a mittels
Immunzytochemie in frühen bovinen Embryonalstadien (Tag1-7) aus In-vivound In-vitro-Produktion
In dieser Arbeit wurde das Auftreten des DNMT1- und des DNMT3a-Proteins in
frühen Embryonalstadien (Zygote - Blastozyste) untersucht, wobei der Schwerpunkt
auf einem Vergleich in vivo und in vitro produzierter Embryonen lag. Die tubalen Invivo-Stadien wurden mittels transvaginaler endoskopischer Eileiterspülung generiert,
wohingegen die späteren Stadien (Morulae und Blastozysten) durch alleinige uterine
Spülung gewonnen wurden. Parallel dazu erfolgte die routinemäßige Produktion von
IVP-Embryonen. Nach der immunzytochemischen Markierung der Proteine erfolgte
ihre Darstellung über die Immunfluoreszenz am konfokalen Laser-ScanningMikroskop. Dabei wurden sowohl Untersuchungen zum Proteingehalt als auch zur
Proteinlokalisation der DNMT1 und DNMT3a in frühen Embryonen aus In-vivo- und
In-vitro-Produktion durchgeführt. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:
1. Im Vorversuch wurden zur Erlernung der transvaginalen endoskopischen
Eileiterspülung 26 nicht superovulierte Färsen im Alter von 13-25 Monaten
unabhängig von ihrem Zyklusstadium endoskopiert.
2. Im Hauptversuch wurden bei 45 synchronisierten und superovulierten Färsen
insgesamt 50 endoskopische Spülungen durchgeführt. Dabei konnten 419
Embryonen gewonnen werden. Davon waren 301 (72%) Embryonen von
exzellenter oder guter Qualität. Über die endoskopischen Spülungen wurden
Zygoten bis 10-16-Zeller gewonnen. Die Wiederfindungsrate (Verhältnis
gefundener Embryonen zu gezählten Gelbkörpern) lag bei 68%.
124
Zusammenfassung
3. Zwischen den verschiedenen Herkünften (in vivo vs. in vitro) konnten nach
immunzytologischer Markierung sowohl für die DNMT1 als auch für die
DNMT3a
statistisch
signifikante
Unterschiede
des
Proteingehaltes
nachgewiesen werden.
4. Für die DNMT1 konnte ein signifikanter Unterschied (P ≤ 0.05) des
Proteingehaltes zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen im 4Zell-, im 10-16-Zell-, im Morula- und im Blastozystenstadium nachgewiesen
werden. Dabei war die Fluoreszenzintensität bei den In-vivo-Embryonen
gegenüber den IVP-Embryonen statistisch signifikant erhöht. Innerhalb der Invivo-Gruppe war der Proteingehalt im Morula-Stadium gegenüber den
Zygoten, den 2- und den 8-Zellern signifikant erhöht und die Blastozysten
zeigten gegenüber den Zygoten und 8-Zellern eine signifikant stärkere
Fluoreszenzintensität. Innerhalb der in vitro produzierten Embryonen konnte
in den Morulae ein signifikant erhöhter Proteingehalt gegenüber den 4-Zellern
und den Blastozysten nachgewiesen werden.
5. Für die DNMT3a konnten signifikante Unterschiede (P ≤ 0.05) des
Proteingehaltes zwischen In vivo und in vitro produzierten Embryonen im 2Zell-, im 4-Zell- und im Blastozystenstadium nachgewiesen werden. Dabei
war die Fluoreszenzintensität bei den 4-Zellern und Blastozysten in vivo
signifikant stärker als in den IVP-Embryonen. Im 2-Zell-Stadium trat der
gegenteilige Effekt auf. Innerhalb der In-vivo-Gruppe war der Proteingehalt im
Blastozystenstadium gegenüber den früheren Stadien signifikant erhöht. Bei
den in vitro produzierten Embryonen konnte im 2-Zell-Stadium eine
gegenüber dem 4-Zell-Stadium signifikant erhöhte Fluoreszenzintensität
nachgewiesen werden.
6. Neben dem signifikanten Einfluss der Herkunft (in vivo vs. in vitro) auf den
Proteingehalt
konnten
auch
Unterschiede
nachgewiesen werden.
125
der
Proteinlokalisation
Zusammenfassung
7. Für
die
DNMT1
Entwicklungsstadien
zeigte
sich
in
überwiegend
den
eine
frühen
(Zygote
gleichmäßige
-
4-Zeller)
Proteinverteilung
zwischen Zytoplasma und Zellkern. Nur einige In-vivo-Zygoten und einige Invitro-4-Zeller wiesen eine fehlende Kernfärbung auf. Im 8-Zell-Stadium war in
einigen In-vitro-Embryonen eine deutliche Kernfärbung zu erkennen, während
in den In-vivo-Embryonen mit einer Ausnahme eine gleichmäßige Färbung
von Zytoplasma und Kern zu erkennen war. Demgegenüber zeigte die
Mehrzahl der IVP-Embryonen im Gegensatz zu den In-vivo-Embryonen im
10-16-Zell- und im Morula-Stadium keine deutliche Färbung des Zellkerns. Im
Blastozystenstadium war bei den meisten in vitro produzierten Embryonen
eine gleichmäßige Färbung von Zytoplasma und Kern bei den Blastomeren
des TE erkennbar, während die Kerne im TE der
in vivo generierten
Embryonen frei von DNMT1-Protein waren.
8. Für die DNMT3a konnte in den frühen Entwicklungsstadien (Zygote - 8-Zeller)
ebenfalls eine gleichmäßige Proteinverteilung zwischen Zytoplasma und
Zellkern festgestellt werden. Lediglich einige In-vivo- und In-vitro-Zygoten
zeigten keine Kernfärbung. Im 10-16-Zell-Stadium war bei der Mehrzahl der
In-vivo-Embryonen eine deutliche Kernlokalisation erkennbar, die den IVPEmbryonen fehlt. Hier zeigten im Gegenteil sogar einige Embryonen eine
fehlende
Kernfärbung.
Im
Blastozystenstadium
war
sowohl
für
die
Blastomeren der ICM als auch des TE bei beiden Herkünften eine reine
zytoplasmatische Proteinlokalisation nachweisbar.
In dieser Arbeit wurde erstmals der Proteingehalt sowie die Proteinlokalisation der
DNA-Methyltransferasen 1 und 3a in bovinen präimplantatorischen Embryonen
unterschiedlicher Herkunft (in vivo vs. in vitro) mittels Immunzytochemie untersucht.
Die
signifikanten
Unterschiede
im
relativen
Proteingehalt
sowie
der
Proteinlokalisation der DNA-Methyltransferasen 1 und 3a zwischen in vivo und in
vitro produzierten Embryonen deuten darauf hin, dass die In-vitro-Produktion sowohl
126
Zusammenfassung
die Erhaltungs- als auch die De-novo-Methylierung vor, während und nach der
großen Aktivierung des embryonalen Genoms beeinflusst.
127
Summary
7 Summary
Sonja Drallmeyer
Comparative measurement of DNA methyltransferase 1 and 3a in early in vivo
and in vitro derived bovine embryos (day 1-7) by immunocytochemistry.
In this work the expression of DNMT1 and DNMT3a in early embryonal stages
(zygote – blastocyst) was analyzed with a main focus on the comparison between in
vivo and in vitro derived embryos. The tubal stage in vivo embryos were derived by
transvaginal endoscopic flushing of the oviduct. Morulae and blastocysts were
derived by flushing the uterus. IVP embryos were produced by routine methods. After
immunocytochemical staining of the embryos, protein analysis was carried out by
confocal laser scanning microscopy. In this manner, both the amount and the
localization of DNMT1 and DNMT3a were analyzed in in vivo and in vitro derived
preimplantation embryos.
1. In a preliminary experiment, 26 non-superovulated 13-25 month old heifers
were used for endoscopic flushing of the oviduct to establish the technique.
2. In the main experiment, 50 endoscopic flushings were carried out on 45
synchronised and superovulated heifers. These flushings gave a total of 419
embryos, including 301 (72%) intact embryos of excellent or good quality
ranging in development from zygote to the 16-cell stage. The recovery rate
was 68%.
3. The immunocytochemical analysis revealed a significant difference in DNMT1
and DNMT3a levels protein between embryos of different origin (in vivo vs. in
vitro).
128
Summary
4. The amount of DNMT1 protein differed significantly between in vivo and in
vitro produced embryos at the 4-cell, 10 to 16-cell, morula, and blastocyst
stages and the fluorescence intensity was significantly higher in in vivo derived
embryos compared to their in vitro produced counterparts. Within the group of
in vivo derived embryos, the amount of DNMT1 protein was significantly
higher in morula stage embryos than in the zygote, 2-cell, and 8-cell embryos.
There was a significantly higher fluorescence signal in in vivo derived
blastocysts than in the in vivo derived 8-cell embryos. Within the in vitro group,
the amount of protein DNMT1 was significantly higher in morula stage
embryos than in 4-cell-embryos and blastocysts.
5. The level of DNMT3a protein was significantly different between in vivo and in
vitro produced embryos at the 2-cell, 4-cell, and blastocyst stages. The
fluorescence intensity was significantly higher in in vivo derived 4-cell embryos
and blastocysts compared to their in vitro produced counterparts. In in vivo
derived 2-cell embryos, the fluorescence signal was significantly lower than in
their in vitro counterparts. Within the in vivo group, the content of DNMT3a
protein was significantly higher in blastocysts than in earlier stages. In the in
vitro group, there was a significantly higher fluorescence intensity in the 2-cell
embryos than in the 4-cell-embryos.
6. The origin of the embryos (in vivo vs. in vitro) does not only affect the amount
of DNMT1 and DNMT3a protein. There was also a difference in the location of
the protein within the embryo.
7. Levels of DNMT1 protein were equal in the cytoplasm and nucleus in most
early zygote to 4-cell embryos. However, a few in vivo derived zygotes and in
vitro produced 4-cell embryos had no staining of the nuclear region. In some in
vitro produced 8-cell embryos, there was stronger staining in the nucleus than
in the cytoplasm. The in vivo derived 8-cell embryos showed uniform staining
with one exception (stronger nuclear staining). Most of the in vitro produced 10
129
Summary
to 16-cell embryos and morulae showed equal staining of cytoplasm and
nucleus. In contrast, in most of the in vivo derived 10 to 16-cell embryos and
morulae there was stronger staining in the nucleus than in the cytoplasm. At
the blastocyst stage, most of in vitro produced embryos showed equal staining
of cytoplasm and nucleus in the TE. In contrast nuclei within the TE of in vivo
derived embryos were free of DNMT1 protein.
8. There were also equal levels of DNMT3a protein in the cytoplasm and nucleus
of early developmental stages (zygote to 8-cell). A few in vivo and in vitro
derived zygotes had no staining in the nucleus. At the 10 to 16-cell stage,
most of the in vivo derived embryos showed stronger staining of the nucleus
than of the cytoplasm. This was not the case in in vitro produced embryos. At
the blastocyst stage, all blastomers in the ICM and TE showed a staining only
in the cytoplasm.
In this work, the content and localization of DNMT1 and DNMT3a protein was
analyzed for the first time in bovine preimplantation embryos of different origin (in
vivo vs. in vitro) by immunocytochemistry. The significant differences in protein
levels and different localization between in vivo and in vitro derived embryos show
that in vitro production of embryos affects both maintenance and de novo
methylation at, before and after embryonal genome activation.
130
Anhang
8 Anhang: Medienrezepte und Einzeldaten
8.1
Zusammensetzung der Medien
0,9% NaCl-Lösung:
NaCl:
SIGMA S 5886; 1,08 M
9g
Aqua bidest:
Barnstead E-pure
1L
Penicillin:
Appli Chem GmbH
0,06 g
Streptomycin:
Appli Chem GmbH
0,1 g
PBS:
Stocklösung:
Na-Pyruvat:
SIGMA P3662
3,6 g
Streptomycinsulfat:
Appli Chem GmbH
5,0 g
D-Glucose:
Appli Chem GmbH
100,0 g
CaCl2 x H2O:
SIGMA C 7902; 0,178 M
13,3 g
Penicillin G (Sodium):
Appli Chem GmbH
6,0 g
Aqua bidest:
Barnstead E-pure
1L
PBS-Gebrauchslösung:
Aqua bidest:
Barnstead E-pure
Stocklösung:
PBS-Pulver:
1L
10 mL
SIGMA D-5773
9,65 g
= Dulbecco´s phosphate buffered saline
Für das Slicen:
PBS-
500 mL
Gebrauchslösung:
BSA (V):
SIGMA
0,5 g
Heparin:
Serva; 177 IE/mg
0,0056 g
131
Anhang
Für die Eileiter-/Uterusspülung:
PBS-Gebrauchslösung:
500 mL
Fetales Kälberserum:
5 mL
Reifungsmedien:
TCM/BSA (FAF):
TCM 199
SIGMA M 2520
1,51 g
Gentamycin-Sulfat
SIGMA G 3632
0,005 g
Na-Pyruvat
SIGMA P3662
0,0022 g
NaHCO3
Riedel-deHaen 31437 0,22 g
Ad. H2O Ampuwa
Fresenius
100 mL
BSA(FAF)
SIGMA A 7030
0,1 g
TCM 199
SIGMA M 2520
1,51 g
Gentamycin-Sulfat
SIGMA G 3632
0,005 g
Na-Pyruvat
SIGMA P3662
0,0022 g
NaHCO3
Riedel-deHaen 31437 0,035 g
Ad. H2O Ampuwa
Fresenius
100 mL
BSA (FAF)
SIGMA A 7030
0,1 g
pH: 7,4
TCM air:
pH: 7,2
SUIGONAN (Intervet GmbH):
eCG:
400 IU
hCG:
200 IU
0,9% NaCl:
1 mL
Aliquotieren in 25µl
132
Anhang
Reifungstropfen:
TCM/BSA(FAF):
965 µl
Suigonan:
25 µl
Cysteamin:
10 µl
100µl Tropfen mit Silikonöl überschichten
Fertilisierungsmedien
Fert.-Talp Stocklösung:
NaCl
114,0 mM
0,6658 g
KCl
3,2 mM
0,0239 g
NaHCO3
25,0 mM
0,2100 g
NaHPO4 x H2O
0,3 mM
0,0041 g
CaCl2 x 2H2O
2,0 mM
0,0294 g
MgCl2
0,5 mM
0,0048 g
Phenolrot
0,01µg/mL
0,0010 g
Penicillamin
20,0 mM
0,0003 g
Na-Lactat 60%
10,0 mM
0,1860 g
Ampuwa:
Fresenius
100 mL
Gentamycin-Stocklösung:
Gentamycin:
25 mg
Ampuwa:
0,5 mL
HHE-Stocklösung:
a) 250 µM Epinephrin-Ansatz:
Na-Lactat (60%):
165 mg
Na-Metabisulfit:
50 mg
Ampuwa:
50 mL
→ 40 mL + 1,83 mg Epinephrin (SIGMA E 4250; MG 183,2), pH 4,0
133
Anhang
b) 1 mM Hypotaurin-Ansatz:
Hypotaurin
SIGMA H 1384; MG 109,1
1,09 mg
10 mL
Ampuwa
c) 50 IE/mL Heparin-Ansatz:
Heparin
Serva; 177 IE/mg
2,82 mg
10 mL
Ampuwa
Epinephrin-Ansatz:
4 mL
Hypotaurin-Ansatz:
10 mL
Ampuwa:
26 mL
→80 µL + 40 µL Heparin
Isopercoll-Stocklösung:
a) Lösung A:
NaHCO3:
EBBS
0,21 g
SIGMA E 7510
10 mL
SIGMA P 1644
10 mL
b) Isopercoll:
Percoll
938 µL
Lösung A
Na-Pyruvat-Lösung:
Na-Pyruvat
SIGMA 3662; 0,073M
Fert.-Talp Stock
0,002 g
1 mL
Fert.-Talp Gebrauchslösung (Spermienzentrifugation u. Wasch-Tropfen):
BSA/V
SIGMA
0,060 g
Na-Pyruvat-Lösung
140 µL
Fert.-Talp Stock
10 mL
134
Anhang
Fertilisierungstropfen:
HHE-Stocklösung
120 µL
Fert.-Talp Gebrauchslsg.
2 mL
100 µL Tropfen mit Silikonöl überschichtet
Kulturmedium:
SOFaa(m) Stocklösungen:
a) Stock A:
NaCl
SIGMA S 5886; 1,08 M
6,290 g
KCl
SIGMA P 5405; 0,072 M
0,534 g
KH2PO4
SIGMA P 5655; 0,012 M
0,162 g
MgSO4
SIGMA M 2643
0,182 g
SIGMA H2O
W 1503
98,40 mL
Na-Lactat
SIGMA L 4263; 0,042 M
600 µL
NaHCO3
SIGMA S 4019; 0,25 M
2,100 g
Phenolrot
SIGMA P 5530
0,010 g
SIGMA H2O
W 1503
100 mL
Na-Pyruvat
SIGMA 3662; 0,073 M
0,080 g
SIGMA H2O
W 1503
10 mL
CaCl2 x 2H2O
SIGMA C 7902; 0,178 M
0,262 g
SIGMA H2O
W 1503
10 mL
Glutamin
SIGMA G 6392
0,292 g
SIGMA H2O
W 1503
10 mL
b) Stock B:
c) Stock C:
d) Stock D:
e) Glutamin-Stocklösung:
135
Anhang
SOFaa(m)-Kulturmedium:
Myo-Inositol
SIGMA I 7508
0,05 g
Gentamycin
SIGMA G 3632
0,005 g
SIGMA H2O
W 1503
78 mL
Glutamine-Stock
100 µL
Stock A
10,0 mL
Stock B
10,0 mL
Stock C
1,0 mL
Stock D
1,0 mL
BME 50x
SIGMA B 6766
3,0 mL
MEM 100x
SIGMA M 7145
1,0 mL
Kultur-Tropfen:
SOFaa(m)-Kulturmedium
10 mL
BSA (FAF)
0,04 g
30 µL Tropfen mit Silikonöl überschichten
Medien für die Immunozytochemie:
25%ige PFA-Stocklösung:
PBS
PFA-Pulver
100 mL
SIGMA
25 g
ca. 1h bei 60-65°C rühren
anschließend 1N NaOH tropfenweise zugeben, bis Lösung klar wird und
in sterile Braunglasflasche sterilfiltrieren (0,2µm-Filter, Sarstedt) und bei 4°C lagern
3,7%iges PFA:
PBS
852 µl
25%ige Stocklösung
148 µl
136
Anhang
1%iges Triton X-100:
4950 µl
PBS
Triton X-100
50 µl
SIGMA
0,05%ige Tween-20-Lösung:
PBS
Tween 20
10 mL
5 µl
ROTH
0,1%iges Triton X-100:
PBS
Triton X-100
10 mL
10 µl
SIGMA
4 N HCl in 0,1% Triton X-100:
0,1%iges Triton X-100
680 µl
37%ige HCl
320 µl
100 mM Tris/HCl pH 8,5:
100 mL
Ampuwa
Tris-HCl Pulver
SIGMA
1,2114 g
mit 1N HCl auf pH 8,5 einstellen
Tris/HCl pH 7,2 - 7,6 :
100 mL
Ampuwa
Tris-HCl Pulver
SIGMA
0,6057 g
Mit HCl tropfenweise auf pH 7,2-7,6 einstellen
Sterilfiltrieren und bei 4°C lagern
Tris/HCl + BSA pH 7,2 – 7,6:
Tris/HCl pH 7,2 – 7,6
10 mL
BSA (FAF)
0,1 g
137
Anhang
2X SSC:
NaCl
SIGMA S 5886; 1,08 M
1,75 g
Na3C6H5O
SIGMA
0,88 g
100 mL
Ampuwa
→ pH 7,0
138
Anhang
8.2
Einzeldaten
Tabelle 10: Übersicht über die endoskopischen Spülergebnisse einzelner
Tiere
510Nr. Spül- gesamt Zyg 2er 3er 4er
8er
> 16er Mor Bla UFO deg l. Z.
6er
16er
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139
Anhang
26
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3
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2
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49
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18
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0
0
0
9
6
2
419
62
53
11
31
27
67
25
5
20
0
79
31
8
gesamt
Zyg.: Zygote
2(-16)er: 2(-16)-Zell-Embryo
Bla.: Blastozyste
UFO: Unbefruchtete Oozyte
Deg.: degeneriert
l.Z.: leere Zona
140
Mor.: Morula
Anhang
Übersicht über die Ergebnisse der immunzytochemischen Bestimmung des
Proteingehaltes an DNMT1 bzw. DNMT3a:
DNMT1
In vivo
In vitro
Mean
SEM
Mean
SEM
Zygoten
24,6 (n=18)
2,29
23,9 (n=12)
1,59
2-Zeller
25,9 (n=16)
3,45
25,0 (n=10)
3,50
4-Zeller
35,5 (n=9)
5,10
18,1 (n=15)
1,55
8-Zeller
21,7 (n=17)
3,46
22,2 (n=15)
1,87
10-16-Zeller
33,3 (n=14)
4,54
23,6 (n=16)
2,36
Morulae
39,4 (n=14)
4,70
25,7 (n=15)
1,92
Blastozysten
38,1 (n=14)
4,23
16,6 (n=10)
2,05
DNMT3a
In vivo
In vitro
Mean
SEM
Mean
SEM
Zygoten
21,3 (n=10)
2,39
20,7 (n=13)
1,54
2-Zeller
17,9 (n=11)
1,19
27,5 (n=13)
1,93
4-Zeller
23,1 (n=9)
1,92
17,1 (n=11)
1,81
8-Zeller
21,5 (n=13)
1,94
24,3 (n=19)
2,10
10-16-Zeller
22,8 (n=11)
1,22
24,8 (n=10)
2,44
Morulae
19,9 (n=15)
1,14
22,1 (n=11)
2,50
Blastozysten
40,8 (n=9)
3,45
22,3 (n=13)
2,64
141
Verzeichnisse
9 Verzeichnisse
9.1
Literaturverzeichnis
.
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Dev. Biol. 268, 195-206
YU, J., N. B. HECHT u. R. M. SCHULTZ (2001):
Expression of MSY2 in mouse oocytes and preimplantation embryos.
Biol. Reprod. 65, 1260-1270
YU, J., N. B. HECHT u. R. M. SCHULTZ (2002):
RNA-binding properties and translation repression in vitro by germ cell-specific MSY2
Protein.
Biol. Reprod. 67, 1093-1098
ZAITSEVA, I., S. ZAITSEV, N. ALENINA, M. BADER u. A. KRIVOKHARCHENCO
(2007):
Dynamics of DNA-Demethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo
and in vitro.
Mol. Reprod. Dev. 74, 1255-1261
170
Verzeichnisse
9.2
Abkürzungsverzeichnis
2x SSC
2x sodium chloride/sodium citrate
Abb.
Abbildung
Adamts1
A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin
type I motif
Ag
Antigen
Ak
Antikörper
AMCA
7-Amino-4-Methyl-Cumarin-3-Acid
ANOVA
Analysis of Variance
AOS
Abnormal Offspring Syndrome
AOTF
Akusto-optischer Filter
ART
Assistierte Reproduktionstechniken
AS
Angelman Syndrom
ATP
Adenosin-Tri-Phosphat
ATR-X
Alpha Thalassemia/Mental Retardation Syndrome, X-linked
Bax
Bos taurus apoptosis regulator box-α
BLIF
bovine leukemia inhibitory factor
bLR-β
bovine leukemia inhibitory factor-receptor-β
BP-Filter
Band-pass Filter
BSA
Bovines Serumalbumin
BWS
Beckwith-Wiedemann Syndrom
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
CG-Dinukleotid
Cytosin-Guanin-Dinukleotid
CO2
Kohlenstoffdioxid
CpG-Island
Cytosin-Guanin-reiche Region des Genoms
Cx31
Connexin 31
Cx43
Connexin 43
D
dies = Tag
DAB
Diaminobenzidine
171
Verzeichnisse
deg.
degeneriert
DMR
differentiell methylierte Regionen
DNA
Deoxyribonucleotide Acid = Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
DNMT
DNA-Methyltransferase
DNMT1o
Oozytenspezifische DNA-Methyltransferase 1
DNMT1s
Somatische DNA-Methyltransferase 1
DOAD
Developmental Origins of Adult Disease
DOHaD
Developmental Origins of Health and Disease
DVD
Digital video disc
eCG
equines Choriongonadotropin
et al.
et alii
Fa.
Firma
Fab
Antigenbindendes Antikörperfragment
Fas
Fas Rezeptor = Rezeptor der Tumornekrosefaktor (TNF)Familie
Fas L
Fas ligand = transmembranes Protein aus der TNF-Familie
Fc
Kristallines Antikörperfragment
FIC
Fluorescein-Isocyanat
FITC
Fluorescein-Isothiocyanat
FLI
Friedrich-Loeffler-Institut
FOAD
Fetal origins of adult disease
FSH
Follikel-stimulierendes Hormon
GLUT
Glukosetransporter
GnRH
Gonadotropes Releasing Hormon
GR-Promoter
Glukokortikoid-Rezeptor Promoter
GV-Oozyte
Oozyte im Germinalvesikel-Stadium
H19
Histon 19
hCG
humanes Choriongonadotropin
HCl
Salzsäure
HECM
Hamster Embryo Culture Medium
172
Verzeichnisse
HFT
Hauptfarbteiler
HHE
Heparin-Hypotaurin-Epinephrin-Medium
HRP
Horseradish Peroxidase = Meerrettichperoxidase
HSP
Heat Shock Protein
ICF
Immunodeficiency, Centromere instability, Facial abnomalies
ICM
Inner cell mass = innere Zellmasse
ICR
Imprinting Control Region
I.E./U.
Internationale Einheiten
IETS
International Embryo Transfer Society
Igf2
Insulin-like growth factor 2
IgG
Immunglobulin G
i.m.
intramuskulär
i.v.
intravenös
IVC
In vitro culture = In-vitro-Kultur
IVF
In vitro fertilisation = In-vitro-Befruchtung
IVM
In vitro maturation = In-vitro-Reifung
IVP
In vitro production = In-vitro-Produktion
KB
künstliche Besamung
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplex
LH
Luteinisierungshormon
LOS
Large Offspring Syndrome
LP-Filter
Long-pass Filter
LSM
Laser-Scanning-Mikroskop
MII
Metaphase II
MATER
Maternal Antigen that Embryos Require
MET
Maternal-Embryonic Transition
mod.
modifiziert
mRNA
messenger ribonucleic acid
N2
lat. Nitrogenium = Stickstoff
NaCl
Natriumcloride = Kochsalz
NANOG
Gen in embryonalen Stammzellen
173
Verzeichnisse
NBCS
New born calf serum
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NFT
Nebenfarbteiler
NGS
Normal goat serum
O2
lat. Oxygenium = Sauerstoff
OC-1
kapsuläres Glycoprotein bei Pferdeembryonen
Oct4
Octamer-4
OPU
Ovum pick up
P
Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit)
PBS
Phosphate buffered saline = Phosphat gepufferte Salzlösung
PCNA
Proliferating Cell Nuclear Antigen
PE
Phycoerythrin
PFA
Paraformaldehyd
PGF2α
Prostaglandin-F 2α
PH
Pinhole = 2. Blende am Laser-Scanning-Mikroskop
prim.
primär
PVA
Polyvinylalkohol
PVP
Polyvinylpyrrolidon
RB
Retinoblastom
RNA
Ribonucleotide Acid
RNase
Ribonuklease
RT
Raumtemperatur
S.
Seite
SAM
S-adenosyl-L-methionine
SAH
S-adenosyl-homocysteine
SCNT
Somatic Cell Nuclear Transfer
sek.
Sekundär
silikon.
silikonisiert
SO
Superovulation
SOD
Superoxide dismutase
sog.
sogenannt
174
Verzeichnisse
SOX
Sarcosine oxidase
SOF
Synthetic Oviductal Fluid = Synthetische Eileiterflüssigkeit
Tab.
Tabelle
TCM
Tissue Culture Medium
TE
Trophektoderm
TRITC
Tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat
TRP53
Transformation-related protein 53
u.
und
u. a.
unter anderem
UFO
unfertilized oocyte
UV-Licht
ultraviolettes Licht
vs.
versus
z.B.
zum Beispiel
ZP
Zytoplasma
z.T.
zum Teil
175
Verzeichnisse
9.3
Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen
Tabellen:
Tabelle 1: Ergebnisse der Eileiterspülungen an lebenden Tieren.................... 7
Tabelle 2: Abweichungen zwischen in vivo und in vitro produzierten
Embryonen [mod. nach WRENZYCKI 2007]] ................................... 14
Tabelle 3: Darstellung der mRNA- und Proteingehalte der DNMT1 in
verschiedenen Entwicklungsstadien am Beispiel der Maus......... 32
Tabelle 4a: Untersuchungen des Proteingehalts mittels Westernblot /
Immunfluoreszenzintensität (IF) in präimplantatorischen
Embryonen ........................................................................................ 47
Tabelle 4b: Untersuchungen zur Proteinlokalisation mittels Immunfluoreszenz
in präimplantatorischen Embryonen............................................... 49
Tabelle 4c: Untersuchungen zu Aberrationen bei präimplantatorischen
Embryonen aus unterschiedlicher Produktion mittels Westernblot
oder Immunfluoreszenz (IF) ............................................................. 51
Tabelle 5: Definition und Auftreten der gewünschten Stadien....................... 65
Tabelle 6: Etablierung der Immunzytochemie.................................................. 80
Tabelle 7: Auflistung der erspülten Stadien in Abhängigkeit der verwendeten
Spülmethode ..................................................................................... 88
Tabelle 8: Intensität der Kernfärbung im Vergleich zu der Färbung des
Zytoplasmas in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums der
Embryonen ...................................................................................... 102
Tabelle 9: Intensität der Kernfärbung im Vergleich zu der Färbung des
Zytoplasmas in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums der
Embryonen ...................................................................................... 106
Tabelle 10: Übersicht über die endoskopischen Spülergebnisse einzelner
Tiere ................................................................................................. 139
176
Verzeichnisse
Abbildungen:
Abbildung 1:
Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion [mod. nach
NIEMANN u. MEINECKE 1993b]] .................................................. 9
Abbildung 2:
Transkriptionsverläufe während der frühen
Embryonalentwicklung des Rindes [nach WRENZYCKI 2007]]
..................................................................................................... 16
Abbildung 3:
Verlauf der DNA-Methylierung [mod. nach STRATHDEE u.
BROWN (2002) und ROBERTSON, Research Interests]] ......... 20
Abbildung 4:
Anteil des methylierten Genoms in Abhängigkeit zum
Entwicklungsstadium [mod. nach DEAN et al. 2001]] .............. 24
Abbildung 5:
Darstellung des direkten „One-Step“-Verfahrens bei dem der
primäre Antikörper direkt mit einem Markierungssystem
ausgestattet ist und des indirekten „Sandwich“- Verfahrens.41
Abbildung 6:
Schematische Darstellung eines konfokalen Laser-ScanningMikroskops ................................................................................. 45
Abbildung 7:
Schematische Darstellung der Synchronisation und
Superovulation........................................................................... 56
Abbildung 8a:
Übersicht über die Instrumente zur transvaginalen
Endoskopie................................................................................. 58
Abbildung 8b:
Detailaufnahmen der Instrumente zur transvaginalen
Endoskopie................................................................................. 58
Abbildung 8c:
Spülkanüle Modell Mariensee ................................................... 58
Abbildung 8d:
Bildgebende Geräte ................................................................... 59
Abbildung 9:
Instrumente zur Uterusspülung................................................ 59
Abbildung 10:
Innenschaft mit Spülkanüle und Endoskop (links), Spülkanüle
mit flexiblem Schlauch (mitte) und Innenschaft mit Endoskop
(rechts)........................................................................................ 61
Abbildung 11:
Durchführung der transvaginalen Endoskopie ....................... 63
Abbildung12:
Querschnitt durch ein Gebärmutterhorn mit inseriertem
Uterusspülkatheter .................................................................... 64
177
Verzeichnisse
Abbildung 13:
Schematische Darstellung der Versuchsanordnung .............. 84
Abbildung 14:
Prozentuale Verteilung der verschiedenen
Entwicklungsstadien zum Zeitpunkt der endoskopischen
Spülung....................................................................................... 86
Abbildung 15:
Exemplarische Darstellung verschiedener
Entwicklungsstadien in vivo und in vitro................................. 89
Abbildung 16:
Beispielhafte Darstellung von mit anti-DNMT1 und
AlexaFluor647 markierten in vivo und in vitro generierten
Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien.............. 91
Abbildung 17:
Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an DNMT1
in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen (* P ≤ 0.05)................................................... 92
Abbildung 18:
Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt an DNMT1 in präimplantatorischen
Embryonalstadien in vivo (A:B P ≤ 0.05).................................. 93
Abbildung 19:
Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt an DNMT1 in präimplantatorischen
Embryonalstadien in vitro (a:b P ≤ 0.05) .................................. 94
Abbildung 20:
Beispielhafte Darstellung von mit anti-DNMT3a und
AlexaFluor647 markierten in vivo und in vitro generierten
Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien.............. 95
Abbildung 21:
Fluoreszenzintensität als Maß für den Proteingehalt an
DNMT3a in in vivo und in vitro generierten
präimplantatorischen Rinderembryonen (* P ≤ 0.05) ............. 96
Abbildung 22:
Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt an DNMT3a in präimplantatorischen
Embryonalstadien in vivo (A:B P ≤ 0.05).................................. 97
Abbildung 23:
Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensität als Maß für den
Proteingehalt an DNMT3a in präimplantatorischen
Embryonalstadien in vitro (a:b P ≤ 0.05) .................................. 98
178
Verzeichnisse
Abbildung 24:
Subzelluläre Lokalisation der DNMT1 in der
präimplantatorischen Entwicklung in vitro und in vivo
generierter Embryonen............................................................ 100
Abbildung 25:
Subzelluläre Lokalisation der DNMT3a in der
präimplantatorischen Entwicklung in vitro und in vivo
generierter boviner Embryonen.............................................. 104
179
Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt:
41. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung gleichzeitig
33. Veterinär-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung am 28./29. Februar 2008 in
Gießen:
S. Drallmeyer, K. Müller, K.G. Hadeler, K. Korsawe, H. Niemann and C.
Wrenzycki (2008):
”Localization of DNMT1 and DNMT3a protein in preimplantation bovine
embryos derived in vivo and in vitro.”
Reproduction in Domestic Animals 43, 8-9
35. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder
(AET-d) am 19./20. Juni 2008 in Dipperz- Friesenhausen:
„Vergleichende
Darstellung
der
Proteine
DNMT1
und
DNMT3a
präimplantatorischen bovinen Embryonen aus In-vivo- und In-vitro-Produktion“
180
bei
Danksagung
•
Mein erster Dank geht an Frau Prof. Dr. Christine Wrenzycki für die
Überlassung des Themas und die gute Betreuung bei der Durchführung und
Fertigstellung der Arbeit. Danke für die Hilfe in allen Situationen und die
Korrekturen bis zur letzten Minute.
•
Dem Leiter des Instituts für Nutztiergenetik des FLI in Mariensee, Herrn Prof.
Dr. H. Niemann danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die
große Unterstützung und Hilfsbereitschaft zu jeder Zeit.
•
Der H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung danke ich für die finanzielle
Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit.
•
Prof. Dr. U. Besenfelder, Dr. H. Havlicek und insbesondere Dr. K. Höffmann
danke ich für die Einweisung in die Technik der transvaginalen Endoskopie
und die stete Bereitschaft, weitere Fragen zu beantworten.
•
Ein riesiges Dankeschön geht an Karsten Müller für die Hilfe bei der
Durchführung der Endoskopie. Danke für die Geduld und das Ertragen in so
mancher Ausnahmesituation.
•
Des Weiteren bedanke ich mich herzlich bei Klaus-Gerd Hadeler für die Hilfe
bei der Embryonengewinnung und die tatkräftige Unterstützung bei der
Lösung technischer Probleme.
•
Grit Möller, Rolf Poppenga und Hans-Georg Sander danke ich für die nette
Zeit im Stall, die aufmunternden Worte und die Hilfe mit so manchem wildgewordenen Rodeo-Rind.
•
Ein großes Dankeschön an Karin Korsawe für die Einführung in die IVF, die
stete Hilfe bei der Erstellung der In-vitro-Embryonen und die Tipps zum
Embryonen-Pretreatment vor der Immunzytochemie.
•
Erika Lemme danke ich für ihre hilfreichen Tipps zur Immunzytochemie und
das Erstellen einiger Embryonen-Bilder.
•
Allen fleißigen Helfern im Labor, insbesondere Steph und Annika, danke ich
für die nette Zeit und stete Hilfe mit den Medien und Embryonen.
181
•
PD Dr. Anke Schnapper und dem Team des Anatomischen Instituts der TiHo
Hannover danke ich für die guten Tipps zum DAKO EnVision-Kit und zur
Immunzytochemie allgemein.
•
Weiterhin danke ich Frau Dr. Sabine Klein für die Einführung und Hilfestellung
am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop.
•
Ph. D. Joe Carnwath danke ich für seine Hilfe am konfokalen Laser-ScanningMikroskop und die schnelle Korrektur des Summary.
•
Karin Korsawe, Lothar Schindler, Petra Hassel, Steph und allen weiteren
Fahrern des Ovarien-Taxis und der Belegschaft des Schlachthofes in MindenLübbecke danke ich für das Sammeln und Transportieren der Rinderovarien.
•
Meinen Mitdoktoranden, allen voran Wiebke, Karsten, Marianne, Javier,
Khurshed und Miguel danke ich für die lustige Zeit im Labor, die stete
Hilfsbereitschaft, die guten Ratschläge und nicht zuletzt für so manchen
netten Grill- und Kinoabend.
•
Ein großes Dankeschön an meine Büro-Mitbewohnerinnen Monika und
Wiebke, die mir immer mit einem offenen Ohr, guten Ratschlägen und
Anregungen zur Seite standen.
•
Claudi und Tammi danke ich für die vielen guten Gespräche und
Aufmunterungen, die gute Hundebetreuung und so manches schwäbische
Schmankerl.
•
Ganz besonders herzlich bedanke ich mich bei Achim und meiner Familie,
ohne deren Verständnis, Unterstützung, Geduld und Aufmunterungen die
Durchführung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre!
182