Massenspektrometrie

Massenspektrometrie
http://masspec.scripps.edu/
Georg Pohnert
1
100
55
Elektronenstoss-Ionisation
70
D
41
Cl
rel. Int. (%)
Elektrospray-Ionisation
D
83
O
+
106
112
HOOC
O100
rel. Int. (%)
OH
Massenspektren
0
209 [M+H]+
100
60
80
100
120
m/z
140
160
180
Massenspektrum: 2D-Darstellung in der
relative Signalintensität gegen Masse /
Ladungsverhältnis aufgetragen wird
50
0
40
148
150
140
180
m/z
220
260
2
Massenspektrometrie
Untersuchungen zur elektrischen Leitfähigkeit von Gasen
J.J. Thomson
(Nobelpreis 1906)
"At first there were very few who
believed in the existence of these bodies
smaller than atoms. I was even told long
afterwards by a distinguished physicist
who had been present at my [1897]
lecture at the Royal Institution that he
thought I had been pulling their legs."
Bau des ersten Massenspektrometers (1910) womit die
Trennung der Neon Isotope 20 und 22 gelang
www.nobelprize.org
3
Thompson 1897, 1913
Auftrennung von Kathodenstrahlen
(Elektronen) im elektrischen Feld
4
Thompson 1897, 1913
Auftrennung von Kathodenstrahlen
(Elektronen) im elektrischen Feld
Beobachtung von
komplexeren
Kanalstrahlen
5
Massenspektrometrie
Francis William Aston
(1877 - 1945)
Cambridge University
Nobelpreis in Chemie, 1922:
"For his discovery, by means of his mass spectrograph, of
isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for
his enunciation of the whole-number rule."
Weist 212 natürlich auftretende Isotope nach
www.nobelprize.org
6
Massenspektrometrie
Grundvoraussetzung: Gutes Vakuum
Vorpumpe
10-4-10-9 Pa
10-1 Pa
Turbomolekularpumpe
http://masspec.scripps.edu/
7
Massenspektrometrie
Einlass: z.B. Vakuumschleuse
Gross, Mass Spectrometry
8
Ionenquelle
ca. 5-10 cm
9
Ionisierungsenergie
E = Energie, D = Dissoziationsenergie, r = Bindungslängen (r0 im Grundzustand...)
Linien: Schwingungsangeregte Zustände, IE = Ionisierungsenergie
10
Ionisierungsenergie
11
Ionisierungsenergie
12
Ionisierungsenergie
13
Ionisierungsenergie
14
Fragmentierung
15
Massenspektren
Elektronenstoss-Ionisation
100
55
D
70
Cl
41
rel. Int. (%)
D
Bis jetzt:
83
106
148
112
150
0
60
80
100
120
140
160
180
m/z
16
Fragmentierung
E = Energie, D = Dissotiationsenergie, r = Abstand (r0 im Grundzustand...)
Linien: Schwingungsangeregte Zustände, IE = Ionisierungsenergie
17
Fragmentierung
18
Fragmentierung
.
.
.
.
19
Fragmentierung
H
H
H
O
H2C
CH3O+
Mass: 31
H2O Mass: 18
H
H
H
O
C3H6+•
Mass: 42
H
H
OH
M=60
20
Ionisierung
Formel
Bindungslängen
Ladungsverteilung
Die Geometrie ist verzerrt und die Ladung nicht an der Stelle lokalisiert, die
man vom Formelbild aus erwartet
21
Zeitskala der Massenspektrometrie
22
Terminologie
Elektronenstoss-Ionisation
100
55
D
70
Cl
41
rel. Int. (%)
D
Molekülion
83
106
148
112
150
0
60
80
100
120
140
160
180
m/z
23
Terminologie
Elektronenstoss-Ionisation
100
55
Basispeak
70
D
Cl
41
rel. Int. (%)
D
Molekülion
83
106
148
112
150
0
60
80
100
120
140
160
180
m/z
24
Terminologie
Fragmentionen
100
55
Basispeak
70
D
Cl
41
rel. Int. (%)
D
Molekülion
83
106
148
112
150
0
60
80
100
120
140
160
180
m/z
25
Fragmentierung
3/26
Bruch einer Sigmabindung
27
MS von Aceton
28
MS von Butanon
29
MS von N-Ethyl-N-methylpropanamin
30
MS von Propylbenzen
31
MS von Alkanen
32
MS von Alkanen
33
Mc Lafferty Umlagerung
34
Isotopenmuster
Die Massenspektren spiegeln das Isotopenverhältnis wieder
35
Halogenierte Verbindungen
CH3Br
CH2Br2
CHBr3
CBr4
36
Isotopenverteilung
C5
C20
C60
C90
C120
Bei grösseren Molekülen kann selbst mit 1.1% statistischer Wahrscheinlichkeit
des Auftretens eines 13C das schwerere Isotop dominieren
37
Bei abnormal hohen M+2 Verdacht auf S oder Si
32S
= 100 %
33S = 0.79%
34S = 4.43%
38
Komplexe Verbindungen können überprüft aber selten
modelliert werden
39
Web basierte Werkzeuge in der MS
z.B. Isotopenverteilungsberechnung:
http://www2.sisweb.com/mstools/isotope.htm
40
Web basierte Werkzeuge in der MS
http://www.sisweb.com/referenc/tools/exactmass.htm
41
Hochaufgelöste Massenspektrometrie
Die Masse des Molekülions wurde zu 415,12111 u bestimmt.
mass matching (automatisiert)
----------------------------------------------------------------------------------Mass
Calculated ppm mmu Formula
----------------------------------------------------------------------------------415.12111
415.12134 0.5 0.2
H13.C13.N13.O4
415.12134 0.5 0.2
H19.C14.N6.O9
415.12085 -0.6 -0.3
H17.C28.N.O3
415.12003 -2.6 -1.1
H23.C13.N2.O13
415.12000 -2.7 -1.1
H17.C12.N9.O8
415.12000 -2.7 -1.1
H11.C11.N16.O3
415.12268 3.8 1.6
H9.C14.N17
415.12268 3.8 1.6
H15.C15.N10.O5
415.12268 3.8 1.6
H21.C16.N3.O10
42
Hochaufgelöste Massenspektrometrie
92.1
92.061
92.0626
92.0581
Auflösung von zusätzlichen Signalen kann zur Veränderung der gemessenen Masse
führen
43
Kalibrierung in der Hochaufgelösten
Massenspektrometrie
z.B. Perfluorokerosin (PFK)
44
HEUTE 17.15 UHR Hörsaal IAAC
45
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
Proben werden verbrannt, CO2 dann mit Gesteinsprobe oder Referenzgas verglichen
46
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
47
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
Proben werden verbrannt, CO2 dann mit Gesteinsprobe oder Referenzgas verglichen
48
Normierung zu Pee Dee Belemnite
Fossil aus North Carolina (Pee
Dee) mit höherem 13C/12C
Verhältnis als andere
Stoffe
The isotope ratio mass spectrometer was calibrated against CO2 gas with a defined
13C/12C content relative to the PDB standard, defined as the 13C/12C isotope ratio of
CO2 gas, yielded by the reaction of Belemnitilla americana from the Peedee formation
of South Carolina with 100% phosphoric acid.
49
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
OH
Echtheitsbestimmung von Vanillin
Bedarf 12.000 t pa
Produktion aus Vanilleschoten 40 t pa
OCH 3
CHO
50
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
Floyd Landis Testosteron Test
epi
Testosteron
T/E > 6 Verdachtsmoment
51
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
52
Isotopenverhältnis Massenspktrometrie
Floyd Landis Testosteron Test
Vergleich der Isotoensignatur
Cholesterol/Testosteron
53
Untersuchung der Zugvogelwanderung
Hobson and Wassenaar, Oecologia, 1997, 109, pp 142ff
54
Untersuchung der Zugvogelwanderung
55
Chemische Ionisation
Bei Problemen der Stabilität der Analyten: Fragmentierung
dominiert, M+. nicht erkennbar
Munson, M.S.B.; Field, F.H. J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 2621-2630.
3/56
Chemische Ionisation
3/57
Chemische Ionisation
C2H5+
C3H5+
3/58
Chemische Ionisation
Charakteristisch: Verlust von neutralen Fragmenten
3/59
Instrumentierung
2/60
Detektoren
Elektronenvervielfacher (Electron Multiplier)
Sekundärelektronenvervielfacher (SEM)
+ +
+
2/61
Detektoren: Kanalelektronenvervielfacher (CEM)
2/62
Instrumentierung
2/63
Massenanalysatoren
•Sektorfeld
•Quadrupol Massenfilter
•Ionenfalle
•Flugzeitbestimmung
•Registrierung der Umlauffrequenz der Ionen in einer
Ionencyclotronresonanz-Zelle
•Orbitrap
2/64
Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS
Flugröhre
der Ionen
2/65
Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS
2/66
Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS
m3
m1 +
+
B senkrecht zur
Tafelebene
+
m2
m1<m2<m3
2/67
Einfachfokussierendes Sektorfeld-MS
+
Ionen der
selben m/z
werden
focussiert
2/68
Quadropol Massenanalysator
2/69
Quadropol Massenanalysator
2/70
Betrieb von Quadropol Massenanalysatoren
• ca. 1-2 cm Seitenlänge
• 5-25 cm Länge
•Radiofrequenz 1-4 MHz
•DC und RF Spannungen 100-1000 V
Optimum: Ionen von ca. 10 eV mit 100 Schwingungen während der gesamten Passage
2/72
Massenspektrometrie
Wolfgang Paul
(1913 - 1993)
Universität Bonn
und
Hans Georg Dehmelt
1922University of Washington
Nobelpreis in Physik, 1989
"For the development of the ion trap technique."
www.nobelprize.org
73
Ionenfallen
2/74
Ionenfallen: Massenselektiver Instabilitätsmodus
2/75
Ionenfallen: Massenselektiver Instabilitätsmodus
2/77
Ionenfallen: Isolierung eines Ions
Möglichkeit I
Zusätzlich zum RF Anteil noch
Gleichspannungsanteil
Möglichkeit II
Zuerst umgekehrte Scanweise,
um schwere Ionen in
Instabilitätsbereich zu senden
Dann leichte Ionen entfernen
Ion bestimmter Masse isoliert
Anal. Biochem. 1997, 244, 1-15
2/79
Ionenfallen: Komplexe Experimente
2/80
Ionenfallen: Komplexe Experimente
2/81
Massenspektrometrie
John B. Fenn
*1917- 2010
Virginia Commonwealth University
Elektrospray Ionisierung
Koichi Tanaka
*1959
Shimadzu Corporation, Japan
MALDI
Nobelpreis in Chemie 2002
"For the development of soft desorption ionisation
methods for mass spectrometric analyses of biological
macromolecules."
www.nobelprize.org
82
Flugzeit MS (time of flight TOF MS)
Charakteristisch: lange Flugröhren
2/83
Flugzeit MS (time of flight TOF MS)
Beschleunigung
potenzialfreier Drift
2/84
Flugzeit MS (time of flight TOF MS)
Immunoglobulin
Massenbereich nach oben praktisch keine Grenzen gesetzt,
Auflösung wird aber schlechter
2/85
Flugzeit MS (time of flight TOF MS)
1 GHz
0.1 GHz
Auswirkung der Geschwindigkeit des analog to digital converters (ADC) auf
die Auflösung
4 GHz Frequenz (8 bit ADC) ist Standard
2/86
Lineare TOF Instrumente
Immunoglobulin
Immer Verteilung von Energien
2/87
Lineare TOF
Reflektor TOF
Zwei Ionen gleicher Masse werden durch den Reflektor zeitlich fokussiert
2/89
Weitere Verbesserung der Auflösung
Besseres Vakuum führt zu grösseren mittleren freien Weglängen
Maximal eine Verbesserung um ca. Faktor 2 möglich
2/90
Instrumentierung
2/91
Matrix unterstützte Laserdesorptions ionisation
MALDI
3/92
MALDI
75.000
50.000
150.000
300.000
MALDI-TOF-Spektrum eines monoklonalen Antikörpers
3/93
MALDI MS Instrumentierung
3/94
MALDI
Laserpulse führen zur Entlassung
von Ionenpaketen.
Durch Umpolung des Feldes auch
negativ geladene Ionen erfassbar
Lottspeich / Zorbas Bioanalytik, Spektrum Verlag
3/95
MALDI
3/96
MALDI
Der Laserpuls sollte gut fokussiert sein und den Analyten treffen (linkes
Spektrum)
Zu grosse Flächen führen zu Empfindlichkeitsverlust
Lottspeich / Zorbas Bioanalytik, Spektrum Verlag
3/97
Probenvorbereitung MALDI
Target
Kristalle
3/98
Probenvorbereitung MALDI
3/99
Wichtige Matrixsubstanzen für MALDI
3/100
Matrixauswahl für MALDI
Ribonuclease B in verschiedenen Matrices
OFT EMPIRISCH
3/101
MALDI MS Anwendung
Monomer M = 104
Polymercharakterisierung
3/102
MALDI MS Anwendung
Polyamid 6: Bei hinreichend grosser Auflösung ist der Anteil der
Lactambildung erkennbar
3/103
MALDI MS-basierte bildgebende Verfahren
3/104
MALDI MS-basierte bildgebende Verfahren
Proteinverteilung im Gehirn
3/105
MALDI MS-basierte bildgebende Verfahren
MALDI Imaging von Peptiden im Blutegel Embryo
3/106
Elektrospray MS
Verdampfung
3/108
Elektrospray MS
3/109
Elektrospray MS
Tropfengrösse R [µm] und durchschnittliche Ladungszahl auf Tropfen
3/110
Elektrospray MS
3/111
Nano Elektrospray MS
Empfindlich: Sequenzierung von
800 fmol Keratin
5 µm
3/112
Elektrospray Quadrupol MS
3/113
Elektrospray TOF MS
3/114
Elektrospray MS
Neurotensin (Peptid)
3/116
Elektrospray MS
Neurotensin (Peptid)
3/117
Probeneinlass
Direct Probe Insertion: Ohne Chromatographie oft Überlagerung von Signalen
Einzige Trennung nach Flüchtigkeit
durch Temperatur-Programm.
3/118
Probeneinlass
Direct Probe Insertion: Ohne Chromatographie oft Überlagerung von Signalen
3/119
Probeneinlass
Direct Probe Insertion: Massenspektren von verschiedenen Verbindungen überlagert
3/120
Probeneinlass
Direct Probe Insertion: Massenspektren nach Abzug von Untergrundsignalen verfälscht
3/121
GC MS
Vorgeschaltete Chromatographie erlaubt Auftrennung von Signalen
3/122
GC MS
Zweidimensionales Chromatogramm wenn Totalionenstrom gemessen wird
3/123
GC MS
Zweidimensionales Chromatogramm wenn Totalionenstrom gemessen wird
3/124
GC MS
Massenspektren nach einfachem Abzug des Untergrundsignals
3/125
GC MS
Massenspektren erlauben oft Bibliothekszuordnungen
3/126
GC MS
Verfolgen der Ionenspur erlaubt selektive Detektion von Signalen
Total Ion Scan
TIC
m/z
= 122
Single
Ion Monitoring
3/127
GC MS
... und deren Integration ohne aufwändige Peakdekonvolution
TIC
3/128
HPLC Elektrospray MS
HPLC/MS (Splitter)
Nano LC/MS
3/129
HPLC Elektrospray MS
3/130
Fourier-Transformation-Ionen Zyclotron Resonanz
(FT ICR MS)
Beste Auflösung und Massengenauigkeit
Vielseitig, Teuer, heute bis zu 15 Tesla Magnet
2/131
Orbitrap
Quadrulogarithmische
Potenzialverteilung
In der Ionenfalle zentrale, spindelförmige Elektrode.
Ionen werden radial zu dieser Elektrode in die Orbitrap hineingeschossen und
bewegen sich aufgrund der elektrostatischen Anziehung auf Kreisbahnen.
Die Frequenz der Ionenbewegung erzeugt in Detektorplatten Signale dann FT
zum Massenspektrum.
Ähnlich FT-ICR-MS aber mit einem elektrostatischen Magnetfeld.
Massenauflösung ähnlich 7 Tesla FT-ICR Gerät.
2/132
Massenanalysatoren
R>70.000 (Standard 1000), Massenbereich 2000-5000
amu, langsam (5 scans s-1) sperrige Instrumente
•Sektorfeld
•Quadrupol Massenfilter
Nominalmassenauflösung, Massenbereich 6002000 amu, schnell, gute Quantifizierung, billige
Instrumente
•Ionenfalle
Nominalmassenauflösung, Massenbereich 6002000 amu, schnell, schlechte Quantifizierung,
eingeschränkte Bibliothekssuche, flexible
Experimente, billige Instrumente
•Flugzeitbestimmung
Hochauflösung, Massenbereich 107 amu...,
schnell, eingeschränkte Quantifizierung, mittlere
Preiskategorie
•ICR MS
Höchste Auflösung, sehr Empfindlich, hoher
dynamischer Bereich, hohe Massen, schnell, sehr
teuer
•Orbitrap
R 200.000, Massenbereich bis 50.000, sehr
Empfindlich, schnell, teuer
2/133