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Funktionelle Analyse der Sekretionssystemassoziierten Gene BPSS1504 und bsaU bei
Burkholderia pseudomallei
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Verena Hopf
geboren am 18.11.1980
in Mühlhausen/Thüringen
Greifswald, 16.07.2012
Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser
1. Gutachter: Prof. Dr. Ivo Steinmetz
2. Gutachter: Prof. Dr. Vogel
Tag der Promotion: 19.12.2012
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................. I
1
Einleitung...................................................................................................... 1
1.1 Burkholderia pseudomallei, der Erreger der Melioidose ................................ 1
1.1.1 Charakterisierung von B. pseudomallei........................................................... 1
1.1.2 Epidemiologie und Klinik der Melioidose......................................................... 2
1.2 Experimentelle murine Melioidose-Modelle ................................................... 3
1.3 Grundlagen der Pathogenese der Melioidose................................................ 4
1.3.1 Adhäsion und Invasion ................................................................................... 4
1.3.2 Interaktion mit der angeborenen Immunantwort.............................................. 5
1.3.3 Überleben von B. pseudomallei in Makrophagen............................................ 6
1.3.4 Induktion von Zelltod durch B. pseudomallei................................................... 7
1.3.5 Intrazelluläre Beweglichkeit von B. pseudomallei............................................ 8
1.3.6 Ausbreitung von Zelle zu Zelle........................................................................ 9
1.4 Sekretionssysteme....................................................................................... 10
1.4.1 Übersicht über die Sekretionssysteme gramnegativer Bakterien ...................10
1.4.1.1 Sekretionssysteme mit Ein-Schritt-Mechanismus........................................... 10
1.4.1.2 Sekretionssysteme mit Zwei-Schritt-Mechanismus ........................................ 11
1.4.2 Typ-III-Sekretionssysteme .............................................................................11
1.4.3 Type-VI-Sekretionssysteme...........................................................................15
1.5 Identifikation neuer Virulenzfaktoren bei B. pseudomallei............................ 18
2
Zielsetzung ................................................................................................. 20
3
Material und Methoden.............................................................................. 21
3.1 Material ........................................................................................................ 21
3.1.1 Geräte ...........................................................................................................21
3.1.2 Verbrauchsmaterialien...................................................................................22
3.1.3 Chemikalien...................................................................................................23
3.1.4 Fertiglösungen, Enzyme und Kits ..................................................................25
3.1.5 Bestandteile von Bakterien- und Zellkulturmedien .........................................26
3.1.5.1 Bestandteile von Zellkulturmedien .................................................................. 26
3.1.5.2 Bestandteile von Nährmedien für die Kultivierung von Bakterien................... 26
3.1.5.3 Antibiotika........................................................................................................ 26
3.1.6 Antikörper und Antikörperkonjugate...............................................................26
3.1.6.1 Antikörper........................................................................................................ 26
3.1.6.2 Antikörperkonjugate ........................................................................................ 27
3.1.7 Plasmide........................................................................................................27
3.1.8 Oligonukleotide..............................................................................................28
-I-
-
Inhaltsverzeichnis
3.2 Bakterien ...................................................................................................... 30
3.2.1 Medien für die Anzucht von Bakterien ........................................................... 30
3.2.2 Bakterienstämme .......................................................................................... 31
3.2.3 Anzucht und Konservierung von Bakterienstämmen ..................................... 31
3.2.4 Herstellung von kompetenten Zellen ............................................................. 32
3.2.5 In vitro-Assays............................................................................................... 32
3.2.5.1 Erstellen von Wachstumskurven..................................................................... 32
3.2.5.2 Schwarmverhalten auf Softagar...................................................................... 32
3.2.5.3 Biofilmassay .................................................................................................... 32
3.3 Arbeiten mit DNA ......................................................................................... 33
3.3.1 Puffer und Lösungen für das Arbeiten mit DNA ............................................. 33
3.3.2 Isolation von genomischer DNA aus B. pseudomallei.................................... 33
3.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) .................................................................. 34
3.3.4 Agarosegelelekrophorese ............................................................................. 35
3.3.5 Reinigung von DNA-Fragmenten und Gelextraktion...................................... 36
3.3.6 Restriktionsverdau und Dephosphorylierung ................................................. 36
3.3.7 Ligation ......................................................................................................... 37
3.3.8 Hitzeschocktransformation ............................................................................ 37
3.3.9 Subklonierung in pCR2.1®Topo Vektor.......................................................... 38
3.3.10 Minipräparation von Plasmid-DNA .............................................................. 38
3.4 Gezielte Mutagenese und Komplementation von B. pseudomallei-Genen .. 39
3.4.1 Herstellung und Klonierung der Knockoutkonstrukte ..................................... 39
3.4.2 Konjugation ................................................................................................... 40
3.4.3 Isolation markerloser Mutanten ..................................................................... 40
Abb. 9: Überblick über die Schritte der gezielten Mutagenese. ............................... 41
3.4.4 Komplementation der Mutanten .................................................................... 41
3.5 Mäuse .......................................................................................................... 42
3.5.1 Rechtliche Grundlagen.................................................................................. 42
3.5.2 Mausstämme ................................................................................................ 43
3.6 In vivo Versuche........................................................................................... 43
3.6.1 Narkotisierung der Mäuse ............................................................................. 43
3.6.2 Intranasale Infektion mit B. pseudomallei ...................................................... 43
3.6.3 Bestimmung der Keimzahl in Leber, Lunge und Milz nach Infektion .............. 43
3.7 Primäre murine Knochenmarkmakrophagen................................................ 44
3.8 Zelllinien ....................................................................................................... 45
3.8.1 Zelllinien und ihre Kultivierung....................................................................... 45
3.8.2 Aussaat der Zellen ........................................................................................ 45
3.8.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen ............................................................... 46
- II -
Inhaltsverzeichnis
3.9 Zellbasierte Infektionsversuche.................................................................... 46
3.9.1 Puffer und Lösungen für Zellbasierte Assays.................................................46
3.9.2 Einstellen der Infektionsdosis ........................................................................46
3.9.3 Invasions-und Replikationsassay...................................................................47
3.9.4 Induktion von Riesenzellbildung durch B. pseudomallei.................................48
3.9.5 Immunfluoreszenzfärbungen intrazellulärer Bakterien ...................................48
3.9.6 Echtzeit-Zellstatusanalyse mittels xCELLigence ............................................49
3.9.7 LDH-Assay ....................................................................................................50
3.9.8 Untersuchung der Caspase-Aktivierung nach B. pseudomallei-Infektion .......51
3.10 Arbeiten mit Proteinen ................................................................................. 52
3.10.1 Puffer und Lösungen für das Arbeiten mit Proteinen ...................................52
3.10.2 Proteinpräparation mit TRIZOL....................................................................53
3.10.3 Aufreinigung von extrazellulären Proteinen .................................................53
3.10.4 Proteinmengenbestimmung nach Bradford..................................................54
3.10.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)..................................54
3.10.6 Western-Blot ...............................................................................................55
3.11 mRNA-Expressionsanalysen ....................................................................... 56
3.11.1 Gewinnung von RNA...................................................................................56
3.11.2 DNase I- Behandlung von RNA ...................................................................57
3.11.3 Reverse Transkription .................................................................................57
3.11.4 Semiquantitative Expressionsanalyse .........................................................57
3.11.5 Quantitative RealTime-PCR ........................................................................58
3.12 Statistik ........................................................................................................ 59
3.13 In silicio-Sequenzanalyse ............................................................................ 59
4
Ergebnisse.................................................................................................. 60
4.1 Gezielte Mutagenese und Komplementation von
BPSS1504 und BPSS1539.......................................................................... 60
4.2 Funktionelle Analyse von BPSS1504........................................................... 62
4.2.1 Wachstum, Motilität und Biofilmbildung von B. pseudomallei ∆BPSS1504 ....62
4.2.2 Expression von BPSS1504............................................................................63
4.2.3 Invasions- und Replikationsverhalten von B. pseudomallei ∆BPSS1504 in
mammalen Zellen ...................................................................................................64
4.2.4 Rolle von BPSS1504 bei der Induktion von Zelltod ........................................66
4.2.4.1 Auswirkungen der BPSS1504-Deletion auf die Zytotoxizität.......................... 66
4.2.4.2 Einfluss von BPSS1504 auf die Induktion von Caspasen .............................. 68
4.2.5 Einfluss der BPSS1504-Deletion auf die Induktion von Riesenzellen.............69
4.2.6 Rolle von BPSS1504 für die Bildung von Aktinschweifen ..............................71
4.2.7 Einfluss von BPSS1504 auf die Virulenz von B. pseudomallei.......................73
- III -
-
Inhaltsverzeichnis
4.2.8 Einfluss von BPSS1504 auf die Regulation des Typ-VI-Sekretionssystem 1 . 74
4.2.9 Auswirkungen der BPSS1504-Deletion auf die Sekretion von
Effektorproteinen des Typ-VI- und Typ-III-Sekretionssystems ....................... 76
4.2.10 In silico-Analyse von BPSS1504 ................................................................. 77
4.3 Charakterisierung von B. pseudomallei ∆bsaU ............................................ 81
4.3.1 Expression von bsaU .................................................................................... 81
4.3.2 Wachstum, Motilität und Biofilmbildung von B. pseudomallei ∆bsaU............. 82
4.3.3 Invasions- und Replikationsverhalten von B. pseudomallei ∆bsaU................ 83
4.3.4 Einfluss von BsaU auf die Induktion von Zelltod ............................................ 84
4.3.4.1 Auswirkungen der bsaU-Deletion auf die Zytotoxizität ................................... 84
4.3.4.2 Einfluss von bsaU auf die Induktion von Caspasen........................................ 85
4.3.5 Einfluss der bsaU-Deletion auf die Induktion von Riesenzellbildung.............. 86
4.3.6 Rolle von BsaU beim Ausbrechen aus dem Endosomen
und der Induktion von Aktinschweifen ........................................................... 87
4.3.7 In silico-Analyse von BsaU ............................................................................ 89
5
Diskussion .................................................................................................. 91
5.1 Funktionelle Analyse des T6SS-1-Gens BPSS1504 .................................... 91
5.2 Funktionelle Analyse des T3SS-3-Gens bsaU ............................................. 95
6
Zusammenfassung .................................................................................. 100
7
Literaturverzeichnis ................................................................................. 102
Anhang .............................................................................................................. 111
Abkürzungsverzeichnis....................................................................................... 111
Internationaler Einbuchstabencode Aminosäuren .............................................. 113
Aligment des durch BPSS1504 kodierten Proteins............................................. 114
Eidesstattliche Erklärung................................................................................. 116
Danksagungen.................................................................................................. 117
Publikationen und Kongressbeiträge ............................................................. 118
Lebenslauf........................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.
- IV -
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Burkholderia pseudomallei, der Erreger der Melioidose
1.1.1 Charakterisierung von B. pseudomallei
Der Erreger der Melioidose wurde erstmals im Jahre 1911 von Whitmore und
Krishnaswami nach Isolation aus obduzierten Patienten in Rangoon (Burma, heute
Myanmar) beschrieben. Da die pathologischen Veränderungen, wie beispielsweise große
Abszesse in inneren Organen, dem durch Bacillus mallei (heute Burkholderia mallei)
verursachten Rotz von Equiden ähnelten, wurde der Erreger Bacillus pseudomallei
genannt (Whitmore, 1913). Die Krankheit erhielt 1921 durch Stanton und Fletcher,
aufgrund der Ähnlichkeit mit dem Pferderotz, den Namen Melioidose (griechisch: melis =
„Rotz“; eidos = „Ähnlichkeit haben mit“) (Stanton, 1921). Nachdem in den folgenden
Jahrzehnten immer wieder Umbenennungen und Neueinordungen in unterschiedliche
Gattungen erfolgte (Bacillus pseudomallei, Bacillus whitmorii, Actinobacillus pseudomallei,
Pseudomonas pseudomallei), wurde das Bakterium 1992 dem neuen Genus Burkholderia
zugeordnet (Yabuuchi et al., 1992), in dem neben Burkholderia pseudomallei und B.
mallei unter anderem auch Vertreter des B. cepacia-Komplexes vertreten sind.
B. pseudomallei ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges Bakterium, welches im
Gegensatz zum Rotzerreger B. mallei aufgrund seiner bipolaren Flagellen beweglich ist.
Als saprophytischer Bodenkeim lebt das Bakterium vorwiegend in feuchten Erdböden und
in Oberflächengewässern der Tropen und Subtropen (Strauss et al., 1969). Jedoch kann
B. pseudomallei als Pathogen beim Menschen sowie zahlreichen Tierarten Erkrankungen
auslösen. In vitro kann der Erreger unter aeroben Bedingungen auf Standardnährböden
bei 37°C innerhalb von 24 bis 36 Stunden angezüchte t werden (White, 2003), wobei sich
vorwiegend gelb-gräuliche Kolonien bilden, welche morphologisch sehr verschieden sein
können. B. pseudomallei ist Oxidase-positiv und kann aerob Glukose und Galaktose
umsetzten, jedoch keine L-Arabinose spalten. Im Jahr 1997 wurden einige Stämme
beschrieben, die L-Arabinose verwerten konnten (Smith et al., 1997), was mit einer 105fach verminderten Virulenz im Hamstermodell assoziiert war (Brett et al., 1997). Diese LArabinose-positiven Stämme wurden 1998 als Burkholderia thailandensis in einer eigenen
Spezies zusammengefasst (Brett et al., 1998).
Das Genom von B. pseudomallei besteht aus zwei zirkulären Chromosomen. Das
größere Chromosom (4,07 Mb) kodiert für Funktionen, die für Metabolismus und
Zellwachstum bedeutend sind. Das kleinere Chromosom (3,17 Mb) hingegen enthält
Gene die für Virulenzfaktoren und die Adaptation an unterschiedliche Umweltbedingungen
1
Einleitung
kodieren (Holden et al., 2004). So besitzt
Widerstandsfähigkeit
gegenüber
verschiedenen
B. pseudomallei eine sehr große
Umwelteinflüssen.
Beispielsweise
überlebt das Bakterium extrem niedrige pH-Werte (Dejsirilert et al., 1991) und hohe
Salzkonzentrationen (Robertson et al., 2010), überdauert lang anhaltenden Nährstoffmangel (Wuthiekanun et al., 1995) und kann selbst in destilliertem Wasser, sowie einigen
Antiseptika und Reinigungsdetergentien überleben (Gal et al., 2004). Daneben kodiert das
B.
pseudomallei-Genom
für
zahlreiche
natürliche
Antibiotikaresistenzen,
wie
beispielsweise gegen Penicilline, Cephalosporine und Aminoglykoside (Cheng & Currie,
2005; Cheng et al., 2005; Jenney et al., 2001).
Aufgrund seiner hohen Umweltstabilität, seiner Antibiotikaresistenzen und der hohen
Virulenz für Tier und Mensch, wurde B. pseudomallei 2002 vom „Center for Disease
Control“ in die Liste der potentiellen Biowaffen aufgenommen.
1.1.2 Epidemiologie und Klinik der Melioidose
Die Melioidose und ihr Erreger B. pseudomallei sind hauptsächlich zwischen dem 20.
nördlichen und 20. südlichen Breitengrad verbreitet. So ist die Melioidose in
Nordaustralien und in Gebieten Südostasiens, wie beispielsweise in Thailand, Vietnam,
Laos, Malysia, Taiwan und Singapur endemisch. Vereinzelt kommen auch Fälle in Indien,
China, und Teilen Afrikas, sowie Süd- und Mittelamerikas vor (Cheng & Currie, 2005). In
den Endemiegebieten tritt die Erkrankung gehäuft während der Regenzeit auf (Dance et
al., 1990). Als primäre Infektionsquellen werden Reis- und Pflanzenplantagen, feuchte
Böden und stehende Gewässer angesehen (Ellison et al., 1969; Leelarasamee &
Bovornkitti, 1989). Die Infektion mit B. pseudomallei erfolgt meist perkutan durch
Inokulation
über
kleine
Hautläsionen
durch
kontaminierte
Erde
oder
Wasser
(Leelarasamee & Bovornkitti, 1989) oder durch Aspiration erregerhaltiger Aerosole (Howe
et al., 1971). Hingegen spielt die Übertragung zwischen Tieren und Mensch praktisch
keine Rolle.
Die
klinischen
Verläufe
von
B.
pseudomallei-Infektionen
reichen
von
asymptomatischen Serokonversionen oder lokalen Hautmanifestationen bis hin zu
tödlichen Sepsen. Die Inkubationszeit ist extrem variabel und kann wenige Tage, einige
Monate, in Einzelfällen sogar Jahre bis Jahrzehnte betragen (Currie et al., 2000; White,
2003). Der Ausbruch und die Schwere der Erkrankung, sowie deren Verlauf werden unter
anderem von der Immunitätslage des Wirts bestimmt. Zu den prädisponierenden Faktoren
zählen insbesondere Diabetes mellitus, chronische Nieren- und Lungenerkrankungen,
Alkoholabhängigkeit sowie andere Erkrankungen oder Medikamente, die zu einer
Immunsuppression führen (Currie et al., 2000; White, 2003). Die Melioidose kann sowohl
2
Einleitung
akut oder subakut, als auch chronisch verlaufen (Howe et al., 1971). Bei akutem und
subakutem Verlauf tritt die Melioidose am häufigsten in Form von Pneumonien oder
Septikämien in Erscheinung und führt unbehandelt meistens in kurzer Zeit zum Tod. Oft
treten unspezifische Symptome wie hohes Fieber, Atemnot, Schwäche, Kopf- und
Muskelschmerzen und Gewichtsverlust auf. Ein typisches Erscheinungsbild für eine
Melioidose ist die Bildung von Absessen in verschiedenen Organen, vor allem in der
Lunge aber auch in Leber, Milz, Skelettmuskeln, Haut, Knochenmark, Lyphknoten und
Prostata. In seltenen Fällen können auch Abzesse im Gehirn oder Encephalomyelitis,
sowie Meningitis auftreten. Im fortgeschrittenen Stadium einer Septikämie kann der
Erreger im Blut, Eiter, Sputum, Urin und anderen Sekreten und Geweben nachgewiesen
werden (Leelarasamee & Bovornkitti, 1989; Wong et al., 1995; White, 2003; Cheng &
Currie, 2005). Eine Melioiodose kann aber auch als lokale Infektion mit Läsionen der Haut
oder Weichteile imponieren (Everett & Nelson, 1975; Chaowagul et al., 1989). In Form
einer Parotitis tritt die Melioidose gelegentlich bei Kindern auf, die keine bestimmten
Risikofaktoren zeigen, und ist in der Regel mit einer sehr guten Prognose verbunden
(Dance et al., 1989).
Da B. pseudomallei natürliche Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika besitzt (siehe
Abschnitt 1.1.1), ist die Behandlung einer Melioidose auf wenige Antibiotika beschränkt.
Mittel der Wahl bei schweren Verlaufsformen sind Ceftazidim oder Carbapeneme,
während sich bei leichteren Verläufen Trimethoprim-Sulfamethoxazol und Doxycyclin, zur
Therapie eignen (Peacock et al., 2008). Trotz optimaler antibiotischer Therapie sind
Rückfälle keine Seltenheit und die Todesfälle durch akute B. pseudomallei-Infektionen
sind vor allem in Thailand, wo die Letalität bei Erwachsenen trotz Therapie 50% beträgt,
immer noch beträchtlich (Peacock, 2006). Nach einer Erkrankung mit Melioidose sind
lebenslang regelmäßige, ärztliche Kontrollen angezeigt, um mögliche Rückfälle rechtzeitig
erkennen und therapieren zu können (Peacock, 2006).
1.2 Experimentelle murine Melioidose-Modelle
Wie unter Abschnitt 1.1.2 beschrieben, spielt der Immunstatus des Wirtes für den Verlauf
einer B. pseudomallei-Infektionen eine entscheidende Rolle. Zwei verschiedene Modelle
mit Inzucht-Mausstämmen spiegeln den akuten (BALB/c) und den chronischen Verlauf
(C57BL/6)
der
Melioidose
wieder.
C57BL/6-Mäuse
repräsentieren
im
murinen
Melioidosemodell einen relativ resistenten Mausstamm, während sich BALB/c-Mäuse sehr
sensibel gegenüber B. pseudomallei-Infektionen zeigen (Hoppe et al., 1999). So ist die
letale Dosis (LD50) bei intravenöser Infektion von C57BL/6-Mäusen mit B. pseudomallei
3
Einleitung
etwa 100-mal höher als bei BALB/c-Mäusen. Weiterhin konnten bereits zwölf Stunden
nach intravenöser Infektion in den inneren Organen von BALB/c-Mäusen wesentlich
höhere Keimzahlen gefunden werden als bei C57BL/6-Mäusen (Hoppe et al., 1999). Die
akute Melioidose, welche in BALB/c-Mäusen beobachtet werden kann, ist durch eine
starke Reaktion des angeborenen Immunsystems charakterisiert. Vermutlich führt die
Überproduktion
von
Zytokinen
in
der
frühen
Phase
der
Infektion
zu
einer
unangemessenen Zellantwort, welche in der Abwehr der Infektion versagt und mit
Gewebezerstörung und multiplen Organversagen einhergeht (Hoppe et al., 1999; Ulett et
al., 2000a; Ulett et al., 2000b). Hingegen zeigt sich bei einer chronischen Melioidose,
welche in C57BL/6-Mäusen beobachtet werden kann, ein moderater Anstieg von
proinflammatorischen Zytokinen, der es ermöglicht B. pseudomallei für eine Zeit in den
Phagozyten zurückzuhalten und genügend Zeit für eine adaptive Immunantwort lässt
(Barnes et al., 2001; Hoppe et al., 1999; Ulett et al., 2000a; Ulett et al., 2000b). Des
Weiteren zeigten Knochenmarkmakrophagen aus C57BL/6-Mäusen unter Stimulation mit
INF-γ
eine
höhere
bakterizide
Aktivität
gegen
B.
pseudomallei
als
Knochenmarkmakrophagen aus BALB/c-Mäusen (Breitbach et al., 2006). Dies lässt
vermuten, dass INF-γ-vermittelte Mechanismen von Makrophagen zur Abwehr von B.
pseudomallei zu der erhöhten Resistenz von C57BL/6-Mäusen verglichen mit BALB/cMäusen beitragen.
1.3 Grundlagen der Pathogenese der Melioidose
Der Verlauf einer B. pseudomallei-Infektion wird zum einem von dem Immunsystem des
Wirtes zum anderen von einer Vielzahl von Virulenzfaktoren des Erregers bestimmt. So
ermöglichen verschiedenste Eigenschaften des Erregers sich der Immunantwort des
Wirtes zu entziehen. Als Schlüsselkomponente in der Pathogenese von B. pseudomallei
gilt seine Fähigkeit, in phagozytierende und in nicht-phagozytierende Zellen einzudringen
und dort zu überleben und zu replizieren ohne durch bakterizide Abwehrmechanismen
wirksam bekämpft zu werden (Jones et al., 1996; Pilatz et al., 2006; Pruksachartvuthi et
al., 1990).
1.3.1 Adhäsion und Invasion
Die initiale Infektion mit B. pseudomallei über die Schleimhäute oder über die verwundete
Haut, setzt die Anheftung des Erregers an die Epithelzellschichten voraus.
Es wurde gezeigt, dass B. pseudomallei an den GM1-GM2 GlukosphingolipidgangliosidRezeptorkomplex in der Zellmembran von humanen Rachenepithelzellen bindet (Gori et
4
Einleitung
al., 1999). Pseudomonas aeruginosa bindet an diesen Rezeptorkomplex über Type-IV-Pili
(Comolli et al., 1999). Diese sind auch für die Adhäsion von B. pseudomallei an
verschiedene Epithelzelllinien von Bedeutung (Essex-Lopresti et al., 2005). Weiterhin
wurden die Genprodukte von boaA und boaB, welche dem Autotransporter-Adhäsin YadA
von Yersinia enterocolitica ähneln, als Adhäsine von B. pseudomallei identifiziert (Balder
et al., 2010).
Der Anheftung von B. pseudomallei an die Wirtszelle folgt die Invasion, welche durch
Endozytose erfolgt und Aktinumlagerungen des Wirtszellzytoskeletts erfordert (Jones et
al., 1996). Der exakte Mechanismus der Invasion ist noch nicht vollständig aufgeklärt.
1.3.2 Interaktion mit der angeborenen Immunantwort
Nach einer Infektion mit B. pseudomallei kommt es im Gewebe zum schnellen Eintritt und
zur Aktivierung von neutrophilen Granulozyten (Barnes et al., 2001). Diese sind in
C57BL/6-Mäusen essentiell um den akuten Verlauf der Melioidose abzuwehren (Barnes
et al., 2001; Easton et al., 2007). Ebenso sind für die Kontrolle der frühen B.
pseudomallei-Infektion Makrophagen von großer Bedeutung. Ihre Depletion führt im
murinen Modell zu signifikant erhöhten Mortalitätsraten (Breitbach et al., 2006; Barnes et
al., 2008). Die Erkennung des Erregers durch die Zellen der angeborenen Immunabwehr
erfolgt durch sogenannte Pattern-recognition-Rezeptoren (PRRs), wie den Toll-likeRezeptoren (TLRs) und den NOD-like-Rezeptoren (NLRs), an konservierten Strukturen
des Bakteriums, den sogenannten PAMPs (pathogen associated molecular patterns)
(Akira, 2001). B. pseudomallei exprimiert mehrere dieser PAMPS wie Flagellin, LPS oder
Peptidoglycan. Bei der Erkennung von B. pseudomallei in vivo scheint vorrangig TLR2,
welcher das LPS von B. pseudomallei erkennt, ausschlaggebend zu sein (Wiersinga et
al., 2007; Wiersinga et al., 2008). Allerdings besitzt B. pseudomallei-LPS im Vergleich
zum LPS anderer gramnegetiver Bakterien ein geringeres Potential an TLR-2 zu binden
(Utaisincharoen et al., 2000).
Die Aufnahme von Erregern durch Phagozyten wird durch Opsonierung mit
Komplementfaktoren verstärkt. Die von B. pseudomallei synthetisierten extrazellulären
Kapselpolysaccharide (EPS) und Lipopolysacharide (LPS) vermindern die Bindung von
Komplementfaktoren an das Pathogen und hemmen hierdurch die Aufnahme durch
phagozytierende Zellen. Gleichzeitig schützen sie B. pseudomallei vor bakteriziden
Wirkungen im phagolysosomalen Milieu, wodurch die Eliminierung des Pathogens durch
Phagozyten erschwert wird (Arjcharoen et al., 2007; DeShazer et al., 1998; ReckseidlerZenteno et al., 2005).
5
Einleitung
1.3.3 Überleben von B. pseudomallei in Makrophagen
Die Erkennung von Erregern durch TLRs oder NLRs führt zur Aktivierung von NF-κB. NFκB ist ein zentraler Transkriptionsfaktor, welcher für die Expression verschiedener Gene
der proinflammatorischen Immunantwort, wie zum Beispiel Zytokinen, der induzierbaren
Stickstoffmonoxid Sythetase (iNOS) und der NADPH-Oxidase, kontrolliert. Durch die
Aktivität der NADPH-Oxidase werden im Phagolysosom reaktive Sauerstoff-Intermediate
gebildet, welche bei der Abwehr von Erregern eine bedeutende Rolle spielen. Ein Defekt
in der NADPH-Oxidase führt zu einem schnelleren Versterben von C57BL/6-Mäusen nach
Infektion mit B. pseudomallei, sowie einer höheren bakteriellen Organlast im frühen
Stadium nach der Infektion. Weiterhin können Knochenmarkmakrophagen von NADPHOxidase defizienten C57BL/6-Mäusen B. pseudomallei weniger effizient abtöten als
Makrophagen der Wildtyp-Mäuse (Breitbach et al., 2006). Das durch iNOS gebildete
Stickstoffmonoxid (NO) ist für eine effiziente Eliminierung vieler Erreger gerade in der
frühen Phase der Infektion von Bedeutung. Jedoch besitzt B. pseudomallei-LPS im
Vergleich zum LPS anderer Erreger nur ein geringes Potenzial die Bildung von iNOS zu
stimulieren (Utaisincharoen et al., 2001). Weiterhin unterdrückt B. pseudomallei die
Bildung von Stickstoffmonoxid durch iNOS, indem es die Expression der negativen
Regulatoren SOCS3 und CIS aktiviert (Ekchariyawat et al., 2005). Die Subpression von
iNOS kann durch Stimulation mit INF-γ überwunden werden (Utaisincharoen et al., 2003,
2004). Es wurde gezeigt, dass iNOS vermittelte Mechanismen bei BALB/c-Mäusen für die
Kontrolle von B. pseudomallei-Infektionen eine bedeutende Rolle spielen, während bei B.
pseudomallei-infizierten C57BL/6-Makrophagen die schädigenden Effekte des durch
iNOS gebildeten Stickstoffmonoxids auf den Wirt überwiegen (Breitbach et al., 2011).
Während INF-γ-stimulierte Makrophagen von iNOS defizienten Knockout in C57BL/6Mäusen keine Einschränkungen in der Fähigkeit B. pseudomallei abzutöten zeigten, war
die bakterizide Aktivität von INF-γ-stimulerten Makrophagen aus BALB/c-Mäusen, bei
denen iNOS inhibiert wurde, deutlich reduziert (Breitbach et al., 2011).
Neben der Bildung von reaktiven Sauerstoff- und reaktiven Stickstoff-Intermediaten
können
Makrophagen
ein
breites
Spektrum
von
Eindringlingen
über
das
Phagolysosomale System eliminieren. B. pseudomallei ist in der Lage aus dem
Phagosomen auzubrechen, wobei das Type-III-Sekretionssystem-3 (T3SS-3) (siehe
Abschnitt 1.4.2) eine entscheidende Rolle spielt (French et al., 2011; Gong et al., 2011;
Pilatz et al., 2006; Stevens et al., 2002). Hierdurch entgeht das Bakterium der
Degradation durch das Phagolysosomale System.
Ein weiterer Weg, welchen eukaryotische Zellen nutzen um zytoplasmatische
Pathogene zu eliminieren, ist die Autophagie, ein Mechanismus der unter anderem auch
6
Einleitung
dazu dient, reguliert zerstörte Proteine, Zellorganellen oder unerwünschte Moleküle
abzubauen. B. pseudomallei scheint, wie auch einige andere Pathogene, nicht von
Autophagosomen umschlossen zu werden (Gong et al., 2011). Eine vermeintliche Rolle
des T3SS-3-Effektorproteins BopA bei der Umgehung der Autophagie (Cullinane et al.,
2008) wurde inzwischen widerlegt (Gong et al., 2011). Ähnlich wie bestimmte Formen der
Ubiquitinierungen bei Proteinen als Signal für den Abbau im Proteasomen dienen, spielen
auch bei der Markierung von Zellbestandteilen und Pathogenen für die Autophagie
Polyubiquitinierungen eine wesentliche Rolle. Ubiquitinierungen können aber auch die
Aktivität von Proteinen beeinflussen. Einige Bakterien haben Strategien entwickelt, um in
diese Mechanismen der eukaryotischen Zellen einzugreifen, indem sie Virulenzfaktoren
mit Deubitiquitinase-Aktivität sekretieren (Angot et al., 2007). Wie gezeigt werden konnte,
kann auch B. pseudomallei Ubiquitinierungen der Wirtszelle zu seinen eigenen Gunsten
ummodellieren. Bei dem sekretierten Virulenzfaktor TssM, handelt es sich um eine
Deubiquitinase welche die Aktivierung von NF-κB inhibiert, indem es die ubiquitinierten
Formen von Intermediaten im NF-κB aktivierenden Signalweg reduziert (Tan et al., 2010).
Von diesen Proteinen war polyubitiquitiniertes TRAF-6 in einem auf den Beobachtungen
bei Shigella flexeri basierendem Modell auch in die Ausbildung von Autophagosomen
involviert (Dupont et al., 2009). Ein Einfluss von TssM auf die Umgehung der Autophagie
wurde bisher aber noch nicht untersucht.
1.3.4 Induktion von Zelltod durch B. pseudomallei
Viele Pathogene induzieren nach der Infektion den Tod der Wirtszellen. Dies bietet
einerseits dem Erreger eine weitere Möglichkeit um den bakteriziden Mechanismen
insbesondere von Phagozyten zu entkommen. Andererseits kann der programmierte
Zelltod von infizierten Zellen des vielzelligen Wirt die Vermehrung von intrazellulären
Bakterien limitieren (Fink & Cookson, 2005; Lazar Adler et al., 2009). Die Aktivität von
CysteÏn-abhängigen
Aspartat-spezifischen
Proteasen
(Caspasen)
spielt
beim
programmierten Zelltod eine zentrale Rolle. Caspasen liegen als latente Zymogene vor
und werden erst durch Abspaltung einer N-terminalen Prodomäne aktiviert (Fink &
Cookson, 2005). Die klassische Apoptose ist gekennzeichnet durch die Aktivierung der
Initiator-Caspasen Caspase-8 und Caspase-9, welche dann die Effektor-Caspasen
Caspase-3 und Caspase-7 prozessieren. Die aktivierten Caspasen spalten selektiv ein
bestimmtes Set von zellulären Substraten, was zu den morphologischen und
biochemischen Veränderungen, welche mit Apotose assoziiert werden, führt. Apoptose
zeigt sich durch Kondensation von Zytoplasma und Zellkern, Spaltung der genomischen
DNA, mitochondrialer Permibilisation, Ausbildung von Apoptosomen und der Präsentation
7
Einleitung
von Oberflächenmolekülen, welche die Zelle für die Phagozytose markieren (Crawford &
Wells, 2010; Fink & Cookson, 2005). Pyroptose ist eine Form des Zelltods, welche durch
die Aktivität der Caspase-1 vermittelt wird, eine proinflammatorische Caspase, welche
auch die Zytokine IL-1β und IL-18 spaltet. Bei der Pyroptose werden die Zellen lysiert und
inflammatorischer Zellinhalt freigesetzt (Fink & Cookson, 2005)
B. pseudomallei ist in der Lage bereits wenige Stunden nach der Infektion sowohl
Apoptose als auch Pyroptose auszulösen (Kespichayawattana et al., 2000; Sun et al.,
2005). Bei der Aktivierung von Caspase-1 durch B. pseudomallei kommt dem
NLRC4/IPAF-Inflammasom und dem NLRP3-Inflammasomen eine zentrale Rolle zu
(Ceballos-Olvera et al., 2011; Miao & Warren, 2010). Der Knockout von Caspase-1, sowie
die Deletion von NLRC4 oder NLRP3 bei Mäusen wirkten sich in einer erhöhten
Empfindlichkeit gegen B. pseudomallei-Infektionen aus. Weiterhin weisen Knochenmarkmakrophagen von Caspase-1-Knockoutmäusen eine geringe Fähigkeit auf eingedrungene
B. pseudomallei abzutöten (Breitbach et al., 2009).
1.3.5 Intrazelluläre Beweglichkeit von B. pseudomallei
Wie einige andere intrazelluläre Pathogene (z.B. Shigella, Listeria, Mycobacterium) besitzt
B. pseudomallei die Fähigkeit sich im Zytoplasma der Wirtzelle durch Polymerisation des
eukaryotischen Zytoskelletproteins Aktin an einem Pol des Bakteriums fortzubewegen.
Diese Beweglichkeit unterstützt die Ausbreitung des Erregers von Zelle zu Zelle (Stevens
et al., 2005). Das Protein BimA von B. pseudomallei spielt bei der Bildung von
Aktinschweifen eine essentielle Rolle. Dieses Protein ist an dem Pol von B. pseudomallei
lokalisiert, an welchem die Aktinpolymerisation erfolgt. Es wurde gezeigt, dass BimA
monomeres Aktin bindet und die Aktinpolymerisation stimuliert (Stevens et al., 2005). Die
meisten Pathogene mit der Fähigkeit zur aktinbasierten Beweglichkeit machen sich den
Arp2/3-Komplex, welcher in die Aktinfilamentbildung und -Organisation involviert ist, zu
nutze, indem sie Proteine sekretieren, die bestimmte Aktivatoren des Arp2/3-Komplexes
nachahmen (Gouin et al., 2005). Zwar rekrutiert B. pseudomallei den Arp2/3-Komplex,
doch scheint dieser für die Aktinschweifbildung nicht essentiell zu sein (Breitbach et al.,
2003).
Bei B. thailandensis wurde gezeigt, dass dieser, neben der aktinvermittelten
Beweglichkeit, auch in der Lage ist sich aktinunabhängig mit Hilfe von Flagellen in der
Wirtszelle fortzubewegen (French et al., 2011). Hierfür kommt von zwei Genclustern,
welche für die Flagellenbiosynthese kodieren, dem auf dem kleinen Chromosomen
lokalisierten fla2-Cluster eine entscheidende Rolle zu (French et al., 2011). Die Relevanz
dieser Beobachtungen bei B. pseudomallei ist aber noch nicht geklärt.
8
Einleitung
A
B
Zellke
en
osm
End bruch
Aus
S
T 3S
rn
Membranlyse
oder –fusion
T6SS-1
-3
2
aFl
RiesenzellBildung &
Zell-ZellAusbreitung
Breitbach et al., 2003
BimA
Modifiziert nach French et al., 2011
Abb. 1: Modell des intrazellulären Lebenszyklus von B. pseudomallei.
A: Dargestellt sind entscheidende Schritte des intrazellulären Lebenszyklus mit den jeweils involvierten
Virulenzfaktoren. Grün: Aktin; Rot: Bakterien, Blau: Zellkern.
B: Immunofluoreszenzfärbung von Intrazellulären B. pseudomallei (grün) mit Aktinschweif (rot); Balken: 5 µm.
1.3.6 Ausbreitung von Zelle zu Zelle
Bei Shigella genügt die aktinvermittelte Beweglichkeit um sich über Membranausstülpungen von Zelle zu Zelle zu bewegen (Monack & Theriot, 2001). Bei B.
pseudomallei ist die intrazelluäre Beweglichkeit zwar Voraussetzung für die Ausbreitung
von Zelle zu Zelle, jedoch sind hierfür ebenso die durch B. pseudomallei-Infektion
hervorgerufenen Zellfusionen, welche zur Bildung von vielkernigen Riesenzellen führen,
notwendig (French et al., 2011; Harley et al., 1998; Stevens et al., 2005). Die Eigenschaft
vielkernige Riesenzellen zu induzieren, ist neben B. pseudomallei, B. thailandensis und B.
mallei (Harley et al., 1998) nur von Viren, wie HIV (Ciborowski & Gendelman, 2006), CMV
(Kinzler & Compton, 2005) oder HSV (Cole & Grose, 2003), sowie Mycobakterien
(Utermohlen et al., 2008) bekannt.
Mit der durch B. pseudomallei induzierten Riesenzellbildung werden der globale
Regulator RpoS, die durch BPSL0590 und BPSL0591 kodierten putativen Toxine, sowie
das Typ-VI-Sekretionssystem-1 (siehe Abschnitt 1.4.3) in Verbindung gebracht. So
konnten Überstände von E. coli-Kulturen, welche die B. pseudomallei-Gene BPSL0590
und BPSL0591 in einem Vektor tragen, bei J774.2-Makrophagen Apoptose, sowie
Zellfusionen induzieren (Dowling et al., 2010). Bei RpoS handelt es sich um einen
9
Einleitung
globalen Regulator, welcher möglicherweise auch Gene, die für die Bildung von
vielkernigen Riesenzellen benötigt werden, reguliert (Utaisincharoen et al., 2006).
1.4 Sekretionssysteme
1.4.1 Übersicht über die Sekretionssysteme gramnegativer Bakterien
Sekretionssysteme sind molekulare Nanomaschinerien in der Zellhülle von Bakterien,
welche dem Bakterium die Freisetzung von Molekülen erlauben. Sie spielen daher eine
zentrale Rolle bei der Interaktion von Bakterien mit ihrer Umwelt. So ermöglichen sie
beispielsweise die Nutzbarmachung von Nährstoffquellen und die Kommunikation mit
anderen Organismen (Filloux, 2011). Oft sind sie in symbiontische oder pathogene
Wechselwirkungen von Bakterien mit größeren Organismen involviert (Tseng et al., 2009).
Bei
gramnegativen
Bakterien
sind
zurzeit
sechs
verschiedene
Typen
von
Sekretionssystemen bekannt (Filloux, 2011). Diese können in zwei Kategorien unterteilt
werden: Sekretionssysteme mit Ein-Schritt-Mechanismus transportieren Proteine vom
bakteriellen Zytosol direkt ins externe Milieu. Beim Zwei-Schritt-Mechanismus machen die
Proteine eine Zwischenstadtion im Periplasma, bevor sie die äußere Membran passieren.
1.4.1.1 Sekretionssysteme mit Ein-Schritt-Mechanismus
Bei Seketionssystemen mit Ein-Schritt-Mechanismus durchspannt ein kontinuierlicher
Kanal die Bakterienhülle, welcher den direkten Transport vom bakteriellen Zytosol in die
Umgebung ermöglicht.
Typ-1-Sekretionssysteme (T1SS) sind im wesentlichen aus drei Hauptkomponenten
aufgebaut: Einer ATP-Bindekassette (ABC), welche durch ATP-Hydrolyse die Energie für
den Transport bereitstellt, einem durch Äußere-Membran-Faktoren (OMF) hergestellten,
Kanal durch das Periplasma und die äußere Membran, sowie Membranfusionsproteinen
(MFP), welche ABC und OMF im Periplasma verbinden (Delepelaire, 2004; Holland et al.,
2005; Tseng et al., 2009). Über T1SS werden beispielweise Alkaline Proteasen oder
Häm-Acquisitierungsproteine transportiert (Filloux, 2011).
Type-4-Sekretionssysteme (T4SS), welche sowohl bei gramnegativen als auch bei
grampositiven Bakterien zu finden sind, sind die einzigen Sekretionssysteme, durch
welche neben Proteinen auch Nukleinsäuren transportiert werden können. Diese werden
in Pflanzen- oder Tierzellen, in Hefen oder in andere Bakterien sezerniert (Christie et al.,
2005; Tseng et al., 2009). Der T4SS-Komplex durchspannt die gesamte Bakterienhülle.
10
Einleitung
Trotz funktioneller Ähnlichkeit der T4SS sind die Gene weniger konserviert als bei
anderen Sekretionssystemen (Tseng et al., 2009).
T3SS und T6SS sind sehr komplexe Strukturen, welche die direkte Freisetzung von
bakteriellen Proteinen in das Zytoplasma von eukaryotischen Zellen in einem Schritt
erlauben, und werden unter Abschnitt 1.4.2 und 1.4.3 näher beschrieben.
1.4.1.2 Sekretionssysteme mit Zwei-Schritt-Mechanismus
Proteine die durch einen Zwei-Schritt-Mechanismus nach außen transportiert werden,
erreichen das Periplasma meist über Exportwege, die auch für periplasmatische oder in
der äußeren Membran lokalisierte Proteine genutzt werden, wie dem ATP-abhänigen SecWeg oder dem Protonengradient-abhängigen Tat-Weg. Solche Proteine besitzen
abspaltbare N-terminale Signalsequenzen für die Sekretion ins Periplasma (Filloux, 2011).
Das Sec-abhängige Typ-II-Sekretionssystem (T2SS) transportiert ATP-abhängig
Proteine aus dem Periplasma durch eine in der äußeren Membran verankerte Pore aus
Sekretinuntereinheiten. Diese Pore ist groß genug um gefaltete Proteine hindurch
zulassen (Cianciotto, 2005; Tseng et al., 2009). Über T2SS werden beispielsweise
Elastase, Lipase und PhosholipaseC aber auch Hämolysine und ADP-ribosylierende
Exotoxine transportiert (Filloux, 2011).
Bei
Type-V-Sektertionsystemen
(T5SS)
werden
Proteine,
nachdem
sie
das
Periplasma erreicht haben, über von den Proteinen selbst gebildete Beta-Fass-Strukturen,
die in die äußere Membran inserieren und dort eine Pore bilden, nach außen transportiert.
Bei den sogenannten Autotransporter-Proteinen formt der C-Terminus die Pore durch
welche der N-Terminus des Proteins transportiert wird. Die Pore kann aber auch von
Proteintrimeren gebildet werden, wobei von drei Polypeptiden jedes zur Bildung der BetaFass-Struktur beiträgt. Eine dritte Möglichkeit ist die sogenannte Partnersekretion bei der
ein Protein die Pore bildet und das zweite Protein sekretiert wird (Dautin & Bernstein,
2007; Jacob-Dubuisson et al., 2004; Tseng et al., 2009). Zu den durch T5SS sekretierten
Proteinen gehören Adhäsine, Proteasen, Lipasen, Zytolysine und Toxine (Filloux, 2011;
Tseng et al., 2009).
1.4.2 Typ-III-Sekretionssysteme
Typ-III-Sekretionssysteme (T3SS) konnten bisher in mehr als 25 Arten gramnegativer
Erreger oder Symbionten identifiziert werden (Cornelis, 2006; Tseng et al., 2009). Für
viele
gramnegative
Tier-
oder
Pflanzenpathogene
stellen
T3SS
essentielle
Virulenzfaktoren dar, während bei anderen Arten T3SS in symbiontische Beziehung mit
11
Einleitung
dem Wirt involviert sind (Cornelis, 2006; Tseng et al., 2009). T3SS ermöglichen es dem
an die Oberfläche der Wirtszelle angeheftetem Bakterium Proteine in dessen Zytosol
freizusetzen und hierdurch wichtige Wirtszellfunktionen zu modulieren. T3SS besitzen
eine konservierte Struktur und sind evolutionär mit den Flagellen verwandt (Van Gijsegem
et al., 1995; Woestyn et al., 1994), bei welchen ein "built-in" Exportapparat für den
sequenziellen Export von Haken- und Filamentkompenenten sorgt (Aizawa, 2001;
Cornelis, 2010). Der Kern wird von neun Proteinen gebildet, die in allen T3SS konserviert
sind. Es können jedoch bis zu 25 verschiedene Proteine für den Zusammenbau eines
T3SS benötigt werden (Tseng et al., 2009). Ein T3SS besteht aus einer dem Basalkörper
der Flagellen ähnlichen Struktur, bei welcher ein äußerer und ein innerer Membran-Ring
durch einen hohlen, das Periplasma durchspannenden Stab verbunden werden, sowie
einer hohlen Nadel an der Bakterienoberfläche. Das Ende der Nadel umfasst den
Spitzenkomplex
aus
meist
einem
hydrophilen
und
zwei
hydrophoben
Translokatorproteinen, welche die Translokationspore in die Zytoplasmamembran der
Zielzellen integrieren. An der zytoplasmatischen Seite des Basalkörpers findet sich eine
ATPase, welche die Energie für den Proteintransport liefert. Durch den zentralen Kanal
vom Boden der Ringe bis zur Spitze der Nadel, 2-3 nm im Durchmesser, können Proteine
wahrscheinlich nur im ungefaltetem Zustand gelangen (Blocker et al., 2001; Kubori et al.,
1998; Sekiya et al., 2001; Tamano et al., 2000). Oft sind Chaperone für den Transport der
Proteine notwendig (Cornelis, 2006). Die Effektoren von T3SS sind sehr divers und
besitzen eine Vielzahl verschiedener biochemischer Aktivitäten, durch welche sie
entscheidende Funktionen der Wirtszellphysiologie umprogrammieren können. Ziele von
T3SS-Effektoren in tierischen Zellen sind oft MAPKs, kleine GTP-Bindeproteine, IκBα,
Phosphoinositide oder das Aktinzytoskelett. Die Effektorfunktionen ermöglichen den
Bakterien
beispielsweise
den
Schutz
vor
Autophagie,
die
Inhibition
der
proinflammatorischen Immunantwort, die Induktion von Zelltod oder die Modulation des
molekularen Transports (Cornelis, 2010; Dean, 2011).
Das Genom von B. pseudomallei kodiert für drei verschiedene T3SS. Das T3SS-1
(BPSS1390-BPSS1408) und das T3SS-2 (BPSS1613-BPSS1629) sind mit T3SS der
Pflanzenpathogene Ralstonia solanacearum und Xanthomonas spp. verwandt und in die
Pathogenese bei Pflanzen involviert (Attree und Attree, 2001; Lee et al., 2010). So wurde
gezeigt, dass diese beiden Sekretionssysteme für die Infektion von Tomatenpflanzen
benötigt werden (Lee et al., 2010). Kürzlich wurde jedoch auch eine Rolle des T3SS-1 für
die Virulenz im Mausmodell berichtet (D'Cruze et al., 2011). Das T3SS-3 (BPSS1520BPSS1554) ist mit dem Inv/Mxi-Spa System von Salmonella und Shigella verwandt und
für die volle Virulenz im Säuger von Bedeutung (Stevens et al., 2004). Wenn auch die
12
Einleitung
Funktion der meisten Gene des T3SS-3 noch nicht charakterisiert ist, können den
Strukturkomponenten basierend auf ihrer Homologie zu Genen in gut charakterisierten
T3SS ihre putativen Funktionen zugeordnet werden (Siehe Abb.2).
Wirtszellmembran
BipB
BipC (Translokator)
BipD (Nadelkappe)
BsaL (Nadel große Untereinheit)
OM
BsaO (Äußerer Ring)
Zellwand
BsaK (Nadel kleine Untereinheit)
IM
BsaJ (innerer Membranring)
BsaQWXYZ (Exportapparat)
BsaV (Zytoplasmatischer Ring)
BsaS (ATPase)
BsaTU, OrgAB (Nadelaufbau)
BsaP (Effektorexport)
BsaR (?), BopE
BicP, BopA (Chaperon & Effektor)
Modifiziert nach Sun et al., 2010
Abb. 2: Vorgeschlagenes Modell des T3SS-3 Nadelkomplexes von B. pseudomallei.
Die putativen Funktionen der Proteine und ihre Position basieren auf Informationen von Homolgen in anderen
gut charakterisierten T3SS. Die die farbliche Hinterlegung entspricht jeweils der Farbe der zugehörigen
Formen.
Mutationen verschiedener Gene, die für den Aufbau und die Funktion des T3SS-3
bedeutend sind (bsaZ, bsaU, bsaQ, bipD) führen zu einem verzögerten Ausbrechen von
B. pseudomallei aus dem Phagosomen und daraus resultierenden Beeinträchtigungen in
allen darauffolgenden Schitten des intrazellulären Lebenszyklus (Stevens et al., 2002;
Pilatz et al., 2006, Muangsombut et al., 2008; French et al., 2011). Des Weiteren wurde
gezeigt, dass eine Mutante des putativen T3SS-3-Effektors bopA, welchem früher
fälschlicherweise eine Rolle bei der Umgehung der Autophagie zugeschrieben wurde
(Cullinane et al., 2008), schlechter aus dem Phagosomen entkommen kann, als der B.
pseudomallei-Wildtyp (Gong et al., 2011). Neben BopA scheinen jedoch noch weitere
Effektoren des T3SS-3 beim Ausbrechen aus dem Phagosomen beteiligt zu sein, da die
Fähigkeit hierzu bei einer Mutante des bopA-Gens weniger stark eingeschränkt war als
bei einer Mutante des bipD-Gens (Gong et al., 2011). Bisher sind neben BopA nur BopE
13
Einleitung
und das in unmittelbarer Nachbarschaft zum T3SS-Cluster 3 kodierte BopC (BPSS1516)
als Effektorproteine des T3SS-3 bekannt (Stevens et al., 2003; Muangman et al., 2011)
Eine Rolle dieser beiden Effektoren beim Ausbrechen aus dem Phagosomen wurde
bislang noch nicht untersucht.
Eine moderate Rolle bei der Invasion wurde für verschiedene T3SS-Gene (bopE,
bopC, bsaQ, bipD, bipB) beschrieben (Muangman et al., 2011; Muangsombut et al., 2008;
Stevens et al., 2003; Suparak et al., 2005). Jedoch scheinen die als Invasionsdefekt
interpretierten, reduzierten intrazellulären Keimzahlen zu den untersuchten Zeitpunkten
(4-6 Stunden nach Infektion) eher auf einer eingeschränkten Überlebens- und
Replikationsfähigkeit der T3SS-Mutanten zu beruhen. So wurde anhand einer Mutante
des sctN-Genes, welches für die ATPase des T3SS-3 kodiert, gezeigt, dass ein Defekt
dieses Sekretionssystems keinen Einfluss auf die intrazellulären Keimzahlen zu frühen
Zeitpunkten (zwei Stunden) nach Infektion hat (French et al., 2011).
Mutationen in den Genen bsaZ und bsaU, welche vermutlich im Aufbau des T3SS-3
involviert sind, sowie den für die Translokatorproteine BipB und BipD kodierenden Genen
führten zu einer verringerten Virulenz im Säugetiermodel (Pilatz et al., 2006; Stevens et
al., 2004; Suparak et al., 2005; Warawa & Woods, 2005). Bisher ist jedoch nicht bekannt,
welche Effektoren des T3SS-3 für die Virulenz von B. pseudomallei entscheidend sind, da
weder Mutanten von bopE noch von bopA eine vergleichbare Attenuierung im Tiermodell
zeigten (Stevens et al., 2004; Warawa & Woods, 2005).
Guanidin
Austausch
Faktor
Rolle beim Ausbrechen aus dem Phagolysosomen
Virulenz
Rolle beim Ausbrechen
aus dem Phagolysosomen
reguliert
BsaN/BicA
Virulenz
reguliert
T3SS3-Effektoren
bprC und T6SS1
Reguliert T6SS1
Modifiziert nach Sun & Gan, 2010
Abb. 3: Gencluster des Typ-III-Sekretionssystem 3 von B. pseudomallei.
Grün: Gene, die für Regulatoren kodieren; weiß: Gene mit unbekannter Funktion; gelb: Gene, die für Effektor
oder Translokator-Proteine kodieren; Blau: Gene, die für Struktukomponenten des Sekretionssystems
kodieren; Rot: Gene, die für Chaperone kodieren.
14
Einleitung
Im T3SS-3 wurden sieben putative Regulatoren identifiziert: bsaN, bprA, bprB, bprC,
bprD, bprR und bprQ. Von den zwei AraC-ähnlichen Transkriptionsfaktoren bsaN und
bprC, ist bsaN für die Expression der T3SS-Effektoren notwendig. Darüber hinaus
reguliert bsaN die Expression von bprA, bprB, bprC und bprD, sowie des ZweiKomponenten-Respons-regulators virA/virG, welcher die Expression des T6SS-1 induziert
(siehe Abschnitt 1.4.3). BprR und BprQ sind Transmembranregulatoren in der inneren
Membran. BprR reguliert die Trankription von bsaN, während BprQ vermutlich die Aktivität
von BprR modifiziert (Sun et al., 2010). BprA, bprB, bprC und bprD werden nicht für die
Expression der T3SS-3-Gene benötigt. BprC spielt jedoch, ähnlich wie BsaN, eine Rolle
für die Induktion von Genen des T6SS-1 (Chen et al., 2011; Sun et al., 2010)
1.4.3 Type-VI-Sekretionssysteme
Typ-VI-Sekretionssysteme (T6SS) wurden erstmals im Jahr 2006 beschrieben (Mougous
et al., 2006; Pukatzki et al., 2006). Inzwischen wurden in mehr als 90 der bisher
sequenzierten Genome von Proteobakterien T6SS identifiziert, wobei einige der
bakteriellen Genome mehrere T6SS-Cluster aufweisen (Boyer et al., 2009). Der Kern der
T6SS-Cluster besteht aus 13 konservierten Genen, welche für essentielle Komponenten
des T6SS-Apparats kodieren (Boyer et al., 2009). Daneben können noch weitere T6SSassoziierte Proteine kodiert werden, welche nicht in allen T6SS-Clustern vorkommen.
T6SS ähneln dem Schwanzstift von Phagen. Wie T3SS ermöglichen auch T6SS die
direkte Freisetzung von Effektorproteinen ins Zytoplasma der Wirtszelle. In vielen gramnegativen Mensch- und Tierpathogenen, sowie Pflanzenpathogenen sind sie für die
Virulenz bedeutend (Bingle et al., 2008; Cascales, 2008; Filloux et al., 2008). In einigen
Fällen können T6SS jedoch auch die Virulenz des Erregers oder die Immunantwort des
Wirtes drosseln, um so eine Langzeitkolonisierung zu ermöglichen (Chow & Mazmanian,
2010; Parsons & Heffron, 2005) oder in wirtsspezifische, symbiontische Interaktionen
involviert sein (Bladergroen et al., 2003). Neben den Interaktionen mit eukaryotischen
Organismen können T6SS auch in antagonistische Interaktionen zwischen verschiedenen
bakteriellen Arten involviert sein (Hood et al., 2010; MacIntyre et al., 2010; Schwarz et al.,
2010) oder beispielsweise durch Unterstützung der Biofilmbildung der Anpassung an
Umweltbedingungen dienen (Aschtgen et al., 2008; Enos-Berlage et al., 2005). T6SS
bestehen aus einer zytoplasmatischen Domäne mit ATPase-Funktion, einer Kanalbrücke
von der inneren zur äußeren Membran und einer Nadel mit einem porenformenden
Protein an der Spitze (Shrivastava & Mande, 2008). Die Strukturproteine von T6SS sind
sehr konserviert, jedoch ist bisher nur von wenigen dieser Proteine die genaue Funktion
bekannt (siehe Abb. 4). Die Proteine IcmF und IcmH (DotU) verankern vermutlich den
15
Einleitung
Sekretionsapparat in der inneren Membran und ein FHA-Protein rekrutiert die ClpVATPase in ihre korrekte Position. Eine Zentrale Rolle spielen die Proteine Hcp und VgrG,
welche T6SS-abhängig sekretiert werden. Dabei hängt die Sekretion des einen Proteins
jeweils von dem anderen Protein ab, was zeigt, das diese beiden Proteine auch am
Aufbau des T6SS beteiligt sind (Cascales, 2008). Vermutlich lagern sich HcpHexamerringe zu einem hohlen Stift zusammen, an dessen Spitze ein VgrG-Trimer eine
Art Stachel bildet (Pukatzki et al., 2009). Häufig tragen die C-terminalen Enden der VgrGProteine funktionelle Effektordomänen. Zu den biologischen Funktionen dieser Cterminalen VgrG-Verlängerungen gehören Querverknüpfung von eukaryotischem Aktin,
ADP-Ribosylierung von Wirtsproteinen oder Degradation von Peptidoglucan im
Periplasma anderer gramnegativer Bakterien (Pukatzki et al., 2009).
VgrG
Zielzellmembran
Hcp
äußere
Membran
innere
Membran
IcmF
ClpV
DotU
ADP
ATP
Effektoren
Modifiziert nach Records, 2011
Abb. 4: Vorgeschlagenes Modell von T6SS.
Dargestellt sind Zentrale Proteine des T6SS und ihre putative Position im Sekretionsapparat.
Neben Hcp und VgrG sind bisher nur wenige Effektorproteine von T6SS bekannt. Hierzu
gehören beispielsweise das für die Virulenz im Zebrafisch bedeutende Protein EvpP von
Edwardsiella tarda oder die Peptidoglycan degradierenden Proteine Tse1 und Tse3 von
P. aeruginosa (Russell et al., 2011; Zheng & Leung, 2007).
Das Genom von B. pseudomallei kodiert für sechs T6SS, welche 2007 von Shell et al.
als
16
T6SS-1
(BPSS1496-BPSS1511),
T6SS-2
(BPSS0515-BPSS0533),
T6SS-3
Einleitung
(BPSS2090-BPSS2109),
T6SS-4
(BPSS0166-BPSS0185),
T6SS-5
(BPSS0091-
BPSS0117) und T6SS-6 (BPSL3096-BPSL3111) bezeichnet wurden (Schell et al., 2007).
Eine spätere Publikation von Shalom et al. im gleichen Jahr ordnete den selben T6SSClustern die Bezeichnungen tss-5, tss-4, tss-6, tss-3, tss-2 und tss-1 zu (Shalom et al.,
2007). Homologe zu fünf der sechs T6SS von B. pseudomallei sind auch bei den nah
verwandten Arten B. mallei und B. thailandensis zu finden. Die Homologen der Gencluster
T6SS-2, T6SS-3, T6SS-5 und T6SS-6 in B. thailandensis sind in interbakterielle
Interaktionen
involviert
und
ermöglichen
B.
thailandensis
sich
gegen
andere
Bakterienspezies durchzusetzen (Schwarz et al., 2010). Das T6SS-1 (Abb. 5), welches
nach der Aufnahme in Makrophagen induziert wird, ist bei B. thailandensis, B. mallei und
B. pseudomallei für die Virulenz im Säuger von großer Bedeutung (Burtnick et al., 2010;
Burtnick et al., 2011; Schwarz et al., 2010).
VirA/G:
Induktion der
Expression von
T6SS1
TssM
Deubiquitinase
T6SS1 unabhängige
Sekretion
VgrG
Wichtig für Hcp1-Sekretion
Hcp1:
Virulenz
wichtig für VgrG-Sekretion
intrazelluläre Replikation
Zytotoxizität,
Riesenzellbildung
tssK:
Virulenz
Fördert Beweglichkeit auf
Schwimm-Agar
Modifiziert nach Shalom et al., 2007
Abb. 5: Gencluster des Typ-VI-Sekretionssystem 1 von B. pseudomallei und bisher bekannte
Funktionen von Genen dieses Clusters.
Bei B. pseudomallei führten Mutationen des tssK-Genes, welches wahrscheinlich eine
Strukturkomponente des T6SS darstellt, sowie des Hcp1-Genes zur Attenuierung im
Säugetiermodell (Pilatz et al., 2006; Burnick et al., 2011). Weiterhin zeigte die Hcp1Deletionsmutante eine reduzierte intrazelluläre Replikation, wies eine verringerte
Zytotoxizität auf und war unfähig bei RAW264.7-Zellen die Bildung vielkerniger
Riesenzellen
zu
induzieren.
Ähnliche
Phänotypen
zeigten
auch Mutanten
der
Strukturkomponente TssA des T6SS-1, sowie des Zweikomponenten-Sensorregulators
VirA/VirG und des AraC-Regulators BprC (Chen et al., 2011).
17
Einleitung
Die ebenfalls im T6SS-1 kodierten Proteine VirA/VirG regulieren nach Aufnahme von B.
pseudomallei in die Wirtszelle die Expression der anderen Gene des T6SS-1 herauf.
BprC
wird
im
T3SS-3
kodiert
(siehe
Abschnitt
1.4.2),
reguliert
jedoch
die
wirtszellunabhängige Expression der T6SS-1-Gene (Chen et al., 2011). Aufgrund der
dualen Rolle von Hcp1 als Struktur- und Effektorprotein ist bisher unklar, ob die
beobachteten Phänotypen auf eine Hcp1-Effektorfunktion zurückzuführen sind oder auf
Funktionen bisher unbekannter Effektoren des T6SS-1 beruhen.
1.5 Identifikation neuer Virulenzfaktoren bei B. pseudomallei
Um neue Virulenzfaktoren zu identifizieren, wurden in früheren Arbeiten unserer
Arbeitsgruppe eine Vielzahl von Tetracyclin-resistenten Transposonmutanten generiert
und in einem Plaqueassay auf Defekte im intrazellulären Lebenszyklus untersucht (Pilatz
et al., 2006). Bei diesem Assay wurden Ptk2-Zellen mit B. pseudomallei infiziert und
anschließend mit Antibiotika-haltigem Agar überschichtet. Bakterien mit intaktem
intrazellulärem Zyklus konnten sich von Zelle zu Zelle ausbreiten, was zur Lyse von
Zellmembranen und zur Bildung von Plaques in der Zellschicht führte. Defekte im
intrazelluären Lebenszyklus gingen somit mit einer reduzierten Plaquebildung einher.
Zahlreiche der in diesem Plaquassay auffällig geworden Mutanten zeigten sich im
Mausmodell deutlich attenuiert.
Kanamycin-haltiger Agar
PtK2
Modifiziert nach Eske-Pogodda, 2007
Abb. 6: Plaqueassay zur Identifikation von Mutanten mit Defekten im intrazellulären Lebenszyklus.
Nur B. pseudomallei-Mutanten mit intaktem intrazellulären Lebenzyklus können sich von Zelle zu Zelle
ausbreiten, ohne das Antibiotika-haltige extrazelluläre Milieu zu durchqueren und hierdurch wie der B.
pseudomallei-Wildtyp, Plaques in der PtK2-Zellschicht induzieren.
18
Einleitung
Im Rahmen solcher Plaqueassay-Screenings wurden Mutanten mit Defekten in
Stoffwechselprozessen, in Strukturkomponenten, aber auch in Genen, welche für
hypothetische Proteine mit unbekannter Funktion kodieren, identifiziert (Eske-Pogodda,
2010; Pilatz et al., 2006). Einige im Plaqueassay auffällig geworden Mutanten mit
Defekten in Stoffwechselgenen, welche eine starke Attenuierung im Mausmodell
aufwiesen, wurden in Immunisierungsstudien auf ihre Eignung als Lebendvaccine
getestet. Dabei zeigte sich, dass die Immunisierung mit den getesteten Mutanten bei
BALB/c-Mäusen zu einem gewissen Grad vor einem akuten Verlauf der Melioidose
schützt, jedoch nicht den chronischen Verlauf einer B. pseudomallei-Infektion verhindern
kann (Breitbach et al., 2008).
Bei einer Mutante mit reduzierter Plaquebildung war das Transposon in das Gen
BPSS1539 (bsaU) im T3SS-3 inseriert. Diese Transposonmutante war im Mausmodell
attenuiert und konnte nach Infektion von HeLa-Zellen nur verzögert aus dem
Phagolysosomen ausbrechen. Im Gegensatz zu den Mutanten des bsaZ- oder des bsaQGenes konnte die bsaU-Transposonmutante jedoch innerhalb des Phagosomen
replizieren (Pilatz et al., 2006). Eine bsaU-Transposon-mutante einer anderen
Arbeitsgruppe zeigte eine reduzierte Sekretion des T3SS-3-Effektors BopE sowie des
Translokatorproteins BipD, was darauf hin deutet, dass BsaU für den Aufbau des T3SS-3
von Bedeutung ist (Hii et al., 2008).
Bei einer weiteren Mutante, welche eine reduzierte Fähigkeit zur Plaquebildung
aufwies, war das Gen BPSS1504 von der Transposonmutagenese betroffen (EskePogodda, 2010). Dieses Gen, welches für ein hypothetisches Protein kodiert, liegt im
Cluster des T6SS-1 und wird auch als tag (type-VI-secretionsystem associates gene) AB
bezeichnet.
Sowohl bsaU als auch BPSS1504 sind nicht konserviert und kodieren für Proteine mit
unbekannter Funktion.
19
Zielsetzung
2 Zielsetzung
Das Typ-VI-Sekretionssystem-1 (T6SS-1) und das Typ-III-Sekretionssystem-3 (T3SS-3)
von B. pseudomallei spielen eine bedeutende Rolle für die Virulenz des Erregers im
Säuger (Burtnick et al., 2011; Pilatz et al., 2006; Stevens et al., 2004). Die Strukturen von
T3SS und T6SS sind insgesamt recht stark konserviert. Durch die Analyse von
Transposonmutanten im Plaqueassay gab es erste Hinweise, dass die Gene bsaU im
Cluster des T3SS-3 und BPSS1504 im Gencluster des T6SS-1 eine Rolle für den
intrazellulären Lebenzyklus von B. pseudomallei spielen. Beide Gene gehören nicht zu
den konservierten Genen von T3SS und T6SS, und Homologe sind ausschließlich in den
beiden sehr nahe verwandten Arten B. thailandensis und B. mallei zu finden. Sowohl
bsaU und als auch BPSS1504 kodieren für hypothetische Proteine mit bisher
unbekannten Funktionen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten markerlose Mutanten von bsaU und BPSS1504
hergestellt werden. Hierfür sollte eine Methode zur gezielten Deletion von B.
pseudomallei-Genen etabliert werden, welche es erlaubt, auf die Verwendung von
Antibiotika, die für die B. pseudomallei-Therapie relevant sind, zu verzichten (Lopez et al.,
2009). Des Weiteren sollten die bsaU- und BPSS1504-Deletionsmutanten durch Insertion
des jeweiligen Zielgens in neutrale Intergenregionen des B. pseudomallei-Genoms und
ebenfalls ohne die Verwendung therapeutisch relevanter Antibiotika, komplementiert
werden (Choi et al., 2008).
In zellbasierten Versuchen sollte die Rolle von bsaU und BPSS1504 für die
intrazelluläre Replikation von B. pseudomallei, sowie dessen Fähigkeit zur Induktion von
Aktinschweifen und zur Induktion von vielkernigen Riesenzellen analysiert werden.
Weiterhin sollte der Einfluss von BPSS1504 und bsaU auf die Zytotoxizität von B.
pseudomallei und die Aktivierung von Caspasen untersucht werden. Im murinen Modell
sollte die Rolle von BPSS1504 für die Virulenz von B. pseudomallei in vivo getestet
werden. Ein weiteres Ziel war es, die Relevanz von BPSS1504 für die Funktionalität des
T6SS-1 zu klären. Außerdem sollten mit Hilfe von in silico-Analysen Hinweise auf die
Struktur und Funktion der durch BPSS1504 und bsaU kodierten Proteine gewonnen
werden.
20
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte
Agarosegelkammer
Armin Baack Labortechnik
Chemikalienwaage Typ SI-603
Denver Instrument
Chemikalienwaage Typ SI-2002
Denver Instrument
Chemikalienfeinwaage Typ SI-114
Denver Instrument
CO2- Inkubator CB 150
Binder Labortechnik
Digitaler Graphikdrucker
Sony
®
Dispergiergerät Ultra-Thurrax T18
IKA
Fluoreszenz-Mikroskop BZ-9000
Keyence
Geldokumentationseinheit Biodoc Analyze
Biometra
Geldokumentationseinheit Fusion FX 7
peqlab
Heizblock
peqlab
Kühl-und Gefrierkombination
Liebherr International
®
LightCycler 480
Roche
Inverses Mikroskop Typ Axiovert 40 CFL
Carl Zeiss
Mikrowelle MG-583 MC
LG
Mehrkanalpipette 50 µl; 200 µl
Brandt
Multipette
Eppendorf
pH/mV- Meter UltraBASIC Typ UB-10
®
Denver Instrument
Pipetierhilfe Pipetus -Akku
Hirschmann Laborgeräte
Platteninkubator
Binder Labortechnik
Plattenphotometer Tecan infinite Typ M200 Pro
Tecan
Proteingelkammer Minigel-Twin
Biometra
Rührhilfe
VWR
Spannungsgerät, Power Pack P25T
Biometra
Schüttelinkubator Typ KS15 mit Haube Typ TH15
Edmund Bühler Labortechnik
®
Schüttelinkubator Certomat BS-1
Satorius
Semidry-Blotter
peqLab
Spectrophotometer Nanodrop
peqlab
Speedvac, Univapo
Fröbel Laborgeräte
Steril-Bank Hera Safe Typ KS15
Heraeus Instruments
Steril-Bank Hera Safe Typ HS12/2
Heraeus Instruments
Stickstofftank, Arpege 70
Air Liquide DCM
Taumelschüttler Typ W17
Biometra
Thermocycler T3000
Biometra
®
Thermomixer Model RCT Basic IKA
IKA
21
Material und Methoden
Thermomixer Model Hotplate/Stirrer Alu
VWR
Tiefkühlgerät -70°C, HFU 686 Basic
Heraeus
UV-Tisch 312
Bachhofer Laborgeräte
UV/Vis-Spectrophotometer Typ Genesys10
Thermo Scientific
Variable Mikroliterpipetten
Satz 0,5-10 µl; 10-100 µl; 100-1000 µl
Brand
Vortex
VWR
Wasserbad Typ WB10
P-D Industriegesellschaft mbH
XCELLigence RTCA SP
Roche
Zell-Zählkammer nach Neubauer
Assistent Germany
Zentrifuge Typ Multifuge 1L-R
Heraeus
Zentrifuge Typ 5415
Eppendorf
Zentrifuge Typ 5417
Eppendorf
Zentrifuge Typ 5810
Eppendorf
3.1.2 Verbrauchsmaterialien
Cellulose-Acetatat-Membranfilter 0,45 µm; Ø 13mm
TM
Chamber Slide
8 well
Satorius
Nagle Nunc International
Deckgläschen, Ø 13mm No1
VWR
Deckgläser 20 mm x 26 mm x 0,4 mm
Haemacytometer
Einmalspritzen 1 ml
Dispomed
Einmalspritzen 5 ml
BD Discardit
Einmalspritzen 20 ml
BD Discardit
Einmaluntersuchungshandschuhe
Peha-soft; Hartmann
Einmalimpfoesen
Nagle Nunc International
Einmalküvetten, PS
Halbmicro 1,5ml; Roth
Einmalküvetten, PS
Halbmicro 2,5ml; Roth
Filterpapier 11µm
Whatman
Injektionsnadeln 27Gx¾" 0,4 mm x 19 mm
BD Microlance
®
TM
3
LightCycler 480 Multiwell-Platte 96, weiß
Roche
Mikro-Schraubröhrchen 2 ml
Nagle Nunc International
Nitril-Handschuhe Nitra-Tex
®
Ansell
Nitrocellulose-Membran Protran
Schleicher und Schüll
Objektträger 17 mm x 26 mm 3x1 inch, Mattrand
R. Langenbrink
Petrischalen 92 mm x16 mm
Sartedt
Pipettenspitzen 5 ml
Brandt
Pipettenspitzen 1 ml
Sarstedt
Pipettenspitzen 100 µl
Sarstedt
®
Pipettenspitzen 10µl Mµlti long reach
Roth
Pipettenspitzen kristall kurz
Roth
22
Material und Methoden
Reaktionsgefäße 0,2 ml PP
Sarstedt
Reagiergefäße 0,5 ml PP
Sarstedt
Reagiergefäße 1,5 ml PP
Sarstedt
Reagiergefäße 2,0 ml PP safe-seal
Sarstedt
Rundbodenröhrchen 5 ml Polysteren
BD Falcon
Rundbodenröhrchen 14 ml PP
Greiner Bio-one
®
Biozym
®
Safe Seal tips professional 10 µl
Biozym
Skalpelle: Präzisa plus
Dahlhausen
Serologische Pipetten 5 ml
Sarstedt
Serologische Pipetten 10 ml
Sarstedt
Serologische Pipetten 25 ml
Sarstedt
Spritzenvorsatzfilter, steril, Celluloseacetat Membran 0,2 µm
VWR
Spritzenvorsatzfilter, steril, Celluloseacetat Membran 0,45 µm
VWR
Safe Seal tips professional 100 µl
®
Steril-Filter: Sericup 0,22 µm
Millipore
Wattestäbchen steril
unomedical
Zentrifugengefäße 15 ml Falcons
Sarstedt
Zentrifugengefäße 50 ml Falcons
Zell/Gewebekulturflaschen Cellstar
BD Falcon
®
Greiner bio-one
Zellkulturplatte 96 well Cellstar
®
Greiner bio-one
Zellkulturplatte 48 well Cellstar
®
Greiner bio-one
Zellkulturplatte 24 well Cellstar
®
Greiner bio-one
Zellkulturplatte 6 well Cellstar
®
Greiner bio-one
Zellkulturplatte 96 well e-plate
Roche
Zellschaber 30cm
TPP
3.1.3 Chemikalien
Agarose MS
Sigma-Aldrich
ε-Amminocapronsäure
AppliChem
Ammoniumpersulfat (APS)
Roth
1-Bromo-3-Chloropropan
Sigma-Aldrich
Bromphenolblau
Sigma-Aldrich
BSA (Rinderserumalbumin) Fraktion V
AppliChem
Calciumchlorid
Sigma-Aldrich
Chloroform
J. T. Baker
Citronensäure
Merck
Coomassiebrilliantblau G-250
Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma-Aldrich
Dithiothreitol (DTT)
Roth
Desoxyadenosintriphoshat (dATP)
Roche
23
Material und Methoden
Desoxycytidintriphoshat (dCTP)
Roche
Desoxyguanosintriphoshat (dGTP)
Roche
Desoxythymidintriphoshat (dTTP)
Roche
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma-Aldrich
Essigsäure
J. T. Baker
Ethanol 99%
ChemSolute; J. T. Baker
Glycerol 85%
Merck
Glycin
Merck
Guanidin-Hydrochlorid
Applichem
Harnstoff
Merk
Isopropanol
ChemSolute
Kaliumacetat
Fluka
Kalium-D-Gluconat
Merck
Di-Kaliumhyrogenphoshat
Merck
Kristallviolett
AppliChem
Magnesiumsulfat
Sigma-Aldrich
Methanol
J. T. Baker
Natriumacetet
Merck
Natriumazid
Merck
Natriumammoniumhydrogenphoshat
Merck
Natriumchlorid
Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Merck
Natrium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma-Aldrich
Natriumhydroxid
Merk
Neutralrot
AppliChem
Paraformaldehyd
Serva
Phosphorsäure
Fluka
PonceauS
Sigma
Saccharose
Merck
Salzsäure
Merck
Saponin
Sigma-Aldrich
®
Tergitol TMN3
Fluka
Tetramehylethylendiamin (TEMED)
Serva
Thioharnstoff
Merck
Trichloessigsäure
Roth
Tris(-hyroxymethyl)-amminomethan (Tris)
Roth
Triton X-100
Sigma-Aldrich
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid)
Fermentas
X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure)
Fermentas
24
Material und Methoden
3.1.4 Fertiglösungen, Enzyme und Kits
®
AmpliTaq DNA-Polymerase
Roche Applied Biosystems
Alkaline Phophatase
Roche
®
Alkaline Phophatase FastAP
Fermentas
Complete™ Mini Proteaseinhibitorcocktail
Roche
TM
CytoTox-ONE
Homogenous Membrane Integrity Assay
DNase I
Fermentas
Fluoprep
Biomérieux
TM
GeneRuler , DNA Ladder Mix
GenElute
Promega
TM
Fermentas
HP Plasmid Maxiprep Kit
Sigma
GIEMSA-Färbelösung
Merck
Ketamin
Gräub
KOD Hot Start DNA-Polymerase
Novagen
®
LightCycler 480 SYBR Green I Master
LumiGLO
TM
Reagent (20x) und Peroxide (20x)
®
Roche
Cell Signaling
Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x)
Fermentas
M-MLV-Reverse Transkriptase
Promega
PageRuler, vorgefärbter Proteinmarker
Fermentas
®
Pfu Turbo DNA Polymerase
Stratagene
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)
Applichem
QIAquick Gel Extraction Kit
QIAGEN
QIAquick PCR Purification Kit
QIAGEN
Restriktionsenonukleasen
New England Biolabs
®
Restriktionsenonukleasen FastDigest
Fermentas
RNaseA
Fermentas
®
RNasin
Promega
Rompun 2%
Bayer
®
Roti -Block (10x)
®
Rotiphorese Gel 30
®
SYBR safe
Roth
Roth
Invitrogen
T4-DNA-Ligase
New England Biolabs
®
Invitrogen
TM
TRIzol Reagent
Invitrogen
Trypsin-EDTA (1x)
PAA
Tryptan Blau (0,4%)
Sigma-Alderich
Topo TA Cloning Kit
®
Tween 20
Sigma-Aldrich
25
Material und Methoden
3.1.5 Bestandteile von Bakterien- und Zellkulturmedien
3.1.5.1 Bestandteile von Zellkulturmedien
D`PBS (Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline)
DMEM+GlutaMAX
TM-I
(4,5g/l Glucose)
®
GIBCO Invitrogen
®
GIBCO Invitrogen
®
F-12K Nutrient Mixture
GIBCO Invitrogen
Fetales Kälberserum (FCS)
PAN Biothech GmbH
β-Mercaptoethanol (50mM)
GIBCO Invitrogen
rmGM-CSF
PAN
TM
Biotech GmbH
PANEXIN BMM
PAN
TM
Biotech GmbH
RPMI 1640
GIBCO Invitrogen
®
TM
®
®
3.1.5.2 Bestandteile von Nährmedien für die Kultivierung von Bakterien
Agar bacteriological
OXOID
2,6-Diaminopimelinsäure (DAP)
Sigma-Aldrich
Hefeextrakt
AppliChem
LB Broth Base (Lennox)
Invitrogen
LB-Agar
Serva
Müller-Hinton-Agar
OXOID
Trypton
AppliChem
Trypton-Soja-Broth
OXOID
Columbia-Agar-Platten mit 5% Schafsblut
BD Bioscience
3.1.5.3 Antibiotika
Ampicillin
Sigma-Aldrich
Gentamycin (50mg/ml)
Sigma-Aldrich
Kanamycinsulfat
Sigma-Aldrich
Polymyxin B- Sulfat
Sigma-Aldrich
Zeocin (100mg/ml)
Invivogen
3.1.6 Antikörper und Antikörperkonjugate
3.1.6.1 Antikörper
Caspase-1, Kaninchen mAk
Santa Cruz Biotechnology
Caspase-7, Kaninchen Ak
Cell Signaling Technology
cleaved Caspase-7 (D198), Kaninchen Ak
Cell Signaling Technology
Caspase-8 (D35G2), Kaninchen Ak
Cell Signaling Technology
murine Caspase-9, Kaninchen mAk
Cell Signaling Technology
Cleaved murine Caspase-9 (D353), Kaninchen Ak
Cell Signaling Technology
GAPDH, Kaninchen polyklonaler Ak
Cell Signaling Technology
26
Material und Methoden
B. pseudomallei BipD, Kaninchen monoklonales Ak-Serum
M. P. Stevens, London, UK
B. pseudomallei BopE, Kaninchen monoklonales Ak-Serum
M. P. Stevens, London, UK
B. pseudomallei Hcp1, Maus polyklonales Ak-Serum
D. DeShazer, Georgia, US
B. pseudeumallei EPS, Klon 3015 Maus monoklonales IgGγ2b
Steinmetz et al., 1995
Human CD107a (LAMP-1γ1), Maus Ak
BD Bioscience
Beta-Aktin (13E5) Kaninchen mAb
Cell Signaling Technology
3.1.6.2 Antikörperkonjugate
®
Invitrogen Molecular Probes
®
Alexa Fluor 568 anti-Maus IgG1
Invitrogen Molecular Probes
Anti-Kaninchen- IgG, HRP-gekoppelt
Cell Signaling Technology
Alexa Fluor 488 anti-Maus IgG2b
TM
Anti-Kaninchen-Cy 3
Dianova
Anti- Maus- IgG, HRP-gekoppelt
Cell Signaling Technology
3.1.7 Plasmide
A
B
Lopéz et al., 2009
Modifiziert nach Choi et al., 2008
Abb. 7: Plasmide die für die gezielte Mutagenese und die Komplementation zum Einsatz kamen.
A: Der Vektor pEX-Km5 basiert auf einem pEX100T Grundgerüst mit einem Replikationsursprung (ori), einem
Startpunkt für den konjugalen Transfer (oriT), einem lacZα-Gen, sowie zwei I-SceI Schnittstellen und dem
sacB (Bacillus subtilis levansucrase)-Gen, welches eine Sensitivität gegenüber Soucrose vermittelt. Zusätzlich
enthält der Vektor das Kanamycinresistenz-Gen nptII und das Reportergen gusA (β-Glucuronidase).
B: Der der auf
einem pUC18T-Grundgerüst basierende, mobilisierbare Vektor enthält mini-Tn7-
Basiselemente, die spezifisch und mit hoher Frequenz in Tn7-Anheftungstellens (attTn7) hinter dem Gen der
Glutamin-6-Phosphat-Synthase (glmS) stabil in bakteriellen Genom integrieren. Tn7R/L: rechtes und linkes
Ende
des
mini-Tn7-Elements;
T0T1:Transkriptionsterminatoren
des
Bakteriophagen
λ;
loxP:
Rekombinationssequenz aus dem Bakteriohagen P1; ble: Zeocinresistenz-Gen; oriT-Origin für den
konjugativen Transfer; ori-Origin aus ColE1; bla β-Lactamase-kodierendes Gen.
27
Material und Methoden
Tabelle 1: Liste der in dieser Arbeit verwendeten Plasmide.
Plasmid
®
Quelle/
Referenz
Charakteristika
r
r
pCR2.1 -Topo
TA- Klonierungsvektor, Km , Ap
invitrogen
pCR2.1-TopoBPSS1504KO
pCR2.1 mit den Sequenzen 647 bp upstream und 827 bp
r
r
downstream des BPSS1504-Orf, Km , Ap
diese Arbeit
pCR2.1-TopoBPSS1539KO
pCR2.1 mit den Sequenzen 765 bp upstream und 766 bp
r
r
downstream des bsaU-Orf, Km , Ap
diese Arbeit
pEX-Km5
nptII- Gen (Km , gusA- Reportergen; B. pseudomallei
optimiertes sacB- Gen
Lopéz et al.,
2009
pEX-KM5BPSS1504KO
pEX-Km5 mit 647 bp upstream und 827 bp downstream
des BPSS1504-Orf
diese Arbeit
pEX-KM5BPSS1539KO
pEX-Km5 mit 765 bp upstream und 766 bp downstream
des bsaU-Orf
diese Arbeit
pUC18TminiTn7Zeo-loxP
Ap , Zeo ; mobilisierbarer mini-Tn7 basierter Vector mit
einem loxP-PEM7-ble-loxP- Fragment
Choi et al.,
2008
pUC18TminiTn7Zeo-BPSS1504
pUC18TminiTn7-zeo-loxP mit dem BPSS1504-Orf
diese Arbeit
pUC18TminiTn7Zeo-BPSS1539
pUC18TminiTn7-zeo-loxP mit dem bsaU-Orf
diese Arbeit
r)
r
r
3.1.8 Oligonukleotide
Random Primer für die RT-PCR wurden von der Firma Promega bezogen. Alle anderen
für diese Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Eurofins
sythetisiert.
Primer für die gezielte Mutagenese von BPSS1504
BPSS1504up_for1a
BPSS1504up_rev2a
BPSS1504dn_for2a
BPSS1504dn_rev1a
5´- CGACGACCCAGTTCGACCTGAAG - 3´
5´- CGTGTGAACGAGGTCGGACATGGAAGGATCCGAACGAATGCG
CGGCTCAG - 3´
5´- CGGCTGAGCCGCGCATTCGTTCGGATCCTTCCATGTCCGACC
TCGTTCAC - 3´
5´- AGGTCCGCGTCGAAGAACATCGTC - 3´
Primer für die gezielte Mutagenese von bsaU
BPSS1539up_for
BPSS1539up_rev
BPSS1539dn_for
BPSS1539dn_rev
5´- TCGACGGCCACGTGTATCTG - 3´
5´- GCGACGCGCCTGAACAACGTATAGCGCGGAACCCATGACCTG
CTCCTTCC - 3´
5´- ACATCACGGAAGGAGCAGGTCATGGGTTCCGCGCTATACGTT
GTTCAGGC - 3´
5´- TCGTGCAGCACGAACTCCAG - 3´
Primer zur Verifizierung der Deletion von BPSS1504 bzw. bsaU
BPSS1504KOver_for
5´- AGCTCGACGAAGGCAAGATCG - 3´
BPSS1504KOver_rev
5´- TCAGGTCGCATTGCAGCCAG - 3´
28
Material und Methoden
BPSS1539ko-seq_for
5´- GTTCTACACGGTGCTGCTCG – 3´
BPSS1539ko-seq_rev
5´- TTCACCTCGACCGCGAGCTG -3´
Primer für die Komplementation von BPSS1504 und bsaU
BPSS1504for-HindIII
5´- CCGCTAGCTAAAGCTTATGAAAATCGTCAAACCCGAAACG - 3´
BPSS1504rev-KpnI
5´- CCGATCACTTGGTACCTGGAAGGCGTCGAGGGAATC - 3´
BsaUfor-HindIII
5´- CCGCTAGCTAAAGCTTGTCATGGGTTCAACCATCAG - 3´
BsaUrev-KpnI
5´- CCGATCACTTGGTACCGCCTGAACAACGTATAGC - 3´
Primer zur Verifizierung der Tn7 - Insertionsstelle
Tn7L
5´- ATTAGCTTACGACGCTACACCC - 3´
BPGLMS1
5´- GAGGAGTGGGCGTCGATCAAC - 3´
BPGLMS2
5´- ACACGACGCAAGAGCGGAATC - 3´
BPGLMS3
5´- CGGACAGGTTCGCGCCATGC - 3
Primer für semiquantitative Expressionsanalysen
virG-F
5´- TACGTCGTGAAGCCGTACTCG -3´
virG-R
5´- CTTTCGCGTCGAAGTAGTAGC -3´
virA-F
5´- CTGTGCTTCGCGTCGATATGG -3´
virA-R
5´- GTGGCAATCGATCGTCGTCAG -3´
hcp1-F
5´- GATCACCCACATGGACCAATAC -3´
hcp1-R
5´- TGCCCGATTCCGCGTGTTC -3´
vgrG-F
5´- CTCACGTCCGGCAACAAGTTC -3´
vgrG-R
5´- CGTCTGCAGCAGTGTCGATG -3´
tssA-F
5´- GACTTCAACGACGTGATGAG -3´
tssA-R
5´- GCGACGATCTCCTGGATG -3´
bimA-F
5´- ATCGACGCCTGACGCTTC -3´
bimA-R
5´- CCTATGGCGATCGATTGCTC -3´
bsaN-F
5´- ATAAATCGGCGCTGGTTATC -3´
bsaN-R
5´- CAGCCAGCGGTCGAATTTC -3´
bprC-F
5´- GAAACAGCTTGCCGAACGTC -3´
bprC-R
5´- GCTACATCGAGCAGCATCTTC -3´
23S rRNA-F
5´- TTTCCCGCTTAGATGCTTT -3´
23S rRNA-R
5´- AAAGGTACTCTGGGGATAA -3´
Primer für Realtime-PCR
virG1
5´- CCCCATAGCGTCTCCACCTC -3´
virG2
5´- GATCCGAAGCATCCCGAACTG -3´
bsaN1
5´- AATAAATCGGCGCTGGTTATCGGC -3´
bsaN2
5´- AGCAATTTCGCCGCCTCGAATAAC -3´
bprC1
5´- GCGGAACAGCCGATAGAG -3´
bprC2
5´- CATCGAGCAGCATCTTCATC -3´
29
Material und Methoden
vgrG1
5´- CTCACGTCCGGCAACAAGTTC -3´
vgrG2
5´- TTGCCGCCCATCGACACC -3´
tssA1
5´- GTCGACAAGGACGACTTCAA -3´
tssA2
5´- GAGCGTGAGCTGGAGGTT -3´
hcp1-F
5´- GATCACCCACATGGACCAATAC -3´
hcp1-R
5´- TGCCCGATTCCGCGTGTTC -3´
16S rRNA1
5´- GGCTAGTCTAACCGCAAGGA -3´
16S rRNA2
5´- TCCGATACGGCTACCTTGTT -3´
3.2 Bakterien
3.2.1
Medien für die Anzucht von Bakterien
YT-Medium:
10 g/l Hefeextract
10 g/l Trypton
YT/Sucrose-Agar:
10 g/l Hefeextract
10 g/l Trypton
15% Sucrose
15 g/l Agar
LB-Medium (Lennox):
20 g/l LB Lennox
(fertiges Gemisch)
LB-Medium mit NaCl
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextract
170 mM, 320 mM oder 470mM Natriumchlorid
LB-Agar:
35g/l LB-Agar
(fertiges Gemisch)
LBG-Agar:
LB-Agar mit 4% Glycerol
Vogel-Bonner-Medium:
(Minimalmedium)
28 mM Natriumammoniumhydrogenphoshat
37 mM Di-Kaliumhydrogenphosphat
3,3 mM Magnesiumsulfat
10 mM Citronensäure
0,214 M Kalium-D-Gluconat
pH 7
30
oder
oder
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextract
5 g/l Natriumchlorid
20g/l LB Lennox
15g/l Agar
Material und Methoden
Ashdown-Agar:
10g/l Trypton-Soya-Broth
15g/l Agar
35% Glycerol
0,0005% Kristallviolett
0,005% Neutralrot
5 µg/ml Gentamycin
Müller-Hinton-Agar:
38 g/l Müller-Hinton-Agar (fertiges Gemisch)
Columbia-Agar mit 5% Schafsblut fertig von BD Bioscience bezogen
3.2.2
Bakterienstämme
Tabelle 2: Liste der verwendeten Bakterienstämme.
Stamm
Beschreibung/Charakteristika
Quelle/Referenz
E. coli
s
SM10(λpir)∆asd::FRT∆aphA::FRT; Km ;
DAP auxotroph
Wirt für Klonierungen
Helfer-Stamm für die Konjugation
Helfer-Stamm für die Konjugation
invitrogen
Phadnis and Das 1987
Choi et al., 2008
∆BPSS1504
B. pseudomallei Wildtypstamm,
Bodenisolat aus Nordost-Thailand
E8- Derivat mit deletiertem BPSS1504-Orf
Institut für Tropenmedizin
Bangkok, Thailand
diese Arbeit
∆BPSS1504:Tn7:
BPSS1504
∆bsaU
∆BPSS1504 mit chomosomal integriertem
miniTN7- Zeo- BPSS1504
E8- Derivate mit deletiertem bsaU-Orf
diese Arbeit
∆bsaU:Tn7:bsaU
∆bsaU mit chomosomal integriertem
miniTN7- Zeo- bsaU
RHO3
DH5α
HB101 pRK2013
DH5α pTNS3
Lopéz et al., 2009
B. pseudomallei
E8
diese Arbeit
diese Arbeit
3.2.3 Anzucht und Konservierung von Bakterienstämmen
Die Kultivierung von E. coli-Stämmen erfolgte standardmäßig auf LB-Agar (ggf. unter
Antibiotikazugabe) bei 37°C und Flüssigkulturen wur den in LB-Medium bei 200-220 rpm
und 37°C angschüttelt.
Die Anzucht von B. pseudomallei erfolgte auf Columbia-Agar mit 5% Schafblut, auf
Müller-Hinton-Agar oder auf Ashdown-Agar bei 37°C. B. peudomallei-Flüssigkulturen
wurden in LB-Medium bei 37°C und 140 rpm angezogen.
Für die Kryokonservierung der Bakterien wurden die zu konserverienden Stämme
über Nacht in LB-Medium angezogen, die Flüssigkultur mit 30% Glycerol versetzt,
aliquotiert und bei -70°C eingefroren.
31
Material und Methoden
3.2.4
Herstellung von kompetenten Zellen
Zur Herstellung transformationskompetenter E. coli wurde über Nacht eine Vorkultur des
jeweiligen Stammes in LB-Medium bei 37°C und 220 r pm angezogen. Diese wurde 1:100
in 100 ml LB-Medium verdünnt und im Schüttelinkubator bei 37°C und 220 rpm bis zu
einer OD600 zwischen 0,3 und 0,5 kultiviert. Danach wurde die Kultur für 20 min auf Eis
abgekühlt und anschließend für 10 min bei 2800 x g und 4°C zentrifugiert. Das
Bakterienpellet wurde in 10 ml eiskaltem 0,1 M CaCl2 resuspendiert und bei 900 x g und
4°C für 10 min erneut pelletiert. Nach zweimalliger Wiederholung dieses Waschvorganges
wurde das Pellet ein weiteres Mal in 10 ml eiskaltem 0,1 M CaCl2 resuspendiert, 30 min
auf Eis inkubiert und anschließend 10 min bei 900 x g und 4°C zentrifugiert. Anschließend
wurden die Bakterien in 2 ml eiskaltem 0,1 M CaCl2
und 1 ml Glycerin (99%)
resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden in 100 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bis zur Verwendung bei -70°C gel agert.
3.2.5
In vitro-Assays
3.2.5.1 Erstellen von Wachstumskurven
Für die Erstellung von Wachstumskurven wurden die jeweiligen B. pseudomallei-Stämme
aus Übernachtkulturen in 50 ml LB- oder Vogel-Bonner-Medium so verdünnt, dass die
Optische Dichte bei 650 nm (OD650) 0,025 betrug. Die Kulturen wurden bei 37°C und 14 0
rpm bebrütet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und die OD650
photometrisch bestimmt. Dabei wurden die Proben so verdünnt, dass die am Photometer
gemessene OD650 stets zwischen 0,02 und 0,8 lag.
3.2.5.2 Schwarmverhalten auf Softagar
Von einer Reinkultur auf Columbia Blutagar wurde eine Pipettenspitze Koloniematerial in
die Mitte von Softagarplatten (LB mit 0,3% Agar) aufgebracht und bei 37°C gebrütet. Nach
48 h wurde der Hofdurchmesser ermittelt.
3.2.5.3 Biofilmassay
Die zu untersuchenden B.pseudomallei-Stämme wurden über Nacht in LB-Lennox bei
37°C und 140 rpm angezogen. Nach Bestimmung der OD 650 wurde jeder Stamm in 10 ml
LB-Medium auf eine OD650 von 0,01 eingestellt und sechs Aliquots von 0,5 ml in 4 mlPolysterenröhrchen pipettiert. Nach 24 h statischer Inkubation bei 37°C wurde das
Medium abgenommen, die Röhrchen einmal mit Aqua dest gewaschen und anschließend
der adhärente Biofilm mit einer 1%igen Kristallviolett-Lösung angefärbt. Der nicht
32
Material und Methoden
gebundene Farbstoff wurde durch dreimaliges Waschen mit Aqua dest entfernt und der
Biofilm mit 1 ml 100%igem Methanol entfärbt. Die Färbung des Methanols wurde über die
Absorbtion bei 540 nm gemessen.
3.3 Arbeiten mit DNA
3.3.1
Puffer und Lösungen für das Arbeiten mit DNA
Lysispuffer zur Isolation genomischer DNA:
50 mM Tris/HCl pH 8
10 mM Na2EDTA
0,5% SDS
Elektrophorese-Puffer (20x):
1,6 M Tris/Essigsäure pH 7,9
50 mM EDTA
DNA-Ladepuffer (6x):
0,4 g/ml Saccharose
0,1 mM Na2EDTA
0,25% Bromphenolblau
Puffer 1 für Plasmid-Präparationen:
50 mM Tris/HCl pH8
10 mM Na2EDTA
100 µg/ml RNaseA
(Lagerung bei 4°C)
Puffer 2 für Plasmid-Präparationen:
200 mM NaOH
1% SDS
Puffer 3 für Plasmid-Präparationen:
3 M Kaliumacetat/ Essigsäure pH 5.5
3.3.2
Isolation von genomischer DNA aus B. pseudomallei
Um genomische DNA aus B. pseudomallei zu gewinnen wurden je 2 ml Übernachtkultur
der entsprechenden Stämme in 2-ml-Safeseal-Reagiergefäßen für 1 min bei 11.000 x g
abzentrifugiert und das erhaltene Bakterienpellet in 600 µl Lysispuffer resupendiert. Durch
Vermischen des Lysates mit dem gleichen Volumen eines Phenol-ChloroformIsoamylalkohol-Gemisches (25:24:1) und anschließender Zentrifugation für 5 min bei
11.000 x g, wurden die Nukleinsäuren von den restlichen Zellbestandteilen getrennt. Bei
diesem Verfahren befinden sich die Nukleinsäuren in der oberen wässrigen Phase, die
sich deutlich von der organischen Phase, welche Lipide enthält und der proteinhaltigen
Interphase abgrenzt. Daher wurde die obere Phase vorsichtig abgenommen und in ein
33
Material und Methoden
frisches 2-ml-Safeseal-Reagiergefäß überführt. Um eine höhere Reinheit zu erreichen
wurde die Phenol-Chloroform-Extraktion wiederholt und im Anschluss daran, die wässrige
Phase mit Chloroform in einem Volumenverhältnis von 1:1 vermischt und 5 min bei
13.000 x g zentrifugiert. Erneut wurde die obere Phase in ein frisches Reaktionsgefäß
überführt. Die Nukleinsäuren wurden durch Zugabe von zwei Volumen 99%igem Ethanol
und 1/20 Volumen 3 M Natriumacetat, gefolgt von einer Inkubation bei -20°C für
mindestens 1 h, ausgefällt und durch Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 20.000 x g
pelletiert. Nachfolgend wurde das DNA-Pellet einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen,
für 5 min bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert und nach Abnahme des Überstandes an der
Luft getrocknet. Schließlich wurde die DNA in 50-80 µl Aqua bidest gelöst und bei 4°C
gelagert.
3.3.3
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die selektive, exponentielle Amplifikation eines spezifischen DNA-Bereiches erfolgte
durch die Polymerasekettenreaktion (PCR). Für die Herstellung der Knockout-Konstrukte
wurde, aufgrund ihrer Korrekturleseaktivität, die PfuTurbo®DNA-Polymerase verwendet.
Die Amplifikation der 5' und 3' des Zielgens gelegenen Regionen erfolgte von
genomischer DNA aus B. pseudomallei E8 in einem 50 µl-Reaktionsansatz. Zum
Verknüpfen der gereinigten PCR-Produkte mittels Overlap extension-PCR (siehe
Abschnitt 3.4.1 Abb.8) wurden als Template in einem 25 µl-Reaktionsansatz 10-15 ng von
jedem der zu verbindenden Fragmente eingesetzt. Als Primer wurden hierbei der
Vorwärtsprimer des 5'-Fragments und der Rückwärtsprimer des 3'-Fragments verwendet.
Die
Reaktionen
erfolgten
in
Ansätzen
folgender
Zusammensetzung
mit
dem
angegebenen Programm im Termocycler:
1x
Cloned Pfu-Puffer
Schritt
Temp. Zeit
je 0,2 mM
dATP, dGTP, dCTP und TTP
1. Denaturierung 95°C
200 nM
Vorwärts-Primer
2. Amplifikation:
200 nM
Rückwärts-Primer
Denaturierung 95°C
4%
DMSO
Annealing
Tm -5°C 25-30sec
0,025U/µl
PfuTurbo®DNA-Polymerase
3-6 ng/µl
je 0,4-0,6 ng/µl
genomische DNA oder
gereinigte PCR-Produkte
Elongation
72°C
5. Elongation
72°C
2 min
Zyklen
1
20-30sec
34
1,5 min/
kbp
7 min
1
Zur Klonierung von Genen fand weiterhin die KOD Hotstart DNA-Polymerase
Verwendung, welche ebenfalls eine Korrekturleseaktivität besitzt. Die Reaktion erfolgte
nach folgendem Schema:
34
Material und Methoden
1x
KOD-Hotstart-Puffer
Schritt
1,5 mM
MgSO4,
1. Denaturierung 95°C
je 0,2 mM dATP, dGTP, dCTP und TTP
Temp. Zeit
Zyklen
5 min
1
2. Amplifikation:
250 nM
Vorwärts-Primer
Denaturierung 95°C
250 nM
Rückwärts-Primer
Annealing
Tm -5°C 25-30sec
15%
DMSO
0,02 U/µl
KOD Hotstart DNA-Polymerase
Elongation
70°C
3-6 ng/µl
genomische DNA
5. Elongation
70°C
25 sec
30 sec
kbp
4 min
34
1
Für alle weiteren in dieser Arbeit durchgeführten PCRs kam die AmpliTaq®DNAPolymerase zum Einsatz. Als Template dienten neben genomischer B. pseudomallei-DNA
auch mittels RT-PCR gewonnene cDNA oder Plasmid-DNA. Die Reaktionen erfolgten wie
folgt:
1x
Reaktionpuffer II
Schritt
Temp. Zeit
Zyklen
2,5 mM
MgCl2
1. Denaturierung 95°C
je 0,2 mM
dATP, dGTP, dCTP und TTP
2. Amplifikation:
250 nM
Vorwärts-Primer
Denaturierung 95°C
250 nM
Rückwärts-Primer
Annealing
Tm -5°C 25-30sec
0-6%
DMSO
0,03 U/µl
AmpliTaq®DNA- Polymerase
Elongation
72°C
3-6 ng/µl
1-4 ng/µl
1,6-4 ng/µl
genomische DNA oder
Plasmid DNA oder
cDNA
5. Elongation
72°C
2 min
1
20-30sec
1min/
kbp
2-4 min
32-35
1
3.3.4 Agarosegelelekrophorese
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die AgaroseGelelektrophorese eingesetzt. Dazu wurden 4 bis 10 µl des jeweiligen DNA-Ansatzes mit
dem entsprechenden Volumen 6-fach DNA-Ladepuffer versetzt, auf das Gel geladen und
für 20 bis 40 min bei 110 V in 0,5-fach Elektrophorese-Puffer aufgetrennt. Zur
näherungsweisen
Bestimmung
der
Fragmentgröße
wurden
5
µl
eines
DNA-
Längenstandards mitgeführt.
Die Agarosekonzentration des Gels richtete sich nach der erwarteten Fragmentlänge:
> 7.000 bp
0,8% Agarose
500-7.000 bp
1,0% Agarose
100-500 bp
2,0% Agarose
35
Material und Methoden
Zur Färbung der DNA wurde der Agarosegellösung der interkalierende Farbstoff
SYBR®safe 1:10.000 zugesetzt, der die DNA-Fragmente nach ihrer Auftrennung unter
UV-Licht als orangefarbene Banden sichtbar werden lässt.
3.3.5
Reinigung von DNA-Fragmenten und Gelextraktion
Die Reinigung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von 100 bis 10.000 bp erfolgte mit
dem QIAquick PCR-Purification Kit der Firma QIAGEN. Zur Aufreinigung von DNAFragmenten aus Agarosegelen wurde der QIAquick Gel-Extraction Kit verwendet. Die
Arbeitsschritte entsprachen den Angaben des Herstellers.
3.3.6
Restriktionsverdau und Dephosphorylierung
Um DNA-Doppelstränge an spezifischen Sequenzen zu spalten, wurden sowohl die
Restriktionsenddonukleasen von der Firma NEB als auch die sogenannten FastDigestEnzyme
der
Firma
Fermentas
verwendet.
Restriktionsansätze
der
mit
Restriktionsenzymen der Firma NEB setzten sich wie folgt zusammen:
4-6 µg gereinigtes PCR- Produkt oder 10 µg Plasmid-DNA
6 µl des optimalen 10x Reaktionspuffers
0,6 µl 100x BSA
40 U Restriktionsenzym 1
40 U Restriktionsenzym 2
X µl Aqua bidest um ein Gesamtvolumen von 60 µl zu erreichen
Die Ansätze wurden für mindestens 2 h bei der vom Hersteller empfohlenen Optimaltemperatur (in der Regel 37°C) inkubiert. Für weite re Klonierungsschritte wurden die
DNA-Fragmente anschließend mit dem QIAquick PCR-Purification Kit gereinigt. Um eine
Religation linearisierter Plasmide nach der Restriktionsspaltung zu vermeiden, wurden
freie 5’-Phosphatgruppen mit Hilfe der Alkalischen Phosphatase (AP) entfernt. Hierfür
wurden zunächst ein DNA-Prämix und ein Enzym-Prämix wie folgt hergestellt:
DNA-Prämix:
5 µl Aqua bidest
Enzym-Prämix:
6 µl Aqua bidest
5 µl 10x AP-Puffer
1 µl 10x AP-Puffer
40 µl linearisiertes Plasmid
3 µl AP
Die Dephosphorylierung erfolgte 1 h bei 37°C, wobei dem DNA-Prämix alle 20 min 3 bzw.
4 µl des Enzym-Prämixes zugegeben wurden. Anschließend wurde die Alkalische
Phosphatase für 15 min bei 65°C inaktiviert.
36
Material und Methoden
Die Restriktion und Dephosphorylierung von Plasmiden mit FastDigest-Enzymen
erfolgte in einem Reaktionsansatz. Restriktionsansätze mit FastDigest-Enzymen setzten
sich wie folgt zusammen:
1 µg gereinigtes PCR-Produkt
2 µg Plasmid
3 µl 10x FastDigest Puffer
2 µl 10x FastDigest Puffer
0,5 µl FastDigest-Enzym 1
0,5 µl FastDigest-Enzym 1
0,5 µl FastDigest-Enzym 2
0,5 µl FastDigest-Enzym 2
1µl (1U) Fast-AP
X µl Aqua dest um 30 µl
Gesamtvolumen zu erreichen
X µl Aqua dest um 20 µl
Gesamtvolumen zu erreichen
Die Ansätze wurden in der Regel für 30 min bei 37°C inkubiert. Bei Ansätzen die die FastAP enthielten, wurde die Inkubation bei 37°C auf 1 h ausgedehnt, um die vollständige
Dephoshorylierung im Anschluss an die Restriktion zu sicherzustellen. Anschließend
wurden die Enzyme für 10 min bei 80°C inaktiviert. Das PCR Produkt wurde nach der
Restriktion erneut mit dem QIAquick PCR-Purification Kit gereinigt.
3.3.7
Ligation
Zueinander passende Enden von Nukleinsäuren wurden mit Hilfe der T4-DNA-Ligase
miteinander verknüpft. Ein 10 µl Ligationsansatz enthielt den Vektor und das Insert im
Verhältnis von 1:1 bis 1:3, wobei die Gesamt-DNA-Menge maximal 1 µg betrug, sowie
200 U T4-DNA-Ligase im einfach konzentrierten Ligasepuffer. Die Ligation erfolgte für
mindestens 1 h bei Raumtemperatur oder bei 16°C. Ab schließend wurde die Ligase für 10
min bei 65°C inaktiviert.
3.3.8
Hitzeschocktransformation
Mit Hilfe der Hitzeschocktransformation wurden Plasmide in kompetente E.coli-Zellen eingeschleust. Dazu wurden 100 µl-Aliquots der kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut, mit
20-100 ng Plasmid-DNA versetzt und für 20-30 min auf Eis inkubiert. Für den Hitzeschock
wurde der Transformationsansatz für 45 Sekunden bei 42°C im Wasserbad inkubiert und
anschließend für 2 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 800 µl LB-Medium, wurde der
Transformationsansatz eine Stunde bei 37°C und 200 rpm inkubiert. 200 µl des Ansatzes
wurden auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika ausplattiert. Bei Transformation eines
Ligationsansatz wurden die Bakterien mittels Zentrifugation für 1 min bei 5000 x g
pelletiert, 700 µl des Überstandes verworfen und die Bakterien in der verbleibenden
37
Material und Methoden
Flüssigkeit resuspendiert und auf die selektiven LB-Agarplatten ausplattiert. Die AgarPlatten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die T räger des rekombinanten Plasmides
wurden durch PCR oder durch Minipräparation mit anschließender Restriktionsspaltung
und Agarose-Gelelektrophorese identifiziert.
3.3.9
Subklonierung in pCR2.1®Topo Vektor
Der TopoTA-Vektor ermöglicht durch überhängende 3´-Desoxythymidin-Reste die
schnelle und einfache Subklonierung von PCR-Produkten mit
3´-Desoxyadenosin-
Überhang, welche von der Taq DNA-Polymerase am Ende jedes DNA-Strangs angefügt
wird. Für die Subklonierung der mit der PfuTurbo®DNA-Polymerase generierten KnockoutKonstrukte (siehe Abschnitt 3.3.3) mussten diese Desoxyadenosin-Reste nachträglich an
die beiden 3'-Enden des PCR-Produktes angehängt werden. Hierfür wurde ein 25 µlReaktionsansatz mit den folgenden Komponenten 15 min bei 72°C inkubiert:
2,5 µl
20-30 ng
1,25 U
1,75 mM
5 nmol
1x Reaktionspuffer
gereinigtes PCR- Produkt
AmpliTaq®DNA-Polymerase
MgCl2
dATP
Von diesem Reaktionsansatz wurden 2-4 µl für die Ligation entnommen und in einem 6
µl-Ansatz mit 1 µl des TOPO®-Vektors (10 ng/µl in Reaktionspuffer) und 1 µl der
mitgelieferten Salzlösung versetzt und für 30-45 min bei Raumtemperatur bei RT
inkubiert. Anschließend wurden 4 µl des Ligationsansatzes mittels Hitzeschock (siehe
Abschnitt 3.3.8) in kompetente E. coli transformiert und der Transformationsansatz auf
LB-Agar mit 50 µg/ml Ampicillin ausplattiert. Für die blau/weiß-Selektion von Klonen, bei
denen das PCR-Produkt in den Vektor eingebaut wurde, wurden vor dem Aufbringen der
Bakteriensuspension 40 µl 100 mM IPTG und 40 µl 4%iges X-Gal auf die Platten
aufplattiert. Nach 24-stündiger Inkubation der Agarplatten bei 37°C wurden einige weiße
Kolonien gepickt und nach Minipräparation des Plasmides (siehe Abschnitt 3.3.10) durch
PCR oder Restriktionsspaltung auf die Integration des PCR- Produkts überprüft.
3.3.10 Minipräparation von Plasmid-DNA
Für eine Plasmid-Minipräparation wurden 3 ml antibiotikahaltiges LB-Medium mit einer
Einzelkolonie des E. coli-Stamms mit dem enthaltenden Plasmid beimpft und über Nacht
bei 37°C und 220 rpm angeschüttelt. Die Übernachtku ltur wurde für 1 min bei 13.000 x g
zentrifugiert und das Bakterienpellet in 300 µl Puffer 1 resupendiert. Durch Zugabe von
38
Material und Methoden
300 µl Puffer 2 wurden die Bakterien mittels alkalischer Lyse aufgeschlossen. Nach 5
minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Lysat durch Zugabe von 350 µl
Puffer 3 neutralisert und die ausfallenden Proteine, nach 5 minütiger Inkubation auf Eis,
zweimal für 5 min bei 12.000 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde in frische
Reaktionsgefäße überführt und die Plasmid-DNA durch Zugabe von 600 µl Isopropanol,
vortexen und anschließender Zentrifugation für 12 min bei 13.000 x g ausgefällt. Das
DNA-Pellet wurde mit 500 µl 70%igem Etanol gewaschen, 5 min bei 13.000 x g
zentrifugiert und anschließend luftgetrocknet. Die gereinigte Plasmid-DNA wurde in 50 µl
Aqua bidest aufgenommen. Die DNA-Konzentration wurde über die Absorbtion bei 260
nm bestimmt.
3.4 Gezielte Mutagenese und Komplementation von B. pseudomalleiGenen
3.4.1
Herstellung und Klonierung der Knockoutkonstrukte
Die gezielte Mutagenese von BPSS1504 und bsaU erfolgte nach einer von Lopéz et al.
(Lopéz et al., 2009) veröffentlichten Methode zur Genverdrängung durch homologe
Rekombination (siehe Abb. 9). Hierfür wurden jeweils etwa 600-900 bp vor (5') und hinter
(3') dem Zielgen mittels PCR amplifiziert. Dabei wurden den beiden PCR-Produkten über
die Primer Oligonukleotidsequenzen angehängt, welche jeweils mit dem zweiten DNAFragment überlappen. In einer weiteren PCR-Reaktion wurden die zu den 3'- und 5'flankierenden Sequenzen des Zielgens homologen DNA-Fragmente über Hybridisierung
der überlappenden Überhänge kombiniert (siehe Abb. 8).
Primer
up_for
Primer
dn_for
up
Zielgen
dn
Primer
up_rev
1. PCR
Primer
dn_rev
Primer
up_for
up
dn
2. PCR
Primer
dn_rev
up
dn
Abb. 8: Schematische Darstellung der Overlap extension PCR.
In einer 1. PCR-Reaktion werden die 5´(up)- und 3´(dn)-flankierenden Sequenzen des Zielgens amplifiziert.
Dabei wird über die Primer dem 5´-Fragment eine Oligonukleotidsequenz angehängt, welche mit dem 3´Fragment überlappt und umgekehrt. In einer 2. PCR-reaktion werden die erhaltenen PCR-Produkte durch
Hybridisierung der überlappenden Sequenzen kombiniert.
39
Material und Methoden
Das resultierende Knockout-Konstrukt wurde nach Anhang eines A-Überhangs in den
Vektor pCR2.1®-Topo subkloniert (siehe 3.3.9), sequenziert und zur Vervielfältigung in E.
coli DH5α transformiert. Sowohl das BPSS1504- als auch das bsaU-Knockout-Konstrukt
wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI aus dem pCR2.1®-Topo-Vektor ausgeschnitten
und aus dem Agarosegel aufgereinigt. Anschließend erfolgte die Ligation mit dem
ebenfalls EcoRI geschnittenen und dephosphoryliertem Vektor pEX-Km5 (siehe Abb. 7).
3.4.2
Konjugation
Die das jeweilige Knockout-Konstrukt enthaltenen pEX-Km5 Vektoren wurden mittels
Konjugation in B. pseudomallei übertragen, wo sie durch homolge Rekombination in das
Genom integrierten. Hierfür wurden die Plasmide zunächst mittels Hitzschock in den E.
coli-Stamm RHO3 transformiert. Da dieser Stamm einen Defekt in der Diaminopimelinsäure (DAP)-Biosynthese besitzt, wurde der Transformationsansatz auf LB-Platten
mit 400 µg/ml DAP und 37,5 µg/ml Kanamycin zur Selektion von Transformanten
ausplattiert und für 2 d bei 37°C inkubiert. Einzel ne Klone wurden gepickt und über Nacht
in LB mit 300 µg/ml DAP und 37,5 µg/ml Kanamycin bei 37°C angeschüttelt. Gleichzeitig
wurden Übernachtkulturen von B. pseudomallei E8 in LB-Medium angezogen. Die
Übernachtkulturen wurden zu unterschiedlichen Verhältnissen gemischt, wobei jeweils zu
100 µl E8-Kultur ein größeres Volumen (200-1200 µl) der RHO3 (=Donor)-Kultur gegeben
und mit LB auf 1,5 ml aufgefüllt wurde. Alle Ansätze wurden 1 min bei 6.000 x g
zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit 1 ml 10 mM MgSO4 gewaschen.
Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das Pellet in 30 µl 10 mM
MgSO4 resuspendiert und auf Cellulose-Acetat-Membranfilter (d=13 mm, Porengröße
0,45 µm) auf eine vorgewärmte LB-Platte mit 400 µg/ml DAP getropft. Nach eintägiger
Inkubation bei 37°C wurden die Membranfilter in 1 m l LB überführt und für 30 sec bei
5000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 400 µl frischem
LB-Medium resuspendiert. 100 µl des unverdünnten Ansatzes sowie 100 µl einer 1:4
Verdünnung wurden auf LB-Agar mit 1000 µg/ml Kanamycin ausplattiert und 2 d bei 37°C
inkubiert. Entstehende Einzelkolonien wurden gepickt und auf LB-Agar mit 1000 µg/ml
Kanamycin und 50 µg/ml X-Gluc subkultiviert. Klone, die eine Blaufärbung zeigten,
wurden mittels PCR auf die Aufnahme des Knockout-Konstruktes getestet.
3.4.3
Isolation markerloser Mutanten
Klone, die das Knockout-Konstrukt enthielten, wurden in 500 µl YT-Medium angeimpft und
für 4 h bei 37°C und 140 rpm inkubiert. Anschließen d wurden 100 µl-Aliquots der Kultur
40
Material und Methoden
auf YT-Agar mit 15% Sucrose ausplattiert und für 2 d bei 37°C bebrütet. Da das sacBGen des Vektors eine Sucrosesensitivität vermittelt, können nur Bakterien wachsen, die
das pEX-Km5-Rückgrad in einem zweiten Rekombinationsereignis verloren haben.
Entstehende Einzelkolonien wurden gepickt und, nach Subkultivierung, mittels PCR
getestet ob sie das Wildtyp- oder das mutierte Allel tragen.
gusA
Kmr
sacB
ori
sceI
sceI
up
up
dn
Zielgen
dn
sceI
up
dn
sceI
sacB
Kmr
up
gusA
up
Zielgen
dn
dn
sceI
+
up
Zielgen
sceI
sacB
Kmr
gusA
dn
+ sucrose
up
dn
up
Mutiertes Allel
Zielgen
dn
Wildtyp - Allel
Modifiziert nach López et al. 2009
Abb. 9: Überblick über die Schritte der gezielten Mutagenese.
Durch homolge Rekombination integriert der Vektor in das Genom, was zur Bildung von Merodiploiden führt,
welche aufgrund des gusA-Reporergens auf X-Gluc zu blauen Kolonien heranwachsen. Durch ein zweites
Rekombinationsereignes wird der Vektor wieder aus dem Genom entfernt. Bakterien die das Vektorrückrad
mit dem sacB-Gen verloren haben lassen sich auf Sucrose selektionieren. Hierbei finden sich sowohl
Mutanten- als auch Wildtyp-Klone.
3.4.4 Komplementation der Mutanten
Für die funktionelle Komplementation der Mutanten wurden die Gene BPSS1504 oder
bsaU aus dem Genom des Wildtyps E8 amplifiziert, wobei in die Primer Schnittstellen für
41
Material und Methoden
HindIII und KpnI integriert wurden. Nach Restriktion wurde das PCR-Produkt in den
Vektor pUC18T-miniTn7T-Zeo-loxP (siehe Abb. 7) kloniert. Die in diesem Vektoren
enthaltenen Tn7mini-Transposon-elemente integrieren in bakteriellen Genomen an
definierten attTn7-Stellen, welche zumeist in neutralen Intergenregionen downstream der
für die Glutamin-6-phosphat-Sythethase kodierenden glmS-Sequenzen liegen. Das
jeweilige Zielgen wurde zwischen die beiden Tn7mini-Elemente kloniert, um eine stabile
Integration in das Genom zu ermöglichen.
Nachdem der Vektor in E. coli DH5α transformiert wurde, erfolgte die Übertragung des
Plasmids in die B. pseudomallei-Mutanten über vierparentale Paarung. Hierfür wurden
neben der zu komplementierenden Mutante als Rezipient (in LB-Medium) und dem Donor
E. coli DH5α mit dem das Zielgen enthaltenden pUC18T-miniTn7T-Zeo-Vektor (in LB mit
25 µg/ml Zeocin), die zwei Helferstämme E. coli HB101 pRK 2013 (in LB-Medium) und E.
coli DH5α pTNS3 (in LB mit 100 µg/ml Ampicillin) über Nacht in kultiviert. Zur
Vorbereitung der Konjugation wurden auf eine LBG-Agar-Platte 100 µl 2 M MgSO4
ausplattiert, sterile Cellulose-Acetat-Membranfilter aufgelegt und für 30 min bei 37°C
vorgewärmt. Zu 600 µl 10 mM MgSO4 wurden 100 µl von jeder der vier Kulturen gegeben
und die Bakteriensuspension 1 min bei 6.000 x g zentrifugiert. Nach einmaligem Waschen
mit 1 ml 10 mM MgSO4 und erneuter Zentrifugation wurde der Konjugationsansatz in 30 µl
10 mM MgSO4 resuspendiert und auf die Cellulose-Acetat-Membranfilter aufgetropft.
Hierauf folgte eine Inkubation für 8 h bei 37°C. An schließend wurden die Membranfilter
steril in 1 ml 10 mM MgSO4 überführt und die Bakterien für 30 sec bei 5.000 x g herunter
zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 500 µl 10 mM MgSO4 resuspendiert und 200 µl
der Suspension wurden auf LBG-Agar mit 3000 µg/ml Zeocin und 15 µg/ml Polymyxin B
ausplattiert. Die Platten wurden für 2 d bei 37°C i nkubiert und die entsehenden
Einzelkolonien nach Subkultivierung, mittels PCR auf die Integration des Zielgens
untersucht.
3.5 Mäuse
3.5.1
Rechtliche Grundlagen
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Arbeiten an Mäusen wurden im Rahmen
des Versuchstiervorhabens 7221.3-1.1-020/11 genehmigt. Vor Beginn der Tierversuche
wurde eine entsprechende Bescheinigung in der Abteilung für Versuchstierkunde der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald erworben. Der Lehrumfang entsprach den
Weiterbildungsempfehlungen für tierexperimentell tätiges Personal der FELASA-Kategorie
B.
42
Material und Methoden
3.5.2
Mausstämme
Tabelle 3: Liste der verwendeten Mausstämme.
Bezeichnung
Beschreibung
Quelle
BALB/cAnCrl
Albino-Inzuchtmausstamm
Charles River Laboratories (Sulzfeld,
Deutschland)
C57BL/6J
Inzuchtmausstamm
(Jackson Laboratory)
Institut für Versuchstierkunde (Greifswald,
Deutschland)
Caspase1-/-
Caspase-1 knockout-Stamm mit
C57BL/6J-Hintergrund
Institut für Versuchstierkunde (Greifswald,
Deutschland)
Die Mäuse wurden in Käfigen zu Kollektiven von maximal zehn Mäusen gehalten. Sie
erhielten als Futter Nagerpellets (Sniff) und Wasser ad libitum.
3.6 In vivo Versuche
3.6.1 Narkotisierung der Mäuse
Ketamin-Rompun-Gemisch
50 µl Rompun 2%
100 µl Ketamin
in 1 ml sterilem PBS
Pro Maus wurde für eine kurze Narkose 100 µl intraperitoneal gespritzt.
3.6.2
Intranasale Infektion mit B. pseudomallei
Für die Charakterisierung der Virulenz der Mutanten Mausmodell wurden weibliche
BALB/c Mäuse im Alter von mindestens 8 Wochen verwendet. Die Bakterien wurden von
Columbia Blutagar über die Optische Dichte bei 650 nm in PBS auf die gewünschte Dosis
pro 30 µl zu applizierendes Volumen eingestellt. Die Tiere wurden zunächst mit einem
Ketamin-Rompun-Gemisch anästhesiert und anschließend mit 30 µl eingestellter
Bakteriensuspension intranasal infiziert. Die Dosis-Bestimmung erfolgte auf Müller-HintonAgar.
3.6.3
Bestimmung der Keimzahl in Leber, Lunge und Milz nach Infektion
Um die Bakterienlast in den Organen infizierter Tiere zu bestimmen, wurden diese 48 h
nach Infektion euthanasiert, Leber, Milz und Lunge entnommen und in 1% Tergitol/ 0,5%
BSA mit dem UltraTurrax homogenisiert. Dabei wurden für Lunge und Milz 0,5 ml und für
die Leber 1 ml Tergitol/ BSA eingesetzt. Die CFU-Bestimmung der Organsuspensionen
43
Material und Methoden
erfolgte auf Ashdown-Selektionsagarplatten, welche für 2-3 Tage bei 37°C inkubiert
wurden. Zur Anreicherung der Bakterien wurden 100 µl der Suspension in 3 ml LBMedium überführt, für 72 h bei 37°C und 140 rpm beb rüted und anschließend 100 µl der
Anreicherungskultur auf Ashdownagar ausplattiert.
3.7 Primäre murine Knochenmarkmakrophagen
Zur Gewinnung von Knochenmarkstammzellen wurden Mäuse im Alter von 10 bis 18
Wochen verwendet. Die durch zervikale Dislokation getöteten Mäuse wurden auf dem
Rücken
liegend
auf
einer
Präparierunterlage
an
den
Vorderläufen
und
dem
Schwanzansatz fixiert und der untere Bauchbereich sowie die hinteren Extremitäten mit
Alkohol desinfiziert. Darauf folgend wurde die Haut über den Hinterläufen entfernt und
sowohl die Femora als auch die Tibiae und Fibulae entnommen. Das Muskelgewebe
wurde mit Hilfe eines Skalpells von den Knochen entfernt, wobei die Fibula jeweils
verworfen wurde. Anschließend wurden die gesäuberten Knochen für mindestens 5 min in
96%-igem Ethanol und anschließend für 5 min in sterilem PBS inkubiert. Durch
Abtrennung geringer Teile an den Knochenenden wurde die Knochenmarkhöhle geöffnet
und das Knochenmark mittels einer Spritze mit 5 ml PBS in eine Petrischale ausgespült.
Die Knochenmarksuspension wurde in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und für 15
min bei 450 x g und 4°C zentrifugiert. Das Zellpell et wurde anschließend in BMM-Medium
(RPMI 1640 mit 5% Panexin®BMM und 50 µM β-Mercatoethanol) mit 2 ng/ml rmGM-CSF
resuspendiert und auf drei 75 mm2 Zellkulturflaschen pro Maus mit einem Endvolumen
von 20 ml pro Zellkulturflasche verteilt. Die Kultivierung und Differenzierung der murinen
Knochenmarkstammzellen zu Makrophagen erfolgte über einen Zeitraum von zehn Tagen
bei 37°C und 5% CO 2. Am 5. sowie am 7. Tag des Differenzierungsprozesses wurden 10
ml des verbrauchten Zellkulturmediums abgenommen und durch 10 ml frisches Medium
ersetzt.
Am 10. Tag nach der Präparation des Knochenmarks wurden die zu Makrophagen
differenzierten Zellen ausgesät. Dafür wurde zunächst das Medium vollständig entfernt,
die Zellen einmal mit 10 ml PBS pro Zellkulturflasche gewaschen und anschließend mit 1
ml 1x Trypsin-EDTA für 10 min bei 37°C und 5% CO 2 inkubiert. Nach Zugabe von 5 ml
BMM-Medium pro Zellkulturflasche wurden die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers vom
Flaschenboden abgelöst. Die Zellsuspension wurde in ein 50 ml Falcon-Röhrchen
überführt und anschließend verbleibende Zellen mit 2 ml Medium pro Flasche ausgespült
und in dasselbe Falcon-Röhrchen hinzugefügt. Nach Zentrifugation für 12 min bei 450 x g
und 4°C wurde der Überstand vorsichtig abgenommen u nd das aus drei Zellkulturflaschen
44
Material und Methoden
erhaltene Zellpellet in 3 ml BMM-Medium resuspendiert. Die Zellzahl wurde mittels einer
Neubauer-Zählkammer wie unter Abschnitt 3.8.2 beschrieben bestimmt.
3.8 Zelllinien
3.8.1 Zelllinien und ihre Kultivierung
Folgende Zelllinien wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet und in den angegebenen
Medien kultiviert:
Tabelle 4: Liste der verwendeten Zelllinien und deren Kulturmedien.
Bezeichnung
Beschreibung
Quelle
Kultivierung
A549
humane epitheliale
Lungenkarzinomzelllinie
ATCC
F-12K mit 10% FCS
RAW264.7
murine makrophagenähnliche
Leukämiezelllinie
ATCC
DMEM+GluaMAX mit
4%Panexin
HepG2
hepatozelluläre Karzinomzelllinie
DSMZ
RPMI1640 mit
10%FCS
Alle Zelllinien wurden bei 37°C, 5% CO 2 inkubiert und in der Regel zweimal wöchentlich
passagiert. Hierfür wurde das verbrauchte Medium von den Zellen abgenommen und
verworfen. A549-Zellen wurden, nach einmaligem Waschen mit 10 ml PBS, zur
Vereinzelung mit 1,5 ml 1x Trypsin-EDTA für 5 min bei 37°C behandelt. Anschließend
wurden 11 ml frisches Medium zugegeben und die Zellen gründlich resuspendiert. Zur
Passage von RAW246.7-Zellen wurden, nach Entfernen des verbrauchten Mediums 10 ml
frisches Medium auf die Zellschicht gegeben und die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers
vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst und gründlich resuspendiert. Standardmäßig
wurde 1 ml der Suspension in eine neue Zellkulturflasche mit 19 ml frischem
Kulturmedium gegeben. Spätestens nach 40 Passagen wurden die Zellen verworfen.
3.8.2 Aussaat der Zellen
Zum Aussähen der Zellen wurde die Zellzahl durch Zählung in der Neubauer-Zählkammer
bestimmt. Hierfür wurden die Zellen zur Anfärbung 1:2 mit Tryptanblau verdünnt und nur
vitale Zellen, die den blauen Farbstoff nicht aufgenommen hatten, gezählt. Die Zellzahl
berechnet sich aus folgender Formel:
Zellzahl pro ml =
gezählteZellen ∗ Verdünnungsfaktor (2 ) ∗ 10.000
Anzahl der ausgezählten Quadranten
45
Material und Methoden
In Abhängigkeit von der anzuwendenden Methode wurden die Zellen auf die gewünschte
Zellzahl pro ml verdünnt und in die entsprechenden Zellkulturplatten ausgesät.
3.8.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zum Einfrieren wurden die Zellen einer konfluenten Zellkulturflasche geerntet und nach
Zentrifugation für 10 min bei 450 x g in dem für die jeweilige Zelllinie geeignetem Medium,
welches mit 10% DMSO versetzt wurde aufgenommen. Aliquots wurden zunächst über
Nacht bei -70°C eingefroren und anschließend in flü ssigem Stickstoff aufbewahrt. Das
Auftauen eines Aliquot erfolgte bei 37°C. Unmittelb ar danach wurden die Zellen in eine
Zellkulturflasche mit geeignetem Medium überführt.
3.9 Zellbasierte Infektionsversuche
3.9.1 Puffer und Lösungen für Zellbasierte Assays
10x PBS:
2 M NaCl
25 mM KCl
80 mM Na2PO4
15 mM KH2PO4
Immunfluoreszenzpuffer:
0,2% BSA
0,05% Saponin
0,1% Natriumazid
in PBS pH 7,4 (mit HCl einstellen)
Tergitiol/BSA:
1% Tergitol
0,5% BSA
in PBS
3.9.2 Einstellen der Infektionsdosis
Am Tag vor den Infektionsexperimenten wurden die gewünschte B. pseudomalleiStämme auf eine Blutplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C kultiviert. Um die
Infektionsdosis für Zellen (MOI: multiplicity of infection) einzustellen wurden mehrere
Kolonien des jeweiligen Stamms mit einem sterilen Wattestäbchen von der Platte
aufgenommen
und
in
10
ml
PBS
gelöst.
Nach
gutem
Durchmischen
der
Bakteriensuspension wurde deren OD650 bestimmt und anhand einer Eichgerade die
Anzahl der Bakterien pro ml Bakteriensuspension ermittelt. Das benötigte Volumen der
46
Material und Methoden
Bakteriensuspension
wurde
berechnet
und
dem
benötigten
Volumen
des
Zellkulturmediums zugefügt. Die Art des verwendeten Mediums richtete sich dabei nach
der zu infizierenden Zelllinie. Für Dosikontrolle wurde eine 1:10 Verdünnungsreihe
hergestellt und jeweils 2x 100 µl von zwei bis drei geeigneten Verdünnungsstufen auf
Müller-Hinton-Agarplatten ausplattiert. Nach zweitägiger Inkubation bei 37°C wurden
diese ausgezählt und die Infektionsdosis berechnet.
3.9.3
Invasions-und Replikationsassay
Beim Invasions- und Replikationsassay wurden die intrazellulären Keimzahlen (CFU:
colony forming units) zu bestimmten Zeitpunkten nach Infektion mit B. pseudomallei
bestimmt. Für diesen Assay wurden 48-Well-Zellkulturplatten verwendet. Pro Zeitpunkt
wurden Dreifachwerte bestimmt. Am Tag vor der Infektion wurden die zu untersuchenden
B. pseudomallei-Stämme auf Blutplatte ausgestrichen und die Zellen wie folgt in 400 µl
des entsprechenden Kulturmedium pro Well ausgesät:
A549-Zellen
45.000 Zellen/Well
RAW264.7-Zellen
90.000 Zellen/Well
BMM
150.000 Zellen/Well
Das Einstellen der Infektionsdosis erfolgte wie unter 3.9.2 beschrieben. Zur Infektion
wurde zunächst das Kulturmedium von den Zellen abgenommen, die Zellen einmal mit
PBS gewaschen und je 400 µl Infektionsmedium in die Kammern gegeben. Die Infektion
von RAW264.7-Zellen und BMMs erfolgte für 30 min und die von A549-Zellen für 1 h bei
37°C und 5% CO 2. Danach wurde das Infektionsmedium abgenommen, die Zellen
zweimal mit PBS gewaschen und 400 µl kanamycinhaltiges Medium in jedes Well
gegeben. Die Kanamycin-Konzentration betrug 250 µg/ml wenn das Medium FCS enthielt
(A549-Zellen) und 125 µg/ml bei Panexin-haltigem Medium (RAW264.7-Zellen und
BMMs). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurde das Medium
abgenommen, die Zellen dreimal mit 400 µl PBS pro Well gewaschen und 150 µl
Tergitol/BSA auf die Zellen gegeben. Es folgte eine Inkubation für mindestens 10 min bei
37°C und 5% CO 2, wobei die Membran der Eukaryotenzellen durch das Tergitol lysiert
wurde. Nach dem Abschaben der lysierten Zellen vom Boden der Zellkulturplatte und
gutem Resuspendieren, wurden 100 µl des Lysats für die Herstellung einer 1:10
Verdünnungsreihe eingesetzt. Für die Bestimmung der intrazellulären Keimzahlen wurden
für jedes Well je zweimal 100 µl verschiedener, angemessener Verdünnungsstufen auf
Müller-Hinton-Agar ausplattiert.
47
Material und Methoden
Nachdem die Agarplatten für 2 d bei 37°C bebrütet w urden, wurden die Kolonien
ausgezählt und die entsprechende intrazelluläre CFU pro well berechnet.
3.9.4
Induktion von Riesenzellbildung durch B. pseudomallei
Zur Beobachtung der durch B. pseudomallei induzierten Bildung von mehrkernigen
Riesenzellen, wurden RAW264.7-Zellen in 8-well-Chamberslides ausgesät und infiziert.
Alle Infektionsansätze wurden als Duplikate angefertigt. Nach der Aussaat von 45.000
RAW267.4-Zellen in 200 µl Medium pro Kammer, wurden diese für 24 h bei 37°C und 5%
CO2 inkubiert. Die Zellen wurden mit den interessierenden B. pseudomallei-Stämmen mit
einer MOI von 2 für 30 min bei 37°C und 5% CO 2 infiziert. Anschließend wurde das
Infektionsmedium abgenommen, die Zellen zweimal mit 200 µl PBS gewaschen und 200
µl RAW267.4-Medium mit 125 µg/ml Kanamycin in jede Kammer gegeben. Hierauf folgte
eine Inkubation für weitere 16 h bei 37°C und 5% CO 2. Danach wurde das Medium von
den Zellen abgenommen und diese, nach dreimaligem Waschen mit 200 µl PBS,
luftgetrocknet und mit 150 µl 100%igem Methanol pro Kammer für 15 min fixiert.
Nachfolgend wurde der Rand des Chamberslides entfernt und die Präparate durch 20
minütige Inkubation in GIEMSA-Lösung angfärbt. Anschließend wurden diese mit Aqua
bidest gespült, getrocknet und im Hellfeld mikrokopiert. Zur Quantifizierung der
Riesenzellbildung wurde pro Infektionsansatz die Verteilung der Zellkerne in drei
Gesichtsfeldern mit insgesamt 700-900 Zellkernen ausgezählt.
3.9.5
Immunfluoreszenzfärbungen intrazellulärer Bakterien
Für die Darstellung von intrazellulären B. pseudomallei und den durch das Bakterium
induzierten Aktinpolymerisationen wurden das B. ps. Exopolysaccharid (EPS) sowie das
β-Aktin infizierter HepG2-Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt. Alle Ansätze
wurden als Duplikate angefertigt. Am Tag vor der Infektion wurden in 24-WellZellkulturplatten pro Well 200.000 HepG2-Zellen in 1 ml Kulturmedium auf runden Deckgläschen (ø 13mm) ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die
Infektion mit B. pseudomallei erfolgte mit einer Infektiondosis mit einer MOI von 100,
wofür nach dem Austausch des Kulturmediums gegen das Infektionsmedium, die
Bakterien bei 120 x g für 4 min auf die Zellen aufzentrifugiert und die Platten
anschließend für 30 min bei 37°C und 5% CO 2 inkubiert wurden. Danach wurde das
Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, und 1 ml Medium mit
250 µg/ml Kanamycin in jedes Well gegeben. Nach einer Inkubation für weitere 8 h oder
16 h wurde zu jedem Infektionsansatz 1 µl Hoechst- Fluoreszenzfarbstoff (c = 1mg/ml) in
48
Material und Methoden
das Medium gegeben und die Platte für 10 min in den 5% CO2-Brutschrank
zurückgestellt. Anschließend wurde das Medium abgenommen, die Zellen einmal mit
kaltem PBS gewaschen und mit Methanol für 10 min bei -20°C fixiert. Nach dreimaligem
Waschen der Zellen mit Immunfluoreszenz (IF)- Puffer, wurden unspezifische
Bindestellen durch einstündige Inkubation mit IF-Puffer in einer feuchten Kammer
geblockt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit den wie in Tabelle 5 angegeben
verdünnten Primärantikörpern über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer. Nachdem
ungebundene Primärantikörper durch dreimaliges Waschen für 5 min in IF-Puffer entfernt
wurden, folgte die Inkubation mit den Sekundärantikörpern, wie in Tabelle 5 angegeben,
für eine Stunde bei Raumtemperatur. Erneut wurden die Zellen dreimal für 5 min mit IFPuffer gewaschen. Anschließend wurden die Präparate mit einem Tropfen Fluoprep auf
Objektträger eingedeckt und im Fluoreszenzmikrokop BZ-9000 betrachtet.
Tabelle 5: Einsatz der Primär- und Sekundärantikörper für die Immunfuoreszenzfärbung von B. ps.
infizierten Zellen.
Primärantikörper
Verdünnung
Sekundärantikörper
Verdünnung
Anti- B. pseudomalleiEPS 3015 IgGγ2b
1:2.000
Alexa Fluor® 488 antiMaus IgG2b
1:800
Anti- LAMP-1γ1
1:400
Alexa Fluor® 568 antiMaus IgG1
1:800
Anti- B. pseudomalleiEPS 3015 IgGγ2b
1:2.000
Alexa Fluor® 488 antiMaus IgG2b
1:800
Anti-Beta-Aktin
1:100
3.9.6
in IF-Puffer
in IF-Puffer
TM
Anti-rabbit Cy 3
in IF-Puffer
in IF-Puffer
1:400
Echtzeit-Zellstatusanalyse mittels xCELLigence
Der Real-Time Cell Analyzer (RTCA) von Roche, auch als xCELLigence-System
bezeichnet, ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung zellulärer Ereignisse über die
Messung des Wechselstromwiderstands (Impedanz) als Funktion der Zeit. Hierfür werden
spezielle 96-Well-Zellkulturplatten (e-plates) mit im Boden der Wells integrierten GoldMikroelektroden genutzt. Die Impedanz steigt in Abhängigkeit von der Zahl der auf den
Elektroden befindlichen Zellen und der Stärke ihrer Adhäsion und gibt dadurch Aufschluss
über den Zellstaus. Diese relative Veränderung der gemessenen Impedanz wird als
Zellindex (CI: cell index) angegeben und berechnet sich nach folgender Formel:
CI =
Zi − Z0
15
49
Material und Methoden
Dabei ist Zi die individuelle Impedanz zu einem bestimmten Zeitpunkt und Z0 die
Impedanz in Abwesenheit von Zellen. Eine Veränderung des Zellindex repräsentiert somit
eine veränderte Zellzahl, Viabilität, Morphologie, und Adhäsion der Zellen.
Zu Versuchsbeginn wurde zunächst eine Hintergrundmessung durchgeführt, wofür in
jedes Well der 96-Well-E-Platte 75 µl Zellkulturmedium pipettiert wurden. Zwischenräume
der Wells wurden mit PBS gefüllt. Im Anschluss erfolgte die Aussaat der Zellen durch
Zugabe von 75 µl der auf die gewünschte Zellzahl von 4.000 A549- oder 20.000
RAW264.7-Zellen pro Well eingestellte Zellsuspension. Für die Mediumkontrolle wurden
weitere 75 µl des zellfreien Mediums in die entsprechenden Wells zugegeben. Um eine
stabile Messung zu ermöglichen, wurde die 96-Well-E-Platte 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert, bevor sie in die RTCA-Station gestellt und bei 37°C und 5% CO 2 bebrütet
wurde. Nach 24 h erfolgte die Infektion der Zellen für 30 min bei 37°C und 5% CO 2. Nach
der Infektion wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und 150 µl kanamycinhaltiges
Medium (A549: 250 µg/ml, RAW264.7: 125 µg/ml) in jedes well gegeben. Die
Aufzeichnung des Zellindex erfolgte über etwa 160 Stunden unter Inkubation bei 37°C
und 5% CO2. Alle Ansätze wurden als Quadruplikate durchgeführt. Zur Auswertung und
graphischen Darstellung wurde die RTCA-Software 1.2.1 verwendet. Um den Einfluss der
B. pseudomallei-Infektion auf die Zellen optimal darzustellen wurde der normalisierte
Zellindex gewählt, wobei alle Kammern zum Zeitpunkt der Infektion auf den Wert 1
normalisiert wurden.
3.9.7
LDH-Assay
Um die zytotoxische Wirkung von B. pseudomallei zu quantifizieren, wurde der CytoToxONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay eingesetzt. Dieser beruht auf der
Messung der Aktivität des bei der Zellzerstörung freigesetzten Enzyms LDH (LactatDehydrogenase), welches Lactat und NAD+ zu Pyruvat und NADH umwandelt.
In
Anwesenheit des Enzyms Diaphorase reduziert das durch die LDH-Reaktion entstandene
NADH das Substrat Resazurin zum Fluoreszenzfarbstoff Resorufin. Das CytoTox-ONE™
Reagent beinhaltet Lactat, NAD+, Resazurin und das Enzym Diaphorase.
In dieser Arbeit wurden als Zielzellen für den Zytotoxizitäts-Assay Knochenmarkmakrophagen (BMM) aus Caspase1-/- Mäusen eingesetzt. Der Assay wurde in 96-WellZellkulturplatten durchgeführt, wobei alle Infektionsansätze als Triplikate angefertigt
wurden.
Als
Hintergrundkontrolle
wurden
nicht
infizierte
BMM
mitgeführt. Als
Maximalwertkontrolle dienten Zellen, die durch Zugabe einer Lysislösung vollständig
lysiert wurden.
Nach dem Ernten der Makrophagen wurden diese zu je 30.000 Zellen in 100 µl
50
Material und Methoden
Medium in die Wells der Zellkulturplatte ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO 2
inkubiert. Für die Infektion wurde, nach Einstellen der gewünschten MOI, das Medium
von den Zellen abgenommen, diese einmal mit PBS gewaschen und 100 µl des
Infektionsmediums in die vorgesehenen Wells gegeben. Nach 30 minütiger Inkubation
bei 37°C und 5% CO 2 wurde das Medium erneut abgenommen, die Zellen zweimal mit
PBS gewaschen und 100 µl BMM-Medium mit 125 µg/µl Kanamycin auf die Zellen
gegeben. Die Platten wurden erneut bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und 10 min bevor die
LDH-Freisetzung bestimmt werden sollte 3 µl Lysis-Lösung in die für den Maximalwert
vorgesehenen Wells gegeben. Nach Inkubation für weitere 10 min im CO2- Brutschrank,
wurden aus jedem Ansatz 50 µl des Überstandes in 8-Well-Streifen übertragen und mit
50
µl
CytoTox-OneTMReagent
vermischt.
Die
Reaktionsansätze
wurden,
vor
Lichteinwirkung geschützt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion
anschließend durch Zugabe von 25 µl Stop-Lösung abgebrochen. Die Riegel wurden bis
zur Messung bei -20°C eingefroren. Die Messung erfo lgte am Tecan-Plattenphotometer
bei einer Extitationswellenlänge von 560 nm und einer Emissionswellenlängenvon 590
nm.
3.9.8 Untersuchung der Caspase-Aktivierung nach B. pseudomalleiInfektion
Um die Aktivierung von Caspasen durch B. pseudomallei-Mutanten im Vergleich zum
Wildtyp zu untersuchen, wurden primäre Knochenmarkmakophagen (BMM) mit den
entsprechenden Stämmen infiziert, wobei alle Infektionsansätze als Duplikate angefertigt
wurden. Nach Ernten der BMM wurden in 6-well-Zellkulturplatten 600.000 Zellen pro Well
in einem Arbeitsvolumen von 3 ml ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO 2
inkubiert. Die Infektion erfolgte mit einer MOI von 50 für 30 min bei 37°C und 5% CO 2.
Danach wurde das Infektionsmedium von den Zellen abgenommen, die Zellen zweimal
mit PBS gewaschen und 2,5 ml Medium mit 125 µg/ml Kanamycin in jedes Well gegeben.
Die Platten wurden für weitere 3 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Zum Ernten der
Proteine wurde erneut das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit PBS
gewaschen und pro well 500 µl Trizol auf die Zellen gegeben. Nach 5 minütiger Inkubation
bei Raumtemperatur, wurden die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der
Kulturschale abgelöst und das Lysat nach mehrmaligem auf- und abpipettieren in sterile
2-ml-Safelock-Reagiergefäße überführt. Das Lysat wurde bis zur weiteren Verwendung
bei -20°C gelagert. Die Aufreinigung der Proteine erfolgte wie unter Abschnitt 3.10.2
beschrieben. Die Aktivierung von Caspasen wurden mittels Western-Blot-Analyse (siehe
Abschnitt 3.10.6) mit den entsprechenden Antikörpern untersucht.
51
Material und Methoden
3.10 Arbeiten mit Proteinen
3.10.1 Puffer und Lösungen für das Arbeiten mit Proteinen
0,3 M Guanidinum-HCl
in 96% Ethanol gelöst
2D-Lysispuffer:
8 M Harnstoff
2 M Thioharnstoff
65 mM CHAPS
0,13 M DTT
80 mM Tris
Lagerung bei -70°C
Bradford-Reagenz:
0,121 mM Coomassie Brillant blue G-250
5% Ethanol
8,5% Phoshorsäure
Lagerung lichtgeschützt bei RT
Trenngelpuffer:
1,5M Tris/HCl pH 8,8
Sammelgelpuffer:
0,5M Tris/HCl pH 6,5-6,9
Laufpuffer:
25 mM Tris/HCl pH 8,3
0,2 M Glycin
0,1% SDS
Proteinprobenpuffer (4x):
2 ml Sammelgelpuffer
1,8 ml Glycerol
3,6 ml 10% SDS
770 µl 1 M DTT
1 Spatelspitzel Bromphenolblau
Anodenpuffer I:
0,3M Tris; pH 10,4
20% Methanol
Anodenpuffer II:
25mM Tris; pH 10,4
20% Methanol
Kathodenpuffer:
40 mM ε-Aminocapronsäure
20% Methanol
10xTBS:
0,2 M Tris/HCl; pH 7,6
1,4 M NaCl
52
Material und Methoden
TBST:
1xTBS
0,1% Tween 20
TBST-BSA:
TBST mit 5% BSA
Ponceau S – Färbelösung:
2,8 mM Ponceau S
0,2 M Trichloressigsäure
3.10.2 Proteinpräparation mit TRIZOL
Zur Gewinnung der Proteine, wurden eukaryotische Zellen oder Bakterien mit Trizol für
mindestens 5 min lysiert. Durch Zugabe von 50 µl 1-Bromo-3-Chloropropan pro 500 µl
Trizollysat und gründlichem Vermischen, gefolgt von einer 5 minütigen Inkubation bei
Raumtemperatur und einer 15 minütigen Zentrifugation bei 12.000 x g und 4°C, erfolgte
eine Auftrennung des Lysates in drei Phasen. Dabei befinden sich die Proteine in der
unteren organischen Phase. Um die Proteine zu isolieren, wurde zunächst die obere
wässrige RNA-Phase abpipettiert. Anschließend wurde die DNA durch Zugabe von 150 µl
99%igem Ethanol pro 500 µl Trizollysat, mehrmaliges invertieren und einer darauf
folgenden Inkubation für 2-3 min bei Raumtemperatur, sowie einer 5 minütigen
Zentrifugation bei 2.000 x g und 4°C gefällt. Der d ie Proteine enthaltene Überstand wurde
in frische 2 ml- Reaktionsgefäße überführt. Durch Zugabe von 750 µl Isopropanol gefolgt
von einer Inkubation für mindestens 10 min bei Raumtemperatur und einer nachfolgenden
Zentrifugation für 10 min bei 12.000 x g und 4°C, w urden die Proteine ausgefällt. Der
Überstand wurde verworfen und das Proteinpellet dreimal für mindestens 20 min mit 1 ml
0,3 M Guanidinium-HCl und einmal für mindestens 20 min mit 1 ml 99% Ethanol auf dem
Rollinkubator gewaschen. Anschließend wurde das Proteinpellet vakuumgetrocknen und
je nach Pelletgröße in 100-200 µl 2D-Lysispuffer gelöst.
3.10.3 Aufreinigung von extrazellulären Proteinen
Um die von B. pseudomallei sezernierten Proteine zu gewinnen, wurden zunächst die
jeweiligen Stämme aus Übernachtkulturen in 50-100 µl LB-Medium auf eine OD650 von
0,025 (Analyse der Hcp1-Sekretion) oder 0,01 (Analyse der BipD- und BopE-Sekretion)
eingestellt und bei 140 rpm und 37°C kultiviert. Na ch Wachstum für 6 h bzw. 8 h wurden
je Stamm 100 ml Kultur, nach 24 h und 32 h jeweils 50 ml Kultur in 50-ml-Falcons
überführt und pro 50 ml Kultur eine Tablette complete-Mini Proteinaseinhibitorcocktail
gelöst. Anschließend wurden die Kulturen für 10 min bei 4°C und 15.000 x g zentrifugiert
und der Kulturüberstand durch einen Spritzenvorsatzfilter (Porengröße: 0,45 µm) in
53
Material und Methoden
frische Falcons sterilfiltriert. Darauf folgte die Fällung der extrazellulären Proteine durch
Zugabe von 10% Trichloressigsäure zum Kulturüberstand, gefolgt von einer Inkubation für
mindestens 15 h bei 4°C. Die ausgefallen Proteine w urden für 1 h bei 4°C und 15.000 x g
pelletiert, der Überstand verworfen und das Proteinpellet viermal mit 99%igem Ethanol
und zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen, wobei auf jeden Waschschritt eine 30
minütige Zentrifugation bei 4°C und 12.800 x g folg te. Im Anschluss wurde das ProteinPellet luftgetrocknet und in 50-150 µl 8 M Harnstoff/ 2 M Thioharnstoff resuspendiert. Die
Lagerung bis zur weiteren Verwendung erfolgte bei -20°C.
3.10.4 Proteinmengenbestimmung nach Bradford
Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes einer Lösung erfolgte kolorimetrisch mit der
Bradford-Methode. Diese beruht auf einer Änderung des Absorptionsmaximums des
Farbstoffs Coomassie brilliant blue G-250 bei der Komplexbildung mit Proteinen von 465
nm auf 595 nm. Für die Messung wurden die Proteinproben 1:50 in einem Volumen von
100 µl verdünnt und mit 1,9 ml Bradford-Reagenz versetzt. Nach mindestens 5 minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur, spätestens aber 30 min nach Zugabe des BradfordReagenz, wurde die Extinktion bei 595 nm gegen 1,9 ml Bradford-Reagenz mit 100 µl
Aqua bidest als Leerwert gemessen. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der
Proben wurde eine Eichkurve mit 1-20 µg BSA als Standard mitgeführt.
3.10.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die
Auftrennung
der
Proteine
nach
ihrem
Molekulargewicht
erfolgte
mittels
diskontinuierlicher SDS-PAGE. Hierzu wurden 40-50 µg Protein in einem Gesamtvolumen von 20-28 µl mit dem entsprechenden Volumen 4x Proteinprobenpuffer versetzt
und auf ein 12%iges oder 13,5%iges Polyacrylamidgel (siehe Tabelle 6) geladen. Zur
näherungsweisen Bestimmung des Molekulargewichtes wurden bei jeder Elektrophorese
5 µl eines vorgefärbten Proteinmarkers mitgeführt.
Tabelle 6: Zusammensetzung der Verwendeten Polyacrylamidgele.
Trenngel 12%
Trenngel 13,5%
Sammelgel
Acrylamid (30%)
1,65 ml
1,25 ml
Trenngelpuffer
2 ml
1,4 ml
1,25 ml
Trenngelpuffer
2,25 ml
1,4 ml
0,25 ml
Sammelgelpuffer
0,8ml
SDS (10%)
50 µl
50 µl
25 µl
APS (10%)
50 µl
50 µl
25 µl
TEMED
5 µl
5 µl
2,5 µl
Aqua dest
Puffer
54
Material und Methoden
Die Gelelektrophorese wurde zunächst für 15 min bei einer Spannung von 120 V und
folgend für 100 min bei 160 V in 1x SDS-PAGE-Laufpuffer durchgeführt.
3.10.6 Western-Blot
Nach der Auftrennung in der SDS-PAGE, konnten die Proteine mittels eines SemidryElektroblot bei einer Stromstärke von 1 mA pro cm2 Gelfläche für 1 h auf eine
Nitrocellulosemembran transferiert werden. Hierfür wurden zunächst drei Lagen
Whatman-Filterpapier und das SDS-Gel in Kathodenpuffer, eine Lage WhatmanFilterpapier und die Nitrocellulosemembran in Anodenpuffer II sowie zwei Lagen
Whatman-Filterpapier in Anodenpuffer I äquilibriert. Eine Bloteinheit wurde wie folgt
geschichtet und Luftblasen zwischen den Lagen durch Ausrollen entfernt.
(-) Kathode
3x Whatman-Filterpapier
Kathodenpuffer
Gel
Kathodenpuffer
Nitrocellulosemembran
Anodenpuffer II
1x Whatman-Filterpapier
Anodenpuffer II
2x Whatman-Filterpapier
Anodenpuffer I
(+) Anode
Nach dem Blotten konnte die Transfereffizienz durch Färbung der Proteine auf der
Membran mit Ponceau S-Lösung überprüft werden, worauf eine Entfärbung mit Aqua
bidest und 1x TBS folgte. Anschließend wurde die Membran zur Blockierung
unspezifischer Bindungsstellen mindestens 1 h in 1x Roti®-Block geschwenkt. Zum
Nachweis der spezifischen Proteine wurde die Membran dem entsprechenden
Primärantikörper, wie in Tabelle 7 angegeben, inkubiert.
Tabelle 7: Einsatz verschiedener Primärantikörper im Western-Blot.
Antikörper
Verdünnung
Inkubation
®
Murine Caspase-1
1:500 in 1x Roti -Block
1h bei Raumtemperatur
Caspase-7 und
Cleaved Caspase-7
Caspase-8
1:1000 und
1:500 in TBST-BSA
1:1000 in TBST-BSA
über Nacht bei 4°C
Murine Caspase-9 und
cleaved murineCaspase-9
GAPDH
1:1000 und
1:500 in TBST-BSA
1:10000 in TBST-BSA
über Nacht bei 4°C
BipD
1:2000 in TBST-BSA
über Nacht bei 4°C
BopE
1:2000 in TBST-BSA
über Nacht bei 4°C
Hcp1
1:15000 in 1x Roti -Block
®
über Nacht bei 4°C
über Nacht bei 4°C
über Nacht bei 4°C
55
Material und Methoden
Die ungebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit TBST für 5 min
entfernt. Anschließend wurde die Membran für mindestens 1 h bei Raumtemperatur mit
dem
Peroxidase-gekoppelten
Sekundärantikörper
inkubiert,
wobei
der
α-mouse-
Antikörper 1:5.000 und der α-rabbit-Antikörper 1:7.000 in 1x Roti®-Block verdünnt
eingesetzt wurde. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit TBST für je 5 min, wurde die
Membran für 2-3 min mit einem LumiGloTM/Perioxide-Gemisch inkubiert. Die bei der
enzymatischen
Spaltung
des
Reagenz
durch
die
Peroxidase
entstehende
Chemolumineszenz konnte an der Fusion FX Geldokumentations-Einheit detektiert
werden.
3.11 mRNA-Expressionsanalysen
3.11.1 Gewinnung von RNA
Für die Analyse der bakteriellen Genexpression nach der Infektion von Makrophagen,
wurden RAW264.7- Zellen in 6-Well-Zellkulturplatten mit B. pseudomallei infiziert, wobei
für jeden Zeitpunkt von allen Infektionsansätzen Duplikate angefertigt wurden. Am Tag vor
der Infektion wurden pro Well 650.000 Zellen in 2,5 ml RAW264.7-Medium ausgesät und
über Nacht bei 37°C und 5% CO 2 inkubiert. Die Infektion erfolgte mit einer MOI von 100
für 30 min bei 37°C und 5% CO 2. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS
gewaschen und 2 ml Medium mit 125 µg/ml Kanamycin in jedes Well gegeben. Darauf
folgend wurden die infizierten Zellen weiterhin bei 37°C und 5% CO 2 inkubiert. Nach 2 h
und nach 5 h wurde das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen
und 500 µl Trizol in jedes Well gegeben. Nach 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur, wurden die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Kulturschale gelöst
und das Zelllysat nach mehrmaligem auf- und abpipettieren in 2 ml-Safelock-Reagiergefäße überführt. Das Trizollysat wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Für die Analyse der Genexpression unter Salzstress wurden die Bakterien in LBMedium mit 0 mM, 170 mM, 320 mM oder 470 mM Natriumchlorid auf eine OD650 von 0,05
angeimpft und nach vier stündigem Wachstum 4 ml jeder Kultur abzentrifugiert. Das
Bakterienpellet wurde in 500 µl Trizol resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei
-20°C gelagert.
Um die RNA aus dem Zelllysat zu isolieren wurden pro 500 µl Trizolprobe 50 µl 1Bromo-3-Chloropropan zugesetzt, das Gemisch mindestens 15 sek gevortext, für 5 min
bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g und 4°C zenrifugiert.
Hierdurch erfolgte eine Auftrennung des Gemisches in drei Phasen, wobei sich die RNA
in der oberen wässrigen Phase befand, während die mittlere weißliche Phase die DNA
56
Material und Methoden
und die untere organische Phase Proteine enthielt. Die obere RNA-Phase wurde
vorsichtig abgenommen und in sterile 1,5 ml-Reagiergefäße überführt. Durch Zugabe
von 250 µl Isopropanol, mehrmaliges Invertieren, sowie einer Inkubation von 10 min bei
Raumtemperatur, gefolgt von einer 10 minütigen Zentrifugation bei 12.000 x g und 4°C,
wurde die RNA gefällt. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet mit 500 µl
70%igem Ethanol gewaschen und für 5 min bei 12.000 x g und 4°C zentrifugiert.
Nachdem erneut der Überstand verworfen wurde, wurde das RNA-Pellet an der Luft
getrocknet und in 22 µl RNase freiem Wasser gelöst. Die RNA wurde bei -20°C gelagert.
3.11.2 DNase I- Behandlung von RNA
Um die RNA von eventuellen Resten genomischer DNA zu säubern, erfolgte eine
Behandlung mit DNase I. Hierfür wurden 2 µg RNA mit 2 U DNase I in einem
Gesamtvolumen von 20 µl des einfach konzentrierten Reaktionspuffers für DNase I für 3045 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 2 µl 50 mM EDTA, wurde das Enzym für 10
min bei 65°C inaktiviert.
3.11.3 Reverse Transkription
Bei der Reversen Transkription wird durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die
Reverse Transkriptase (RTase), entlang einer RNA-Matrize ein komplementärer DNAStrang (copyDNA/cDNA) erzeugt. Um der RTase einen Startpunkt mit freier 3’Hydroxylgruppe zu liefern wurde zunächst in einem Gesamtvolumen von 12 µl 1 µg
mRNA mit 500 ng eines Random-Primer versetzt und zur Hybridisierung für 5 min bei
65°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze auf Eis gelagert und 4 µl M-MLV 5x
RTase-Puffer, 0,01 µmol dNTPs, 20 U RNasin® sowie 200 U M-MLV-RTase hinzugefügt
und mit RNase freiem Wasser auf 20 µl aufgefüllt. Die Reverse Transkription erfolgte für 1
h bei 42°C. Anschließend wurde das Enzym für 10 min bei 70°C inaktiviert. Die cDNA
wurde bei -20°C gelagert.
3.11.4 Semiquantitative Expressionsanalyse
Für die Semiquantitative Expressionsanalyse wurde die aus 40-100 ng Gesamt-RNA
gewonnene cDNA in einem 25 µl PCR-Ansatz als Template eingesetzt um ein 120-360 bp
großes Genfragment mit der AmpliTaq®DNA-Polymerase zu amplifizieren (siehe Abschnitt
3.3.3). Als Kontrolle für den Einsatz äquivalenter Mengen cDNA wurde eine PCR auf ein
Fragment der 23S rRNA durchgeführt. Um Kontaminationen durch genomische DNA
auszuschließen wurden Kontroll-PCRs mit RNA als Template mitgeführt.
57
Material und Methoden
3.11.5 Quantitative RealTime-PCR
Bei der quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) erfolgt neben der Vervielfältigung der DNA
auch deren Quantifizierung mit Hilfe von Farbstoffen, welche bei Bindung an DNA
fluoreszieren. Durch Messung der Fluoreszenz, die mit der Menge der PCR-Produkte
zunimmt, während jedes PCR-Zykluses, wird ein sigmoidaler Verlauf der PCR erkennbar.
Die Zyklenzahl nach welcher sich die Fluoreszenzsignale des PCR-Produkts signifikant
von der des Hintergrundes abheben und die PCR in die exponentielle Phase übergeht, ist
abhängig von der Ausgangsmenge der Ziel-DNA und bestimmt den Ct-Wert (Cycle
Threshold). Der mathematisch exakte Wert hierfür, welcher dem ersten Maximum der
zweiten Ableitung entspricht, wird als Cp-Wert (Crossing Point) bezeichnet.
Um die Zunahme der DNA zu messen, wurde in dieser Arbeit der interkalierende
Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I, der an doppelsträngige DNA bindet verwendet. Ein
Nachteil
dieses
Verfahrens
gegenüber
der
Verwendung
fluorenszenzmarkierter
Oligonukleotide, welche spezifisch an einer bestimmten Stelle eines DNA-Stranges
binden, ist, dass zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden
kann. Um dennoch die Spezifität der PCR-Produkte zu bestimmen, wurde am Ende der
PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchführt, bei der es bei einer Fragmentlängeabhängigen Schmelztemperatur durch Denaturierung der DNA zur Freisetzung des
Fluoreszenzfarbstoffes kommt.
Die Realtime-PCR erfolgte im 96-well-Format in einem Volumen von 10 µl pro Well.
Hierfür wurde die cDNA von 60-120 ng Gesamt-RNA aus den unter 3.11.1 beschriebenen
Versuchen mit 5 µl des Maxima SYBR Green I-Mastermix (enthält die Taq-Polymerase
und Floureszenzfarbstoff), je 3 pmol der jeweiligen Vorwärts- und Rückwärts-Primer sowie
4 µg BSA versetzt. Um Einflüsse durch Menge und Qualität der eingesetzten cDNA
weitgehend zu kompensieren, wurde von jeder cDNA-Probe in einer parallelen PCR die
bakterielle 16S rRNA als Referenzgen analysiert. Um die Effizienz der PCR zu ermitteln,
wurde bei jedem Experiment eine Verdünnungsreihe bestehend aus dem cDNA-Pool,
dessen 1:10- und 1:100-Verdünnung sowie ein Leerwert (NTC, non target control)
mitgeführt. Nach dem Bestücken der Platte wurde diese für 30 sec bei 2.500 x g
zentrifugiert. Die qRT-PCR wurde mit dem LightCycler®480 Instrument mit dem in Tabelle
8 dargestellten Programm durchgeführt. Alle PCR-Ansätze wurden als Duplikate
angefertigt und der Mittelwert aus den Cp-Werten gebildet. qRT-PCR-Messungen, welche
um mehr als 0,15 von der optimalen Effizienz 2 abwichen, wurden nicht in die
Datenmengen aufgenommen. Die Messungen wurden mit dem Advanced Modus der
relativen Quantifizierung nach der E (effiency)-Methode mit der LightCycler® 480 Software
58
Material und Methoden
Version 1.5 ausgewertet und das relative mRNA-Level jedes Gens zu dem des Wildtyps 2
h nach Infektion normalisiert.
Tabelle 8: Schritte der Realtime-PCR.
Schritt
Temperatur
Zeit
Zyklen
Anstiegsrate
Denaturierung
95°C
10 min
1
4,4°C/sec
Amplifikation: Denaturierung
95°C
15 sec
Annealing
53°C
25 sec
Elongation
72°C
30 sec
95°C
Schmelzkurvenanalyse
65°C
5 sec
1 min
42
1
97°C
Cooling
40°C
30 sec
1
Messungen
0
4,4°C/sec
0
2,2°C/sec
0
4,4°C/sec
1
4,4°C/sec
0
2,2°C/sec
0
0,11°C/sec
5/°C
4,4°C/sec
0
3.12 Statistik
Um die Signifikanzen von Unterschieden zwischen verschiedenen Gruppen zu ermitteln,
wurde entweder der Students t-Test oder der One-way-ANOVA-Test verwendet.
Überlebenskurven wurden mit dem log rank Kaplan-Meier Test verglichen. Alle
statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism Version 4.0 ausgeführt.
Signifikanzen wurden wie folgt gekennzeichnet: * p<0,05; ** p<0,005; ***p<0,001.
3.13 In silicio-Sequenzanalyse
Zur Analyse von Proteinsequenzen wurden diese von www.ncbi.nih.nlm.gov geladen und
mit verschiedenen online-Resourcen auf bekannte Sequenzmotive hin untersucht.
Tabelle 9: Verwendete Online-Resourcen zur Sequenzanalyse.
Motiv
Programm
Internetadresse
sekretorische Signalpeptide
SignalP 3.0
cbs.dtu.dk/services/SignalP/
Transmembran-Domänen
TMHMM 2.0
CDD
Interpro
cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
www.ebi.ac.uk/interpro/
Konservierte Domänen
Proteine mit Sequenzähnlichkeiten wurden mittels PSI-BLAST (www.ncbi.nlm.nih/blast)
gesucht. Für die Strukturvorhersage wurden die Sequenzen bei ESyPred3D eingegeben.
Die erhaltenen pdb-Dateien ermöglichten die Darstellung der vohergesagten Struktur mit
dem Programm pyMOL (Version 1.2r1; DeLano Scientific LLC). Für das Multible Aligment
wurde das Programm ClustalX 2.1(www.ebi.ac.uk/pub/software) genutzt.
59
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Gezielte Mutagenese und Komplementation von BPSS1504 und
BPSS1539
Die gezielte Mutagenese von BPSS1504 (tagA/B) und BPSS1539 (bsaU) wurde mit einer
von Lopéz et al. beschriebenen Methode zur Genverdrängung durchgeführt (Lopez et al.,
2009). Diese Methode ermöglicht die Generierung von markerlosen Deletionsmutanten,
da das für die Mutagenese verwendete Plasmidrückgrad vollständig wieder aus dem
Genom entfernt wird. Die erfolgreiche, vollständige Deletion der Zielgene wurde durch
PCR bestätigt. Wie in Abb.10A gezeigt, lieferte eine PCR mit Primern, die in den 5'- und
3'-flankierenden Regionen des BPSS1504-Lokus binden, auf der DNA der potentiellen
BPSS1504-Mutanten ein im Vergleich zum Wildtyp um etwa 2650 bp verkürztes PCRProdukt, was der Größe des BPSS1504-Gens entspricht. Ebenso lieferte eine PCR mit
Primern, welche aufwärts (5´) und abwärts (3´) des bsaU-Lokus binden, bei den
potentiellen bsaU-Mutanten ein im Vergleich zum Wildtyp um die Länge des bsaU-Genes
von 1300 bp verkürztes PCR-Produkt (siehe Abb. 11A). Da es möglich ist, dass bei
merodiploiden B. pseudomallei-Klonen, welche sowohl das Wildtyp- als auch das mutierte
Allel besitzen, die PCR-Reaktion, die das kürzere PCR-Produkt liefert bevorzugt wird,
wurde eine zusätzliche PCR mit einem Primerpaar, welches innerhalb des jeweiligen
Zielgens bindet, durchgeführt. Da diese nur auf der genomischen DNA des Wildtyps ein
Produkt lieferte, nicht aber auf der aus den potentiellen Mutanten isolierten DNA wurde
die Deletion des Zielgens hierdurch ebenfalls bestätigt.
Um in späteren, der Charakterisierung der Mutanten dienenden Experimenten
nachweisen zu können, dass eventuelle phänotypische Veränderungen tatsächlich
ausschließlich auf der Deletion des Zielgens beruhen, wurde das jeweiligen Gen in das
Genom der Mutante re-integriert. Beruht ein gefundener Phänotyp bei einer Mutante allein
auf der Mutation des Zielgens, sollte er durch eine solche Komplementation des
entsprechenden Gens reversibel sein. Die stabile Re-Integration von BPSS1504
beziehungsweise bsaU in das Genom der Mutanten B. pseudomallei ∆BPSS1504 und B.
pseudomallei ∆bsaU gelang mit Hilfe von Tn7mini-Vektoren (Choi et al., 2008) und wurde
durch PCR-Analysen bestätigt. So lieferte eine PCR mit einem am Anfang und am Ende
des
BPSS1504-Orf
bindenden
Primerpaar
bei
den
potentiellen
BPSS1504-
Komplementanten das der Größe des BPSS1504-Gens entsprechende PCR-Produkt von
2650 bp, welches erwartungsgemäß bei B. pseudomallei ∆BPSS1504 fehlte (siehe Abb.
10B).
60
Ergebnisse
A
M
bp
∆BPSS1504 – Klone
WT
1
2
3
B
4
WT
bp
∆BPSS
1504
M
∆BPSS1504:
Tn7:BPSS1504
1
2
3000
3000
s3
glm
s2
s1
glm
s3
Klon2
glm
glm
glm
500
s2
Klon1
glm
C
s1
1000
Abb. 10: Nachweis der Deletion (A) und der Komplementation (B und C) von BPSS1504 durch PCR.
A: PCR mit dem Primerpaar BPSS1504KOver_for (195 bp 5´ von BPSS1504) und BPSS1504KOver_rev (208
bp 3´ von BPSS1504) auf genomischer DNA des B. ps. E8 Wildtyps oder der potentiellen BPSS1504Deletionmutanten.
B: PCR mit dem Primerpaar BPSS1504for und BPSS1504rev (am Anfang und am Ende des BPSS1504-Orf)
auf genomischer DNA des B. ps. E8 Wildtyps, von B. ps. ∆BPSS1504 oder nach BPSS1504Komplementation (M: Marker).
C: Bestimmung der Insertionsstelle des BPSS1504-Gens nach Komplementation.
Ebenso lieferte die PCR mit am Anfang und Ende des bsaU-Orf bindenden Primern bei
den potentiellen bsaU-Komplementanten das der Länge des bsaU-Gens entsprechende
PCR-Produkt von 1300 bp (siehe Abb. 11B).
Da das B. pseudomallei Genom drei für die Glutamin-6-phosphat-Sythetase
kodierende glmS-Sequenzen enthält, hinter welchen die Tn7mini-Elemente an definierten
attTn7-Stellen integrieren können, wurde mit Hilfe einer weiteren PCR mit einem im
Vektor bindenden und einem für die jeweilige glmS-Sequenz-spezifischen Primer die
Lokalisation des re-integrierten Gens bestimmt. Wie die in Abb. 10C abgebildeten PCRAnalysen zeigten, war die Integration des BPSS1504-Gens in allen erhaltenen
Komplementantenklonen hinter der glmS2-Sequenz (BPSL1312) erfolgt.
Die in Abb. 11C abgebildeten PCR-Analysen zeigen, dass die Re-integration des
bsaU-Genes im Gegensatz zum BPSS1504-Gen in den verschieden Klonen hinter
unterschiedlichen glmS-Sequenzen erfolgt war und auch mehrfache Integrationen des
bsaU-Gens in einem Klon auftraten (Abb. 11C Klon 2). Für die Experimente wurde ein
Klon verwendet, bei dem das bsaU-Gen hinter glmS2 integriert war (Abb. 11C Klon 1).
61
Ergebnisse
A
∆bsaU – Klone
WT
M
bp
1
2
3
3000
B
3
2
3
glm
s
glm
s
2
glm
s
glm
s
1
glm
s
1
3
Klon3
glm
s
glm
s
glm
s
1
1500
Klon2
2
Klon1
glm
s
C
2000
∆bsaU:Tn7:bsaU
bp
WT ∆bsaU
M
1
2
3
1200
Abb. 11: Nachweis der Deletion (A) und der Komplementation (B und C) des bsaU-Genes durch PCR.
A: PCR mit dem Primerpaar BPSS1539ko-seq_for (832 bp 5´ von bsaU) und BPSS1539ko-seq_rev (925 bp
3´ von bsaU) auf genomischer DNA des B. ps. E8 Wildtyp oder der potentiellen bsaU-Deletionmutanten.
B: PCR mit dem Primerpaar BsaU_for und BsaU_rev (am Anfang und am Ende des bsaU-Orf) auf
genomischer DNA des B. ps. E8 Wildtyp, von B. ps. ∆bsaU oder nach bsaU-Komplementation (M:Marker).
C: Bestimmung der Insertionsstelle des bsaU-Gens nach Komplementation.
4.2 Funktionelle Analyse von BPSS1504
4.2.1 Wachstum, Motilität und Biofilmbildung von B. pseudomallei
∆BPSS1504
Um zu überprüfen, ob BPSS1504 einen Einfluss auf das Wachstum von B. pseudomallei
in vitro hat, wurden zunächst Wachstumsversuche in komplexem Nährmedium und in
Minimalmedium durchgeführt. Wie in Abb. 12 dargestellt, unterscheidet sich das
Wachstum von B. pseudomallei ∆BPSS1504 weder in LB-Medium noch in Vogel-BonnerMedium vom B. pseudomallei E8 Wildtyp.
A
B
7.5
5.0
2.5
12.5
OD bei 650nm
OD bei 650nm
10.0
E8
∆BPSS1504
0.0
10.0
7.5
5.0
E8
2.5
∆BPSS1504
0.0
0
10
20
30
40
0
Zeit [h]
25
50
75
Zeit [h]
Abb. 12: Wachstumsverhalten von B. ps. ∆BPSS1504 im Vergleich zum B. ps. E8 Wildtyp.
A: Änderung der Optischen Dichte bei 650 nm während des Wachstums in LB-Medium.
B: Änderung der Optischen Dichte bei 650 nm während des Wachstums in Vogel-Bonner-Medium.
Abgebildet ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis von drei Experimenten.
62
100
Ergebnisse
Weiterhin zeigte B. pseudomallei ∆BPSS1504 auf Softagar eine mit dem B. pseudomallei
E8 Wildtyp vergleichbare in vitro-Beweglichkeit (Abb. 13A).
Bei einigen gramnegativen Bakterien, wie enteroaggregativen E. coli (EAEC) ist das
T6SS in die Biofilmbildung involviert (Aschtgen et al., 2008). Daher wurde untersucht, ob
das T6SS-assozierte Gen BPSS1504 für die Biofilmbildung von B. pseudomallei von
Bedeutung ist. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass sich die Fähigkeit von B.
pseudomallei ∆BPSS1504 zur Biofilmbildung in vitro nicht vom B. pseudomallei E8
Wildtyp unterscheidet (siehe Abb. 13B)
A
B
125
0.30
OD bei 540nm
100
Motilität in %
0.35
75
50
25
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
E8
∆ BPSS1504
0.00
E8
∆ BPSS1504
Abb. 13: Motilität und Biofilmbildung von B. ps. ∆BPSS1504 im Vergleich zum B. ps. E8 Wildtyp.
A: Ausschwärmen auf Softagarplatten nach 24 h Inkubation bei 37°C; der Hofdurchmesser des B. ps. E8
Wildtyps wurde gleich 100% gesetzt. Gezeigt sind gepoolte Daten aus drei unabhängigen Experimenten
jeweils mit Doppelbestimmung.
B: Quantifizierung der Biofilmbildung nach 24 h statischer Inkubation bei 37°C über Bestimmung des
Kristallviolett-Rückhaltevermögens adhärenter Bakterien durch Absorptionmessung bei 540 nm. Gezeigt ist
ein repräsentatives Ergebnis aus fünf unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit Mittelwert und
Standardabweichung aus Sechsfachbestimmungen.
4.2.2 Expression von BPSS1504
In Mikroarrayanalysen der Arbeitsgruppe von Patrick Tan in Singapur wurde die
Expression von B. pseudomallei-Genen unter mehr als 80 verschieden Bedingungen
getestet. BPSS1504 tauchte dabei jedoch nie unter den Top 50 Perzentilen auf (Ong Ee
Ling Catherine, persönliche Kommunikation), was auf eine eher geringe Expression von
BPSS1504 schließen lässt.
Wie verschiedene Arbeiten zeigten, wird das T6SS-1 nach Invasion in Makrophagen
induziert (Shalom et al., 2007; Chen et al., 2011). So erreichte beispielsweise die
Expression von hcp1 etwa fünf Stunden nach der Infektion von RAW264.7-Zellen ihren
Maximalwert (Chen et al., 2011). Um zu überprüfen ob, die Expression von BPSS1504
durch Invasion in Makrophagen induziert wird, wurde die mRNA-Expression von
BPSS1504 zwei Stunden und fünf Stunden nach der Infektion von RAW264.7-Zellen
63
Ergebnisse
untersucht. In quantitativen (Realtime-PCR) und semiquantitativen PCR-Analysen unter
Verwendung der Taq DNA-Polymerase konnte die Expression von BPSS1504 nicht
nachgewiesen werden, was vermutlich auf die sehr geringe Expression des Gens
zurückzuführen ist. Der Nachweis der BPSS1504-Expression gelang allerdings durch
semiquantitative RT-PCR-Analysen mit Hilfe der KOD Hotstart DNA-Polymerase, welche
eine höhere Sensitivität aufweist als die Taq DNA-Polymerase. Wie in Abb. 14 gezeigt,
konnte im B. pseudomallei-Wildtyp E8 ein Anstieg der Expression von BPSS1504 fünf
Stunden nach der Infektion von RAW264.7-Zellen nachgewiesen werden. Als Kontrolle
wurde die Mutante B. pseudomallei ∆BPSS1504 mitgeführt, welche erwartungsgemäß
keine BPSS1504-Expression aufwies.
2h
+
5h
-
+
-
BPSS1504
BPSS1504
23S rRNA
Abb. 14: Expression von BPSS1504 im B. ps. E8 Wildtyp und B. ps. ∆BPSS1504 2 h und 5 h nach
Infektion von RAW264.7-Zellen.
Semiquantitative RT-PCR mit 23S rRNA als Referenzgen.
Gezeigt sind repräsentative Ergebnisse aus zwei unabhängig von einander durchgeführten Experimenten.
4.2.3 Invasions- und Replikationsverhalten von B. pseudomallei
∆BPSS1504 in mammalen Zellen
Da die Expression von BPSS1504 nach Aufnahme in Makrophagen induziert wird (siehe
4.2.2), sollte die Rolle von BPSS1504 für das intrazelluläre Überleben von B.
pseudomallei näher analysiert werden. Hierzu wurden sowohl humane Lungenepithelzellen (A549) als auch murine Makrophagen-ähnliche Leukämiezellen (RAW264.7)
und primiäre Knochenmarkmakrophagen aus C57BL/6-Mäusen (C57BL/6-BMM) mit B.
pseudomallei infiziert. Hierbei wurden keine signifikanten Unterschiede in der Fähigkeit
von B. pseudomallei ∆BPSS1504 zur Invasion in phagozytierende (RAW264.7/ BMM) und
nicht-phagozytierende (A549) Zellen gegenüber dem B. pseudomallei E8 Wildtyp
beobachtet. Hingegen zeigte sich, dass B. pseudomallei ∆BPSS1504 in verschiedenen
Zellen schlechter repliziert als der B. pseudomallei E8 Wildtyp. In A549-Zellen schien
dieser Replikationsdefekt abhängig von der Infektionsdosis zu sein. Nach Infektion mit
einer niedrigen MOI (MOI 2,5) zeigten sich keine Unterschiede in der intrazellulären
64
Ergebnisse
Replikation von B. pseudomallei ∆BPSS1504 und dem Wildtyp (siehe Abb.15A). Jedoch
wurden 16 Stunden nach Infektion mit einer höheren Infektionsdosis (MOI 23) in den mit
B. pseudomallei ∆BPSS1504 infizierten Zellen signifikant geringere intrazelluläre
Keimzahlen gefunden als bei den mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp infizierten Zellen
(Siehe Abb.15B). Da bei dieser Infektionsdosis die mit dem B. pseudomallei-Wildtyp
infizierten A549-Zellen 24 Stunden nach Infektion deutlich lysiert waren, konnten zu
diesem Zeitpunkt keine intrazellulären Keimzahlen mehr bestimmt werden.
*
B
10 6
10 5
10 4
10 3
10 2
E8
∆BPSS1504
10 1
0
6
12
18
24
intrazelluläre CFU/well
intrazelluläre CFU/well
A
10 7
10 6
10 5
10 4
10 3
10 2
E8
∆BPSS1504
10 1
10 0
30
Zeit post infectiom [h]
0
16
Zeit post infectionem [h]
Abb. 15: Vergleich des Invasions- und Replikationsverhalten des B. ps. E8 Wildtyps und B. ps.
∆BPSS1504 in A549-Zellen.
A: Invasion und Replikation nach Infektion mit MOI 2,5.
B: Invasion und Replikation nach Infektion mit MOI 23.
Gezeigt ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten
Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.
Ebenso wurden die intrazellulären Keimzahlen in RAW264.7-Zellen 16 Stunden nach
Infektion bestimmt, da die Zellen zu späteren Zeitpunkten nach der Infektion mit dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp stark lysiert waren. Wie in Abb. 16A gezeigt, fanden sich auch
hier 16 Stunden nach Infektion signifikant niedrigere intrazelluläre Keimzahlen in
RAW264.7-Zellen, die mit B. pseudomallei ∆BPSS1504 infiziert waren, als in Zellen, die
mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp infiziert waren.
Besonders stark ausgeprägt war der Replikationsdefekt in primären Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6-Mäusen. Wie in Abb. 16B
gezeigt, konnte sich B.
pseudomallei ∆BPSS1504 in diesen Zellen nach normaler Invasion im untersuchten
Zeitraum von 24 Stunden nicht mehr vermehren. Da der Defekt in der intrazellulären
Replikation in Makrophagen durch Komplementation des BPSS1504-Gens wieder
aufgehoben werden konnte (siehe Abb. 16), können unspezifische Effekte der Deletion
auf andere Gene, die für das intrazelluläre überleben bedeutend sind, ausgeschlossen
werden.
65
Ergebnisse
***
intrazelluläre CFU/well
10 7
10
B
***
6
10 5
10 4
E8
∆BPSS1504
∆BPSS1504:
Tn7:BPSS1504
10 3
10
2
10
1
10 0
0
16
Zeit post infectionem [h]
intrazelluläre CFU/ well
A
10 5
**
10 4
E8
∆BPSS1504
∆BPSS1504:
Tn7:BPSS1504
10 3
0
6
12
18
24
30
Zeit post infectionem [h]
Abb. 16: Vergleich des Invasions- und Replikationsverhalten des B. ps. E8 Wildtyps, B. ps.
∆BPSS1504 und B. ps. ∆BPSS1504:Tn7:BPSS1504 in Makrophagen
A: Invasion und Replikation in RAW 264.7-Zellen nach Infektion mit MOI 1,5.
B: Invasion und Replikation in C57BL/6-BMM nach Infektion mit MOI 4.
Gezeigt ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis aus drei unabhängig voneinander durchgeführten
Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.
4.2.4 Rolle von BPSS1504 bei der Induktion von Zelltod
4.2.4.1 Auswirkungen der BPSS1504-Deletion auf die Zytotoxizität
4.2.4.1.1 Echtzeit-Zellstatus-Analysen
B. pseudomallei kann nach der Infektion von Zellen Zelltod auslösen (Kespichayawattana
et al., 2000; Sun et al., 2005). Um zu untersuchen, ob BPSS1504 in die Induktion von
Zelltod involviert ist, wurden zunächst Echtzeit-Zellstatus-Analysen anhand verschiedener
Zelllinien durchgeführt (Details zur Methodik siehe Abschnitt 3.9.6). Diese Analysen
geben Aufschluss über Änderungen der Zellzahl, Adhäsion, Viabilität oder Morphologie
der Zellen. Wie in Abb. 17 zu sehen, steigt der Zellindex von nicht infizierten Zellen
aufgrund des Wachstums und der Adhäsion der Zellen kontinuierlich an, bis er die
Plateauphase erreicht, wenn die Zellen sich nicht mehr ausbreiten können. Anschließend
sinkt der Zellindex, wenn die Zellen beginnen sich vom Boden der Zellkulturplatte
abzulösen und absterben. Nach Infektion mit B. pseudomallei E8 können die Zellen nicht
mehr bis zur maximalen Zelldichte anwachsen, stattdessen tritt das Absinken des
Zellindex deutlich früher ein als bei nicht infizierten Zellen, was unter anderem auf das
durch die Infektion verursachte Eintreten des Zelltods zurückzuführen ist. Auch die
Infektion mit B. pseudomallei ∆BPSS1504 führte zu einem etwas früheren Absinken des
Zellindex verglichen mit nicht infizierten Zellen, jedoch war dieses verzögert gegenüber
den mit B. pseudomallei E8 infizierten Zellen. So begann bei A549-Zellen, die mit B.
pseudomallei E8 infiziert waren, der Zellindex etwa 40 Stunden nach der Infektion
abzusinken, während der Zellindex von uninfizierten A549-Zellen noch 20 Stunden länger
66
Ergebnisse
weiter anstieg. Der Zellindex von A549-Zellen, die mit B. pseudomallei ∆BPSS1504
infiziert waren, begann etwa 48 Stunden nach der Infektion zu sinken (siehe Abb. 17A).
Besonders deutlich war der Unterschied in der Zytoxizität bei RAW264.7-Zellen zu
beobachten, wie in Abb. 17B gezeigt wird. Bei diesen begann der Zellindex etwa 30 h
nach Infektion mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp bis auf den Hintergrundwert
abzusinken, was ein Indikator für das Absterben aller Zellen ist. Die nicht infizierten
Kontrollzellen hingegen erreichten nach 110 Stunden den maximalen Zellindex.
RAW264.7-Zellen die mit B. pseudomallei ∆BPSS1504 infiziert waren, konnten noch bis
etwa 72 h nach Infektion weiter wachsen und erst danach reflektierte ein Absinken des
Zellindex ein langsames Ablösen und Sterben der Zellen (Abb. 17B). Diese Daten zeigen,
dass durch die Infektion mit B. pseudomallei ∆BPSS1504 weniger Zelltod ausgelöst wird,
als durch den B. pseudomallei E8 Wildtyp. Trotz des sehr ausgeprägt Effekts bei
RAW264.7-Zellen, ließ sich nicht volkommen ausschließen, dass diese Beobachtungen
auf die schlechtere intrazelluläre Replikation von B. pseudomallei ∆BPSS1504
zurückzuführen ist.
A Infektion
Normalisierter Zellindex
Normalisierter Zellindex
B Infektion
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
20
uninfizierte A549-Zellen
40
60
80
100
120
140
160
Zeit post infectionem [h]
Zeit post infectionem [h]
uninfizierte RAW264.7-Zellen
E8 infizierte A549-Zellen
E8 infizierte RAW264.7-Zellen
∆BPSS1504 infizierte A549-Zellen
∆BPSS1504 infiziete RAW264.7-Zellen
Abb. 17: Echtzeit-Zellstatus-Analyse von Zellen, die mit dem B. ps. E8 Wildtyp oder mit B. ps.
∆BPSS1504 infiziert wurden, im Vergleich zu nicht infizierten Zellen.
A: A549-Zellen nach Infektion mit MOI 20.
B: RAW264.7-Zellen nach Infektion mit MOI 2.
Gezeigt sind repräsentative Ergebnisse aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.2.4.1.2 LDH-Assay
Um einen sekundären Effekt durch die Unterschiede in der intrazellulären Replikation
auszuschließen zu können, sollte der Effekt von BPSS1504 auf die Zytotoxizität unter
67
Ergebnisse
Bedingungen untersucht werden, unter welchen die intrazellulären Keimzahlen von
Mutante und Wildtyp vergleichbar sind. Kürzlich konnten Arbeiten unserer Arbeitsgruppe
zeigen, dass Knochenmarkmakrophagen aus Caspase-1-/- Mäusen in ihrer Fähigkeit B.
pseudomallei abzutöten stark eingeschränkt sind (Breitbach et al., 2009).
Wie in Abb. 18A gezeigt, konnte B. pseudomallei ∆BPSS1504 in diesen Zellen
vergleichbar gut replizieren wie der B. pseudomallei E8 Wildtyp. Die Messung der LDHFreisetzung aus infizierten Zellen ermöglicht die Detektion von feinen Unterschieden in
der Zytotoxizität bereits zu Zeitpunkten, zu denen die Echtzeit-Zellstatus-Analysen noch
kein Zellsterben erkennen lassen. Die in Abb. 18B dargestellten Messung der LDHFreisetzung aus infizierten Caspase-1-/- Makrophagen 24 Stunden nach Infektion zeigten,
dass trotz vergleichbarer intrazellulärer Keimzahlen, eine signifikante Verringerung der
zytotoxischen Eigenschaften von B. pseudomallei ∆BPSS1504 verglichen mit dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp auftrat. Durch Komplementation von BPSS1504 erreichte die
Zytotoxizität von B. pseudomallei wieder das Wildtypniveau. Diese Ergebnisse weisen auf
einen direkten Einfluss von BPSS1504 auf die Induktion des Zelltodes nach B.
pseudomallei-Infektion hin.
B
10 7
70
10 6
10 5
10 4
10 3
10 2
E8
∆BPSS1504
10 1
10 0
LDH-Freisetzung (%)
intrazelluläre CFU/well
A
*
**
60
50
40
uninfiziert
E8
∆BPSS1504
∆BPSS1504:
Tn7:BPSS1504
30
20
10
0
0
6
12
18
24
6h
30
24h
Zeit post infectionem [h]
Zeit post infectionem [h]
Abb. 18: Vergleich der Zytotoxiztät von B. ps. ∆BPSS1504 mit dem B. ps. E8 Wildtyp.
A: Invasions- und Replikationsverhalten von B. ps. E8 und B. ps. ∆BPSS1504 in Caspase1-/- BMM nach
Infektion mit MOI 2.
B: LDH- Freisetzung aus Caspase1-/- BMM nach Infektion mit B. ps., B. ps. ∆BPSS1504 oder B. ps.
∆BPSS1504 MOI 5 .
Gezeigt sind repräsentative Ergebnisse aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.2.4.2 Einfluss von BPSS1504 auf die Induktion von Caspasen
Es ist bekannt, dass in B. pseudomallei infizierten Makrophagen kurz nach Infektion ein
Caspase-1 vermittelter Zelltod, den man als Pyroptose bezeichnet, ausgelöst wird (Sun et
al.,
68
2005).
Weiterhin
kann
B.
pseudomallei
in
phagozytierenden
und
nicht-
Ergebnisse
phagozytierenden
Zellen
den
Zelltod
durch
klassische
Apoptose
induzieren
(Kespichayawattana et al., 2000).
Um einen möglichen Einfluss von BPSS1504 auf die Pyroptose oder Apoptose zu
prüfen, wurden Knochenmarkmakrophagen aus C57BL/6- und Caspase-1-/- Mäusen drei
Stunden nach Infektion mit B. pseudomallei lysiert und Western-Blot-Analysen mit
spezifischen Antikörpern gegen die pyroptotische Caspase-1 und die apoptotischen
Caspasen 7, 8 und 9 durchgeführt. Zu diesem frühen Zeitpunkt nach der Infektion waren
noch keine signifikanten Unterschiede im Replikationsverhalten zwischen B. pseudomallei
∆BPSS1504 und dem B. pseudomallei E8 Wildtyp zu detektieren. Die in Abb. 19
abgebildeten Western-Blot-Analysen zeigen, dass Caspase-1 durch B. pseudomallei
∆BPSS1504 in vergleichbarem Level wie durch den B. pseudomallei E8 Wildtyp aktiviert
wird. Auch konnte kein Unterschied in der Aktivierung der Caspasen 7, 8 und 9 in
C57BL/6- und Caspase-1-/- Makrophagen durch B. pseudomallei ∆BPSS1504 gegenüber
B. pseudomallei E8 festgestellt werden. Die gezeigten Daten lassen vermuten, dass
BPSS1504 keine entscheidende Rolle für die Induktion des pyroptotischen Zelltods oder
für das Auslösen der klassischen Apoptose spielt.
t
er
izi
f
in
E8
Un
04
t
15
er
S
izi
f
S
P
in
E8
Un
∆B
4
50
S1
S
P
∆B
4
50
t
rt
er
S1
S
zie
if zi
i
f
P
in
in
B
E8 ∆
E8
Un
Un
04
15
S
PS
∆B
Procaspase 8
Procaspase 1
Caspase 8
Caspase 1 p10
Procaspase 9
Procaspase 7
Caspase 9
Caspase 7
GAPDH
GAPDH
C57BL/6-BMM
Caspase1-/- BMM
C57BL/6-BMM
Caspase1-/- BMM
Abb. 19: Western-Blot-Analyse von Proteinen aus C57BL/6 oder Caspase1-/- BMM 3 h nach Infektion
mit dem B. ps. E8 Wildtyp oder B. ps. ∆BPSS1504 (MOI 50) zur Detektion der Caspasen 1, 7, 8 und 9
mit GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) als Ladekontrolle.
Repräsentatives Ergebnis aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.2.5 Einfluss der BPSS1504-Deletion auf die Induktion von Riesenzellen
Die Ausbreitung von B. pseudomallei von Zelle zu Zelle steht in einem engen
Zusammenhang mit dessen Fähigkeit, Zellfusionen zu induzieren, welche zur Bildung von
vielkernigen Riesenzellen führen.
69
Ergebnisse
A
B
Uninfizierte RAW264.7
***
100µm
100µm
E8 infizierte RAW264.7
intrazelluläre CFU/ Well
10
***
7
10 6
10 5
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
0
16
Zeit post infectionem [h]
100µm
100µm
E8
∆BPSS1504
∆bsaU
∆BPSS1504 infizierte RAW264.7
100µm
100µm
∆BPSS1504:Tn7:BPSS1504 infizierte RAW264.7
100µm
100µm
C
100%
>60 Kerne/Zelle
80%
30-60 Kerne/Zelle
60%
11-29 Kerne/Zelle
40%
4-10 Kerne/Zelle
20%
2-3 Kerne/Zelle
1 Kern/Zelle
0%
uninfiziert
E8 infiziert
∆BPSS1504
infiziert
∆BPSS1504:Tn7:
BPSS1504 infiziert
∆bsaU infiziert
Abb. 20: Bildung von vielkernigen Riesenzellen bei RAW264.7-Zellen 16 h nach Infektion mit dem B.
ps. E8 Wildtyp, B. ps. ∆BPSS1504 und B. ps. ∆BPSS1504:Tn7:BPSS1504 (MOI 2).
A: Mikroskopische Aufnahme von RAW264.7-Zellen nach GIEMSA- Färbung.
B: Invasion und Replikation von B. ps. E8; , B. ps. ∆BPSS1504 und B. ps. ∆bsaU in RAW264.7-Zellen
C: Quantifizierung der Zellkernverteilung durch Auszählung der Kerne pro Zelle.
Abbildungen sind repräsentativ für vier unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.
70
Ergebnisse
Einige Proteine des T6SS-1 wie Hcp1 und TssA/B scheinen hierbei eine wesentliche
Rolle zu spielen (Burnick et al., 2011, Chen et al., 2011). Daher wurde der Einfluss von
BPSS1504 auf die Fähigkeit von B. peudomallei die Bildung von vielkernigen
Riesenzellen bei RAW264.7-Zellen zu induzieren überprüft. Hierfür wurden die Zellen mit
einer MOI von 2 infiziert und 16 Stunden nach der Infektion mit GIEMSA angefärbt. Wie
die Lichtmikroskopischen Aufnahmen in Abb. 20A zeigen, war die Fähigkeit von B.
pseudomallei ∆BPSS1504 Riesenzellen zu induzieren stark eingeschränkt. Während die
mit dem Wildtyp infizierten Zellen zu mehr als 90% in Zellfusionen involviert waren und
Riesenzellen mit zum Teil mehr als 200 Kernen bildeten, konnten bei den mit B.
pseudomallei ∆BPSS1504 infizierten Zellen kaum Riesenzellen beobachtet werden (Abb.
20A und 20C). Durch Komplementation des BPSS1504-Gens konnte der WildtypPhänotyp wieder hergestellt werden (Abb. 20A und 20C).
Zwar wurde unter Abschnitt 4.2.3 gezeigt, dass B. pseudomallei ∆BPSS1504 in
RAW267.4 Zellen schlechter repliziert als der B. pseudomallei E8 Wildtyp, doch scheint
es unwahrscheinlich, dass die 16 Stunden nach der Infektion um eine logarithmische
Stufe geringeren intrazellulären Keimzahlen zum fast vollständigen Erliegen der
Riesenzellbildung führen. Um auszuschließen, dass der beobachtete Phänotyp von B.
pseudomallei
∆BPSS1504
bei
der
Induktion
von
Riesenzellen
allein
auf
die
eingeschränkte intrazelluläre Replikation zurückzuführen ist, wurde die Mutante B.
pseudomallei ∆bsaU, welche in RAW264.7-Zellen ähnlich repliziert wie B. pseudomallei
∆BPSS1504 (siehe Abb. 20B) als Kontrolle mitgeführt. Die mit B. pseudomallei ∆bsaU
infizierten Zellen wiesen zwar eine reduzierte Riesenzellbildung gegenüber den mit dem
B. pseudomallei E8 Wildtyp infizierten Zellen auf, jedoch konnte B. pseudomallei ∆bsaU
deutlich mehr Riesenzellbildung induzieren als B. pseudomallei ∆BPSS1504 (siehe Abb.
20A und 20C). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass BPSS1504 eine direkte Rolle
bei der Induktion von Riesenzellen spielt, die unabhängig von der reduzierten Replikation
in diesen Zellen ist.
4.2.6 Rolle von BPSS1504 für die Bildung von Aktinschweifen
B. pseudomallei besitzt die Fähigkeit, im Zytoplasma der Wirtszelle BimA-abhängig an
einem Pol des Bakteriums Aktinumpolymerisationen zu induzieren, was die Ausbreitung
des Erregers von Zelle zu Zelle unterstützt. In B. mallei führte die Mutagenese des tssEGenes im Cluster des T6SS-1 zu einem Defekt in der Aktinschweifbildung (Burtnick et al.,
2010). Weiterhin wies eine Mutante des tssA-Gens von B. pseudomallei eine verringerte
Fähigkeit zur Induktion von Aktinschweifen auf. Darüber hinaus wurde in verschiedenen
Arbeiten gezeigt, dass das die Expression des in die Aktinschweifbildung involvierten
71
Ergebnisse
bimA-Gens durch das T6SS-1 assoziierte Zwei-Komponenten-Regulatorsystem VirA/VirG
heraufreguliert wird (Schell et al., 2007; Chen et al., 2011).
Deshalb wurde die Fähigkeit von B. pseudomallei ∆BPSS1504 Aktinumlagerungen in
eukaryotischen Zellen zu induzieren überprüft. Hierzu wurden Immunofluoreszenzfärbung
von infizierten HepG2-Zellen durchgeführt. Wie in Abb. 21A gezeigt ist B. pseudomallei
∆BPSS1504 wie der B. pseudomallei E8 Wildtyp in der Lage, im Zytosol von HepG2Zellen Aktinschweife zu bilden. Weiterhin war nach Infektion von RAW264.7-Zellen kein
Unterschied in der bimA-Expression durch B. pseudomallei ∆BPSS1504 und dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp erkennbar (Abb. 21B). Diese Ergebnisse zeigen, dass
BPSS1504 bei der Induktion von Aktinschweifen, im Gegensatz zu anderen Genen des
T6SS-1, keine entscheidende Rolle zukommt.
A
α- B. ps. EPS
α- β- Aktin
Merge
E8
10µm
α- B. ps. EPS
α- β- Aktin
Merge
∆BPSS1504
10µm
B
+
-
BPSS1504
bimA
23SrRNA
Abb. 21: Vergleich der Aktinschweifbildung durch den B. ps. E8 Wildtyp und B. ps ∆BPSS1504.
A: Immunofluoreszensfärbungen von HepG2-Zellen 16 h nach Infektion mit B. ps. E8 oder B. ps ∆BPSS1504
(MOI 400); rot: β-Aktingerüst der Zelle; grün: B. pseudomallei.
B: Expression von bimA in B. ps. E8 oder B. ps ∆BPSS1504 5 h nach Infektion von RAW 264.7-Zellen
Alle Abbildungen sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.
72
Ergebnisse
4.2.7 Einfluss von BPSS1504 auf die Virulenz von B. pseudomallei
Aufgrund der Defekte von B. pseudomallei ∆BPSS1504 im intrazellulären Lebenzyklus,
wurde im nächsten Schritt die Rolle von BPSS1504 für die Virulenz von B. pseudomallei
in einem murinen Modell untersucht. Nach intranasaler Infektion von BALB/c Mäusen mit
500 CFU überlebten die mit B. pseudomallei ∆BPSS1504 infizierten Tiere den
untersuchten Zeitraum von 62 beziehungsweise 118 Tagen, während die mit dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp infizierten Tiere bereits innerhalb von drei Tagen verstarben
(siehe Abb. 22A). Diese Attenuierung in der Virulenz konnte durch die Komplementation
des BPSS1504-Gen wieder aufgehoben werden. Wie in Abb. 22A gezeigt, verstarben die
mit B. pseudomallei ∆BPSS1504:Tn7:BPSS1504 infizierten Mäuse, ähnlich den mit B.
pseudomallei E8 infizierten Tieren innerhalb von wenigen Tagen. Die mit B. pseudomallei
∆BPSS1504 infizierten Mäuse wurden 62 (n=4) und 118 (n=5) Tage nach der Infektion
getötet, um die Bakterienlast in den Organen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass
sowohl Leber und Milz als auch die Lungen bei allen Tieren steril waren. Weiterhin fanden
sich in BALB/c Mäusen 48 Stunden nach intranasaler Infektion mit 30 CFU signifikant
geringere Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz der mit B. pseudomallei ∆BPSS1504
infizierten Tiere im Vergleich zu den mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp infizierten
Mäusen (siehe Abb. 23).
B
125
***
100
75
50
E8
∆BPSS1504
∆BPSS1504:Tn7:BPSS1504
25
0
125
Überlebende Tiere [%]
Überlebende Tiere [%]
A
100
75
50
3000 CFU
13000 CFU
130000 CFU
25
0
0
20
40
60
80
100
Zeit post infectionem [d]
0
20
40
60
80
100
Zeit post infectionem [d]
Abb. 22: Einfluss der BPSS1504-Deletion auf das Sterbeverhalten von BALB/c-Mäusen nach B.
pseudomallei Infektion.
A: Sterbeverhalten von BALB/c-Mäusen (n=9) nach intranasaler Infektion mit 500 CFU des B. ps. E8 Wildtyps,
B. ps. ∆BPSS1504 oder B. ps. ∆BPSS1504:Tn7:BPSS1504. Gezeigt sind gepoolte Daten aus zwei
unabhängig von einander durchgeführten Versuchen.
B: Sterbeverhalten von BALB/c-Mäusen (n=5) nach intranasaler Infektion mit unterschiedlichen Dosen von B.
ps. ∆BPSS1504. Gezeigt sind Daten aus einem einfach durchgeführten Experiment.
73
Ergebnisse
Lunge
Milz
*
10 7
10 3
10 2
10
10 3
CFU/organ
CFU/organ
CFU/organ
10 4
3
10 2
10 0
E8
∆ BPSS1504
10 2
10 1
10 1
1
**
10 4
10 4
10 5
10
**
10 5
10 6
Leber
10 0
E8
∆ BPSS1504
10 0
E8
∆ BPSS1504
Abb. 23: Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Milz und Leber von BALB/c-Mäusen (n=4) 48 h nach
intranasaler Infektion mit 30 CFU B. ps. E8 oder B. ps. ∆BPSS1504.
Gezeigt sind Daten aus einem einfach durchgeführten Experiment.
Um den Grad der Attenuierung von B. pseudomallei ∆BPSS1504 zu untersuchen, wurden
BALB/c-Mäuse mit verschiedenen Infektionsdosen von B. pseudomallei ∆BPSS1504
infiziert (siehe Abb. 22B). Dabei überlebten die Tiere eine Infektionsdosis von 3.000 CFU
ohne zu erkranken. Bei einer Dosis von 13.000 CFU (n=5) verstarb lediglich eine Maus
fünf Tage nach der Infektion, während die anderen Tiere zunächst erkrankten, sich jedoch
nach einigen Tagen erholten und den untersuchten Zeitraum von 94 Tagen überlebten.
Die Organpräperation der überlebenden Tiere zeigte, dass 94 Tage nach der Infektion die
Organe fast aller Mäuse steril waren. Lediglich bei einer Maus war B. pseudomallei noch
in der Lunge zu finden (1500 CFU/Organ). Bei einer Infektionsdosis von 130.000 CFU
erkrankten alle Tiere und verstarben innerhalb von fünf Tagen, was zeigt, dass die
Deletion von BPSS1504 nicht zu einer kompletten Avirulenz führt.
Daten aus unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass BALB/c-Mäuse nach
intranasaler Infektion mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp bereits bei einer Infektionsdosis
von weniger als 100 CFU innerhalb von wenigen Tagen versterben (unpublizierte Daten).
Es ist daher anzunehmen, dass die Deletion von BPSS1504 zu einer etwa 1000 fachen
Virulenzattenuierung von B. pseudomallei E8 führt.
4.2.8 Einfluss von BPSS1504 auf die Regulation des Typ-VISekretionssystem 1
Die aufgezeigten phänotypischen Veränderungen von B. pseudomallei ∆BPSS1504, wie
die stark eingeschränkte Fähigkeit zur Induktion von Riesenzellbildung und reduzierte
intrazelluläre Replikation, ähneln den Phänotypen anderer Mutanten des T6SS-1, wie
74
Ergebnisse
zum Beispiel den Mutanten des hcp1-Gens und der T6SS-1 Regulatorgene virA/G
(Burtnick et al., 2011, Chen et al., 2011). Daher stellte sich die Frage, ob die BPSS1504Deletion einen Einfluss auf die Expression anderer Gene des T6SS-1 hat. Die starke
Attenuierung von B. pseudomallei ∆BPSS1504 im Mausmodell könnte ebenfalls ein
Hinweis darauf sein, dass BPSS1504 eine regulatorische Funktion besitzt. Wie unter 4.2.2
gezeigt wurde, wird die mRNA-Expression von BPSS1504 nach Invasion in Makrophagen
induziert. Daher wurden RAW264.7-Zellen mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp oder B.
pseudomallei ∆BPSS1504 infiziert und die mRNA-Expression verschiedener Gene des
T6SS-1, sowie deren Regulatoren zwei Stunden und fünf Stunden nach Infektion
analysiert. Hierbei konnte, analog zu bisher publizierten Daten, fünf Stunden nach der
Infektion ein signifikanter Anstieg des mRNA-Levels der T6SS-Gene hcp1, vgrG und tssA
aber auch des im T3SS-Cluster-3 kodierten Regulator-Genes bprC gezeigt werden.
Jedoch fanden sich zwischen B. pseudomallei ∆BPSS1504 und dem B. pseudomallei E8
Wildtyp keine signifikanten Unterschiede in der Expression von hcp1, vgrG, tssA oder virG
sowie den Regulatoren bprC und bsaN (siehe Abb. 24). BPSS1504 scheint daher keinen
regulatorischen Einfluss auf die Expression des T6SS-Cluster1 zu haben.
virG
bsaN
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
relatives mRNA-Level
relatives mRNA-Level
1
2
2
5
hcp1
2
1
2
5
relatives mRNA-Level
*
3
2
1
Zeit post infectionem [h]
∆BPSS1504
**
5
**
4
3
2
1
0
0
5
E8
tssA
*
4
**
5
Zeit post infectionem [h]
vgrG
**
2
3
Zeit post infectionem [h]
Zeit post infectionem [h]
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
4
0
0
0.0
relatives mRNA-Level
relatives mRNA-level
3.0
*
5
2
3.5
relatives mRNA-Level
bprC
2
5
Zeit post infectionem [h]
2
5
Zeit post infectionem [h]
Abb. 24: Expression der T6SS-1 Gene hcp1, vgrG und tssA sowie deren Regulatoren virG, bsaN und
bprC beim B. ps. E8 Wildtyp und B. ps. ∆BPSS1504 nach Infektion von RAW264.7-Zellen.
Relative Quantifizierung der Genexpression durch Realtime-PCR mit 16S rRNA als Referenzgen; gezeigt sind
Mittelwerte mit Standardabweichungen aus vier unabhängigen, jeweils als Doppelbestimmung durchgeführten
Experimenten. Normalisiert wurde jeweils gegen die 2 h-Werte des B. ps. E8 Wildtyps.
75
Ergebnisse
4.2.9 Auswirkungen der BPSS1504-Deletion auf die Sekretion von
Effektorproteinen des Typ-VI- und Typ-III-Sekretionssystems
Die Tatsache, dass B. pseudomallei ∆BPSS1504 trotz der normalen m-RNA Expression
von hcp1 und anderen T6SS-1-Genen einen ähnlichen Phänotyp aufweist wie einige
andere T6SS-1 Mutanten (Burtnick et al., 2011; Chen et al., 2011), führte zu der Frage, ob
das durch BPSS1504 kodierte Protein einen Einfluss auf die Sekretion von Effektoren des
T6SS-1 hat. In Proteomanalysen, die in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt wurden,
konnte das Hcp1-Protein in Überständen von B. pseudomallei E8-Kulturen in der frühen
stationären Phase detektiert werden (Meukow, unveröffentlichte Daten). Deshalb wurden
Überstände von B. pseudomallei E8- und B. pseudomallei ∆BPSS1504-Kulturen, die bis
zu 32 Stunden in LB-Medium oder Vogel-Bonner-Medium angezogen wurden, gesammelt
und Westenblot-Analysen mit einem Hcp1-spezifischen Antikörperserum durchgeführt.
Hierbei zeigte sich sowohl beim B. pseudomallei E8 Wildtyp als auch bei B. pseudomallei
∆BPSS1504 über die Zeit eine Zunahme von Hcp1 im Kulturüberstand. Jedoch waren
weder in LB-Medium (Abb. 25A) noch in Minimalmedium (Abb. 25B) Unterschiede in der
Hcp1-Sekretion zwischen dem Wildtyp und der ∆BPSS1504-Mutante erkennbar. Dies
deutet darauf hin, dass es sich bei dem durch BPSS1504 kodierten Protein nicht um eine
Strukturkomponente des T6SS-1 handelt, die für die Sekretion von Effektoren essentiell
ist.
B
A
8h
BPSS1504
Hcp1
Hcp1
+
24h
-
+
32h
-
+
BPSS1504
-
+
-
Kulturüberstand
Hcp1
Kulturüberstand
Zelllysat
Hcp1
Zelllysat
Abb. 25: Western-Blot–Analyse intra- und extrazellulärer Proteinen des B. ps. E8 Wiltyps und B. ps.
∆BPSS1504 zur Detektion von sekretiertem Hcp1.
A: nach Anzucht in LB-Medium für 8 h, 24 h und 32 h.
B: nach Anzucht in Vogel-Bonner-Medium für 32 h.
Abbildungen sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.
Weiterhin wurde untersucht, ob BPSS1504 einen Einfluss auf die Funktionalität des
T3SS-3, welches ebenfalls für die Virulenz von B. pseudomallei im Säuger bedeutend ist,
hat. Hierfür wurde mittels Western-Blot die Sekretion des T3SS-3 Effektorproteins BopE,
sowie des Translokatorproteins BipD untersucht. Auch hier zeigten sich keine
76
Ergebnisse
Unterschiede in der Sekretion durch B. pseudomallei ∆BPSS1504 verglichen mit dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp (Abb. 26). Die gezeigten Daten legen nahe, dass die starke
Virulenzattenuierung durch die BPSS1504-Deletion unabhängig von bekannten Effektoren
des T6SS-1 und des T3SS-3 hervorgerufen wird.
B
A
BPSS1504
+
BPSS1504
-
+
-
BipD
Zelllysat
BopE
Zelllysat
BipD
Kulturüberstand
BopE
Kulturüberstand
Abb. 26: Western-Blot–Analyse intra- und extrazellulärer Proteine des B. ps. E8 Wildtyps und B. ps.
∆BPSS1504 nach 6 h Wachstum in LB zur Detektion von T3SS-3 Translokor- oder Effektor-Proteinen.
A: Expression und Sekretion von BipD.
B: Expression und Sekretion von BopE.
Abbildungen sind repräsentativ für zwei unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.
4.2.10 In silico-Analyse von BPSS1504
Die in dieser Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass BPSS1504 eine bedeutende Rolle für
das intrazelluläre Überleben und die Virulenz von B. pseudomallei spielt. Die zugrunde
liegenden molekularen Wirkungsmechanismen des durch BPSS1504 kodierten Proteins,
welche zu den beobachteten Phänotypen der Mutante führen, bleiben jedoch noch
ungeklärt. Um einen Anhaltspunkt für eine mögliche Funktion von BPSS1504 zu
bekommen, wurde die Suche nach homologen Proteinen mit bekannter Funktion und
nach konservierten Domänen in der Proteinsequenz hinzugezogen. Die BLAST-Analyse
von BPSS1504 ergab, dass Homologe zu diesem Gen ausschließlich in B. mallei und B.
thailandensis zu finden sind und dort ebenso für ein hypothetisches Protein im Cluster des
T6SS-1 kodieren. Dabei ist das BPSS1504-homologe Gen des Pathogens B. mallei
BMA10247_A1681 zu 99% identisch mit BPSS1504, während das Gen BTH_II0862 des
nahezu avirulenten B. thailandensis nur 85% Sequenzidentität mit BPSS1504 teilt (siehe
Anhang).
Die Tatsache, dass Homologe zu BPSS1504 nur in zwei zu B. pseudomallei sehr
nahe verwandten Arten gefunden wurde lässt vermuten, dass es sich bei dem kodiertem
Protein nicht um eine konservierte Strukturkomponente des T6SS handelt. Jedoch
können nicht konservierte T6SS-assozierte Gene (tags) beispielsweise zur Verankerung
des Sekretionsapparates in der Zellhülle beitragen, wie zum Beispiel das TagL-Protein
von EAEC welches in der inneren Membran lokalisiert ist und mit TssL und dem
77
Ergebnisse
Peptidoglycan interagiert (Aschtgen et al., 2010). In Pseudomonas putida wird diese
Funktion
dem
TagP-Protein
zugeschrieben
(Aschtgen
et
al.,
2010).
Durch
bioinformatische Analyse der durch BPSS1504 kodierten Proteinsequenz im TMHMMServer konnten für dieses Protein keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden.
Weiterhin konnten bei der Suche nach konservierten Domänen keine PeptidoglucanBindedomänen gefunden werden.
Hingegen ergab die Suche nach konservierten Domänen, dass die Aminosäuren 114240 des BPSS1504-Proteins eine konservierte Domäne mit unbekannter Funktion,
DUF2169, welche häufig in bakteriellen Proteinen zu finden ist, bilden. Der C-Terminus
der Proteinsequenz wird hauptsächlich von Pentapeptid-Repeats gebildet, bei welchen
jede fünfte Aminosäure Phenylalanin oder Leucin ist. Pentapeptidrepeat-Proteine sind in
nahezu allen Organismen außer in Hefen zu finden, kommen aber besonders häufig bei
Cyanobakterien vor. Bisher sind nur von sehr wenigen dieser Proteine die Funktionen
bekannt (Vetting et al., 2006). Das HglK-Protein von Anabena sp. ist in den Aufbau der
Glycolipidschicht bei der Bildung von Heterozysten verwickelt (Black et al., 1995). Jedoch
ist der molekulare Mechanismus hierfür nicht geklärt. Die Pentapeptiderepeat-Proteine
Qnr von Klebsiella pneumoniae und MfpA von Mycobacterium tuberculosis vermitteln eine
gewisse Resistenz gegen Fluoroquinolone (Montero et al., 2001; Tran & Jacoby, 2002).
Diese Klasse von Antibiotika entfaltet ihre Wirkung indem sie mit den Typ-IITopoisomerasen Topoisomerase IV und Gyrase interagieren und die Religation der DNA
während des Katalysezyklus der Enzyme hemmen, was letztlich zu Doppelstrangbrüchen
in der DNA führt. Die Pentapeptideproteine Qnr und MfpA schützen die DNA indem sie
die DNA-Gyrase hemmen (Montero et al., 2001; Tran & Jacoby, 2002). Die Struktur von
MfpA wurde aufgeklärt (Hegde et al., 2005). Dabei zeigte sich, dass die PentapeptidRepeat-Struktur eine rechtshändige, quadrilaterale β-Helix bildet, die in ihrer Struktur und
Ladung der B-Form der DNA ähnelt. Dabei bildet jedes Pentapeptid eine Seite der
quadrilateralen Struktur wobei die konservierten, hydrophoben Phenylalanin- und LeucinReste ins innere der Helix hineinragen (siehe Abb. 28A). Eine ähnliche Struktur weist
auch das Pentapepidrepeat-Protein AlgB von Xanthomonas albilineans auf, welches
ebenfalls die DNA-Gyrase hemmt und hierdurch eine Resistenz gegen das antibiotisch
und phototoxisch wirkende Polyketid-Peptid Albicidin vermittelt (Vetting et al., 2011).
Weiterhin weisen auch die Pentapeptiderepeat-Proteine Np275 und Np276 aus Nostoc
punctiforme eine ähnliche Struktur auf, mit dem Unterschied, dass die konservierten in
das innere der Helix hineinragenden Aminosäurenreste ausschließlich Leucin-Reste sind
(Vetting et al., 2009). Über die Funktion dieser Proteine ist jedoch nichts bekannt. Die
78
Ergebnisse
Pentapetide-Domäne von BPSS1504 weist eine große Ähnlichkeit zu den genannten
Pentapeptid-Proteinen auf (siehe Abb. 27).
A
Np275
HglK
BPSS1504
MfpA
B
Np275
HglK
BPSS1504
MfpA
Abb. 27: Ausschnitte aus einem multiplem Alignment verschiedener Pentapepidrepeat-Proteine.
A: Np275 AS 74-130, HglK AS 497-555, BPSS1504 AS 686-746, ; MfpA AS 69-125
B: Np275 AS 131-195, HglK AS 577-638, BPSS1504 AS 772-836; MfpA AS 126-186
Ein „*“ kennzeichnet Positionen mit einem einzigen, voll konservierten Aminosäurerest; Ein „:“ kennzeichnet
Konservierung zwischen Gruppen mit sehr ähnlichen Eigenschaften; Ein „.“ kennzeichnet Konservierung
zwischen Gruppen mit leicht ähnlichen Eigenschaften.
Blau: kleine und hydrophobe (inkl.aromatische) Aminosäuren (AVFPMILW); Magenta: Saure Aminosäuren
(DE); Rot: Basische Aminosäuren (RK); Grün Aminosäuren mit Hydroxyl-; Sulfhydryl- oder Amino-Gruppe und
Glycin (STYHCNGQ.)
D
Hegde et al., 2005
Abb. 28: Vergleich der vorhergesagten Struktur für das durch BPSS1504 kodierte Protein mit dem
Pentapeptide-Protein MfpA aus Mycobacterium tuberculosis. A-C aus Hedgee et al. 2005.
A: MfpA-Dimer in Seitenansicht mit Farbverlauf von blau am N-Terminus nach rot am C-Terminus.
B: MfpA-Monomer Ansicht entlang der helikalen Achse vom N-Terminus (blau) zum C-Terminus (rot).
C: Stick-Darstellung der Reste 2 bis 81 mit Ansicht entlang der helikalen Achse.
D: Strukturvorhersage des durch BPSS1504 kodierten Proteins durch ESy-Pred3D in Darstellung analog zu
A-C.
79
Ergebnisse
Die Strukturvorhersage durch ESyPred3D schlägt für das durch BPSS1504 kodierte
Protein eine dem MfpA-Protein ähnliche Struktur vor (Abb. 28B). Auf dieser Basis wäre
eine Interaktion des BPSS1504-Proteins mit DNA bindenden Proteinen denkbar.
Weiterhin zeigt der C-terminus des BPSS1504-Proteins mit seiner Pentapeptidstruktur
eine gewisse Ähnlichkeit zu den C-Termini von PipB und PipB2, zwei Effektorproteinen
des T3SS von Salmonella enterica (siehe Abb. 29). Es wäre daher auch denkbar, dass
BPSS1504 analoge Effektorfunktionen zu PipB und PipB2 besitzt. PipB2 ist ein
Linkerprotein für Kinesin-1 und für die Reorganisation des späten Endolysosomes und der
Ausbildung Salmonella-induzierten Filamenten bedeutend. Es wurde gezeigt, das PipB
diese Funktion nicht besitzt (Henry et al., 2006; Knodler & Steele-Mortimer, 2005). Ein
Pentapeptide (LFNEF) von PipB2, welches bei PipB fehlt, scheint eine essentielle Rolle
für die PipB2-vermittelte Positionierung des Endolysosomens zu spielen. Doch scheinen
noch weitere Sequenzmotive von PipB2 für dessen Funktion notwendig zu sein. Im
intrazellulären Lebenszyklus von B. pseudomallei ist bisher kein mit der Salmonellainduzierten Reorganisation des Endolysosomens vergleichbarer Schritt bekannt. Auch
fehlt bei BPSS1504 das für diese Funktion essentielle Sequenzmotiv LFNEF. Eine zu
PipB2 analoge Funktion von BPSS1504 ist nicht vollkommen auszuschließen, scheint
aber eher unwahrscheinlich.
PipB
PipB2
BPSS1504
PipB
PipB2
BPSS1504
PipB
PipB2
BPSS1504
PipB
PipB2
BPSS1504
Abb. 29: Ausschnitt aus einem Alignment von PipB, PipB2 und BPSS1504.
Ein „* “ kennzeichnet Positionen mit einem einzigen, voll konservierten Aminosäurerest; Ein „:“ kennzeichnet
Konservierung zwischen Gruppen mit sehr ähnlichen Eigenschaften; Ein „.“ kennzeichnet Konservierung
zwischen Gruppen mit leicht ähnlichen Eigenschaften.
Blau: kleine und hydrophobe (incl.aromatische) Aminosäuren (AVFPMILW); Magenta: Saure Aminosäuren
(DE); Rot: Basische Aminosäuren (RK); Grün Aminosäuren mit Hydroxyl-; Sulfhydryl- oder Amino-Gruppe und
Glycin (STYHCNGQ).
80
Ergebnisse
4.3 Charakterisierung von B. pseudomallei ∆bsaU
Eine Transposonmutante des im T3SS-3 lokalisierten Gens bsaU (BPSS1539) war in
einem
Plaqueassay
durch
reduzierte
Plaquebildung
auffällig
geworden.
Diese
Transposonmutante konnte nach Infektion von HeLa-Zellen nur verzögert aus dem
Phagolysosomen ausbrechen und zeigte sich attenuiert im Mausmodell (Pilatz et al.,
2006). Dabei konnten jedoch polare Effekte auf andere Gene des T3SS-3 wie bsaZ oder
bipD, deren Mutanten ähnliche Phänotypen zeigten, nicht ausgeschlossen werden. Im
Rahmen dieser Arbeit wurden eine markerlose Deletionsmutante des bsaU-Gens und
eine Komplementante hergestellt und die Auswirkungen der gezielten Deletion untersucht.
4.3.1 Expression von bsaU
Es konnte gezeigt werden, dass das T3SS-3 im B. pseudomallei-Stamm K96243 unter
Salzstress induziert wird (Pumirat et al., 2010). Um zu testen ob sich das Gen bsaU auch
in B. pseudomallei E8 durch Salzstress induzieren lässt, wurde die Expression von bsaU
nach
vier
stündigem
Wachstum
in
LB-Medium
mit
verschiedenen
Natriumchloridkonzentrationen überprüft. Hierbei zeigte sich eine deutliche Zunahme der
Cl
Na
47
0m
M
32
0m
M
Na
Cl
Cl
Na
17
0m
M
Cl
Na
85
mM
0m
M
Na
Cl
Genexpression mit steigender Salzkonzentration, wie in Abb. 30 gezeigt.
bsaU
23S rRNA
Abb. 30: Expression von bsaU in B. pseudomallei E8 nach vier stündigem Wachstum in LB-Medium
mit 0, 85, 170, 320, oder 470 mM NaCl.
Semiquantitative RT-PCR mit 23S rRNA als Referenzgen.
Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
81
Ergebnisse
4.3.2 Wachstum, Motilität und Biofilmbildung von B. pseudomallei ∆bsaU
Die initiale Charakterisierung von B. pseudomallei ∆bsaU zeigte, dass das Wachstum der
Mutante sich weder in LB-Medium noch in Minimalmedium signifikant vom B.
pseudomallei E8 Wildtyp unterschied (siehe Abb. 31A und 31B). Aufgrund der Induktion
von bsaU unter Salzstress wurde weiterhin das Wachstum der Mutante in LB-Medium mit
170 mM NaCl untersucht, wobei ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zum B.
pseudomallei E8 Wildtyp aufgezeigt werden konnten (Abb. 31C).
Weiterhin zeigte B. pseudomallei ∆bsaU verglichen mit dem B. pseudomallei E8
Wildtyp keine signifikanten Unterschiede in der Beweglichkeit auf Softagar und in der
Biofilmbildung (Abb. 32).
A
B
10.0
7.5
5.0
2.5
E8
∆bsaU
0.0
0
10
20
30
40
Zeit [h]
C
12.5
OD bei 650nm
OD bei 650 nm
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
E8
∆bsaU
0.0
0
25
50
75
100
Zeit [h]
OD bei 650 nm
12.5
10.0
7.5
5.0
E8
∆bsaU
2.5
0.0
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [h]
Abb. 31: Wachstumsverhalten von B. ps. ∆bsaU im Vergleich zum B. ps. E8 Wildtyp.
A: Änderung der Optischen Dichte bei 650 nm während des Wachstums in LB-Medium.
B: Änderung der Optischen Dichte bei 650 nm während des Wachstums Vogel-Bonner-Medium.
C: Änderung der Optischen Dichte bei 650 nm während des Wachstums in LB-Medium mit 170 mM NaCl.
Abgebildet ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis von drei Experimenten.
82
Ergebnisse
A
B
125
0.35
0.30
OD bei 540nm
Motilität in %
100
75
50
25
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
E8
0.00
∆ bsaU
∆ bsaU
E8
Abb. 32: Motilität und Biofilmbildung von B. ps. ∆bsaU im Vergleich zum B. pseudomallei E8 Wildtyp.
A: Ausschwärmen auf Softagarplatten nach 24 h Inkubation bei 37°C; der Hofdurchmesser des Wildtyps E8
wurde gleich 100% gesetzt; Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten jeweils mit Doppelbestimmung.
B: Quantifizierung der Biofilmbildung nach 24 h statischer Inkubation bei 37°C über Bestimmung des
Kristallviolett-Rückhaltevermögens
adhärenter
Bakterien
durch
Absorptionmessung
bei
540
nm.
Repräsentatives Ergebnis aus fünf unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit Mittelwert und
Standardabweichung aus Sechsfachbestimmungen.
4.3.3 Invasions- und Replikationsverhalten von B. pseudomallei ∆bsaU
Im nächsten Schritt wurde die Fähigkeit von B. pseudomallei ∆bsaU in phagozytierende
und in nicht-phagozytierende Zellen einzudringen und intrazellulär zu replizieren
untersucht. Hierzu wurden sowohl humane Lungenepithelzellen (A549) als auch murine
Makrophagen-ähnliche
Leukämiezellen
(RAW264.7)
und
primiäre
Knochenmark-
makrophagen aus C57BL/6-Mäusen (C57BL/6-BMM) infiziert. Hierbei zeigte B.
pseudomallei ∆bsaU verglichen mit B. pseudomallei E8 Wildtyp keine Unterschiede in der
Fähigkeit zur Invasion in phagozytierende (RAW264.7-Zellen; C57BL/6-BMM) und in
intrazelluläre CFU/well
nichtphagozytierende Zellen (A549-Zellen).
10 6
**
10 5
10 4
10 3
*
10 2
E8
10 1
bsaU
10 0
0
6
12
18
24
30
Zeit post infectiom [h]
Abb. 33: Vergleich des Invasions- und Replikationsverhalten des B. ps. E8 Wildtyps und B. ps.
∆BPSS1504 in A549-Zellen nach Infektion mit MOI 2,5.
Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten mit
Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.
83
Ergebnisse
Hingegen war die intrazelluläre Replikation von B. pseudomallei ∆bsaU deutlich
eingeschränkt. Wie in Abb. 33 gezeigt, waren die intrazellulären Keimzahlen von B.
pseudomallei ∆bsaU in A549-Zellen sowohl 6 Stunden als auch 24 Stunden nach
Infektion signifikant niedriger als die des B. pseudomallei E8 Wildtyps.
Da RAW264.7-Zellen 24 Stunden nach der Infektion mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp
stark lysiert waren, wurden die intrazellulären Keimzahlen in diesen Zellen 16 Stunden
nach der Infektion bestimmt. Wie in Abb. 34A gezeigt, fanden sich auch hier signifikant
geringere Keimzahlen in den Zellen, die mit B. pseudomallei ∆bsaU infiziert waren
verglichen mit den Zellen, die mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp infiziert waren.
Ebenso waren die intrazellulären Keimzahlen in C57BL/6 Knochenmarkmakrophagen 24
Stunden nach Infektion mit B. pseudomallei ∆bsaU gegenüber dem B. pseudomallei E8
Wildtyp signifikant reduziert (Abb. 34B).
B
***
10 6
10 5
10
4
10 3
E8
∆bsaU
10 2
0h
16h
Zeit post infectionem [h]
intrazelluläre CFU/ well
intrazelluläre CFU/ well
A
10 5
*
10
4
10 3
E8
∆bsaU
10 2
0
6
12
18
24
30
Zeit post infectionem [h]
Abb. 34: Vergleich des Invasions- und Replikationsverhalten des B. ps. E8 Wildtyps und B. ps. ∆bsaU
in Makrophagen.
A: Invasion und Replikation in RAW264.7-Zellen nach Infektion mit MOI 3.
B: Invasion und Replikation in C57BL/6-BMM nach Infektion mit MOI 1,5.
Gezeigt ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis aus drei unabhängig voneinander durchgeführten
Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.
4.3.4 Einfluss von BsaU auf die Induktion von Zelltod
4.3.4.1 Auswirkungen der bsaU-Deletion auf die Zytotoxizität
Um zu untersuchen, ob die Deletion von bsaU Auswirkungen auf die Zytotoxizität von B.
pseudomallei gegenüber phagozytierende und nicht-phagozytierende Zellen hat, wurden
Echtzeit-Zellstatus-Analysen durchgeführt (vergleiche Abschnitt 4.2.4.1.1). Dabei zeigte
sich nach Infektion von A549-Zellen mit B. pseudomallei ∆bsaU ein langsameres
Absinken des Zellindexes als bei den mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp infizierten
84
Ergebnisse
Zellen (siehe Abb. 35A). Ebenso zeigte sich nach Infektion von RAW264.7-Zellen ein
deutlicher Unterschied in der Zytotoxizität von B. pseudomallei ∆bsaU gegenüber dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp (siehe Abb. 35B). Der Zellindex von mit B. pseudomallei E8
infizierten RAW264.7-Zellen sank etwa 30 h nach Infektion in kurzer Zeit auf den
Hintergrundwert ab, während nicht infizierte RAW 264.7-Zellen noch bis zu 110 Stunden
weiter wachsen konnten. Hingegen begann der Zellindex der mit B. pseudomallei ∆bsaU
infizierten Zellen erst etwa 50 h nach Infektion abzusinken, was auf ein verzögertes
Eintreten des Zelltods gegenüber den mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp infizierten
Zellen hinweist. Wie diese Daten zeigen, scheint die bsaU-Deletion einen Einfluss auf die
Zytotoxizität von B. pseudomallei zu haben.
A Infektion
Normalisierter Zellindex
Normalisierter Zellindex
B Infektion
0
20
40
60
80
100 120
Zeit post infectionem [h]
140
160
0
20
40
60
80
100 120
Zeit post infectionem [h]
uninfizierte A549-Zellen
uninfizierte RAW264.7-Zellen
E8 infizierte A549-Zellen
E8 infizierte RAW264.7-Zellen
∆bsaU infizierte A549-Zellen
∆bsaU infiziete RAW 264.7-Zellen
140
160
Abb. 35: Echtzeit-Zellstatusanalyse nach Infektion mit dem B. ps. E8 Wildtyp oder B. ps. ∆bsaU im
Vergleich zu nicht infizierten Zellen.
A: A549-Zellen nach Infektion mit MOI 20.
B: RAW264.7-Zellen nach Infektion mit MOI 2.
Gezeigt sind repräsentative Ergebnisse aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.3.4.2 Einfluss von bsaU auf die Induktion von Caspasen
Um näher zu untersuchen, ob die verminderte Zytotoxizität von B. pseudomallei ∆bsaU
auf Defekte bei der Induktion von apoptotischen oder pyroptotischen Caspasen
zurückzuführen ist , wurde die Aktivierung der Caspasen 1 und 7 durch B. pseudomallei
∆bsaU in C57BL/6-Knochenmarkmakrophagen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der
Infektion untersucht. Durch Western-Blot-Analyse konnte gezeigt werden, dass drei, acht
und zehn Stunden nach der Infektion mit B. pseudomallei ∆bsaU weder die pyroptotische
Caspase-1 noch die apoptotische Caspase-7 in ihrer aktiven Form vorliegen, während
85
Ergebnisse
diese Caspasen zu den entsprechenden Zeitpunkten nach der Infektion mit dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp in ihrer aktiven Form nachweisbar sind (siehe Abb. 36). Diese
Daten deuten darauf hin, dass BsaU direkt oder indirekt sowohl in pyroptotische als auch
in apoptotische Mechanismen verwickelt ist.
A
t
er
izi
f
in
E8
Un
s
∆b
aU
Procaspase 1
B
t
er
izi
f
in
Un E 8
U
sa
∆b
Caspase 1 p10
GAPDH
Procaspase 7
Caspase 7
GAPDH
Abb. 36: Western-Blot-Analyse von Proteinen aus C57BL/6 BMM 8 h nach Infektion mit dem B. ps. E8
Wildtyp oder B. ps. ∆bsaU (MOI 50)
A: Aktivierung von Caspase-1
B: Aktivierung von Caspase-7
Als Ladekontrolle diente die GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase). Repräsentatives
Ergebnis aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.3.5 Einfluss der bsaU-Deletion auf die Induktion von Riesenzellbildung
Verschiedene Arbeiten berichteten über eine reduzierte Induktion von Riesenzellbildung
durch Mutationen in Genen des T3SS-Cluster-3 (Burtnick et al., 2008; Muangsombut et
al., 2008; Suparak et al., 2005). Um zu untersuchen, ob BsaU in die Induktion von
vielkernigen Riesenzellen involviert ist, wurden RAW264.7-Zellen 16 Stunden nach der
Infektion fixiert und mit GIEMSA-Lösung angefärbt. Wie in Abb. 37 gezeigt, ist die
Riesenzellenbildung nach Infektion mit B. pseudomallei ∆bsaU verglichen mit der
Riesenzellbildung nach Infektion mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp deutlich reduziert,
wenn auch B. pseudomallei ∆bsaU prinzipiell noch in der Lage ist Riesenzellbildung zu
induzieren (siehe Abb. 37). Die Komplementation des bsaU-Gens führte wieder zu einer
Zunahme in der Induktion von Zellfusionen. Die Daten lassen vermuten, dass bsaU, in
Analogie zu anderen Genen des T3SS-3, direkt oder indirekt in die Bildung von
vielkernigen Riesenzellen involviert ist.
86
Ergebnisse
A
B
Uninfizierte RAW264.7
E8 infizierte RAW264.7
∆bsaU infizierte RAW264.7
∆bsaU:Tn7:bsaU infizierte
RAW264.7
100µm
100µm
100µm
100µm
100µm
100µm
100µm
100µm
100%
>60 Kerne/Zelle
80%
30-60 Kerne/Zelle
60%
11-29 Kerne/Zelle
40%
4-10 Kerne/Zelle
2-3 Kerne/Zelle
20%
1 Kern/Zelle
0%
uninfiziert
E8 infiziert
∆bsaU infiziert ∆bsaU:Tn7:bsaU
infiziert
Abb. 37: Bildung von vielkernigen Riesenzellen bei RAW264.7-Zellen 16 h nach Infektion mit dem B.
ps. E8 Wildtyp, B. ps. ∆bsaU und B. ps. ∆bsaU:Tn7:bsaU im Verhältnis 2:1.
A: Mikroskopische Aufnahme von RAW264.7- Zellen nach GIEMSA-Färbung.
B: Quantifizierung der Zellkernverteilung durch Auszählung der Kerne pro Zelle.
Abbildungen sind repräsentativ für vier unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.
4.3.6 Rolle von BsaU beim Ausbrechen aus dem Endosomen und der
Induktion von Aktinschweifen
Eine Transposonmutante des bsaU-Gens konnte, ähnlich wie andere Mutanten von
T3SS-3-Genen, nur verzögert aus dem Phagosomen ausbrechen (Pilatz et al., 2006). Um
polare Effekte auf andere Gene des T3SS-Cluster-3 auszuschließen, wurden die
Deletionsmutante und die Komplementante des bsaU-Gens mittels ImmunofluoreszenzFärbung von infizierten HepG2-Zellen auf ihre Fähigkeit aus dem Endolysosomen
auszubrechen untersucht.
87
Ergebnisse
A
α- B. ps. EPS
α- β- Aktin
Merge
E8
10µm
α- β- Aktin
α- B. ps. EPS
Merge
∆bsaU
10µm
α- β- Aktin
α- B. ps. EPS
Merge
∆bsaU:Tn7:bsaU
10µm
10µm
B
α- β- Aktin
α- B. ps. EPS
Merge
∆bsaU
10µm
α- β- Aktin
α- B. ps. EPS 10µm
Merge
∆bsaU
10µm
C
Hoechst
α- B. ps. EPS
α- LAMP1
Merge
E8
10µm
Hoechst
α- B. ps. EPS
α- LAMP1
Merge
∆bsaU
10µm
Abb. 38: Immunfluoreszenzfärbung von HepG2-Zellen nach Infektion mit dem B. ps. E8 Wildtyp B. ps.
∆bsaU oder B. ps. ∆bsaU:Tn7:bsaU.
A: Färbung des β-Aktin-Gerüst der Zellen (rot) und der Bakterien (grün) 8 h nach Infektion.
B: Färbung des β-Aktin-Gerüst der Zellen (rot) und der Bakterien (grün) 16 h nach Infektion.
C: Färbung des Zellkerns (blau), der LAMP-1 assozierten Vakuolen (rot) und der Bakterien (grün) 8 h nach
Infektion.
88
Ergebnisse
Wie in Abb. 38A und 38C gezeigt, war der B. pseudomallei E8 Wildtyp acht Stunden nach
der Infektion frei im Zytoplasma zu finden, konnte Aktinschweife ausbilden, und war kaum
mit Lamp-1, einem Marker des Endolysosomens assoziiert. Hingegen war B.
pseudomallei ∆bsaU zu diesem Zeitpunkt kaum in Assoziation mit Aktinschweifen zu
finden. Stattdessen waren in den mit B. pseudomallei ∆bsaU infizierten Zellen vorwiegend
Bakteriencluster
zu
beobachten
(Abb.
38A).
Diese
waren
zumeist
mit
dem
endolysosomalen Protein Lamp-1 assoziiert (siehe Abb. 38C), was auf eine Lokalistion
der Mutante im Endolysosomen hinweist. Die komplementierte Mutante B. pseudomallei
∆bsaU:Tn7:bsaU konnte wieder häufiger frei im Zytosol vorgefunden werden, wo sie
Aktinschweife induzieren konnte (siehe Abb 38A). Dies deuted darauf hin, dass es sich
bei dem beobachteten Phänotyp nicht nur um einen polare Effekt auf andere Gene des
T3SS-Cluster 3 handelt, sondern bsaU selbst eine Rolle für das Ausbrechen aus dem
Endosomen spielt. Wie in Abb. 38B gezeigt war B. pseudomallei ∆bsaU 16 Stunden nach
Infektion in großer Anzahl frei im Zytoplasma lokalisiert, was zeigt, dass die Mutante
zeitlich verzögert aus dem Endolysosomen ausbrechen kann und nahe legt, dass bsaU
für das Ausbrechen aus dem Endosomen nicht absolut essentiell ist. Daneben war B.
pseudomallei ∆bsaU zu diesem Zeitpunkt aber auch in riesigen, mit einer Vielzahl von
Bakterien gefüllten Vesikeln zu finden, was auf eine Replikation von B. pseudomallei
∆bsaU im Endolysosomen hindeutet.
4.3.7 In silico-Analyse von BsaU
Viele Strukturkomponenten von T3SS sind hoch konserviert. Das bsaU-Gen liegt im
Cluster des T3SS zwischen den Genen, die für diese konservierten Strukturkomponenten
kodieren. Interessanterweise konnten durch BLAST-Analysen homologe Proteine nur in
den nahe verwandten Spezies B. mallei und B. thailandensis gefunden werden, welche
94% (B. mallei NCTC 10247) und 91% (B. thailandensis E264) Identität zeigen. In der
Proteinsequenz konnten keine bereits bekannten konservierten Domänen und keine
Transmembrandomänen gefunden werden, welche auf eine mögliche Funktion oder
Lokalisation des Proteins hinweisen könnten. In einem kürzlich veröffentlichten Review,
wurde BsaU eine mögliche Funktion bei der Kontrolle der Nadellänge des T3SS-3
zugeordnet (Sun & Gan, 2010), jedoch gibt es hierzu keine experimentellen
Anhaltspunkte. Die Strukturvorhersage des Proteins lässt vermuten, dass lange Bereiche
der Aminosäuresequenz eine ungeordnete Loop-Struktur bilden (siehe Abb. 39). Dies
könnte darauf hindeuten, dass das native Protein als Monomer sehr instabil ist.
Möglicherweise bildet BsaU Polymere, oder interagiert unter in vivo-Bedingungen mit
anderen Proteinen.
89
Ergebnisse
A
B
Abb. 39: Vorhersage der Tertiärstuktur für das BsaU-Protein.
A: Cartoondarstellung mit Sekundärstrukturmotiven (α-Helices, β-Faltblätter, Loops) und Farbverlauf von blau
am N-Terminus nach rot am C-Terminus.
B: Oberflächendarstellung mit Farbverlauf von blau am N-Terminus nach rot am C-Terminus.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das BsaU-Protein für Kristallisationsversuche für
Röntgenstrukturanalysen aufgereinigt. Das gereinigte Protein konnte jedoch unter
verschiedensten Bedingungen nicht kristallisiert werden (unveröffentlichte Daten Verena
Hopf und Xenia Bogdanovic). Dies könnte ein weiterer Hinweis darauf sein, dass BsaU
erst durch die Interaktion mit anderen Proteinen stabilisiert wird. So könnte es
beispielsweise mit anderen Proteinen des T3SS-3 in Wechselwirkung treten und
hierdurch in den Aufbau des T3SS-3 involviert sein.
90
Diskussion
5 Diskussion
Sekretionssysteme spielen eine zentrale Rolle für die Interaktionen von Bakterien mit ihrer
Umwelt. In vielen Fällen sind sie in mutualistische oder pathogene Wechselwirkungen von
Bakterien
mit
anderen
Organismen
verwickelt
(Tseng
et
al.,
2009).
Typ-III-
Sekretionssysteme (T3SS) und Typ-VI-Sekretionssysteme (T6SS) sind bedeutende
Virulenzfaktoren verschiedener gramnegativer Erreger (Tseng et al., 2009). B.
pseudomallei besitzt drei T3SS und sechs T6SS (Schell et al., 2007; Sun & Gan, 2010).
Es wurde gezeigt, dass das T3SS-3 und das T6SS-1 Cluster dieses Erregers mit der
Virulenz gegenüber Säugern im Zusammenhang stehen (Stevens et al., 2004; Pilatz et
al., 2006, Burtnick et al., 2011). Die Expression dieser beiden Sekretionssysteme wird
nach Aufnahme in die Wirtszelle induziert und ihre Funktionalität spielt für den
intrazellulären Lebenzyklus von B. pseudomallei eine essentielle Rolle (Burtnick et al.,
2008; Chen et al., 2011; Shalom et al., 2007; Stevens et al., 2002; Sun et al., 2010). Von
den in dieser Arbeit untersuchten Genen, ist das Gen bsaU im Gencluster des T3SS-3
und das Gen BPSS1504 im Cluster des T6SS-1 lokalisiert, jedoch gehören beide nicht zu
den konservierten Genen dieser Sekretionssysteme. So konnten Homologe zu diesen
Genen ausschließlich in den homologen Genclustern der sehr nahe mit B. pseudomallei
verwandten Arten B. mallei und B. thailandensis gefunden werden. Da über die
Funktionen dieser Gene bisher praktisch nichts bekannt ist, wurden sie im Rahmen dieser
Arbeit näher untersucht.
5.1 Funktionelle Analyse des T6SS-1-Gens BPSS1504
Seit ihrer Entdeckung im Jahr 2006 wurden T6SS in mehr als 90 der bisher sequenzierten
Genome von Proteobakterien identifiziert (Boyer et al., 2009; Pukatzki et al., 2006). Der
Kern der T6SS-Cluster besteht aus 13 konservierten Genen, welche für essentielle
Komponenten des T6SS-Apparats kodieren (Boyer et al., 2009). Daneben können noch
weitere T6SS-assoziierte Proteine kodiert werden, welche nicht in allen T6SS-Clustern
vorkommen. Das Wissen über die Struktur dieses Sekretionsapparates, dessen
Mechanismus zur Proteinfreisetzung, sowie über die Effektoren von T6SS und deren
Wirkung im Wirt ist bisher noch sehr unvollständig.
Das Genom von B. pseudomallei kodiert für sechs T6SS, von welchen fünf auf dem
kleinen Chromosomen lokalisiert sind (Schell et al., 2007; Shalom et al., 2007). Es wurde
gezeigt, dass unter den sechs T6SS-Clustern das T6SS-1 von B. pseudomallei eine
essentielle Rolle für die Virulenz im Säugerwirt spielt. In diesem Zusammenhang wurde
gezeigt, dass Mutationen der Gene hcp1 und vgrG, virAG und tssK zu einer
91
Diskussion
Virulenzattenuierung im Säugetiermodell führen (Burtnick et al., 2011; Chen et al., 2011,
Pilatz et al., 2006). In der vorliegenden Arbeit wurde mit BPSS1504 ein hypothetisches
Protein des T6SS-Cluster 1 identifiziert, welches eine klare Rolle für die Virulenz im
Säuger spielt und dessen Deletion zu einer 1000-fachen Attenuierung im Mausmodell
führte. Da die Virulenz durch Komplementation von BPSS1504 wieder das Wildtypniveau
erreichte, konnten unspezifische, durch die Mutagenese hervorgerufene Effekte
ausgeschlossen werden.
BPSS1504 gehört zum hcp1-Operon, dessen Expression nach Aufnahme in die
Wirtszelle durch den Zweikomponenten-Responsregulator VirA/G heraufreguliert wird
(Chen et al., 2011). In Übereinstimmung mit den Daten von anderen Genen des T6SSCluster 1, konnte in dieser Arbeit fünf Stunden nach der Infektion von RAW264.7Makrophagen eine erhöhte Expression von BPSS1504 nachgewiesen werden. Im
Einklang hiermit stehen die Daten der vorliegenden Arbeit, welche zeigen, dass
BPSS1504 für einen intakten intrazellulären Lebenszyklus von B. pseudomallei essentiell
ist. So zeigte die Mutante B. pseudomallei ∆BPSS1504 nach normaler Invasion in
phagozytierende und in nicht-phagozytierende Zellen eine reduzierte Fähigkeit zur
intrazellulären Replikation, welche in C57BL/6-Makrophagen komplett zum erliegen kam.
Da das Wachstum in verschiedenen Kulturmedien durch die BPSS1504-Deletion nicht
beeinträchtigt war, scheint es unwahrscheinlich, dass BPSS1504 in Stoffwechselwege,
die für das Wachstum wichtig sind involviert ist. In Makrophagen aus Caspase-1Knockoutmäusen konnte B. pseudomallei ∆BPSS1504 ähnlich gut replizieren wie der B.
pseudomallei E8 Wildtyp. In früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass
Knochenmarkmakrophagen von Caspase-1-Knockoutmäusen eine verminderte Fähigkeit
intrazelluläre B. pseudomallei abzutöten aufweisen (Breitbach et al., 2009). Die Tatsache,
dass B. pseudomallei ∆BPSS1504 sich in C57BL/6-Makrophagen, welche eine besonders
hohe bakterizide Wirkung gegenüber B. pseudomallei aufweisen, nicht mehr vermehren
kann, jedoch in Caspase-1-Knockoutmakrophagen ähnlich gut repliziert wie der Wildtyp,
spricht dafür, dass die Mutante den Abwehrmechanismen des Wirts schlechter
entkommen kann als der B. pseudomallei-Wildtyp. Ob BPSS1504 direkt oder indirekt mit
den bakteriziden Funktionen von Makrophagen in Wechselwirkung tritt, bleibt daher noch
zu klären.
Neben der eingeschränkten Fähigkeit zur intrazellulären Repliktion, zeigte B.
pseudomallei ∆BPSS1504 eine verminderte Zytotoxizität, sowie eine stark eingeschränkte
Fähigkeit zur Induktion von vielkernigen Riesenzellen. Wie die Daten dieser Arbeit zeigen,
scheinen diese Effekte der BPSS1504-Deletion nicht ausschließlich auf der verringerten
intrazellulären Replikation zu beruhen. Es bleibt noch offen auf welche Weise BPSS1504
92
Diskussion
die Induktion von Zelltod beeinflusst, da weder ein Einfluss auf die Aktivierung von
Caspasen der klassischen Apoptose, noch auf die Aktivierung der pyroptotischen
Caspase-1 detektiert werden konnte. Es wurde kürzlich gezeigt, dass Plaques in
Zellschichten nach B. pseudomallei-Infektion durch die Lyse der durch B. pseudomallei
induzierten Riesenzellen entstehen (French et al., 2011). Daher wäre es denkbar, dass
die reduzierte Zytotoxizität von B. pseudomallei ∆BPSS1504 mit der Unfähigkeit zur
Induktion von Riesenzellbildung im Zusammenhang steht.
Der durch die Deletion von BPSS1504 hervorgerufene Phänotyp mit normaler
Invasion aber eingeschränkter intrazellulärer Replikation, Zytotoxizität und Induktion von
vielkernigen Riesenzellen ähnelt den Phänotypen, welche kürzlich auch bei den hcp1und virA/G-Mutanten von B. pseudomallei gefunden wurden (Burtnick et al., 2011, Chen
et al., 2011). Des Weiteren zeigte eine Mutante des für die ATPase des T6SS-1
kodierenden clpV1-Gens von B. thailandensis einen ähnlichen Phänotyp (French et al.,
2011). Daher kann der Phänotyp von B. pseudomallei ∆BPSS1504 als klassisch T6SS-1
assoziierter Phänotyp aufgefasst werden.
Neben den Mutanten der genannten Gene des T6SS-1 von B. peudomallei war auch
eine Mutante des tssE-Gens, welches für eine Strukturkomponente des Typ-VISekretionsappararts kodiert, im homologen T6SS-Cluster von B. mallei unfähig die
Bildung von vielkernigen Riesenzellen zu induzieren (Burtnick et al., 2010). Diese Mutante
wies gleichzeitig einen Defekt in der Bildung von Aktinschweifen auf, worauf die Autoren
das Erliegen der Riesenzellbildung zurückführten. Ebenso war eine virA/G-Mutante von B.
pseudomallei 8 h nach der Infektion von RAW264.7-Zellen unfähig Aktinschweife zu
bilden und eine tssA/B-Mutante zeigte eine reduzierte Aktinschweifbildung. Im Gegensatz
zu den T6SS-Regulatoren VirA/G schienen die T6SS-Strukturkomponenten TssA/B für die
Induktion der Aktinumlagerungen nicht absolut essentiell zu sein (Chen et al., 2011). Es
wurde gezeigt, dass VirA/G neben der Expression des T6SS-1 auch bimA, welches für die
Aktinschweifbildung essentiell ist, heraufreguliert (Chen et al., 2011; Stevens et al., 2005).
Die Rolle der T6SS-Strukturkomponenten TssA/B für die Aktinschweifbildung hingegen ist
noch ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass das T6SS-1-Gen
BPSS1504 für die Ausbildung von Aktinschweifen nicht benötigt wird. Dieser Befund
ähnelt den Ergebnissen der Untersuchungen von French et al., in welchen gezeigt wurde,
dass eine Mutante der ClpV-ATPase des T6SS-1 in B. thailandensis in der Lage war
normal Aktinschweife auszubilden (French et al., 2011). Die intrazelluläre Beweglichkeit
scheint daher nur einer von verschiedenen Faktoren zu sein, die in die Induktion von
Zellfusionen durch B. pseudomallei involviert sind (French et al., 2011). Jedoch ist der
genaue Mechanismus, welcher zur Riesenzellbildung nach B. pseudomallei-Infektion
93
Diskussion
führt, bisher noch nicht aufgeklärt. Es wird angenommen, dass die Bildung von
Riesenzellen auf der Fusion von Zellmembranen beruht, und das T6SS-1 könnte
möglicherweise hierbei eine Rolle spielen (French et al., 2011).
Bisher ist nicht geklärt welche Effektorfunktionen zu dem T6SS-1 assoziierten
Phänotyp führen. Die durch hcp1 und vgrG1 kodierten Proteine sind zum einem
Bestandteile der Apparatstruktur zugleich aber auch Effektoren des T6SS und hängen in
ihrer Sekretion gegenseitig voneinander ab (Burtnick et al., 2011). Als Effektorproteine
könnten
sie
bedeutende
Funktionen
der
Wirtszelle
modulieren,
ähnlich
der
Aktinquervernetzung durch das VgrG1 von Vibro cholerae (Ma et al., 2009) oder der
Suppression der proinflammatorischen Immunantwort durch das Hcp von Aeromonas
hydrophila (Suarez et al., 2010). Es wird daher angenommen, dass die Effektorfunktionen
von Hcp1 oder VgrG1 für die Virulenz von B. pseudomallei von Bedeutung sind. Jedoch
sind bisher keine Effektormechanismen dieser Proteine von B. pseudomallei aufgezeigt.
Da die Sekretion von Hcp1 und VgrG1 von einem funktionellen T6SS abhängt, könnte die
verminderte Virulenz von Mutanten mit Defekten in Genen, welche für die Struktur des
Sekretionsapparates wichtig sind, wie beispielsweise tssK, auf die verminderte Sekretion
von Hcp1 und VgrG zurück zu führen sein. Ebenso lässt sich der durch die Mutation der
Regulatorgene virA/G beobachtete Phänotyp durch eine verminderte Expression von
hcp1 und vgrG erklären (Burnick et al., 2011; Chen et al., 2011). Hingegen ist die Rolle
von BPSS1504 im T6SS-1 noch ungeklärt. Die Ähnlichkeit der Phänotypen von B.
pseudomallei ∆BPSS1504 mit den Phänotypen anderer Mutanten des T6SS-1 und die
hohe Attenuierung im Mausmodell ließen spekulieren, dass BPSS1504 die Expression
von anderen Schlüsselgenen T6SS-Cluster-1 oder deren Regulatoren beeinflusst. Jedoch
konnten unter Bedingungen, welche die Expression des T6SS-1 induzieren, nach
Deletion von BPSS1504 keine Unterschiede in der Expression der T6SS-1-Schlüsselgene
hcp1, vgrG, virG, tssA oder deren im T3SS-3 kodierten Regulatoren bsaN und bprC
gefunden werden. Dies legt nahe, dass BPSS1504 keinen Einfluss auf die Regulation der
Expression des T6SS-Cluster-1 hat. Weiterhin wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch
die Sekretion von Hcp1 nicht von der BPSS1504-Deletion beeinträchtigt wurde. Da die
normale Sekretion von Hcp ein Indikator für ein funktionelles T6SS ist (Pukatzki et al.,
2009), deuten die Daten darauf hin, dass die BPSS1504-Deletion die Funktionalität des
T6SS-1 nicht beeinträchtigt. Während die Virulenzattenuierung von bisher bekannten
Mutanten des T6SS-1 stets mit einem Defekt in der Expression oder Sekretion der
bekannten T6SS-Effektoren Hcp1 und VgrG in Zusammenhang gebracht werden konnte
(Burtnick et al., 2011; Chen et al., 2011), scheint die Attenuierung von B. pseudomallei
∆BPSS1504 von Hcp1, und vermutlich auch von VgrG, unabhängig zu sein. Weiterhin
94
Diskussion
scheint die BPSS1504-Deletion die Funktionalität des T3SS-3 nicht zu beeinträchtigen, da
B. pseudomallei ∆BPSS1504 eine normale Sekretion des T3SS-3-Effektorproteins BopE
und des Translokatorproteins BipD zeigte.
Um einen Hinweis auf den Wirkungsmechanismus von BPSS1504 zu bekommen,
wurde die Proteinsequenz auf charakteristische Strukturmotive untersucht. Dabei zeigte
sich,
dass
der
C-Terminus
des
durch
BPSS1504
kodierten
Proteins
eine
Pentapeptiderepeat-Domäne enthält, die eine starke Ähnlichkeit zu verschiedenen
Proteinen zeigt, welche durch Nachahmung der B-Form der DNA Typ-II-Topoisomerasen
inhibieren (Montero et al., 2001; Tran & Jacoby, 2002). Daher wäre es durchaus denkbar,
dass BPSS1504 mit DNA-bindenden Proteinen interagiert und hierüber die Transkription
von anderen Virulenzfaktoren beeinflusst. So hat die Windung und Entwindung der DNA
durch die Aktivität von Topoisomerasen einen entscheidenden Einfluss auf die
Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie des Bakteriums. Man kann
aber
auch
spekulieren,
dass
BPSS1504
spezifisch
an
DNA-bindende
Transkriptionsfaktoren bindet, und hierdurch einen Einfluss auf die Transkription von
entscheidenden Virulenzfaktoren ausübt. Weiterhin ist es auch möglich, dass BPSS1504
selbst
ein
sekretierter
Effektor
des
T6SS-1
ist.
Hierfür
spricht,
dass
die
Pentapeptiderepeat-Domäne von BPSS1504 auch eine gewisse Ähnlichkeit zu den T3SSEffektorproteinen PipB und PipB2 von S. enterica aufweist. Erste Überexpressionsversuche von BPSS1504 in HeLa-Zellen zeigten jedoch keinen Einfluss auf die
Morphologie oder Viabilität der Zellen (Daten nicht gezeigt). Auch konnte in
Sekretomanalysen aus unserer Arbeitsgruppe kein Protein detektiert werden, welches
dem durch BPSS1504 kodierten Protein entspricht, während der Nachweis von Hcp1 in
diesen
Analysen
auf
die
Funktionalität
des
T6SS-1
unter
den
gewählten
Versuchsbedingungen hindeutet (unpublizierte Daten N. Meukow).
Zusammenfassend kann man sagen, dass in der vorliegenden Arbeit ein
hypothetisches Protein des T6SS-1, kodiert durch das Gen BPSS1504, als neuer
Virulenzfaktor von B. pseudomallei charakterisiert wurde, welcher scheinbar seine
Wirkung ausübt ohne die Funktionalität des T6SS-1 oder des T3SS-3 zu beeinflussen.
Die molekulare Wirkungsweise des durch BPSS1504 kodierten Proteins, welche eine
große Bedeutung für das intrazelluläre Überleben von B. pseudomallei hat, bleibt jedoch
noch offen.
5.2 Funktionelle Analyse des T3SS-3-Gens bsaU
Typ-III-Sekretionssysteme (T3SS) werden von vielen gramnegativen Pathogenen oder
Symbionten genutzt um bakterielle Proteine in das Zytosol des Wirtes freizusetzten, und
95
Diskussion
hierdurch wichtige Wirtszellfunktionen zum eigenen Nutzen umzumodulieren (Tseng et
al., 2009, Dean, 2011). Die Struktur, der Aufbau und die Funktionsweise von T3SS,
wurden eingehend untersucht und sind weitestgehend aufgeklärt. Der Kern der
Apparatstruktur ist evolutionär mit den Flagellen verwandt und wird von neun in allen
T3SS konservierten Proteinen gebildet (Cornelis 2006; Tseng et al., 2009). Es können
jedoch bis zu 25 verschiedene Proteine für den Zusammenbau eines T3SS benötigt
werden (Tseng et al., 2009). Darüber hinaus kennt man etwa 400 verschiedene
Effektorproteine von T3SS und zahlreiche Funktionen von T3SS-Effekoren im Wirt (Dean,
2011).
Das B. pseudomallei-Genom kodiert für drei T3SS. Es wurde gezeigt, dass das T3SSCluster 3 mit der Virulenz von B. pseudomallei gegenüber Säugern im Zusammenhang
steht. So führten Mutationen der T3SS-3-Gene bipD und bsaZ, sowie des in dieser Arbeit
untersuchten Gens bsaU zu einer Virulenzattenuierung im Mausmodell (Stevens et al.,
2004; Pilatz et al., 2006).
Die Expression des T3SS-3 wird bei Kontakt von B. pseudomallei mit der Wirtszelle,
sowie durch einen sauren pH-Wert oder Salzstress induziert (Chen et al., 2011;
Jitprasutwit et al., 2010; Pumirat et al., 2010). Die Funktionalität des T3SS-3 spielt eine
wichtige Rolle beim Ausbrechen von B. pseudomallei aus den Endosomen (French et al.,
2011). Es wurde gezeigt, dass eine Transposonmutante des bsaU-Gens nur verzögert
aus den Endosomen ausbrechen kann (Pilatz et al., 2006). Hierin ähnelt sie den Mutanten
der Gene bsaQ und bsaZ, die für Strukturkomponenten des T3SS-3 kodieren, sowie des
bipD-Gens, welches für ein T3SS-3-Translokatorprotein kodiert (Stevens et al., 2002;
Muangsombut et al., 2008). Jedoch konnten sekundäre Effekte auf diese Gene nicht
ausgeschlossen werden. Die gezielte Deletion von bsaU bestätigte den Phänotyp der
Transposonmutante. Durch Komplementation des bsaU-Genes revertierte der Phänotyp
zumindest teilweilweise wieder zum Verhalten des Wildtyps, was nahe legt, dass es sich
hierbei nicht um einen polaren Effekt auf andere Gene des T3SS-3 handelt.
Trotz des verzögerten Ausbrechen aus dem Endosomen konnten bei der bsaUTransposonmutante nur geringfügige Unterschiede in der intrazellulären Replikation in
HeLa-Zellen und in J774-Makrophagen detektiert werden (Pilatz et al., 2006). In dieser
Arbeit wurden in A549-Zellen und in RAW264.7-Zellen 16 Stunden nach Infektion mit B.
pseudomallei ∆bsaU signifikant geringere Keimzahlen gefunden als in den mit dem B.
pseudomallei E8 Wildtyp infizierten Zellen, was die Rolle von bsaU für die intrazelluläre
Replikation deutlich hervorhebt. Ein Defekt in der intrazellulären Replikation wurde bereits
für verschiedene andere Mutanten des T3SS-3 beschrieben. So konnten sich Mutanten
des bsaZ-Gens und des bipD-Gens bis zu zwölf Stunden nach der Infektion von
96
Diskussion
Makrophagen nicht vermehren (Stevens et al., 2002). Diese Mutanten können ähnlich wie
B. pseudomallei ∆bsaU nur verzögert aus dem Phagosomen ausbrechen. B.
pseudomallei ∆bsaU unterscheidet sich von diesen Mutanten in der Fähigkeit, sich im
Endosomen vermehren zu können. Dennoch ist es nahe liegend, dass die gegenüber
dem B. pseudomallei-Wildtyp reduzierte intrazelluläre Replikation von B. pseudomallei
∆bsaU ebenfalls auf der Lokalisation im Endosomen beruht.
Neben der Rolle für das Ausbrechen aus dem Endosomen, wurde dem T3SS-3 lange
Zeit eine Rolle bei der Invasion zugeschrieben. Diese Annahme begründete darauf, dass
Mutanten verschiedener Gene dieses Sekretionssystems wie bopE, bipD und bipB sechs
beziehungsweise vier Stunden nach der Infektion reduzierte intrazelluläre Keimzahlen
aufwiesen (Stevens et al., 2004; Suparak et al., 2005). Zu diesem relativ späten Zeitpunkt
nach der Infektion können jedoch, neben der Invasion, bereits Defekte im intrazellulären
Überleben und in der intrazellulären Replikation der im Endosomen gefangen T3SS-3Mutanten eine Rolle spielen. Wie in dieser Arbeit durch Bestimmung der intrazellulären
Keimzahlen zwanzig Minuten nach Infektion gezeigt wurde, wies B. pseudomallei ∆bsaU
keine Unterschiede in der Fähigkeit zur Invasion verglichen mit dem Wildtyp auf. Eine
andere Arbeit zeigte, dass eine bsaU-Transposonmutante das Effektorprotein BopE und
das Translokatorprotein BipD schlechter sekretieren konnte als der Wildtyp (Hii et al.,
2008), was darauf hinweist, dass bsaU für die Funktionalität des T3SS-3-Apparates von
Bedeutung ist. Damit stellt bsaU ein Beispiel dafür dar, dass das T3SS-3 bei der Invasion
von B. pseudomallei keine Rolle zu spielen scheint. Dies stimmt mit den Ergebnissen
einer neueren Arbeit überein, in welcher eine Mutante, bei der die ATPase des T3SS-3
deletiert wurde, ein normales Invasionsverhalten aufwies (French et al., 2011).
Daten von Mutanten des bsaQ- und des bsaZ-Gens weisen darauf hin, dass das
T3SS-3 eine Rolle für die Induktion von Zelltod durch B. pseudomallei spielt (Sun et al.,
2005; Burtnick et al., 2008). In Übereinstimmung mit diesen Daten wies B. pseudomallei
∆bsaU verglichen mit B. pseudomallei E8 eine verringerte Zytotoxizität auf. Einhergehend
mit dem verzögertem Eintreten des Zelltodes konnte in den mit B. pseudomallei ∆bsaU
infizierten Zellen bis zu zehn Stunden nach der Infektion keine Aktivierung der
pyroptotischen Caspase-1 und der apoptotischen Caspase-7 detektiert werden, während
die aktive Form dieser beiden Caspasen in den mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp
infizierten Zellen bereits zwei Stunden nach der Infektion nachgewiesen werden konnte.
Es ist möglich, dass diese beobachteten Effekte der bsaU-Deletion auf die Induktion von
Pyroptose und Apoptose auf dem verzögerten Ausbrechen von B. pseudomallei ∆bsaU
aus den Endolysosomen beruhen. Weitere Daten aus unserer Arbeitsgruppe zeigten,
dass eine bsaU-Transposomutante zwölf Stunden nach der Infektion in C57BL/6-
97
Diskussion
Makrophagen Caspase-7 aber nicht Caspase-1 aktivieren kann (Kathrin Matschinski,
unveröffentlichte Daten). Da eine Transposonmutante des bsaU-Gens nur noch geringe
Mengen des T3SS-3- Effektorproteins BopE, welches eine Rolle bei der Aktivierung von
Caspase-1 spielt, sekretieren konnte (Hii et al., 2008), scheint es nahe liegend, dass die
fehlende Aktivierung von Caspase-1 nach Ausschaltung des bsaU-Gens auf eine
verminderte BopE-Sekretion zurückzuführen ist. Des weiteren scheint auch BsaK,
welches sowohl eine Strukturkomponente als auch ein sekretiertes Protein des T3SS-3
darstellt, bei der Aktivierung von Caspase-1 über das NLRC4-Inflammasomen eine Rolle
zu spielen (Miao et al., 2010). Es ist nicht auszuschließen, dass B. pseudomallei ∆bsaU
eine eingeschränkte BsaK-Sekretion aufweist, was ebenfalls zu dem beobachteten Defekt
in der Caspase-1-Aktivierung beitragen könnte.
Neben
der
eingeschränkten
intrazellulären
Replikation
und
der
reduzierten
Zytotoxizität, konnte B. pseudomallei ∆bsaU weniger Riesenzellen induzieren als der B.
pseudomallei E8 Wildtyp. Das T3SS-3-Translokatorprotein BipB wurde, neben dem
T6SS-1 und den durch BPSL0590 und BPSL0591 kodierten Toxinen, mit der Induktion
von vielkernigen Riesenzellen in Verbindung gebracht (Suparak et al., 2005). Ein Defekt
bei der Induktion von Riesenzellen wurde bereits auch bei anderen Mutanten des T3SS-3
beobachtet, welche jedoch nicht oder nur verzögert aus dem Endolysosomen ausbrechen
können (Muangsombut et al., 2008; Burtnick et al. 2008). Hingegen wurde die Fähigkeit
der bipB-Mutante aus dem Phagosomen ausbrechen zu können und Aktinschweife zu
bilden nicht untersucht. Es scheint wahrscheinlich, dass die reduzierte Induktion von
Zellfusionen durch B. pseudomallei ∆bsaU in RAW264.7-Zellen auf dem verzögertem
Ausbrechen aus dem Endolysosomen und den reduzierten intrazellulären Keimzahlen
beruht. So wurde bei B. thailandensis gezeigt, dass eine Mutante mit einem Defekt in der
ATPase des zum T3SS-3 homologen Sekretionssystems nach direkter Freisetzung in das
Zytosol der Wirtszellen mit Hilfe einer Nanoplade-Technik, aber nicht nach Infektion, die
Bildung von vielkernigen Riesenzellen in mit dem Wildtyp vergleichbarer Ausprägung
induzieren kann (French et al., 2011). Es ist daher naheliegend, dass es sich bei dem
Einfluss des T3SS-3 auf die Induktion von Riesenzellen eher um einen sekundären Effekt
als um einen direkten Einfluss handelt, da die Induktion von Riesenzellbildung das
Ausbrechen von B. pseudomallei aus den Endosomen voraussetzt.
Der Phänotyp von B. pseudomallei ∆bsaU entspricht weitest gehend dem Phänotyp
anderer Mutanten von Strukturkomponenten des T3SS-3. Wenn auch BsaU nicht zu den
konservierten Strukturkomponenten gehört, so gibt es doch Hinweise, dass BsaU für den
Aufbau und die Funktionalität des T3SS-3 eine Rolle spielt (Hii et al., 2008).
98
Diskussion
Die
Strukturvorhersage
für
BsaU
legt
nahe,
dass
große
Abschnitte
der
Aminosäuresequenz eine ungeordnete Struktur aufweisen und das BsaU-Protein daher
als Monomer sehr instabil ist. Es scheint eher wahrscheinlich, dass das Protein Polymere
bildet oder mit anderen Proteinen interagiert. In umfangreichen Kristallistionsscreenings
gelang es nicht, das aufgereinigte BsaU-Protein zu kristallisieren (unveröffentlichte Daten
Verena Hopf und Xenia Bogdanovic), was ein weiterer Hinweis darauf sein könnte, dass
BsaU in vivo erst durch die Interaktion mit anderen Proteinen seine stabile Faltung und
Funktion erhält. Es scheint naheliegend, dass das BsaU mit anderen Proteinen des T3SS3 in Wechselwirkung tritt und hierdurch in den Aufbau des T3SS-3 involviert ist. In einem
kürzlich veröffentlichten Review wurde dem BsaU-Protein eine Funktion bei der Kontrolle
der Nadellänge des T3SS-3 zugeordnet (Sun & Gan, 2010), doch gibt es hierzu keine
experimentellen Hinweise. BsaU kommt scheinbar für die volle Funktionalität des T3SS-3
von B. pseudomallei eine bedeutende Rolle zu. Die aufgestellten Hypothesen über die
Funktion des Proteins müssen aber noch experimentell bestätigt werden.
99
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Das gramnegative Bakterium Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der Melioidose.
Die Virulenz von B. pseudomallei steht in engem Zusammenhang mit dessen Fähigkeit,
intrazellulär überleben zu können. Nach dem Eindringen in die Wirtszelle durch
Endozytose ist das Bakterium in der Lage, aus Endolysosomen auszubrechen,
intrazellulär zu replizieren und sich unter Induktion von Aktinpolymerisationen und der
Bildung von vielkernigen Riesenzellen von Zelle zu Zelle auszubreiten. B. pseudomallei
verfügt über eine Vielzahl von Sekretionssystemen, von denen das Typ-III-Sekretionssytem-3 (T3SS-3) und das Typ-VI-Sekretionssystem-1 (T6SS-1) eine wichtige Rolle für
den intrazellulären Überlebenszyklus und die Virulenz des Erregers im Säuger spielen.
In einem Plaqueassay-Screening von Transposonmutanten, zur Identifikation von B.
pseudomallei-Mutanten mit Defekten im intrazellulären Lebenszyklus, waren unter
anderem Transposonmutanten der Gene bsaU und BPSS1504 auffällig geworden. Das
Gen bsaU ist im Gencluster des T3SS-3 und das Gen BPSS1504 im Cluster des T6SS-1
lokalisiert. Beide gehören nicht zu den konservierten Genen dieser Sekretionssysteme
und kodieren für hypothetische Proteine mit unbekannter Funktion.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von bsaU und BPSS1504 im
intrazellulären Lebenszyklus von B. pseudomallei und für die Virulenzeigenschaften
dieses Erregers näher zu untersuchen, sowie Hinweise auf die Funktionen der durch
bsaU und BPSS1504 kodierten Proteine zu gewinnen. Hierfür wurden markerlose
Deletionsmutanten der Gene bsaU und BPSS1504 hergestellt und die Mutanten B.
pseudomallei ∆BPSS1504 und B. pseudomallei ∆bsaU komplementiert.
Die Mutante B. pseudomallei ∆BPSS1504 zeigte im Zellkulturmodel Defekte in der
intrazellulären Replikation, eine reduzierte Zytotoxizität und war unfähig, die Bildung von
vielkernigen Riesenzellen zu induzieren, während die Fähigkeit Aktinpolymerisationen zu
induzieren scheinbar nicht von der BPSS1504-Deletion beeinträchtigt wurde. Durch
Komplementation von BPSS1504 konnte der Wildtyp-Phänotyp wieder hergestellt werden.
Die Daten der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass der Defekt von B.
pseudomallei ∆BPSS1504 bei der Induktion von vielkernigen Riesenzellen und die
reduzierte Zytotoxizität nicht allein auf dem Defekt in der intrazellulären Replikation
beruhten, sondern BPSS1504 hierbei eine direkte Rolle spielt. Nähere Analysen legten
jedoch nahe, dass die BPSS1504-Deletion weder die Induktion der apoptotischen
Caspasen Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8 und Caspase-9 durch B. pseudomallei
noch die Aktivierung der pyroptotischen Caspase-1 beeinflusst. Die Charakterisierung von
B. pseudomallei ∆BPSS1504 in vivo zeigte eine etwa 1000-fache Virulenzattenuierung
100
Zusammenfassung
nach intranasaler Infektion von BALB/c-Mäusen. Durch Komplementation des BPSS1504Gens konnte wieder eine mit dem B. pseudomallei E8 Wildtyp vergleichbare Virulenz
hergestellt werden, was polare Effekte auf andere Gene ausschließen lässt.
Ähnliche Phänotypen wie die von B. pseudomallei ∆BPSS1504 wurden kürzlich auch
von Mutanten des T6SS-1-Effektorproteins Hcp1, der T6SS-1-Strukturkomponenten
TssA/B und der T6SS-1 Regulatoren VirA/G und BprC berichtet. In der vorliegenden
Arbeit wurde gezeigt, dass B. pseudomallei ∆BPSS1504 eine normale Expression von
Schlüsselgenen des T6SS-1 inklusive hcp1, vgrG, tssA und dessen Regulatoren virA/G,
bprC und bsaN aufwies. Weiterhin wies eine normale Hcp1-Sekretion darauf hin, dass die
Funktionalität des T6SS-1 nicht von der BPSS1504-Deletion von beeinträchtigt wurde.
Diese Daten legen nahe, dass die beobachteten Phänotypen von B. pseudomallei
∆BPSS1504, im Gegensatz zu den Phänotypen bisher bekannter Mutanten des T6SS-1,
unabhängig von Hcp1 sind. Des Weiteren blieb auch die Funktion des T3SS-3 von der
BPSS1504-Deletion unbeeinträchtigt, da das T3SS-3-Effektorprotein BopE und das
Translokatorprotein BipD von B. pseudomallei ∆BPSS1504 normal sekretiert wurden.
In silico-Analysen zeigten, dass der C-Terminus des BPSS1504-Proteins von einer
Pentapeptiderepeat-Domäne gebildet wird. Diese weist eine sehr starke Ähnlichkeit zu
den Proteinen MfpA aus Mykobakterien und und Qnr von Klebsiella auf, welche an Typ-IITopoisomerasen binden, indem sie die B-Form der DNA imitieren. Daher wäre eine
Interaktion von BPSS1504 mit DNA-bindenden Proteinen denkbar. Des Weiteren zeigt die
Pentapeptidrepeat-Domäne von BPSS1504 gewisse Ähnlichkeiten zu den T3SSEffektoren PipB und PipB2 von Salmonella, was eine Funktion von BPSS1504 als
Effektorprotein nicht ausschließen lässt.
Ähnlich wie bei B. pseudomallei ∆BPSS1504, jedoch weniger stark ausgeprägt,
konnten auch bei B. pseudomallei ∆bsaU Einschränkungen in der intrazellulären
Replikation, eine verringerte Zytotoxizität sowie eine verzögerte Induktion der Riesenzellbildung gefunden werden. Die reduzierte Zytotoxizität von B. pseudomallei ∆bsaU ging
mit Defekten in der Aktivierung der apoptotischen Caspase-7 sowie der pyroptotischen
Caspase-1 einher. B. pseudomallei ∆bsaU konnte, wie Mutanten der T3SS-3-Gene bsaZ,
bsaQ und bipD nur verzögert aus dem Endolysosomen ausbrechen. Dieser Effekt konnte
durch Komplementation des bsaU-Gens zumindest teilweise wieder aufgehoben werden,
was zeigt, dass es sich hierbei nicht um polare Effekte auf andere Gene handelt. In silicoAnalysen ließen vermuten, dass das monomere BsaU-Protein sehr instabil ist. Es scheint
naheliegend, dass BsaU am Aufbau des T3SS-3-Apparates beteiligt ist. So wurde
gezeigt, dass eine bsaU-Transposonmutante nur eingeschränkt in der Lage war BopE
und BipD zu sekretieren (Hii et al., 2008).
101
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110
Anhang
Anhang
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AHL
N-Acyl-Homoserinlakton
ATP
Adenosintriphosphat
ATTC
American Type Culture Collection
B. pseudomallei; B. ps.
Burkholderia pseudomallei
BMM
bone marrow derived macrophages;
Knochenmarkmakrophagen
bp
Basenpaare
BPSL
Burkholderia pseudomallei large Chromosomen
BPSS
Burkholderia pseudomallei small Chromosomen
BSA
Bovin serum albumin; Rinderserumalbumin
bsa
Burkholderia secretion apparatus
cDNA
complementary desoxyribonucleic acid
CFU
colony forming unit; Koloniebildende Einheit
CMV
Cytomegalovirus
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
dCTP
Desoxycytidintriphosphat
dGTP
Desoxyguanosintriphosphat
DHL
N-Dekanoyl-Homoserinlakton
DNA
desoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure
EPS
Exopolysaccharid
et al.
und andere (lat. Et alii)
FCS
fetal calf serum, Fetales Kälberserum
glmS
Glutamin-6-phosphat-Sythtase
GM-CSF
Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor
GTP
Guanosintriphosphat
HIV
Human immunodeficiency Virus
HSV
Herpes simplex Virus
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IκBα
Inhibitor von NFκB, alpha
iNOS
induzierbare NO-Synthase
111
Anhang
LAMP
Lysosomal-associated membrane protein
LDH
Lactatdehydrogenase
LPS
Lipopolysaccharid
MAPK
mitogen-activated protein kinase
MOI
multiplicity of infection
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NADPH
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (reduziert)
NCTC
National Collection of Type Cultures
NFκB
NLR
nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells
NOD like receptor
NLRC
NOD like receptor mit CARD-Domäne
NO
nitric oxid, Stickoxid
OD
Optische Dichte
orf
open reading frame
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PAMP
pathogen-associated molecular pattern
PRR
Pattern recognition receptor
PCR
Polymerasekettenreaktion
RNA
Ribonukleinsäure
RPLP0
ribosomal protein large P0
T1SS
Typ-I-Sekretionssystem
T2SS
Typ-II-Sekretionssystem
T3SS
Typ-III-Sekretionssystem
T4SS
Typ-IV-Sekretionssystem
T5SS
Typ-V-Sekretionssystem
T6SS
Typ-VI-Sekretionssystem
TH-Zellen
T-Helferzellen
TLR
Toll-like receptor
TNFα
tumor necrosis factor alpha
TTP
Desoxythymidintriphosphat
U
Unit
112
Anhang
Internationaler Einbuchstabencode Aminosäuren
A
Ala
Alanin
B
Asx
Aspartat oder Asparagin
C
Cys
Cystein
D
Asp
Aspartat
E
Glu
Glutamat
F
Phe
Phenylalanin
G
Gly
Glycin
H
His
Histidin
I
Ile
Isoleucin
K
Lys
Lysin
L
Leu
Leucin
M
Met
Methionin
N
Asn
Asparagin
P
Pro
Prolin
Q
Gln
Glutamin
R
Arg
Arginin
S
Ser
Serin
T
Thr
Threonin
V
Val
Valin
W
Trp
Tryptophan
X
beliebige Aminosäure
Y
Tyr
Tyrosin
Z
Glx
Glutamat oder Glutam
113
Anhang
Aligment des durch BPSS1504 kodierten Proteins
verschiedener B. pseudomallei-Stämme und der homologen Proteine von B.
mallei und B. thailandensis
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
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MKIVKPETLALMCRTLRIERADRLSIGALACFALRAHAPDGPGDLAPEATLWQIAQQWLG
MKIVKPETLALMCRTLRIERADRLSIGALACFALRAHAPDGPGDLAPEATLWQIAQQWLG
MKIVKPETLALMCRTLRIERADRLSIGALACFALRAHAPDGPGDLAPEATLWQIAQQWLG
MKIVKPESLALLCRTLRFEGIDRLSIGALACFALRADAPAGPGDLAPEASLWQVARQWLG
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60
60
60
60
60
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B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
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AHAPLDEGWPKPAGEFLVYGDACAPAGREHAGGAPFAVRARIGAACKARLVDARDPAERV
AHAPLDEGWPKPAGEFLVYGDACAPAGREHAGGAPFAVRARIGAACKARLVDARDPAERV
AHAPLDEGWPKPAGEFLVYGDACAPAGREHAGGAPFAVRARIGAACKARLVDARDPADRV
EHAPLDDGLPKPSGEFLVYGDACAPPGRDRAARAPFAVRARIGAACKERLVDARDAAGRA
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120
120
120
120
120
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
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LADFRALPPSHPQRVRDLGPFDARWLAERWPHLPSGTRAEHFHTAPRDQRIAGFWRGDED
LADFRALPPSHPQRVRDLGPFDARWLAERWPHLPSGTRAEHFHTAPRDQRIAGFWRGDED
LADFRALPPSHPQRVRDLGPFDARWLAERWPHLPSGTRAEHFHTAPRDQRIAGFWRGDED
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180
180
180
180
180
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
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IELVNLHAQHPIVAGALPRVRARCFVERSAGGATRVDACPMRAETVWLFPGAACGIVLYR
IELVNLHAQHPIVAGALPRVRARCFVERSAGGATRVDACPMRAETVWLFPGAACGIVLYR
IELVNLHAQHPIVAGALPRVRARCFVERSAGGATRVDACPMRAETVWLFPGAACGIVLYR
IELVNLHADRPAIAGALPRVRARCFVERWVGGVARIDACPMRAETVWLFPGAACGIVLYR
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240
240
240
240
240
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
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GLATIDDEDGDDVLRVIAGWEDAAAPPLPADAYLGRPASGGAGSRPTPAP----VASVVP
GLATIDDEDGDDVLRVIAGWEDAAAPPLPADAYLGRPASGGAGSRPTPAPDAAPVASVVP
GLATIDDEDGDDVLRVIAGWEDAAAPPLPADAYLGRPASGGAGSRPTPAPDAAPVASVVP
ALVAIDDEDGDDVVRVIAGWEHADAPPLPDEAYIGRPAPEDEGSRPALAP-AAAPAAIAD
300
296
300
300
299
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B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
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AALTAEEAHADEHAPGGSASASQAHSPAAPEFPEAPHAPDLSALEREAAALAGQTDALLA 356
AALTAEEAHADEHAPGGSASASQAHSPAAPEFPEAPHAPDLSALEREAAALAEQTDALLA 360
AALTAEEAHADEHAPGGSASASQAHSPAAPEFPEAPHAPDLSALEREAAALAGQTDALLA 360
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B.ma.10247
B.ps.E8
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B.th.E64
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GLGITEADIARLLPAREAPAELNLDQLATLAAELDAQTAQWQAQQAVAAVERGDAASATP
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B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
114
420
416
420
420
415
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AAPATPDAEAAHEASLADLLRQADAQMRALVEQHGLSRARMEAAARTLPELAPLAGSLDA 476
AAPATPDAEAAHEASLADLLRQADAQMRALVEQHGLSRARMEAAARTLPELAPLAGSLDA 480
AAPATPDAEAAHEASLADLLRQADAQMRALVEQHGLSRARMEAAARTLPELAPLAGSLDA 480
-SPASPNSAAAHDASLADLLRQADAQIRALVDQHGLSRAQMEAAARDRPELAALA---DA 471
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**
Anhang
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
LDALDAPLDVDALTAGLAA-AGGDAAAEPDTPAEPSPPAPANEFAAAVPAPASSTAAPPV
LDALDAPLDVDALTAGLAA-AGGDAAAEPDTPAEPSPPAPANEFAAAVPAPASSTAAPPV
LDALDAPLDVDALTAGLAA-AGGDAAAEPDTPAEPSPPAPANEFAAAVPAPASSTAAPPV
LDALDAPLDVDALTAGLAA-AGGDAAAEPDTPAEPSPPAPANEFAAAVPAPASSTAAPPV
LDALDAPLDIDALTAGLAAPAGDEAIVEPDAPAGPDRPAGADRPADGAPASMHAAAPSAG
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B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
DDAPPGPLTREQVIERHARGLGFAGLDLSGLDLSSAALERADFRRARLERTRFAGCRLAG
DDAPPGPLTREQVIERHARGLGFAGLDLSGLDLSSAALERADFRRARLERTRFAGCRLAG
DDAPPGPLTREQVIERHARGLGFAGLDLSGLDLSSAALERADFRRARLERTRFAGCRLAG
DDAPPGPLTREQVIERHARGLGFAGLDLSGLDLSSAALERADFRRARLERTRFAGCRLAG
DAPPAEPLTREQVIERHARGLGFAGLDLSGLDLSSAALERADLRDARIERTCFAGCRLRG
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599
595
599
599
591
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
ASFERALLSHADFSNADLRDAVFAGASAPGASWRGAVLERARLEHGDFSGGDFVQASLAD
ASFERALLSHADFSNADLRDAVFAGASAPGASWRGAVLERARLEHGDFSGGDFAQASLAD
ASFERALLSHADFSNADLRDAVFAGASAPGASWRGAVLERARLEHGDFSGGDFAQASLAD
ASFERALLSHADFSNADLRDAVFAGASAPGASWRGAVLERARLEHGDFSGGDFAQASLAD
ASFERALLSRADFSNADLREATFVDASAPGASFRGAALDRARLAHADFTGADFTRASLAD
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659
655
659
659
651
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
SHCAHAQFDASAMTALVAARIDGTHASFAGCTLDAADFTSARLPRANFQHATLADAALAC 719
SHCAHAQFDASAMTALVAARIDGTHASFAGCTLDAADFTSARLPRANFQHATLADAALAC 715
SHCAHAQFDASAMTALVAARIDGTHASFAGCTLDAADFTSARLPRANFQHATLADAALAC 719
SHCAHAQFDASAMTALVAARIDGTHASFAGCTLDAADFTSARLPRANFQHATLADAALAC 719
GHCAHARFDESAMTQLAAARLDGAHASFAGCALDAADFTSARMPRANFQHATLTAATFAF 711
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B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
AHCDGAEWYGAQAPRVRLRAASLRGSRADASTSFRQADLSSAALDDANWDGVDLRGTNLH 779
AHCDGAEWYGAQAPRVRLRAASLRGSRADASTSFRQADLSSAALDDANWDGVDLRGTNLH 775
THCDGAEWYGAQAPRVRLRAASLRGSRADASTSFRQADLSSAALDDANWDGVDLRGTNLH 779
AHCDGAEWYGAQAPRARLRAASLRGSRADASTSFRQADLSSAALDDANWDGVDLRGTNLH 779
AQCDGAEWYGAQASGAQLRSASLRGSRADASTSFRQAVLSGAALDDANWDGVDLRYANLH 771
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B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
EATLDGASLARANASGAQLTRARARRADLTQADLTHADARCSNLHGASLRRARLGGTQLQ
EATLDGASLARANASGAQLTRARARRADLTQADLTHADARCSNLHGASLRRARLGGTQLQ
EATLDGASLARANASGAQLTRARARRADLTQADLTHADARCSNLHGASLRRARLGGTQLQ
EATLDGASLARANASGAQLTRARARRADLTQADLTHADARCSNLHGASLRRARLGGTQLQ
KATLDRASLARAIASGAQLTLSLARRADLTKADLTHADARFSNLQGASLRRARLDGTQLQ
539
535
539
539
531
839
835
839
839
831
:**** ****** ******* : *******:********* ***:*********.*****
B.ma.10247
B.ps.E8
B.ps.1710b
B.ps.K96243
B.th.E64
SSNLYGADCYGTALARPQLDGANIERTLLAVPGRPELAASR
SSNLYGADCYGTALARPQLDGANIERTLLAVPGRPELAASR
SSNLYGADCYGTALARPQLDGANIERTLLAVPGRPELAASR
SSNLYGADCYGTALARPQLDGANIERTLLAVPGRPELAASR
SSNLYGADCYGTALGRSQLAGANVERTLFVVPGRPELASSR
**************.*.** ***:****:.********:**
880
876
880
880
872
Ein „* “ kennzeichnet Positionen mit einem voll konservierten Aminosäurerest; Ein „:“ kennzeichnet
Konservierung zwischen Gruppen mit sehr ähnlichen Eigenschaften; Ein „.“ kennzeichnet Konservierung
zwischen Gruppen mit leicht ähnlichen Eigenschaften.
115
Eidesstattliche Erklärung
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer
anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten
ohne Kennzeichnung übernommen habe.
Unterschrift des Promovenden
116
Danksagung
Danksagungen
Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Ivo Steinmetz für die Möglichkeit, im
Institut für Medizinische Mikrobiologie dieses interessante Thema bearbeiten zu können,
bedanken.
Großer Dank gilt Dr. med. Katrin Breitbach für die Betreuung meiner Arbeit und für die
kritische Durchsicht meiner Dissertation.
Ganz besonders möchte ich mich bei Dr. rer. nat. André Göhler, Kathrin Matschinski
sowie Dr. rer. nat. Anje Bast für die vielen wissenschaftlichen Diskussionen und oft sehr
wertvollen Rat bedanken.
Weiterhin danke ich unseren technischen Assistentinnen Claudia Cord, Eylin Topfstedt,
Claudia Weber und Anne Krause für die Organisation des Laboralltags.
Die Arbeiten zur Promotion wurden durch ein Stipendium des DFG-Graduiertenkollegs
840/3 „Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt bei generalisierten bakteriellen
Infektionen“ gefördert.
117
Publikationen und Kongressbeiträge
Publikationen und Kongressbeiträge
Originalarbeit
Verena Hopf, Antje Bast, Ivo Steinmetz, Katrin Breitbach
BPSS1504, a Cluster 1 type VI secretion gene, is involved in intracellular
survival and virulence of Burkholderia pseudomallei
(In Vorbereitung)
Poster
Verena Hopf, Antje Bast, Ivo Steinmetz, Katrin Breitbach
BPSS1504, a hypothetical T6SS protein, contributes to in vivo virulence of B.
pseudomallei in an Hcp1-independent manner
European Melioidosis Network Meeting 2012, Amsterdam, Niederlande
Verena Hopf, Antje Bast, Ivo Steinmetz, Katrin Breitbach
The hypothetical type VI secretion protein BPSS1504 is involved in the
intracellular life cycle and in vivo virulence of Burkholderia pseudomallei
Jahrestagung der DGHM, 2011, Essen, Deutschland
Breitbach K., Kayama H., Hopf V., Bast A. , Yamamoto M., Takeda K., Steinmetz I.
The Burkholderia pseudomallei type III secretion effector protein BopA
induces caspase-dependent cell death in macrophages
VIth World Melioidosis Congress 2010, Townsville, Australien
118
119