Disseration Michael Ok - OPUS Würzburg

Analyse der Interaktion und die gezielte Modifikation
von angeborener Immunantwort gegenüber
Aspergillus fumigatus
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Michael Ok
aus Berlin-Reinickendorf
Würzburg 2011
Eingereicht am: .........................................................................................................................
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender:
………………………………………………..
Gutachter:
PD Dr. Jürgen Löffler
Gutachter:
Prof. Dr. Thomas Dandekar
Tag des Promotionskolloquiums: .............................................................................................
Doktorurkunde ausgehändigt am: .............................................................................................
„Frustra fit per plura quod potest fieri per pauciora“
(Ockham’s Razor – William von Ockham)
gewidmet Dr. theol. Peter Plank †
Inhalt
1
2
Zusammenfassung ........................................................................................................................... 1
1.1
Deutsch .................................................................................................................................... 1
1.2
Englisch .................................................................................................................................... 3
Einleitung ......................................................................................................................................... 4
2.1
3
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ..................................................... 4
2.1.1
Pilzinfektionen nach allogenen Stammzelltransplantationen ......................................... 7
2.1.2
Zunehmende Resistenzen von A. fumigatus gegen Antimykotika .................................. 9
2.1.3
Diagnose von invasiver Aspergillose ............................................................................. 10
2.2
Das angeborene Immunsystem und die First Line of Defence .............................................. 11
2.3
Evolutionär konservierte Strukturen pathogener Mikroorganismen ................................... 14
2.4
Immuntherapien mit Hilfe von dendritischen Zellen ............................................................ 16
2.5
Hämostase während einer invasiven Aspergillose ................................................................ 17
2.6
Ziele der Arbeit ...................................................................................................................... 18
Material und Methoden ................................................................................................................ 20
3.1
Material ................................................................................................................................. 20
3.1.1
Blutspender ................................................................................................................... 20
3.1.2
Leukoreduction system chambers (LRSCs) .................................................................... 20
3.1.3
Aspergillus fumigatus-Stämme ..................................................................................... 20
3.1.4
Primer- und FRET-Sonden ............................................................................................. 21
3.1.5
Antikörper, rekombinante Proteine und FACS-Farbstoffe ............................................ 22
3.1.6
Reaktionskits ................................................................................................................. 24
3.1.7
Reagenzien, Lösungen, Medien und Puffer................................................................... 25
3.1.8
Verbrauchsmaterialien .................................................................................................. 28
3.1.9
Gebrauchsgegenstände ................................................................................................. 29
3.1.10
Geräte ............................................................................................................................ 29
3.1.11
Programme .................................................................................................................... 30
3.2
Methoden .............................................................................................................................. 31
3.2.1
Isolation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut .................................... 31
3.2.2
Generierung von humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen ................. 32
3.2.3
Isolation von myeloiden dendritischen Zellen aus PBMCs ............................................ 33
3.2.4
Herstellung von humanen Serum .................................................................................. 34
3.2.5
Ex vivo T-Zellexpansion durch Antigen-Präsentation von DCs ...................................... 34
3.2.6
Anzucht von A. fumigatus-Stämme ............................................................................... 36
4
3.2.7
Inaktivierung von A. fumigatus Morphologien ............................................................. 37
3.2.8
Expression von A. fumigatus Antigenen im Pechia Pastoris-System ............................ 37
3.2.9
Konfrontationsassay mit A. fumigatus Morphologien .................................................. 37
3.2.10
Stimulation von dendritischen Zellen mit A. fumigatus-Antigenen .............................. 38
3.2.11
NFκB-Translokationsassay mit moDCs .......................................................................... 38
3.2.12
RNA-Isolation und reverse Transkription ...................................................................... 39
3.2.13
Relative quantitative RT-PCR ......................................................................................... 39
3.2.14
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)............................................................... 42
3.2.15
Western blot Analyse .................................................................................................... 43
3.2.16
Durchflußzytometrie ..................................................................................................... 44
3.2.17
Fluoreszenzmikroskopie ................................................................................................ 46
3.2.18
Aggregometrie mit humanen Thrombozyten und A. fumigatus Morphologien ........... 46
3.2.1
Bestimmung der Gerinnungsparameter........................................................................ 50
3.2.2
Statistische Analyse ....................................................................................................... 50
Ergebnisse...................................................................................................................................... 52
4.1
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1) ..................................................... 52
4.1.1
Die Aktivierung von NFκB .............................................................................................. 52
4.1.2
Differentielle Genexpression nach Stimulation mit Aspf1 ............................................ 52
4.1.3
Die Analyse der Interaktion mit dem A.fumigatus aspf1-Knockoutstamm .................. 54
4.1.4
Die Aufnahme und Präsentation von Aspf1 durch DCs ................................................. 55
4.1.5
Die Untersuchung der Aktivierung und Reifung von iDCs nach der Behandlung mit
Mitogillin 56
4.1.6
Die Stimulationskapzität gegenüber CD8+ T-Zellen durch Antigenpräsentation von
Aspf1-behandelten DCs (mLR)....................................................................................................... 57
4.1.7
4.2
Aspf1 induziert Apoptose bei iDCs ............................................................................... 58
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1 ............................................. 59
4.2.1
Untersuchung der zytotoxischen Effekte von Cat1 auf moDCs..................................... 59
4.2.2
Expression von Aktivierungs- und Reifungsmarker auf DCs nach der Stimulation mit
rekombinanten Proteinen ............................................................................................................. 59
4.2.3
Die Immunantwort von moDCs auf die Stimulation mit Cat1 wird durch die NFκBAktivierung vermittelt ................................................................................................................... 61
4.2.4
Die Aufnahme von mycelialer Katalase 1 (Cat1) durch dendritische Zellen ................. 63
4.2.5
Die ex vivo T-Zell-Expansion (mLR) ................................................................................ 65
4.2.6
Die Induktion der angeborenen Immunantwort von moDCs durch KatalaseKockoutstämme von Aspergillus fumigatus .................................................................................. 65
4.3
Aggregometie und Hämostase .............................................................................................. 66
5
Diskussion ...................................................................................................................................... 69
5.1
Die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1) ...................................................................................... 69
5.2
Die myceliale Katalase 1 (Cat1) moduliert die Immunantwort von humanen dendritischen
Zellen 73
5.3
Collagen-induzierte Aggregation von Thrombozyten bei IA ................................................. 77
5.4
Ausblick.................................................................................................................................. 78
6
Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 80
7
Anhang........................................................................................................................................... 90
7.1
Abkürzungen, Einheiten und Genbezeichungen ................................................................... 90
7.2
Sequenzen ............................................................................................................................. 94
7.2.1
Nukleinsäuresequenzen von Amplikons untersuchter Gene in der relativen qRT-PCR 94
7.2.2
Proteinsequenzen von rekombinant hergestellten A. fumigatus-Antigenen im P.
pastoris-System ............................................................................................................................. 97
8
Curriculum vitae .......................................................................................................................... 100
9
Publikationen............................................................................................................................... 102
9.1
Veröffentlichte Studien ....................................................................................................... 102
9.2
Präsentationen .................................................................................................................... 106
Danksagung ......................................................................................................................................... 107
Erklärung ............................................................................................................................................. 109
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Differentielle Expression von Genen ausgewählter Zytokine und Chemokine nach der
Stimulation mit Aspf1 bzw. Crf1 ............................................................................................................ 53
Tabelle 2: ELISA nach der Stimulation von moDCs mit Gel1, Mep1, Pep1 und Sod1 ........................... 63
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Aspergillus fumigatus ......................................................................................................... 4
Abbildung 2: Cleistothecium von Aspergillus fumigatus ......................................................................... 5
Abbildung 3: Die First Line of Defense und die zweite Verteidigungslinie des angeborenen
Immunsystems ...................................................................................................................................... 12
Abbildung 4: Phagozytose von geschwollenen A. fumigatus Konidien ................................................ 14
Abbildung 5: Aufbau der Zellwand von A. fumigatus ........................................................................... 15
Abbildung 6: Isolation von PBMCs ........................................................................................................ 32
Abbildung 7: Ermittlung der Annealingtemperatur .............................................................................. 40
Abbildung 8: Messreihen am Aggregometer ........................................................................................ 47
Abbildung 9: ELISA mit Überständen nach Stimulation mit Aspf1 ........................................................ 54
Abbildung 10: ELISA mit Überständen nach Stimulation verschiedenen Pilzstämmen ........................ 55
Abbildung 11: Fluoreszenzmikroskopie von stimulierten DCs mittels eines Konfokalmikroskops ....... 56
Abbildung 12: Die Untersuchung der Oberflächenmarkerexpression bei iDCs nach 48-stündiger
Behandlung mit Aspf1 bzw. Crf1 ........................................................................................................... 57
Abbildung 13: Antigenpräsentation induziert T-Zellproliferation (mLR) .............................................. 58
Abbildung 14: Apoptoserate bei iDCs nach Stimulation mit Aspf1 ....................................................... 59
Abbildung 15: Expression von Aktivierungs- und Reifungsmarker nach Cat1-Stimulation................... 60
Abbildung 16: NFκB Aktivierung nach Stimulation mit Cat1 ................................................................. 61
Abbildung 17: ELSIA nach Stimulation von moDCs bzw. mDCs mit Cat1 .............................................. 62
Abbildung 18: Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation von Cat1 durch moDCs bzw. mDCs .......... 64
Abbildung 19: ELSIA mit Zellkulturüberständen nach Konfrontation von moDCs mit Aspergillus
fumigatus-Morphologien ...................................................................................................................... 66
Abbildung 20: Auswertung der Aggregometriedaten mittels des Perl-Programms ............................. 67
Abbildung 21: Ermittlung von Gerinnungsparametern nach der Behandlung mit Aspergillus
fumigatus-Morphologien ...................................................................................................................... 68
Abbildung 22: Mitogillin (Aspf1) als aktives Ribotoxin in DCs ............................................................... 72
Abbildung 23: Aggregation durch Collagen bzw. ADP........................................................................... 78
Deutsch
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
1.1 Deutsch
Die invasive Aspergillose stellt eine ersthafte Erkrankung sowie auch eine signifikante Ursache von
Morbidität und Mortalität bei verschiedenen Patientengruppen dar. Dabei tritt sie hauptsächlich
durch den opportunistischen Pathogen Aspergillus fumigatus hervorgerufen mit einer Inzidenz von
4% bis 15% vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten nach allogenen hämatopoetischer
Stammzelltransplantationen (HSCT) oder Organtransplantationen auf und führt bei 40% bis 90% der
Fälle zum Tod des Patienten. Die Behandlung dieser Hochrisikogruppe erfolgt bestenfalls mit
Antimykotika prophylaktisch, denn eine schnelle sowie auch verlässliche Diagnose von invasiver
Aspergillose läßt sich aufgrund der hohen zeitlichen Latenz des Pilzes und dem Defizit an Sensitivität
bzw. Spezifität in vielen Fällen nicht ermitteln. Zusätzlich steigt die Zahl der Resistenzen von
Aspergillus-Stämmen gegen die verschiedenen Antimykotika stetig an, so dass klinische und
ökonomische Nebenwirkungen unvermeidbar sind. Als Alternative zur konventionellen Behandlung
mit Azolen stellt eine Immuntherapie mittels Antigen-behandelten dendritischen Zellen (DCs) dar,
welche durch Präsentation von Aspergillus fumigatus-Antigenepitopen eine spezifische ex vivo TZellenexpansion von allogenen CD8+CD3+ T-Zellen bewirken kann und damit ein schonenderes Mittel
für den Patienten ist. Dazu wurden sieben verschiedene rekombinante Proteine aus A. fumigatus in
dieser Arbeit charakterisiert und deren Potential ermittelt, bei DCs eine pro-inflammatische
Immunantwort auszulösen. Es stellte sich heraus, dass sowohl die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1) als
auch die myceliale Katalase Cat1 in der Lage waren, den nukleären Faktor kappa B (NFκB) zu
aktivieren und eine Translokation der Untereinheit p65 in den Nukleus zu induzieren, woraufhin
Gene von pro-inflammatorischen Zytokine und Chemokine sowie auch von Aktivierungs- und
Reifungsmarker der DCs exprimiert wurden. Im Gegensatz zum Aspf1, war es beim Cat1 zusätzlich
auch möglich gewesen eine Verifizierung auf Proteinebene für segregierte Zytokine und Chemokine
bzw. Oberflächenmarker zu erhalten. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass die
Zytotoxizität von Cat1 entsprechend der unbehandelten Zellen gewesen ist und dass es den Cat1behandelten moDCs gelang nach der Aufnahme des Antigens und dessen Prozessierung durch die
darauffolgende Präsentation der Proteinepitope über den MHC II Komplex eine ex vivo-Aktivierung
von autologen zytotoxischen T-Zellen zu erreichen. Damit ist nun ein potentieller Kandidat für eine
auf
Immuneffektorzellen
basierte
Immuntherapie
gegen
invasive
Aspergillose
für
immungeschwächte Patienten gefunden. Ergänzt wurde diese Arbeit mit der experimentellen
Untersuchung von Hämostase während einer invasiven Aspergillose, da gehäuft pathologische
Beobachtungen von lokalen Einblutungen bei Patienten mit pulmonaler Aspergillose verzeichnet
1|Seite
Deutsch
Zusammenfassung
wurden. Es stellte sich heraus, dass die durch Collagen induzierte Aggregation sich durch aktive
Pilzmorphologien beeinträchtigen läßt, wohingegen die untersuchten Gerinnungsparameter nicht
betroffen gewesen sind. Dies verdeutlicht neben der bereits bekannten Bedeutung der
Thrombozyten als antimikrobielle Komponente im Blut nun auch ihrer Empfindlichkeit gegenüber
sezernierten oder Zellwand-gebundenen Aspergillus fumigatus-Faktoren während der invasiven
Aspergillose.
2|Seite
Englisch
Zusammenfassung
1.2 Englisch
Invasive Aspergillosis is a serious fungal disease and contributes significantly to morbidity and
mortality in different patient cohorts. Predominantly caused by one major opportunistic pathogen
named Aspergillus fumigatus, the incidence for invasive aspergillosis of 4% to 15% can be found
mainly in immunocompromised patients after allogeneic hematopoetic stem cell transplantations
(HSCT) or solid organ transplantations and leads in 40% to 90% of all affected cases to death. The
clinical approach for this high risk group consists at the best of the treatment with antimycotics in a
prophylactic way. Furthermore, fast and reliable diagnostic analysis for invasive aspergillosis misses
the detection of A. fumigatus in many cases and therefore is still problematic, which is mainly caused
due to the high latency of time for the fungal growth and the deficit in sensitivity and specificity,
respecively. Additionally, steadily increasing numbers of resistant Aspergillus-strains against the
different antimycotics complicate the situation so that clinical and economic side effects are
unavoidable. Alternatively to conventional treatment with azoles is the immunotherapy with
antigen-treated dendritic cells, which can be instrumentalized for a specific ex vivo T-cell expansion
of allogenic CD8+CD3+ T-cells mediated by presentation of antigen epitopes and is a gently approach
for patient’s care. Therefore, seven different recombinant A. fumigatus proteins were characterized
in this thesis and their potential of inducing DC`s immune response in a pro-inflammatory fashion
was determined. It could be shown that the ribonuclease Mitogillin (Aspf1) as well as the mycelial
catalase Cat1 was able to activate the nuclear factor kappa B (NFκB) and induced afterwards the
translocation of subunit p65 into the nucleus, whereupon genes of pro-inflammatory cytokines and
chemokines as well as activation and maturation marker of DCs were expressed. In contrast to Aspf1,
Cat1 finally caused the segregation of cytokines and chemokines in DCs and furthermore the
upregulation of cell surface marker. Moreover, lower cytotoxicity was determined in experiments
with Cat1 and also moDCs, which were treated with the recombinant antigen, were able to
internalize the protein, processed it and afterwards to activate ex vivo autologic cytotoxic T-cells by
presentation of protein epitopes over MHC II complex coupling. Thus, a potential candidate for an
immune effector cell-based immunotherapy for invasive aspergillosis in human patients has been
found. This work was complemented by the experimental investigation of hemostasis during invasive
aspergillosis because of the strong impact of observed local bleeding in patients with pulmonary
aspergillosis. It exposed that Collagen-induced aggregation was impaired by active fungal
morphologies, whereas analysed coagulation parameters in sera were not affected. Beside the
already known meaning of thrombocytes as antimycotic component in human blood, this impact
elucidate also the sensitivity of platelets to segregated or cell wall-accociated Aspergillus fumigatus
factors during invasive aspergillosis.
3|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
2 Einleitung
2.1 Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
In der freien Natur findet sich der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus hauptsächlich in seiner
primären ökologischen Nische, dem Erdboden oder der verrottenden Vegetation, wieder. Es ist ein
saprotropher Organismus, der eine signifikante Rolle beim globalen Recycling von Kohlenstoff und
Stickstoff aus faulender Biomasse spielt und sich in seiner Dauerform, der Spore, über die Luft
verbreitet (1). Die Spore, welche auch als Konidie bezeichnet wird, hat einen Durchmesser von 2,5 bis
3µm und entspringt mit weiteren Konidien kettenförmig angeordnet den Konidiophoren
(Abbildung 1). A. fumigatus ist eine thermophile Spezies, so dass der Pilz bei Temperaturen von bis zu
55°C wächst und widersteht Temperaturen von bis zu 70°C (2). Aufgrund des geringen Durchmessers
der Konidien ist die Verbreitung des Pilzes durch die Luft ermöglicht und deshalb tritt er auch
weltweit in der Atmosphäre auf.
Abbildung 1: Aspergillus fumigatus
Die scan-elektronenmikroskopische Aufnahme (SEM)
einer Konidiophore mit einer 1030-fachen Vergrößerung.
Quelle: www.sciencephotolibrary.com
Für Aspergillus fumigatus waren bis vor Kurzem keine Teleomorphe (sexuelles Stadium) bekannt, bei
denen nach meiotischer Rekombination Ascosporen gebildet werden und damit diese zu einem
pleomorphen Entwicklungszyklus führen (3). Es konnte nachgewiesen werden, dass der
opportunistisch pathogene Pilz A. fumigatus in vitro nach einer Inkubationszeit von 6 Monaten im
Dunkeln bei 30°C auf Haferbreiagar hellgelbe und reife Cleistothecien mit einem Durchmesser von
150-500µm ausbildet, welche sphärische Fruchtkörper darstellen, diese meist in einem Cluster von
4|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
zwei bis fünf Cleistothecien auftreten und charakteristisch für das Geschlecht von Aspergillen sind (4)
(Abbildung 2). Nachdem diese Fruchtkörper zusammenfallen, lassen sich die linsenförmigen,
gelbweißen bis grünweißen Ascosporen erkennen (Durchmesser von 4-5µm).
Abbildung 2: Cleistothecium von Aspergillus fumigatus
Die Scan-Elektromikroskopieaufnahme eines Cleistotheciums mit
einem Durchmesser von ca. 500µm (links; Messbalken entspricht
100µm). Im Lichtmikroskop ist erkennbar, dass die beiden
Cleistothecien von Konidienketten, welche die Anamorphe
darstellen, umgeben sind (rechts; Messbalken entspricht 400µm).
Quelle: O’Gorman et al. 2009
Nach der Entdeckung des sexuellen Entwicklungszyklus von A. fumigatus wurde neben seiner
Bedeutung als Mittel für molekularbiologische Untersuchungen auch darauf hingewiesen, dass die
dabei auftretende rekombinante Verteilung des genetischen Erbguts einen evolutionären Vorteil des
Pilzes beim Einfluss auf die Empfindlichkeit von immunsupprimierten Patienten auf den Pilz haben
könnte. Bei solchen Patienten treten aufgrund der reduzierten Abwehrmechanismen gegen
extrinsische Mikroorganismen häufig Fälle von Infektionen auf, welche für immunkompetente
Menschen bereits vor dem Erscheinungsbild einer Infektion vermieden werden. Da der Pilz unter den
normalen Bedingungen deshalb keine Gefahr für den menschlichen Organismus darstellt und dieser
aus diesem Grund auch normalerweise kein Pathogen ist, wird er als opportunistischer Pathogen
bezeichnet, bei dem die Pathogenese erst nach einer Beeinträchtigung des Immunsystems auftritt. In
diesem Zusammenhang konnte ein signifikant erhöhter Beitrag zur Virulenz beim sich sexuell
reproduzierenden A. fumigatus mit mating type Locus MAT1-1, welcher die alpha-Domäne des HMGGens (high-mobility group) darstellt, in Bezug auf die Invasion in geschwächte Organismen
nachgewiesen werden (5). Eine Schwächung des Immunsystems kann viele Ursachen haben; so sind
Erkrankungen des Immunsystems wie Neutropenie, bei der die Anzahl an Granulozyten
krankheitsbedingt verringert ist, oder HIV-Infektionen, bei denen hauptsächlich CD4+ T-Helferzellen
zerstört werden, nur zwei Bespiele. Meist stellt die Infektion mit Aspergillus fumigatus ein
Risikofaktor bei Patienten mit einer gewollten Immunsuppression durch Immunsuppresiva wie den
Glucocorticoiden dar. Dies erfolgt üblicherweise vor Organtransplantationen, bei der allogenen
5|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) und auch während der Behandlung von
Patienten mit einer Autoimmunerkrankung wie beispielsweise der multiplen Sklerose. Eine HSCT
wird in den unterschiedlichsten Fällen durchgeführt, wie bei Kindern mit Thalassämie major (6),
welche eine rezessive Erbkrankeit ist und in ihrer homozygoten Form sich vollständig manifestiert.
Dabei fehlen den Betroffenen die β-Globinketten und es kommt zum Überschuss von γ- und δGlobin, wodurch instabile Erythrozyten entstehen und diese bereits im Knochenmark wieder
absterben. Weitere Beispiele für eine Behandlung mittels HSCT wären HIV-Infektionen (7), die
chronische granulomatöse Erkrankung (CGD) (8) oder Wegener-Granulomatose, die nach dem
Pathologen Friedrich Wegener bezeichnet wurde und zu Entzündungen der Gefäße führt,
myelodysplastische Syndrome (9), welche aufgrund von genetischen Veränderungen zu unreifen und
fehlerhaften Blutzellen führen, sowie weitere Bluterkrankungen. Vorwiegend jedoch findet die HSCT
Anwendung bei den verschiedenen Formen von Leukämien (10). Für eine hämatopoetische
Stammzelltransplantation wird Knochenmark des Spenders entnommen und daraus die CD34+ Zellen
isoliert, wobei eine vollständige Aufreinigung dieser Zellen nicht möglich ist. Daher besteht für den
Empfänger stets ein Risiko für eine Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease;
GvHD), denn mitgebrachte T-Zellen des Spenders, welche den Empfänger als fremd erkennen,
werden aktiviert, proliferieren und führen zu einer Reaktion gegen den Wirt. Diesen Patienten wird
deshalb im Anschluss an die Transplantation in der Regel ein Regime an Glucocorticoiden
verabreicht, die die verbleibenden Reste des mitgebrachten adaptiven Immunsystems in ihrer
Fähigkeit zur Proliferation und zur Freisetzung von Interleukin-1 unterdrücken sollen, aber damit
auch als Nebenreaktion zu einem erhöhten Risiko für Infektionen wie beispielsweise der invasive
Aspergillose führen. Bei diesen Patienten handelt es sich deshalb auch um eine Hochrisikogruppe
(11). Die Inzidenz für eine invasive Aspergillose innerhalb dieser Gruppe liegt bei 4 – 15% und die
betroffenen Patienten weisen eine Letalität von 60 – 85% auf (12, 13). Die frühzeitige Erkennung
einer solchen Pilzinfektion würde dazu beitragen das Risiko zu minimieren, jedoch stellt sich das als
relativ schwer heraus, da der Pilz eine hohe zeitliche Latenz aufweist und die Diagnosemethoden an
Sensitivität und Spezifität noch zu wünschen übrig lassen. Eine Behandlung der betreffenden Fälle
kann daher bestenfalls prophylaktisch durch den Einsatz von Antimykotika erfolgen. Dies aber hat zur
Folge, dass entsprechende klinische und ökonomische Nebenwirkungen unvermeidbar sind und ein
signifikantes Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko erhalten bleibt. Im Jahr 2008 wurden über 10.000
Patienten in den USA wegen IA stationär im Krankenhaus behandelt, so dass dies eine zusätzliche
Aufenthaltszeit von durchschnittlich 17,7 Tagen pro Patient geführt hat und die Kosten dafür bei
96.000 USD lagen (14).
6|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
2.1.1 Pilzinfektionen nach allogenen Stammzelltransplantationen
Die zunehmenden Inzidenzen von invasiven Pilzinfektionen insbesondere Aspergillosen
beeinträchtigen den positiven therapeutischen Ausgang von Patienten mit hämatologischem Krebs
oder von Transplantatempfängern (15). Dabei sind bereits bessere primäre Behandlungen als
Alternative zur konventionellen Antimykotika-Therapie mit Amphotericin B entwickelt worden,
jedoch zeigen die Verträglichkeit und das Überleben der Patienten, dass weitere Verbesserungen
nötig sind. Es wird zum Primärziel gesetzt, durch eine Prophylaxe gegen den Pilz die Inzidenzrate der
durchbrechenden invasiven Pilzinfektionen für die Patienten zu reduzieren, da die Erfassung einer
Verringerung der möglichen Sterblichkeit bedingt durch die Pilzinfektion sich als schwierig erweist.
2.1.1.1 Primäre Prophylaxe
Von allen Azolen wurde Fluconazol am häufigsten in gut designten Prophylaxe-Studien gegen
Pilzinfektionen verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass bei einer orale Dosierung zwischen 50mg/d
und 400mg/d der prophylaktische Effekt sich mit der maximalen Gabe von 400mg/d am Deutlichsten
von dem des Placebos unterschied. Nebenbei konnte auch die longitudinale Beobachtung über 75
Tagen zeigen, dass über die antimykotische Wirkung hinaus eine geringere Inzidenz für intestinales
GvHD festzustellen war (16-19). Im Gegensatz zu Fluconazol besitzt Itraconazol ein breiteres
Anwendungsspektrum, welches sich, anstatt nur gegen Candida albicans besonders wirksam zu sein,
über verschiedene Mitglieder der Candida-Familie erstreckt und sogar bis hin zu den Schimmelpilzen
reicht. Dieses Präparat hat jedoch den Nachteil, dass es verzögert zu einem adäquaten Level an
Wirkstoff im Plasma führt und sich daher für den Beginn einer Prophylaxe nicht als geeignet erweist.
Für die Fortführung aber ist es mit einer Gabe von 2,5mg/kg Körpergewicht kombiniert mit dem
Polyen Nystatin (500.000IU) 4-mal täglich sehr effektiv gegen Candidämie. Bei der dabei
verwendeten Dosierung konnten aber Infektionen mit Schimmelpilzen und der daraus folgende Tod
der Patienten nicht vorgebeugt werden. Im Vergleich zu Fluconazol zeigte es auch, dass die Zahl der
Pilzinfektionen und die Mortalität nicht zugenommen haben, wodurch es zumindest gegen das breite
Spektrum an invasive Candidiasen als Verbesserung zu werten ist (20-24). Das Posaconazol ist eine
weitere Azolvariante und konnte mit einer Dosierung von 600mg/d einen signifikanten Rückgang von
sowohl der nachgewiesenen und wahrscheinlichen invasiven Pilzinfektionen als auch der
Mortalitätsrate vorweisen, wobei es sich hauptsächlich um Inzidenzraten für Aspergillosen gehandelt
hatte. Bedauerlicherweise kam in der Studie auch heraus, dass die Behandlung mit dem Posaconazol
im Gegensatz zu Fluconazol und Itraconazol eine höhere Rate an möglichen oder wahrscheinlichen
unerwünschten Komplikationen bei Patienten hervorgerufen hatte (25). In einer weiteren Studie
7|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
konnte aber auch gezeigt werden, dass das Posaconazol ebenso verträglich wie auch sicher im
Vergleich zum Fluconazol ist (26). Daher wird es sowohl bei der Einleitung einer Chemotherapie, die
bei
Patienten
mit
beispielsweise
akuter
myeloischer
Leukämie
(AML)
oder
einem
myelodysplastischen Syndrom (MDS) eine induzierte Neutropenie bewirkt, als auch bei Patienten mit
GvHD empfohlen. Ein anderes Azol, das Voriconazol, wurde in noch zu geringen Studien ausreichend
untersucht, um in einen Vergleich mit bestehender Antimykotoka bei der Primärprophylaxe gebracht
werden zu können. Andere Alternativen stellen das Ketoconazol (27-35), das Miconazol (36, 37) und
das Clotrimazol (38) dar, wobei das Erste nur in wenigen Zentren getestet wurde und das Zweite
keine signifikante Reduktion der invasiven Pilzinfektionen sogar bei einer Dosis von 2g/d gezeigt
hatte.
Die
Kaplan-Meier-Analyse
zeigte
für
ein
Regime
mit
Clotrimazol,
dass
die
Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten unter der Behandlung mit Fluconazol im Vergleich zum
Clotrimazol deutlich höher gewesen ist.
Allen Triazolen ist gemeinsam, dass sie den Ergosterol-Syntheseweg in Aspergillus fumigatus
inhibieren könnten, sofern sie in den Pilz eindringen würden, und dadurch den Aufbau der
Plasmamembran verhindern (39).
Mit Hilfe von Polyenen wie dem Amphotericin B und dem Nystatin existiert ein weiteres Mittel um
gegen Pilzinfektionen bei Patienten mit einem gesteigerten Risiko auf Pilzinfektionen vorzugehen.
Das Amphotericin B wird in verschiedener Form verabreicht – so besteht eine Behandlung durch
Inhalation, wobei das Amphothericin B direkt in die Lunge gelangt, eine weitere durch eine Infusion
mit Amphothericin B-Deoxycholat und wiederum eine andere Variante durch eine Lipid-basierte
Komposition von Amphothericin B, bei der das Amphothericin B in Liposomen eingebunden vorliegt.
Das Präparat besitzt generell ein breites Wirkungsspektum und wird am Häufigsten als orale
Suspension mit einer Dosierung von 1,5g/d bis 3g/d angewendet. Für die Inhalation wird die
Komposition des Amphothericin B-Lipid-Komplex mit einer Dosis von 50mg/d gewählt, die in einer
Studie zwar zu einer Verringerung von invasiver pulmonaler Aspergillose geführt hat, dabei aber
nicht die Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten bei einer bereits aufgetretenen Infektion
verbesserte. Außerdem ist das Präparats dabei nur in der Lunge äußerst wirksam und hat zusätzliche
Nebenwirkungen (40-44). Die Infusion von Amphothericin B konnte nur mit 0,2mg/kg/d eine
vergleichbare Effizienz bei der Vorbeugung von invasiven Pilzinfektionen im Vergleich mit
Fluoconazol vorweisen, wobei jedoch die Toxizität des Amphotericin B dadurch höher gewesen ist als
die des Fluoconazol (45).
Im Falle des Nystatins gibt es bedauerlicherweise noch nicht genug Daten, um auf seine Wirksamkeit
schließen zu können (46, 47). Lediglich die Verwendung als Co-Faktor zum Itraconazol zeigt gute
Ergebnisse (24).
8|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
Die Gruppe der Echinocandine zur Prophylaxe gegen invasive Pilzinfektionen umfasst das
Caspofungin und das Micafungin. Dabei entspricht die Wirkung des Caspofungin bei einer Dosis von
50mg/d derjenigen des Itraconazols mit einer Dosis von 400mg/d (48). Eine gleiche Dosierung des
Micafungins konnte in einer Studie zeigen, dass es zur Verringerung der invasiven Candidiasen führt,
jedoch aber nicht die Aspergillosen signifikant reduzieren konnte (49).
Das Defizit an Wirkungsspektrum und positivem Ausgang der Infektionen bzw. indiskutablen hohen
Raten an Morbidität und Mortalität lassen den Wunsch offen, dass vor allem mehr Therapien
benötigt werden, die das Immunsystem in der Bekämpfung von Infektionen einbinden.
2.1.1.2 Sekundäre Prophylaxe
Betrachtet man die Rückfallrate von 30 – 50% der Patienten nach einer invasiven
Pilzinfektion, so wird deutlich, dass nach der Erstbehandlung eine weiterführende Behandlung der
Patienten notwendig ist. Dabei stellt sich die sekundäre Prophylaxe mit Voriconazol als ein Mittel zur
Verfügung, um die Sterblichkeitsrate aber auch die Belastung der Patienten durch die Erkrankung zu
verringern (50). Mit einer intravenösen (4mg/kg/12h) oder einer oralen (200mg/12h) Gabe des
Antimykotikums lässt sich eine Inzidenzrate von 6,7%±3,6% der Rückfälle erreichen und somit stellt
diese Behandlung eine deutliche Verbesserung dar.
Zusammen betrachtet sind die nun inzwischen verringerte Rückfallrate nach einer aufgetretenen
invasiven Aspergillose und die Gesamtheit der zuvor auftretenden Fälle an möglicher und
wahrscheinlicher Aspergillose nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation weiterhin ein
bestehendes Problem bei der Behandlung der Patienten. Ein bislang noch zu gering betrachteter
Risikofaktor für die Problematik bei einer Antimykotikatherapie ist eine stetig steigende Zunahme an
Resistenzen des Pilzes gegen diese Präparate.
2.1.2 Zunehmende Resistenzen von A. fumigatus gegen Antimykotika
In einer Studie von Pfaller et al. wurde über eine Dauer von neun Jahren die sinkende
Empfindlichkeit von Aspergillus fumigatus gegenüber diversen Antimykotika beobachtet, wobei sich
herausgestellt hat, dass gegenüber Voriconazol die geringste Resistenzrate bei A. fumigatus-Isolaten
mit 0,0% bis 1,6% vorzufinden war. Im Falle der weiteren beiden Triazole, die in dieser Studie
untersucht wurden, konnte ermittelt werden, dass gegenüber Itraconazol bei 0,7% bis 4,0% der
nicht-Wildtypen ein geringfügig erhöhter Prozentsatz und gegenüber Posaconazol bei 1,1% bis 5,7%
9|Seite
Der opportunistische Schimmelpilz Aspergillus fumigatus
Einleitung
der A. fumigatus-Isolaten der größte Anteil an resistenten Stämmen vorzufinden war (51). Die
erstaunliche Fähigkeit von Aspergillus fumigatus, in der Lage zu sein, gegenüber allen bekannten
Azolen einen Resistenzmechanismus zu entwickeln, erfordert von Seiten der Entwicklung solcher
Präparate einen ebenso stetigen Fortschritt, welcher sich bereits durch die Einbeziehung der Polyene
und Echinocandine über die Azole hinaus erstreckt. Der Hauptmechanismus in der Resistenz gegen
Azole
besteht
in
der Überexprimierung von Effluxpumpen
der ABC-Transporter-
und
Hauptvermittler-Superfamilie (52). Eine weitere Möglichkeit einer etwaigen Kombination von
Antimykotika könnte daher im Targeting dieser Proteine bestehen.
2.1.3 Diagnose von invasiver Aspergillose
Damit invasive Pilzinfektionen angemessen behandelt werden können, müssen sie frühzeitig
erkannt werden, wobei hier zwei molekularbiologische Möglichkeiten der Diagnostik angesprochen
werden sollen, da diese aufgrund der hohen Sensitivität im Vergleich zu mikrobiologischen oder
radiologischen Verfahren die frühste Detektion einer invasiven Aspergillose darstellen.
2.1.3.1 Der „Golden Standard“
Mittlerweile hat sich der Nachweis von aus Aspergillus fumigatus stammenden
Galactomannan (GM) in der Diagnostik von invasiven Aspergillosen bei Patienten nach einer
allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation etabliert (53). Dabei wird im ELISA geprüft,
ob in Plasmaproben der Patienten über die Dauer ihrer Behandlung mit Glucocorticoiden neben der
Detektion von β-D-Glucanen auch die von Galactomannan, einem Mannosemolekühl mit an den
Seitenketten angehängten Galactosemolekülen, möglich ist (54, 55). In den Konsensusdefinitionen
für invasive Pilzerkrankungen der European Organization for Research and Treatment of Cancer and
Mycoses Study Group (EORTC/MSG) wurde dieser Test als Standardverfahren aufgenommen (56). In
der Studie von Maertens et al. stellte sich anfangs heraus, dass eine Spezifität von durchschnittlich
94,8% erreicht wurde, wobei eine hohe Divergenz zwischen Erwachsenen mit 98,2% und Kindern mit
47,6% bestand. Außerdem stellte die relativ geringe Sensitivität ein Problem bei der frühzeitigen
Detektion von GM dar, denn Fälle mit bewiesener IA konnten lediglich zu 64,5% im ELISA als positiv
verifiziert werden. Zusätzlich waren die Seren von wahrscheinlicher und möglicher IA mit 16,4% und
25,5% zu einem noch viel geringeren Prozentsatz zutreffend. Dies lässt den Schluss zu, dass neben
dem Nachweis von Galactomannan bzw. β-D-Glucanen ein sensitiverer und im Sinne der positiven
10 | S e i t e
Das angeborene Immunsystem und die First Line of Defence
Einleitung
Detektion reproduzierbarer Test wie dem DNA-Nachweis durch Real-time PCR in den Blutproben
durchgeführt werden sollte.
2.1.3.2 Nachweis von Pilz-DNA mittels PCR
Im Jahr 2006 wurde die Initiative der europäischen Aspergillus-PCR gegründet und dabei zum
Ziel gesetzt, eine standardisierte Methode zum verlässlichen Nachweis von Aspergillus-DNA in Seren
von Patienten zu etablieren. Dieser Zusammenschluss von Arbeitsgruppen innerhalb der
International Society for Human and Animal Mycoses (ISHAM) umfasste mehr als 60 Zentren, welche
über ganz Europa verteilt waren und zusätzlich auch Zentren in Australien und dem mittleren Ostens
assoziativ eingeschlossen hatten. Die erste Veröffentlichung der Ergebnisse dieser Arbeit im Jahr
2007 zeigte, dass eine Spezifität von 89,6% und eine Sensitivität von 64,5% bei der Detektion von
DNA in Seren von Patienten, welche in den verschiedenen Stufen der invasiver Aspergillose gemäß
der Definition von EORTC einzugliedern gewesen sind, erreicht werden konnte. Dabei war das
Ergebnis vom Alter des Spenders unabhängig und die Sensitivität lag bereits zu diesem Zeitpunkt auf
demselben Level des ELISAs. Ein Jahr später ließ sich die Sensitivität auf 80,6% steigern, bei nahezu
gleichbleibender Spezifität von 86,3% (57, 58).
Die Feststellung von Pilz-DNA in Patientenseren stellt auch einen ökonomischen Vorteil bei der
Diagnose von IA dar, weil der materielle Aufwand für die Durchführung einer PCR im Vergleich zum
ELISA geringer ist.
2.2 Das angeborene Immunsystem und die First Line of Defence
Bei immungeschwächten Patienten können A. fumigatus-Konidien auf dem alveolaren Epithel
auskeimen und anschließend über die alveolaren Gefäße eindringen, wobei sie die First Line of
Defence der angeborenen Immunabwehr aus pulmonaler Schleimhaut, alveolaren Makrophagen und
dendritischen Zellen bestehend passieren (3). Die Patienten sind, ebenso wie alle anderen
Menschen, den Keimen fortlaufend ausgesetzt. Lediglich die Keimbelastung lässt sich aufgrund von
Filtersystemen innerhalb der Gebäude verringern, was jedoch nicht vor einer Erkrankung bewahrt.
Ein sehr unterschätzter Punkt ist leider auch das Einschleppen von Aspergillussporen in der Lunge
direkt vor der Aufnahme des Patienten im Krankenhaus. Jedoch hängt das Risiko für Patienten durch
A. fumigatus infiziert zu werden unter anderem von der Konzentration der Konidien in der
eingeatmeten Luft bzw. in der Lunge ab. Die Konidien sind allgegenwärtig in der Umgebung
vorzufinden, aber die Sporenkonzentration kann beträchtlich variieren, so dass diese von 0,2 bis 15
11 | S e i t e
Das angeborene Immunsystem und die First Line of Defence
Einleitung
Konidien/m3 Luft in spezialisierten Krankenhäusern bis zu 109 Konidien/m3 Luft in Umgebungen mit
bestimmten Bedingungen der Kompostierung reicht (59-61). Beim Einatmen der Konidien durch
gesunde Menschen werden diese von Teilen der First Line of Defence abgewehrt. Dabei handelt es
sich zunächst um die Lungenschleimhaut, die durch eine verschiedenartige Zusammensetzung des
Schleims die Sporen bindet und neutralisiert. Sind die Eindringlinge erst einmal in der Lunge
angekommen, findet der Pilz ein feuchtwarmes Milieu vor, welches für das Auskeimen eine ideale
Voraussetzung darstellt und zum Anschwellen der Konidie führt. Dabei wird der gesamte
Metabolismus mobilisiert und die ersten ausgeschiedenen Metabolite gelangen auch auf das
Lungenepithel. Jedoch wehren Makrophagen den Pilz daraufhin ab, indem sie die Konidien aufsuchen
und phagozytieren. Sollte dies aufgrund verschiedener Ursachen nicht geschehen, beginnt die
Konidie auszukeimen. Der dabei gebildete Keimschlauch wächst und dringt in das Lungenepithel ein.
Bei der Invasion des Pilzes erfolgt dann die Konfrontation mit dendritischen Zellen im interstitiellen
Raum und der Keimling wächst weiter bis zum Stadium der Hyphe, die während des Wachstums in
ein Lungengefäß eindringt und dabei nun der zweiten Verteidigungslinie der angeborenen
Immunantwort begegnet, welche sich aus NK-Zellen, Monozyten und polymorphonukleären
Leukozyten (PMNs) zusammensetzt und sich im kapillarem Lumen befindet (Abbildung 3).
Abbildung 3: Die First Line of Defense und die zweite Verteidigungslinie
des angeborenen Immunsystems
Die schematische Darstellung von Komponenten der Wirtsantwort gegenüber
inhalierten Aspergillus-Konidien. Quelle: J. P. Park and B. Mehrad, 2009
12 | S e i t e
Das angeborene Immunsystem und die First Line of Defence
Einleitung
Bei der Abwehr von Aspergillus fumigatus ist bei gesunden Menschen die First Line of Defence in
permanentem Einsatz und verhindert damit erfolgreich ein Wachstum des Pilzes bis zum
Hyphenstadium. Dabei stellen die dendritischen Zellen eine entscheidende Komponente dar, denn
ihre Fähigkeit, den Pilz ebenso wie Makrophagen durch Phagozytose zu neutralisieren, wird
zusätzlich mit der Eigenschaft, die pilzspezifischen Antigene verarbeiten und nach Einwandern in das
Lymphknotengewebe an spezifische T-Zellen präsentieren zu können, ergänzt (62).
Diese spezielle Komponente der angeborenen Immunantwort hat ihren Ursprung im Knochenmark
bei den MDPs (monocyte, macrophage and DC precursors), welche sich erst zu CDPs (common DC
precursors) differenzieren müssen, damit das Entwickungsschicksal der dendritischen Zellen
festgelegt wird (63). Man unterscheidet zwischen zwei Klassen von dendritischen Zellen; zum einen
gibt es die myeloiden DCs, welche die größte Untergruppe an DCs mit den ihnen eigenen
Oberflächenmarkern CD1c+ (BDCA-1), CD11chigh und CD123low im menschlichen Blut darstellen, und
zum anderen die plasmazytoiden dendritischen Zellen, welche durch den Oberflächenmarker CD303
(BDCA-2) definiert sind (64-69).
Die Exposition von Strukturen der Pathogene an DCs löst eine pro-inflammatorische Immunantwort,
vermittelt beispielsweise durch Toll-like Rezeptoren wie TLR2 und TLR4 über die Adapterproteine
TRIF und MyD88 mit einer darauf resultierenden Aktivierung von NFκB, zunächst auf
Genexpressionsebene und anschließend auf Proteinebene aus (70-73). Dies führt zu einer Änderung
der Expression ihrer charakteristischen Oberflächenmarker CD40, CD80, CD83 und CD86 der zuvor
ruhenden DCs und induziert die Segregation von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen
(74, 75). Unter anderem wird durch den Typ II-Membranrezeptor Dectin-1, welcher zur Familie der Ctype Lectin-Rezeptoren (CLR) gehört und β-Glucane erkennt (76), die Phagozytose ausgelöst, welche
daraufhin zu einer Internalisierung von Pilzbestandteilen führt. Dabei werden nicht nur die Proteine
des potentiellen Pathogens sondern auch pathogen-spezifische Lipide aufgenommen und
prozessiert. Eine Klasse von MHC-verwandten Proteinen auf dendritischen Zellen sorgt für die
Präsentation von pathogen-assoziierten Lipiden an Th17-Zellen. Es handelt sich dabei um die in der
als CD1 bezeichneten Gruppe von miteinander verwandten Proteinen. Untereinander weisen sie
leichte Unterschiede auf, wobei CD1a, CD1b und CD1c eine andere Klasse an Lipiden als das CD1d
präsentieren (77, 78). Somit stellt die Reaktion der dendritischen Zellen auf einen erkannten
Mikroorganismus nicht nur eine Kombination aus MHC Klasse II- und CD1-vermittelter
Antigenpräsentation dar, welche als Verbindung zur adaptiven Immunantwort mittels einer
Polarisierung der Th1/Th2-Antwort in Richtung Th1/Treg für den Schutz gegen beispielsweise
Aspergillus fumigatus gesehen werden kann (70), sondern sie führt auch konzertiert durch die
Zytokin- und Chemokinsegregation zur vollständigen Mobilisierung des Immunsystems.
13 | S e i t e
Evolutionär konservierte Strukturen pathogener Mikroorganismen
Einleitung
Ein Teilmechanismus der Pilzabwehr durch dendritische Zellen ist die Ausbildung von Fungipoden,
welche durch den direkten Kontakt mit Pilzzellwänden geformt werden (79). Es handelt sich dabei
um auf zell-proximaler Seite zusammengerollte und auf distaler Seite sanfte Strukturen, welche über
Stunden bestehen bleiben und jeweils eine Länge von 13,7±5,6µm und eine Breite von 1,8±0,67µm
an der Kontaktstelle zum Pilz aufweisen (Abbildung 4).
Abbildung 4: Phagozytose von geschwollenen A. fumigatus Konidien
Dendritische Zellen binden geschwollene Konidien (links) und zerstören sie durch
Phagozytose mittels Fungipoden (rechts) (79). Quelle: www.sciencephotolibrary.com
Dabei wird jedoch nicht der Phagozytoserezeptor Dectin-1 sondern der Oberflächenmarker CD206
als generativer Rezeptor für die Formation eines Fungipods benötigt, wobei es sich um den
Mannoserezeptor handelt. Es gelang den auf der Zellwand exponierten Pathogen-assoziated
molecular Pattern (PAMP) für diesen Rezeptor ausfindig zu machen und es stellte sich heraus, dass es
sich dabei um das Zymosan, einem β-Glucan, handelte. Die Erkennung von Pathogenen durch das
angeborene Immunsystem verläuft ausschließlich über Pattern-recognition recepors (PRRs). Es sind
die evolutionär konservierte Strukturen an Pathogenen, welche als Target für Zellen der
angeborenen Immunantwort dienlich sind, und daher müssen ihre Erkennungsrezeptoren eine
ebenso evolutionäre Konservierung aufweisen.
2.3 Evolutionär konservierte Strukturen pathogener Mikroorganismen
Wie bereits in der Arbeit von Mezger et al. 2008 festgestellt wurde, ist Dectin-1 ein Rezeptor
auf dendritischen Zellen und reagiert auf Liganden der Zellwand von Aspergillus fumigatus. Dieser
Rezeptor ist neben Weiteren, wie bereits zuvor erwähnt wurde, ein Teils des Repertoires an Patternrecognition receptors, das für die Identifikation von Pathogen-associated molecular pattern (PAMP)
einer großen Palette an Mikroorganismen verwendet wird (80). Es handelt sich dabei um eine große
Gruppe von Rezeptoren, welche lösliche und zellgebundene Rezeptoren umfasst. Hinzu kommt noch
14 | S e i t e
Evolutionär konservierte Strukturen pathogener Mikroorganismen
Einleitung
die Erkennung durch das Zytokin-Signaling, welches initiiert wird durch TNF- und Mitglieder der IL1-Familie. Beim Anschwellen von Konidien verlieren diese ihre hydrophobe Oberflächenschicht,
wobei Teile der inneren Zellwand exponiert werden (81, 82). Diese besteht aus einer
Zusammensetzung von hauptsächlich Polysacchariden, welche meist β-Glucan, Mannan,
Glactomannan und Chitin umfasst (83).
In Abbildung 5 wird dargestellt, wie sich die Zusammenstellung der Komponenten der Zellwand
während des Beginns des Metabolismus von ruhenden Konidien über den geschwollenen Konidien
bis hin zu den Hyphen verändert.
Abbildung 5: Aufbau der Zellwand von A. fumigatus
A) Transmissions-Elektronenmikroskopie- und B) Scan-Elektronenmikroskopie-Aufnahme der
konidialen Zellwand. C) Schematische Darstellung der konidialen Zellwandzusammensetzung.
D) und E) zeigen die Transmissions- und Scan-Elektronenmikroskopie der hyphealen
Zellwand. F) Skizze der Zellwand von A. fumigatus-Hyphen (84).
Neben der Bedeutung von Dectin-1 bei der Detektion von Aspergillus fumigatus-gebundenem β(1,3)Glucan, sind auch TLR2, TLR4 und DC-SIGN für die Reaktion auf Pilzbestandteile durch dendritische
Zellen nachgewiesen worden. Mannane beispielsweise lassen sich durch viele Rezeptoren erkennen,
wobei die meisten von ihnen membrangebunden sind. So ist zu dieser Gruppe an Rezeptoren das DCSIGN, Galectin 3, Dectin-2, TLR4 und Mincle zu zählen (85-92). Es konnte in einer Glycan arrayAnalyse gezeigt werden, dass Dectin-2 und DC-SIGN höhere Mannosestrukturen binden, welche
hauptsächlich auf eukarytischen Glycoproteinen vorzufinden sind (93). Da diese von Pilzen wie A.
fumigatus gebildet worden sein könnten und zu einer Phygozytose der entweder sezernierten oder
15 | S e i t e
Immuntherapien mit Hilfe von dendritischen Zellen
Einleitung
Zellwand-verankerten Glycoproteinen führen würde, sollten dendritische Zellen in der Lage sein
diese Proteine zu verarbeiten und ihre Epitope zu präsentieren. Eine Erkennung von nicht
glykosylisierten Proteinen durch DCs ist zur Zeit nicht bekannt und müsste beim Auftreten genauer
untersucht werden.
2.4 Immuntherapien mit Hilfe von dendritischen Zellen
Wie in den Kapiteln 2.1.1 und 2.1.2 bereits angesprochen wurde, stellt die Behandlung von
Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation mit verschiedenen Antimykotika zum
Zwecke einer angemessenen Prophylaxe eine Reihe von Problemen dar. Die Spezifität der Präparate,
ihre Nebenwirkungen und die Resistenzen der neuen Generation von Aspergillus fumigatusStämmen gegenüber diesen Mitteln sind signifikante Gründe, um nach alternativen zu der
medikamentösen Behandlung der Patienten zu suchen. Die Effizienz des Immunsystems, welche der
Infektion im gesunden Organismus Herr werden kann, ist ein bedeutendes Instrument, welches bei
der Wahl einer zusätzlichen Therapie nicht außer Acht gelassen werden kann. Daher stellen
antikörper- und zellbasierte Immuntherapien eine gute Alternative dar, denn die Spezifität und
Anpassungsfähigkeit ist neben der zu erwartenden Verträglichkeit ein großer Fortschritt gegenüber
der
herkömmlichen
Medikamentengabe.
Bei einem
immunotherapeutischen
Ansatz mit
dendritischen Zellen wäre es beispielsweise möglich, diese Zellen mit einem Antigen zu beladen und
mittels der Antigenpräsentation spezifische T-Zellen ex vivo zu expandieren. Die Rückführung von
spezifischen T-Helferzellen bzw. zytotoxischen T-Zellen in den Patienten würde dann zu einer
gerichteten Immunreaktion gegen den Pathogen führen. Eine Variante dieser Therapie könnte es
aber auch sein, dass den T-Zellen die gepulsten dendritischen Zellen beigefügt werden, so dass diese
durch ihre Fähigkeit zur Phagozytose und zur Rekrutierung bzw. Koordination von weiteren
Immunzellen mittels der Segregation von Zytokinen und Chemokinen der pro-inflammatorischen
Antwort Nachdruck verleihen.
In vorangegangenen Studien ließen sich Antigene identifizieren, welche für die Umsetzung der
Immuntherapie mittels dendritischer Zellen ermöglicht wurde. Dies findet jedoch in Bezug zu
problematischen Komplikationen mit verschiedenen Viren statt, wobei es sich um Infektionen mit
dem Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Adenovirus (Adv) handelt. Diese führen
ebenfalls bei immungeschwächten Patienten zu einer hohen Rate an Morbidität und Mortalität (9496). Die Immuntherapie verwendete eine rekombinante Form eines Antigens, dem Ad5f35CMVpp65,
deren Epitope zu einer Expansion von zytotoxischen T-Lymphozyten geführt hat, welche virusspezifisch und polyklonal waren (97, 98). Bei dem Ausgangsmaterial der Expansion handelte es sich
16 | S e i t e
Hämostase während einer invasiven Aspergillose
Einleitung
um eine CCR7/CD45RA+ T-Zellpopulation. Damit stellt diese Methode eine Verbesserung des zuvor
für Cytomegalovirus entwickelten spezifischen Ansatzes einer Immuntherapie dar (99), denn die
expandierten T-Zellklone waren nun gegen alle drei Virusarten gerichtet. Eine entsprechende
Therapieform ist jedoch bei der Prophylaxe oder Behandlung von Aspergillus-Infektionen noch nicht
entwickelt worden, da zur Zeit keine identifizierten Antigene existieren, welche von dendritischen
Zellen aufgenommen, verarbeitet und ihre Epitope für eine T-Zellexpansion über den MHC IIKomplex präsentiert werden könnten. Die Ermittlung von Pilz-assoziierten bzw. vom Pilz sezernierten
Antigenen als Grundlage für eine ähnliche Therapie bzw. die Charakterisierung der angeborenen
Immunantwort gegenüber solchen Antigenen ist der zentrale Bestandteil dieser Arbeit.
2.5 Hämostase während einer invasiven Aspergillose
Es konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass in vitro eine antimikrobielle Aktivität von
humanen Thrombozyten gegen Aspergillus-Spezies besteht. Plättchen binden plasma-opsonisierte
Hyphen und degranulieren daraufhin (100). Dabei führt die Interaktion der Plättchen mit den Hyphen
zu einer Verringerung der Galactomannan-Freisetzung, einer Beeinträchtigung des Wachstums der
Hyphen und dem Verlust der Integrität der Zellwand. Diese Effekte konnten verhindert werden,
wenn die granuläre Exozytose der Thrombozyten geblockt wurde (100, 101). Es konnte das Serotonin
als Faktor bestimmt werden, welcher bei der Degranulierung der Plättchen den Tod von Konidien
und Hyphen durch Schädigung der Zellmembransynthese mittels Inhibition der Ergosterolsynthese
verursacht hat. Diese Beeinträchtigung ist vergleichbar mit der Anwendung von Azolen (102, 103).
Die Rolle der Plättchen bei der Abwehr des Pilzes ist ein Aspekt, der zu der Beobachtung führen
könnte, dass während der Pilzinvasion auch eine Veränderung der Hämostase zu beobachten ist, da
der antimikrobielle Einsatz derer zur Verringerung der für die Hämostase nötigen Menge an
Thrombozyten führen könnte. Die Pilzinfektionen führen nämlich am Ort der Invasion zu lokalen
Einblutungen, welche eine bedeutende klinische Komplikation bei der Behandlung betroffener
Patienten darstellt (104). In einer pathophysiologischen Hypothese wurde angenommen, dass die
Invasion der Hyphen in das Lungenparenchym sowie in die Blutgefäße zu den Blutungen führen kann.
Darüber hinaus könnten Mikrothromben dafür verantwortlich sein, welche durch Thrombozytenbzw. Endothelaktivierung durch A. fumigatus gebildet werden, da diese beispielsweise durch eine
sekundäre venöse Stase ein solches pathologisches Profil aufweisen könnten (105). Auch ist die
Annahme denkbar, dass Faktoren, welche vom Pilz aus freigesetzt werden und die Gerinnung
beeinflussen, ein über Generationen entwickelter Mechanismus ist, welcher als Anpassung des Pilzes
an die Bedingung einer Invasion zu deuten wäre. Es ließen sich jedoch diese Faktoren noch nicht
17 | S e i t e
Ziele der Arbeit
Einleitung
feststellen, wobei der empfindliche Mechanismus von Gerinnungskaskade durch das große Arsenal
an Proteasen, Peptidasen und Lipasen, welche während der Invasion expremiert und sezerniert
werden (Serine-Proteasen, Metalloproteasen, aspartische Proteasen, Dipeptidyl-Peptidasen und
Phospolipasen), durchaus parallel zur Gewinnung von Nährstoffen für den Pilz zu einem aberranten
Profil der Hämostase des Wirts führen könnte (106-108).
2.6 Ziele der Arbeit
In Kapitel 2.4 wurde bereits die Immuntherapie mit Hilfe von dendritischen Zellen erwähnt,
wofür eine Ermittlung von A. fumigatus-Antigenen analog zur bereits bestehenden Viren-gezielten
Immuntherapie durch gepulste DCs benötigt wird. Es gibt nur wenige Daten, welche eine
Immuntherapie von Patienten in Bezug zur invasiven Pilzinfektion setzen. Dies könnte zumindest
teilweise dadurch zu erklären sein, dass die antigenen Eigenschaften von Aspergillus fumigatus sehr
komplex und noch immer nicht vollständig charakterisiert sind. Inzwischen sind jedoch mehrere A.
fumigatus-Proteine als immunogene Antigene identifiziert worden, wobei es sich um das 18-kDa IgEbindende Protein Aspf1, welches auch als Mitogilin bezeichnet wird und ein Mitglied der Familie von
Ribotoxine ist (109), die GPI-verankerte extrazelluläre Zellwandglucanase Crf1 (110), die myceliale
Katalase 1 Cat1, die Metalloprotease Mep1, das Aspergillopepsin Pep1, die 1,3-betaGlucanosyltransferase Gel1 und die Cu, Zn Superoxid-dismutase Sod1 handelt. Mit der
Charakterisierung von Aspf1 beginnend soll nun die immunogene Eigenschaft aller Proteine auf
dendritische Zellen untersucht werden. Dabei stellt Aspf1 als Mitglied einer Familie von
konservierten
RNasen,
welche
definierte
Phosphodiesterbindungen
der
28S
rRNA
von
eukaryotischen Ribosomen spalten, bereits vor der Untersuchung von pro-inflammatorischer
Immunantwort die Herausforderung, ob ein erhöhtes Maß an Toxizität des Proteins bei DCs vorliegt
(111). Darüber hinaus wird die Untersuchung von Sod1 und Cat1 einen besonderen Stand haben, da
diese beiden Proteine mit der Degradierung von reaktiven, oxidativen Gruppen beschäftigt sind. Im
Gegensatz zu Sod1, wird Cat1 im Stadium des Mycels exprimiert und sezerniert während sich Sod1
intrazellulär befindet. Die Aufgabe von Cat1 besteht deshalb darin, eine H2O2-Detoxifikation
außerhalb des Pilzes durchzuführen, was eine direkte Reaktion auf die angeboren Immunantwort von
Granulozyten darstellt, da diese H2O2 als Reaktion auf die Pilzinvasion produzieren (112, 113).
Ein weiterer Teil der Arbeit ist es auch, die Reaktion von Thrombozyten auf den Pilz zu untersuchen,
unter dem Aspekt der Beeinträchtigung von Hämostase während einer invasiven Aspergillose. Dazu
sollen sowohl die Veränderungen der Aggregation von Thrombozyten, welche beispielsweise durch
exponiertes Collagen ausgelöst werden würde, als auch die Beeinträchtigung auf plasmaspezifische
18 | S e i t e
Ziele der Arbeit
Einleitung
Gerinnungsparameter untersucht werden. Dies soll dann neben der bereits bekannten
antimikrobiellen Eigenschaften von Blutplättchen auch mögliche Angriffspunkte für eine
medikamentöse Behandlung von betroffenen Patienten offenlegen, um den durch Invasion
bedingten Einblutungen entgegen zu wirken.
19 | S e i t e
Material
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Blutspender
Die Blutabnahme erfolgte stets an den Armbeugevenen (V. cephalica, V. mediana cubiti oder V.
basilica) von freiwilligen, gesunden Spendern in einem Alter zwischen 20 und 40 Jahren. Es bestand
keine Präferenz bei der Wahl des Geschlechts und auch nicht bei der des vom Spender dabei zur
Verfügung gestellten Arms. Ausgeschlossen wurde durch Befragung lediglich eine noch anhaltende
Infektion, eine bereits kürzlich erfolgte Blutabnahme an der gleichen Vene bzw. die Einnahme von
gerinnungshemmenden Medikamenten innerhalb der letzten 48h. Vor der Punktion der Vene durch
eine sterile Butterfly-Nadel wurde die Einstichstelle gründlich desinfiziert. Das entnommene Blut
wurde aufgefangen in
I)
EDTA-Monovetten (EDTA KE/9ml - Sarstedt) für die Untersuchung von
Immuneffektorzellen
II)
Serum-Monovetten (Serum/7,5ml - Sarstedt) für die Generierung von
humanen Serum
III)
Citrat-Monovetten (Coagulation 9 NC/10ml - Sarstedt) für die Untersuchung
von Thrombozyten
3.1.2 Leukoreduction system chambers (LRSCs)
Am Institut für Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums Würzburg wurden während
jeder Thrombozytenspende gesunder Freiwilliger die mononukleären Zellen aus peripherem Blut
(PBMCs) mit einer Ausbeute von 1,88×109 (±0,40×109; p<0,0001) in einem konischem Kompartiment,
das als Leukoreduction system chamber (LRSC) bezeichnet wird, aufgefangen (114).
3.1.3 Aspergillus fumigatus-Stämme
Die A. fumigatus-Stämme1 wurden von
1
Der Umgang mit sowohl genetisch veränderten Organismen (GVOs) als auch mit potenziell pathogenen
Organismen ist lediglich in S2-Räumen erlaubt.
20 | S e i t e
Material
Material und Methoden
a
Prof. Jean-Paul Lagté, Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris
b
PD Dr. rer. nat. Sven Krappmann, Zentrum für Infektionsforschung, Universität Würzburg
bereit gestellt.
Wildtypstämme:
a
ATCC46645
G10 (IP 4)
b
D141 (klinisch relevant)
a
Deletionsmutanten-Stämme:
a
Δaspf1
ΔcatA-01 (IP 148)
a
Δcat1 Δcat2-18 (IP 151)
a
3.1.4 Primer- und FRET-Sonden
Hersteller: TIB MOLBIOL GmbH - Berlin, Deutschland
Primer
Gen
CCL20
CXCL10
hALAS
IL-1β
IL-10
IL-12p35
IL-12p40
IL-23p19
IL-8
TNF-α
Primer
Sequenz
forward
5’-ctgtcttggatacacagaccgta-3’
reverse
5’-ggttctttctgttcttgggcta-3’
forward
5’-acgtgttgagatcattgctacaa-3’
reverse
5’-gattttgctcccctctggt-3’
forward
5’-aatgagtcgccacccacg-3’
reverse
5’-cagctcccgctctaagtcca-3’
forward
5’-cagggacaggatatggagcaa-3’
reverse
5’-gcagactcaaattccagcttgtta-3’
forward
5’-tgctggaggactttaagggttac-3’
reverse
5’-gtagatgcctttctcttggagc-3’
forward
5’-gagagacctctttcataactaatggg-3’
reverse
5’-tcaagggaggatttttgtgg-3’
forward
5’-ctcgtggccatatgggaac-3’
reverse
5’-tggccagcatctccaaact-3’
forward
5’-tagtgggacacatggatctaag-3’
reverse
5’-gcaagcagaactgactgttg-3’
forward
5’-tcttggcagccttcctgatt-3’
reverse
5’-tccagacagagctctcttccatc-3’
forward
5’-acaagcctgtagcccatgtt-3’
reverse
5’-aagaggacctgggagtagatga-3’
21 | S e i t e
Material
Material und Methoden
Sonden
Gen
Sondenart
CCL20
Hybridisierung
CXCL10
Hybridisierung
hALAS
Hybridisierung
IL-1β
Hybridisierung
IL-10
Hybridisierung
IL-12p35
Hybridisierung
IL-12p40
Hybridisierung
IL-23p19
TaqMan®
IL-8
Hybridisierung
TNF-α
Hybridisierung
Komponente
Sequenz
Akzeptor-Fluorochrom
5’-gttgtctgtgtgcgcaaatccaaa-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-cagacttgggtgaaatatattgtgcgtc-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-agtaaattcttgatggccttcgattct-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-gattcagacatctcttctcacccttctttt-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-cctgccccagcaccatgttgtttc-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-gtgtccataactgccccacacacc-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-gcttatcatctttcaacacgcaggaca-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-gtacagattcttttccttgaggccca-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-cggcgctgtcatcgatttcttccct-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-tgaaaacaagagcaaggccgtggagc-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-aggcagatctttctagatcaaaacatgctg-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-cagttattgatgagctgatgcaggccc-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-ggtcctcacctgtgacacccctga-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-aagatggtatcacctggaccttggacc-PH-3’
Reporter und Quencher
5’-6FAM-ccatctccacactggatatgggga-BBQ-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-gacatctaagttctttagcactccttggca-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-aactgcaccttcacacagagctgc-PH-3’
Akzeptor-Fluorochrom
5’-gcattggcccggcggttc-FL-3’
Donor-Fluorochrom
5’-LC640-ccactggagctgcccctcagct-PH-3’
3.1.5 Antikörper, rekombinante Proteine und FACS-Farbstoffe
FACS-Antikörper und fluoreszierende Farbstoffe
Antikörper
Typ
Hersteller
Antikörper /
Farbstoff
Typ
Hersteller
CD1a-FITC
IgG2a
Dako
CD69-APC
IgG1
BD Pharmingen
CD14-FITC
IgG2a
BD Pharmingen
CD25-PE
IgG1
BD Pharmingen
CD80-PE
IgG1
BD Pharmingen
TLR2-PE
IgG2a
Biolegend
CD83-PE
IgG1
BD Pharmingen
TLR4-PE
IgG2a
Biolegend
CD86-PE
IgG1
BD Pharmingen
Dectin-1-PE
IgG2a
Biolegend
CD40-PE
IgG2a
Beckman Coulter
Isotypkontrolle-FITC
IgG1
BD Pharmingen
HLADR-FITC
IgG2a
BD Pharmingen
Isotypkontrolle-FITC
IgG2a
BD Pharmingen
CCR7-APC
IgG2a
R&D Systems
Isotypkontrolle-PE
IgG1
BD Pharmingen
CD11c-APC
IgG1
Miltenyi Biotech
Isotypkontrolle-PE
IgG2a
BD Pharmingen
22 | S e i t e
Material
Material und Methoden
CD56-PE
IgG1
BD Pharmingen
Isotypkontrolle-PE
IgG2b
BD Pharmingen
CD3-PerCP
IgG1
BD Pharmingen
Isotypkontrolle-PerCP
IgG1
BD Pharmingen
CD4-PE
IgG1
BD Pharmingen
Isotypkontrolle-APC
IgG1
BD Pharmingen
CD8-FITC
IgG1
BD Pharmingen
Isotypkontrolle-APC
IgG2b
BD Pharmingen
CD1c-PE
IgG2a
Miltenyi Biotech
Propidiumiodid (PI)
-
BD Pharmingen
CD1d-PE
IgG1
BD Pharmingen
Annexin V-FITC
-
BD Pharmingen
CD45-FITC
IgG1
BD Pharmingen
CFSE
-
Invitrogen
(Ursprungsorganismus der Antikörper war stets Mus musculus)
Verdünnung der Antikörper: 1:100 (für 1×105 Zellen), Verdünnung von Propidiumiodid und Annexin
V-FITC: 1:50 (für 1×105 Zellen), Verdünnung von CFSE: variabel2
Antikörper für angepasste Inhouse-ELISA
Antikörper
anti-human CCL20/MIP-3α
anti-human CXCL10/IP-10
anti-human IL-10
anti-human IL-1β
anti-human IL-6
Orgamismus
Mus musculus
(Maus)
Capra hircus
(Ziege)
Mus musculus
(Maus)
Capra hircus
(Ziege)
Mus musculus
(Maus)
Capra hircus
(Ziege)
Mus musculus
(Maus)
Capra hircus
(Ziege)
Mus musculus
(Maus)
Capra hircus
(Ziege)
Typ
Hersteller
monoklonal, IgG1,
Capture antibody
biotinyliert, polyklonal, IgG,
Detection antibody
monoklonal, IgG1,
Capture antibody
biotinyliert, polyklonal, IgG,
Detection antibody
monoklonal, IgG1,
Capture antibody
biotinyliert, polyklonal, IgG,
Detection antibody
monoklonal, IgG1,
Capture antibody
biotinyliert, polyklonal, IgG,
Detection antibody
monoklonal, IgG1,
Capture antibody
biotinyliert, polyklonal, IgG,
Detection antibody
R&D Systems
Antikörper für die Western blot Analyse
Antikörper
I 224-1 α-CatB Hybrodoma-Überstand, unverdünnt als
Erstantikörper
Orgamismus
Mus musculus
(Maus)
Hersteller
LMU München, Maxvon-Pettenkofer Institut,
2
Endkonzentration in 3ml AIMV-Medium wurde auf 0,5µM pro 1×10 6 CD8+ T-Zellen mit optimaler Färbung
und niedrigster Zytotoxizität austitriert. Das CFSE-Lyophylisat wurde entsprechen der Vorgabe des Herstellers
Invitrogen mit 18µl DMSO gelöst; Stammlösung hatte eine Konzentration von 5mM.
23 | S e i t e
Material
I 6-4 α-CatB Hybrodoma-Überstand, unverdünnt als
Erstantikörper
ECL α-Mus musculus HRP-verbundes F(ab’)2 Fragment,
1:2000 verdünnt als Zweitantikörper
Material und Methoden
Mus musculus
(Maus)
Ovis aries
(Schaf)
PD Dr. Frank Ebel
GE Healthcare
Rekombinante Proteine
Protein
Zytokine für
Zellkultur
Hersteller
rhIL-2 (Lyophylisat, gelöst in HBSS mit Stammlösung von 2,43mg/ml)
R&D Systems
rhIL-4 (Lyophylisat, gelöst in HBSS mit Stammlösung von 150µg/ml)
R&D Systems
rhGM-CSF (Leukine - sargramostim, Stammlösung mit 500µg/ml)
Bayer Schering
AG
α-sarcin Aspergillus giganteus Antigen - Art.-Nr.: S6907 (Lyophylisat)
pp65 Cytomegalovirus Antigen - Art.-Nr.: 130-091-824 (Stammlösung mit 3,85mg/ml)
Aspf1 (18kDa Ribonuklease aus A. fumigatus, GenBank: AfuA_5g02330)
Crf1 (Zellwandglucanase bzw. Allergen f16 aus A. fumigatus, GenBank: Afu6g03230)
Mep1 (Elastinolytische Metalloproteinase aus A. fumigatus, GenBank: Afu8g07080)
Gel1 (1,3-β-Glucanosyltransferase aus A. fumigatus, GenBank: Afu2g01170)
Pep1 (Aspartische Endopeptidase aus A. fumigatus, GenBank: AfuA_5G13300)
Sod1 (Cu,Zn-Superoxiddismutase aus A. fumigatus, GenBank: Afu5g09240)
Cat1 (mycelial catalase 1 aus A. fumigatus, GenBank: Afu3g02270)
Sigma Aldrich
Miltenyi Biotech
Hergestellt im
Pechia pastorisSystem in den
Laboren von Prof.
Jean-Paul Latgé,
Unité des
Aspergillus,
Institut Pasteur,
Paris, France
humanes CCL20/MIP-3α
humanes CXCL10/IP-10
Standard für angepasste
Inhouse-ELISA
humanes IL-10
humanes IL-1β
R&D Systems
humanes IL-6
Enzym-gekoppeltes
Streptavidin für ELISA
Streptavidin-HRP - Art.-Nr.: DY998
3.1.6 Reaktionskits
Aufreinigung
von
Immunzellen
Bezeichnung
Hersteller
CD14 MicroBeads (human) - Art.-Nr.: 130-050-201
Isolation von Monozyten aus PBMCs
CD1c (BDCA-1)+ Dendritic Cell Isolation Kit (human) - Art.-Nr.: 130-090-506
Isolation von myeloiden dendritischen Zellen (mDC1) aus PBMCs
Miltenyi Biotech
CD8+ T Cell Isolation Kit (human) - Art.-Nr.: 130-094-156
Isolation von untouched T-Zellen aus PBMCs
24 | S e i t e
Material
Material und Methoden
NK Cell Isolation Kit (human) - Art.-Nr.: 130–092–657
Isolation von untouched NK-Zellen
Total-RNA-Aufreinigung
reverse Transkription (cDNA)
relative quantitative real-time PCR
Dead Cell Removal Kit (human) - Art.-Nr.: 130-090-101
Depletion von Phosphatidylserin (PS)+ Zellen
Qiagen RNeasy Micro Kit - Art.-Nr.: 74004
Isolation von total-RNA aus 1×105 bis 5×105 Zellen pro Säule
Qiagen RNeasy Mini Kit - Art.-Nr.: 74106
Isolation von total-RNA aus 5×105 bis 1×106 Zellen pro Säule
Qiagen
Qiagen Qiashredder - Art.-Nr.: 79656
Qiagen QuantiTect Reverse Transcription - Art.-Nr.: 205313
Qiagen Probe PCR + ROX vial Kit - Art.-Nr.: 204354
ELISA
Human IL-23 Quantikine ELISA Kit - Art.-Nr.: D2300B
Detektion der p19-Untereinheit von IL-23
R&D Systems
TNF-alpha ELISA Kit Hu TNF-α Cytoset - Art.-Nr.: CHC1753
Invitrogen
IFN-gamma ELISA Kit Hu IFN-γ Cytoset - Art.-Nr.: CHC1233
Nuclear Extract Kit - Art.-Nr.: 40010
TransAM NFkB p65 Activation Assay Kit - Art.-Nr.: 40096
Active Motif
3.1.7 Reagenzien, Lösungen, Medien und Puffer
Reagenzien und Lösungen
Name
Hersteller
2-Mercaptoethanol
Agarose
Albumin Fraktion V (bovinic, biotinfrei)
Ammoniumperoxidisulfat
Biocoll
Camptothecin
Cycloheximid
Depleted Zymosan
Dimethylsulfoxid (DMSO)
DNA-Leiter
Ecotainer Aqua
EDTA
Essigsäure
Ethanol absolut
Ethidiumbromid
Fötales Kälberserum (FCS)
Sigma Aldrich
Roth
Roth
Roth
Biochrom AG
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
Invivogen
Roth
Invitrogen
B Braun
Sigma Aldrich
Roth
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
25 | S e i t e
Material
Glycerin
Glycin
HBSS (Hanks balanced salt solution)
Heparin-Natrium (20000U/ml)
Kaliumchlorid
Lipopolysaccharid
Methanol
Milchpulver
Natriumacetat
Natriumazid
Natriumcarbonat
Natriumchlorid
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Natronlauge (2N)
Octenisept (farblos)
Paraformaldehyd
Phytohemaglutinin M-type (PHA)
Ponceau
Protein-Leiter (SDS-Pageruler prestained)
Rapidstep ECL Reagent
Refobacin 80mg (Gentamycinsulfat)
RNase-freies Wasser
Rotiphorese Gel 30
Salzsäure (1N)
Schwefelsäure (2N)
Stablilisiertes H2O2 (Komponente A) - Art.-Nr.: DY999
Stablilisiertes Tetramethylbenzidin (Komponente B) - Art.-Nr.: DY999
Sucrose
TEMED
Tris
Tris-HCl
Trizma base
Trypanblau (0,4%)
Tween 20
Ultra-pure Lipopolysaccharid
Zymosan
Material und Methoden
Roth
Roth
Invitrogen
Ratiopharm
Merck
Sigma Aldrich
Riedel-de-Haën
Roth
Sigma Aldrich
Roth
Roth
Riedel-de-Haën
Serva
Roth
Schülke & Mayr
Roth
Gibco Invitrogen
Sigma Aldrich
Fermentas
Merck Calbiochem
Merck
Qiagen
Roth
Riedel-de-Haën
Roth
R&D Systems
R&D Systems
Merck Calbiochem
Roth
Roth
Roth
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
Invivogen
Invivogen
Medien
Name
Hersteller
AIM V Medium (Research-grade)
Invitrogen
Institut für Hygiene und Mikrobiologie,
Universitätsklinikum Würzburg
CellGenix
Invitrogen
Invitrogen
Bierwurzplatten zur Kultivierung von A. fumigatus
CellGro Medium für dendritische Zellen (GMP-grade)
RPMI 1640 GlutaMAX (mit Phenolrot, research-grade)
RPMI 1640 (ungefärbt, research-grade)
26 | S e i t e
Material
Material und Methoden
Western blot analyse-Puffer
Fertigpuffer
Puffer
Name
Hersteller
Buffer, reference standard, pH 4,00
Sigma Aldrich
Buffer, reference standard, pH 7,00
Sigma Aldrich
FACS-Flow / Clean / Rinse
BD Pharmingen
Agarosegel Ladepuffer (blue juice)
Invitrogen
HI 70300 pH-Meter Puffer
Hanna instruments
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1L (10×)
Sigma Aldrich
TAE Buffer 4L (Ultrapur, 10×)
Invitrogen
SDS-Stop-Lösung (3×)
pH 6,7
2,42g (154mM) Tris-HCl
6g (6% w/v) SDS
15ml (15% v/v) Glycerin
3mg (3‰ w/v) Bromphenolblau
85ml H2O
Vor der Verwendung komplementiert durch 10% (v/v) 2-Mercaptoethanol
auf 1× mit H2O verdünnen
Puffer A
pH 6,7
6,057g (0,5M) Tris
100ml H2O
Puffer B
pH 8,9
36,34g (3 M) Tris
100ml H2O
10% SDS-Lösung
10g (10% w/v) SDS
100ml H2O
10% APS-Lösung
1g (438mM) Ammoniumperoxidisulfat
10ml H2O
10×TBS Puffer
pH 7,5
12,184g (100mM) Tris
87,66g (1,5M) NaCl
1l H2O
0,1%iges TBS-T
1ml Tween 20
1l 1×TBS
3% TBS-T Milch
3g (3% w/v) Milchpulver
100ml TBS-T
10× Elektrophoresepuffer
pH 8,9
30g (248mM) Tris
144g (1,98M) Glycin
10g (1% w/v) SDS
1l H2O
27 | S e i t e
Inhouse-ELISA-Puffer
Material
Semi-dry Transferpuffer
3,029g (25mM) Tris
11,26g (150mM) Glycin
100ml (10% v/v) Methanol
900ml H2O
Ponceau S-Lösung
0,5g (0,5% w/v) Ponceau S
100ml H2O
Western blot-Stripping Puffer
3g (62mM) Tris
8g (2% w/v) SDS
1,4ml (100mM) 2-Mercaptoethanol
399ml H2O
Waschpuffer
500µl (0,05% v/v) Tween 20
1l 1×PBS
Blockingpuffer
3g (1% w/v) BSA
15g (5% w/v) Sucrose
0,15g (0,05% w/v) Natriumazid
300ml 1×PBS
Standardpuffer
0,3g (0,1% w/v) BSA
300ml 1×PBS
Zweitantikörperpuffer
1,21g (20mM) Trizma base
4,38g (150mM) NaCl
0,5g (0,1% w/v) BSA
500ml H2O
Streptavidin-Puffer
5g (1% w/v) BSA
500ml 1×PBS
Material und Methoden
pH 8,3
pH 6,8
pH 7,4
3.1.8 Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung
Hersteller
LS-Säulen Art.-Nr.: 130-042-401
Miltenyi Biotech
MS-Säulen Art.-Nr.: 130-042-201
Miltenyi Biotech
LD-Säulen Art.-Nr.: 130-042-901
Miltenyi Biotech
LightCycler Capillaries (20µl) Art.-Nr.: 04929292001
Roche Diagnostics
ELISA-Plattenklebefolien Art.-Nr.: DY992
R&D Systems
96 Well ELISA Mikroplatte Art.-Nr.: 655001
Greiner Bio-One
6, 24, 48 und 96 Well Zellkulturplatten
BD Bioscience Falcon
Zellschaber
SPL Life Sciences
T-75 Zellkulturflaschen
Greiner Bio-One
Plastikröhrchen (15ml, 50ml)
Greiner Bio-One
serologische Pipetten (5ml, 10ml, 25ml, 50ml)
Greiner Bio-One
Pasteurpipetten (steril einzelverpackt, 3ml)
A. Hartenstein
28 | S e i t e
Material
Material und Methoden
Cell strainer (40µm, Nylon)
BD Bioscience Falcon
FACS-Röhrchen (5ml, 12×75mm)
BD Bioscience Falcon
Elektroporationsküvetten (0,4cm gap)
Bio-RAD
Spritzen (5ml Syringe Luer-Lok Tip)
BD Bioscience
Spritzennadeln (Microlance 3 20G 1 1/2“ 0,9x40mm)
BD Bioscience
Reaktionscaps (1,5ml, 2ml)
Eppendorf
Einfrierröhrchen (2ml)
Nunc
Butterfly-Nadel Safety-Multifly-Set (21G x 3 /4“TW; 0,8 x 19 mm)
Sarstedt
Pur-Zellin (4cm x 5cm)
Hartmann
Combitips® plus (5ml, 10ml)
Biozym, Sarstedt, Nerbe,
StarLab
Eppendorf
Fujifilm SuperRX Röntenfilm (18×24cm)
A. Hartenstein
Pipettenspitzen (10µl, 100µl, 200µl, 1000µl, 1250µl)
3.1.9 Gebrauchsgegenstände
Bezeichnung
Hersteller
Deckgläschen optisch plan geschliffen für Haemacytometer
A. Hartenstein
JetPull 2
Holtsch Medizinprodukte
LightCycler Centrifuge Adapters (Aluminiumblock) Art.-Nr.: 1909312
Roche Diagnostics
Multikanalpipette
Eppendorf
Multipette
Eppendorf
2
Neubauerkammer Precicolor (0,0025mm )
HBG Germany
OctoMACS Separator Art.-Nr.: 130-042-108
Miltenyi Biotech
Präzisionspipetten (2,5µl, 10µl, 100µl, 200µl, 1000µl)
Eppendorf
QuadroMACS Separator Art.-Nr.: 130-091-051
Miltenyi Biotech
Schutzbrille
A. Hartenstein
UV-Schutzvesir
A. Hartenstein
3.1.10 Geräte
Gerätebezeichnung
Hersteller
-80°C Gefrierschrank
Agarose gele electrophoresis chamber
Spannungsquelle: BluePower 500
Apact 4 V.99.12 Aggregometer
Heraeus
PeqLab
Serva
Apact
ApoTom Fluoreszenzmikroskop
Zeiss
BlueFlash-M semi-dry western blot chamber
Spannungsquelle: Standard Powerpack P25
Centrifuge 5415 R
Serva
Biometra
Eppendorf
EPI 2500 Elektroporationsspannungquelle
Dr. L. Fischer (Heidelberg)
FACSCalibur
BD
29 | S e i t e
Material
Material und Methoden
Galaxy mini spindown centrifuge
VWR
Gefrier- und Kühlkombination
Liebherr
Hera cell 240
Heraeus
Hera safe KS18
Heraeus
HydroFLEX microplate washer
Tecan
LightCycler 1.5
Roche
Magnetrührer
Variomag
Mastercycler 5341
Eppendorf
MC-6400 butterfly spindown centrifuge
A. Hartenstein
Microplate MS1 minishaker
IKA
Microplate Reader (Model 680)
Bio-RAD
Microprocessor pH Meter (ph 211)
HANNA instruments
Mikrowelle MM41568
Micromaxx
Mini Rocker MR-1
Mini-PROTEAN 3 Cell
Spannungsquelle: PowerPac Basic
MSC-Advantage
PeqLab
Multifuge 3 S-R
Heraeus
MultiImage Light Cabinet (UV-Kammer)
Alpha Innotech Corporation
ND-1000 Spectrometer (Nanodrop)
PeqLab Biotechnologie
neoBlock 1 Heizblock (Model 2-2503)
neoLab
Nicon Eclipse 50i und TS100 Mikroskope
Nicon
Pipettierhilfe Pipetus-Akku
Hirschmann
Präzisionswaage GF-200
A&D Instruments
Röntgenfilmentwickler M35 X-OMAT Processor
Kodak
StepOnePlus Real-Time PCR Machine
Applied Biosystems
Sysmex Cytometer
Hematology Systems
Thermal Cycler 9800 Fast
Applied Biosystems
Vortex Genie 2
Scientific Industries
Wasserbad WB 7
Memmert
Bio-RAD
Thermo Scientific
3.1.11 Programme
Programmname
Verwendungszweck
Acrobat Reader 9.0
Wiedergabe von PDF-Dateiinhalten
Hersteller
Adobe
Apact Application
Programmiersprache zur Erstellung
Algorithmen für die Verarbeitung
Auswertung von Aggregometriedaten
Erfassung und Analyse der Aggregation
CellQuest Pro
Erfassung und Analyse von FACS-Daten
BD Pharmingen
ChemBioOffice Ultra 2010
Erstellung von biologischen Skizzen
CambridgeSoft
Endnote 14
Verwaltung von Literaturverzeichnissen
Thomson Reuters
FlowJo
Kompensation und Analyse von FACS-Daten
Treestar
Activeperl
von
und
Activestate
Apact
30 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
GIMP
Bildverarbeitung
Opensource
Gnuplot
Darstellung von Aggregometriedatenreihen
ImageJ
Schwärzungsanalyse von Röntgenfilmen
Irfanview
Bildbearbeitung
Opensource
National institute of
health (NIH)
Irfan Skiljan
Office 2003 & 2010
Präsentions-, Tabellen- und Textverarbeitung
Microsoft
Openoffice
Posterbearbeitung
Opensource
Statistica
Statistische Auswertung
Statsoft
VirtualDub
Formatierung und Schneiden von Videos
Avery Lee
3.2 Methoden
3.2.1 Isolation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut
Parallel zu der Arbeit von Griogoleit et al. (115) jedoch mit dem Unterschied, dass die
Leukozyten nicht aus einem Buffy-Coat stammten, wurden die mononukleären Zellen des peripheren
Blutes (PBMCs; engl. peripheral blood mononuclear cells) in Leukoreduction system chambers
(LRSCs) während einer Thrombozytenspende von gesunden, freiwilligen Spendern mittels eines
Apheresegeräts aufkonzentriert (114, 116). Damit diese Zellen eine für den weiteren Gebrauch in der
Zellkultur erforderliche Reinheit aufweisen konnten, wurde die Zellsuspension des Konzentrats in ein
50ml Plastikröhrchen gegeben und zunächst mit Hanks balanced salt solution (HBSS), welches
ergänzt mit 1% FCS und 5mM EDTA worden ist, auf ein Volumen von 50ml aufgefüllt. Anschließend
folgte die Aufreinigung der PBMCs gemäß des Protokolls, wobei anfangs 25ml dieser so verdünnten
Zellsuspension über 20ml einer Ficoll-Hypaque Lösung mit einer Dichte von 1,077g/ml (Biocoll)
geschichtet worden ist. Eine nachfolgende Dichtegradientenzentrifugation bei 400×g für 20min bei
Raumtemperatur (mit der niedrigst möglichen Beschleunigung der Zentrifuge und ohne die
Verwendung einer Bremse nach dem Zentrifugationsvorgangs) ergab schließlich der Erwartung
entsprechend fünf Fraktionen an Phasen (Abbildung 6). Die Interphase zwischen der HBSS- und der
Ficolllösung wurde dann mit einer sterilen Pasteurpipette vorsichtig entnommen und in ein neues
50ml Plastikröhrchen gegeben. Nachdem die Interphasen aller verwendeter Ficoll-Seperationen des
gleichen Spenders entnommen worden waren, wurde die Zellsuspension aus nun reinen PBMCs
erneut mit HBSS (inkl. 1% FCS und 5mM EDTA) auf 50ml aufgefüllt. Ein Waschschritt mit daran
anschließender Zählung der Zellmenge mittels einer Neubauer-Kammer nach vorausgehender 1:20Verdünnung zum einem mit HBSS (1:10) und anschließend mit Trypan-Blau (1:2) lieferte die exakte
Menge an lebenden PBMCs.
31 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Abbildung 6: Isolation von PBMCs
Über das Ficoll-Hypaque wurden durch Dichtegradientenzentrifugation
die PBMCs von den Thrombozyten, Erythozyten und Granulozyten
abgetrennt.
3.2.2 Generierung von humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen
Bei der Herstellung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs;
engl. monocyte-derived dendritic cells) wurden gemäß des Herstellerprotokolls zur Isolation von
Monozyten (CD14+) die zuvor im Ficoll-Dichtegradienten aufgereinigten PBMCs mit CD14spezifischen Microbead-gekoppelten Antikörper zunächst behandelt und anschließend auf LS-Säulen,
welche in einem Permanentmagneten eingelegt worden waren, gegeben (1,5×108 PBMCs/Säule). Es
handelte es sich bei dieser Separation um eine Positivselektion, so dass in dem Magnetfeld, das die
Säulen durchfloß, die CD14+-Zellen magnetisch fixiert worden sind. Die Säulen wurden daraufhin
dreimalig mit je 3ml HBSS (inkl. 1% FCS und 5mM EDTA) gewaschen und anschließend aus dem
Magneten entfernt, damit die noch in den Säulen verbliebenen Zellen in ein 50ml-Plastikröhrchen
mit jeweils 2ml HBSS (inkl. 1% FCS und 5mM EDTA) eluiert werden konnten. Eine anschließende
Zählung der Zellen mit Hilfe der Neubauer-Kammer lieferte die Anzahl an Monozyten. Die
Untersuchung der Zellsuspension mittels Durchflußzytometrie ergab, dass es sich dabei um eine zu
mind. 92% reine CD14+-Zellpopulation gehandelt hatte, die vollständig Annexin V- bzw.
Propidiumiodid-negativ und damit vital gewesen ist. Nachfolgend wurden die Monozyten in RPMI
(inkl. 10% FCS, 580U/ml IL-4 und 560U/ml GM-CSF) aufgenommen und 3ml/Well mit einer
Zellkonzentration von 8,3×105 Monozyten/ml auf 6-Well-Zellkulturplatten gegeben. Diese wurden
dann im Inkubator (37°C und 5% CO2) für 5d inkubiert. An jedem zweiten Tag erfolgte eine Fütterung
der Zellen, wobei 1ml aus jedem Well entnommen und in einem 50ml Plastikröhrchen gepoolt
wurde, so dass die Zellen nach Auffüllen der Lösung auf 50ml mit frischem RPMI
herunterzentrifugiert (300×g für 10min) werden konnten. Anschließend ist der Überstand dekantiert
und das Pellet mit der entsprechenden Menge (1ml/Well) an frisch angesetztem RPMI-Medium (inkl.
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Methoden
Material und Methoden
10%FCS, 560U/ml GM-CSF und 580U/ml IL-4) resuspendiert worden. Danach wurde 1ml dieser
Suspension jeweils auf die einzelnen Wells verteilt.
Alternativ zu der Generierung der moDCs mit RPMI-Medium wurden Bedingungen für die Herstellung
von CD1a+ moDCs entwickelt, bei denen die Verwendung von fötalem Kälberserum (FCS)
ausgeschlossen werden konnte. Dazu sind zunächst die Monozyten während der Isolation in HBSS
ohne die Verwendung von FCS jedoch weiterhin unter Ergänzung mit 5mM EDTA stets aufgenommen
worden und im Anschluss an die magnetische Zellseperation wurden die Zellen in dem serumfreien
CellGro-Medium (inkl. 2% autologes humanes Serum, 250U/ml Natriumheparin, 2240U/ml GM-CSF,
580U/ml IL-4) aufgenommen. Das Medium wurde analog zur vorangehend erläuterten DCGenerierung alle 2 Tage teilweise mit CellGro-Medium aufgefrischt und dabei jeweils vollständig mit
Heparin, GM-CSF sowie IL-4 ergänzt.
In beiden Fällen konnte die durchflußzytometrische Determinierung der Apoptoserate mittels
Annexin V-FITC und Propidiumiodid zeigen, dass zwischen dem 4. und 7. Tag der DC-Differenzierung
ein Plateau an Vitalität bzw. Mortalität der Zellen erreicht wurde, bei dem der prozentuale Wert an
apoptotischen Zellen <17% gewesen ist.
3.2.3 Isolation von myeloiden dendritischen Zellen aus PBMCs
Für die Verwendung von myeloiden dendritischen Zellen in Versuchen zur Untersuchung der
angeborenen Immunantwort antigenpräsentierender Zellen, welche direkt im menschlichen Blut
vorgefunden werden konnen, war es zunächst notwendig, die von dem Hersteller vorgegebenen
Aufreinigungsschritte zu modifizieren. Dazu wurden vorausgehend die PBMCs mit einem von
Miltenyi Biotech zur Verfügung gestellten FcR-blockenden Reagenz für 15min bei 4°C behandelt und
an einem Waschschritt folgend zunächst durch positiv-Selektion die CD19+ B-Zellen, welche ebenfalls
auch CD1c+ sind, mittels des magnetischen Labelings für 15min bei 4°C markiert und anschließend
über eine LS-Säule mit einer Säulenauslastung von 1,5×108 PBMCs/Säule depletiert. Der so erhaltene
Durchfluß wurde dann mit dem biotinylierten anti-CD1c-Antikörper über 15min bei 4°C behandelt
und überschüssiger Antikörper durch Zugabe von 25ml HBSS und anschließender Zentrifugation bei
300×g für 10min abgewaschen. Durch ein weiteres Labeling mittels der Bindung des magnetisch
gekoppelten anti-Biotin-Antikörpers ließen sich die so vorbereiteten Zellen schließlich erneut über
eine LS-Säule positiv selektionieren, wobei es sich nun um die myeloiden DCs gehandelt hat. Eine
durchflußzytometische Untersuchung bzw. die experimentelle Verwendung der gewonnen Zellen
konnte jetzt erfolgen. Da die gleichzeitige Verwendung von FcR-blockenden Reagenz, anti-CD19
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Methoden
Material und Methoden
Microbeads und biotinyliertem anti-CD1c-Antikörper eine Aktivierung von NK-Zellen (117) und
gleichzeitig einen Verlust an anti-CD1c-Antikörper nach sich ziehen würde, war es durch diese
Modifikation möglich, eine erhöhte Vitalität der Zellen und auch Reinheit (87%±3% der Fraktion war
CD1c+ CD11chigh CD123low) bzw. gesteigerte Ausbeute (3.1%±0.6% der PBMCs) an mDCs erzielt
werden.
3.2.4 Herstellung von humanen Serum
Einem freiwilligen Spender wurde in Serum-Monovetten Blut abgenommen und die
Röhrchen daraufhin nach leichtem Schwenken für 1h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann
erfolgte ein Zentrifugationsschritt, bei dem die Monovetten mit 380×g für 30min bei
Raumtemperatur zentrifugiert worden sind. Anschließend konnte das Serum (obere gelbliche Phase
des nun geronnen Bluts) in frische Plastikröhrchen pipettiert und dieses dann bei 300×g für 10min
zentrifugiert werden. Daraufhin ist der Überstand wieder in ein neues Plastikröhrchen gegeben
worden, welches für 30min bei 56°C im Wasserbad behandelt wurde. Dies wurde durchgeführt,
damit eine Inaktivierung der Serumkomponenten erfolgreich erzielt worden ist. Das so fertig
präparierte inaktive Serum konnte für maximal 7 Tage bei 4°C aufbewahrt werden.
3.2.5 Ex vivo T-Zellexpansion durch Antigen-Präsentation von DCs
Sieben Tage vor der Co-Kultivierung von autologen moDCs mit CD8+CD3+ zytotoxischen TZellen wurden Monozyten des Spenders entsprechend des in Kap. 3.2.2 erläuterten Protokolls
aufgereinigt und über 5 Tage zu dendritische Zellen differenziert. Daran anschließend erfolgte die
Behandlung der Zellen unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen für die Aufnahme und
Prozessierung von Antigenen mittels Phagozytose. Zunächst wurden dafür die moDCs mit einem
Zellschaber in den Wells der 6-Well-Platten in die Suspension überführt. Die Zellsuspension musste in
50ml Plastikröhrchen gefüllt und mit 300×g für 10min bei Raumtemperatur zentrifugiert werden,
damit drei darauf folgende Waschschritte mit HBSS (inkl. 5mM EDTA jedoch nun ohne den Zusatz von
1% FCS) durchgeführt werden konnten. Die Zahl der nun gereinigten dendritischen Zellen konnte
dann mittels der Neubauer Zählkammer determiniert werden und eine dem experimentellen Ansatz
angepasste Zellmenge wurde für die Aufnahme in frischem RPMI-Medium (inkl. 10% humanes
Serum, 560U/ml GM-CSF und 580U/ml IL-4) bzw. CellGro-Medium (inkl. 2% humanes Serum,
250U/ml Natriumheparin, 2240U/ml GM-CSF, 580U/ml IL-4) erneut in einem 50ml Plastikröhrchen
herunterzentrifugiert. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1×106/ml auf Zellkulturplatten
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Methoden
Material und Methoden
gegeben und anschließend behandelt, wobei eine unbehandelte negative Kontrolle und eine mit
pp65 (100µg/ml) stimulierte Positivkontrolle für die Präsentation stets mitgeführt wurden.
Nach 48h Stimulationszeit sind die Proben erneut jedoch dieses Mal separat voneinander geerntet
worden und sie mussten in drei aufeinander folgenden Waschschritten von Zytokinen und
Chemokinen sowie den Resten toter Zellfragmente befreit werden. Jede der letztendlich erhaltenen
verschieden Zellsuspensionen wurde dann gezählt und für die Co-Kultivierung mit T-Zellen
vorbereitet. Dazu wurden die Zellen in AIM-V-Medium (inkl. 10% humanes Serum, 140U/ml GM-CSF
und 145U/ml IL-4) aufgenommen mit einer finalen Zellsupsensionskonzentration von jeweils
1×105/ml.
Am 7. Tag erfolgte eine weitere Blutabnahme des gleichen Spenders zur Isolation von PBMCs und der
daran anschließenden Depletion von CD8-CD69+ Zellen (118). Hierzu wurden zunächst die PBMCs mit
einem Gemisch aus biotinylierten, monoklonalen Antikörpern der Firma Miltenyi Biotech (CD4, CD15,
CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD69, CD123, T-cell receptor-γ/δ, CD235a) für 10min bei 4°C
behandelt (100µl/1×108PBMCs) und anschließend dreimal gewaschen. Nun konnte die magnetische
Kopplung mit anti-Biotin-Microbeads erfolgen, bei der eine Inkubation von 15min bei 4°C notwendig
war. Im Anschluss daran wurden die Zellen erneut dreimalig gewaschen und daraufhin über eine LSSäule mit einer Säulenauslastung von 1,5×108 Zellen/Säule separiert. Der Durchfluss der Separation
enthielt nun die CD8+CD69- T-Zellen, welche somit ruhende zytotoxische T-Zellen darstellten. Eine
Untersuchung dieser Fraktion ergab, dass es sich dabei mit einer Reinheit von stets >95% um
CD8+CD69-CD3+
T-Zellen
gehandelt
hat.
Anschließend
wurden
diese
Zellen
mit
CFSE
(Carboxyfluorescein-Succinimidylester) markiert, wobei die Zellen zunächst gezählt worden sind und
dann in 3ml AIM-V Medium aufgenommen wurden. Die Zugabe an CFSE wurde daraufhin im Dunkeln
durchgeführt und es ist dabei eine Menge an CFSE beigemengt worden, welche zu einer
Endkonzentration von 0,5µM/1×106 Zellen geführt hat. Während der Inkubationszeit von 15min bei
37°C im Inkubator sind die Zellen durch das CFSE gelblich gefärbt worden und es folgten dann drei
aufeinanderfolgende Waschschritte. Die dabei erhaltenen Zellen wurden gezählt und schließlich mit
AIM-V inkl. 10% humanes Serum und 5UI/ml IL-2 so aufgenommen, damit eine Zellsupsension mit
einer Konzentration von 1×106 T-Zellen/ml erhalten wurde. 500µl der Zellsuspension ist dann jeweils
in die einzelnen Wells einer 24-Well-Platte vorgelegt worden, so dass anschließend durch Zugabe von
jeweils 500µl der vorbereiteten DC-Suspensionen die Co-Kultivierung ergänzt werden konnte und ein
stimulierende Zelle/antwortende Zelle-Verhältnis von 1:10 vorlag. Eine negative Kontrolle mit
lediglich AIM-V-Medium (inkl. 10% humanes Serum, 140U/ml GM-CSF und 145U/ml IL-4) und eine
Positivkontrolle für die Proliferation mit AIM-V-Medium (inkl. 10% humanes Serum, 140U/ml GMCSF, 145U/ml IL-4 und 22,5µl Phytohemaglutinin M-type-Lösung) wurden stets mitgeführt. Die Platte
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Methoden
Material und Methoden
wurde dann mit Alufolie umwickelt und bei 37°C und 5%CO2 für 9d inkubiert. Am 2. Tag erfolgte die
erste Fütterung mittels einer Zugabe von 1ml/Well von frischem AIM-V-Medium (inkl. 10% humanes
Serum, 140U/ml GM-CSF, 145U/ml IL-4 und 5UI/ml IL-2) und am 4. Tag sind die Zellen durch den
Austausch von 1ml Medium pro Well erneut versorgt worden. Abschließend konnte am 9. Tag die
durchflusszytometrische Untersuchung durchgeführt werden, wobei eine Proliferation der CD8+CD3+
T-Zellen durch einen Abfall an Fluoreszenz im Fluoreszenzkanal 1 (FL1) des Durchflusszytometers zu
erkennen war.
3.2.6 Anzucht von A. fumigatus-Stämme
Im Institut für Hygiene und Mikrobiologie des Universitätsklinikums Würzburg wurde auf
einer
Bierwurzplatte
10µl
einer
1×109
Konidien/ml
konzentrierten
Pilzsporensuspension
ausgestrichen, die Platte mit Parafilm versiegelt und über 3 Tage bei 28°C kultiviert bis grau-grüne
Konidien flächendeckend gebildet worden sind. Anschließend ist je nach Menge an Pilzsporen
entsprechend mehrmals 1ml steriles Wasser auf die Platte pipettiert und die Konidien dann mit
einem Wattestab sanft abgerieben worden. Die Suspension pipettierte man in ein mit einem Zellsieb
versehenes 50ml Plastikröhrchen und füllte dann das Röhrchen mit HBSS auf. Eine Zählung in der
Neubauer-Kammer gab Aufschluss über die Menge an aufgenommenen Konidien. Die benötigte
Konzentration wurde dann auf 1×109/ml eingestellt, indem die Konidien bei 800×g für 10min
herunterzentrifugiert worden sind, der Überstand dekantiert und das Pellet in einer entsprechenden
Menge an HBSS aufgenommen wurde.
Damit sich die Konidien zu Keimschläuche bzw. Hyphen entwickeln konnten, wurden 5×109 Konidien
in 20ml RPMI (inkl. 5% FCS) aufgenommen und in einem mit Alufolie verschlossenen
Erlenmeyerkolben bei 28°C auf dem Schüttler 3h bzw. 6h inkubiert. Anschließend wurde die Menge
an ausgekeimten Pilzsporen gezählt und eine Suspension mit einer Zellkonzentration von 1×109/ml in
RPMI-Medium (inkl. 10% FCS) hergestellt. Die dabei nicht ausgekeimten geschwollenen Konidien
wurden ebenfalls bestimmt, damit bei Vergleichsversuchen unter den verschiedenen Aspergillus
fumigatus-Stämmen jeweilige die Pilzsuspension auf diejenige in dem Versuchsaufbau verwendete
Suspension mit der größten Menge an kontaminierenden und nicht metabolisch aktiven Konidien
mittels der Zugabe an Ethanol-inaktivierten, geschwollenen Konidien des entsprechenden Stamms
geeicht werden konnte (Kapitel 3.2.7). Damit ließ sich der auftretende Einfluss von exponierten
Strukturen angeschwollener Konidien auf Immuneffektorzellen nicht verhindern, jedoch auf ein
gleiches Level bringen. Die zusätzliche Reaktion der Zellen wäre damit auf die beim Versuch
verwendeten Keimschläuche bzw. Hyphen zurückzuführen. Dadurch ist die variierende Veränderung
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Material und Methoden
der Immunantwort in vitro nicht mehr von den durch unsynchrone Auskeimung der Konidien
verursachte Schwankungen überlagert und zeigt bessere Verifizierbarkeit der Versuche mit den
Zellen der verschiedenen Spender.
3.2.7 Inaktivierung von A. fumigatus Morphologien
Damit auch mit inaktiven Pilzmorphologien gearbeitet werden konnte, wurden 1×109
Konidien, Keimschläuche oder Hyphen in einem Plastikröhrchen herunterzentrifugiert und der
Überstand danach verworfen. Anschließend ist das Pilzpellet in 3ml RPMI-Medium resuspendiert
worden bis die Morphologien soweit wie möglich durch energisches Aspirieren mit der Pipette
vereinzelt vorlagen. Nach 10min Ruhezeit wurde dann 7ml reines Ethanol auf den Pilz gegeben und
sofort gut gevortext. Die dabei entstandene Suspension musste bei Raumtemperatur für 30min unter
ständigem Schwenken inkubiert werden bis eine vollständige Inaktivierung der biologischen
Funktionen erreicht werden konnte. Nun konnten die Morphologien mit jeweils 25ml HBSS in drei
aufeinanderfolgenden Waschschritten von allen Resten des Ethanols befreit werden. Die dabei
erhaltenen Pilzmorphologien wurden gezählt und mit einer Konzentration von 1×109/ml in RPMIMedium (inkl. 10% FCS) resuspendiert. Der Nachweis einer Inaktivierung erfolgte stets durch den
Ausstrich des Pilzes auf einer Bierwurzplatte und einer Inkubation bei 28°C über 3 Tage.
3.2.8 Expression von A. fumigatus Antigenen im Pechia Pastoris-System
Die Herstellung von A. fumigatus Antigenen wurde in dem Labor von Prof. Jean-Paul Latgé
(Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris in Frankreich) durchgeführt (119, 120).
3.2.9 Konfrontationsassay mit A. fumigatus Morphologien
Der experimentelle Ansatz zur Feststellung einer Immunantwort von monozytenabgeleiteten DCs auf A. fumigatus Morphologien wurde immer so gewählt, dass der MOI von 1
vorlag (MOI = multiplicity of infection). Dabei sind die Zellen nach ihrer Generierung laut Kapitel
3.2.2 von den Wells der 6-Well-Platten mit Hilfe eines Zellschabers abgelöst worden und durch die
Überführung in ein 50ml Plastikröhrchen, einer darauffolgenden Zentrifugation bei 300×g für 10min
sowie die Aufnahme des Zellpellets in RPMI (inkl. 10% FCS, 560U/ml GM-CSF und 580U/ml IL-4) für
die Herstellung einer Zellsuspension mit einer Konzentration von 1×106/ml für die Co-Kultivierung mit
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Methoden
Material und Methoden
dem Pilz vorbereitet worden. Anschließend wurde der Pilz in der definierten Menge zugegeben und
für 6h mit entweder lebenden oder Ethanol-inaktivierten Konidien, Keimschläuchen oder Hyphen
inkubiert worden. Anschließend wurden für weitere Untersuchungen die Zellkulturüberstände im
Gefrierschrank bei -20°C eingefroren (Kapitel 3.2.14) und die RNA des nach Zentrifugation von
Zellsuspension erhaltenen Zellpellets sofort drauf mit einem RNeasy Mini-Kit (Qiagen) extrahiert.
Eine reverse Transkription der RNA führte schließlich zu cDNA, welche in der qRT-PCR untersucht
werden konnte (Kapitel 3.2.12).
3.2.10 Stimulation von dendritischen Zellen mit A. fumigatus-Antigenen
Für eine Untersuchung der Immunantwort von moDCs bzw. mDCs auf RNA- bzw.
Proteinexpressionsebene aufgrund einer Stimulation durch rekombinante Aspergillus fumigatusAntigene wurden die Zellen zunächst wie in Kapitel 3.2.2 generiert bzw. Kapitel 3.2.3 isoliert.
Anschließend sind die Zellen in einer Konzentration von 1×106 DCs/ml mittels vorangehender
Zählung und einer Aufnahme der DCs in einem entsprechenden Volumen an RPMI-Medium (inkl. 10%
FCS, 560U/ml GM-CSF und 580U/ml IL-4) auf eine 24-Well-Platte vorgelegt. Auf die drauffolgende
Zugabe des entsprechenden Antigens (Aspf1, Crf1, Gel1, Mep1, Pep1, Sod1, Cat1) mit resultierender
gewünschter Endkonzentration folgte die Inkubation bei 37°C und 5% CO2. Die Dauer wurde durch
den experimentellen Ansatz bestimmt. Daraufhin sind die Zellen aus den Wells pipettiert worden und
durch Zentrifugation bei 300×g für 5min wurde der Überstand von den DCs separiert. Der Überstand
konnte dann für die ELISA-Analyse im Gefrierschrank bei -20°C eingefroren werden (Kapitel 3.2.14)
und das Zellpellet wurde durch Aufnahme im RLT-Puffer von Qiagen für die RNA-Isolation vorbereitet
(Kapitel 3.2.12).
3.2.11 NFκB-Translokationsassay mit moDCs
Die relative Menge an nukleären Faktor kappa B (NFκB) im nukleären Extrakt wurde durch
die Bindung des Proteins an seine Konsensussequenz im Trans-AM p65 Transcription Factor Assay-Kit
von Active Motife entsprechen der Angabe des Herstellers festgestellt. Dazu wurden 1×106 DCs
direkt nach einem Experiment mit einer Stimulationszeit von 30min, 1h und 6h für die Isolation des
nukleären Extrakts verwendet. Der nach der Erfassung von optischer Dichte (OD) erhaltene Wert von
stimulierten Proben wurde stets in Relation zur negativen Kontrolle des gleichen Zeitpunkts und
gleichen Spenders gesetzt, welche i.d.R. lediglich aus unstimulierten dendritischen Zellen bestanden
hatte.
38 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Hierbei wurde bis zur letztendlichen Ermittlung der OD zunächst das nukleäre Extrakt jeder Probe auf
eine mit NFκB-Konsensusoligonukleotiden-beschichteter Platte gegeben. Anschließend konnte das
NFκB mittels eines primären anti-p65-Antikörpers und eines sekundären HRP-gekoppelten
Antikörpers für die Detektion durch eine Farbreaktion von H2O2 und Tetramethylbenzidin (TMB)
vorbereitet werden. Der Farbumschlag beim Abstoppen der Reaktion mittels 1N Schwefelsäure
führte dazu, dass die Platte im Extinktionsmessgerät mit Licht der Wellenlänge von 450nm inklusive
einer λ-Korrektur bei 655nm gelesen werden konnte. Erhaltene Absorptionsdaten wurden in direkt
proportionaler Relation zur negativen Kontrolle gesetzt, so dass ein Faktor errechnet worden ist, der
als Multiplikator des im Zellkern vorzufindenden NFκBs betrachtet werden darf.
3.2.12 RNA-Isolation und reverse Transkription
Die Isolation der RNA aus monozyten-abgeleiteten DCs wurde mit dem RNeasy Mini Kit
(Qiagen) bei Zellmengen von mindestens 1×106 bzw. mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen) bei einer
Zellzahl von höchstens 1×106 verwendet. Das Protokoll des Herstellers wurde dabei genau befolgt
und die zu verwendenden Puffer und Materialien waren im Kit bereits enthalten. Die Qualität und
Menge an RNA wurde mittels einer Messung der optischen Dichte im UV-Spektum mit Hilfe des ND1000 Spectrometers (Nanodrop) determiniert.
Daraufhin ist die Konzentration der RNA einer Messreihe an die niedrigste Konzentration
ausgerichtet worden, so dass alle weiteren Proben der Messreihe mit H2O verdünnt werden
mussten. Es musste aber eine Mindestmenge von 300ng/Ansatz an RNA verwendet werden, um eine
geeignete Detektion der Zielgene in der qRT-PCR zu gewährleisten. Nun konnte die reverse
Transkription mit Hilfe des reverse Transkription-Kit (Qiagen) erfolgen, wobei die Durchführung strikt
nach dem Protokoll des Herstellers erfolgte. Die anschließend erhaltene cDNA wurde bei -20°C für
max. drei Monate gelagert.
3.2.13 Relative quantitative RT-PCR
Die relative quantitative RT-PCR wurde gemäß der MiQe-Guidelines für quantitative real-time
PCR durchgeführt (121). Dabei mussten jedoch zunächst die optimalen Laufbedingungen für jedes
Primerpaar herausgefunden werden, da die Primer vom Hersteller TIB Molbiol produziert wurden
und nicht an die Taq-Polymeraseaktivität (25bp/s) und MgCl2-Konzentration des Qiagenkits
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Methoden
Material und Methoden
angepasst waren. Für die Ermittlung der Annealingtemperatur der Primer eines jeden zu
untersuchenden Gens wurde die folgende Berechnung zu Grunde gelegt:
Die Annealingtemperatur eines Primers sollte laut Hersteller mindestens 5°C und höchstens 8°C
unterhalb der Schmelztemperatur dessen liegen. Da der forward- und der reverse-Primer i.d.R. leicht
voneinander abweichende Schmelztemperaturen aufwiesen, wurde das Temperaturintervall beider
Primer überlagert und die mittlere Temperatur im überschneidenden Temperaturspektrum als
Annealingtemperatur gewählt (Abbildung 7). Die ermittelte Temperatur musste zusätzlich auch
mindestens 3°C niedriger als die kleinste Schmelztemperatur der Sonden sein.
Abbildung 7: Ermittlung der Annealingtemperatur
Das Spektrum des Primer 1 (hellgrau) und des Primer 2
(dunkelgrau) geht jeweils von der Schmelztemperatur (T m1
bzw. Tm2) bis minus 8°C davon. Der überlappende Bereich
(grün) stellt das Temperaturspektum mit potentiellen
Annealingtemperaturen. Verwendet wurde die mittlere
Temperatur dieses Spektrums.
Die Bestimmung der Elongationszeit bedurfte der Feststellung der Amplikonlänge (Kapitel 7.2.1).
Anhand der enzymatischen Aktivität der Taq-Polymerase und resultierend daraus eine
Einbaugeschwindigkeit von 25bp pro Sekunde, ist die Elongationszeit als Ergebnis aus der Summe
von Amplikonlänge und einem Puffer von 20% der Amplikonlänge dividiert durch die Einbaurate von
25bp/s berechnet worden. Diese Zeit schwankte prozentual enorm aufgrund der verschiedenen
Amplikonlängen.
Ebenfalls zu beachten war, dass ab einer Amplikonlänge von mehr als 250bp die Zeit für eine
Aktivierung mittels Hitze (95°C) der hot-start Taq-Polymerase von normalerweise 3min auf 5min
angehoben werden musste. Von Seiten des Primer- und Sondenherstellers wurde empfohlen, dass
die
Annealingtemperatur
möglichst
langsam
erreicht
werden
sollte,
um
mögliche
Sekundärstrukturen zu vermeiden. Es ließ sich ermitteln, dass mit einem Temperaturabfall von
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Methoden
Material und Methoden
0,2°C/s nach dem Aufschmelzen der Doppelstränge bei 95°C auf die jeweilige Annealingtemperatur
eine optimale Amplifikation erreicht werden konnte.
Während eines Laufs wurde die Fluoreszenz der Sonden im Anschluss an die Annealingphase eines
jeden Zyklus punktuell gemessen. Nachdem zu Beginn der PCR eine Grundfluoreszenz durch den
Detektor festgestellt wurde, stieg die Fluoreszenz anschließend abhängig von der in der Probe
enthaltenen Menge an DNA-Template an. Der Wert der Grundfluoreszenz wurde als Basis für die
Berechnung des später bei der Auswertung verwendeten Crossingpoints (CP) verwendet. Die
Fluoreszenz/Zyklus-Kurve verlief exponentiell und erreichte bald darauf eine Plateauphase. Die
Tangente der Kurve, welche die maximale Steigung aufwies, wurde von der Software als
Schnittgerade zur Basallinie verwendet, wobei der Schnittpunkt den Crossingpoint der Amplifikation
festgelegt hat. Ausgegeben wurde der Zykluswert, an dem der CP vorzufinden war.
Für die Berechnung des Verhältnisses (ratio) einer relativen Quantifizierung wurde folgende Formel
verwendet:
mit
: Effizienz der PCR des Zielgens
: Effizienz der PCR des Housekeepinggens
: Crossing-point der negativen Kontrolle zum Zielgen
: Crossing-point der stimulierten Probe zum Zielgen
: Crossing-point der negativen Kontrolle zum
Housekeepinggens
: Crossing-point der stimulierten Probe zum Houskeepinggens
Die dabei zugrundeliegende Effizienz einer PCR muss im Vorfeld festgestellt werden, da sich diese
durch Faktoren, wie Primer- und MgCl2-Konzentration aber auch Menge an kontaminierender, nicht
zu amplifizierender DNA, verändert.
mit
Steigung der Gerade in einem Koordinatensystem aus CP (y-Achse) und
Konzentration (x-Achse); es handelt sich bei den Konzentrationen um Verdünnungen der
Stammlösung an DNA-Template des zu untersuchenden Gens.
Das Optimum mit einer 100%igen Reaktion liegt bei einer Effizienz von 2, wobei die der
Standardkurve zu entnehmende Steigung einen Wert von -3,32 haben muss.
41 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
3.2.14 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Bei der Durchführung der ELISAs mittels vorgefertigter Kits wurden stets die Protokolle der
Hersteller eingehalten und die mitgelieferten Puffer und Materialien dabei verwendet.
Im Gegensatz dazu waren die Inhouse-ELISA individuell im Labor zusammengestellt worden und jede
Komponente des Assays wurde sorgfältig ausgesucht sowie auch ihre Menge austitriert, damit eine
optimale Komposition aus Platte, Antikörper, Enzym, Lösungen und Puffer zustande gekommen ist.
Dabei spielte vor allem die Bindekapazität der Platte und ihre Oberflächengröße, aber auch die
Konzentrationen der Antikörper, die Inkubationszeiten und die Komponenten der Puffer eine
wesentliche Rolle. Da die Qualität der Antikörper für verschiedene Antigene und ihrer
Bindungsspezifitäten stets sehr gut gewesen sind, konnte mit den ursprünglich für das Chemokin
CCL20 ermittelten Einstellungen auch bei der Detektion weiterer Chemokine und Zytokine bei
gleicher Qualität fortgefahren werden.
Zunächst wurden die Wells einer medium-binding, full-area 96-Well-Platte (Greiner) mit dem
Erstantikörper beschichtet. Dafür wurden mit einer Multipette 100µl einer 2µg/ml Antikörperlösung
pipettiert und anschließend die Platte mit einer Klebefolie versiegelt, damit daraufhin der Antikörper
bei Raumtemperatur über Nacht inkubieren konnte. Am zweiten Tag sind die Wells dreimalig mit
jeweils 300µl Waschpuffer im Platewasher gereinigt worden. Nun mussten die weiteren reaktiven
Bindungspartner auf der Platte mittels eines Blockingpuffers neutralisiert werden. In jedes Well
wurden 300µl des Puffers gefüllt und die Platte erneut bei Raumtemperatur für mindestens 2h auf
dem Plattenschüttler bei 600rpm behandelt. Ein weiterer Waschschritt führte schließlich zu einer
nun vollständig einsatzbereiten ELISA-Platte, auf der nun Kontrollen, die Standards und die zu
untersuchenden Proben pipettiert werden konnten. Sie konnte bis zu 6 Monate bei 4°C gelagert
werden, wofür eine Versiegelung mit einer Klebefolie notwendig gewesen ist. Beim Beginn eines
ELISAs musste zunächst der Standard erstellt werden, welcher für die Ermittlung der Standardkurve
benötigt wird. Dazu ist in einem 1,5ml Eppendorf-Cap 998,4µl und in 12 weitere Eppendorf-Caps je
500µl des Standardpuffers gegeben worden, woraufhin die erste Standardlösung mit einer
Endkonzentration von 40ng/ml durch Zugabe von 1,6µl der 25µg/ml Antigen-Stammlösung zu dem
Standardpuffer des ersten Eppendorf-Caps hergestellt. Durch kurzes Vortexen wurde stets eine
optimale Vermischung erreicht. 500µl dieser Standardlösung sind dann mit den bereits vorgelegten
500µl Standardpuffer der künftigen zweiten Standardlösung vermengt worden. Eine gründliche
Durchmischung der Lösung und die Fortführung der schrittweisen 1:1-Verdünnung bis zum 13.
Standard ergab schließlich die Standardlösungen der gesamten Standardreihe. Im Anschluss daran
wurden der Standard und die unbekannten Proben der verschiedenen Versuche in Duplikaten mit
42 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
jeweils einem Volumen von 100µl auf die Platte pipettiert. Die Platte wurde versiegelt und die
Antigen-enthaltenen Lösungen darauf sind bei Raumtemperatur für 2h auf dem Plattenschüttler mit
600rpm inkubiert worden. Es erfolgte nun der nächste Waschschritt, welcher von der Zugabe von je
100µl des biotinylierten Zweitantikörpers (Arbeitskonzentration von 4µg/ml) gefolgt war. Wiederum
wurde die Platte für 2h auf dem Plattenschüttler versiegelt behandelt. Anschließend ist die Platte
wieder gewaschen worden und mit dem Streptavidin-gekoppelten Enzym (HRP; horseradish
peroxidase), welches in der Enzym-haltigen Lösung aufgenommen war und mit 100µl/Well auf die
Platte gegeben wurde, für 20min unter ständigem Schütteln mit 600rpm inkubiert. Damit später die
Absorption des bei dem enzymatischen Schritt erzeugten Farbstoffes gemessen werden konnte,
musste nun nach einem weiteren Waschschritt die Zugabe von 100µl der Substratlösung in jedes
Well durchgeführt werden. Darauf folgte eine Inkubation, bei der die Platte nicht mehr auf dem
Schüttler gestellt wurde, sondern ruhend im Dunkeln gehalten worden ist, damit die Reaktion so
spezifisch wie möglich nur von dem Enzym katalysiert wird. Nach 12min war der Standard optimal
aufgetrennt, so dass die Reaktion des Enzyms durch Zugabe von 50µl der 1N Schwefelsäure
abgestoppt und damit die Platte im ELISA-Reader eingelesen werden konnte. Die höchsten
Konzentrationen des Standards fielen bei der so verwendeten Inkubationszeit nicht aus dem
Detektionsbereich des Readers heraus. Die Ermittlung der Absorption bei einer Wellenlänge von
450nm mit einer λ-Korrektur bei 570nm ergab schließlich anhand der Standardkurve die
Konzentrationen an Chemokinen und Zytokinen der unbekannten Proben.
3.2.15 Western blot Analyse
Damit die Zellen für die Western blot Analyse lysiert vorlagen, wurden sie zunächst in 1xTrisGlycine/SDS Probenpuffer aufgenommen und anschließend für 5min bei 95°C erhitzt. Ein
Spritzenaufschluss der Zellreste ergab schließlich die für die SDS-PAGE vorbereitete Probe. Nachdem
die Probe hergestellt wurde, konnte sie entweder direkt für die Gelelektrophorese verwendet
werden oder im Gefrierschrank bei -20°C für bis zu 2 Monate gelagert werden.
Die Proben wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel bei 120V für 45min aufgetrennt. Daraufhin
wurde das Gel auf eine Nitrozellulosemembran überführt und der Western blot konnte bei einer
Stromstärke von 275mA durchgeführt werden. Dazu wurde das Gel mit der Membran in eine
Semidry-Western blot-Kammer gelegt und für 30min behandelt. Nun konnte das Gel entfernt werden
und die Membran wurde dann mit Ponceau S-Puffer überschichtet. Das dreimalige Waschen mit
destilliertem Wasser legte nun die rot gefärbten Proteinbanden frei. Danach ist die
Nitrozellulosemembran mit TBS-Puffer dreimalig gewaschen worden, bis die Rotfärbung nicht mehr
43 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
zu sehen war. Die Membran wurde daraufhin mit dem 3% TBS-T Milchpuffer für 1h auf der
Schwenkplattform bei einer Schwenkfrequzenz von 60 Schwenks/s behandelt, damit sämtliche
unspezifischen Reaktionsgruppen auf der Membran neutralisiert werden konnten. Nun war sie für
die Inkubation mit dem monoklonalen Erstantikörper vorbereitet. Dieser wurde je nach Antikörper in
einer anderen Verdünnung in 3% TBS-T Milchpuffer verdünnt und dann auf die Membran für eine
Inkubation über Nacht bei 4°C gegeben. Am zweiten Tag ist der Erstantikörper dekantiert und
überschüssiger Antikörper ist mittels eines Waschschritts, bei dem die Membran dreimalig
hintereinander für je 10min mit TBS-T-Puffer überschichtet wurde, von weiteren Resten befreit
worden. Der HRP-gekoppelte Zweitantikörper wurde nun hinzugegeben. Eine Inkubation für 1h bei
Raumtemperatur auf der Schwenkplattform präparierte die Membran für die Reaktion mit einer ECLLösung, wobei zunächst erneut ein Waschschritt erfolgen musste. Die ECL-Lösung wurde dann auf die
Membran gesprüht und für 3min auf ihr inkubiert. Ein Abtupfen sorgte dafür, dass die überschüssige
Lösung nicht weiter mitgeführt wurde. Nun konnte die Nitrozellulosemembran zwischen zwei
Klarsichtfolien eingebettet für die Belichtung des Röntgenfilms in der Dunkelkammer verwendet
werden. Die Belichtungszeit schwankte je nach Menge an aufgetragenem Protein und daraus
resultierender Chemilumineszenz. Für einen Vergleich war deshalb stets die Mitführung von
Kontrollen und Standards auf demselben Gel unabdingbar.
Die Schwärzung der Banden ließ sich mittels des Programms ImageJ rechnerisch erfassen, wobei der
Schwärzungsgrad als Histogramm aufgezeigt wird. Die Fläche des Histogramms war damit
proportional zu der Stärke des Signals. So wurde die Schwärzung von bekannten Konzentrationen
ermittelt und in einem Koordinatensystem eingetragen, wobei die Abszissenachse aus der lineare
Darstellung der Schwärzung und die Ordinatenachse aus der logarithmischen Darstellung der
Konzentration bestand. Die Ermittlung der Steigung und des y-Achsenabschnitts dieser Gerade
(Regressionsgerade mit mindestens R2>0,998) ergab die rechnerische Grundlage für die Berechnung
der einzelnen Konzentrationen des Proteins in den unbekannten Proben.
Dazu wurde folgende Formel verwendet:
3.2.16 Durchflußzytometrie
3.2.16.1 Apoptoseassay
Damit die Viabilität der DCs nach der Behandlung mit verschiedenen Antigenen analysiert
werden konnte, wurde die Rate an Apoptose und Nekrose durch eine durchflusszytometrische
44 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Untersuchung ermittelt. Dazu sind die Zellen zum einen mit FITC-gekoppeltem Annexin V für die
Detektion von extrazellulär lokalisiertem Phosphatidylserin und zum anderen mit Propidiumiodid
(PI), welches zum Nachweis von frei vorliegender DNA toter Zellen notwendig ist, verwendet (122).
Dazu wurden die Zellen gezählt und nach einem Zentrifugationschritt in Bindingpuffer des ApoptoseKits bzw. HBSS inkl. 100mM CaCl2 aufgenommen, so dass eine Zellsuspension mit der Konzentration
von 1×106 DCs/ml vorlag. 100µl dieser Suspension ist dann in die FACS-Röhrchen überführt worden,
so dass pro Ansatz vier Röhrchen befüllt waren. Das erste Röhrchen blieb ungefärbt, die zwei
folgenden wurden mit je 2µl eines der Farbstoffe (Annexin V-FITC bzw. PI) ergänzt und dem letzten
sind beide Farbstoffe zugegeben worden. Eine Inkubation nach Versieglung der Röhrchen mit
Parafilm bei Raumtemperatur für 15min führte schließlich zu fertig präparierte Zellsuspensionen,
welche nach weiterer Zugabe von 200µl an Bindepuffer nun im FACS untersucht werden konnten.
3.2.16.2 Untersuchung der Zelloberflächenmarkerexpression
48h nach der Behandlung von unreifen dendritischen Zellen bzw. myeloiden DCs (1×106) mit
Aspf1, Crf1, Cat1, Sod1, Gel1, Pep1 oder Mep1 (jeweils entweder 5µg/ml bzw. 10µg/ml), wurden die
Zellen mit FITC- oder PE-gekoppelten Antikörpern gegen CD1a, CD1c, CD11c, CD40, CD80, CD83,
CD86 und HLA class II entsprechend Kapitel 3.2.16.1 gefärbt, jedoch mit dem Unterschied, dass der
Bindingpuffer lediglich aus HBSS bestand und die Inkubation bei 4°C stattfand. Anschließend erfolgte
ebenfalls im Gegensatz zur oben erwähnten Untersuchung am FACS ein Waschschritt mit je 2ml
HBSS, woraufhin die Zellen in 300µl HBSS aufgenommen wurden. Die Zellen waren damit bereit für
die Messung am FACS-Gerät.
3.2.16.3 Kompensation der FACS-Daten mit FlowJo
Die durchflußzytometrischen Daten wurden durch die Verwendung der FlowJo-Software
gemäßt der Vorgabe des Softwareherstellers mit den entsprechenden Positiv- und Negativ-Proben
kompensiert (Version 8.8.6; Trustees of Leland Stanford, Jr., University). Dies beugt einer fälschlichen
Auswertung vor, da die Farbstoffe nicht präzise in jeden Fluoreszenzkanal hineinstrahlen, sondern
ein breiteres Fluoreszenzspektrum aufweisen. Bei der Untersuchung von gleichzeitig FITC- und PEbzw. PI-gefärbten Zellen, musste der Anteil an FITC aus dem Fluoreszenzkanal 2 (FL2), welcher für die
Messung von PE und PI verwendet wurde, abgezogen werden. Die rechnerische Subtraktion dieser
Fluoreszenz wurde durch FlowJo mittels Erstellung einer Kompensationsmatrix, anhand derer eine
genaue Angleichung erfolgt ist, durchgeführt.
45 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
3.2.17 Fluoreszenzmikroskopie
Nachdem die dendritischen Zellen dem HA-getaggten Aspf1 (5µg/ml) für 15min, 30min bzw.
3h ausgesetzt waren, wurden sie mit 3,7%igem Paraformaldehyd für 5min fixiert. Für eine
interazelluläre Färbung wurden diesen Zellen anschließend nochmal mit 0,2%igem Triton X-100 für
1min behandelt. Die Färbung erfolgte dann durch einen HA-spezifischen monoklonalen
Erstantikörper und anschließend mit dem entsprechenden Cy3-gelabelten Zweitantikörper, welcher
gegen die IgG-Antikörper der Spezies, aus der der Erstantikörper stammte, gerichtet war. Die Proben
wurden dann mit einem SP5 Konfokallaserscanmikroskop analysiert. Die Färbung der Zellen und die
Untersuchung derer im Fluoreszenzmikroskop wurde im Labor von PD Dr. Frank Ebel am Max von
Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der LMU München von Allison
McCormick durchgeführt.
3.2.18 Aggregometrie mit humanen Thrombozyten und A. fumigatus
Morphologien
Die Aggregometrie wurde im Arbeitskreis von Prof. Nieswand im Rudolf-Virchow-Zentrum
des Universitätsklinikum Würzburg am Apact 4-Aggregometer durchgeführt. Bevor eine Messung
möglich gewesen ist, mussten zunächst die Thrombozyten im plättchenreichen Plasma (PRP) isoliert
werden. Dafür wurde freiwilligen Spendern Vollblut in Citrat-Röhrchen entnommen und bei 300×g
für 20min bei 18°C ohne die Verwendung einer Bremse zentrifugiert. Dies resultierte in einer Plasmaund einer Zell-Phase im Röhrchen. Die Plasmaphase wurde mittels einer serologischen Pipette
vorsichtig abgenommen und in ein 15ml-Plastikröhrchen gegeben. Das so gewonnene PRP musste
sofort nach der Isolation für die Versuchsdurchführung verwendet werden, da die Plättchen sehr
sensibel in ihrer Integrität und Erregbarkeit gewesen sind und ihre Reaktion auf einen Stimulus sich
mit der Zeit enorm verschlechtere. Daher bestand ein Zeitfenster von höchstens 3h nach Isolation für
den anschließenden Versuch mit reproduzierbaren Ergebnissen. Ein Leerwert für das Eichen des
Aggregometers wurde erstellt, indem ein Volumen von 500µl PRP bei 13400×g für 5min
herunterzentrifugiert wurde und das plättchenarme Plasma (PPP) entnommen, in ein neues Eppi-Cap
überführt und dann gemessen worden ist. Für jeden Messvorgang am Aggregometer musste ein
Volumen von 160µl in die Plastiküvetten gegeben werden. Die Mitführung von Luftbläschen war
dabei strikt zu vermeiden. Nach der Eichung der vier Kanäle des Geräts wurden die PRP-befüllten
Küvetten hineingestellt und der Maximalwert für die Extinktion des roten Laserlichtes gemessen. Die
46 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Plättchenkonzentration befand sich dafür stets in einem vom Gerät tolerierten Bereich von 1×105/µl
bis 3×105/µl. Determiniert wurde die Konzenzentration der Plättchen im Sysmex Cytometer nach
einer 1:10-Verdünnung des PRPs in PBS. Unter ständigem Rühren mittels eines Magnetrührers in
jeder Küvette wurde während einer Aggregationsmessung die Zugabe von Agonisten, welche die
Aggregation auslösen konnten, stets auf eine 1:100-Verdünnung festgelegt, so dass 1,6µl der zuvor
100-fach höher konzentrierten Stammlösung zu den Plättchen gegeben wurde. Bevor dies jedoch
geschehen konnte, sind die Thrombozyten für 5min entweder mit Morphologien von Aspergillus
fumigatus (ATCC bzw. D141) oder mit dem Nährmedium des Pilzes als Negativkontrolle inkubiert
worden. Dazu wurde stets 10µl der Pilz-Stammlösung mit 1×107 Morphologien/10µl verwendet,
wobei auch hier eine entsprechende Stammlösung zuvor eingestellt werden musste.
Nach der Inkubationsphase von 5min mit A. fumigatus-Morphologien wurde die Aggregation durch
die Zugabe von einem Agonisten, wie ADP bzw. Collagen, ausgelöst. Die Messung der Aggregation
verlief ebenfalls über 5min. Währenddessen erreichte die Aggregation ihr Maximum in der
Verringerung der Extinktion und mündete in einer Plateau-Phase des Extinktionskurvenverlaufs
(Abbildung 8).
Abbildung 8: Messreihen am Aggregometer
(1) Die Messung vor der Zugabe von Pilzmorphologien
(maximale Extinktion). (2) Messung der Extinktion nach
der Aggregation. Die Messreihen vor und nach der Zugabe
eine Agonisten (ADP bzw. Collagen) wurden als
Grundlage für die Berechnung des Aggregationsratios
verwendet. Die y-Achse zeigt den Wert für das Maß an
Abfall von Extinktion an.
47 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Damit die in der Aggregometrie erhobenen Daten für eine Quantifizierung der Beeinträchtigung der
Aggregation verwendet werden konnten, musste der Aggregation ein Wert beigemessen werden.
Dieser wurde in einem Verhältnis aus Extinktion nach der Stimulation zu der Extinktion der gleichen
Probe vor der Zugabe des aggregationsinduziierenden Agonisten festgehalten. Es sollte sichergestellt
werden, dass die Verringerung der Aggregation nicht auf die von Spender zu Spender schwankende
Menge an Plättchen, der unterschiedlichen Erregbarkeit der Plättchen oder einer Schwankung der
Aggregation in einem Replikat zurückgeführt werden kann. Damit nun ein verlässlicher Wert für den
Zeitpunkt direkt vor der Stimulation (nach 5min) als auch nach der Aggregation (nach 10min)
ermittelt werden konnte, wurde zunächst zu jedem Versuchsreplikat eine Messreihe aus je 10
Messpunkten für jeden der beide Zeitpunkte erstellt. Die Messreihe erstreckte sich über ein
zeitliches Fenster von je 2sec (Messung der Extinktion durch den Aggregometer erfolgte alle 200ms).
Die Werte der Reihe eines Zeitpunkts sollten im Grunde gleich sein, jedoch lagen leichte
Schwankungen bedingt durch die Messung vor. Daher sind diese Werte je zu einem Mittelwert
zusammengefasst worden. Anschließend sind die beiden resultierenden Werte eines Replikats mit
den entsprechenden Werten der weiteren Replikate eines Versuchs gemittelt worden. Das ergab
schließlich einen robusten Wert für die Extinktion vor und nach der Stimulation mit Collagen bzw.
ADP. Nun wurde der Wert für die Extinktion vor der Stimulation mit dem am experimentellen Ansatz
ausgerichteten Basiswert von 600 gleichgesetzt, welcher somit höher gewesen ist als der
Extinktionswert für die maximale Menge an Thrombozyten (3×105/µl). Die Differenz dieser
Anpassung wurde dann zur Normalisierung des Extinktionswerts nach der Stimulation verwendet.
Dies stellte sicher, dass Schwankungen in der Plättchenkonzentration von Spender zu Spender
ausgeglichen werden. Es war daraufhin möglich gewesen die beiden Werte für die Extinktion vor und
nach Stimulation eines Versuchs in ein Verhältnis zu setzen, so dass der normalisierte Ratio für die
Aggregation zustande kam. Dabei war definitionsgemäß der Wert für höhere Extinktion mit
ruhenden Thrombozyten nun auf 600 festgesetzt. Im Anschluss daran konnten die normalisierten
Ratios von Pilz-behandelten und von Nährmedium-behandelten Thrombozyten (Negativkontrolle)
entsprechend der unten aufgeführten Formel verrechnet werden, so dass dabei der Prozentsatz an
Aggregation eines Spenders resultierte.
(
)
48 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Für die Ermittlung des normalisierten Ratios jedes Versuchsansatzes eines Spenders wurde ein PerlProgramm geschrieben, indem die Daten verarbeitet wurden und schließlich in eine CSV-Datei
exportiert worden sind. Ein weiteres Perl-Programm fasste dann die einzelnen Spender-Daten aus
den CSV-Dateien zu einem Datensatz zusammen und verrechnete diesen für die Ermittlung des
Mittelwerts der verschiedenen Ratios.
....
while(<DATEI>) {
$zeile = $_;
chomp($zeile);
#Initialisierung der Zusammenfassung von Messdaten vor Aggregation
if($counter > 1510 && $counter <= 1520) {
$replikate_norm[$r] = $zeile;
$r++;
}
$counter++;
} #close while vor Aggregation
while($pos < $r) {
$replikate_normmean = $replikate_normmean + $replikate_norm[$pos];
$pos++;
}
$replikate_normmean = $replikate_normmean / $r;
$difference = 600 - $replikate_normmean;
$pos = 0;
$r = 0;
while(<DATEI>) {
$zeile = $_;
chomp($zeile);
#Initialisierung der Zusammenfassung von Messdaten nach Aggregation
if($counter > 3020 && $counter <= 3030) {
$replikate[$r] = $zeile;
$r++;
}
$counter++;
} #close while nach Aggregation
while($pos < $r) {
$replikate_mean = $replikate_mean + $replikate[$pos];
$pos++;
}
$replikate_mean = $replikate_mean / $r;
$norm = $replikate_mean + $difference;
#Berechnung des Aggregations-Ratios
49 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
$ratio = 600 / $norm;
$replikate_mean =~ tr/./,/;
$norm =~ tr/./,/;
$ratio =~ tr/./,/;
....
Auszug des Perl-Programms für die Erstellung des normalisierten Ratios einer Versuchsbedingung mit
mindestens drei Replikaten.
3.2.1 Bestimmung der Gerinnungsparameter
Damit die Gerinnungsparameter im Plasma von Spendern nach der Behandlung des PRPs mit
verschiedenen Morphologien der beiden Stämme ATCC und D141 untersucht werden konnten,
wurde zunächst das plättchenreiche Plasma mit dem Pilz inkubiert und anschließend die
Pilzmorphologien und die Blutplättchen durch Zentrifugation bei 13400×g für 5min in der
Tischzentrifuge vom Plasma separiert worden. Der Überstand ist dann in ein neues Kryoröhrchen
pipettiert worden, welches auf Eis gelegt wurde und nun für die Analyse der Gerinnungsparameter
vorbereitet
war.
Diese
teils
ELISA-basierte
Untersuchung
fand
im
Zentrallabor
des
Universitätsklinikum Würzburg statt und wurde nicht später als 30min nach dem Experiment
durchgeführt. Es handelte sich bei den zu bestimmenden Faktoren um die Thromboplastinzeit nach
Quick (%), den International Normalized Ratio, den PTT-Wert (sec), den Fibrinogen-Wert (g/l) und die
Konzentration an D-Dimere (mg/l).
3.2.2 Statistische Analyse
Mittelwert
Die Messwerte der gleichen Versuche jedoch von unterschiedlichen Spendern wurden zum
arithmetischen Mittel zusammengefasst. Dabei wurden stets mindestens 3 Blutspender verwendet,
damit eine größere Varianz verursacht durch Ausreißer in den Messwerten verhindert werden
konnte.
̅
mit
∑
̅ : Standardfehler des Mittelwerts
n: Stichprobengröße
: Einzelwerte
50 | S e i t e
Methoden
Material und Methoden
Standardfehler des Mittelwerts (standard error of the mean; SEM)
Der Standardfehler ist die durchschnittliche Abweichung des Mittewerts vom wahren
Mittelwert. Dieser errechnet sich durch den Quotienten aus Standardabweichung und der Wurzel
aus der für den Mittelwert zugrundeliegender Stichprobengröße.
̅
mit
mit
√
√
: Standardabweichung der Wertemenge
Var : Varianz der Wertemenge
Gepaarter zweiseitiger studentischer T-Test
√
mit
̅
für | |
mit Signifikanzniveau α = 5%
Anzahl an Paare
Differenzen der Paare
̅ : arithmetisches Mittel der Differenzen
: Standardabweichung der Differenzen
51 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
4.1.1 Die Aktivierung von NFκB
Bei der relativen Quantifizierung von aktiviertem NFκB p65, welches im Nukleus lokalisiert
gewesen ist, konnte demonstriert werden, dass nach einer Stimulation von moDCs mit Aspf1 die
Aktivierung des Transkriptionsfaktors induziert wurde und eine Translokation der p65-Untereinheit in
den Nukleus erfolgt ist. Dabei diente die Stimulationbedingung mit LPS (10µg/ml) als Positivkontrolle,
bei der nach 24h ein 3,2-fach höhere Menge und nach 48h ein um 2-fach erhöhtes Level an
intranukleärem NFκB gegenüber der Negativkontrolle vorlag. Das Mitogillin (5µg/ml) hingegen
verursachte einen etwas geringeren Effekt, jedoch waren die Werte mit einem 1,5-fachen Anstieg
nach 24h und einem 2,2-fachen Anstieg nach 48h signifikant und ließen auf eine deutliche
Aktivierung des NFκB-Signalwegs hinweisen.
4.1.2 Differentielle Genexpression nach Stimulation mit Aspf1
In Vorversuchen wurden iDCs mit LPS stimuliert und anschließend konnten mittels qRT-PCR
die Levels an differentieller Zytokin- und Chemokinexpressionen bei der Relation zur unstimulierten
Kontrolle festgestellt werden. Die Daten zeigten erhöhte Levels für die Gene tnf-α (nach 6h: 25-fach
erhöht; nach 24h: keine Veränderung; nach 48h: 3-fach erhöht), il-8 (nach 6h: 102-fach erhöht; nach
24h: 15-fach erhöht; nach 48h: 21-fach erhöht), il-10 (nach 6h: 8-fach erhöht; nach 24h: keine
Veränderung; nach 48h: keine Veränderung), cxcl10 (nach 6h: 2.600-fach erhöht; nach 24h: 53-fach
erhöht; nach 48h: 4-fach erhöht) und ccl20 (nach 6h: 1.150-fach erhöht; nach 24h: 22-fach erhöht;
nach 48h: 5-fach erhöht). Diese Genexpressionsanalysen konnten mit Hilfe der ELISA-Analyse von
Überständen der stimulierten Zellen verifiziert werden.
Parallel zu den Vorversuchen mit LPS sind dendritische Zellen dann mit den rekombinanten
Antigenen Aspf1 bzw. Crf1 behandelt worden, wobei die Stimulation zu einer differentiellen
Genexpression der Gene für die Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-12p35 und IL-23p19 aber auch für die
Chemokine IL-8, CXCL10 und CCL20 geführt hat. Die Expression der verschiedenen Zytokine und
Chemokine variierte enorm beim Vergleich zwischen den beiden Antigenen (Tabelle 1). Nach der
Stimulation mit dem Antigen Crf1 konnte lediglich ein leichter Anstieg des Expressionslevels der Gene
für IL-8, CXCL10 und CCL20 beobachtet werden (2,1-fach bis 2,9-fach). Im Gegensatz dazu induzierte
das rekombinante Protein Aspf1 eine beachtliche Hochregulation besonders der Gene für CXCL10,
CCL20 und IL-8 sowie auch initial für IL-23p19.
52 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Genprodukte
TNF-α
IL-8
IL-23p19
CXCL10
CCL20
IL-12p35
IL-10
IL-1β
Ergebnisse
Differentielle Expression (fold-change) zu den
angegebenen Zeitpunkten nach der Stimulation mit:
Aspf1
Crf1
6h
24h
48h
6h
24h
48h
8,2
12,0
22,0
3,0
30,0
72,0
275,0
2,1
2,8
2,9
7,5
2,2
N/E
N/E
N/E
39,0
60,0
27,0
2,3
2,9
3,1
247,0
299,0
314
3,1
N/E
14,0
N/E
N/E
N/E
N/E
0,6
0,8
N/E
N/E
N/E
N/E
7,4
N/E
N/E
N/E
N/E
Tabelle 1: Differentielle Expression von Genen ausgewählter Zytokine und
Chemokine nach der Stimulation mit Aspf1 bzw. Crf1
DCs wurden für 6h, 24h, oder 48h mit A. fumigatus-Antigenen stimuliert und
anschließend sind die Expressionslevels von Genen für TNF-α, IL-8, IL-23p19,
CXCL10, CCL20, IL-12p35, IL-10 und IL-1β durch quantitative reverse
Transkription-PCR zu ermitteln gewesen. Dabei sind die Expressionsdaten
gegen den Expressionslevel von halas (Housekeepinggen) durch Verrechnung
(ΔCPZielgen - ΔCPh-ALAS)
der Crossingpoint-Werte jeder Probe nach der 2
-Methode
normalisiert worden (121, 123). In der Tabelle sind die Mittelwerte der
Hochregulation angegeben, wobei für eine unveränderte Expression ein „-“
steht. Diese ist definiert als eine Änderung, die kleiner als 2-fach und größer
als 0,8-fach ist. N/E steht für „Nicht Ermittelt“.
Nachdem die iDCs mit Aspf1 kultiviert worden waren, stieg bereits nach 6h der Genexpressionslevel
von pro-inflammatorischen Genen an und weitere Anstiege konnten nach 24h und 48h verzeichnet
werden. Hingegen war nach der Stimulation mit LPS festzustellen, dass das Genexpressionsmaximum
bereits nach 6h erreicht wurde und spätere Zeitpunkte einen im Vergleich zum 6-stündigen Wert
verzeichneten Abfall der Expression zur Folge hatten. Im Gegensatz zur pro-inflammatorischen
Antwort der Zellen auf Genexpressionsebene zeigten die iDCs ein leicht verringertes
Expressionsmuster bei der anti-inflammatorischen Immunantwort nach Stimulation mit Aspf1 wie es
beispielsweise bei dem Gen il-10 verdeutlicht wird. Die Resultate von pro- und antiinflammatorischer Immunantwort der relativen qRT-PCR ließen sich bei exemplarischer Betrachtung
des Zytokins IL-10 und des Chemokins CCL20 durch die Untersuchung der Zellsuspensionsüberstände
mittels ELISA jedoch nur für IL-10 bestätigen (Abbildung 9).
53 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Ergebnisse
Abbildung 9: ELISA mit Überständen nach Stimulation mit Aspf1
Das Diagramm zeigt die Quantifizierung mittels ELISA von CCL20 und
IL-10 in Zellkulturüberständen nach 24-stündiger Kultivierung. Die
Ergebnisse der Aspf1- und LPS-behandelten Proben wurden vergleichen
mit den unstimulierten Kontrollen (*: p <= 0,1; **: p <= 0,05).
Die Expressionsuntersuchung von Genen für die Pattern-recognition receptors (PRRs) TLR2 und TLR4
zeigte, dass keine der beiden verwendeten Antigene eine signifikante Änderung der differentiellen
Genexpression nach der Stimulation ausgelöst haben, wohingegen für LPS bereits nachgewiesen
werden konnte, dass es den Expressionslevel des Gens für TLR4 reduziert (80).
4.1.3 Die Analyse der Interaktion mit dem A.fumigatus aspf1-Knockoutstamm
Eine Analyse des Zytokins IL-10 und des Chemokins CCL20, welche beide jeweils von iDCs
nach der Stimulation mit entweder LPS, dem lebenden Wildtypstamm oder dem korrespondierenden
aspf1-Kockoutstamm sezerniert wurden, enthüllte einen Anstieg des Zytokin- und Chemokinlevels
verglichen mit der unstimulierten Kontrolle. Interessanterweise war der Level an CCL20 (p=0,06) und
IL-10 (p=0,09) nach der Stimulation mit dem aspf1-Knockoutstamm signifikant höher als die Werte
des Wildtypstamms. Beim Vergleich des Ethanol-inaktivierten Wildtypstamms mit der Mutante war
kein signifikanter Unterschied feststellbar (Abbildung 10).
54 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Ergebnisse
Abbildung 10: ELISA mit Überständen nach Stimulation verschiedenen Pilzstämmen
Die Co-Kultivierung von iDCs mit Morphologien von A. fumigatus Wildtyp- und
Mutantenstämmen ist von einer ELISA-Analyse der Zellkulturüberstände gefolgt worden.
Dabei zeigte ein beidseitig, gepaarter studentischer T-Test von Proben mit aktiven WildtypKeimschläuchen (WT-GT) und aktiven Δaspf1-Mutanten-Keimschläuchen einen p-Wert
von 0,057 für CCL20 und einen von 0,089 für IL-10. Die mit Sternchen gekennzeichneten
p-Werte wurden gegen die unstimulierte Kontrolle getestet (**: p<=0,05; ***: p<=0,01).
4.1.4 Die Aufnahme und Präsentation von Aspf1 durch DCs
Wie im Kapitel 4.1.2 zuvor gezeigt wurde, läßt sich die differentielle Genexpression in iDCs
durch das Ribotoxin Aspf1 im Gegensatz zum Crf1 deutlich modifizieren. Deshalb liegt die Frage nahe,
ob die Aktivierung von DCs abhängig ist von der zytoplasmatischen Lokalisation des Antigens oder ob
die Aktivierung schon allein durch die Anlagerung dessen an der Zellmembran auftritt, welche eine
Oberflächenrezeptor-vermittelte Antwort implizieren würde. Dazu wurde die konvokale Mikroskopie
verwendet, bei der nachgewiesen werden konnte, dass Aspf1 in den ersten 15min bereits an der
Zelloberfläche detektiert werden konnte und dass die Signalintensität stark anstieg als die
Kultivierung mit dem Antigen bis 3h verlängert worden ist (Abbildung 11). Der Vergleich der
Ergebnisse von Proben mit bzw. ohne Anwendung einer Permeabilisierung ergab, dass kein
Unterschied festzustellen war. Dies ließ darauf hindeuten, dass der größte Anteil an Aspf1 an der
Zelloberfläche gebunden blieb.
55 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Ergebnisse
Abbildung 11: Fluoreszenzmikroskopie von stimulierten DCs mittels eines Konfokalmikroskops
In den einzelnen Bildern lässt sich bei der Fluoreszenzmikroskopie erkennen, dass vom Zeitpunkt 15min
bis 3h ein Anstieg an Fluoreszenz durch die Assoziation von HA-getaggtem Aspf1 an die Zellen zu
verzeichnen ist. Die Zellen sind deutlich als noch vitale iDCs zu identifizieren.
4.1.5 Die Untersuchung der Aktivierung und Reifung von iDCs nach der
Behandlung mit Mitogillin
Nach einer Exposition der dendritischen Zellen zum Aspf1- bzw. Crf1-Antigen für 48h wurde
mittels Durchflusszytometrie die Proteinexpression der Zelloberflächenmarker CD1a, CD40, CD80,
CD83, CD86 und HLA Klasse II untersucht. Dabei stellen CD80 und CD86 die klassischen Marker der
Aktivierung von iDCs und CD83 den prädominierenden Marker für die Reifung der Zellen dar. Die
Analyse zeigte, dass die Oberflächenmarker unverändert beim Vergleich zur unstimulierten Kontrolle
geblieben sind, so dass dies suggerierte, dass beide Proteine nicht in der Lage waren die Reifung von
iDCs zu triggern (Abbildung 12).
56 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Ergebnisse
Abbildung 12: Die Untersuchung der Oberflächenmarkerexpression bei iDCs nach 48stündiger Behandlung mit Aspf1 bzw. Crf1
Die Expression (in Prozent) von ausgewählten DC-Markern (CD1a, CD40, CD80, CD83,
CD86 und HLA Klasse II) nach der Stimulation mit Aspf1, Crf1 und LPS wurde erfasst
durch eine durchflusszytometriesche Analyse und der anschließenden Bildung der Differenz
an Marker-positiven Zellen von stimulierten zu unstimulierten DCs, so dass nur die
Unterschiede zur Kontrolle im Diagramm angezeigt werden.
4.1.6 Die Stimulationskapzität gegenüber CD8+ T-Zellen durch
Antigenpräsentation von Aspf1-behandelten DCs (mLR)
Die Fähigkeit von DCs, zytotoxische T-Zellen zur Proliferation anzuregen, wurde in einer
mixed Lymphocyte Reaction (mLR) untersucht, wobei DCs, welche zuvor für 48h mit Aspf1 behandelt
worden sind, verwendet wurden. Es konnte demonstriert werden, dass Aspf1-beladene DCs und
unstimulierte DCs die Proliferation von CD8+ T-Zellen in ähnlicher Weise stimuliert haben. Dabei
dienten als Positivkontrolle für die Präsentation stets Zellen, die mit dem CMV-Antigen pp65
behandelt worden sind, und im Gegensatz zu den beiden Proben von unstimulierten und Aspf1behandelten DCs war hierbei eine signifikante Proliferationsrate der T-Zellen vorzufinden (p=0,099)
(Abbildung 13).
57 | S e i t e
Modulation der Immunantwort durch Mitogillin (Aspf1)
Ergebnisse
Abbildung 13: Antigenpräsentation induziert T-Zellproliferation (mLR)
Das Diagramm stellt den Prozentsatz an proliferierenden zytotoxischen T-Zellen dar,
welche entweder durch die Präsentation eines Antigens wie z.B. bei der Positivkontrolle mit
pp65-behandelten DCs oder durch einen PHA-induzierten Stimulus ausgelöst wird. Der
studentische T-Test wurde durchgeführt, indem die Ergebnisse von stimulierten Proben mit
denen der entsprechenden Negativkontrollen gepaart wurden (*: p<=0,1; ***: p<=0,01).
4.1.7 Aspf1 induziert Apoptose bei iDCs
Damit die Apoptose-induzierende Aktivität von Aspf1 quantifiziert werden konnte, wurde das
Antigen in Zellkultur den DCs gegenüber exponiert und anschließend die frühe und späte
Apoptoserate durch Messung von Annexin V- und Propidiumiodid-positiven Zellen festgestellt.
Parallel dazu diente eine Behandlung von iDCs einerseits mit α-Sarcin und andererseits mit
Camptothecin als Positivkontrolle, wobei α-Sarcin ein dem Aspf1 verwandtes Ribotoxin aus dem Pilz
Aspergillus giganteus ist und in ähnlicher Weise wie das Aspf1 wirkt. Camptothecin wiederum
inhibiert die Topoisomerase I und löst damit auf einem anderen, nicht Ribosomen-gekoppelten
Signalweg in Zellen Apoptose aus. Dabei konnte festgestellt werden, dass Aspf1 (9,3%; p=0,259), αSarcin (11,3%; p=0,099) und Camptothecin (13,93%; p=0,034) in der Lage waren, nach 24-stündiger
Expositionszeit im Vergleich zu unbehandelten Zellen ein erhöhtes Level an Apoptose in den
behandelten Zellen zu induzieren (Abbildung 14).
58 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
Ergebnisse
Abbildung 14: Apoptoserate bei iDCs nach Stimulation mit Aspf1
Die erhöhte Apoptoserate bei Aspf1-behandelten Zellen war vergleichbar mit Zellen,
die mit α-Sarcin inkubiert worden waren. Dabei handelt es sich beim α-Sarcin ebenfalls
um eine Ribonuklease, die die sarcin/ricin-loop (SRL) der eukaryotischen 28S rRNA
spaltet. Der Prozentsatz an apoptotischen DCs wurde mittels Durchflusszytometrie nach
einer 24-stündigen Kultivierung von DCs mit Aspf1, α-Sarcin bzw. Camptothecin
festgestellt (*: p<=0,1; **: p<=0,05).
4.2 Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
4.2.1 Untersuchung der zytotoxischen Effekte von Cat1 auf moDCs
Die Quantifizierung des durch extrazelluläre Auslagerung auf der Zelloberfläche
vorzufindenen Phosphatidylserins und der exponierten DNA toter Zellen durch Annexin V-FITC bzw.
Propidiumiodid zeigte, dass keine signifikanten Unterschiede in der Apoptoserate zwischen
unstimulierten (26% tote Zellen nach 48h, ±SEM von 3%) und Cat1- (37% tote Zellen nach 48h, ±SEM
von 13%, p=0,40) bzw. LPS-behandelten Zellen (28% tote Zellen nach 48h, ±SEM von 9%, p=0,72)
vorlagen.
4.2.2 Expression von Aktivierungs- und Reifungsmarker auf DCs nach der
Stimulation mit rekombinanten Proteinen
Eine Inkubation von moDCs mit rekombinatem Cat1 (10µg/ml) über 48h führte im Vergleich
zur unstimulierten Kontrolle zu einer Hochregulation der spezifischen Aktivierungs- und
Reifungsmarker auf der Zelloberfläche (CD80: +61%±6%, p=0,01; CD83: +57%±15%, p=0,06; CD86:
+82%±6%, p=0,01) (Abbildung 15 a). Darüber hinaus induzierte die Stimulation mit Cat1 (10µg/ml)
59 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
Ergebnisse
nach 24h bei myeloiden DCs (CD11c+CD1c+) verglichen mit der Negativkontrolle eine signifikante
Hochregulation des Reifungsmarkers CD83 (+36%±5%) (Abbildung 15 b, c).
Abbildung 15: Expression von Aktivierungs- und Reifungsmarker nach Cat1Stimulation
a) und b) Die Unterschiede zwischen den Prozentsätzen der für Oberflächenmarker
positiven Zellen von stimulierten und unstimulierten DCs sind in den Diagrammen
dargestellt. c) Eine exemplarische Darstellung der FACS-Dotplots von CD11c-APC- und
CD83-PE-gefärbten mDCs zeigt den Anstieg der Menge an CD83 + mDCs nach der
Stimulation mit Cat1.
60 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
Ergebnisse
Im Gegensatz dazu konnte durch die Behandlung mit Pep1 (CD80: +31%±7%, p=0,05; CD83:
+1%±0,90%, p=0,41; CD86: +8%±1%, p=0,02) nur eine schwache Aktivierung induziert werden. Die
Stimulation mit Gel1, Mep1 und Sod1 führte hingegen zu keiner Aktivierung bzw. Reifung der Zellen.
4.2.3 Die Immunantwort von moDCs auf die Stimulation mit Cat1 wird durch
die NFκB-Aktivierung vermittelt
Die Exposition von Cat1 gegenüber moDCs verursachte eine zeitabhängige NFκB-Aktivierung
und -Translokalisation aus dem Zytosol in den Nukleus (30min: +1,13-fache Änderung; 2h: +2,04fache Änderung) (Abbildung 16).
Abbildung 16: NFκB Aktivierung nach Stimulation mit Cat1
Die Detektion des an der NFκB-Konsensussequenz bindenden Proteins p65 in der nukleären
Fraktion von moDCs nach einer Stimulation mit Cat1 bzw. LPS für 30min bzw. 2h zeigt
einen zeitlich abhängigen Anstieg der Menge an intranukleärem p65. Der „fold increase“
wird definiert als ein Ratio der optischen Dichte jeder Probe zu ihrer korrespondierenden
unstimulierten Kontrolle. Ein studentischer T-Test von stimulierten und unstimulierten
Proben ergab die angegebenen p-Werte (*: p<=0,1; **: p<=0,05).
In dem gleichen experimentellen Ansatz, jedoch nach einer 24-stündigen Kultivierung, wurde ein
Anstieg der Expression von Genen beobachtet, welche pro-inflammatorische (IL-12p40 [+80-fache
Änderung ± 28-fach], CCL20 [+29-fache Änderung ± 5-fach]) und anti-inflammatorische (IL-10 [+3fache Änderung ± 2-fach]) Zytokine bzw. Chemokin codieren. Dieser Befund wurde mittels weiterer
ELISA-Qualifizierung von ausgewählten Proteinen in den Zellkulturüberständen, welche nach 24stündiger Kultivierung isoliert worden sind, bestätigt. Dabei konnte festgestellt werden, dass
beachtliche Mengen an TNF-α (+62-fache Änderung ± 15-fach), CCL20 (+71-fache Änderung ± 17fach) und CXCL10 (+138-fache Änderung ± 26-fach) nach der Stimulation von moDCs mit Cat1
produziert wurden. Als Positivkontrolle diente erneut die Stimulation mit LPS, bei der ebenfalls ein
61 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
Ergebnisse
Anstieg des Levels an TNF-α (+18-fache Änderung ± 8-fach), CCL20 (+39-fache Änderung ± 19-fach)
und CXCL10 (+72-fache Änderung ± 14-fach) ermittelt wurde (Abbildung 17 a, b). Im Gegensatz dazu
zeigte die Behandlung mit Gel1, Mep1, Pep1 und Sod1 entweder keine veränderte Immunantwort
oder nur ein sehr geringfügig erhöhtes Level an exemplarisch untersuchtem CXCL10 und CCL20
(Tabelle 2).
Abbildung 17: ELSIA nach Stimulation von moDCs bzw. mDCs mit Cat1
24h nach der Stimulation der DCs mit Cat1 bzw. LPS wurden ELISA-Analysen mit
Überständen der Zellkultur durchgeführt, bei der die Mengen an segregierten Zytokinen und
Chemokinen determiniert werden konnten. Dabei stellt a) im Diagramm die TNF-α-, IL-10und CCL20-Konzentrationen und b) die Konzentration für CXCL10 nach der Stimulation
von moDCs dar. c) Die Mengen an CCL20, IL-10 und IL-1β in den Überständen der mDCs
wurden ermittelt. d) Der Level an IL-6 und TNF-α bei Cat1-stimulierten myeloiden DCs
zeigt die hohe Segregation dieser Zytokine nach 24-stündiger Stimulationszeit.
62 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
CXCL10 (ng/ml)
Antigene
Ergebnisse
CCL20 (ng/ml)
6h
24h
48h
6h
24h
48h
Gel1 (10µg/ml)
-
1,046 ±
0,339
1,514 ±
1,324
-
-
-
Mep1 (10µg/ml)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Pep1 (10µg/ml)
Sod1 (10µg/ml)
LPS (10µg/ml)
0,714 ± 1,522 ±
0,020
0,444
0,059 ± 0,544 ±
N/E
0,027
0,200
11,723 ± 37,940 ± 34,138 ±
1,442
4,558
4,592
-
0,248 ±
0,063
0,021 ±
0,003
1,263 ±
0,036
N/E
1,329 ±
0,216
Tabelle 2: ELISA nach der Stimulation von moDCs mit Gel1, Mep1, Pep1 und Sod1
Die ELISA-Daten für die Chemokine CCL20 und CXCL10 zeigen den geringen Effekt der
rekombinanten Antigene Gel1, Mep1, Pep1 und Sod1 nach 24-stündiger Stimulation von
moDCs.
Ein gleiches pro-inflamatorisches Segregationsmuster für TNF-α (stark erhöht), CCL20 (stark erhöht)
und IL-10 (ungefähr gleichbleibend) konnte auch für stimulierte myeloiden dendritischen Zellen
(mDCs) gezeigt werden. Darüber hinaus löste die Behandlung mit Cat1 bei mDCs die Ausschüttung
von IL-6 und IL-1β aus (Abbildung 17 c, d). Jedoch war keine Segregation von CXCL10 sowohl mit Cat1
als auch mit LPS bei mDCs zu beobachten. Nebenbei konnte auch gezeigt werden, dass beide DCTypen (moDCs und mDCs) keine Expression von IFN-γ nach der Stimulation mit Cat1 oder LPS
aufgewiesen hatten.
4.2.4 Die Aufnahme von mycelialer Katalase 1 (Cat1) durch dendritische Zellen
Bei der Western blot Analyse mit Proteinextrakten aus DCs (moDCs bzw. mDCs), welche
zuvor mit Cat1 über eine Dauer von 15min bis 3h inkubiert worden sind, wurde die
Nitrozellulosemembran mit dem monoklonalen Antikörper I6-4, welcher gegen Epitope der
mycelialen Katalase 1 gerichtet ist, behandelt. Dies führte zu einer Detektion des 90kDa Proteins,
welches mit der vollständigen Länge der immundominaten Untereinheit des Cat1-Proteins korrelierte
(124). Die Aufnahme von Cat1 durch moDCs und mDCs über das betrachtete Zeitintervall erreichte
demzufolge ein Maximum bei 30min. Die quantifizierende Messung mittels einer Standardkurve,
welche durch das Auftragen von verschieden konzentriertem rekombinanten Cat1 auf dem Gel, der
Detektion der Proteinbanden im Western blot und die Auswertung mittels ImageJ zustande kam,
zeigte, dass 2×105 moDCs eine mittlere Menge von 48,2ng an Cat1 (±SEM von 3,8ng; p=0,03)
63 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
Ergebnisse
innerhalb von 30min internalisiert haben (Abbildung 18 a, b). Nach 3h konnte das internalisierte Cat1
nur noch schwer detektiert werden, so dass damit suggeriert wurde, dass das internalisierte Cat1
nach seiner Aufnahme in den endosomalen Kompartimenten der DCs prozessiert worden ist.
Abbildung 18: Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation von Cat1 durch moDCs bzw. mDCs
Die konzentrationsabhängige Detektion von Cat1 (in einer Verdünnungsreihe zu sehen bei a), oben,
Belichtungszeit: 1sec) zeigt die Aufnahme von Cat1 durch dendritische Zellen (monozyten-abgeleitete
und myeloide) über 30min und die Verarbeitung des Antigens nach 3h (a), mittig, Belichtungszeit:
20sec; a), unten, Belichtungszeit: 1min). b) Die absolute Menge an aufgenommenen Cat1 durch 2×105
moDCs gipfelte nach 30min und lag bei 48,2pg (Belichtungszeit: 40sec; Standardkurve unter
Verwendung der Konzentrationen 2µg, 0,2µg und 0,02µg, R2=0,9987). c) Nach einer Inkubationszeit
von 48h mit dem rekombinanten Cat1 bzw. dem Kontrollprotein pp65 waren DCs in der Lage CD8 + TZellen zur Proliferation anzuregen. Die durch Cat1-Epitoppräsentation ausgelöste Antwort war nach 9d
um 9% höher als die durch Anwesenheit von unstimulierten DCs induzierte Hintergrundproliferation
(*: p<=0,1; **: p<=0,05).
64 | S e i t e
Immunantwort gegenüber Gel1, Pep1, Mep1, Sod1 und Cat1
Ergebnisse
4.2.5 Die ex vivo T-Zell-Expansion (mLR)
Durch die Co-Kultivierung von moDCs mit CFSE-markierten autologen CD8+ zytotoxischen TZellen über 9d wurde eine MHC II Komplex-vermittelte Epitoppräsentation von A. fumigatusAntigenen durchgeführt. Dabei ist festzustellen gewesen, dass beim Vergleich zur Negativkontrolle
mit unstimulierten DCs eine um 9% erhöhte signifikante Proliferationsrate (p=0,10) vorzufinden war.
Dies demonstrierte, dass Cat1-Epitope von dendritischen Zellen präsentiert worden sind und diese zu
einer Aktivierung von CD8+CD69- T-Zellen geführt hat (Abbildung 18 c).
4.2.6 Die Induktion der angeborenen Immunantwort von moDCs durch
Katalase-Kockoutstämme von Aspergillus fumigatus
Nachdem nun das rekombinante Cat1 eine starke Antwort in moDCs induziert hat, wurde
anschließend die Reaktion auf Mutanten untersucht, denen entweder die konidiale Katalase CatA
oder die beiden mycelialen Katalasen Cat1 und Cat2 fehlten. Nach Stimulation der moDCs mit den
Mutantenstämmen
(ΔcatA-Stamm
bzw.
Δcat1Δcat2-Stamm)
oder
dem
komplementären
Wildtypstamm G10 wurde die Produktion von ausgewählten Chemokinen im ELISA quantifiziert.
Dabei konnte gezeigt werden, dass beide Morphologien – Konidien und Keimschläuche – aller drei A.
fumigatus-Stämme die CCL20- (p<=0,05) und nur Keimschläuche der dieser Stämme die CXCL10Produktion (p<=0,01) induziert haben. Zusätzlich führte die Co-Kultivierung von moDCs mit
Keimschläuchen der Δcat1Δcat2-Mutante zu einer höheren CCL20-Segregation (+22.2%±6.3%) im
Vergleich zu moDCs, welche mit Wildtyp-Keimschläuchen konfrontiert worden sind (p=0,08)
(Abbildung 19). Unter den verschiedenen Bedingungen konnte kein Hinweis dafür gefunden werden,
dass eine gesteigerte IFN-γ-Segregation vorlag.
65 | S e i t e
Aggregometie und Hämostase
Ergebnisse
Abbildung 19: ELSIA mit Zellkulturüberständen nach Konfrontation von moDCs mit
Aspergillus fumigatus-Morphologien
Dendritische Zellen, die mit Keimschläuche des Wildtypstamms G10 bzw. der zwei A.
fumigatus-Deletionsmutanten (ΔcatA; Δcat1Δcat2) (MOI = 1) konfrontiert worden sind,
zeigten eine signifikante Segregation der Chemokine CCL20 und CXCL10. Nur im Vergleich
des CCL20-Levels von Δcat1Δcat2- und G10-Keimschläuchen stimulierter Zellen konnte ein
signifikanter Unterschied festgestellt werden (p-Wert von 0,08).
4.3 Aggregometie und Hämostase
Damit der Effekt von Pilzmorphologien auf die Hämostase untersucht werden konnte, mussten
zunächst sowohl aktive als auch Ethanol-inaktivierte Pilzmorphologien in der Aggregometrie mit
plättchenreichem Plasma verwendet werden. Es galt den Einfluss auf plasmaspezifische und
plättchenspezifische Faktoren gleichzeitig zu betrachten, bevor eine genaue Untersuchung auf
Plasma- oder Plättchenebene erfolgen konnte. Dabei stellte sich heraus, dass ruhende oder
geschwollene Konidien, Keimschläuche und Hyphen der Stämme ATCC und D141 zwar nicht die
Aggregation der Thrombozyten auslösen oder gar eine Bindung derer an ihre Zellwand bewirken
konnten, jedoch aber die durch Collagen induzierte Plättchenaktivierung gehemmt wurde. Die
Untersuchung eines weiteren Agonisten, dem ADP, zeigte, dass dieser Effekt nicht auf eine generelle
66 | S e i t e
Aggregometie und Hämostase
Ergebnisse
Verringerung der Fähigkeit zur Aggregation zurückzuführen war, sondern sich lediglich auf den
Collagen-induzierten Signalweg der Blutplättchen beschrängte (Abbildung 20).
Abbildung 20: Auswertung der Aggregometriedaten mittels des Perl-Programms
Die ermittelten Aggregationsänderungen (in Prozent) wurden durch den Bezug zur
Negativkontrolle (Behandlung mit Nährmedium) erstellt. Dabei zeigte sich ausschließlich
eine Beeinträchtigung der Aggregation, welche durch Collagen induziert wurde. Dieses
Ergebnis war beim D141-Stamm stärker ausgeprägt als beim ATCC-Stamm. Der D141Stamm ist ein klinisches Isolat und zeigte in diesen Versuchen bereits mit ruhenden und
geschwollenen Konidien einen signifikanten Effekt (*: p<=0,1; **: p<=0,05).
Nachfolgene Analysen der Gerinnungsparameter mit den Plasmaüberständen von behandeltem PRP
zeigten, dass die Inkubation der verschiedenen Morphologien beider Aspergillus fumigatus-Stämme
im plättchenreichem Plasma sich nicht auf die dabei determinierten Faktoren ausgewirkt hatte
(Abbildung 21). Dies ließ den Schluss zu, dass es sich somit um eine Thrombozyten-gekoppelten
Effekt handeln musste, welcher zu einer Abnahme der Fähigkeit von Plättchen zur Aggregation
führte.
67 | S e i t e
Aggregometie und Hämostase
Ergebnisse
Abbildung 21: Ermittlung von Gerinnungsparametern nach der Behandlung mit
Aspergillus fumigatus-Morphologien
Sowohl die Inkubation des PRPs mit Morphologien des ATCC- als auch mit jeden des
D141-Stamms zeigte keine Beeinträchtigung der determinierten Gerinnungsparameter.
68 | S e i t e
Die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1)
Diskussion
5 Diskussion
5.1 Die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1)
Dendritische Zellen stellen eine der wesentlichen Komponten in der angeborenen
Immunabwehr gegen Pilze dar und übernehmen dabei einerseits Wächteraufgabe, welche die
Mobilisierung des Immunsystems
mittels Zytokin- und Chemokinsegregation beinhaltet, und
andererseits sind es Zellen, die eine Brücke zum adaptiven Immunsystem schlagen. Sie sind dazu
noch strategisch an den für Pathogene geeigneten Eingangsbereiche des Organismus lokalisiert, wie
beispielsweise dem Respirationstrakt (125). DCs nehmen Antigene in der Peripherie auf, wandern in
sekundäres lympoides Gewebe ein, aktivieren T-Zellen, reifen und segregieren Zytokine und
Chemokine (126). In den Lymphen präsentieren DCs antigen-spezifische, co-stimulatorische und
Th1/Th2-polarisierende Signale an T-Helferzellen (127). Die Polarisation von DCs in Richtung einer
pro- oder anti-inflammatorischen Immunantwort ist abhängig von verschiedenen Faktoren, welche
DC-Untergruppen, Pathogen-erkennende Rezeptoren (PRRs, wie z.B. die TLRs und das dectin 1) und
die Morphologie des Schimmelpilzes umfassen (128, 129).
DCs wurden zuvor als Wirkungsverstärker und Antigenträger in diversen Impfstudien gegen maligne
Erkrankungen und infektiöse Agentien verwendet, so wie beispielsweise auch gegen den humanen
Cytomegalovirus und den humanen Immunschwäche-induzierenden Virus (130-132). Lediglich
wenige Daten aus dem Mausmodel liegen jedoch vor für die Verwendung von DCs zur Impfung gegen
A. fumigatus (133). Svirshchevskaya et al. zeigte, dass die intravenöse Injektion von Aspf1-Peptiden
beachtlich die T-Zellantwort in Mäusen inhibierte, wobei diese durch anschließender Gabe eines
Extraks des Pilzes Aspergillus fumigatus induziert wurde (134). Zusätzlich konnte von Bozza et al.
gezeigt werden, dass pilzspezifische RNA als ein potenter Aktivator auf murine DCs wirkt (135).
Allerdings existieren noch keine Daten, welche die Interaktion von humanen DCs mit rekombinanten
Antigenstrukturen von A. fumigatus charakterisieren. Innerhalb der letzten 15 Jahre wurden mehrere
Aspergillus fumigatus-Antigene von Latgé und seinen Kollegen untersucht (136) und diese Studien
zeigten, dass die Produktion von rekombinanten Antigenen von A. fumigatus in Pichia pastoris
extrem effizient ist. Dabei können große Mengen der rekombinanten Proteine (5 bis 50µg/ml)
extrazellulär produziert und daraufhin leicht über eine Ni-Säule aufgereinigt werden. Das Taggen der
Proteine, welches die für eine Aufreinigung notwendige Markierung des Proteins am C- oder Nterminalen Ende über eine entsprechende Säule bezeichnet, mit 6×His interferierte nicht mit den
Antigen-Eigenschaften der rekombinanten Proteine. Ein weiterer Vorteil dieser Expressionsmethode
war auch, dass im Gegensatz zu Proteinen, welche über das üblicherweise verwendete E. coliExpressionssystem hergestellt wurden, diese Antigene vollständig endotoxinfrei gewesen sind.
69 | S e i t e
Die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1)
Diskussion
Unter den aufgereinigten Antigenen befand sich auch die Ribonuklease Mitogillin, welche auch als
Aspf1 gemäß der Bezeichnung für allergene Proteine aus Aspergillus fumigatus bezeichnet worden
ist. Dieses Protein ist ein Mitglied der Familie von konservierten RNasen, die eine einzige
Phosphodiesterbindung an der 28S rRNA von eukaryotischen Ribosomen spaltet (111). Die natürliche
Funktion von Aspf1 ist noch unklar, jedoch gibt es bereits einen Hinweis durch die Arbeit von Lamy et
al., bei der das Protein in Nierenzellen von Mäusen nach einer Infektion mit A. fumigatus entdeckt
worden ist. Dies zeigte, dass Aspf1 während einer Infektion produziert wird. Genauere Untersuchung
verdeutlichten, dass es vor allem in der nekrotischen Umgebung um die Pilzkolonien herum
lokalisiert war (137). Darüber hinaus demonstierte Arruda et al., dass 85% der Patienten mit IgEAntikörper gegen A. fumigatus auch IgE-Antikörper gegen Aspf1 aufwiesen, welches sie daraufhin als
das Hauptallergen des Pilzes definierten (109).
Die Ergebnisse in dieser Arbeit zeigen, dass Aspf1 fähig ist die Apoptose in humanen DCs in vitro zu
induzieren, was zuvor bereits für α-Sarcin, einem weiteren Pilz-Ribotoxin, beschrieben wurde (138).
Es
könnte
angenommen
werden,
dass
die
Induktion
der
Apoptose
ein
natürlicher
Ausweichmechanismus von A. fumigatus ist, da die Apoptose der DCs die Erzeugung einer
angemessenen adaptiven Immunantwort während der Infektion u.a. durch eine Beeinträchtigung der
Fähigkeit T-Lymphozyten zu stimulieren einschränken würde. Parallel dazu demonstrierte Kim et al.,
dass das Phosphatidylserin aus apoptotischen Zellen zu einer Regulation der Aktivität von DCs führt.
Downstream-Signalwege in DCs, die nach dem Kontakt mit apoptotischen Zellen bzw. mit dem
Phospatidylserin dieser Zellen aktiviert werden, resultieren in der Inhibition von il-12p35Transkription und daraus folgend von IL-12p70-Synthese (139). Weitere Studien zeigten, dass ein
anderes Molekül, das von A. fumigatus segregiert wird und als Gliotoxin bezeichnet wird, die
Antigen-präsentierende Zellfunktion inhibiert und bevorzugt den Tod von Monozyten einleitet, so
dass ein beachtlicher Abfall im Monozyten/Lymphozyten-Verhältnis zu verzeichnen ist (140).
Es wurde zuvor gezeigt, dass Ribotoxine in der Lage sind die Lipidmembranen zu durchqueren ohne
dass ein Rezeptorprotein beteiligt ist. Dabei handelt es sich um extrem postiv geladene Proteine,
welche sich zunächst an die negativ geladenen Phospholipide der Membran anlagern und
anschließend mittels Konformationsänderung in die Membran eindringen. Es spielen vorwiegend
elektrostatische Kräfte, das Verhältnis aus Phosphatidylcholin zu Phosphatidylglycerol in der
Membran
(min.
1:10),
die
Schmelztemperatur
der
Phospholipide
und
Van-der-Waals-
Wechselwirkungen eine Rolle. Einmal in der Zelle angekommen, haben Ribotoxine eine hohe Affinität
zu der negativ geladenen RNA und speziell zu jener, die sich an der Sarcin/Ricin-Loop von 28S rRNAs
befindet (141-148). Die Activesite des Aspf1 befindet sich an den Aminosäuren Y(74), H(76), E(122),
R(147), H(163), wobei eine Übereinstimmung von 92% mit dem α-Sarcin vorliegt und dessen
70 | S e i t e
Die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1)
Diskussion
Activesite um eine Aminosäue verschoben an den Aminosäuren Y(75), H(77), E(123), R(148), H(164)
vorzufinden ist.
Die zytotoxische Wirkung wird durch die Proteininhibition ausgelöst, welche auf die Spaltung der 28S
rRNA folgt, jedoch geschiet dies nur wenn die Ribotoxine in der Lage sind die Membran der Zellen zu
überwinden. Dies kann beispielsweise auch ermöglicht werden, wenn eine Veränderung der
Membranpermeabilität, verursacht durch die Infektion der Zellen mit einem Virus oder durch die
Transformation der Zellen, zu Grunde liegt (147). Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit zeigen,
dass Aspf1 auf der Zelloberfläche von moDCs nach 15min detektiert wurde und dass das Signal
während der Inkubation über 3h bedeutend zunahm. Lediglich ein Bruchteil der Proteinmenge
konnte über die Zellmembran in das Zytosol eindringen und daraufhin die ribosomale Aktivität
inhibieren. Darüber hinaus deuten die Untersuchungen an, dass Aspf1 eine pro-inflammatorische
Zytokinantwort ausgelöst hat. Die Expressionslevel für zwei ausgewählte Chemokine, CXCL10 und
CCL20, waren beachtlich angestiegen im Vergleich zur negativen Kontrolle. Für CXCL10 konnte
gezeigt werden, dass es chemoattraktiv auf Monozyten und T-Zellen wirkt und die Adhäsion von TZellen an Endothelzellen unterstützt. CCL20 ist für Lymphozyten stark chemotaktisch und lockt
darüber hinaus schwach Neutrophile an. Interessanterweise resultierte die Stimulation mit LPS und
auch A. fumigatus-Keimschläuchen schon bereits nach 6h in einem maximalen Level der
Genexpression (80) sowie der Zytokinabgabe, wohingegen die Aspf1-Stimulation erst nach 24h und
48h zu einem Maximum der Genexpression geführt hat.
TLR-Liganden, wie das LPS, stimulieren nicht nur die Transkription von Zytokinen und costimulatorischen Molekülen, sondern lösen auch Gruppe von Antworten aus, die das
Membranvakuolensystem, das Zytoskelett und die Maschinerie der Proteintranslation und
Proteindegradation betreffen (149). Die Freisetzung von Zytokinen durch iDCs in Versuchen mit
verschiedenen Pilzmorphologien, welche auch Strukturen für die Stimulation von TLRs aufgewiesen
haben, war geringer mit Wildtyp-Keimschläuchen als bei Zellen, die mit Δaspf1-Keimschläuche
stimuliert wurden. Diese Beobachtung könnte zeigen, dass Aspf1, welches bereits vom Stadium der
Keimung des Pilzes exprimiert wird, in das Zellkulturmedium segregiert wurde und nach dem
Eindringen in die DCs möglichweise die Freisetzung der untersuchten Zytokinen und Chemokinen
durch Inhibition ihrer Synthese beeinflusst hat. Die Einleitung der pro-inflammatorischen
Immunantwort durch Aspf1 könnte potentiell durch den Transkriptionsfaktor NFκB reguliert sein.
Dieses DNA-bindende Protein findet sich in seiner inaktiven Form gebunden am inhibierenden IκBProtein im Zytoplasma vor. Die Behandlung der DCs mit LPS bzw. Aspf1 führte zu der Freisetzung der
NFκB-Dimere, welche anschließend in den Nukleus tranloziert wurden, wo sie die immunrelevanten
Zielgene aktivierten.
71 | S e i t e
Die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1)
Diskussion
Eine genaue Regulation der transkriptionellen Antworten auf viele verschiedene Stimuli ist
entscheidend für eine angemessene Funktion des Säugetierimmunsystems (150). Die Aktivierung von
NFκB als ein Resultat auf die Reduktion des Levels an Proteinsynthese verursacht durch die von Aspf1
oder von anderen verwandten Ribotoxinen bewirkte Inhibition der Ribosome wird über SAPK/JNK1
(stressaktivierte Proteinkinasen bzw. cJun NH2-terminale Kinasen) vermittelt (138). Die Beschädigung
der 28S rRNA an der Cleavagesite des Ribotoxins verursacht die Aktivierung der SAPK/JNK1 (151)
(Abbildung 21). Diese Mitglieder der Familie von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen phosphorylieren
Substrate wie das cAMP response element binding protein (CREB) und NFκB (152).
Durch die mLR konnte demonstriert werden, dass im Gegensatz zum CMV-Antigen pp65 das Aspf1
nicht von iDCs verarbeitet und präsentiert wurde. Die Proliferaton der T-Zellen unterschied sich nicht
signifikant von dem Level an Proliferation, das durch unbeladene iDCs erreicht wurde. Es konnte
sogar eher ein tendentiell geringere Proliferation beobachtet werden, welche jedoch nicht signifikant
war, aber durch eine verringerte Zahl an lebenden DCs während der Co-Kultivierung mit T-Zellen
verursacht sein könnte. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet nach der Stimulation von iDCs mit
α-Sarcin.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Induktion der Zytokinexpression und Apoptose der
humanen iDCs durch Aspf1 ein neuer immunomodulatorischer Mechanismus darstellt, der jedoch zu
einer funktionellen Beeinträchtigung und der Zerstörung von dendritischen Zellen führt und
gleichzeitig eine Möglichkeit von A. fumigatus sein könnte, um sich der Immunantwort zu entziehen.
Abbildung 22: Mitogillin (Aspf1) als aktives Ribotoxin in DCs
Der Mechanismus von Invasion des Ribotoxins Aspf1 ist – neben weiteren
Verwandten dieser Ribonuklease wie z.B. α-Sarcin – bereits bekannt.
Ribotoxine besitzen eine hohe Zellspezifität und wurden bereits für
Krebstherapien als mögliche Chemotoxine untersucht. Es war jedoch unklar, ob
Mitogillin fähig ist die Membran von DCs zu durchqueren und dadurch toxisch
zu wirken. Die Bindung der Ribonuklease an die 28S rRNA aktiviert den
SAPK/JNK1-Signalweg und führt so zur NFκB-Aktivierung.
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Die myceliale Katalase 1 (Cat1) moduliert die Immunantwort von
humanen dendritischen Zellen
Diskussion
5.2 Die myceliale Katalase 1 (Cat1) moduliert die Immunantwort von
humanen dendritischen Zellen
Allogene Stammzelltransplantationen sind assoziiert mit einer langjährigen und ernsthaften
Immundefizienz, welche zu einem hohen Risiko für opportunistische Infektionen führt. Trotz der
breiten Anwendung von neuen antimykotischen Agentien, wie auch neue Generationen von Azolen
und Candinen, hat die Inzidenz für IA in den vergangenen Jahren eine stetig steigende
Mortalitätsrate hervorgebracht. Folglich sind effektivere Präventionen und Behandlungsoptionen im
höchsten Maße erforderlich, um A. fumigatus-Infektionen bei Hochrisikopatienten unter Kontrolle zu
bringen. Eine sehr vielversprechende Strategie ist die ex vivo-Expansion von spezifischen allogenen
zytotoxischen T-Zellen sowie T-Helferzellen durch die Stimulation mit Antigen-behandelten
dendritischen Zellen (153-155). Diese Methode ist bereits erfolgreich für die Behandlung von
Cytomegalovirus-,
Adenovirus-
und
Epstein-Barr-Virus-Infektionen
bei
immungeschwächten
Patienten entwickelt worden (97, 98, 156, 157).
Eine erste Annäherung für die Anwendung eines solchen immunotherapeutischen Ansatzes bei
Aspergillus-Infektionen wurde breits von Perruccio et al. unternommen. Dabei wurde in deren Studie
ein adaptiver Transfer von Aspergillus-spezifischen CD4+ T-Zellklone (T-Helferzellen) durchgeführt,
die durch die Stimulation mit hitze-inaktivierten Konidien generiert worden waren. Dies führte zu
einer Reduktion der durch invasiver Aspergillose verursachten Mortalität in den Empfängern (158).
Weitere Studien mit Aspergillus-Antigenen und weiteren humanen Immunzellpopulationen (wie
definierten DC-Subpopulationen, NK-Zellen, T-Lymphozyten) sind dringend notwendig, um deren
potentiellen Vorteil für zukünftige immunotherapeutische Methoden festzustellen. Ein Beispiel für
solch eine Anwendung könnte der Einsatz von Antigen-behandelten DCs sein, welche entweder zur
Steigerung der Immunität im Spender vor der Stammzellentnahme oder alternativ dazu für einen
prophylaktischen oder therapeutischen Ansatz gegen IA im Patienten nach der HSCT verwendet wird.
Um die Charakterisierung der verschiedenen A. fumigatus-Antigene bezüglich ihre Fähigkeit die
Aktivierung
und
Reifung
von
humanen
moDCs
bzw.
mDCs
auszulösen,
wurde
die
immunmodulatorische Fähigkeit von weiteren 5 definierten rekombinanten Proteinen untersucht.
Die Antigene wurden ebenfalls in dem Hefepilz P. pastoris exprimiert, damit Kontaminationen mit
bakteriellen Endotoxinen verringert werden. Alle Antigenpräparationen konnten mittels eines ultrasensitiven HPAEC-Detektionssystems auf ihre Abwesenheit von LPS hin getestet werden.
In den Analysen, welche auch die Quantifizierung von festgelegten Zytokinen und Chemokinen
beinhaltet hatten, wurde die Fähigkeit zur Induktion einer Ausreifung von moDCs, die
Antigenaufnahme durch moDCs bzw. mDCs und die stimulatorische Fähigkeit der behandelten
monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen auf CD8+ T-Zellen erfasst, wobei herausgefunden
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Die myceliale Katalase 1 (Cat1) moduliert die Immunantwort von
humanen dendritischen Zellen
Diskussion
werden konnte, dass nur Cat1 einen signifikanten modulatorischen Effekt induzierte. Die Protease
Pep1 zeigte lediglich eine schwache Aktivierung der moDCs, welche sich in einer leichten
Hochregulation von relevanten Oberflächenmarkern geäußert hat, wohingegen Gel1, Mep1 und
Sod1 überhaupt keinen signifikanten Einfluss auf humane moDCs hatten.
Viele Antigenkandidaten wurden bereits im Mausmodell zum Zwecke von Impfstudien gescreent,
wobei es sich sowohl um Zellwand-gekoppelte (1,3-beta-Glucanosyltransferase [Gel1] und
Glycosylphosphatidylinositol-anchored extracellular cell wall Glucanase [Crf1]), segregierte (Katalase
1 [Cat1], Metalloprotease [Mep1], Aspergillopepsin [Pep1]) als auch zytosolische Proteine (Cu, Zn
Superoxide dismutase [Sod1]) gehandelt hat. Einen protektiven Effekt gegen das Pilzwachstum in der
Lunge und gegen die Ausbreitung in das Gehirn wurde nur mit Gel1, Crf1 und Pep1 beobachtet.
Interessanterweise führte die Behandlung mit Cat1 dabei sogar zu einer verstärkten Ausbreitung von
A. fumigatus im Mausorganismus. Über die Th17-Antwort hinaus, welche auch durch nichtprotektive Glycolipide und Lipid-gekoppeltem Galactomannan ausgelöst wurde, induzierten die
protektiven Antigene Gel1, Crf1 und Pep1 zusätzlich Th1/Treg-Antworten. In diesem Zusammenhang
ist ein Anstieg der Überlebensrate bei Gel1- und ein Langzeitschutz gegen IA bei Crf1- und Pep1behandelten Tieren beobachtet worden (159). Die Analyse weiterer rekombinanter Pilzantigene im
Mausmodel offenbarte einen zusätzlichen protektiven Kandidaten, dem Aspf3 (GenBank accession
no. XP_747849), welches die durch IA verursachte Mortalität in Mäusen reduzierte (160, 161). Aspf3
ist ähnlich dem Thiol-spezifischen Peroxireducin und baut Hydroperoxide ab, wodurch der Pilz vor
oxidativer Schädigung geschützt wird. Es konnte kürzlich gezeigt werden durch Ito et al., dass Aspf3
eine Hauptkomponente der IgG-bindenden HPLC-Fraktion ist und dass durch die Eliminierung eines
der allergenen Domänen, entweder durch N-terminale oder C-terminale Verkürzung des Proteins, es
möglich gewesen ist, selbst ohne die Verwendung von Adjuvantien einen Schutz gegen pulmonale IA
in Mäusen zu erlangen (161).
Im Kontrast zu den Daten aus dem Mausmodel waren Proteine wie Crf1, Gel1, Pep1 und Crf1 nicht in
der Lage gewesen eine signifikante Antwort in humanen moDCs auszulösen. Interessanterweise
scheinen grundsätzliche Unterschiede zwischen der immunstimulatorischen Fähigkeit von gewissen
Antigenen auf humane und murine Immunzellpopulation zu existieren. Dieses Phänomen kann
teilweise durch die evolutionären Unterschiede und der Entwicklung von verschiedenen
Abwehrstrategien in der angeborenene Immunantwort von Mäusen und Menschen erklärt werden.
Es ist bereits bekannt, dass die Zusammensetzung und Funktion der murinen angeborenen
Immunität weit von der humanen divergiert. So ist beispielsweise das humane Blut neutrophilreich
(50–70% Neutrophile und 30–50% Lymphozyten) wohingegen das murine Blut lymphozytenreich ist
(75–90% Lymphozyten und 10–25% Neutrophile). Diese Unterschiede sind nicht verwunderlich, da
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Die myceliale Katalase 1 (Cat1) moduliert die Immunantwort von
humanen dendritischen Zellen
Diskussion
beide Spezies sich vor etwa 65 bis 75 Millionen Jahren voneinander in der Entwicklung trennten, sie
unterschiedliche Körpergrößen sowie Lebenszeiten aufweisen und sich in gänzlich unterschiedlichen
ökologischen Nischen weiterentwickelt haben (162), wobei Mäuse einen Lebensraum besiedeln, an
dem sie ständig einer hohen Konzentration an Pilzsporen ausgesetzt sind.
In Studien, bei denen die Antworten von primären Immunzellen untersucht wurden, waren niedrige
Apoptoseraten essentiell. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein relativ niedriges Level an
Zytotoxizität nach der Stimulation von moDCs mit Cat1 (37%±13% im Vergleich zu Negativkontrolle
mit 26%± 3% nach einer 48-stündigen Kultivatierung) vorlag. Im Gegensatz dazu wurde eine hohe
Apoptoserate beobachtet, wenn moDCs mit den Ribotoxinen Aspf1 oder α-Sarcin (138) stimuliert
wurden.
Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass moDCs, welche in vitro mit Cat1 für 30min stimuliert
worden sind, eine Aktivierung des NFκBs und dadurch ausgelöst einen Anstieg des
Transkriptionslevels von pro-inflammatorischen Genen (il-12p40, tnf-α, cxcl10 und ccl20) zeigten. Die
Aktivierung und Translokation des Transkriptionsfaktors NFκB regulierte Gene hoch, die in der TZellentwicklung,
der
Reifung
und
der
Proliferation
involviert
sind.
Im
Gegensatz
zu
Stimulationsexperimenten mit Aspf1 diente die expimierte mRNA auch als Template für die
Proteinbiosynthese und führte so zu segregierten Zytokinen und Chemokinen, welche in dem
Zellkulturüberstand detektiert werden konnten. In einem in vivo-Versuchsaufbau würde dies
potentiell Immunzellpopulationen, wie Lymphozyten und Neutrophile, aktivieren.
Die lange Zeit und die Komponenten, welche nötig waren um Monozyten in moDC zu differenzieren,
könnten sich jedoch negativ auf ihr immunologisches Potential auswirken. Deshalb ist es sehr
naheliegend, dass alternative DC-Quellen wie myeloide DCs in Betracht gezogen werden. Hierbei war
es möglich, die Beobachtung von pro-inflammatorischer Induktion bei moDCs durch Cat1 auch für
mDCs zu bestätigen, welche zusätzlich erhöhte Levels an IL-6 und IL-1β zeigten. Darüber hinaus
wurde sowohl bei der Inkubation von moDCs als auch mDCs mit Cat1 für 24h bzw. 48h die DCReifung ausgelöst, welche ein wesentlicher Bestandteil für die erfolgreiche Aktivierung der adaptiven
Immunantwort ist. Eine spezifische Interaktion zwischen Cat1-behandelten DCs und T-Zellen, welche
letztlich in der Aktivierung von spezifischen T-Zellen resultieren soll, benötigt die Aufnahme,
Verarbeitung und Präsentation des Proteins. Tatsächlich konnte beobachtet werden, dass erhebliche
Mengen an zellassoziiertem Cat1 nach 30min Inkubationszeit vorlagen. Diese Detektion
verschwanden zu später untersuchten Zeitpunkten, so dass die quantitative Verarbeitung des
aufgenommenen Proteins nach 3h damit vermutet werden kann.
Die immunstimulatorische Kapazität von DCs hängt von ihrer Fähigkeit ab Peptide zu präsentieren.
Dabei basiert die Intensität dieses Signals, welches den T-Zellen gegenüber exponisert wird, auf der
75 | S e i t e
Die myceliale Katalase 1 (Cat1) moduliert die Immunantwort von
humanen dendritischen Zellen
Diskussion
Quantität von Epitop-gekoppelten MHC II Komplexen, welche auf der Zelloberfläche vorzufinden
sind. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass 48,2pg von 2×105 moDCs über 30min
aufgenommen wurde und keine weitere Aufnahme von Antigen nach 30min erfolgt ist. Damit eine
Steigerung des Signals erfolgen kann, wäre eine Erhöhung der MHC II Komplex-Expression notwendig
und darüber hinaus die Verwendung von ausschließlich T-Zell-stimulatorischen Cat1-Epitopen. Die
Identifizierung dieser Cat1-Peptide wäre dann der nächste Schritt in Richtung einer möglichen
immunmodulatorischen Strategie.
Schon zuvor wurde Cat1 als ein vermeintlicher Virulenzfaktor von A. fumigatus betrachtet, welcher
der oxidativen Abwehrreaktion durch humane Phagozyten entgegenwirken könnte. Dabei ist die
myceliale Katalase allein nicht ausreichend genug um gegen einen oxidativen Burst von humanen
immunkompetenten PMNs zu schützen (163). Zusätzlich werden die conidiale Katalase CatA und eine
weitere myceliale Katalase Cat2 exprimiert, deren Relevanz in Bezug zu einer Immunantwort
ungeklärt bleibt. Ausserdem stellt Cat1 nicht nur eine Katalase der Hyphen dar und kann deshalb
dennoch einen bedeutenden Beitrag zum Schutz gegen reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen
species; ROS) leisten.
Für die serologische Diagnostik von IA wurden von Sarfati et al. 3 fungale Antigene identifiziert
(18kDa Ribonuklease [RNU], 88-kDa Dipeptidylpeptidase V [DPPV] und Cat1), die instrumentalisiert
werden
könnten,
um
den
„golden
Standard“-Antigenassay
für
die
Detektion
der
Pilzzellwandkomponente Galactomannan (GM) zu ergänzen (120). Cat1 bewies dabei, dass es das
hervorstechendste Antigen war, das von Seiten der serologischen Antwort mit dem Auftreten von
bewiesener oder wahrscheinlicher IA positiv korrelierte. Dies wies darauf hin, dass Cat1 ein
relevantes Antigen während der Infektion ist, da es in großen Mengen exprimiert wird. Deshalb
wurde zunächst erwartet, dass eine cat1-Deletionsmutante in ihrer Fähigkeit humane DCs zu
stimulieren beeinträchtigt sein würde. Überraschenderweise war dies jedoch nicht der Fall, was
vielleicht damit zusammenhängt, dass mehrere A. fumigatus-Moleküle an der Zellwand in der Lage
sind humane DCs zu stimulieren und dadurch die Rolle von Cat1 in diesem experimentellen Ansatz
verborgen bleibt.
Diese Arbeit enthüllte, dass aufgereinigtes Cat1 fähig ist, humane moDCs und mDCs zu stimulieren,
eine pro-inflammatorische Antwort auszulösen und spezifische T-Zellen vermittelt durch
Antigenpräsentation von DCs zu aktivieren. Wegen diesen Eigenschaften kann Cat1 als ein Werkzeug
beim Design von zukünftigen therapeutischen Konzepten instrumentalisiert werden, nachdem es
möglich gewesen ist, die Antwort von Immuneffektorzellen des angeborenen Immunsystems
dadurch zu modulieren. Dies könnte es ermöglichen, eine gesteigerte Kontrolle über Infektionen mit
Aspergillus fumigatus beim immungeschwächten Patienten zu erlangen.
76 | S e i t e
Collagen-induzierte Aggregation von Thrombozyten bei IA
Diskussion
5.3 Collagen-induzierte Aggregation von Thrombozyten bei IA
Während der Untersuchung von Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation mit
invasiver Aspergillose ist auffällig oft beobachtet worden, dass im betroffenen Lungengewebe es zu
lokalen Einblutungen gekommen ist. Dabei stellte sich die Frage, welche Auswirkung der Pilz auf die
Hämostase hat, denn allen Erwartungen zum Trotz ließen sich anscheinend die Blutgefäße beim
Eindringen des Pilzes nicht mittels der Aggregation von Thrombozyten verschließen.
In diesem Zusammenhang wurden die Versuche mit plättchenreichem Plasma von gesunden
Spendern durchgeführt, wobei das Plasma zunächst mit Morphologien verschiedener Stämme
inkubiert wurde. Dabei sollten sezernierte oder Pilz-gebundene Faktoren, welche eine Veränderung
der Aktivierung von Thrombozyten bewirken könnten, relevate Signalwege bzw. Gerinngunsfaktoren
im Plasma beeinträchtigen. Die Stimulation der Thrombozyten mit Collagen zeigte, dass bei
verschiedenen Morphologien des klinischen Isolats D141 eine signifikante Verringerung der
Aggregation zur Folge hatte. Der gleiche Versuch jedoch mit ADP, welches den P2Y12- und P2Y1Signalweg über einerseits dem inhibierenden Gi-Protein und andererseits über dem aktivierenden GqProtein, das auch vom Thrombin über PAR1 und PAR4 aktiviert wird, reagiert (Abbildung 23), konnte
zeigen, dass die Plättchen in ihre Fähigkeit zur Aggregation nicht grundsätzlich nachlassen. Auch
wurde damit bereits angedeutet, dass einige lösliche Faktoren im Plasma nicht davon betroffen
waren, da das Collagen bei der Verletzung von Gefäßendothel exponiert wird und es zusammen mit
dem an Blutplättchen immobilisierten van-Willebrand-Faktor (VWF) über den GPVI-Rezeptor wirkt,
welcher ebenso wie der Signalweg des ADPs bzw. Thrombins zur Aktivierung der IP3 und DAG führt
(164). Bei der Untersuchung des plättchenfreien Plasmas nach der Inkubation mit Morphologien der
Stämme ATCC bzw. D141 wurde festgestellt, dass beispielsweise Fibrinogen nicht von Pilzsezernierten Faktoren zu Fibrin gespalten wurde und damit zur Bildung eines Thrombus führte. Die
Beeinträchtigung der Collagen-induzierten Aggregation erscheint plausibel, da bei der Invasion des
Pilzes in die Blutgefäße das Collagen exponiert wird und dadurch die Collagen-abhängige Aggregation
von Thrombozyten am Ort der Invasion stimuliert werden würde. Eine gezielte Inhibition dieses
Mechanismus könnte auch die antimikrobiellen Eigenschaften von Thrombozyten beeinträchtigen,
da diese auf die Aktivierung und Degranulation mit einer darauffolgenden Ausschüttung von
Serotonin durch die Plättchen zurückzuführen ist. Mit dem Wachstum des Pilzes und der Produktion
von
etwaigen
Metaboliten
bzw.
Zellwandbestandteilen,
welche
den
Collagensignalweg
beeinträchtigen könnten, würde dem vorgebeugt werden.
77 | S e i t e
Ausblick
Diskussion
Die weitere Untersuchung der Plasmabestandteile – und dabei zunächst speziell des löslichen vanWillebrand-Faktors – sowie der Plättchenrezeptoren wie dem Collagenrezeptor sollte Aufschluss
darüber geben, ob eine Beeinträchtigung des Collagenrezeptors oder des VWF vorliegt.
Abbildung 23: Aggregation durch Collagen bzw. ADP
Auf der linken Seite sind die Signalwege der drei bedeutendsten Rezeptoren für die
Plättchenadhäsion dargestellt. Das Schema auf der rechten Seite zeigt den GPCRgekoppelten Signalweg zur Aktivierung von Thrombozyten. Quelle: Li et al. 2010
5.4 Ausblick
In Hinblick auf die Etablierung einer Immuntherapie für Patienten nach einer allogenen
hämatopoetischen Stammzelltransplantation und daraufhin einem gesteigerten Risiko für invasive
Aspergillosen, ist die Ausarbeitung der pro-inflammatorischen Immunantwort von dendritischen
Zellen gegenüber einem potentiellen Kandidaten ein erster Schritt, welcher ausgebaut werden
müsste. Unter den charakterisierten rekombinanten Antigenen erwies sich die myceliale Katalase
Cat1 als immunmodulatorisches Protein, bei dem nun die Aufgabe besteht, dessen Epitope auf ihre
immunogene
Eigenschaften
zu
prüfen.
In
einer
Peptid-Bibliothek
von
Cat1
mit
Amminosäuresequenzen einer Länge von 8 bis 12 Aminosäuren sind diejenigen zu ermitteln, welche
bei der Präsentation gegenüber T-Zellen über den MHC II Komplex die höhste Fähigkeit zur Induktion
der Aktivierung und Proliferation von spezifischen T-Zellen vorweist. Katalasen sind in vielen
Organismen vertreten und daher bedarf es für die Spezifität der Reaktion von T-Zellen gegen
Aspergillus fumigatus einer genauen Auswahl von unverwechselbaren Sequenzabschnitten, die der
Pilzspezies eigen sind.
78 | S e i t e
Ausblick
Diskussion
Ausserdem wirft die Erkennung von Cat1 durch dendritische Zellen die Frage auf, ob das Protein
durch eine Glycosylierung modifiziert ist und erst dadurch von PRRs der DCs erkannt wird. Da die
rekombinanten Antigene im P. pasoris-System generiert wurden und daher keine weiteren
Modifikationen aufweisen, sollte Cat1 konservierte Sequenzbereiche besitzen, welche als Liganden
von pro-inflammatorisch relevanten PRRs dienen. Um dies genauer Untersuchen zu können, müsste
geklärt werden, welcher Rezeptor für die Immunantwort von dendritischen Zellen verantwortlich ist.
Dies kann beispielsweise durch Rezeptorinhibition erfolgen, bei der durch spezifische blockende
Antikörper gegen den ausgewählten Rezeptor die Signalvermittlung unterbunden wird. Da jedoch
diese Art von Antikörper nur für wenige Rezeptoren erhältlich ist, würde alternativ der siRNAinduzierte Knockdown von Rezeptor-mRNA eine bessere Möglichkeit darstellen. Die Verifizierung des
Knockdowns mittels qRT-PCR von cDNA für die Untersuchung auf mRNA-Ebene und mittels
Durchflusszytometrie für die Untersuchung der Verringerung von Rezeptorsignalen auf der
Zelloberfläche stellt sicher, dass eine verringerte Antwort der Zellen tatsächlich auf den Verlust des
betroffenen Rezeptors zurückzuführen ist. Dies erweist sich als praktikabel, da ein breites Spektrum
an siRNA besteht bzw. siRNA spezifisch für das betreffende Ziel leicht designt werden kann.
Damit der Zusammenhang zwischen pathologisch beobachteten Einblutungen bei Patienten, welche
aufgrund einer invasiven Aspergillose verstorben sind, und pilzspezifischen Faktoren, welche die
Hämostase beeinträchtigen, besser untersuchen kann, muss der Fokus zunächst auf spezifische
Signalwege in humanen Thrombozyten gelegt werden, welche vorzugsweise bei der antimikrobiellen
Wirkung der Thrombozyten gegenüber Aspergillus fumigatus eine Rolle spielen. Dies könnte klären,
ob bei klinischen Isolaten ein Abwehrmechanismus sich entwickelt hat, der in der Lage ist, die
Reaktion von Blutplättchen zu unterbinden, wobei als Nebenwirkung der Verlust der Hämostase
auftreten könnte. Die Beteiligung von Collagen scheint unter dem Gesichtspunkt ein erster Hinweis
zu sein, so dass der Downstream-Signalweg des Collagens nach Versuchen mit Morphologien von
Aspergillus fumigatus untersucht werden müsste.
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Anhang
7 Anhang
7.1 Abkürzungen, Einheiten und Genbezeichungen
α
°C
λ
μ
×g
anti
Grad Celsius
Wellelänge
mikro (10-6)
fache Erdbeschleunigung
A
A
ab
Abb.
A. dest
ADP
Adv
AK
allg.
AML
APC
APC
APS
Adenin
antibody
Abbildung
Aqua dest (destilliertes Wasser)
Adenosin-5’-diphosphat
Adenovirus
Antikörper
allgemein
akute myeloische Leukämie
antigen presentating cell
Allophycocyanin
Ammoniumpersulfat
B
b
bp
BSA
bzw.
Base
Basenpaar(e)
Bovine serum albumin
beziehungsweise
C
c
C
Ca
ca.
CaCl2
CCL20
CD
CDP
CFSE
CGD
CHX
CLR
CMV
CO2
cpm
CP
CREB
Cu
CXCL10
Cy
concentration (Konzentration)
Cytosin
Calcium
circa
Calciumchlorid
C-C motif ligand 20 (pro-infl. Chemokin)
Gene ID: 6364
Cluster of Differentiation (Unterscheidungsgruppen)
common DC precursor
carboxyfluorescein succinimidyl ester
chronic granulomatous disease
cycloheximid
C-type Lectinrezeptor
Cytomegalovirus
Kohlendioxid
counts per minute
crossing point
cAMP response element binding protein
Gene ID: 1385
Kupfer
C-X-C motif ligand 10 (pro-infl. Chemokin)
Gene ID: 3627
Carboxyfluorescein
D
d
day (Tag)
90 | S e i t e
Anhang
Da
DAG
DC
dd
DMSO
DNA
Dalton
Diacylglycerol
dendritic cell
doppelt destilliert
Dimethylsulfoxid
desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
E
E
EBV
EC50
ECL
E. coli
EDTA
ELISA
EORTC/MSG
ER
EtBr
EtOH
Glutaminsäure
Effizienz
Epstein-Barr-Virus
Konzentration an Inhibitor zur 50% Inhibition in vivo
enhanced chemiluminescence
Escherischia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
enzyme-linked immunosorbend assay
European Organization for Research and Treatment of Cancer and
Mycoses Study Group
endoplasmatisches Retikulum
Ethidiumbromid
Ethanol
F
f
FCS
FITC
FL
femto (10-15)
fetal calf serum
fluorescein isothiocyanate
Fluoreszenzkanal
G
g
G
GM
GM-CSF
GPCR
GPI
GPVI
GvHD
GVO
Gramm
Guanin
Galactomannan
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (Zytokin)
G-protein coupled receptor
Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol
Glycoprotein VI
Gene ID: 51206
Graft versus Host Disease (Transplantat gegen Wirt-Erkrankung)
genetisch veränderter Organismus
H
h
H
HA
HBSS
H2O
H2O2
HCl
Hepes
His
HIV
HMG
HRP
HSCT
5-HT
hour (Stunde)
Histidin
Hemagglutinin
Hanks balanced salt solution
Wasser
Wasserstoffperoxid
Salzsäure
N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethane-sulfonic acid]
Histidin
humanes Immundefizienz-Virus
high-mobility group
horseradish peroxidase
hematopoetic stem cell transplantation
5-Hydroxytryptamin (Serotonin)
I
IA
iDC
i.d.R.
IFN-γ
invasive Aspergillose
immature dendritic cell (unreife dendritische Zelle)
in der Regel
Interferon Gamma
Gene ID: 3458
E
91 | S e i t e
Anhang
IgG
IL
IL-1β
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10
IL-12
IL-23
inkl.
IP3
ISHAM
IU
Immunglobulin G
Interleukin
Interleukin 1 beta (pro-inflammatorisches Zytokin) Gene ID: 3553
Interleukin 2 (Wachstumsfaktor)
Gene ID: 3558
Interleukin 4 (Wachstums- und Stimulationsfaktor) Gene ID: 3565
Interleukin 6 (Interferon beta 2)
Gene ID: 3569
Interleukin 8 (pro-inflammatorisches Chemokin)
Gene ID: 3576
Interleukin 10 (anti-inflammatorisches Zytokin)
Gene ID: 3586
Interleukin 12 (pro-inflammatorisches Zytokin)
Gene ID: 3592
Interleukin 23 (pro-inflammatorisches Zytokin)
Gene ID: 51561
inklusive
Inositoltriphosphate
International Society for Human and Animal Mycoses
international unit
J
JNK1
cJun NH2-terminale Kinase
K
k
Kap.
KCl
Konz.
kilo
Kapitel
Kaliumchlorid
Konzentration
L
l
LRSC
LPS
Liter
Leukoreduction system chamber
Lipopolysaccharide
M
m
m
M
mA
mAb
max.
mDC
MDP
MDS
MetOH
MgCl2
MgSO4
MHC
min
min.
MIP-3-alpha
mLR
moDC
MOI
mRNA
Meter
milli (10-3)
Molar (mol pro Liter)
Milliampere
monoclonal antibody (monoklonaler Antikörper)
maximal
myeloid dendritic cell (myeloide dendritische Zelle)
monocyte, macrophage and DC precursor
myelodysplastisches Syndrom
Methanol
Magnesiumchlorid
Magnesiumsulfat
major histocompatibility complex
Minute
minimal
siehe CCL20
mixed lymphocyte reaction
monocyte-derived dendritic cell (Monozyten-abgeleitete dendritische
Zelle)
multiplicity of infection
messenger RNA
n
N
NaAc
NaCl
NaOH
NFκB
NK
nano (10-9)
normal
Natriumacetat
Natriumchlorid
Natriumhydroxid
nuclear factor kappa B (Transkriptionsfaktor)
natürliche Killerzellen
N
Gene ID: 5599
92 | S e i t e
Anhang
ns
nt
nicht signifikant
Nukleotid(e)
O
OD
optische Dichte
P
p
PAMP
PBMC
PBS
PCR
pDC
PE
PI
pH
PHA
PMN
PPP
PRP
PRR
pico (10-12)
pathogen associated molecular pattern
peripheral blood mononuclear cell
phosphate buffered saline (Phosphatsalzpuffer)
polymerase chain reaction (Polymerase-Ketterreaktion)
plasmacytoid dendritic cell (plasmazytoidische dendritische Zelle)
Phycoerythrin
Propidiumiodid
negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Phytohemagglutinin
polymorphonukleäre Leukozyten
platelet-poor plasma (plättchenarmes Plasma)
platelet-rich plasma (plättchenreiches Plasma)
pattern recognition receptor
R
R
RNA
ROS
rRNA
RT
Arginin
ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
reactive oxygen species
ribosomale RNA
Raumtemperatur
S
s, sec
SAPK
SCYB10
SDS
SEM
SEM
s.o.
sog.
spez.
Sekunde
stressaktivierte Proteinkinase
siehe CXCL10
sodium dodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)
Scan-Elektronenmikroskopie
standard error of the mean
siehe oben
sogenannt
speziell
t
T
T
T
T
Tab.
Taq
TBS
TLR
Tm
TMB
TNF-α
Tris
time (Zeit)
Temperatur
Thymin
Tween® 20
Triton® X-100
Tabelle
Thermus aquaticus
Tris buffered saline (Trissalzpuffer)
toll-like receptor
Schmelztemperatur
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine
tumor necrosis factor alpha (pro-infl. Zytokin)
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
u.a.
ü.N.
USD
UV
unter anderem
über Nacht
US Dollar
Ultraviolett
T
U
Gene ID: 5601
Gene ID: 7124
93 | S e i t e
Anhang
V
V
V.
Vol.
v/v
VWF
Volt
vena
Volumen
Volumen per Volumen
van-Willebrand-Faktor
W
WP
w/v
washed platelet (aufgereinigte Thrombozyten)
weight per volume (Gewicht pro Volumen)
Y
Y
Tyrosin
Z
z.B.
Zn
z.T.
zw.
z.Z.
zum Beispiel
Zink
zum Teil
zwischen
zur Zeit
Gene ID: 7450
7.2 Sequenzen
7.2.1 Nukleinsäuresequenzen von Amplikons untersuchter Gene in der relativen
qRT-PCR
Aufgelistet sind hier die Zielsequenzen für eine Amplifikation in der relativen quantitativen
RT-PCR mittels Roche Lightcycler 1.5. Die hellgrau markierten Sequenzabschnitte heben
Konsesussequenzen der Primer, die dunkelgrauen Abschnitte die der Sonden und die
unterstrichenen Bereiche den Amplikon hervor.
ccl20 (NM_001130046.1)
AGAATATAACAGCACTCCCAAAGAACTGGGTACTCAACACTGAGCAGATCTGTTCTTTGAGCTAAAAACCATGTG
CTGTACCAAGAGTTTGCTCCTGGCTGCTTTGATGTCAGTGCTGCTACTCCACCTCTGCGGCGAATCAGAAGCAAG
CAACTTTGACTG
163
|CTGTCTTGGATACACAGACCGTATTCTTCATCCTAAATTTATTGTGGGCTTCACACGGCAGCTGGCCAATGAAG
GCTGTGACATCAATGCTATCATCTTTCACACAAAGAAAAAGTTGTCTGTGTGCGCAAATCCAAAACAGACTTGGG
TGAAATATATTGTGCGTCTCCTCAGTAAAAAAGTCAAGAACATGTAAAAACTGTGGCTTTTCTGGAATGGAATTG
GACATAGCCCAAGAACAGAAAGAACC|
412
TTGCTGGGGTTGGAGGTTTCACTTGCACATCATGGAGGGTTTAGTGCTTATCTAATTTGTGCCTCACTGGACTTG
TCCAATTAATGAAGTTGATTCATATTGCATCATAGTTTGCTTTGTTTAAGCATCACATTAAAGTTAAACTGTATT
TTATGTTATTTATAGCTGTAGGTTTTCTGTGTTTAGCTATTTAATACTAATTTTCCATAAGCTATTTTGGTTTAG
TGCAAAGTATAAAATTATATTTGGGGGGGAATAAGATTATATGGACTTTCTTGCAAGCAACAAGCTATTTTTTAA
....
cxcl10 (NM_001565.2)
GGGGGAGACATTCCTCAATTGCTTAGACATATTCTGAGCCTACAGCAGAGGAACCTCCAGTCTCAGCACCATGAA
TCAAACTGCCATTCTGATTTGCTGCCTTATCTTTCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCTCTCTCTAGAAC
94 | S e i t e
Anhang
TGTACGCTGTACCTGCATCAGCATTAGTAATCAACCTGTTAATCCAAGGTCTTTAGAAAAACTTGAAATTATTCC
TGCAAGCCAATTTTGTCC
244
|ACGTGTTGAGATCATTGCTACAATGAAAAAGAAGGGTGAGAAGAGATGTCTGAATCCAGAATCGAAGGCCATCA
AGAATTTACTGAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGTCTAAAAGATCTCCTTAAAACCAGAGGGGAGCAAAATC|
387
GATGCAGTGCTTCCAAGGATGGACCACACAGAGGCTGCCTCTCCCATCACTTCCCTACATGGAGTATATGTCAAG
CCATAATTGTTCTTAGTTTGCAGTTACACTAAAAGGTGACCAATGATGGTCACCAAATCAGCTGCTACTACTCCT
GTAGGAAGGTTAATGTTCATCATCCTAAGCTATTCAGTAATAACTCTACCCTGGCACTATAATGTAAGCTCTACT
GAGGTGCTATGTTCTTAGTGGATGTTCTGACCCTGCTTCAAATATTTCCCTCACCTTTCCCATCTTCCAAGGGTA
....
halas (NM_199166.1)
....
CCAGTGGACTGCTGAAGAACTTCCAGGACATCATGCAAAAGCAAAGACCAGAAAGAGTGTCTCATCTTCTTCAAG
ATAACTTGCCAAAATCTGTTTCCACTTTTCAGTATGATCGTTTCTTTGAGAAAAAAATTGATGAGAAAAAGAATG
ACCACACCTATCGAGTTTTTAAAACTGTGAACCGGCGAGCACACATCTTCCCCATGGCAGATGACTATTCAGACT
CCCTCATCACCAAAAAGCAAGTGTCAGTCTGGTGCAGTAATGACTACCTAGG
953
|AATGAGTCGCCACCCACGGGTGTGTGGGGCAGTTATGGACACTTTGAAACAACATGGTGCTGGGGCAGGTGGTA
CTAGAAATATTTCTGGAACTAGTAAATTCCATGTGGACTTAGAGCGGGAGCTG|
1079
GCAGACCTCCATGGGAAAGATGCCGCACTCTTGTTTTCCTCGTGCTTTGTGGCCAATGACTCAACCCTCTTCACC
CTGGCTAAGATGATGCCAGGCTGTGAGATTTACTCTGATTCTGGGAACCATGCCTCCATGATCCAAGGGATTCGA
AACAGCCGAGTGCCAAAGTACATCTTCCGCCACAATGATGTCAGCCACCTCAGAGAACTGCTGCAAAGATCTGAC
CCCTCAGTCCCCAAGATTGTGGCATTTGAAACTGTCCATTCAATGGATGGGGCGGTGTGCCCACTGGAAGAGCTG
....
il-1β (NM_000576.2)
....
GACAAGCTGAGGAAGATGCTGGTTCCCTGCCCACAGACCTTCCAGGAGAATGACCTGAGCACCTTCTTTCCCTTC
ATCTTTGAAGAAGAACCTATCTTCTTCGACACATGGGATAACGAGGCTTATGTGCACGATGCACCTGTACGATCA
CTGAACTGCACGCTCCGGGACTCACAGCAAAAAAGCTTGGTGATGTCTGGTCCATATGAACTGAAAGCTCTCCAC
CTC
529
|CAGGGACAGGATATGGAGCAACAAGTGGTGTTCTCCATGTCCTTTGTACAAGGAGAAGAAAGTAATGACAAAAT
ACCTGTGGCCTTGGGCCTCAAGGAAAAGAATCTGTACCTGTCCTGCGTGTTGAAAGATGATAAGCCCACTCTACA
GCTGGAGAGTGTAGATCCCAAAAATTACCCAAAGAAGAAGATGGAAAAGCGATTTGTCTTCAACAAGATAGAAAT
CAATAACAAGCTGGAATTTGAGTCTGC|
779
CCAGTTCCCCAACTGGTACATCAGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTCTTCCTGGGAGGGACCAAAGGCGG
CCAGGATATAACTGACTTCACCATGCAATTTGTGTCTTCCTAAAGAGAGCTGTACCCAGAGAGTCCTGTGCTGAA
TGTGGACTCAATCCCTAGGGCTGGCAGAAAGGGAACAGAAAGGTTTTTGAGTACGGCTATAGCCTGGACTTTCCT
GTTGTCTACACCAATGCCCAACTGCCTGCCTTAGGGTAGTGCTAAGAGGATCTCCTGTCCATCAGCCAGGACAGT
....
il-10 (NM_000572.2)
ACACATCAGGGGCTTGCTCTTGCAAAACCAAACCACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCAC
TGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCA
CCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTC
AAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCT
95 | S e i t e
Anhang
268
|TGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTG
ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTC
AGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAAT
GCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTAC|
524
AAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGAGAC
ATCAGGGTGGCGACTCTATAGACTCTAGGACATAAATTAGAGGTCTCCAAAATCGGATCTGGGGCTCTGGGATAG
CTGACCCAGCCCCTTGAGAAACCTTATTGTACCTCTCTTATAGAATATTTATTACCTCTGATACCTCAACCCCCA
TTTCTATTTATTTACTGAGCTTCTCTGTGAACGATTTAGAAAGAAGCCCAATATTATAATTTTTTTCAATATTTA
....
il-12p35 (NM_000882.2)
....
GTTTGGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGC
TGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTG
ATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGA
GTTGCCTAAATTCCA
616
|GAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTT
AGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCT
AAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGT
GAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGA|
868
AGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTAT
TGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAAAAAGCGAGGTCCCTCCAAACCGTTGTCATTTTTATAAAACT
TTGAAATGAGGAAACTTTGATAGGATGTGGATTAAGAACTAGGGAGGGGGAAAGAAGGATGGGACTATTACATCC
ACATGATACCTCTGATCAAGTATTTTTGACATTTACTGTGGATAAATTGTTTTTAAGTTTTCATGAATGAATTGC
....
il-12p40 (NM_002187.2)
CTGTTTCAGGGCCATTGGACTCTCCGTCCTGCCCAGAGCAAGATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTT
TCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCC
100
|CTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGA
AATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTT
AGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCA|
302
GTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTG
GTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTC
TGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTC
TTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTA
....
il-23p19 (NM_016584.2)
....
ATCAGGCTCAAAGCAAGTGGAAGTGGGCAGAGATTCCACCAGGACTGGTGCAAGGCGCAGAGCCAGCCAGATTTG
AGAAGAAGGCAAAAAGATGCTGGGGAGCAGAGCTGTAATGCTGCTGTTGCTGCTGCCCTGGACAGCTCAGGGCAG
AGCTGTGCCTGGGGGCAGCAGCCCTGCCTGGACTCAGTGCCAGCAGCTTTCACAGAAGCTCTGCACACTGGCCTG
GAGTGCACATCCAC
96 | S e i t e
Anhang
315
|TAGTGGGACACATGGATCTAAGAGAAGAGGGAGATGAAGAGACTACAAATGATGTTCCCCATATCCAGTGTGGA
GATGGCTGTGACCCCCAAGGACTCAGGGACAACAGTCAGTTCTGCTTGC|
437
AAAGGATCCACCAGGGTCTGATTTTTTATGAGAAGCTGCTAGGATCGGATATTTTCACAGGGGAGCCTTCTCTGC
TCCCTGATAGCCCTGTGGGCCAGCTTCATGCCTCCCTACTGGGCCTCAGCCAACTCCTGCAGCCTGAGGGTCACC
ACTGGGAGACTCAGCAGATTCCAAGCCTCAGTCCCAGCCAGCCATGGCAGCGTCTCCTTCTCCGCTTCAAAATCC
TTCGCAGCCTCCAGGCCTTTGTGGCTGTAGCCGCCCGGGTCTTTGCCCATGGAGCAGCAACCCTGAGTCCCTAAA
....
il-8 (NM_000584.2)
CTCCATAAGGCACAAACTTTCAGAGACAGCAGAGCACACAAGCTTCTAGGACAAGAGCCAGGAAGAAACCACCGG
AAGGAACCATCTCACTGTGTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCTC
127
|TCTTGGCAGCCTTCCTGATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGTGCAGTTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGAACTTAGA
TGTCAGTGCATAAAGACATACTCCAAACCTTTCCACCCCAAATTTATCAAAGAACTGAGAGTGATTGAGAGTGGA
CCACACTGCGCCAACACAGAAATTATTGTAAAGCTTTCTGATGGAAGAGAGCTCTGTCTGGA|
337
CCCCAAGGAAAACTGGGTGCAGAGGGTTGTGGAGAAGTTTTTGAAGAGGGCTGAGAATTCATAAAAAAATTCATT
CTCTGTGGTATCCAAGAATCAGTGAAGATGCCAGTGAAACTTCAAGCAAATCTACTTCAACACTTCATGTATTGT
GTGGGTCTGTTGTAGGGTTGCCAGATGCAATACAAGATTCCTGGTTAAATTTGAATTTCAGTAAACAATGAATAG
TTTTTCATTGTACCATGAAATATCCAGAACATACTTATATGTAAAGTATTATTTATTTGAATCTACAAAAAACAA
....
tnf-α (NM_000594.2)
....
CTCCCCTGGAAAGGACACCATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAA
GAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGC
CACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCT
AATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTG
426
|ACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT
GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTAC
TCCCAGGTCCTCT|
587
TCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGA
CCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCT
GGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGC
CCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGAGGACGAACATCCA
....
7.2.2 Proteinsequenzen von rekombinant hergestellten A. fumigatus-Antigenen
im P. pastoris-System
Aspf1 (Mitogillin; 18kDa Ribonuclease)
XP_748109.1 major allergen and cytotoxin AspF1 [Aspergillus fumigatus Af293]
MVAIKNLFLLAATAVSVLAAPSPLDARATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYSQAKAESNSHHAPLSDGKT
97 | S e i t e
Anhang
GSSYPHWFTNGYDGNGKLIKGRTPIKFGKADCDRPPKHSQNGMGKDDHYLLEFPTFPDGHDYKFDSKKPK
EDPGPARVIYTYPNKVFCGIVAHQRGNQGDLRLCSH
Aspf16 (Crf1; Cell wall glucanase)
XP_747754.1 cell wall glucanase/allergen F16-like [Aspergillus fumigatus Af293]
MMLPLLAVSAFASLGAAQTYTSCNPTNSLKTWSLSTDFTQGSSDGWTAISGNVTYGSNGAEFTINKRYDA
PTLETNFYIFFGEVEVVMRAANGTGIVSSIVMESDDLDEIDWECTGTDTTQIQTNYFGKGNTTTYDRAIW
ETVSSPQDEFHTYKVVWTAAAITWYIDGTAVRTLEYADAVDGKNYPQTPMVVKLGIWAGGDPSNSEGTIE
WAGGETDYDEVPFTMYVKSVNIINYNPAASYNYTDKTGSYTSIVASNSTTGSGIHSSNSVSVFAPSSSTS
TFTSSRALIATASTYPASVQTSSSGVVSLSSSSASSSSAAASSTSGSASAVFTGAAVTNLPSFFFTVFFA
LAIALAF
Cat1 (Mycelial catalase 1)
XP_748550.1 mycelial catalase Cat1 [Aspergillus fumigatus Af293]
MRLTFIPSLIGVANAVCPYMTGELNRRDEISDGDAAAATEEFLSQYYLNDNDAFMTSDVGGPIEDQNSLS
AGERGPTLLEDFIFRQKIQRFDHERVPERAVHARGAGAHGVFTSYGDFSNITAASFLAKEGKQTPVFVRF
STVAGSRGSSDLARDVHGFATRFYTDEGNFDIVGNNIPVFFIQDAILFPDLIHAVKPRGDNEIPQAATAH
DSAWDFFSQQPSTMHTLLWAMSGHGIPRSFRHVDGFGVHTFRFVTDDGASKLVKFHWKSLQGKASMVWEE
AQQTSGKNPDFMRQDLHDAIEAGRYPEWELGVQIMDEEDQLRFGFDLLDPTKIVPEEFVPITKLGKMQLN
RNPRNYFAETEQVMFQPGHIVRGVDFTEDPLLQGRLFSYLDTQLNRHGGPNFEQLPINQPRVPVHNNNRD
GAGQMFIPLNPHAYSPKTSVNGSPKQANQTVGDGFFTAPGRTTSGKLVRAVSSSFEDVWSQPRLFYNSLV
PAEKQFVIDAIRFENANVKSPVVKNNVIIQLNRIDNDLARRVARAIGVAEPEPDPTFYHNNKTADVGTFG
TKLKKLDGLKVGVLGSVQHPGSVEGASTLRDRLKDDGVDVVLVAERLADGVDQTYSTSDAIQFDAVVVAA
GAESLFAASSFTGGSANSASGASSLYPTGRPLQILIDGFRFGKTVGALGSGTAALRNAGIATSRDGVYVA
QSVTDDFANDLKEGLRTFKFLDRFPVDH
Gel1 (1,3-β-Glucanosyltransferase)
XP_749253.1 1,3-beta-glucanosyltransferase Gel1 [Aspergillus fumigatus Af293]
MKASAVTAALAVGASTVLAAPSIKARDDVTPITVKGNAFFKGAERFYIRGVDYQPGGSSDLADPIADADG
CKRDIAKFKELGLNTIRVYSVDNSKNHDECMNALADAGIYLVLDVNTPKYSINRAKPKESYNDVYLQYIF
ATVDAFAGYKNTLAFFSGNEVINDGPSSSAAPYVKAVTRDLRQYIRSRKYREIPVGYSAADIDTNRLQMA
QYMNCGSDDERSDFFAFNDYSWCDPSSFKTSGWDQKVKNFTGYGLPLFLSEYGCNTNKRQFQEVSSLYST
DMTGVYSGGLVYEYSQEASNYGLVEISGNNVKELPDFDALKTAFEKTSNPSGDGNYNKTGGANPCPAKDA
PNWDVDNDALPAIPEPAKKYMTEGAGKGPGFAGPGSQDRGTQSTATAEPGSGSATGSSSSGTSTSSKGAA
AGLTVPSLTMAPVVVGAVTLLSTVFGAGLVLL
Mep1 (Elastinolytic metalloproteinase)
XP_747506.1 elastinolytic metalloproteinase Mep [Aspergillus fumigatus Af293]
MRGLLLAGALALPASVFAHPAHQSYGLNRRTVDLNAFRLKSLAKYVNATETVIEAPSSFAPFKPQSYVEV
ATQHVKMIAPDATFRVVDDHYVGDNGVAHVHFRQTANGLDIDNADFNVNVGKDGKVFSYGNSFYTGQIPS
SAALTKRDFSDPVTALKGTTNTLQLPITVDSASSESTEEKESYVFKGVSGTVSDPKAKLVYFVKDDGTLA
98 | S e i t e
Anhang
LAWRVETDIDSNWLLTYIDAKSGEEIHGVVDYVAEADYQVYAWGINDPTEGERTVIKDPWDSVASEFTWI
SDGSTNYTTSRGNNGIAQSNPSGGSSYLNNYRPSSSSLSFKYPYSVSSSPPSSYIDASIIQLFYTANIYH
DLLYTLGFTEKAGNFEYNTNGQGGLGNDYVILNAQDGSGTNNANFATPPDGQPGRMRMYVWTESTPYRDG
SFEAGIVIHEYTHGLSNRLTGGPANSNCLNALESGGMGEGWSDFMATAIRLKPGDKRSTDYTMGEWASNR
AGGIRQYPYSTSLSTNPLTYTSVNSLNAVHAIGTVWASMLYEVLWNLIDKHGKNDAPKPTLRDGVPTDGK
YLAMKLVMDGMALQPCNPNFVQARDAILDADTALTGGENQCEIWTAFAKRGLGAGAKYSSRNRVGSTEVP
SGVC
Pep1 (Aspartic endopeptidase)
XP_753324.1 aspartic endopeptidase Pep1/aspergillopepsin F [Aspergillus fumigatus Af293]
MVVFSKVTAVVVGLSTIVSAVPVVQPRKGFTINQVARPVTNKKTVNLPAVYANALTKYGGTVPDSVKAAA
SSGSAVTTPEQYDSEYLTPVKVGGTTLNLDFDTGSADLWVFSSELSASQSSGHAIYKPSANAQKLNGYTW
KIQYGDGSSASGDVYKDTVTVGGVTAQSQAVEAASHISSQFVQDKDNDGLLGLAFSSINTVSPRPQTTFF
DTVKSQLDSPLFAVTLKYHAPGTYDFGYIDNSKFQGELTYTDVDSSQGFWMFTADGYGVGNGAPNSNSIS
GIADTGTTLLLLDDSVVADYYRQVSGAKNSNQYGGYVFPCSTKLPSFTTVIGGYNAVVPGEYINYAPVTD
GSSTCYGGIQSNSGLGFSIFGDIFLKSQYVVFDSQGPRLGFAPQA
Sod1 (Cu,Zn superoxide dismutase)
XP_753715.1 Cu,Zn superoxide dismutase SOD1 [Aspergillus fumigatus Af293]
MQGVTPPVIAVLRGDSKITGTVTFEQADENSPTTVSWNIKGNDPNAKRGFHVHQFGDNTNGCTSAGPHFN
PYGKTHGAPEDSERHVGDLGNFETDAEGNAVGSKQDKLIKLIGAESVLGRTLVVHAGTDDLGRGGNEESK
KTGNAGARPACGVIGIAA
99 | S e i t e
8 Curriculum vitae
Persönliche Angaben
Name
Michael Ok
Geburtsdatum
8. Oktober 1979
Geburtsort
Berlin – Reinickendorf
Email
[email protected]
Wissenschaftliche Berufserfahrung
2/2008 bis 12/2010
Promotionsstudium der Biologie
Universität Würzburg
Externe Doktorarbeit angefertigt an der Medizinischen Klinik
und Poliklinik II des Universitätsklinikums Würzburg bei Prof.
Hermann Einsele und PD Dr. Jürgen Löffler mit dem Titel:
„Analyse der Interaktion und die gezielte Modifikation von
angeborener Immunantwort gegenüber Aspergillus fumigatus“
12/2006 bis 11/2007
Wissenschaftliche Hilfskraft
Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie, Universität Würzburg
„Genotypische Untersuchung von ADHS“ (Prof. Lesch)
12/2005 bis 2/2007
Wissenschaftliche Hilfskraft
Lehrstuhl für Genetik und Neurobiologie, Universität Würzburg
„Untersuchung von Mechanismen und der Evolution des
Arthropodenverhaltens“ (Prof. Heisenberg)
Studium
3/2008
Abschluss als Diplom-Biologe (Gesamtnote: gut)
Universität Würzburg
100 | S e i t e
10/2001 bis 1/2008
Studium der Biologie
Universität Würzburg


Schwerpunkt Biochemie
Nebenfächer Genetik, Bioinformatik und Rechtsmedizin
Diplomarbeit am Institut für klinische Biochemie und
Pathobiochemie des Universitätsklinikum Würzburg bei Dr. Jörg
Geiger und PD Dr. Elke Butt mit dem Titel:
„Untersuchung und Quantifizierung von cAMP- und cGMPabhängigen Signalwegen über PDE2A, PDE3A und PDE5A in
humanen Thrombozyten “ (Note: sehr gut)
6/1999
Abitur
Riemenschneider Gymnasium, Würzburg
Physik und Mathematik als Leistungsfächer
Zivildienst
12/1999 bis 7/2000
in der Altenpflege
Seniorenwohn- und Pflegeheim „Haus Fuchsenmühle mbH“,
Ochsenfurt
8/1999 bis 12/1999
in der Altenpflege
Seniorenheim „Haus vom Guten Hirten“ Caritas, Berlin
101 | S e i t e
9 Publikationen
9.1 Veröffentlichte Studien
Vorbereitet seit 10/2010 "Aspergillus fumigatus mycelial catalase Cat1 modulates innate
immune responses of human monocyte-derived and myeloid
dendritic cells “
Michael Ok, Jean Paul Latgé, Frank Ebel, Anna-Lena Schmitt, Tanja
Breitschopf, Eva Giese, Allison McCormick, Max Topp, Hermann Einsele
und Juergen Loeffler
The interactions between Aspergillus fumigatus and the human innate
immune system and in particular the fungal target molecules that are
recognized by innate immune cells are still not very well understood. In
this study, we have characterized 5 different recombinant antigens of A.
fumigatus (namely catalase 1 [Cat1], metalloprotease [Mep1],
aspergillopepsin [Pep1], 1,3-beta-glucanosyltransferase [Gel1] and Cu,
Zn superoxide dismutase [Sod1]), for their capacity to modulate innate
immune responses of human monocyte-derived dendritic cells (moDC)
and identified the mycelial catalase Cat1 as a potent inducer of a proinflammatory immune response in vitro. This finding was confirmed
using human myeloid dendritic cells (mDC) that showed high proinflammatory and low anti-inflammatory cytokine and chemokine
expression profiles (TNF-α, IL-12p40, IL-6, IL-1β, CXCL10, CCL20 // IL-10)
after exposure to Cat1. In contrast to the other four soluble or cell wall
associated antigens Cat1 induced also maturation of moDCs; moreover,
epitopes of Cat1 were able to stimulate cytotoxic T-cells (CD3+ CD8+).
We conclude from these data that Cat1 might be a valuable candidate
for specific immune modulation of moDCs that are directed against A.
fumigatus.
Manuskript ist vorbereitet für die Einreichung beim Journal of
Immunology
102 | S e i t e
Eingereicht 10/2010
" Human Natural Killer cells display important killing impact on
Aspergillus fumigatus, which is directly mediated by IFN-γ release“
Maria Bouzani, Michael Ok, Allison McCormick, Frank Ebel, Oliver Kurzai,
Oliver C. Morton, Hermann Einsele und Juergen Loeffler
Despite the strong interest in the NK cell mediated immunity towards
malignant cells and viruses, there is a relative lack of data on the
interplay between NK cells and filamentous fungi, especially Aspergillus
fumigatus, which is the major cause of invasive aspergillosis (IA). By
studying the in vitro interaction between human NK cells and A.
fumigatus, we found that only the germinated morphologies were highly
immunogenic, inducing a Th1-like response, with the up- regulation of
cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Moreover, the stimulation of NK cells
caused strong fungicidal effects towards A. fumigatus. We identified the
direct NK cell – pathogen contact and the priming of NK cells with
rhuman IL-2 (rhIL2) as essential elements in this interaction. However,
the most interesting finding was that NK cells did not mediate antiAspergillus cytotoxicity through the degranulation of their traditional
cytotoxic proteins (perforin, granzymes, granulysine), but via an
alternative mechanism, involving soluble factor(s). Our study is the first
to demonstrate that IFN-γ, released by NK cells, kills directly A.
fumigatus, attributing new properties to both human NK cells and IFN-γ
and suggesting them as possible therapeutic tools against IA.
Eingereicht bei: Journal of Immunology, 28. Oktober 2010,
Manuskript-Identifikationsnummer: 10-03593-FL
Eingereicht 8/2010
" Genetic susceptibility to Aspergillus fumigatus infections “
Michael Ok, Hermann Einsele und Juergen Loeffler
Invasive aspergillosis mostly caused by the opportunistic mould
Aspergillus fumigatus is characterized by high morbidity and mortality in
risk group patients. Several ethno-pathological factors promote the
development and the course of this fungal infection like neutropenia, Tcell depletion, CD34-selected stem cell products, corticosteroid therapy
103 | S e i t e
or cytomegalovirus infections, respectively. Furthermore, a growing
number of defined single nucleotide polymorphisms affiliated to genes
affecting the innate immune response has been described which
genetically determine susceptibility to A. fumigatus. Thereby, it concerns
a broad band ranging from genes encoding for cytokines or chemokines,
their respective receptors to those of toll-like receptors including further
genes involved in recognition and defence of pathogens by the innate
immune system. Here, we summarize in detail the current knowledge
about genetic markers correlated with invasive aspergillosis and their
relevance for the developing and outcome of infections with A.
fumigatus.
Eingereicht bei: International Journal of Medical Microbiology, 17.
August 2010
Akzeptiert 4/2010
"Genetic polymorphisms in the cytokine and chemokine system:
Their possible importance in allogeneic stem cell transplantation“
Juergen Loeffler, Michael Ok, Oliver C. Morton, Markus Mezger und
Hermann Einsele
Chemokines represent central players of the innate and adaptive
immunity and are involved in the regulation of inflammatory events
occurring during infectious complications or during graft vs. host disease
(GvHD). Patients after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) are
at a high risk for the development of acute GvHD or to suffer from fungal
infections. Susceptibility to fungal infections and the course of GvHD can
be genetically influenced by single nucleotide polymorphisms (SNPs),
which regulate expression or biological activity of chemokines, and
therefore have an impact on the outcome of invasive aspergillosis and
GvHD. High lightened studies of abetting factors for GvHD revealed SNPs
in TNFA, IL-6, IL-10, INF-γ, CCL2, CCL5 (RANTES), IL-1Ra, IL-23R, IL7Ralpha, IL-10RB, and CCR9 genes as prevalent considerable.
Furthermore, additional SNPs were described to be significantly
associated with fungal infections (Aspergillus fumigatus, Candida
albicans), including markers in CCL3, CCL4, CCL20, CXCL2, CXCL8,
104 | S e i t e
CXCL10, CCR1, and CCR2. This review summarizes the current knowledge
about the growing number of genetic markers in chemokine genes and
their relevance for patients after alloSCT.
Erschienen in: Current Topics in Microbiology and Immunology,
Nr. 341, S. 83-96
Akzeptiert 8/2009
"Immune responses of human immature dendritic cells can be
modulated by the recombinant Aspergillus fumigatus antigen
Aspf1“
Michael Ok, Jean Paul Latge´, Carina Baeuerlein, Frank Ebel, Markus
Mezger, Max Topp, Oliver Kurzai, Doreen Killian, Markus Kapp, GoetzUlrich Grigoleit, Helga Sennefelder, Javier Arroyo, Hermann Einsele und
Juergen Loeffler
Invasive aspergillosis is a significant cause of morbidity and mortality in
patients after stem cell transplantation, in solid organ transplant
recipients, and in patients with hematological malignancies. The
interactions between human immature dendritic cells (iDCs) and
Aspergillus fumigatus antigens are widely uncharacterized. We analyzed
the immune response of iDCs to different recombinant A. fumigatus
antigens (Aspf1 and Crf1). One of these antigens, the 18-kDa RNase
Aspf1, triggered the increased level of expression of genes encoding
proinflammatory cytokines and chemokines, and augmented the
activation of NF_B and the apoptosis of iDCs. Furthermore, by
fluorescence microscopy, we could demonstrate that in the first 3 h a
major portion of Aspf1 accumulates on the cell surface. Finally, we could
show an increased segregation of cytokines and chemokines after the
stimulation of iDCs by an Aspf1 deletion mutant strain of A. fumigatus.
Erschienen in: Clinical and Vaccine Immunology, Nr. 16, S. 14851492
105 | S e i t e
9.2 Präsentationen
10/2010
Poster Präsentationen beim internationalen Symposium 2010
der Graduate School of Life Sciences, Würzburg
„Supernatants of different A. fumigatus morphologies influence
platelet aggregation”
10/2010
Vortrag beim Meeting der European Science Foundation,
(Fuminomics), Paris in Frankreich
„Human innate immunity and Aspergillus fumigatus – Dendritic
cells and A. fumigatus antigens“
3/2010
Poster Präsentationen bei der European Group for Blood &
Marrow Transplantation, Wien in Österreich
„Interactions of human immature dendritic cells with defined
recombinant Aspergillus fumigatus antigens”
„Direct interaction of human NK cells with Aspergillus fumigatus
induces a Th1 immune response and provokes significant
fungal killing but not via their usual cytotoxic pathways”
12/2009
Poster Präsentation bei der American Society of Hematology,
New Orleans in den USA
„Human Natural Killer cells are able to kill Aspergillus fumigatus
but not via the perforin - granzyme pathway“
8/2009 & 10/2009
Vortrag bei der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, Göttingen & beim Meeting der European Science
Foundation, (Fuminomics), Nouan-le-Fuselier in Frankreich
„Characterization of the interaction between human immature
dendritic cells and the recombinant Aspergillus fumigatus
antigens Aspf1 and Crf1“
3/2008
Poster Präsentation bei der Deutsche Gesellschaft für
experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie,
Mainz
„Regulation of human platelet cyclic nucleotide levels experimental data and in silico modeling“
106 | S e i t e
Danksagung
Ich möchte hiermit ganz herzlich Prof. Hermann Einsele und PD Dr. Jürgen Löffler danken,
dass ich unter ihrer Leitung meine Doktorarbeit mit diesem interessanten und
anspruchsvollen Thema anfertigen durfte und sie mir dafür die Laborräume und Materialien
zur Verfügung gestellt haben. Zusätzlich bin ich sehr erfreut darüber, dass sich PD Dr. Jürgen
Löffler als Erstgutachter dieser Arbeit zur Verfügung gestellt und mich soweit es ihm möglich
war in meinen Zielen unterstützt hat.
Auch möchte ich mich bei Prof. Dr. Thomas Dandekar bedanken, dass er sich bereit erklärt
hat, der Zweitgutachter dieser Arbeit zu sein und darüber hinaus in der jungen Kooperation
im IZKF-Projekt A-127 mitzuwirken.
Bei der Versorgung sowohl mit rekombinanten Antigenen als auch mit verschiedenen
Aspergillus-Stämmen stand das Labor von Prof. Jean-Paul Latgé immer gern zur Verfügung.
Als native speaker leistete Oliver Morton gern Hilfe bei den verschiedenen Korrekturen der
eingereichten Manuskripte und war auch sonst bei Fragen mir gegenüber ein hilfreicher und
offener Kollege.
Auch gebührt meinem weiteren Kooperationspartnern Prof. Oliver Kurzai, PD Dr. Frank Ebel,
Allison McCormick, Prof. Dr. Max Topp, Claudia Stühler, PD Dr. Sven Krappmann, Anette
Schedler, Prof. Bernhard Nieswandt und Frauke May einen besonderen Dank für die große
Unterstützung während der verschiedenen Experimente.
Dem ganzen Labor in C11 verdanke ich eine schöne Zeit mit vielen sehr wertvollen
Erinnerungen. So waren die Mitglieder der Arbeitsgruppen von Dr. Ulrich Grigoleit, Prof. Ralf
Bargou und PD Dr. Ruth Seggewiss überaus sympathische Kollegen. In der AG Löffler danke
ich vor allem Markus Mezger, Maria Bouzani, Anna-Lena Schmitt und Tanja Breitschopf für
ihre Hilfe und auch dafür, dass die Arbeit durch sie noch mehr Spaß gemacht hat.
Eine moralische Stütze habe ich nach wie vor durch meine Eltern Gevriye und Nicmi Ok und
natürlich sind meine Brüder Dr. med. Sami Ok und Dipl.-Ing. Saliba Ok immer für mich da.
107 | S e i t e
Finanziell unterstützt wurde diese Arbeit durch
die Wilhelm Sander-Stiftung im Projekt „Analyse der angeborenen Immunantwort gegen
Aspergillus fumigatus“
das Bayerische Immuntherapie-Netzwerk (BayImmuNet) im Projekt „Entwicklung
immunologischer Ansätze zur Prävention und Therapie von Patienten mit Pilzinfektion
Aspergillus fumigatus nach Stammzelltransplantation“
die European Science Foundation (ESF) im Programm „Functional genomics in Aspergillus
fumigatus and new strategies to fight against the first fungal pathogen in Europe
(Fuminomics)”
das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung der Universität Würzburg (IZKF) im
Projekt A-127 „Hämostase und Invasive Aspergillose: Analyse von Wirt-PathogenInteraktionen“.
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Erklärung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Fakultät für Biologie an der Julius-Maximilians-Universität
Würzburg im Institut für Molekulare Infektionsimmunologie der Medizinischen Klinik und Poliklinik II
des Universitätsklinikums Würzburg angefertigt.
Hiermit erkläre ich, dass die Arbeit „Analyse der Interaktion und die gezielte Modifikation von
angeborener Immunantwort gegenüber Aspergillus fumigatus“ selbstständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen verwendet habe.
Ferner erkläre ich, dass diese Arbeit in keinem anderen Studiengang als Prüfungsleistung verwendet
wurde und ich mit Ausnahme des Titels Diplom-Biologe keine weiteren akademischen Grade
erworben oder zu erwerben versucht habe.
Würzburg, 2011
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Michael Ok
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