MS+fuer+Bachelor+Biogeochemie
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Massenspektrometrie http://masspec.scripps.edu/ Georg Pohnert 1 Massenspektren 100 55 Elektronenstoss-Ionisation 70 D 41 rel. Int. (%) Elektrospray-Ionisation D 83 O + 106 112 HOOC O100 rel. Int. (%) OH Cl 0 209 [M+H]+ 100 60 80 100 120 m/z 140 160 180 Massenspektrum: 2D-Darstellung in der relative Signalintensität gegen Masse / Ladungsverhältnis aufgetragen wird 50 0 40 148 150 140 180 m/z 220 260 2 Massenspektrometrie Untersuchungen zur elektrischen Leitfähigkeit von Gasen J.J. Thomson (Nobelpreis 1906) "At first there were very few who believed in the existence of these bodies smaller than atoms. I was even told long afterwards by a distinguished physicist who had been present at my [1897] lecture at the Royal Institution that he thought I had been 'pulling their legs." Bau des ersten Massenspektrometers (1910) womit die Trennung der Neon Isotope 20 und 22 gelang www.nobelprize.org 3 Thompson 1897, 1913 Auftrennung von Kathodenstrahlen (Elektronen) im elektrischen Feld 4 Thompson 1897, 1913 Auftrennung von Kathodenstrahlen (Elektronen) im elektrischen Feld Beobachtung von komplexeren Kanalstrahlen 5 Massenspektrometrie Francis William Aston (1877 - 1945) Cambridge University Nobel Preis in Chemie, 1922: "For his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the whole-number rule." Weist 212 natürlich auftretende Isotope nach www.nobelprize.org 6 Massenspektrometrie Wolfgang Paul (1913 - 1993) Universität Bonn und Hans Georg Dehmelt 1922University of Washington Nobel Preis in Physik, 1989 "For the development of the ion trap technique." www.nobelprize.org 7 Massenspektrometrie John B. Fenn *1917 Virginia Commonwealth University Elektrospray Ionisierung Koichi Tanaka *1959 Shimadzu Corporation, Japan MALDI Nobel Preis in Chemie 2002 "For the development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules." www.nobelprize.org 8 Instrumentierung 9 Massenspektrometrie Grundvoraussetzung: Gutes Vakuum Vorpumpe 10-4-10-9 Pa 10-1 Pa Turbomolekularpumpe http://masspec.scripps.edu/ 10 Massenspektrometer Schematische Darstellung einer EI Ionenquelle ... und so sieht sie aus 11 Ionisierungsenergie E = Energie, D = Dissoziationsenergie, r = Abstand (r0 im Grundzustand...) Linien: Schwingungsangeregte Zustände, IE = Ionisierungsenergie 12 Massenspektren 100 55 Elektronenstoss-Ionisation D 41 Cl rel. Int. (%) Bis jetzt: 70 D 83 106 112 0 rel. Int. (%) 100 40 209 [M+H]+ 60 80 100 120 m/z 148 150 140 160 180 OH 50 O + Elektrospray-Ionisation HOOC O 0 100 140 180 m/z 220 260 13 Fragmentierung 14 Fragmentierung 15 Fragmentierung H H H O H2C CH3O+ Mass: 31 H2O Mass: 18 H H H O C3H6+• Mass: 42 M=60 16 Kohlenwasserstoffe 17 Alkohole 18 Ester 19 Probeneinlass Direct Probe Insertion: Ohne Chromatographie oft Überlagerung von Signalen Einzige Trennung nach Flüchtigkeit durch Temperatur-Programm. 20 Probeneinlass Direct Probe Insertion: Ohne Chromatographie oft Überlagerung von Signalen 21 Probeneinlass Direct Probe Insertion: Massenspektren von verschiedenen Verbindungen überlagert 22 GC MS Vorgeschaltete Chromatographie erlaubt Auftrennung von Signalen 23 GC MS Zweidimensionales Chromatogramm wenn Totalionenstrom gemessen wird 24 GC MS Zweidimensionales Chromatogramm wenn Totalionenstrom gemessen wird 25 GC MS Massenspektren nach einfachem Abzug des Untergrundsignals 26 GC MS Massenspektren erlauben oft Bibliothekszuordnungen 27 GC MS Verfolgen der Ionenspur erlaubt selektive Detektion von Signalen m/z = 121 TIC 28 GC MS ... und deren Integration ohne aufwändige Peakdekonvolution TIC TIC SIM 29 HPLC Elektrospray MS 30 Isotopenmuster Die Massenspektren spiegeln das Isotopenverhältnis wieder 31 Halogenierte Verbindungen CH3Br CH2Br2 CHBr3 CBr4 32 Isotopenmuster Die höheren Signale werden mit zunehmender C-Zahl statistisch häufiger 33 Hochaufgelöste Massenspektrometrie Die Masse des Molekülions wurde zu 415,12111 u bestimmt. mass matching (automatisiert) ----------------------------------------------------------------------------------Mass Calculated ppm mmu Formula ----------------------------------------------------------------------------------415.12111 415.12134 0.5 0.2 H13.C13.N13.O4 415.12134 0.5 0.2 H19.C14.N6.O9 415.12085 -0.6 -0.3 H17.C28.N.O3 415.12003 -2.6 -1.1 H23.C13.N2.O13 415.12000 -2.7 -1.1 H17.C12.N9.O8 415.12000 -2.7 -1.1 H11.C11.N16.O3 415.12268 3.8 1.6 H9.C14.N17 415.12268 3.8 1.6 H15.C15.N10.O5 415.12268 3.8 1.6 H21.C16.N3.O10 34 Hochaufgelöste Massenspektrometrie 92.1 92.061 92.0626 92.0581 Auflösung von zusätzlichen Signalen kann zur Veränderung der gemessenen Masse führen 35 Kalibrierung in der Hochaufgelösten Massenspektrometrie z.B. Perfluorokerosin (PFK) 36 Isotopenverhältnis Massenspektrometrie Proben werden verbrannt, CO2 dann mit Gesteinsprobe oder Referenzgas verglichen 37 Isotopenverhältnis Massenspktrometrie Proben werden verbrannt, CO2 dann mit Gesteinsprobe oder Referenzgas verglichen 38 Isotopenverhältnis Massenspktrometrie 39 Isotopenverhältnis Massenspktrometrie OH Echtheitsbestimmung von Vanillin Bedarf 12.000 t pa Produktion aus Vanilleschoten 40 t pa OCH 3 CHO Herkunft Vanilleschote Eugenol Guajacol Lignin (Holz) δ13C[‰]V-PDB -16.8 to -21.5 -29.9 to -31.7 -24.9 to -36.2 -26.5 to -28.7 40 Isotopenverhältnis Massenspktrometrie Floyd Landis Testosteron Test epi Testosteron T/E > 6 Verdachtsmoment 41 Isotopenverhältnis Massenspktrometrie 42 Isotopenverhältnis Massenspktrometrie Floyd Landis Testosteron Test Vergleich der Isotoensignatur Cholesterol/Testosteron 43 Untersuchung der Zugvogelwanderung Hobson and Wassenaar, Oecologia, 1997, 109, pp 142ff 44 Untersuchung der Zugvogelwanderung 45 Instrumentierung 46 Detektoren Elektronenvervielfacher (Electron Multiplier) Sekundärelektronenvervielfacher (SEM) + + + 47 Detektoren Elektronenvervielfacher (Electron Multiplier) Kanalelektronenvervielfacher (CEM) 48 Detektoren MCP (Multichannel plate) Ionen Glaskapillaren mit ca. 20 μm Durchmesser. Beschichtet mit Elektronen emittierender Schicht Ein Ion generiert ca. 1000 Elektronen. Pro Kanal kann ein Ion detektiert werden: Simultan mehrere Ionen detektierbar. Der Kanal kann lokalisiert werden, was auch eine örtliche Auflösung erlaubt. 49 Detektoren Ionen 50 Instrumentierung 51 Massenanalysatoren •Sektorfeld •Quadrupol Massenfilter •Ionenfalle •Flugzeitbestimmung •Registrierung der Umlauffrequenz der Ionen in einer Ionencyclotronresonanz-Zelle •Orbitrap 52 Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS Flugröhre der Ionen 53 Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS 54 Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS m3 m1+ + B senkrecht zur Tafelebene + m2 m1<m2<m3 55 Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS + Ionen der selben m/z werden focussiert 56 Ionen im radialen elektrostatischen Feld + Elektrostatischer Sektor: erlaubt nur Ionen mit definierter Ekin die Passage durch den Auslassspalt 57 Doppeltfokussierendes Sektorfeld-MS 58 Quadropol Massenanalysator 59 Quadropol Massenanalysator 60 Betrieb von Quadropol Massenanalysatoren • ca. 1-2 cm Seitenlänge •15-25 cm Länge •Radiofrequenz 1-4 MHz •DC und RF Spannungen 100-1000 V Optimum: Ionen von ca. 10 eV mit 100 Schwingungen während der gesamten Passage 61 Ionenfallen http://www.mpq.mpg.de/mpq-events/2001-open-door/atomuhr.html 62 Flugzeit MS (time of flight TOF MS) Charakteristisch: lange Flugröhren 63 Flugzeit MS (time of flight TOF MS) Beschleunigung potenzialfreier Drift 64 Flugzeit MS (time of flight TOF MS) Immunoglobulin Massenbereich nach oben praktisch keine Grenzen gesetzt, Auflösung wird aber schlechter 65 Flugzeit MS (time of flight TOF MS) 1 GHz 0.1 GHz Auswirkung der Geschwindigkeit des analog to digital converters (ADC) auf die Auflösung 4 GHz Frequenz (8 bit ADC) ist Standard 66 Lineare TOF Instrumente Immunoglobulin Immer Verteilung von Energien 67 Reflektor TOF Reflektor Modus verlängert den Flugweg 68 Lineare TOF Reflektor TOF Bei zwei Ionen gleicher Masse wird durch den Reflektor in zeitlich fokussiert 69 Weitere Verbesserung der Auflösung Besseres Vakuum führt zu grösseren mittleren freien Weglängen Maximal eine Verbesserung um ca. Faktor 2 möglich 70 Fourier-Transformation-Ionen Zyclotron Resonanz (FT ICR MS) Beste Auflösung und Massengenauigkeit Vielseitig, Teuer 71 Fourier-Transformation-Ionen Zyclotron Resonanz (FT ICR MS) a) Radius von Ionenbewegung im Magnetfeld ist Funktion der Geschwindikeit aber Frequenz ist unabhängig b) bei Resonanz mit externem RF Feld gewinnt Teilchen Energie und r wird grösser. RF ~ 72 Fourier-Transformation-Ionen Zyclotron Resonanz (FT ICR MS) 73 Fourier-Transformation-Ionen Zyclotron Resonanz (FT ICR MS) 74 Matrix unterstützte Laserdesorptions ionisation MALDI 75 MALDI Laserpulse führen zur Entlassung von Ionenpaketen. Durch Umpolung des Feldes auch negativ geladene Ionen erfassbar Lottspeich / Zorbas Bioanalytik, Spektrum Verlag 76 MALDI MALDI-TOF-Spektrum eines monoklonalen Antikörpers 77 Probenvorbereitung MALDI Target Kristalle 78 Wichtige Matrixsubstanzen für MALDI 79 MALDI MS Anwendung Bacillus anthracis Bacillus thuringiensis Bacillus cereus Bacillus subtilis Fingerprinting von verschiedenen Bakterienstämmen 80 PSD MALDI MS Sequenzierung Angiotensinogen (DRVYIHPFHLLVYS) ([M+H]+ = 1758.9) 81 PSD MALDI MS Sequenzierung 82 Elektrospray MS Verdampfung 83 Elektrospray MS Tropfengrösse [μm] und durchschnittliche Ladungszahl auf Tropfen 84 Elektrospray MS 85 Nano Elektrospray MS Empfindlich: Sequenzierung von 800 fmol Keratin 5 μm 86 Elektrospray MS Neurotensin (Peptid) 87 Elektrospray MS Protease LA 88
