DISS. ETH NO. 22814 A thesis submitted to - ETH E

DISS. ETH NO. 22814
CHARACTERIZATION OF FOXA1 IN DEVELOPMENT AND FUNCTION OF
THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
EMANUEL GASSER
Mag. rer. nat., Universität Wien
born on 09.06.1985
citizen of Austria and Italy
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Markus Stoffel
Prof. Dr. Christian Wolfrum
Prof. Dr. Sebastian Jessberger
2015
A BSTRACT Abstract
Foxa1 belongs to the forkhead family of winged-helix transcription factors. Mice
homozygous for a null mutation in Foxa1 display severe metabolic defects that culminate
in neonatal mortality within the first two weeks of life. Defects include an abnormal
feeding behavior and progressive starvation, as well as hypoglycemia and a decreased
pancreatic glucagon content. Conditional deletions of Foxa1 in various peripheral organs,
as well as the dopaminergic system have not reproduced the drastic phenotype of the
Foxa1 null model, a fact that has been attributed mainly to the extensive overlap in tissue
distribution and functional repertoire of Foxa1 and Foxa2.
The present study focuses on the role of Foxa1 in the developing central nervous system
and the ramifications of its absence from differentiated neurons on a molecular and
organismal level. To this end a BAC transgenic Foxa1/eGFP reporter mouse was created,
allowing the characterization of Foxa1 expressing brain nuclei and the isolation of the
respective neuronal populations from newborn mice by flow-cytometry. By applying this
strategy, Foxa1 was found to be prominently expressed in the subthalamic nucleus, the
supramammillary nuclei and the ventral premammillary nucleus in addition to the
already established presence in the ventral tegmental area. Unlike the dopaminergic
midbrain, where Foxa1 and Foxa2 are co-expressed, no Foxa2 was detected in the
subthalamic nucleus and the ventral premammillary nucleus. The significance of these
findings was emphasized by the apparent failure of Foxa1 null mice to develop the
subthalamic nucleus. Similarly, clear deficits in the formation of the mammillary region
were evident in Foxa1 null mice.
In a parallel approach the relevance of Foxa1 for the functional integrity of the
subthalamic nucleus and the ventral premammillary nucleus during later developmental
stages and adulthood was investigated. The subthalamic nucleus is a key component of
the basal ganglia circuitry, where it suppresses the occurrence of unintended motor
programs. Perturbations in the signal propagation through the subthalamic nucleus are
associated with the manifestation of dyskinesias like Parkinson disease, Huntington
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A BSTRACT disease and hemibalism. Concordant with the movement antagonizing function of the
subthalamic nucleus, Synapsin1-Cre-mediated deletion of Foxa1 in postmitotic neurons
induced hyperlocomotion in adult mice, indicating a functional deficit within the
subthalamic entity following Foxa1 ablation. The existence of such a deficit was
corroborated by the findings that deletion of Foxa1 from subthalamic neurons results in
the reduction of their number either during the postnatal, or the adult period. Moreover,
transcriptional profiling of Foxa1 deficient, subthalamic neurons, revealed major
deregulations in the expression of mitochondrial and synaptic genes, further underlining
the insulted state of the affected neurons.
The ventral premammillary nucleus is essential for conveying the permissive signals of
leptin for the onset of puberty to the neuronal components of the hypothalamuspituitary-gonadal (HPG) axis. Puberty is only initiated if the body is equipped with
sufficient energy stores to sustain the development and survival of the potential offspring.
In this context, leptin modulates the HPG axis via the neurons of the ventral
premammillary nucleus. Strikingly, neuronal deletion of Foxa1 by Synapsin1-Cre, led to
the loss of the ventral premammillary nucleus and this loss was already evident in
newborn mice. At the same time, the timing of puberty and the overall fertility of Foxa1
knock-out mice remained unaffected. Nonetheless, this constitutes the first described
genetic model where the ventral premammillary nucleus is absent and as such it could
facilitate the study of the interactions between leptin and the HPG axis.
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Z USAMMENFASSUNG Zusammenfassung
Foxa1 gehört zur Familie der sogenannten Forkhead-Transkriptionsfaktoren. Foxa1
knock-out Mäuse weisen schwere metabolische Störungen auf und sterben infolgedessen
innerhalb von wenigen Tagen nach der Geburt. Die festgestellten Störungen umfassen
unter anderem ein beeinträchtigtes Essverhalten, Hypoglykämie sowie eine verminderte
Glukagonproduktion der Bauchspeicheldrüse. Die gewebespezifische Gendeletion von
Foxa1 in diversen peripheren Organen, sowie in dopaminergen Neuronen führen nicht
zu dem selben drastischen Ausgang wie beim globalen knock-out Model. Das wird vor
allem auf das überlappende funktionelle Repertoire und Expressionsprofil der beiden
Transkriptionsfaktoren Foxa1 und Foxa2 zurückgeführt.
Die vorliegene Studie konzentriert sich auf die Funktion von Foxa1 während der
Entwicklung des zentralen Nervensystems und beleuchtet ferner die Auswirkungen die
ein Abschalten des Gens in differenzierten Neuronen auf moleklularer und OrganismusEbene nach sich ziehen. Zu diesem Zweck wurde eine BAC transgene Foxa1/eGFP
Reportermaus generiert, wobei die Expression des Reportergens unter der Kontrolle der
genomischen Transkriptions-regulierenden Sequenzen des Foxa1 Gens steht. Dadurch
wurde das Charakterisieren der Foxa1 exprimierenden Gehirnregionen und das Isolieren
der entsprechenden Neuronen aus neugeborenen Mäusen ermöglicht. Über diese
Herangehensweise konnte etabliert werden, dass Foxa1 vor allem im subthalamischen
Nukleus, den supramammillaren Nuklei, dem ventralen premammillaren Nukleus und
dem ventralen Tegmentum exprimiert ist. Anders als im dopaminergen System und, mit
Einschränkungen, in den supramammillaren Nuklei, wo auch Foxa2 vorhanden ist,
konnten im subthalamischen Nukleus und im ventralen premammillaren Nukleus
lediglich Foxa1 detektiert werden. Die Bedeutung dieser Beobachtung wurde durch die
Erkenntnis verstärkt, dass Foxa1 knock-out Mäuse keinen subthalamischen Nukleus
ausbilden. Ferner wurden bei Foxa1 knock-out Mäusen klare Abweichungen in der
Ausbildungen der Mammillarkörper attestiert.
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Z USAMMENFASSUNG Parallel dazu wurde die Funktion von Foxa1 in den Neuronen des subthalamischen
Nukleus und des ventralen premammillaren Nukleus im späten Entwicklungsstadium
und im Erwachsennestadium untersucht.
Der subthalamische Nukleus ist Teil der Basalganlien, wo er das Auftreten
unerwünschter Bewegnungprogramme unterdrückt. Funktionelle Störungen des
subthalamischen Nukleus führen zu Bewegungsstörungen, wie sie bei Parkinson, Chorea
Huntington und Hemiballismus zu beobachten sind. Übereinstimmend mit der
Bewegungs-unterdrückenden Funktion des subthalamischen Nukleus, zeigen Mäuse, bei
denen Foxa1 mittels der Synapsin1-Cre Rekombinase in post-mitotischen Neuronen
deletiert wurde, ein hyperaktives Bewegungsmuster. Gleichzeitig wurde bei diesen
Mäusen auch eine geringere Anzahl von subthalamischen Neuronen vorgefunden, und
der Verlust selbiger wurde zeitlich auf die postnatale bzw. adulte Periode eingeschränkt.
Die Genexpressionsanalyse der Foxa1 defizienten subthalamischen Neuronen hat
ausserdem eine beträchtliche Deregulation von mitochondrialen und synaptischen Genen
zum Vorschein gebracht, was auch auf eine funktionelle Beeinträchtigung der
betroffenen Neuronen hinweist.
Der ventrale premammillare Nukleus spielt im Zuge der pubertären Entwicklung eine
wesentliche Role in der Übertragung der Leptin permissiven Signale auf die
Hypothalamus-Hypophyse-Gonaden (HPG) Achse. Die Pubertät wird normalerweise
erst dann eingeleitet, wenn der Körper über ausreichend Fettreserven verfügt um das
Heranwachsen und Überleben des Nachwuchses zu gewährleisten. In diesem
Zusammenhang verfügt Leptin über eine modulierende Funktion, die über Neuronen
des ventralen premammillaren Nukleus an die Neuronen der HPG Achse weitergegeben
wird. Die Deletion von Foxa1 durch Synapsin1-Cre bewirkte überraschenderweise, dass
die betroffenen Mäuse ohne den ventralen premammillaren Nukleus geboren werden.
Das Eintreten der Pubertät, sowie die Fertilität der Mäuse blieb allerdings wider
Erwarten unbeeinträchtigt. Nichtsdetsotrotz stellt dies das erste genetische Model dar, in
dem der ventrale premammillare Nukleus fehlt und könnte somit Studien erleichtern, die
die Auswirkungen von Leptin auf die HPG Achse zum Inhalt haben.
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