Verwendete Kits - kups

Methylierung
als molekularbiologischer
Marker zur
Lungenkarzinom-Diagnostik
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Universität zu Köln
vorgelegt von Viola Schmiemann
Köln 2005
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. R. Jürgen Dohmen,
Institut für Genetik, Universität zu Köln
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. Brigitte Royer-Pokora,
Institut für Humangenetik,
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Der experimentelle Teil dieser Arbeit wurde am
Institut für Cytopathologie,
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf mit Betreuung durch
Prof. Dr. A. Böcking und Dr. med. H. J. Grote durchgeführt.
Tag der mündlichen Prüfung: 25.04.2005
Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................. 1
Abstract............................................................................................................................. 5
1. Einleitung...................................................................................................................... 6
1.1 DNA-Methylierung als epigenetische Veränderung................................................... 6
1.2 Funktion der DNA-Methylierung ............................................................................... 7
1.3 Veränderung der Methylierungsmuster bei klinischen Syndromen ........................... 9
1.4 Veränderung der DNA Methylierungsmuster in Tumoren....................................... 10
1.5 Das Lungenkarzinom................................................................................................ 11
1.5.1 Lungenkarzinom-Diagnostik........................................................................ 12
1.5.2 Molekularbiologische Veränderungen des Lungenkarzinoms ..................... 13
1.5.3 Promotor-Methylierung an histologischem Material der Lunge.................. 14
1.5.4 Promotor-Methylierung an zytologischem Material der Lunge................... 16
1.6 Biomarker zur Diagnose von Lungenkarzinomen .................................................... 17
1.6.1 Besonderheiten der molekularen Zytopathologie......................................... 18
1.6.2 Mutationen als Biomarker ............................................................................ 18
1.6.3 Chromosomenaberrationen als Biomarker................................................... 19
1.6.4 Aberrante Promotor-Methylierung als Biomarker ....................................... 19
1.7 Ziel der Arbeit........................................................................................................... 20
2. Material und Methoden............................................................................................... 21
2.1 Humane Zellinien und ihre Kultivierung.................................................................. 21
2.2 Bronchialsekrete, Sputen und Formalin-fixiertes Gewebe ....................................... 22
2.2.1 Verarbeitung und Quantifizierung von Tumorzellen in Bronchialsekreten 22
2.2.2 Sputen........................................................................................................... 22
2.2.3 Gewebe......................................................................................................... 22
2.3 Verwendeten Kollektive ........................................................................................... 23
2.3.1 Fall-Kontroll-Studien Kollektiv ................................................................... 23
2.3.2 Kohorten-Studien Kollektiv ......................................................................... 24
2.3.3 Sputen Kollektiv........................................................................................... 26
2.3.4 Formalin-fixiertes Gewebe Kollektiv........................................................... 26
2.4 Vektoren.................................................................................................................... 26
Inhaltsverzeichnis
2
2.5 Bakterien................................................................................................................... 26
2.5.1 Bakterienstämme und ihre Anzucht ............................................................. 26
2.5.2 Transformation kompetenter One Shot INVαF´ Zellen ............................... 26
2.6 Chemikalien .............................................................................................................. 27
2.7 Enzyme ..................................................................................................................... 27
2.8 Antikörper................................................................................................................. 28
2.9 Molekularbiologische Kits........................................................................................ 28
2.10 Medien, Puffer und Lösungen ................................................................................ 28
2.10.1 Medien zur Anzucht von Zellkulturzellinien ............................................. 28
2.10.2 Medien zur Anzucht von E. coli-Zellen ..................................................... 28
2.10.3 Lösungen für DNA Extraktion ................................................................... 29
2.10.4 Lösungen für Elektrophoresen ................................................................... 29
2.10.5 Lösungen für Immunzytochemie und -histochemie................................... 29
2.10.6 Lösungen für Feulgen-Färbung .................................................................. 30
2.11 Geräte, Apparaturen, sonstiges Material................................................................. 30
2.12 Software .................................................................................................................. 31
2.13 Sequenzen ............................................................................................................... 31
2.13.1 Oligonukleotide für DNA-Extraktions Studie............................................ 31
2.13.2 Oligonukleotide für Promotor Methylierungs-Nachweis mittels QMSP ... 32
2.13.3 Oligonukleotide für die Klonierung von Promotorfragmenten.................. 33
2.13.4 Oligonukleotide für die Sequenzierung...................................................... 33
2.14 Mikrodissektion an histologischem Material.......................................................... 33
2.15 Isolierung von Nukleinsäuren................................................................................. 34
2.16 Ethanolfällung von DNA ........................................................................................ 35
2.17 Quantitäts- und Qualitätskontrolle der Nukleinsäurelösung................................... 35
2.18 Enzymatische Reaktionen....................................................................................... 35
2.18.1 Methylierung der DNA mit SssI-Methylase............................................... 35
2.18.2 Klonierung von PCR-Produkten ................................................................ 36
2.18.3 Analyse der Klonierungsprodukte mittels EcoRI-Verdau.......................... 36
2.19 DNA-Agarosegelelektrophorese............................................................................. 36
2.20 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen.............................................. 36
Inhaltsverzeichnis
3
2.21 Polymerase-Kettenreaktion.................................................................. 37
2.21.1 ß-Globin PCR ............................................................................................ 37
2.21.2 QMSP ......................................................................................................... 37
2.21.3 PCR zur Klonierung von Promotorfragmenten.......................................... 39
2.22 DNA-Analyse mittels Bisulfit ................................................................................ 39
2.23 Sequenzierung......................................................................................................... 40
2.24 Nachweis von DNA-Hypomethylierung
mittels 5-Methylcytosin-Antikörper AB-1 .................................................. 40
2.24.1 Vorbehandlung des Zellmaterials............................................................... 40
2.24.2 Immunologische Reaktion.......................................................................... 41
2.24.3 Auswertung der immunologischen Reaktion ............................................. 41
2.25 Bild-Zytometrie ...................................................................................................... 42
2.25.1 Feulgen Färbung......................................................................................... 42
2.25.2 DNA-Bild-Zytometrie ................................................................................ 42
2.26 Statistische Auswertung.......................................................................................... 43
3. Ergebnisse................................................................................................................... 44
3.1 DNA Extraktion........................................................................................................ 44
3.1.1 DNA Extraktion aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten ................... 44
3.1.2 DNA Extraktion aus Formalin fixierten, Paraffin eingebetteten Geweben 46
3.2 Fall-Kontroll-Studien: aberrante Promotormethylierung als Tumormarker............ 46
3.2.1 Etablierung der Bisulfitkonversion und einer internern Kontrolle............... 46
3.2.2 Etablierung der Methylierungsmarker.......................................................... 47
3.2.3 Sensitivität und Spezifität der Marker
bei Tumorzell positiven Bronchialsekreten ................................................ 48
3.2.4 Methylierung in Bronchialsekreten verschiedener diagnostischer Gruppen 49
3.2.5 Sensitivität der Marker in Bezug auf histologische Subtypen und in
Kombination miteinander ............................................................................ 50
3.2.6 Klinisch-pathologische Korrelation ............................................................. 53
3.3 Retrospektive Kohorten-Studie: aberrante Promotormethylierung
als Tumormarker.......................................................................................... 53
3.4 Methylierungsmuster in zytologischem und histologischem
Untersuchungsmaterial ................................................................................ 57
3.4.1 Vergleich der Methylierungsmuster in zytologischen und histologischen
Untersuchungsmaterial mittels QMSP......................................................... 57
Inhaltsverzeichnis
4
3.4.2 Analyse der Methylierungsmuster einzelner Promotoren ............................ 58
3.5 Globale DNA Hypomethylierung ............................................................................. 62
3.5.1 Globale DNA Hypomethylierung als Tumormarker.................................... 62
3.5.2 DNA Hypomethylierung in histologischen Präparaten von
Lungenkarzinomen ...................................................................................... 63
3.6 Aberrante Promotormethylierung in Sputen............................................................. 66
4. Diskussion................................................................................................................... 67
4.1 Extraktions-Studie .................................................................................................... 67
4.1.1 DNA Extraktion aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten ................... 67
4.1.2 DNA Extraktion aus Formalin fixiertem, Paraffin eingebetteten Gewebe .. 69
4.2 Aberrante Promotormethylierung als molekularbiologischer Tumormarker
für die Lungenkarzinom Diagnostik ............................................................ 69
4.2.1 Etablierung der Bisulfitkonversion und QMSP............................................ 70
4.2.2 Aberrante Methylierung des APC Promotors 1A......................................... 72
4.2.3 Aberrante Methylierung des p16INK4a Promotors ......................................... 74
4.2.4 Aberrante Methylierung des RARB2 Promotors .......................................... 75
4.2.5 Aberrante Methylierung des RASSF1A Promotors ...................................... 76
4.2.6 Aberrante Methylierung des SEMA3B Promotors........................................ 77
4.2.7 Kombination verschiedener Methylierungsmarker als diagnostischen Test 77
4.2.8 Retrospektive Kohorten-Studie – Methylierung zur Erweiterung der
bisherigen Lungenkarzinom-Diagnostik...................................................... 78
4.3 Methylierungsmarker: Tumor- oder Risikomarker?................................................. 81
4.4 Globale DNA-Hypomethylierung............................................................................. 82
4.4.1 Hypomethylierung als Tumormarker ........................................................... 82
4.4.2 DNA Hypomethylierung in histologischen Präparaten von
Lungenkarzinomen ...................................................................................... 83
5. Zusammenfassung ...................................................................................................... 85
6. Literatur ...................................................................................................................... 86
7. Abkürzungen............................................................................................................. 102
8. Anhang...................................................................................................................... 103
Eidesstattliche Erklärung .............................................................................................. 107
Teilpublikationen dieser Arbeit .................................................................................... 108
Abstract
5
Abstract
In this study, a diagnostic test for lung cancer was developed using aberrant promoter
methylation as a tumormarker. For the detection of promoter methylation, DNA was
isolated from bronchial secretions, treated with sodium-bisulfite and analyzed with a
quantitative methylation specific real-time PCR (QMSP). For the QMSP, primer/TaqMan®-probe sets for different promoter-regions were designed and tested in
case-control-studies comprising 297 bronchial secretions (112 lung cancers, 85 nontumor-cases). Applying QMSP as well as sequencing of promoter regions to DNA from
bronchial secretions and corresponding formalin fixed tumor-tissue showed that the
markers APC and RARB2 detect an epigenetic damage of the bronchial epithelium and
may therefore be classified as risk markers. In contrast, RASSF1A and p16INK4a proved
to be tumor-specific. Finally, three useful markers for diagnostic purposes were combined to a panel (APC, p16INK4a, RASSF1A). In a retrospective cohort-study comprising
235 bronchial aspirates (111 lung cancers, 103 non-tumor-cases, 21 other tumors) the
results of the case-control-studies were verified. Using QMSP lung cancer was detected
with a sensitivity of 52% and a specificity of >99%. Combining the molecular test with
conventional cytology and histology, lung cancer was diagnosed in 88% at the first
bronchoscopy. The methylation assay represents the first diagnostic test for lung cancer
which fits for every day use and is independent of cell morphology. Thereby 40% of
lung cancer cases with bronchial secretions lacking morphologically visible tumor cells
could be identified. Furthermore, in 80% of cases with highly suspicious cytology the
tumor was confirmed. The test can be accomplished using residual material of regular
cytology. Therefore, it can be integrated in diagnostic routine without changes of the
standard procedures. As a result, the newly developed test has a great diagnostic potential.
For the first time it was possible to quantify DNA hypomethylation in histological sections of squamous-cell carcinomas using a monoclonal antibody raised against the base
5-methyl-cytosine and analysing the staining results with image-cytometry. The
squamous-cell carcinomas showed global hypomethylation in 80% of the studied cases.
In average the 5-methyl-cytosine content of tumor cells was 29.4% lower than in respective reference cells.
Einleitung
6
1. Einleitung
1.1 DNA-Methylierung als epigenetische Veränderung
Die Weitergabe von Informationen erfolgt bei der Epigenetik auf der Ebene der Expression und bei der Genetik auf der Ebene der DNA-Sequenz. Epigenetische Effekte sind
in vielen Eukaryoten bekannt: genomisches Imprinting in Pflanzen, Mating type und
Telomer silencing in Hefe, position effect variegation in Drosophila sowie
X-Chromosom Inaktivierung und genomisches Imprinting in Säugetieren.
Die häufigste epigenetische Modifikation ist die Methylierung von Cytosin. Dabei wird
bevorzugt die palindromische Basenfolge von Cytosin und Guanin (CpG-Dinukleotid)
methyliert. In höheren Pflanzen findet sich Methylierung zudem in der Sequenz CpNpG
(Gruenbaum et al. 1981). Die chemische Reaktion wird in der Zelle von DNA Methyltransferasen (DNMT) postreplikativ katalysiert. Dabei wird eine Methylgruppe auf das
Kohlenstoffatom 5 des Cytosins von dem Donor S-Adenosyl-Metheonin übertragen
(Szyf 1996).
Im Laufe der Evolution hat sich der CpG-Anteil der Wirbeltier-DNA verringert. Die
Häufigkeit der Nukleotidfolge CpG entspricht nur einem fünftel dessen, was man nach
der Basenzusammensetzung erwarten würde. Grund dafür ist die häufige Desaminierung von Cytosinresten und ihre unzureichende Reparatur.
Das Methylierungsmuster der DNA ist Zelltyp-spezifisch und wird während der
Embryonalentwicklung durch drei unabhängige Methyltransferasen etabliert (Bestor
2000). Die am besten charakterisierte und am häufigsten in somatischen Zellen zu findende Methyltransferase ist DNMT1. Während der S-Phase ist dieses 193 kDa Protein
an den Replikationsorten im Kern lokalisiert und interagiert mit PCNA (proliferating
cell nuclear antigen), einem für die DNA-Reparatur und DNA-Replikation essentiellen
Protein (Leonhardt et al. 1993). DNMT1 hat eine im Vergleich zu unmethylierten Sequenzen 10-40fach erhöhte Spezifität für hemimethylierte DNA-Stränge, weshalb man
sie auch als Erhaltungsmethylase (maintenance) bezeichnet (Pradhan et al. 1999). Sie
ist essentiell für die Embryonalentwicklung (Li et al. 1992), das Imprinting (Li et al.
1993, Howell et al. 2001) und die X-Chromosom-Inaktivierung in weiblichen Zellen
(Beard et al. 1995).
Das DNMT2-Protein wurde 1998 charakterisiert (Yoder und Bestor 1998). Es ist in den
frühen Stadien der Säugetierentwicklung aktiv, eine Methylaseaktivität konnte jedoch
Einleitung
7
bislang weder in biochemischen noch in genetischen Tests gezeigt werden. Vermutlich
kommt DNMT2 eine Funktion bei der Centromerausbildung zu (Bestor 2000).
In Drosophila melanogaster findet sich bislang keine CpG-Methylierung, sondern nur
eine sehr schwache CpT-Methylierung in embryonalen Stadien (Lyko et al. 2000).
Allerdings besitzt Drosophila nicht nur ein DNMT1-ähnliches Protein, sondern auch ein
DNMT2 Homolog (Hung et al. 1999), was möglicherweise eher spezifisch für eine
CpT-Methylierung ist (Lyko et al. 2000). Zu bemerken ist jedoch, daß die Homologien
in der Drosophila-Sequenz bezüglich DNMT1 und DNMT2 von Bestor kritisch bewertet werden (Bestor 2000).
Die dritte Gruppe von DNA-Methyltransferasen, DNMT3a und DNMT3b, konnte ebenfalls 1998 charakterisiert werden. Sie zeigen eine gleich starke Aktivität gegenüber
hemi- und nicht methylierter DNA (Okano et al. 1998). In Mausmodellen konnte gezeigt werden, daß Mäuse mit einer gezielt eingeführten homozygoten Inaktivierung des
DNMT3a-Gens (Knockout-Mäuse) zwar lebend geboren werden, jedoch zwergwüchsig
sind und im Alter von vier Wochen versterben. DNMT3b-Knockout-Mäuse sind nicht
lebensfähig. Mutierte Embryos zeigen eine große Anzahl an Störungen in der Entwicklung und eine Wachstumsbeeinträchtigung beginnend am Tag 9. Wenn sich die Mutationen auf die C-terminale Domäne des Gens beschränken, tritt in den Mäusezellen eine
Demethylierung der centromerischen DNA-Sequenz auf, wie sie auch vergleichbar
beim ICF-Syndrom im Menschen zu beobachten ist (Okano et al. 1999). Basierend auf
den Erkenntnissen aus den Mausmodellen und der Spezifität der Enzyme sowohl für
hemi- als auch nicht methylierte DNA, werden die beiden DNMT3-Proteine als denovo-Methylasen bezeichnet (Okano et al. 1998).
1.2 Funktion der DNA-Methylierung
Im Säugetiergenom gibt es einige hundert Basenpaar große Sequenzabschnitte, in denen
CpG-Dinukleotide zehnmal häufiger auftreten als sonst. Diese als CpG-Inseln bezeichneten Genomabschnitte befinden sich in der 5´-Region (Promotorregion, untranslatierte
Region und Exon 1) von schätzungsweise der Hälfte aller humanen Gene (Bird et al.
1986).
Außerdem befinden sich ca. 80% der CpG-Dinukleotide in repetitiven DNA-Sequenzen
– Satelliten des Heterochromatins –, in Introns, in untranslatierten und in kodierenden
Regionen von inaktiven gewebe- und entwicklungsspezifischen Genen. Hier liegen die
CpG-Dinukleotide vorrangig in methylierter Form vor (Esteller und Herman 2002).
Einleitung
8
Für viele Gene ergibt sich eine umgekehrte Korrelation zwischen Methylierung und
Genexpression (Doerfler 1983). Die DNA-Methylierung ist meist assoziiert mit einer
Inaktivierung der betroffenen DNA-Sequenz und einer Transkriptionshemmung.
Derzeit werden zwei Mechanismen diskutiert, die die Transkriptionshemmung durch
DNA-Methylierung erklären könnten (Zahava und Cedar 1997). Durch Methylierung an
CpG-Dinukleotiden in Promotorregionen kann eine Bindung von bestimmten
Transkriptionsfaktoren an die DNA gehemmt werden. Solche Transkriptionsfaktoren
enthalten ein CpG-Dinukleotid in ihrer Erkennungssequenz. Zu ihnen zählen z.B. die
Faktoren AP-2, CREB, c-Myc/Myn, E2F1, NFκB, ERS-2, HIF1α und PEA-3 (Bergman
und Mostoslavsky 1998). Allerdings gibt es auch eine Reihe von Faktoren, die methylierungsunabhängig DNA binden oder erst gar keine CpG-Erkennungssequenz besitzen.
Hierzu zählen u. a. SP1, CTF und YY1 (Mostoslavsky und Bergman 1997) Der zweite
Mechanismus zur Hemmung der Transkription erfolgt durch die Bindung von Repressorproteinkomplexen, die methylierte CpG-Dinukleotide erkennen, dazu gehören
MeCP1 und MeCP2. Die Proteine MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 und MeCP2 bilden
eine Familie, die mit hoher Affinität über eine gemeinsame Methyl-CpGBindungsdomäne (MBD) Methylcytosin binden kann. Die MBD´s können mit verschiedensten Proteinen assoziiert sein, u.a. mit Histondeacetylasen. Diese können
Histonkomplexe deacetylieren, was zu einer dichteren Verpackung der DNA und
schließlich zu einer Transkriptionshemmung führt. Beide beschriebenen Mechansimen
schließen einander nicht aus, man vermutet sogar, daß sie synergetisch wirken.
In Prokaryoten dient die DNA Methylierung außerdem der Unterscheidung von Eigenund Fremd-DNA im Rahmen des Modifikations-Restriktions-Systems und schützt die
DNA vor dem Abbau durch Restriktionsenzyme. Zudem markiert die DNA-AdenosinMethylase den parentalen DNA-Strang, was für das postreplikative MismatchReparatursystem von großer Bedeutung ist, da hier nur Basen am unmethylierten
Strang einer hemimethylierten DNA ausgetauscht werden. Das Protein MBD4 könnte
dabei eine verwandte Funktion zum dam-Gen in Eukaryoten haben (Bellacosa 2001).
In Eukaryoten wirkt sich die Methylierung nicht nur auf die Transkription, sondern
auch auf die Organisation und differentielle Genexpression aus. Ähnlich dem Prokaryoten-System kann bei Eukaryoten die DNA-Methylierung auch als „Immunantwort“
gegenüber Fremd-DNA auf zellulärer Ebene angesehen werden (Doerfler 1991, Yoder
et al. 1997). So wurde gezeigt, daß in transgenen Pflanzen die Transkription fremder
DNA durch DNA-Methylierung des Selektionsmarkers verhindert wird. Auch endogene
Einleitung
9
retrotransposable Elemente wie z.B. Retroviren, LINE1- und Alu-Elemente werden
durch de novo Methylierung inaktiviert und ihre Transkription so verhindert. Mehr als
ein Drittel des menschlichen Genoms besteht aus transponierbaren Elementen (Li et al.
2001).
DNA-Methylierung bestimmt auch das genomische Imprinting („elterliche Prägung“).
Dabei werden einige Gene durch parentalspezifische Methylierungsmuster kontrolliert
und entsprechend exprimiert. Ein bekanntes Beispiel für das Imprinting sind die benachbarten Gene H19 und Igf2 auf Chromosom 11p15. Die Gene unterliegen einer entgegengesetzten Prägung. Dabei wird das väterliche Allel von H19 methyliert, während
das mütterliche unmethyliert bleibt und transkribiert wird (Tremblay et al. 1995, Stoger
et al. 1993). Umgekehrt ist dieses bei Igf2 zu finden. Die geprägten Methylierungsmuster bleiben während der Gametogenese erhalten, während ungeprägte Genomregionen während der Zellteilung komplett demethyliert werden und im BlastocystenStadium einer de novo Methylierung unterliegen (Jaenisch 1997, Reik und Walter
2001).
Mit dem Imprinting vergleichbar ist die DNA-Methylierung bei der Inaktivierung eines
der beiden X-Chromosomen in der weiblichen Zelle zur Gen-Dosis Regulierung. Ausgehend vom X-chromosome-inactivation center (Xic) wird das Xist Gen auf dem zu
inaktivierenden Chromosom exprimiert. Das entstehende Xist-RNA Transkript akkumuliert im Zellkern. Durch einen bisher noch nicht völlig verstandenen Mechanismus
kommt es zur Chromatinkondensation und zur DNA-Methylierung. Diese entgültige
Inaktivierung des X-Chromosoms wird im späten Blastozystenstadium eingeleitet
(Heard et al. 1997, Avner und Heard 2001).
1.3 Veränderung der Methylierungsmuster bei klinischen Syndromen
Verschiedene klinische Syndrome des Menschens sind mit Veränderungen im Methylierungsmuster der DNA assoziiert und führen zu einer mentalen Retardierung der Patienten. Patienten mit dem „Immunodeficiency, Centromere Instability and Facial Anomalies” (ICF) – Syndrom zeigen verschiedenste Mutationen in der katalytischen Domäne
des DNMT3B-Gens und damit eine verminderte Proteinaktivtität (Hansen et al. 1999,
Xu et al. 1999). Als Folge werden repetitive Sequenzen hypomethyliert und centromernahe Regionen destabilisiert, was letztendlich die Chromosomen-Aberration nach sich
zieht (Franceschini et al. 1995).
Einleitung
10
Das Fragiles-X-Syndrom ist gekennzeichnet durch die de novo Methylierung der Promotorregion des FMR1-Gens. Dieses Gen hat einen hochpolymorphen CCG-Repeat, der
bei betroffenen Patienten Wiederholungssequenzen von 29 bis über 200 aufweisen kann
(Kremer et al. 1991 , Oberle et al. 1991).
Das Rett-Syndrom weist Mutationen im MeCP2-Gen auf, wobei die Mehrzahl der Veränderungen Transitionen von C zu T in der Methyl-Bindungsdomäne (MBD) sind
(Nan et al. 1997, Ballestar et al. 2000).
1.4 Veränderung der DNA Methylierungsmuster in Tumoren
Cytosin und Methylcytosin können am Kohlenstoffatom C4 entweder chemisch induziert oder spontan zu Uracil bzw. Thymin desaminiert werden. Das Reparaturenzym
Uracil-DNA-Glycosylase erkennt die Base Uracil in der DNA-Sequenz und tauscht sie
gegen Cytosin aus. Schwieriger zu reparieren sind die zu Thymin desaminierten Methylcytosine, da die Thymin-DNA-Glycosylase Thymin-Reste als normalen Bestandteil
der DNA wertet und diese nicht effizient austauschen kann (Laird und Jaenisch 1994).
Als Folge entstehen Punktmutationen. 24% aller Mutationen im Gen p53 in menschlichen Tumoren sind zurückzuführen auf Transitionen von CpG nach TpG oder CpA
(Magewu und Jones 1994, Hollstein et al. 1998).
In der Entstehung von Tumoren spielen sowohl eine globale Verminderung der DNA
Methylierung (Hypomethylierung) als auch eine meist auf Promotorregionen bezogene
Erhöhung der Methylierung (Hypermethylierung) eine entscheidende Rolle. Dabei können beide Prozesse voneinander unabhängig oder auch in Kombination ablaufen. Die
Hypomethylierung tritt sowohl genomweit als auch spezifisch in Proto-Onkogenen auf.
So findet man beispielsweise eine verminderte Methylierung von K-RAS in Lungenund Colonkarzinomen (Feinbert und Vogelstein 1983). Gleichzeitig kann man in Tumoren aber auch eine Hypermethylierung der Promotoren von Tumorsuppressor- und anderen Genen finden, z.B. bei APC, CDKN2A und RASSF1A (Gonzalgo et al. 1997, Hiltunen et al. 1997, Honorio et al. 2003). Bei den drei genannten Beispielen ist die Hypermethylierung als Mechanismus zur Inaktivierung der Gene in menschlichen Tumoren sicher belegt und durchaus vergleichbar mit der Inaktivierung von Genen durch
Mutationen wie Deletionen und Punktmutationen (Baylin et al. 2001).
Einleitung
11
1.5 Das Lungenkarzinom
Das Lungenkarzinom ist weltweit die Tumorerkrankung mit der höchsten Mortalität
(Parkin et al. 2001). Es manifestiert sich in der Regel in der 6. Lebensdekade. Derzeit
sind in Deutschland Männer häufiger als Frauen betroffen, doch die Zahl von Lungenkarzinompatientinnen steigt jährlich an. Die Prognose ist mit einer langfristigen Überlebensrate von weniger als 11% seit vielen Jahren unverändert schlecht, da die Tumoren
meist erst in fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert werden. Der Krankheitsverlauf
auch von Patienten, die zunächst mit kurativer Zielsetzung operiert wurden, wird entscheidend von dem Auftreten und Ort der Metastasierung geprägt. Zum Zeitpunkt der
Erstdiagnose sind bereits ca. 70% der Kleinzelligen- und 35% der Nicht-KleinzelligenKarzinome in andere Organe metastasiert (Wiethege et al. 2000). Patienten mit einer
Diagnose des Lungenkarzinoms im Stadium I mit einer Tumorgröße ≤ 1 cm haben
therapiert eine deutlich bessere Überlebensrate von mehr als 50% (Harpole et al. 1995).
Lungentumoren entwickeln sich aus prämalignen Läsionen, die an verschiedenen Stellen innerhalb des bronchoalveolären Epithels entstehen können. Dieser Feldkanzerisierungs-Prozeß ist auf eine wiederholte Exposition der Lunge gegenüber Karzinogenen
zurückzuführen. Der wesentlichste Kausalfaktor für die Entstehung bösartiger Lungentumoren ist mit rund 90% der Abusus von Tabakprodukten. 85-90% der Lungentumorpatienten sind Raucher und ca. 20% aller Raucher erkranken an bösartigen Lungentumoren (Kreuzer et al. 1998, Kreuzer et al. 1999, Mannino et al. 1998). Neben chronischen Tabakabusus sind noch weitere inhalative Noxen bekannt, welche die Entstehung
von Lungentumoren begünstigen. Dazu gehören radioaktive Stäube, Asbest, Silikate,
Arsen, Chromdämpfe, Kokereirohgase und Nickeldämpfe (Butz 1999, Haugen 2000).
Die stadienhafte Ausdehnung eines Lungenkarzinoms ist in der TNM-Klassifikation
festgelegt (Sobin und Wittekind 1997). Dabei steht „T“ für Tumorausdehnung, „N“ für
Lymphknoten-Beteiligung und „M“ für Fernmetastasierung. Die histologische Klassifikation der Lungentumoren wurde zuletzt 2004 von der Weltgesundheitsorganisation
(WHO) revidiert (Travis et al. 2004). Diese WHO-Klassifikation unterscheidet bei den
bösartigen epithelialen Neubildungen neben Kleinzelligen Karzinomen u. a. folgende
Hauptgruppen Nicht-Kleinzelliger Karzinome: Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome, großzellige Karzinome und adenosquamöse Karzinome. Das Plattenepithelkarzinom (SCC) entwickelt sich aus dem Bronchialepithel hauptsächlich der Haupt-, Lappen- und Segmentbronchien, wobei relative Veränderungen des Bronchialepithels in
Form einer Reservezellhyperlasie und Plattenepithelmetaplasie Vorläuferläsionen dar-
Einleitung
12
stellen. Das Adenokarzinom (AC) findet man vornehmlich in der Lungenperipherie. Es
entwickelt sich aus dem schleimbildenden Epithel der Bronchien (zentrales AC) oder
aus Clara-Zellen und/oder Alveozyten vom Typ II (peripheres AC). Die Häufigkeit des
AC steigt derzeit weltweit an, ca. 35% aller Lungenkarzinome sind AC und ca. 32%
SCC. In bis zu 50% aller Nicht-Kleinzelligen Lungenkarzinome (NSCLC) findet man
eine Vermischung von unterschiedlichen histologischen Typen. Das Kleinzellige
Lungenkarzinom (SCLC) entsteht ähnlich dem SCC bevorzugt in zentralen Bronchien.
Man vermutet, daß es sich aus pluripotenten bronchialen Vorläuferzellen ableitet. SCLC
machen 15-20% aller Lungenkarzinome aus.
1.5.1 Lungenkarzinom-Diagnostik
Es gibt bildgebende, zytologische und histologische Diagnoseverfahren zum Nachweis
von Lungenkarzinomen. In einem konventionellen Thorax-Röntgenbild lassen sich
Knoten in der Lunge ab einer Größe von ca. 1,5 cm nachweisen. Zumeist befindet sich
der Tumor dann in einem fortgeschrittenen Stadium und ist nicht mehr kurabel. 1992
wurde die ebenfalls auf Röntgenstrahlung basierende Spiral Computer Tomographie
(Spiral CT) eingeführt, mit der sich Knoten ab 3-5 mm Größe nachweisen lassen. In
großen Studien wie dem Early Lung Cancer Action Project (ELCAP) wurde die Nutzung des Spiral CT´s als Screening Methode für Hochrisikopatienten überprüft
(Henschke et al. 1999). Bei 2,7% (27/1000) der Studienteilnehmer konnte ein Tumor
diagnostiziert werden, 24 davon befanden sich im Stadium I und 23 von 24 Patienten
waren operabel. Nachteilig beim Spiral CT-Screening ist, daß bei einer hohen Zahl von
Hochrisikopatienten (ca. 20-30%) verdächtige Knoten in der Lunge nachgewiesen werden, die sich im Follow-up als nicht maligne herausstellen (Henschke et al. 1999). Das
Spiral CT ist eine bildgebende Technik, die für ein Massenscreening prinzipiell geeignet ist. Die Sensitvität und Spezifität der Methode, sowie die Frage nach einer Reduktion der Mortalität, müssen in weiteren Studien überprüft werden.
Die Fluoreszenz-Bronchoskopie (laserlight induced fluorescence endoscopy, LIFE)
nutzt die Autofluoreszenz des Lungenepithels zur Detektion von Tumoren und Vorläuferläsionen. Dysplastisches und malignes Gewebe weisen im Vergleich zu Normalgewebe eine schwächere Fluoreszenz bei 442 nm auf (Hung et al. 1991). Die LIFE eignet
sich nur bedingt zum Screening von Hochrisikopatienten, da es sich um eine invasive
Maßnahme handelt, die nur zentral liegende Tumore nachweisen kann und eine schlechte Spezifität besitzt.
Einleitung
13
Während einer Bronchoskopie ist es möglich, zur histologischen Sicherung Biopsien
und zur zytologischen Sicherung Bronchialsekrete und –bürstungen zu entnehmen. Bei
der Bronchoskopie können dabei histologisch nur mit dem Bronchoskop erreichbare
Tumoren biopsiert werden. In ca. 40% aller Fälle ist ein Tumor erst nach wiederholten
invasiven Maßnahmen histologisch diagnostizierbar. Bronchialbürsten ermöglichen
ebenfalls nur die Beurteilung lokal abgegebürsteter Zellen. Das Bronchialsekret beinhaltet dagegen abgeschilferte Zellen aus verschiedensten Bereichen der Lunge. Damit
ist auch eine Sicherung peripher liegender Tumoren prinzipiell möglich. Das Sputum
weist ebenfalls ein vergleichbar großes Spektrum an Zellen aus der Lunge auf und kann
nicht invasiv gewonnen werden. Es wurde bereits mehrfach versucht, an Sputen eine
zytologische Vorsorge für Hochrisikopatienten zu etablieren. Aus verschiedenen Gründen, z.B. wegen des Desinteresses der betroffenen Gruppen an diesem Test oder der
unzureichenden Aufklärung über die technische Abgabe eines diagnostisch nutzbaren
Sputums, bleibt bislang eine größere Akzeptanz dieser Vorsorgemaßnahme aus.
1.5.2 Molekularbiologische Veränderungen des Lungenkarzinoms
Lungenkarzinome sind sowohl histomorphologisch als auch hinsichtlich ihrer molekularbiologischen Veränderungen sehr heterogen. Trotzdem lassen sich für einige histologische Subtypen charakteristische genetische Defektmuster bestimmen. Die Entstehung
der Lungenkarzinome vollzieht sich in mehreren Stufen. Genetische Prädispositionen,
speziell Polymorphismen von Karzinogenaktivierungs- und -desaktivierungsenzyme
erklären, weshalb manche Individuen trotz entsprechender Exposition kein Karzinom
entwickeln (Remmele 1997).
Bei der Genese und Progression von bösartigen Lungentumoren spielen molekulare
Mechanismen wie z.B. veränderte Genexpression, Punktmutationen, Amplifikationen
oder Deletionen kleiner Genomabschnitte eine zentrale Rolle. Besonders häufig sind
Mutationen im Tumorsupressorgen p53, die in 70% der SCLC und in 47% aller NSCLC
zu finden sind (Greenblatt et al. 1994). In dem Zusammenhang ist auch zu erwähnen,
daß Methylierung des p53-Gens die Bindung von Benzo-a-pyren – einem Karzinogen
aus dem Tabakrauch – an Guanin Reste fördert. Dies führt zu einer erhöhten G nach T
Transitionsrate (Pfeifer et al. 1984, Pfeifer et al. 2000). Punktmutationen in Onkogenen
finden sich beim Lungenkarzinomen in der RAS-Familie. K-RAS Mutationen sind bei
AC in bis zu 44% und bei SCLC in 0% nachgewiesen worden (Clayton et al. 2000).
Einleitung
14
Weiterhin sind eine Überexpression der Onkogene EGFR, HER2, c-MYC, n-MYC,
L-MYC, RAF1, FOS, JUN, BCL-2, MYB, MDM2, KIT und Deletionen in den Tumorsupressorgenen
RB,
CDKN2A,
CDKN2B,
FHIT,
VHL
beschrieben
worden
(Wiethege et al. 2000).
Die komparative genomische Hybridisierung (comparative genomic hybridization,
CGH) konnte beim SCLC bevorzugt Deletionen auf dem kurzen Arm von Chromosom
3 (3p), dem langen Arm von Chromosom 10 (10q) und den Chromosomenarmen 4q, 5q,
13q und 17p nachweisen. Amplifikationen wurden auf 3q und auf 5p beschrieben (Balsara und Testa 2002). AC besitzen gehäuft Verluste auf Chromosom 9 und 19, Zugewinne finden sich auf Chromosom 1. SCC zeigen häufige Verluste auf Chromosom 2
und Zugewinne auf Chromosom 3 (Balsara und Testa 2002). Die CGH-Muster erlauben
allerdings im Einzelfall keinen Rückschluß auf den führenden histologischen Tumortyp.
Für die Entstehung und Progression von Lungentumoren stellen chromosomale Veränderungen offenbar eine wesentliche Ursache dar. Wie es zu dieser Chromosomeninstabilität kommt, ist bisher noch unklar.
Neben der bereits unter 1.5.3 erwähnten DNA-Hypermethylierung spielt offenbar die
globale Hypomethylierung bei der Tumorentstehung eine Rolle. Studien weisen darauf
hin, daß Hypomethylierung genetische Instabilität, eine Reaktivierung von transponierbaren Elementen und eine erhöhte Mutationsrate fördert (Feinberg 2004). Bislang gibt
es nur wenige Arbeiten, die die Hypomethylierung von Lungentumoren - hauptsächlich
an NSCLC-Karzinomen - untersucht haben. Generell wurde eine verminderte Methylierung der DNA in Tumoren im Vergleich zu Normalgewebe nachgewiesen (Piyathilake
et al. 2003, Feinberg und Vogelstein 1983). Die Mechanismen der globalen Hypomethylierung sind noch nicht gut erforscht. Neben einer passiven Demethylierung (Jost
und Bruhat 1997) wurden auch biochemische Wege diskutiert (Razin et al. 1986, Vairapandi und Duker 1993, Jost & Jost 1995).
1.5.3 Promotor-Methylierung an histologischem Material der Lunge
In Lungenkarzinomen ist der Methylierungsstatus der Promotoren von weit über 40
Genen bekannt. Für die Untersuchungen wurden Biopsien, Resektate oder Zellinien von
Lungenkarzinomen verwendet. Die Tabelle 1.1 soll einen Überblick über Promotoren
mit hoher Methylierungsfrequenz geben. Die Heterogenität der Proben und die verschiedenen Untersuchungsmethoden lassen nur bedingt einen Vergleich der Ergebnisse
zu. So wird z.B. bei einem methylierungssensitiven Restriktionsenzymverdau nur eine
Einleitung
15
minimale Anzahl von CpG-Dinukleotiden untersucht, wohingegen eine genomische
Sequenzierung nach Bisulfitkonversion eine größere Anzahl von CpG-Dinukleotiden
erfaßt. Weiterhin wurden in den einzelnen Studien unterschiedliche Regionen innerhalb
eines Promotors untersucht, was ebenfalls das Ergebnis beeinflußt, da das Methylierungsmuster der CpG-Inseln nicht uniform sein muß (Zheng et al. 2000). In vielen Fällen wurde die aberrante Promotormethylierung von Zellinien untersucht. Der Vorteil
bei der Arbeit mit Zellinien gegenüber histologischem Material liegt darin, daß die
Menge von DNA unlimitiert ist und Versuche - z.B. zur Expression von Genen - problemlos möglich sind. Während Analysen zum globalen Methylierungsstatus der DNA
zeigten, daß Zellinien stärker methyliert sind als die Primärtumoren, bleibt die Herkunft
dieses Unterschieds unklar (Flatau et al. 1983, Smiraglia et al. 2001). Für viele der in
Tabelle 1.1 aufgeführten Promotoren liegt die in Zellinien gefundene Methylierungsfrequenz innerhalb der Spannweite der Methylierungsfrequenz des Tumorgewebes (z.B.
APC, CDH1, CDH13, CDKN2A und RASSF1A). Dieses Ergebnis legt nahe, Zellinien
zum Screening auf aberrante Promotormethylierungen zu verwenden.
Tabelle 1.1: Literaturübersicht - Aberrante Promotormethylierung in Lungenkarzinomgewebe.
NSCLC = Nicht-Kleinzellige Tumoren, SCLC = Kleinzellige Tumoren, MSP = methylierungsspezifische
PCR, QMSP = quantitative methylierungsspezifische PCR, BGS = bisulfite genomic sequencing.
Gen
Methylierung
Methode
Literatur
NSCLC
SCLC
APC
72-96%
58%
MSP, QMSP
Brabender et al. 2001; Harden et al. 2003;
Usadel et al. 2002; Virmani et al. 2002
CDKN2A
9-68%
5-9%
MSP
Ahrendt et al. 1999; Chan et al. 2002; Chen et
al. 2002; Harden et al. 2003; Toyooka et al.
2001a; Toyooka et al. 2003
CDH1
18-28%
21%
MSP
Virmani et al. 2002; Zöchbauer-Müller et al.
2001a
CDH13
43-50%
20-71%
MSP
Esteller et al. 1999a; Toyooka et al. 2001b
DAPK
19-44%
-
MSP
Tang et al. 2000; Kim et al. 2001a
FHIT
37-64%
64%
MSP
Zöchbauer-Müller et al. 2001b; Virmani et al.
2002
GSTP1
7-40%
59%
MSP
Esteller et al. 1999a; Virmani et al. 2002
MGMT
19-47%
0-19%
MSP
Zöchbauer-Müller et al. 2001a; Esteller et al.
1999b; Toyooka et al. 2001a
RARB2
35-43%
45-62%
MSP
Toyooka et al. 2001a; Virmani et al. 2000
RASSF1A
30-88%
72-100%
BGS, MSP
Dammann et al. 2000; Agathanggelou et al.
2001; Burbee et al. 2001 ; Sato et al. 2002
Einleitung
16
1.5.4 Promotor-Methylierung an zytologischem Material der Lunge
Nur wenige Arbeiten zur Promotor-Methylierung wurden an zytologischen Material der
Lunge – Bronchialsekreten (BRS), Bronchialbrüsten (BRB) und Sputen – durchgeführt.
Eine Literaturübersicht zu den bisherigen Studien findet sich in Tabelle 1.2 für BRS und
1.3 für Sputen. Generell stellt man fest, daß die Methylierungsfrequenz der Promotoren
in zytologischem Material niedriger als im Tumorgewebe ist.
Tabelle 1.2: Literaturübersicht - Aberrante Promotormethylierung in Bronchialsekreten.
NSCLC = Nicht-Kleinzellige Tumoren, SCLC = Kleinzellige Tumoren, NT = Nicht-Tumor-Patienten,
QMSP = quantitative methylierungsspezifische PCR, MSP = methylierungsspezifische PCR
Gen
APC
Methylierung
NSCLC SCLC
NT
16%
-
CDKN2A 3-25%
Methode
Literatur
-
QMSP
Topaloglu et al. 2004
-
0%
1-Schritt
MSP,
QMSP
Topaloglu et al. 2004; Ahrendt et
al. 1999; Kurakawa et al. 2001;
Zöchbauer-Müller et al. 2003
CDH1
42%
-
-
QMSP
Topaloglu et al. 2004
CDH13
-
-
5%
1-Schritt
MSP
Zöchbauer-Müller et al. 2003
DAPK
21%
-
-
1-Schritt
MSP
Chan et al. 2002
GSTP1
3%
-
-
QMSP
Topaloglu et al. 2004
MGMT
9-23%
-
-
1-Schritt
MSP,
QMSP
Chan et al. 2002; Topaloglu et al.
2004
RARB2
0-71%
-
9%
1-Schritt
MSP,
QMSP
Topaloglu et al. 2004; Chan et al.
2002; Zöchbauer-Müller et al.
2003
-
5%
1-Schritt
MSP,
QMSP
Topaloglu et al. 2004; ZöchbauerMüller et al. 2003
RASSF1A 13%
Die meisten Arbeiten zur aberranten Promotormethylierung an zytologischem Material
sind mit einer konventionellen PCR (MSP) im Anschluß an eine Bisulfitkonversion
durchgeführt worden. Bei den Sputen wurde die Sensitivität des Methylierungsnachweises durch eine 2- oder 3-Schritt-PCR zusätzlich erhöht. Die QMSP besitzt durch die
Verwendung der sog. TaqMan®-Sonde und eines Fluoreszenzfarbstoffs zum Nachweis
der PCR-Reaktion eine ähnlich hohe Sensitivität. So kann ein methyliertes Allel unter
Einleitung
17
5.000 bis 10.000 unmethylierten Allelen detektiert werden. Die Spezifität der QMSP ist
höher als die der MSP, da die QMSP quantifizierbar ist und somit ein Schwellenwert
(Cut-off) in der Auswertung verwendet werden kann.
Die Ergebnisse zur aberranten Methylierung in Bronchialsekreten und Sputen wurden
nahezu ausschließlich an NSCLC-Patienten gewonnen. Kritische Kontrollen, z.B. von
Patienten mit Nikotinabusus jedoch ohne Tumorleiden, wurden selten untersucht. Daher
läßt sich oft keine Aussage bezüglich der Spezifität von Methylierungsmarkern machen.
Tabelle 1.3: Literaturübersicht - Aberrante Promotormethylierung in Sputen.
NSCLC = Nicht-Kleinzellige Tumoren, SCLC = Kleinzellige Tumoren, NT = Nicht-Tumor-Patienten,
QMSP = quantitative methylierungsspezifische PCR, MSP = methylierungsspezifische PCR, RE-Verdau
= Restriktionsenzymverdau.
Gen
Methylierung
NSCLC SCLC
CDKN2A 58-90% 40%
Methode
Literatur
NT
12-35% 2- und 3Schritt
MSP
Palminsano et al. 2000; Kersting
et al. 2000; Zöchbauer-Müller et
al. 2003; Belinsky et al. 2002
CDH13
-
-
7-10%
1-Schritt
MSP
Zöchbauer-Müller et al. 2003
DAPK
21%
-
-
1-Schritt
MSP
Belinsky et al. 2002
hMLH1
38%
-
-
REVerdau
Wang et al. 2003
MGMT
52%
-
14-30% 2-Schritt
MSP
Palminsano et al. 2000; Belinsky
et al. 2002; Gilliland et al. 2002
RARB2
-
-
23-27% 1-Schritt
MSP
Zöchbauer-Müller et al. 2003
50%
3-31%
Belinsky et al. 2002; Honorio et
al. 2003
RASSF1A 21%
1-Schritt
MSP
1.6 Biomarker zur Diagnose von Lungenkarzinomen
Die inzwischen immer umfangreicheren Kenntnisse der molekularen Genetik bösartiger
Lungentumoren bilden die Grundlage für die Entwicklung molekularer Biomarker. Die
Suche nach einem geeigneten Biomarker umfaßt dabei ein breites Spektrum sowohl der
methodischen Ansätze als auch der genetischen Alterationen selbst.
Im Idealfall sollte ein Biomarker an nicht- bzw. minimal-invasiv gewonnenem Untersuchungsmaterial anwendbar sein und möglichst keine die übliche Routineabläufe störenden Anforderungen stellen. Für das Lungenkarzinom eignen sich daher insbesondere
Einleitung
18
Sputen, Bronchialsekrete und Bronchialbürsten als Untersuchungsmaterial. Die Bearbeitung und Auswertung der molekularbiologischen Analysen sollte kostengünstig und
schnell erfolgen können. Gerade im diagnostischen Alltag, in dem die Ärzte auf die
Diagnosen angewiesen sind und die Patienten in Unsicherheit auf ein Ergebnis warten,
sollte ein molekularbiologischer Test möglichst wenig Zeit in Anspruch nehmen. Um
eine hohe Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten, sollten die als Biomarker verwendeten genetischen Alterationen bei Tumorpatienten eine hohe Prävalenz aufweisen,
bereits im Frühstadium der Tumorerkrankung nachweisbar sein und bei Patienten ohne
Tumorerkrankung nicht auftreten.
1.6.1 Besonderheiten der molekularen Zytopathologie
Der Einsatz molekularbiologischer Verfahren an Präparaten der pulmonalen Exfoliativzytologie weist gegenüber entsprechender Untersuchungen an Tumorgewebe Besonderheiten auf. Die Fixierung der zytologischen Materialien in Saccomanno Fixativ (50%
Ethanol, 2% Polyethyleneglycol 5.000) erhält die DNA in hochmolekularem und chemisch unmodifizierten Zustand (Grote et al. 2003a). Dagegen wird die DNA aus Gewebeproben der Histopathologie durch die verwendete Formalinfixierung fragmentiert und
chemisch modifiziert (Srinivasan et al. 2002). Ein wesentlich limitierender Faktor für
die Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen an zytologischem Material ist
die geringe Anzahl von Tumorzellen in einem Überschuß von Nichttumorzellen. Dies
setzt eine hohe Sensitivität des zu verwendenden Tests voraus.
1.6.2 Mutationen als Biomarker
In der zweiten Hälfte der 90er Jahre wurde mit der Entwicklung molekularer Biomarker
an Mutationen begonnen, deren Nachweis man zum Tumorzell-Screening verwenden
wollte. Die Verfahren benutzten in der Regel mehrere hintereinander geschaltete PCRSchritte und waren dadurch hochsensitiv, allerdings auch methodisch aufwendig. Typische Beispiele stellen die Single Strand Polymorphism (SSCP) -Untersuchungen und
sog. Systeme der amplifizierungsresistenten Mutation (ARMS) dar. Das zentrale Problem der Verfahren ist, daß sie ursprünglich zum Nachweis bekannter Mutationen entwickelt wurden und darum ein Gen nur punktuell untersuchen können. Da nur 23% der
p53-Mutationen in sechs sog. „hot-spot“-Regionen liegen, ist die Mutations-Prävalenz
bei alleiniger Untersuchung dieser hot-spots bei etwa 15% anzusetzen (Greenblatt et al.
1994). Dieser theoretische Wert der Mutationsfrequenz wird von zwei Studien, die an
Einleitung
19
zytologischem Exfoliativmaterial aus der Lunge durchgeführt wurden, deutlich überschritten, so daß sich die Frage nach der Spezifität der betreffenden Untersuchungen
stellt (Behn et al. 1998a, Behn und Schuermann 1998b).
Das Gen K-RAS ist grundsätzlich für ein punktuelles Screening geeigneter, da 80% der
Punktmutationen in Codon 12 auftreten, allerdings besitzt es für den Einsatz als Biomarker eine zu niedrige Prävalenz und Spezifität (Wiethege et al. 2000).
1.6.3 Chromosomenaberrationen als Biomarker
Zum Nachweis von Deletionen, Amplifikationen und Aneuploidie eignet sich die Mehrfachfarben Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). Mit diesem Verfahren können
sowohl gefärbte als auch ungefärbte fixierte Ausstrichpräparate untersucht und die Ergebnisse mit der konventionellen Zytomorphologie korreliert werden. Damit eignet sich
die FISH insbesondere als adjuvante diagnostische Methode bei unklaren morphologischen Befunden. Die hohen Kosten für die benötigten DNA-Sonden und die zeitaufwendige Auswertung behindern allerdings eine breite diagnostische Anwendung im
Rahmen des Tumorzell-Screenings (Sokolova et al. 2002).
1.6.4 Aberrante Promotor-Methylierung als Biomarker
Seit Anfang 2000 wird aberrante Promotormethylierung in Sputen untersucht. Besonders hervorzuheben ist die Arbeit von Palmisano und seinen Mitarbeitern, die CDKN2A
und/oder MGMT Promotormethylierung in 100% der Sputen von Patienten mit Plattenepithelkarzinom teils bis zu drei Jahren vor der klinischen Diagnosestellung nachwiesen (Palmisano et al. 2000). In der Studie wurden auch Sputen von 123 Hochrisikopatienten, die Zigarettenrauch und/oder Radon-Strahlung ausgesetzt waren, untersucht. Bei
dieser Gruppe wurde eine Promotormethylierung von CDKN2A und MGMT in 15%
bzw. 25% nachgewiesen. Die Ergebnisse zur Methylierung in Sputen allgemein zeigen,
daß die zu erlangende Spezifität an dem Material sehr begrenzt ist. Deshalb schlug Belinsky in einem Review 2004 folgendes Modell vor: an Stelle einzelner definitiver Tumormarker will er aberrante Methylierung verschiedener Gene in einem Panel kombinieren und dieses zu einer Risikoabschätzung nutzen. Dieses Modell prognostiziert eine
Steigerung des Lungenkarzinomrisikos für Raucher und Exraucher proportional zur
Anzahl der Gene, die in Sputen eine Promotormethylierung aufweisen. Ab einem gewissen Risikolevel sollen dann zusätzliche diagnostische Maßnahmen wie z.B. das Spiral CT oder eine Bronchoskopie zur Früherkennung hinzugezogen werden.
Einleitung
20
1.7 Ziel der Arbeit
Nicht selten sind bis zur endgültigen Diagnose eines Lungenkarzinoms mehrere invasive Untersuchungen erforderlich, die für den Patienten belastend sind (Schreiber und
McCrory 2003). Die Entwicklung eines molekularbiologischen Tests an zytologischem
Restmaterial würde eine ideale Ergänzung zur Diagnostik darstellen und könnte sowohl
die Zahl der Wiederholungsbronchoskopien als auch die Notwendigkeit weiterer invasiver Untersuchungen senken.
Der erste Teil der Arbeit befaßt sich mit der Extraktion und dem Erhaltungszustand der
DNA aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten und Formalin fixierten, Paraffin
eingebetteten Gewebeproben. In bisherigen Publikationen gibt es zur Extraktion von
DNA aus zytologischem Material kaum verwertbare Informationen. Deshalb sollten
vier verschiedene Extraktionsprotokolle überprüft werden, um letztendlich die geeignetste Methode für die geplanten Experimente festzulegen.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte ein molekularbiologischer Test entwickelt werden, der
die zytologische Diagnostik von Lungenkarzinomen erhärtet und ergänzt. Als Marker
sollten aberrante Methylierungsmuster von Promotorregionen dienen. Eine sensitive
Methode zum Nachweis methylierter, aus Bronchialsekreten bzw. Formalin-fixiertem
Gewebe isolierter DNA sollte etabliert werden. Die Sensitivität und Spezifität der Methylierung verschiedener Promotorregionen zum Nachweis von Tumorzellen sollte
zunächst im Fall-Kontroll-Studien Design überprüft werden. Durch eine Kombination
geeigneter Marker sollte letztendlich ein möglichst sensitiver und spezifischer Test entwickelt werden. Im Rahmen einer retrospektiven Kohorten-Studie sollte abschließend
die Tauglichkeit des diagnostischen Tests am alltäglichen Einsendegut überprüft werden. In weiteren Untersuchungen sollten die an Bronchialsekreten gewonnenen Ergebnisse mit dem entsprechenden histologischen Material abgeglichen werden.
Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Phänomen der globalen Hypomethylierung in Karzinomen. Hier sollte die Frage geklärt werden, ob Hypomethylierung als
Tumormarker einsetzbar ist und ob ein Zusammenhang zwischen Gen-spezifischer
Hyper- und globaler Hypomethylierung zu finden ist.
2. Material und Methoden
21
2. Material und Methoden
2.1 Humane Zellinien und ihre Kultivierung
Alle Zellinien wurden von der American Type Cell Culture (ATCC) bezogen. Der Zellstamm Wi-38 wurde von Dr. G. G. Maul, Wistar Institut, Philadelphia, USA, zur
Verfügung gestellt.
Die Zellinien HT-29, NCI-H522, T24 und der Zellstamm Wi-38 (s. Tab. 2.1) wurden in
Dulbecco´s Modified Eagle Medium mit stabilisiertem Glutamin, 15% hitzeinaktiviertem FCS, 100 U/ml Penicillin sowie 100 µg/ml Streptomycin bei 37°C in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wuchsen adhärent in
175 cm2 Kulturflaschen mit je 15 ml Medium. Sie wurden alle 2-5 Tage 1:3 bis 1:5
passagiert. Dazu wurde das Medium abgesaugt, die Zellen kurz mit PBS gewaschen und
mit 3 ml Trypsin / EDTA (0,02% / 0,05%) für 2 min bei 37°C inkubiert. Die Zellen
wurden vom Flaschenboden abgelöst und das Trypsin durch Zugabe von 12 ml frischem
Medium inaktiviert. Je 3 ml Zellsuspension wurden in neue Kulturflaschen überführt
und mit Medium auf 15 ml aufgefüllt.
Zum Anlegen von Gefrierkulturen wurden die Zellen nach der Behandlung mit Trypsin
in 1 ml eiskalten FCS / 10% DMSO suspendiert und in 2 ml Kryoröhrchen überführt.
Die Zellen wurden bei –80°C eingefroren und für die Versuche gelagert. Die Stocklösungen wurden nach 24 Stunden bei –80°C in Stickstoff überführt. Um die Zellen wieder in Kultur zu nehmen, wurde diese möglichst kurz aufgetaut und direkt in 10 ml
Medium aufgenommen.
Tabelle 2.1: Übersicht über die verwendeten Zellinien.
Angegeben sind die offiziellen Namen und Nummern der Zellinien bei der American Type Culture Collection (ATCC), das Ursprungsgewebe, die Morphologie und eventuelle Besonderheiten.
Name
ATCC-Nr.
Gewebe; Morphologie
Besonderheit
NCI-H522
CRL-5810
Lunge, Adenokarzinom
Mutation in p53 Codon 191
HT-29
HTB-38
Colon, Adenokarzinom
Mutation in p53 Codon 273
T24
HTB-4
Harnblase, Urothelkarzinom G3-4
Wi -38
CCL-75
Lunge, Fibroblasten
-
2. Material und Methoden
22
2.2 Bronchialsekrete, Sputen und Formalin-fixiertes Gewebe
2.2.1 Verarbeitung und Quantifizierung von Tumorzellen in Bronchialsekreten
Bronchialsekrete wurden während einer Bronchoskopie von Patienten mit Verdacht auf
ein Lungenkarzinom gewonnen. Direkt nach Entnahme wurden sie im Verhältnis 1:5
mit Saccomanno-Fixativ (50% Ethanol / 2% Polyethylenglycol 1500 / 60 mg/l Rifampicin) versetzt und zum Institut für Cytopathologie, Heinrich-Heine-Universität (HHU),
Düsseldorf, geschickt. Die Proben wurden hier zunächst bei 670 x g für 5 min zentrifugiert. Ein Teil des Zellsediments wurde zur Herstellung von zytologischen Ausstrichpräparaten verwendet, die nach Papanicolaou-Färbung in der diagnostischen Routine
befundet wurden. Die restlichen Zellen wurden in Saccomanno-Fixativ resuspendiert
und im Kühlschrank bei 4°C für spätere molekularbiologische Untersuchungen verwart.
Die klinischen Befunde der Patienten wurden durch Aktendurchsicht bei den behandelnden Ärzten erhoben. Die Tumorzellzahl in Bronchialsekreten wurde semiquantitativ
an den 4 Routineobjektträgern bestimmt. Die zytologisch Tumorzell-positiven Fälle
wurden dabei in zwei Gruppen unterteilt: a) Präparate mit wenigen Tumorzellen, d. h.
einzelne Tumorzellen oder kleine Tumorzellgruppen in bis zu drei Regionen (Tu +)
und b) multiple Tumorzellen, d. h. einzelne Tumorzellen oder kleine Tumorzellgruppen
in mindestens vier Regionen oder größere Tumorzellkomplexe (Tu ++). Die zytologischen diagnostischen Gruppen dringender Verdacht, zweifelhaft und falsch-negativ
wurden im Artikel „Standardization of cytopathologic diagnosis“ definiert (Böcking
1998).
2.2.2 Sputen
In Saccomanno fixierte Sputen wurden mit 2% (w/v) DTT-Lösung im Verhältnis 1:10
behandelt um den Schleim zu aufzulösen. Für die Routine wurden vier Ausstriche auf
Objektträger angefertigt. Die restlichen Zellen wurden in Saccomanno-Fixativ
resuspendiert und im Kühlschrank bei 4°C für spätere molekularbiologische Untersuchungen verwart.
2.2.3 Gewebe
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Gerharz, Institut für Pathologie, Bethesda Krankenhaus Duisburg, konnte auf archiviertes, Formalin-fixiertes, Paraffin-eingebettetes
Gewebe zurückgegriffen werden.
2. Material und Methoden
23
2.3 Verwendeten Kollektive
2.3.1 Fall-Kontroll-Studien Kollektiv
Im Fall-Kontroll-Studien Design wurden insgesamt 314 Bronchialsekrete von 297 Patienten, bei denen primär ein Verdacht auf ein Lungenkarzinom bestand, untersucht. Alle
Patienten wurden in einem Zeitraum von Juli 2001 bis Juni 2003 bronchoskopiert. Von
16 Patienten wurden zwei und von einem Patienten drei Bronchialsekrete in die FallKontroll-Studien einbezogen. Diese Bronchialsekrete wurden entweder zeitgleich oder
bei einer nachfolgenden Bronchoskopie entnommen.
Tabelle 2.2: Angaben zum Fall-Kontroll-Studien Kollektiv. Die Tabelle ist unterteilt in Daten für die
Nicht-Tumorgruppe (NT) und Tumor Gruppe (Tu). Angegeben ist der Median des Alters mit der Altersspanne der Patienten, das Geschlecht, der Nikotinabusus, das Tumorstadium und die Histologie. Bei
„Stadium – entfällt“ sind die extrapulmonalen Primärtumoren mit Metastasierung in die Lunge zusammengefaßt.
NT-Pat. n = 85
Tu-Pat. n = 212
65 (21-82)
65 (37-89)
Geschlecht
weiblich
männlich
33
52
67
145
Raucher Status
Raucher
Ex-Raucher
keine Angaben
22
24
39
88
51
73
Alter
Stadium
I
II
III
IV
limited disease
extensive disease
unvollständige Daten
entfällt
6
2
20
45
29
10
94
6
Histologie
AC
SCC
NSCLCandere
SCLC
cSCLC
68
65
26
47
6
2. Material und Methoden
24
Die Nicht-Tumorgruppe umfaßte 89 Bronchialsekrete von 85 Patienten. Bei diesen Fällen wurden folgenden gutartigen Lungenerkrankungen diagnostiziert: 6x Asthma bronchiale, 39x chronische obstruktive Bronchitis, 5x Lungenembolie, 2x Lungenfibrose, 2x
obstruktive Schlafapnoe Syndrom, 23x Pneumonie, 1x Sarkoidose und 7x Tuberkulose.
Die Gruppe der malignen Erkrankungen umfaßte 225 Bronchialsekrete von 212 Patienten mit folgender Tumordiagnosen 68 AC, 64 SCC, 26 NSCLCandere, 47 SCLC und 6
kombinierte SCLC (cSCLC). Die Tumortypisierung wurde nach den Richtlinien der
„WHO Histological typing of Lung and Pleural Tumours“ (3. Auflage 1999) unter
Verwendung der zytologischen und histologischen Gutachten durchgeführt. Angaben zu
Alter, Geschlecht, Raucher-Status und Tumorstadien sowohl der Tumor- als auch der
Nicht-Tumorgruppe wurden in Tabelle 2.2 zusammengefaßt.
2.3.2 Kohorten-Studien Kollektiv
Im Zeitraum vom 07.07.2002 bis zum 31.10.2002 wurden insgesamt 400 Bronchialsekrete aus der Abteilung für Pneumologie des Florence-Nightingale-Krankenhauses, Düsseldorf, kontinuierlich gesammelt. Aus diesem Kollektiv wurde jeweils die erste
Einsendung des Patienten für eine retrospektive Kohorten-Studie verwendet. Bei zeitgleicher Einsendung mit mehrerer Bronchialsekrete wurde grundsätzlich das mit positiver zytologischer Diagnose molekularbiologisch untersucht. Bei negativer zytologischer
Diagnose wurde ein Bronchialsekret für die Studie zufällig ausgewählt. Im Kohortenstudien-Design wurden Bronchialsekrete von insgesamt 235 Patienten (103 NichtTumor-, 111 Lungentumor- und 21 sonstigen Patienten) untersucht. 108 Bronchialsekrete dieses Kollektivs wurde bereits in der oben beschriebenen Fall-Kontroll-Studie
verwendet. Angaben zum Alter, Geschlecht und den Nikotinabusus der einzelnen Gruppen befinden sich in Tabelle 2.3. Die Kategorie Nicht-Tumorpatienten umfaßte Bronchialsekrete von Patienten mit Verdacht auf ein Lungenkarzinom, das im Rahmen der
durchgeführten diagnostischen Maßnahmen ausgeschlossen werden konnte. Bei diesem
Kollektiv handelt es sich um Risikopatienten, bei denen folgende gutartige Lungenerkrankungen diagnostiziert wurden: Asthma bronchiale, chronische obstruktives Bronchitis, Lungenembolie, Lungenfibrose, obstruktive Schlafapnoe Syndrom, Pneumonie,
Sarkoidose und Tuberkulose. In der Gruppe der Tumorpatienten befanden sich 86
NSCLC und 25 SCLC. Die Gruppe schloß auch 33 Nachsorge-Patienten, ein Bronchialsekret aus der dem Tumor gegenüberliegenden Lunge und ein Bronchialsekret von einem Patienten 5 Monate vor Tumorerstdiagnose mit ein. Eine genaue Aufschlüsselung
2. Material und Methoden
25
nach Tumortyp und Staging ist in Tabelle 2.3 angegeben. Die Gruppe der 21 sonstigen
Fälle umfaßte 4 Bronchialsekrete von Patienten mit Metastasen, ein Bronchialsekret von
einem Morbus Hogdkin Fall mit mittelerer Dysplasie der Bronchialschleimhaut und 16
Bronchialsekrete von Patienten mit sonstigen Malignomen. Bei den sonstigen
Malignomen konnten drei nicht nach dem Referenzstandard (zytologische oder histologischer Sicherung) bewertet werden. Die verbliebenen 13 Fälle sind Patienten mit CUPSyndrom (1), epithelialem Mesotheliom (3), Pleuramesotheliom (3), Larynx-Karzinom
(1), Mesenchymom (1), Morbus Hodgkin (1), Non-Hodgkin-Lymphom der Lunge (1),
Pharynx-Karzinom (1) und pulmonalem Blastom (1).
Tabelle 2.3: Angaben zum retrospektiven Kohortenstudien-Kollektiv.
Die Tabelle ist unterteilt in Daten für die Nicht-Tumorgruppe (NT), die Tumor Gruppe (Tu) und sonstige
Patienten. Angegeben sind der Median des Alters mit der Altersspanne der Patienten, das Geschlecht, der
Nikotinabusus, das Tumorstadium und die Histologie.
NT-Pat. n = 103
Tu-Pat. n = 111
Sonstige n = 21
63 (21-82)
64 (43-83)
66 (34-83)
Geschlecht
weiblich
männlich
39
64
45
66
10
11
Raucher Status
Niemalsraucher
Raucher
Ex-Raucher
keine Angaben
4
40
40
18
1
61
29
20
4
7
4
7
Alter
Stadium
I
II
III
IV
limited disease
extensive disease
unvollständige Daten
entfällt
26
5
27
20
11
7
1
14
Histologie
AC
SCC
NSCLCandere
SCLC
cSCLC
33
28
25
23
2
2. Material und Methoden
26
2.3.3 Sputen Kollektiv
Insgesamt untersucht wurden Sputen von 10 Patienten. Darunter waren 6 Sputen mit
zytologisch dringendem Tumorverdacht und 4 Tumorzell-positive.
2.3.4 Formalin-fixiertes Gewebe Kollektiv
Das Kollektiv Formalin-fixierter Gewebe umfaßte Biopsien von 11 SCC- und 14
SCLC-Patienten. Es setzte sich aus 9 weiblichen und 16 männlichen Patienten im Alter
von 50 bis 84 (Median 62).
2.4 Vektoren
pCR® 2.1, Invitrogen, Karlsruhe
2.5 Bakterien
2.5.1 Bakterienstämme und ihre Anzucht
Der E. coli-Stamm INVαF´ wurde von der Firma Invitrogen, Karlsruhe, bezogen.
F´ endA1 recA1 hsdR17 (rk-, mk+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 ф80lacZ∆M15
∆(lacZYA-argF)U169 λDie E. coli-Bakterien wurden bei 37°C in LB-Medium unter Schütteln (250 rpm) für
mind. 14 h kultiviert. Zur Selektion von Plasmid-Transformanten wurde dem Medium
Ampicillin in einer Konzentration von 50 µg/ml zugesetzt.
Zum Anlegen von Gefrierkulturen wurde 1 ml einer frischen Übernachtkultur mit 15%
(v/v) Glycerin in einem Kryoröhrchen gemischt und bei –80°C gelagert.
2.5.2 Transformation kompetenter One Shot INVαF´ Zellen
Kompetente Zellen wurden auf Eis langsam aufgetaut, mit 2 µl T/A-Ligationsansatz
(vgl. 2.18.2) versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 30
sek bei 42°C im Wasserbad und einer Abkühlung auf Eis wurde zu den Bakterien 250
µl vorgewärmtes LB-Medium gegeben und diese für 1 h bei 37°C inkubiert. 50-200 µl
der Suspension wurden auf mit Antibiotika versetzte und mit je 40 µl (100 mM) IPTG
und (40 mg/ml) X-Gal bestrichene LB-Platten verteilt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Positive Klone erscheinen weiß bis blaßblau, da das LacZ-Gen des Vektors aufgrund der Insertion eines DNA-Fragmentes unterbrochen wird.
2. Material und Methoden
27
Alle Experimente mit veränderten Organsimen wurden unter Beachtung der Vorschriften des Gentechnikgesetzes vom 16.12.1993 (BGB1.1, S. 2066) sowie der GentechnikSicherheitsverordnung vom 14.03.1995 (BGB1.1, S. 297) durchgeführt.
2.6 Chemikalien
Alle in der Liste nicht aufgeführten Chemikalien, die in den Versuchen verwendet wurden, wurden von den Firmen Merck, Darmstadt, oder Sigma, Deisenhofen, mit der
Qualität p.A. bezogen.
Agarose SeaKem LE
Biorad, München
Biotinylierte Anti Mouse IgG
Vector/Alexis, Grünberg
Bromphenolblau (BPB)
Pharmacia Biotec, Schweden
Desoxynukleotidtriphosphat (dNTPs)
Invitrogen, Karlsruhe
DNA-Größenmarker
Invitrogen, Karlsruhe
Fötales Kälberserum
Seromed Biochrom, Deisenhofen
Hefeextrakt
Serva, Heidelberg
IPTG
Roche, Mannheim
Normalserum Pferd
Vector/Alexis, Grünberg
Penicillin/Streptomycin
Biochrom, Berlin
Sonicated Salmon Sperm DNA
Amersham Pharmacia, Freiburg
Trypsin
Biochrom, Berlin
X-Gal
Roche, Mannheim
Xylencyanol (XC)
USB, Ohio, USA
Zellkulturmedium
Invitrogen, Karlsruhe
2.7 Enzyme
EcoRI
NE BioLabs, Frankfurt a.M.
Expand High Fidelity Polymerase
Roche, Mannheim
LightCycler-FastStart DNA Master
Hybridization Probes
Roche, Mannheim
HotMaster Taq DNA Polymerase
Eppendorf, Hamburg
PLATINUM Taq Polymerase
Invitrogen, Karlsruhe
Proteinase K Lösung
Invitrogen, Karlsruhe
SssI Methylase
NE BioLabs, Frankfurt a.M.
2. Material und Methoden
28
2.8 Antikörper
5-Methylcytosine (Ab-1)
Oncogene/Biosciences, Darmstadt
2.9 Molekularbiologische Kits
Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (01)
für den ABI PRISM 377 DNA Sequencer
Applied Biosystems, CA, USA
E. Z. N. A. Plasmid Miniprep Kit I
Peqlab, Erlangen
Intergen CpGenome DNA Modification Kit
Intergen Company, NY, USA
NucleoSpin Tissue
Macherey-Nagel, Düren
NucleoTraP®CR
Macherey-Nagel, Düren
Puregene DNA Isolation Kit
Gentra Systems, MN, USA
QIAamp DNA Mini Kit
Qiagen, Hilden
QIAquick PCR Purification Kit
Qiagen, Hilden
QIAquick Extraction Kit
Qiagen, Hilden
TA Cloning® Kit, Version T
Invitrogen, Karlsruhe
Vectastain ABC Elite Standard
Vector/Alexis, Grünberg
Wizard DNA Clean-Up
Promega, WI, USA
2.10 Medien, Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden nach Vorschrift aus Molecular Cloning mit ddH2O
hergestellt, sterilfiltriert oder autoklaviert (Sambrook und Russell 2001).
2.10.1 Medien zur Anzucht von Zellkulturzellinien
Dulbecco´s Modified Eagle Medium mit stabilisiertem Glutamin wurde mit 15%
hitzeinaktiviertem FCS und 100 U/ml Penicillin sowie 100 µg/ml Streptomycin versetzt.
2.10.2 Medien zur Anzucht von E. coli-Zellen
LB-Medium (1000ml)
10 g Typton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
ad H2O und auf pH 7,5 einstellen
2. Material und Methoden
29
LB-Agar
LB-Medium + 1,5% (w/v) Agar
autoklavieren und entsprechendes Antibiotikum nach dem Abkühlen zusetzen
2.10.3 Lösungen für DNA Extraktion
Proteinase K Puffer
0,01 M Tris-HCl pH 7,8
0,005 M EDTA pH 8,0
0,5% SDS
2.10.4 Lösungen für Elektrophoresen
Laufpuffer für Agarose-Gele (TBE-Puffer)
8,9 mM Tris
8,9 mM Borat
2 mM EDTA
5 x DNA Ladepuffer
2,5 mM Tris-HCl pH 8.0
50 mM EDTA pH 8,0
90% Glycerin
0,01% Bromphenolblau
0,01% Xylencyanol
2.10.5 Lösungen für Immunzytochemie und -histochemie
10xTBS
245 mM Tris
1 M NaCl
ad 1l mit aqua dest. und auf pH 7,6 einstellen
10 mM Citratpuffer pH 6,0
Stammlösung A:
0,1 M Citronensäure
Stammlösung B:
0,1 M Natriumcitrat
beide Lösungen bei 8°C im Kühlschrank lagern, kurz vor Gebrauch 1,8 ml Stammlösung A mit 8,2 ml Stammlösung B mischen und auf pH 6,0 einstellen.
2. Material und Methoden
30
2.10.6 Lösungen für Feulgen-Färbung
10% gepuffertes Formalin
100 ml Formalin
900 ml ddH2O
4 g NaH2PO4
6,5 g NaHPO4
5 N HCl
414 ml 37% rauchende HCl
586 ml ddH2O
SO2-Wasser
Stammlösung:
100 g Kaliumdisulfid K2S2O5
900 ml ddH2O
Lösung in dunkler Flasche aufbewahren
Gebrauchslösung:
50 ml Stammlösung
50 ml 1 N HCl
900 ml ddH2O
2.11 Geräte, Apparaturen, sonstiges Material
ABI PRISM 377 DNA Sequencer
Applied Biosystems, CA, USA
BioDocAnalyze
Whatman Biometra, Göttingen
BioPhotometer
Eppendorf, Hamburg
Consort E833 Power Supply
Consort, Belgien
EPS 301 Power Supply
Amersham Pharmacia, Freiburg
Gelelektrophoresekammern:
Hoefer HE 33 Mini Submarine
Hoefer Pharmacia Biotech, USA
Perfect Blue Mini M
PEQLAB GmbH, Erlangen
Labor-pH-Meter 765
Knick, Berlin
LightCycler
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
LightCycler Capillaries
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Microdissector PPMD
Eppendorf, Hamburg
Micro Feather Skapell Nr. 715
Feather, USA
Rotationsmikrotom HM 340 E
Microm, Walldorf
2. Material und Methoden
31
Shandon Färbeautomat
Thermo-Electron, Dreieich-Buchschlag
T-gradient PCR-Cycler
Whatman Biometra, Göttingen
Thermomixer Comfort
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 4515D
Eppendorf, Hamburg
UV-Leuchttisch TFX
Vilber Lourmat, Frankreich
Uvette
Eppendorf, Hamburg
2.12 Software
Access, Microsoft
AutoCyte QUIC-DNA-System, Autocyte, Burlington, USA
Human Genome Server – The Sanger Centre [http://www.ensembl.org]
PubMed, Nucleotide, Protein, OMIM [http://www.ncbi.nlm.nih.gov]
2.13 Sequenzen
Alle Oligonukleotide und TaqMan®-Sonden wurden bei der Firma MWG-Biotech,
Ebersberg, bestellt. Die Stocklösungen wurden auf 100 pmol/µl eingestellt und bei
–20°C gelagert. Die Gebrauchslösungen der unmodifizierten Oligonukleotide wiesen
eine Konzentration von 10 pmol/µl oder 20 pmol/µl auf. Die TaqMan®-Sonden wurde
auf eine Konzentration von 4 pmol/µl verdünnt.
2.13.1 Oligonukleotide für DNA-Extraktions Studie
Tabelle 2.4: Oligonukleotide für die Untersuchungen zur Amplifizierbarkeit von aus Saccomanno Fixativ
extrahierter DNA. Angegeben sind Genname, Primer-Sequenz (F = forward, R = reverse), Hybridisierungstemperatur und Größe des zu erwartenden PCR-Fragments.
Gen
Primer-Sequenz
Hybrid.
Temp.
Größe
[bp]
ß-Globin
F: 5´-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3´
R: 5´CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3´
55°C
268
ß-Globin
F: 5´- GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-3´ 55°C
R: 5´-GCT CAC TCA GTG TGG CAA AG-3´
536
ß-Globin
F: 5´-ATT TTC CCA CCC TTA GGC TG-3´
R: 5´-TGG TAG CTG GAT TGT AGC TG-3´
989
55°C
2. Material und Methoden
32
2.13.2 Oligonukleotide für Promotor Methylierungs-Nachweis mittels QMSP
Tabelle 2.5: Für den Nachweis von Methylierung in Promotorenregionen verschiedener Gene wurden
methylierungsspezifische Oligonukleotide und TaqMan®-Sonden konstruiert. Angeben sind die Namen
der zugehörigen Gene, die Oligonukleotidsequenz (F = forward, R = reverse, unterstrichen sind durch die
Bisulfitkonversion modifizierte Basen), die Hybridisierungstemperatur, die Anzahl der durch die drei
Oligonukleotide abgedeckten CpG-Dinukleotide und die Fragmentgröße des zu erzeugenden PCRProduktes. Accession no. der NCBI-Datenbank und die Position des PCR-Fragmentes: APC: Accession
no. U02509, Position 716-834; p16INK4a: Accession no. U12818, Position 129-199; RARB2: Accession
no. X56849, Position 951-1095; RASSF1A: Accession no. AC002481, Position 17883-18052; MYOD1:
Accession no. AF027148, Position 4860-5021.
GenPrimer-Sequenz
Promotor
Hybrid Anzahl Größe
[bp]
Temp. CpG
APC
58°C
8
74
58°C
7
70
60°C
11
146
61°C
10
169
58°C
10
83
58°C
0
161
F: 5´-GAA CCA AAA CGC TCC CCA T-3´
R: 5´-TTA TAT GTC GGT TAC GTG CGT TTA TAT-3´
TaqMan®: 5´-6FAM-CCC GTC GAA AAC CCG CCG ATT ATAMRA-3´
p16INK4a
F: 5´-TGG AGT TTT CGG TTG ATT GGT T-3´
R: 5´-AAC AAC GCC CGC ACC TCC T-3´
TaqMan®: 5´-6FAM-ACC CGA CCC CGA ACC GCG-TAMRA-3´
RARB2
F: 5´-CGA GAA CGC GAG CGA TTC-3´
R: 5´-GAC CAA TCC AAC CGA AAC GA-3´
TaqMan®: 5´-6FAM-CCT TCC GAA TAC GTT CCG AAT CCT ACTAMRA-3´
RASSF1A
F: 5´-GGT TTT GCG AGA GCG CGT-3´
R: 5´-GCT AAC AAA CGC GAA CCG AAC-3´
TaqMan®: 5´-6FAM-GGA GGC GTT GAA GTC GGG GTT CTAMRA -3´
SEMA3B
F: 5´-GGT TGT TTG TTC GGT TAT TCG ATT-3´
R: 5´-CCC ACC AAA CCA ACC ACC G-3´
TaqMan®: 5´-6FAM-CAC GCA CCG CCC GCC GTA CC-TAMRA-3´
MYOD1
F: 5´-CCA ACT CCA AAT CCC CTC TCT TTA T-3´
R: 5´-TGA TTA ATT TAG ATT GGG TTT AGA GAA GGA-3´
TaqMan®: 5´-6FAM-TCC CTT CCT ATT CCT AAA TCC AAC CTA
AAT ACC TCC-TAMRA-3´
2. Material und Methoden
33
2.13.3 Oligonukleotide für die Klonierung von Promotorfragmenten
Tabelle 2.6: Oligonukleotide für die Klonierung von Promotorfragmenten.
Angeben sind die Namen der zugehörigen Gene, die Primer-Sequenz (durch die Bisulfitkonversion modifizierte Basen sind unterstrichen), die Hybridisierungstemperatur und die Fragmentlänge des zu erzeugenden PCR-Produktes. F = forward, R = reverse. Bei der PCR für RASSF1A wurden 5% Formalin zugesetzt.
Gen
Primer-Sequenz
Hybrid.
Temp.
Größe
[bp]
APC
F: 5´- GTT AGG GTT AGG TAG GTT GTG -3´
R: 5´- ACA ACA CCT CCA TTC TAT CTC C -3´
60,6°C
220
RARB2
F: 5´- AGT TGT TTG AGG ATT GGG ATG -3´
R: 5´- AAT CAT TTA CCA TTT TCC AAA
CTT AC -3´
57,5°C
195
RASSF1A
F: 5´- GAG GGA AGG AAG GGT AAG G -3´
R: 5´-CAA CTC AAT AAA CTC AAA CTC CC-3´
60°C
259
2.13.4 Oligonukleotide für die Sequenzierung
Tabelle 2.7: Die Oligonukleotide M13 F und M 13 R wurden für die Sequenzierung der klonierten Promotorfragmente der Gene APC, RARB2 und RASSF1A verwendet. Die Oligonukleotide APC-F und APCR wurden zum direkten Sequenzieren der DNA aus Bronchialsekreten genutzt. F = forward, R = reverse.
Name
Primer-Sequenz
M13 F
5´- GTA AAA CGA CGG CCA G -3´
M13 R
5´- GTC CTT TGT CGA TAC TG -3´
APC-F
5´- CCT ATA CCC CAC TAC GAA ATA C -3´
APC-R
5´- GAA GTT TGG GTT ATG GTG GTT TTA GTA TT -3´
2.14 Mikrodissektion an histologischem Material
Von Formalin fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe wurden mit einem Rotationsmikrotom 10 µ Schnitte angefertigt und diese in einem 37°C warmen Wasserbad auf
Objektträger aufgezogen. Die Präparate wurden zunächst in Xylol entparaffiniert und
anschließend durch eine absteigende Alkoholreihe (99,5 %, 96 %, 70 % EtOH für je 5
min) geführt. Die Schnitte wurden für 5 sek in Hämatoxilin gefärbt und anschließend
bis zur Mikrodissektion gewässert.
2. Material und Methoden
34
Präparate mit nur wenigen Nicht-Tumorzellen wurden manuell mit Micro-FeatherSkapellen unter Sicht im Inversionsmikroskop mikrodisseziert. Für aufwendigere Präparationen wurde der Eppendorf Mikrodissektor PPMD genutzt. Um die Morphologie der
Zellen klar zu erkennen und sie präparieren zu können, wurden die Objektträger zunächst durch eine aufsteigende Alkoholreihe gezogen und dann mit Xylol überschichtet.
Interessante Zellkomplexe wurden mit einer Femto-Glaskapillare oder einem Mikrochisel vorsichtig vom Objektträger gelöst und mit einer Pipettenspitze abgesaugt. Die
mikrodissezierten Zellkomplexe wurden in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bis
zur DNA-Extraktion bei 4°C gelagert.
2.15 Isolierung von Nukleinsäuren
DNA aus Kulturzellen, Bronchialsekreten, Sputen und mikrodisseziertem Gewebe wurde über Proteinpräzipitation mit Hilfe des Puregene DNA Isolation Kits nach Herstellerangaben extrahiert. Die Lyse des jeweiligen Materials ist unter 2.15.1.1 / 2 / 3 beschrieben. Außerdem wurde DNA aus Bronchialsekreten für die DNA ExtraktionsStudie mit Phenol-Chloroform – wie bei Sambrook und Russell beschrieben – und zwei
auf Silikamembran basierenden Kits – NucleoSpin Tissue und QIAquick Extraction Kit
– nach Herstellerangaben isoliert (Sambrook und Russell 2001).
2.15.1.1 Kulturzellen
Die Zellen einer konfluent bewachsenen 175 cm2- Kulturflasche wurden nach Absaugen
des Mediums zunächst trypsiniert und unter Zugabe von 2 ml frischem Medium/FCS
mit 1.500 x g für 10 min bei 4°C pelletiert. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS
gewaschen und in 2 ml Zell-Lysispuffer mit 2 µl Proteinase K (20 mg/ml) für 30 min
bei 65°C inkubiert.
2.15.1.2 Bronchialsekrete und Sputen
Die Bronchialsekrete und Sputen wurden bei 750 x g zentrifugiert und der Überstand
abgegossen. Ca. 50 µl Zellen wurden in 1,5 ml Reaktionsgefäße übertragen, mit 250 µl
Lysepuffer und 2 µl Proteinase K (20 mg/ml) versetzt und für 30 min bei 65°C
inkubiert.
2. Material und Methoden
35
2.15.1.3 mikrodisseziertes Gewebe
Das mikrodissezierte Gewebe wurde in 250 µl Lysepuffer aufgenommen und mit 2 µl
Proteinase K (20 mg/ml) versetzt. Die Schnitte wurden bei 65°C und 450 rpm schüttelnd über Nacht inkubiert. Bei Bedarf wurde erneut Proteinase K dazugegeben und die
Inkubationszeit verlängert bis die Schnitte vollständig aufgelöst waren.
2.16 Ethanolfällung von DNA
Für eine Ethanolfällung wurde die DNA-Lösung mit einem Zehntel ihres Volumens an
3 M NaAc (pH 5,2) und dem 2,5fachem ihres Volumens an EtOHabsolut versetzt und gut
geschüttelt (vortex). Die Proben wurden für mindestens 2 Stunden bei -20°C inkubiert
und anschließend für 30 min bei 16.000 x g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und das DNA-Sediment mit 70%igen EtOH versetzt. Die
Proben wurden für 15 min bei 16.000 x g zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen,
die DNA getrocknet und in ddH2O resuspendiert.
2.17 Quantitäts- und Qualitätskontrolle der Nukleinsäurelösung
Die Konzentration und Reinheit der isolierten DNA wurde photometrisch bei 260 nm
und 280 nm ermittelt. Dabei entspricht die Extinktion von 1,0 einer OD einer DNAKonzentration von 50 µg/ml. Die Nukleinsäure liegt bei einem Quotienten OD260/OD280
von 1,8-2,0 proteinfrei vor.
Durch Auftragen von 500 ng bis 1 µg unverdauter DNA auf ein 0,3%iges Agarosegel
wurde die Intaktheit der DNA überprüft. Durch Bestimmung der Rf – Werte (retarding
front) mit der BioDocAnalyse Software konnte das Laufverhalten der aufgetragenen
Proben exakt bestimmt werden.
2.18 Enzymatische Reaktionen
2.18.1 Methylierung der DNA mit SssI-Methylase
Der Reaktionsansatz für einen 50 µl-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
1 µg DNA
5 µl 10x Reaktionspuffer
0,25 µl 200xSAM (S-Adenosylmethionin)
0,5 µl SssI Methylase
2. Material und Methoden
36
Der Reaktionsansatz wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und die Methylase
anschließend durch Erhitzen bei 65°C für 20 min inaktiviert.
2.18.2 Klonierung von PCR-Produkten
Bei der PCR-Reaktion mit einer Taq-Polymerase wird an das 3´-Ende eines neu synthetisierten DNA-Stranges ein zusätzliches Adenosin-Nukleotid angehängt. Diese Eigenschaft kann man sich beim Klonieren zu nutzen machen, wenn man einen
T/A-Klonierungsvektor mit komplementären Thymidin-Überhängen verwendet.
Nach Aufreinigung der zu klonierenden PCR-Fragmente (2.21.3) wurden 1-3 µl mit 10
ng Vektor, 1x Ligationspuffer und 1 µl T4 DNA Ligase auf ein Volumen von 10 µl gebracht und bei 14°C für 16 Stunden inkubiert. Für die Transformation wurden 2 µl des
Ligationsansatzes verwendet (vgl. 2.5.2), der Rest wurde im Kühlschrank aufbewahrt.
2.18.3 Analyse der Klonierungsprodukte mittels EcoRI-Verdau
Der Erfolg der Klonierung wurde mit einem EcoRI Restriktionsenzymverdau überprüft.
Dazu wurden 5 µl isolierte Plasmid-DNA, 2 µl 10x Puffer H, 12 µl ddH2O und 1 µl
EcoRI je Ansatz verwendet und für 2 h bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde auf einem
1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Bei einer erfolgreichen Klonierung waren zwei Banden zu erwarten, eine bei 2.789 bp und eine bei 16 bp plus die bp-Anzahl des klonierten
Fragments.
2.19 DNA-Agarosegelelektrophorese
Die DNA-Proben und ein geeigneter Längenstandard wurden mit 1/5 Volumen Ladepuffer versetzt und auf einem Agarosegel in 1x TBE-Puffer bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Dabei wurde in Abhängigkeit von der Fragmentgröße ein Gel von
0,3% bis 1,5% verwendet. Durch Zugabe von 0,5 µg/ml Ethidiumbromid in das Gel
wurden die Nukleinsäuren angefärbt und konnten auf einem Transilluminator bei 302
nm betrachtet werden.
2.20 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem QIAqiuck
Extraction Kit nach Herstellerangaben. Dazu wurde die zu isolierende DNA-Bande aus
dem Gel ausgeschnitten und das Gelstück mit 3 Volumen Puffer QC bei 50°C aufgelöst.
Die DNA wurde über Silicagel-Säulchen aufgereinigt und mit 30 µl dH2O von der
Membran eluiert.
2. Material und Methoden
37
2.21 Polymerase-Kettenreaktion
2.21.1 ß-Globin PCR
Von dem β-Globin-Gen wurden drei unterschiedlich große Fragmente (268 bp, 536 bp,
989 bp) amplifiziert. In den Reaktionsansatz von 100 µl wurden je 100 ng isolierte
DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM je Oligonukleotidpaar, 0,2 mM dNTP und 2,5 U PlatinumTaq eingesetzt. Genaue Angabe zu Oligonukleotiden und Hybridisierungstemperatur sind in Tabelle 2.4 zu finden. Die PCRBedingungen waren wie folgt:
Zyklenzahl
Denaturierung
1
95°C / 5 min
35
95°C / 1min
Hybridisierung
Elongation
55°C / 1min
72°C / 2min
Je 10µl PCR-Produkt wurde mit 2 µl DNA Ladepuffer versetzt und auf einem 1%igen
Agarosegel aufgetrennt. Durch Vergleich mit Marker-DNA wurde die Größe des PCRProduktes überprüft.
2.21.2 QMSP
Die Methylierung fünf verschiedener Gen-Promotoren (APC, p16INK4a, RARß2,
RASSF1A, SEMA3B) wurde nach Bisulfitkonversion der DNA mit der quantitativen
methylierungs-spezifischen PCR (QMSP) untersucht. Jede PCR wurde mit Negativund Positivkontrollen durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde eine Probe ohne DNA
verwendet. DNA der Zellinie NCI-H522 (Promotor bei APC und RASSF1A methyliert),
T24 (Promotor bei p16INK4a und SEMA3B methyliert) und mit SssI-Methylase behandelte DNA der Zellinie Wi-38 (alle Promotoren methyliert) dienten als Positivkontrolle.
Als interne Referenz wurde für jede Probe eine CpG-freie Sequenz aus der Promotorregion des MYOD1 Gens amplifiziert. Mit dieser internen Kontrolle konnten Rückschlüsse auf den Erfolg der Bisulfitkonversion und den Erhaltungszustand der DNA gezogen
werden. Außerdem ermöglichte die interne Referenz eine Quantifizierung des PCRProduktes (s. u.).
2. Material und Methoden
38
In einem 20 µl QMSP-Ansatz wurden 50 ng umgewandelte DNA, 600 nM je Primer,
200 nM TaqMan®-Sonde, 3,5 mM MgCl2 und 2 µl LightCycler-FastStart DNA Master
Hybridization Probes eingesetzt. Die QMSP-Reaktion wurde in LightCycler Kapillaren
in einem LightCycler unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Zyklenzahl
Denaturierung
1
95°C / 10 min
60
95°C / 10 sek
Hybridisierung
Elongation
58-61°C / 8 sek
72°C / 10 sek
1
40°C / 30 sek
Genaue Angaben zu den Oligonukleotiden, TaqMan®-Sonden, PCR-Fragmentlängen
und Hybridisierungstemperaturen finden sich in Tabelle 2.5.
Die Auswertung der QMSP erfolgte sowohl qualitativ als auch quantitativ. Je 10 µl
PCR-Produkt wurden mit 2 µl DNA Ladepuffer versetzt und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Durch Vergleich mit einer DNA-Leiter wurde die Größe des PCRProduktes überprüft. Die QMSP Ergebnisse für die Untersuchungen am APC Promotor
1A und am RARB2 Promotor wurden mittels Endpunkt-Analyse und Schwellenwert
(Cut off) bestimmt. Dabei wurde das Methylierungslevel als Verhältnis zweier absoluter
Meßwerte definiert:
Methylierungslevel [%] =
zu untersuchender Promotor
x 100%.
interne Referenz MYOD1
Der Cut off für APC wurde auf 35 und für RARB2 auf 30 festgelegt. Alle Werte ≥ dem
Cut off wurden als positiv gewertet. Die QMSP Ergebnisse für die Promotoren von
p16INK4a, RASSF1A und SEMA3B wurden mittels Kreuzungspunkt-Analyse bestimmt.
Hierbei wurden alle Werte ≥ 0 als positiv gewertet.
Zur Bestimmung der Sensitivität der der Primer/Sonden Paare wurde für jeden GenPromotor eine Verdünnungsreihe mit Gemischen aus Zellinien-DNA mit entsprechender Promotormethylierung und Lachsspermien- oder Wi-38 DNA hergestellt. Die Verdünnungsreihe wurde mit Bisulfit behandelt und mit der entsprechenden QMSP
untersucht.
2. Material und Methoden
39
2.21.3 PCR zur Klonierung von Promotorfragmenten
In den 20 µl PCR-Ansatz wurden 3 µl Bisulfit konvertierte DNA, 0,2 mM dNTP, 0,3
µM je Oligonukleotid, 1,25 U Eppendorf Hot Start Taq und 1 x PCR Puffer mit MgCl2
gegeben. Die PCR Bedingungen waren wie folgt:
Zyklenzahl
Denaturierung
1
94°C / 3 min
34
94°C / 1 min
Hybridisierung
Elongation
57,5°C; 60°C bzw. 60,6°C / 45 sek 65°C / 1 min
1
65°C / 8 min
Das komplette PCR-Produkt wurde mit 4 µl DNA Ladepuffer versetzt und auf einem
1%igen Agarosegel aufgetrennt. Durch Vergleich mit Marker-DNA wurde die Größe
des PCR-Produktes überprüft. Die Produktbande wurde mit einem Skapell ausgeschnitten und die DNA mit dem QIAqiuck Extraction Kit nach Herstelleragaben isoliert.
2.22 DNA-Analyse mittels Bisulfit
Die Bisulfitkonversion von DNA ermöglicht es Cytosin von methyliertem 5-MethylCytosin zu unterscheiden. Dabei wird während der Behandlung der DNA mit Natriumbisulfit Cytosin zu Uracil deaminiert, wohingegen 5-Methyl-Cytosin chemisch unmodifiziert bleibt. Mit methylierungsspezifischen Oligonukleotiden ist es möglich, den
Methylierungsstatus einzelner Sequenzabschnitte nach Bisulfitkonversion mittels PCR
zu untersuchen.
Zu Beginn der Arbeit wurde die aus Bronchialsekreten isolierte DNA mit dem CpGenome DNA Modification Kit nach Herstellerangaben konvertiert. Zu einem späteren
Zeitpunkt wurde das Kit durch ein von Herman und Mitarbeitern 1996 publiziertes Protokoll ersetzt (Herman et al. 1996), das zunächst für die Anwendungen in der vorliegenden Arbeit optimiert werden mußte. Die Konversion wurde wie nachstehend
beschrieben durchgeführt. Für jede Bisulfitkonversion wurde 1 µg DNA eingesetzt. Die
DNA wurde mit 0,3 M NaOH-Lösung für 15 min bei 37°C denaturiert. Dem 50 µl
Reaktionsansatz wurden 30 µl 10 mM Hydrochinon- und 520 µl 3 M Natriumbisulfitlösung zugesetzt und anschließend für 16-20h bei 50°C inkubiert. Die Aufreinigung der
DNA erfolgte mit dem Wizard DNA Purification Kit nach Herstellerangaben. Die DNA
wurde in 50 µl H2O eluiert und mit einer Endkonzentration von 0,3 M NaOH für 5 min
bei RT inkubiert. Anschließend wurde die DNA mit Ethanol gefällt und in 20 µl H2O
resuspendiert (s. 2.16).
2. Material und Methoden
40
2.23 Sequenzierung
Die nicht radioaktive Sequenzierung von Plasmiden und PCR-Fragmenten wurde mit
Hilfe des BigDye Sequenzierungskits und dem ABI PRISMTM 377 DNA Sequenzierungsgeräts der Firma ABI durchgeführt. In den Reaktionsansatz mit 10 µl Volumen
wurden 100-150 ng DNA oder 500 ng Plasmid-DNA, 2,5 pmol Primer und 2 µl BigDye
eingesetzt. Die PCR-Bedinungen waren wie folgt:
Zyklen
Denaturierung
1
96°C / 5 min
25
96°C / 30 sek
Hybridisierung
Elongation
50°C / 15 sek
60°C / 4 min
Die DNA wurde mit EtOH gefällt (s. 2.16) und anschließend in 15 µl HPLC-H2O resuspendiert. Die Proben wurden im Sequenzer mit POP6-Polymer aufgetrennt und die
Sequenzen anschließend durch Vergleich mit der NCBI-Datenbank abgeglichen.
2.24 Nachweis von DNA-Hypomethylierung mittels 5-MethylcytosinAntikörper AB-1
2.24.1 Vorbehandlung des Zellmaterials
2.24.1.1 Zellen aus Bronchialsekreten
Für die Immunfärbung wurden Zytozentrifugate mit einem Durchmesser von 5 mm angefertigt. Dazu wurden Saccomanno fixierte Bronchialsekrete bei 670 xg für 5 min
zentrifugiert, dekantiert und das Pellet im restlichen Saccomanno resuspendiert. Ein
Teil des Pellets wurde in Zytotunnel gegeben und die Zellen mittels Zytozentrifuge bei
700 xg für 10 min auf Objektträger (OT) zentrifugiert. Die OT wurden nach Papanicolaou gefärbt und erneut befundet. Die Deckgläser wurden in Xylol von den OT abgelöst.
Die OT wurden für je 5 min in 100% und 96% Ethanol inkubiert. Nach einer Nachfixation der Zellen mit eiskaltem Methanol/Eisessig (3:1) für 15 min wurden die Präparate
schnell getrocknet, für einen Tag bei RT und für 48h bei 50°C gealtert. Die OT wurden
mit der Zell-beschichteten Seite nach oben in Petrischalen gelegt und mit 1x PBS überdeckt. Die Schalen wurden mit 40 cm Abstand unter einer 60 W starken UV-Lampe
(254nm) platziert und die Präparate für 10h bestrahlt. Nach 30 min Inkubation in
MeOH / 3% H2O2 wurden die OT zweimal in 1x PBS für je 5 min gewaschen. Danach
erfolgte die immunologische Reaktion wie unten beschrieben (siehe 2.24.2).
2. Material und Methoden
41
2.24.1.2 Histologische Schnitte
Bei histologischem Material wurden 4 µm Schnitte mit einem Rotationsmikrotom angefertig und im 37°C warmen Wasserbad auf OT aufgezogen. Die Schnitte wurden in Xylol entparaffiniert und für je 5 min in 100% und 96% Ethanol gestellt. Anschließend
wurden die OT für 30 min in MeOH / 3% H2O2 inkubiert. Die OT wurden für je 5 min
in 70% Ethanol und Aqua dest. gespült. Anschließend wurden die OT zweimal für je 5
min in kochendem Citratpuffer bei 600 W in der Mikrowelle behandelt. Nach zweimaligen Waschen der OT in 1x PBS für je 5 min wurde die immunologische Reaktion wie
unten beschrieben durchgeführt (siehe 2.24.2)
2.24.2 Immunologische Reaktion
Für den Serumblock wurde eine Lösung aus 1,5 ml Normalserum vom Pferd in 98,5 ml
1x TBS-Puffer auf die OT getropft und für 20 min einwirken gelassen. Nach Abschütten der Flüssigkeit vom OT wurden die Präparate mit dem 5-Methylcytosin (AB-1) Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 über Nacht bei RT inkubiert. Nach zwei
Waschschritten mit 1x PBS wurden die Zellen 30 min mit einem Link (225 µl Normalserum vom Pferd/75 µl biotinyliertes Anti Mouse IgG/14,7 ml 1x TBS) behandelt. Nach
2 Waschschritten mit 1x PBS wurden die OT mit ABC Elite Standard bedeckt und für
40 min inkubiert. Nach Waschen in 1x PBS wurden die OT je nach Bedarf für 1 bis 10
min in einer DAB-Lösung (120 mg DAB und 50 µl 30% H2O2 in 200 ml 1x PBS) entwickelt. Die Färbereaktion wurde durch 5 min Wässern gestoppt. Die Zellen wurden für
5-10 sek mit Hämatoxilin gegengefärbt. Die OT wurden anschließend nochmals gewässert und mit Aquatex eingedeckt.
2.24.3 Auswertung der immunologischen Reaktion
2.24.3.1 Zytologisches Material
Die zytologischen Präparate galten nur dann als auswertbar, wenn mindestens 90% der
Granulozyten eine starke Immunfärbung aufwiesen. Die Granulozyten wurden als
Referenzzellen verwendet. Die Intensität der Immunreaktion von Tumor- und Referenzzellen wurde visuell miteinander verglichen. Erschien der überwiegende Teil der
Tumorzellen blasser gefärbt als die Referenzzellen so wurde der Fall als hypomethyliert
gewertet.
2. Material und Methoden
42
2.24.3.2 Histologisches Material
Die Auswertung der 5-Methylcytosin Antikörperfärbung an histologischen Präparaten
wurde mittels Bild-Densitometrie analog zur DNA-zytometrischen Auswertung der
Feulgen Färbung (vgl. 2.25.2) durchgeführt. Statt des Interferenzfilters bei 570 nm
wurde ein Blaufilter verwendet. Für die Messung wurden Bereiche ausgewählt, die kräftig gefärbte Lymphozyten, Granulozyten oder Mitosen als interne Referenz aufwiesen.
Dementsprechend wurden die Analysezellen nur in Arealen gemessen, die zwischen
kräftig gefärbten Referenzzellen lagen. Insgesamt wurden mindestens 30 Lymphozyten
als Referenzzellen und 100 Tumorzellen als Analyse-Zellen gemessen.
Die integrierte optische Dichte (IOD) der 5-Methylcytosin Antikörperfärbung der Analysezellen wurde um die am selben Präparat mittels Bild-Zytometrie bestimmte mittlere
DNA-Ploidie korrigiert. Die verwendete Formel lautet wie folgt:
Methylierung [%] =
IOD Analyse x 2 [c]
x 100
IOD Referenz x DNA - Ploidie
2.25 Bild-Zytometrie
2.25.1 Feulgen Färbung
Die Feulgen Färbung wurde in einem Shandon Färbeautomaten nach folgendem Protokoll durchgeführt: 15 min Xylol, 5 min 100% EtOH, 5 min 96% EtOH, 50 min 10%
gepuffertes Formalin, 10 min ddH2O, 5 min ddH2O, 60 min 5 N HCl 27°C, 3x 2 min
ddH2O, 60 min Schiff´s Reagenz, 3x 5 min SO2-Wasser, 2x 1 min ddH2O, 3 min 70%
EtOH, 3 min 96% EtOH, 3 min 100% EtOH, 10 min Xylol. Anschließend wurden die
Präparate mit Entellan eingedeckt und im Dunklen bis zur Durchführung der DNABild-Zytometrie aufbewahrt.
2.25.2 DNA-Bild-Zytometrie
Die Messung des DNA-Gehalts einzelner Kerne erfolgte über die photometrische Bestimmung der integrierten optischen Dichte der feulgen-gefärbten Zellkerne. Verwendet
wurde dazu das AutoCyte QUIC-DNA-System in Kombination mit einem konventionellen Lichtmikroskop (Zeiss Axioplan 2). Die an einen Computer angeschlossene
CCD-schwarz-weiß-Kamera mit einer Auflösung von 572 Linien ermöglichte eine Projektion der Zellen auf einen Monitor. Dort erfolgte die Auswahl der einzelnen zu messenden Kerne. Diese wurden fokussiert und über die Select-Funktion automatisch erfaßt. Die Bildverarbeitungssoftware ist im Stande Kerngrenzen zu detektieren, Kernflä-
2. Material und Methoden
43
chen zu errechnen und die integrierte Dichte innerhalb der Meßmaske zu bestimmen.
Durch gleichzeitige visuelle Kontrolle wurde die Messung von Artefakten verhindert
und eine nicht zutreffende Auswahl von Kernen durch eine manuelle Korrektur geändert. Die Messungen erfolgten im grünen Licht bei 570 nm (Interferenzfilter 570 ± 10
nm) im Bereich des Absorptionsmaximums der mit fuchsinschwefelhaltiger Säure konjugierten DNA. Die Kerne absorbieren das Licht entsprechend der gebundenen Farbstoffmenge. Die unterschiedliche Absorption des Lichts ist im schwarz-weiß Kamerabild durch unterschiedliche Graustufen bis hin zur vollständigen Schwärzung der Zellkerne visualisiert. Zu Beginn jeder Messung wurde ein Lichtabgleich durchgeführt, da
jedes Präparat einen eigenen Wert für die Lampenspannung am Mikroskop aufweist.
Dieser Wert wurde so eingestellt, daß eine vollständige Ausnutzung des gesamten Umfangs aller 100 Graustufen durch das Bildanalysesystem gewährleistet wurde.
Die IOD der Zellkerne wurde ausschließlich in Arealen gemessen, in denen auch die
Antikörperfärbung ausgewertet wurde (s. oben). Insgesamt wurden mindestens 30
Lymphozyten als interne Referenzzellen gemessen. Die mittlere IOD dieser Zellen wurde als diploider Chromosomensatz (2c) gewertet. Der Variations-Koeffizient der Referenzzellen und die Korrelation Kernflächen/IOD lagen zumeist unter 5% bzw. r < 0,4.
Es wurden mindestens 300 Analyse-Zellen gemessen und die Abweichung vom diploiden Chromosomensatz als mittlere DNA-Ploidie [DNA-Ploidie = 2 x DNA-Index] angegeben. Die Messungen entsprechen damit den Konsensus-Erklärungen der European
Society of Analytical Cellular Pathology (Haroske et al. 2001).
2.26 Statistische Auswertung
Für die klinisch-pathologische Korellation wurde der zweiseitige chi-quadrat Test verwendet. Das Signifikanzlevel wurde auf P < 0,05 festgelegt.
3. Ergebnisse
44
3. Ergebnisse
3.1 DNA Extraktion
3.1.1 DNA Extraktion aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten
In der Extraktions-Studie wurde mit verschiedenen Verfahren DNA aus 45 Saccomanno
fixierten Bronchialsekreten isoliert. Anschließend wurden die Ergebnisse der Verfahren
bezüglich DNA-Ausbeute, -Reinheit, -Erhaltungszustand und -Amplifizierbarkeit miteinander verglichen. Als Referenzmethode wurde die DNA-Extraktion mit PhenolChloroform gewählt. Bei den anderen drei auf Kits (Puregene, NucleoSpin Tissue,
QIAamp DNA Mini) basierenden Extraktionsprotokollen wurde die DNA entweder
über das Aussalzen von Proteinen mit Ammoniumacetat oder über die Bindung der
DNA an Silikamembranen isoliert. Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle 3.1 zusammengefaßt.
Tabelle 3.1: Vergleich verschiedener DNA Extraktionsprotokolle.
Angegeben ist der Median der DNA-Ausbeute mit Minimum und Maximum, der Mittelwert der Reinheitsquotienten mit dazugehöriger Standardabweichung, der Median der Fragmentgrößen mit Minimum
und Maximum sowie die Erfolgsquote der PCR.
DNA
Extraktionsmethode
DNA
Ausbeute [µg]
NucleoSpin Tissue
DNA
Reinheit
[A260/A280]
Fragmentgröße
[kb]
PCR
1.44 (0.18; 29.28) 1.70 + 0.18
26 (13; > 40)
100%
Phenol-Chloroform
2.76 (0.78; 55.60) 1.69 + 0.16
> 40 (> 40; > 40) 100%
Puregene
1.53 (0.24; 30.90) 1.77 + 0.16
> 40 (17; > 40)
100%
23 (13; > 40)
100%
QIAamp DNA Mini 1.14 (0.24; 18.90) 1.83 + 0.12
Die Ausbeute war abhängig von der Extraktionsmethode. Die Aufreinigung mit PhenolChloroform war am erfolgreichsten (2,76 µg), gefolgt von Puregene (1,53 µg), NucleoSpin Tissue (1,44 µg) und QIAamp DNA Mini (1,14 µg). Die DNA Reinheit lag
zwischen 1,69 und 1,83. Der höchste Reinheitsquotient wurde mit dem QIAamp DNA
Mini Kit erreicht (1.83 ± 0.12). Das Auftrennen der extrahierten DNA auf 0,3%igen
Agarosegelen zeigte, daß die DNA im Saccomanno Fixativ in einem hochmolekularen
Zustand erhalten bleibt (siehe Abb. 3.1). Mit der in dieser Studie verwendeten konventionellen Gelelektrohorese wurde keine Fragmentierung der DNA aufgrund des Fixativs
3. Ergebnisse
45
festgestellt, wohl aber eine Fragmentierung in Abhängigkeit des gewählten Extraktionsverfahrens nachgewiesen (Abb.3.1). Die DNA Fragmente der mit Phenol-Chloroform
extrahierten Proben wurden im 0,3%igen Agarosegel so gut wie nicht aufgetrennt. Die
mit Puregene gereinigten Proben waren im Median über 40 kb (17 kb; >40 kb) groß.
Die mit dem NucleoSpin Tissue und QIAamp DNA Mini Kit extrahierte DNA wurde
stärker geschert; die Fragmentgrößen lagen hier bei 26 kb (13 kb; >40 kb) und 23 kb
(13 kb; >40 kb).
QIA
NST
P-C
Pur
Fall 4
NST
QIA
1 kb
P-C
Pur
Fall 3
QIA
1 kb
Pur
NST
P-C
QIA
1 kb
Fall 2
NST
Pur
P-C
1 kb
Fall 1
40
kb
40 kb
20
kb
20 kb
Abbildung 3.1: Vergleich verschiedener DNA Extraktionsprotokolle. Die Zellen jedes
Bronchialsekrets wurden auf vier Extraktionsansätze aufgeteilt und die DNA mit folgenden
Methoden extrahiert: Phenol-Chloroform (PC), mit Puregene (Pur), mit NucleoSpin Tissue
(NST) und QIAamp DNA Mini Kit (QIA). Auf dem 0,3%igen Agarosegel sind 500 ng der
je vier Extraktionsansätze von vier Bronchialsekreten (Fall 1 bis 4) elektrophoretisch aufgetrennt worden. Zum späteren Größenvergleich wurde zu jedem Fall eine 1kb DNA Extension Leiter mit aufgetragen.
Die Amplifizierbarkeit der isolierten DNA wurde an 15 Bronchialsekreten für alle vier
Methoden überprüft. Mittels PCR wurden in allen Fällen erfolgreich drei verschieden
große β-Globin-Fragmente (268, 536 und 989 bp) amplifiziert. Da keinerlei Unterschied
zwischen den vier DNA Extrationsprotokollen bezüglich der DNA Amplifizierbarkeit
festzustellen war, wurden keine weiteren Fälle mehr untersucht.
3. Ergebnisse
46
EtOH fix.
Form. fix.
1kb Leiter
3.1.2 DNA Extraktion aus Formalin fixierten, Paraffin eingebetteten Geweben
DNA aus Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten
Geweben wurde ausschließlich durch Aussalzen von Proteinen isoliert. Die DNA wies eine starke, durch das
Formalin hervorgerufene Fragmentierung auf, was sich
gut an der aufgetragenen Probe in Abbildung 3.2 veranschaulichen läßt. Die DNA schmierte hierbei über die
gesamte Spurlänge. Die im Vergleich dazu aufgetragene
40.000
10.000
8.144
5.090
4.072
3.054
Probe von in Saccomanno fixierter DNA wurde in einem
hochmolekularen Zustand erhalten. Sie wies eine hauptsächlich durch die Extraktionsmethode bedingte Fragmentierung auf. Der Erhaltungszustand der DNA nach
Fixation in ungepufferten Formalin war im Vergleich zu
2.036
1.636
DNA nach Fixation in gepufferten Formalin noch we-
1.018
ungepufferten Formalin in nur ca. 20% der Fälle erfolg-
sentlich schlechter. So konnte die DNA von Proben mit
reich amplifiziert werden. DNA aus gepuffertem Forma-
517/506
lin erbrachte in ca. 90% ein brauchbares PCR-Ergebnis.
Für die hier durchgeführten Studien wurde nur mit gepuffertem Formalin fixiertes Gewebe verwendet.
Abbildung 3.2: Einfluß des Fixativums auf den DNA-Erhalt. Gezeigt ist ein 0,3%iges Agarosegel auf
dem eine 1 kb-DNA Extensions Leiter, 500 ng Saccomanno fixierte DNA und 500 ng in gepuffertem
Formalin fixierte DNA aufgetragen sind.
3.2 Fall-Kontroll-Studien: aberrante Promotormethylierung als
Tumormarker
3.2.1 Etablierung der Bisulfitkonversion und einer internern Kontrolle
Die Bisulfitkonversion wurde zunächst für DNA aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten in Anlehnung an das von Herman und Mitarbeitern publizierte Protokoll optimiert (Herman et al. 1996). Die anschließenden QMSP-Läufe waren nach erfolgreicher
Konversion problemlos durchzuführen.
Bei der Etablierung der QMSP an Formalin fixierten Proben stellte sich heraus, daß in
ungepuffertem Formalin fixiertes Gewebe ungeeignet für die geplanten Experimente
3. Ergebnisse
47
war. Nur durch Einsatz großer DNA Mengen und vieler PCR-Zyklen gelang es in 20%
der untersuchten Proben ein schwaches PCR-Produkt zu erzeugen. Der Prozeß der Bisulfitkonversion führt zu einer zusätzlichen Fragmentierung der DNA, was unter Umständen auch Einfluß auf die PCR-Reaktionen selber hat. Vermehrte Strangbrüche bei
der Bisulfitkonversion treten insbesondere bei folgenden zwei Reaktionsschritten auf:
1. der Denaturierung der DNA mit 10 M Natriumhydroxidlösung und 2. der Desaminierung der DNA mit Natriumbisulfit. Durch eine schonendere DNA-Denaturierung mit
3 M Natriumhydroxidlösung, sowie eine Senkung der Reaktionszeit auf 4-8 Stunden
und der Reaktionstemperatur auf 50°C bei der Bisulfitbehandlung sollte die zusätzlich
auftretende DNA-Fragmentierung verringert werden. Die Erfolgsrate der QMSP an in
ungepuffertem Formalin fixierter DNA stieg trotzdem nicht an. Die Methode ließ sich
somit nicht zufriedenstellend etablieren.
Ausschließlich in gepuffertem Formalin fixiertes Gewebe eignete sich dagegen mit ca.
90% erfolgreichen PCR-Läufen für die QMSP-Versuche und die Klonierung der Promotorfragmente. Die Umstellung der Fixierung von ungepuffertem auf gepuffertes
Formalin erfolgte im Institut für Pathologie von Professor Gerharz Ende 2002. Somit
konnten in dieser Arbeit nur Gewebe, das zu einem späteren Zeitpunkt eingesendet
wurde, verwendet werden.
Durch die Klonierung und Sequenzierung von Promotorregionen konnte nachgewiesen
werden, daß die Bisulfitkonversion eine nahezu 100%ige Effizienz besaß (vgl. Sequenzierungsergebnisse 3.4.2).
Für die Qualitätskontrolle der Bisulfitkonversion wurde eine QMSP an einer CpG freien, stark Cytosin-haltigen Sequenz des MYOD1-Gens etabliert. Die modifizierte DNA
wurde nur dann für die weiteren Untersuchungen verwendet, wenn die MYOD1 PCR
und somit auch die Desaminierung der unmethylierten Cytosine zu Uracil erfolgreich
war. Weiterhin dienten die QMSP-Ergebnisse für MYOD1 der Berechnung des eingeführten Schwellenwertes bei der Auswertung (s. 2.21.2).
3.2.2 Etablierung der Methylierungsmarker
Für die zu untersuchenden Genpromotoren (APC, p16INK4a, RARß2, RASSF1A,
SEMA3B) lagen in der Literatur bereits Daten zur Hypermethylierung an Lungenkarzinomen bzw. –Zellinien vor. Durch den Vergleich von publizierten Promotorsequenzen
und den zugehörigen Prävalenzen aberranter Methylierung wurde die Region festgelegt,
die von den Primer/TaqMan®-Sonden Paaren abgedeckt werden sollte. Zum Zeitpunkt
3. Ergebnisse
48
der Oligonukleotid-Etablierung für die QMSP war nur das Primer/TaqMan®-Sonden
Paar für den Promotor von APC publiziert.
Die Oligonukleotide für die einzelnen Gene wurden zunächst an mit SssI-Methylase
methylierter DNA etabliert. Ihre Sensitivität wurde anschließend durch Verdünnungsexperimente mit Gemischen aus komplett methylierter DNA und Lachsspermien-DNA
bzw. unmethylierter Wi-38 DNA überprüft. Bei allen etablierten Oligonukleotiden
konnte unter Verwendung eines LightCyclers mit der QMSP noch ein methyliertes Allel
unter 5.000 unmethylierten Allelen nachgewiesen werden. Die Abbildung 3.3 zeigt eine
QMSP am Beispiel der Verdünnungsreihe für den Promotor von p16INK4a.
1 : 100
1 : 250
Fluoreszenz (F1/F2)
1 : 500
1 : 750
1 : 1.000
1 : 5.000
1 : 7.500
Zyklen
Abbildung 3.3: Verdünnungsreihen zur Messung der Sensitivität von Primer/Sonden-Paaren mittels
QMSP im LightCycler. Aufgetragen ist die Zyklenzahl gegen die Fluoreszenz der Sonde. Die Proben sind
mit 1:x beschriftet, wobei 1 das methylierte Allel und x die Anzahl der unmethylierten Allele beschreibt.
3.2.3 Sensitivität und Spezifität der Marker bei Tumorzell positiven
Bronchialsekreten
Im Anschluß an die Etablierung der Primer/Sonden-Paare wurde ihre Sensitivität und
Spezifität in Fall-Kontroll-Studien an Bronchialsekreten von Lungenkarzinompatienten
mit multiplen Tumorzellen (Tu ++) und Bronchialsekreten von Risikopatienten ohne
Lungenkarzinom (NT) evaluiert. Die Promotoren von APC und RARB2 wiesen Methylierung mit einer Sensitivität von 70,9% (61/86) bzw. 77,8% (35/45) bei einer Spezifität
von 53,9% bzw. 56,2% nach. Durch die Einführung der Endpunktauswertung und das
Verwenden eines Schwellenwertes (Cut-off) bei ≥ 35 für APC und ≥ 30 für RARB2 gelang es, die Spezifität des Nachweises auf 99% bzw. 84% zu steigern. Aberrante Methylierung konnte nun mit einer Sensitivität von 30% (26/86) für APC und von 47%
(21/45) für RARB2 nachgewiesen werden (Abb. 3.4). Promotor-Hypermethylierung von
3. Ergebnisse
49
p16INK4a und RASSF1A konnte in 27% (12/45) bzw. 55% (47/86) der Fälle mit einer
Spezifität von 100% detektiert werden (Abb. 3.4). Der Marker SEMA3B erwies sich in
90
80
60
21/45
47/86
70
30
0/89
10
0
APC
NT
RASSF1A
0/89
20
14/89
40
12/45
26/86
50
1/89
Fälle mit aberranter Methylierung [%]
100
37/42
23/25
Bronchialsekreten als unspezifisch und wurde nicht weiter untersucht (Abb. 3.4).
p16
RARB2
SEMA3B
Tu ++
Abbildung 3.4: Fall-Kontroll Studie mit QMSP der Marker Gene APC, RARB2, RASSF1A, p16INK4a und
SEMA3B. Dargestellt ist die Häufigkeit der aberranten Promotormethylierung in Bronchialsekreten mit
multiplen Tumorzellen (Tu ++) und Bronchialsekreten von Risikopatienten ohne Lungenkarzinom (NT).
3.2.4 Methylierung in Bronchialsekreten verschiedener diagnostischer Gruppen
Nach der Etablierung und Evaluierung der Promotormethylierungen an Bronchialsekreten mit reichlich Tumorzellen (Tu ++), wurde das Fall-Kontroll-Studienkollektiv um
folgende zytologische Diagnose-Gruppen erweitert: positiver Befund mit wenigen Tumorzellen (Tu +) im Bronchialsekret, dringender Verdacht (d. V.) und zweifelhaft
(zw.). Außerdem wurden Fälle mit falsch-negativer (f.-neg.) Zytologie einbezogen. In
den nachfolgenden Auswertungen wurden drei (APC, p16INK4a, RASSF1A) und vier
(APC, p16INK4a, RASSF1A, RARB2) Marker miteinander kombiniert. Die Unterscheidung in ein drei bzw. Vier-Marker-Panel ist begründet durch die sinkende Spezifität bei
Hinzunahme des vierten Markers RARB2. Die Spezifität mit drei Markern lag bei 99%
und mit vier Markern bei 83%.
Für die zytologischen Diagnose-Gruppen Tu + und d. V. konnten mit drei Markern 65%
(35/54) bzw. 69% (18/26) der Tumorfälle mittels QMSP detektiert werden. Mit vier
3. Ergebnisse
50
Markern fand sich für die entsprechenden Gruppen bei 87% (47/54) bzw. 92% (24/26)
der Fälle ein positiver QMSP-Befund. Bei zytologisch zweifelhafter oder falschnegativer Diagnose konnte ein Lungenkarzinom in 44% (11/25) bzw. 76% (19/25) und
11/25
50
15/89
40
16/27
19/25
24/26
60
10/27
70
18/26
80
47/54
90
35/54
100
34/45
38/45
30
20
1/89
Fälle mit aberranter Methylierung [%]
37% (10/27) bzw. 59% (16/27) molekularbiologisch diagnostiziert werden.
10
0
Tu ++
Tu +
d. V.
zw.
f.-neg.
r.-neg
3 Marker: APC, RASSF1A, p16
4 Marker: APC, RASSF1A, p16, RARB2
Abbildung 3.5: Fall-Kontroll Studie mit QMSP der Marker Gene APC, RASSF1A , p16INK4a und RARB2.
Dargestellt ist die Häufigkeit der aberranten Promotormethylierung in Bronchialsekreten mit unterschiedlichen zytologischen Diagnosegruppen. Tu ++ = BRS mit multiplen Tumorzellen, Tu + = BRS mit wenigen Tumorzellen, d. V. = dringender Verdacht, zw. = zweifelhaft, f.-neg. = falsch-negativ, r.-neg. = richtig negativ.
3.2.5 Sensitivität der Marker in Bezug auf histologische Subtypen und in Kombination miteinander
In Abbildung 3.6 wurden die Patienten der oben beschriebenen Fall-Kontroll-Studien
nach dem histologischen Subtyp ihres Karzinoms gruppiert und der Methylierungsstatus der vier getesteten Promotorregionen synoptisch dargestellt (weißes Kästchen = unmethyliert, graues Kästchen = methyliert). Die Methylierungsfrequenz der verschiedenen Markergene korrelierte bis zu einem gewissen Grad mit dem histologischen Subtyp.
Besonders ausgeprägt war diese Korellation für den Marker RASSF1A, der 89% (36/40)
der SCLC detektierte (Abb. 3.6).
3. Ergebnisse
51
246
254
253
252
256
247
257
245
244
266
255
263
39
38
37
36
35
34
33
67
66
65
64
63
62
31
58
61
32
83
30
29
28
27
26
25
24
23
115
124
121
125
93
99
75
74
71
104
112
158
162
161
160
159
55
2
10
9
8
7
6
5
12
3
13
1
86
85
185
4
21
11
19
157
237
14
144
145
146
147
129
127
122
120
119
118
117
116
134
155
138
139
143
140
70
132
131
141
142
126
114
128
92
90
78
73
72
89
105
101
156
100
82
1016
59
57
56
87
22
18
20
17
16
130
79
98
97
95
91
96
109
107
108
110
111
112
SCLC
Pat.-Nr.
APC
RASSF1A
p16
RARB2
APC
RASSF1A
p16
RARB2
NSCLC andere
Pat.-Nr.
AC
Pat.-Nr.
APC
RASSF1A
p16
RARB2
APC
RASSF1A
p16
RARB2
Pat.-Nr.
SCC
211
210
284
287
283
282
281
280
274
273
272
271
270
269
268
40
47
46
45
44
43
49
41
50
69
42
68
48
60
54
53
52
51
84
123
77
76
106
102
113
Abbildung 3.6:
Fall-Kontroll Studie mit QMSP der Marker Gene APC, RASSF1A, p16INK4a und
RARB2. Dargestellt ist die aberrante
Promotormethylierung in Bronchialsekreten jedes einzelnen Fall-KontrollStudien Patienten (Pat.-Nr.) in Bezug auf
den histologischen LungenkarzinomSubtyp.
SCC = Plattenepithelkarzinom,
AC = Adenokarzinom,
NSCLCandere = Nicht-Kleinzelliges
Lungenkarzinom,
SCLC = Kleinzelliges Lungenkarzinom,
weißes Kästchen = unmethylierte
Promotorsequenz,
graues Kästchen = methylierte
Promotorsequenz
3. Ergebnisse
52
Die Abbildung 3.7 beschreibt den Zugewinn der Sensitivität bei einer Verwendung des
Drei- bzw. Vier-Marker-Panels. Die zusätzliche Untersuchung von APC und p16INK4a
steigerte die Sensitivität bei SCLC nur minimal auf 90% bei einer Spezifität von 99%.
Die zusätzliche Überprüfung der Methylierung von RARB2 erhöhte die Sensitivität zwar
auf 98%, allerdings auf Kosten der Spezifität von nunmehr 83% (s. Abb. 3.7).
Anders als bei SCLC wiesen die einzelnen Marker bei NSCLC geringere Methylierungsprävalenzen auf. Der Marker p16INK4a detektierte 41% (20/49) der Plattenepithelkarzinome (Abb. 3.7). Die zusätzliche Untersuchung von APC und RASSF1A erhöhte
die Sensitivität auf 55% (27/49). Mit dem Vier-Marker-Panel konnten 84% (41/49) der
70
60
39/40
36/40
19/24
15/89
50
40
28/63
80
14/24
90
44/63
41/49
100
27/49
30
20
1/89
Fälle mit aberranter Methylierung [%]
Plattenepithelkarzinomen nachgewiesen werden (s. Abb. 3.7).
10
0
SCC
AC
NSCLC
SCLC
NT
3 Marker: APC, p16, RASSF1A
4 Marker: APC, p16, RARB2, RASSF1A
Abbildung 3.7: Fall-Kontroll Studie mit QMSP der Marker Gene APC, RASSF1A, p16INK4a und RARB2.
Dargestellt ist die aberrante Promotormethylierung in Bronchialsekreten verschiedener histologischer
Lungenkarzinom-Subtypen (SCC = Plattenepithelkarzinom, AC = Adenokarzinom, NSCLCandere =
Nicht-Kleinzelliges Lungenkarzinom, SCLC = Kleinzelliges Lungenkarzinom) und Nicht-Tumorfälle
(NT) mit drei Markern (APC, RASSF1A, p16INK4a) und vier Markern (APC, RASSF1A, p16INK4a, RARB2).
Bei Adenokarzinomen und NSCLCandere zeigte APC eine Sensitivität von ca. 33%. Die
zusätzliche Untersuchung von p16INK4a und RASSF1A detektierte 44% (28/36) der AC
und 58% (14/24) der NSCLCandere. Mit vier Markern konnte die Sensitivität für beide
histologischen Subtypen auf 70% (44/63) bzw. 79% (19/24) erhöht werden.
Für einen diagnostischen Test ist die Kombination von verschiedenen Markern zur Erhöhung der Sensitivität unbedingt erforderlich. Das Drei-Marker-Panel erfüllte die
3. Ergebnisse
53
Bedingung der notwendigen hohen Spezifität. Die Kombination der Methylierungsergebnisse der Gruppen Tu ++, Tu +, d. V., zw. und f.-neg. aus den Fall-Kontroll-Studien
ergab mit dem Drei-Marker-Panel eine Sensitivität von 59,7% (105/176) bei einer Spezifität von 99% (1/89). Für das Vier-Marker-Panel wurde eine Sensitivität von 81%
(143/176) bei einer Spezifität von 83% (15/89) berechnet. Dabei war der Promotor von
RARB2 in Bronchialsekreten von Tumorpatienten doppelt so häufig methyliert wie bei
Nicht-Tumorpatienten (48% versus 20,8%).
3.2.6 Klinisch-pathologische Korrelation
In die Berechnungen für die klinisch-pathologische Korrelation wurden die FallKontroll Patienten der Tu + und Tu ++ Gruppe einbezogen. Ausschließlich das Methylierungslevel des Markers APC korrelierte positiv mit dem Alter sowohl der Tumor- als
auch der Nicht-Tumorgruppe (p < 0,001 bzw. p < 0,01). Für APC, RASSF1A, p16INK4a,
RARB2 und SEMA3B konnte keine Korrelation zwischen Methylierungsstatus und Geschlecht, Rauchgewohnheiten oder Tumorstadium festgestellt werden. Der Marker
RASSF1A zeigte jedoch einen Trend, daß Hypermethylierung mit der Anzahl von PaketJahren assoziiert ist (χ2 = 1,98; P > 0,25). Ein Paketjahr entspricht dabei einem täglichen
Konsum von 20 Zigaretten für die Dauer eines Jahres.
3.3 Retrospektive Kohorten-Studie: aberrante Promotormethylierung
als Tumormarker
Die retrospektive Kohorten-Studie umfaßte 400 kontinuierlich gesammelte Bronchialsekrete von Patienten, die mit einem Verdacht auf ein Lungenkarzinom im Zeitraum
vom 07.07.2002 bis zum 31.10.2002 in der Abteilung für Pneumologie des FlorenceNightingale-Krankenhauses, Düsseldorf, bronchoskopiert worden sind. Als Referenzstandard wurden die zeitgleiche oder im weiteren Verlauf erstellten histologischen und
zytologischen Befunde verwendet. Von den 400 Bronchialsekreten erfüllten 259 die im
Material- und Methodenteil (s. 2.3.2) beschriebenen Einschlußkriterien. Davon wurden
24 Sekrete aus der retrospektiven Kohortenstudie ausgeschlossen, da sich weniger als
800 ng DNA extrahieren ließ und somit eine Bisulfitkonversion mit anschließenden
QMSP-Läufen nicht durchführbar war. Drei weitere Fälle wurden wegen mangelnden
Referenzstandards ebenfalls von der Studie ausgeschlossen. Die verbliebenen Bronchialsekrete setzten sich aus folgenden Gruppen zusammen: 103 Nicht-Tumorfälle, 111
3. Ergebnisse
54
Lungenkarzinomfälle und 21 sonstige Malignome. Eine genaue Aufschlüsselung der
Gruppen erfolgte im Material- und Methodenteil (s. 2.3.2).
Mit dem Vier-Marker-Panel (APC, p16INK4a, RARB2 und RASSF1A) wiesen 100/235
Bronchialsekreten eine aberrante Promotormethylierung auf. Dabei konnten Lungenkarzinome und Rezidive mit einer Sensitivität von 78,5% bei einer Spezifität von 79%
nachgewiesen werden. Aberrante Promotormethylierung mit dem Vier-Marker-Panel
wurde außerdem noch in Bronchialsekreten von 21/103 Nicht-Tumorpatienten, 11/33
Nachsorge-Patienten ohne Rezidiv, 3/4 Patienten mit Lungenmetastasen (1x Zervix-, 1x
Colon- und 1x Rektums-Karzinom) und 6/16 Patienten mit sonstigen Malignomen (1x
epitheliales Mesotheliom, 2x Pleuramesotheliom, 1x CUP-Syndrom, 1x SCC des Larynx, 1x Dysplasie Grad 2 des Trachealepithels) detektiert. Keinerlei Hypermethylierung mit dem Vier-Marker-Panel zeigten 25/82 Lungenkarzinom-Fälle, 2 Patienten mit
Rezidivtumor, 82/103 Nicht-Tumorfälle, 13/33 Nachsorge-Patienten ohne Rezidiv, 1
Bronchialsekret aus einem tumorfreien Lungenlappen bei bestehendem Lungenkarzinom, 1/4 Patient mit Lungenmetastase (1x Mamma-Karzinom) und 7/13 Patienten mit
sonstigen Malignomen (2x epithelialem Mesotheliom, 1x Pleuramesotheliom, 1x Mesenchymom, 1x Morbus Hodgkin, 1x Non-Hodgkin-Lymphom der Lunge, 1x PharynxKarzinom und 1x pulmonalem Blastom).
Die Ergebnisse der retrospektiven Kohorten-Studie für das Drei-Marker-Panel (APC,
p16INK4a und RASSF1A) sind in Abb. 3.8 zusammengestellt. 56/235 Bronchialsekreten
zeigten eine aberrante Promotormethylierung. Lungenkarzinome und deren Rezidive
konnten mit einer Sensitivität von 52% bei einer Spezifität von 99% nachgewiesen werden. Weiterhin zeigten ein Patient ohne Tumor und ein Patient mit einer pulmonalen
Metastase eines Rektumkarzinoms eine aberrante Methylierung des APC Promotors.
Zwei Patienten mit sonstigen Malignomen waren im Bronchialsekret für APC (PharynxKarzinom) bzw. p16INK4a (epitheliales Mesotheliom) methylierungs-positiv. Ein
Patient mit einem Morbus Hodgkin wies eine mittlere Dysplasie der Trachealschleimhaut auf und zeigte eine aberrante Methylierung des RASSF1A Promotors. Bei 7/27
Nachsorge-Patienten ohne Rezidiv wurde eine aberrante Methylierung des APC (3)
bzw. des RASSF1A (4) Promotors bis zu 13 Monate nach der Erstdiagnose gefunden.
Der sich anschließende Beobachtungszeitraum betrug 0 bis 16 Monate. In diesem Zeitraum zeigten sowohl ein APC- (14 Monate) als auch ein RASSF1A- (16 Monate) positiver Fall eine erneute Tumorprogression. Die DNA von 179 Bronchialsekreten wies keinerlei Methylierung auf. Darunter waren 37/76 Lungentumor- und 2/6 Rezidivfälle.
3. Ergebnisse
55
Ebenfalls keine Hypermethylierung zeigten die Promotoren von 102/103 NichtTumorpatienten, 20/27 Nachsorge-Patienten ohne Rezidiv, 1 Bronchialsekret aus einem
tumorfreien Lungenlappen bei bestehendem Lungenkarzinom, 3/4 Metastasen und
11/13 Fälle sonstiger Malignome.
Patienten
n = 259
ausgeschlossene Patienten: n = 24
Grund: DNA-Gehalt < 800 ng
QMSP: APC, p16INK4a, RASSF1A
n = 235
Hypermethylierung
n = 56
kein Referenzstandard: n = 1
keine Hypermethylierung
n = 179
kein Referenzstandard: n = 2
Zielbedingung vorhanden:
Zielbedingung vorhanden:
n = 39 Lungenkarzinome
n = 4 Rezidivtumoren
n = 37 Lungenkarzinome
n = 2 Rezidivtumoren
Zielbedingung abwesend:
Zielbedingung abwesend:
n = 1 Patient ohne Tumor
n = 7 Nachsorgepat. ohne Rezidiv
n = 1 Metastase
n = 1 Dysplasie Grad 2
n = 2 sonstige Malignome
n = 102 Patient ohne Tumor
n = 20 Nachsorgepat. ohne Rezidiv
n = 1 falscher Entnahmeort
n = 1 5 Monate vor Tumordiagnose
n = 3 Metastase
n = 11 sonstige Malignome
Abbildung 3.8: Retrospektive Kohorten-Studie. Flußdiagramm der QMSP Ergebnisse für das DreiMarker-Panel (APC, RASSF1A, p16INK4a). Als Referenzstandard wurden die zeitgleiche und im Follow-up
erhobenen Diagnosen der Histologie und Zytologie verwendet.
3. Ergebnisse
56
Die Präparate von Patienten mit einem Lungenkarzinom, bei denen das Bronchialsekret
in der diagnostischen Routine mit einem negativen zytologischen Befund bewertet wurde, wurden von einem Arzt für Pathologie auf Screening-Fehler überprüft. Dabei stellte
sich heraus, daß nachträglich in 3 von 45 Fällen Tumorzellen (1 SCLC) bzw. morphologisch auffällige Zellen (2x dringender Verdacht auf ein AC bzw. SCC) im Bronchialsekret gefunden werden konnten. Mit dem Drei-Marker-Panel waren 40% (18/45) der
zytologisch falsch-negativen Befunde methylierungs-positiv. Dies bedeutet, daß Zellen
bereits epigenetisch nachweisbare tumorspezifische Veränderungen aufweisen können,
bevor sie morphologisch auffällig werden. Für die Zytologie erbrachte die QMSP mit
dem Drei-Marker-Panel somit folgende diagnostische Zugewinne: 1. Identifizierung
von Lungenkarzinomen in 40% (18/45) der zytologisch falsch-negativen Befunde; 2.
Bestätigung eines zytomorphologisch bestehenden dringenden Verdachts in 80% (8/10)
und eines zweifelhaften Befunds in 25% (1/4).
Die Methylierungsfrequenzen des Drei-Marker-Panels variierten zwischen der FallKontroll-Studie und der retrospektiven Kohorten-Studie wie folgt: 90% vs. 80% für
SCLC, 37% vs. 58% für NSCLCandere, 44% vs. 50% für AC, 55% vs. 42% für SCC.
43
Zyto
Histo
64
52
QMSP
73
Zyto + Histo
67
Zyto + QMSP
79
Histo + QMSP
88
Zyto + Histo + QMSP
0
20
40
60
80
100
Sensitivität [%]
Abbildung 3.9: Retrospektive Kohorten-Studie. Sensitivität von Histologie, Zytologie und 3 Marker Panel
für den Nachweis eines Lungenkarzinoms. Dargestellt ist die Sensitivität der einzelnen Methoden und
ihrer Kombination.
Die Abbildung 3.9 gibt die Sensitivität des Nachweises von Lungenkarzinomen bei der
ersten Bronchoskopie an. Dargestellt sind die Werte für die Zytologie, Histologie und
das Drei-Marker-Panel alleine und für verschiedene methodische Kombinationen.
3. Ergebnisse
57
Mit der Zytologie bzw. Histologie lassen sich 43% bzw. 64% der Tumoren nachweisen.
Beide diagnostischen Methoden zusammen detektierten 73% der Lungenkarzinome.
Durch die Kombination der QMSP mit der Histologie und Zytologie konnte die Sensitivität der Lungenkarzinomdiagnostik mit einer einzigen Bronchoskopie auf 88% gesteigert werden.
3.4 Methylierungsmuster in zytologischem und histologischem Untersuchungsmaterial
3.4.1 Vergleich der Methylierungsmuster in zytologischen und histologischen Untersuchungsmaterial mittels QMSP
Die Korrelation der Methylierungsmuster in zytologischem (Bronchialsekret) und histologischem (Gewebebiopsie) Untersuchungsmaterial sollte klären, inwieweit sich Rückschlüsse vom Methylierungsbefund des zytologischen Materials auf den Methylierungsstatus des Tumors ziehen lassen. Dazu wurde der Methylierungstatus der Promotoren von APC, p16INK4a, RARB2 und RASSF1A an Gewebeproben von insgesamt 25 Tumoren und dem zugehörigen Bronchialsekreten untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.2 zusammengestellt. Die aberrante Methylierung des APC Promotors konnte in
3/25 Fällen sowohl im Tumor als auch im dazugehörigen Bronchialsekret nachgewiesen
werden. Dabei wurde der oben eingeführte Schwellenwert von ≥ 35 nicht berücksichtigt, da unklar ist, ob sich der für Bronchialsekrete verwendete Wert sich auf Tumorgewebe übertragen läßt. Zusätzlich zeigte sich in weiteren 9 Bronchialsekreten eine aberrante Methylierung. Die Hypermethylierung des APC Promotors 1A mißt präferenziell
eine Schädigung des Lungenepithels und weist nicht zwingend die Methylierung im
Tumor nach. Die Methylierung des RARB2 Promotors trat in 5 Fällen nur im Tumor, in
9 Fällen nur im Bronchialsekret und in weiteren 10 Fällen sowohl im Tumor als auch im
Bronchialsekret auf. Bei der Auswertung wurde – wie bereits schon bei APC – der oben
eingeführte Schwellenwert von ≥ 30 nicht berücksichtigt. RARB2 ist nicht tumorspezifisch und somit als Risikomarker einzustufen. Die aberrante Methylierung des Promotors von p16INK4a wurde fünfmal ausschließlich in Tumoren und einmal sowohl im
Tumor als auch im Bronchialsekret nachgewiesen. Bei einem der p16INK4a positiven
Tumorgewebe war das dazugehörige Bronchialsekret zytologisch negativ und enthielt
somit keine Tumorzellen. Da der Marker tumorspezifisch ist, konnte er offensichtlich in
dem tumorfreien Bronchialsekret keine Methylierung nachweisen. Der Promotor von
3. Ergebnisse
58
RASSF1A war bis auf in einem Fall im Tumorgewebe und dazugehörigem Bronchialsekret gleichzeitig hypermethyliert. Bei dem diskrepanten Fall handelt es sich um das
bereits bei p16INK4a beschriebene negative Bronchialsekret. Zusammenfassend läßt sich
aus dem Vergleich von Bronchialsekret zu Tumorgewebe ableiten, daß in Bronchialsekreten von den Markern p16INK4a und RASSF1A ausschließlich Tumorzellen detektiert
wurden. Die Methylierung von APC und RARB2 hat dagegen bis zu einem gewissen
Grad eine Vorschädigung des Lungenepithels angezeigt.
Tabelle 3.2: Vergleich der QMSP-Ergebnisse in Tumorgewebe und dazugehörigem Bronchialsekret
(BRS). meth. = methyliert, unmeth. = unmethyliert.
Promotor
Tumor
meth.
BRS
meth.
Tumor
unmeth.
BRS
unmeth.
Tumor / BRS Tumor / BRS
meth.
unmeth.
APC
3
12
22
13
3
13
p16INK4a
6
1
19
24
1
19
RARB2
15
19
10
6
10
1
RASSF1A
16
15
9
10
15
9
3.4.2 Analyse der Methylierungsmuster einzelner Promotoren
Die Klonierung und anschließende Sequenzierung von Promotorregionen verschiedener
Tumoren sollte Aufschluß über das Ausmaß der Methylierung einzelner Promotoren
und gegebenenfalls das Vorliegen einer Gewebe-Heterogenität hinsichtlich von Methylierungsdefekten geben. Zusätzlich konnte auf diese Weise die Effizienz der Bisulfitkonversion und die Spezifität der Primer/Sonden-Paare bestimmt werden. Die
Klonierungs-Primer wurden dabei so gewählt, daß sie die mittels QMSP untersuchten
Promotorregionen umschlossen. Für den p16INK4a Promotor gelang es nicht ein klonierbares PCR-Fragment zu erzeugen. Die Ergebnisse für die Untersuchung der Promotoren
APC, RARB2 und RASSF1A sind in Abbildung 3.10 zusammengefaßt.
3. Ergebnisse
59
Abbildung 3.10: Untersuchung von Promotorregionen auf die Methylierung einzelner CpG-Dinukleotide.
Dargestellt sind die Ergebnisse der Klonierung von Promotorfragmenten von APC, RARB2 und
RASSF1A. Je Fall wurden 5-6 Klone sequenziert. Methylierte CpG-Dinukleotide sind als schwarz
hinterlegte und unmethylierte CpG-Dinukleotide als farblose Kreise dargestellt. Die von den
Primer/TaqMan®-Paaren erfaßten CpG-Dinukleotide sind grau hinterlegt. Zusätzlich zur Fallnummer ist
unter den einzelnen Klonen das Ergebnis der QMSP an den korrespondierenden histologischen Präparaten (hQMSP) und zytologischen Präparaten (zQMSP) angegeben (pos = methyliert, neg = unmethyliert).
3. Ergebnisse
60
Für den APC Promotor 1A wurde DNA von drei QMSP negativen und 2 QMSP positiven Tumoren in E. coli transformiert. Jeweils 5-6 Klone wurden sequenziert (s. Abb.
3.10). Das klonierte Fragment umfaßte insgesamt 17 CpG-Dinukleotide, wovon 9 von
dem APC-Primer/Sonden-Paar abgedeckt wurden. Die APC negativen Tumoren waren
mit Ausnahme eines Klons homogen unmethyliert. Klon 1 des Patienten 7291/04 wies
ein methyliertes CpG-Dinukleotid auf. Zwei von den drei im Tumor APC negativen
Fällen waren im Bronchialsekret hypermethyliert. Das QMSP positive Tumorgewebe
von Patient 915/03 zeigte eine homogene Methylierung des APC Promotors. Der ebenfalls APC positive Fall 50077/02 wies eine homogene Promotormethylierung bei drei
Klonen und keinerlei Hypermethylierung bei 2 Klonen auf.
Für den APC Promotor 1A wurde außerdem DNA aus 14 Bronchialsekreten direkt, d. h.
ohne Zwischenschritt über die Klonierung, sequenziert. Die Sequenzen waren entsprechend überlagert, ließen sich jedoch klar auswerten. So zeigten 7 Bronchialsekrete mit
negativer QMSP keinerlei Methylierung der CpG-Dinukleotide (2 Fälle gutartiger Lungenerkrankung, 1 SCC, 2 NSCLCandere, 2 SCLC). Bei weiteren 7 Fällen wurde eine
Methylierung von 1-8 CpG-Dinukleotiden (3 Fälle gutartiger Lungenerkrankung, 2 AC,
1 NSCLCandere, 1 SCLC) festgestellt. Der APC Promotor war bei diesen Fällen unterschiedlich stark methyliert.
Für die Untersuchung des RARB2 Promotors wurde DNA von drei QMSP positiven
und zwei QMSP negativen Geweben transformiert. Das klonierte PCR-Fragment umfaßte 13 CpG-Dinukleotide, wovon 11 vom Primer/Sonden-Paar abgedeckt wurden.
Der Promotor von RARB2 wies in 2 von 3 QMSP positiven Geweben ein heterogenes
Methylierungsmuster auf (s. Abb. 3.10). Drei der insgesamt 10 untersuchten Klone
zeigten keinerlei Methylierung. Mit großer Wahrscheinlichkeit wurde hier DNA von im
Gewebe verbliebenen Nicht-Tumorzellen kloniert. Der ebenfalls QMSP positive Fall
7291/04 wies eine nahezu homogene Hypermethylierung der Dinukleotide auf. Die beiden QMSP negativen Gewebe zeigten keinerlei Methylierung der untersuchten RARB2
Promotorregion.
Für die Untersuchung des RASSF1A Promotors wurde DNA von drei QMSP positiven
und zwei QMSP negativen Geweben in E. coli transformiert. Die dazu nötigen PCRFragmente umfaßten insgesamt 22 CpG-Dinukleotide, wovon 11 vom Primer/SondenPaar abgedeckt wurden. Alle drei QMSP positiven Gewebe wiesen eine nahezu komplette Methylierung des untersuchten RASSF1A Promotors auf (s. Abb. 3.10). Beim Fall
42021/03 wurden außerdem noch 2 homogen unmethylierte Klone detektiert, was ver-
3. Ergebnisse
61
mutlich – wie bereits bei RARB2 beschrieben – auf zwischen Tumorzellen liegenden
Nicht-Tumorzellen zurückzuführen ist. Die zwei im Tumor QMSP negativen Fälle wiesen keinerlei Methylierung der untersuchten CpG-Dinukleotide auf.
Bei der Auswertung der einzelnen Sequenzen zeigte sich, daß die Bisulfitkonversion
eine Effizienz von nahezu 100% besaß. In Abbildung 3.11 sind Ausschnitte einer methylierten und unmethylierten DNA-Sequenz des RASSF1A Promotors dargestellt. Bei
der Bisulfitkonversion werden unmethylierte Cytosine zu Uracil deaminiert. In der Sequenz sind sie dann als Thymin abzulesen. Die Sequenzierung des Gegenstranges zeigt
entsprechend eine Konvertierung von Guanin (G) zu Adenosin (A). Die unten abgebildete unmethylierten Sequenz wies eine Desaminierung aller Cytosinbasen zu Uracil auf.
Bei der methylierten Sequenz blieben nur die 5-Methylcytosinbasen als Cytosin erhalten, wohingegen die unmethlyierten Cytosine zu Uracil desaminiert wurden. Das
Elektrophärogramm der Sequenzen zeigte bei den Klonierungen eine saubere Sequenz.
G C G C T
G C G C T
A G C
A A G C G C G
A G C A A G C G C
G G C
G G G C
C G
C G
G GC G G
G
G G C G G G
Abbildung 3.11: Dargestellt ist ein Ausschnitt zweier Sequenzen vom RASSF1A Promotor. Die obere
Sequenz weist methylierte CpG-Dinukleotide auf, die untere Sequenz ist komplett unmethyliert. Unmethylierte Cytosine werden Uracil desaminiert, bei der Sequenzierung erhält man daher Thymin statt
Cytosin bzw. auf dem Gegenstrang Adenosin statt Guanin. Mit schwarzen Buchstaben ist die Originalsequenz über die sequenzierte Sequenz geschrieben. Außerdem ist das Elektrophärogramm der Sequenzierung dargestellt, um die Reinheit der Sequenzen zu demonstrieren.
3. Ergebnisse
62
3.5 Globale DNA Hypomethylierung
3.5.1 Globale DNA Hypomethylierung als Tumormarker
Nach bisherigen Erkenntnissen nimmt die globale Methylierung der DNA im Tumorgewebe im Vergleich zu gesunden Gewebe ab. Seit kurzer Zeit ist ein Antikörper gegen
5-Methylcytosin erhältlich, der sich als potentieller Tumormarker an BronchialsekretAusstrichen eignen könnte. Um dieser Frage nachzugehen, wurde der Antikörper an
Zytozentrifugat-Präparaten von Bronchialsekreten mit reichlich PlattenepithelkarzinomZellen etabliert. Insgesamt wurden Zytozentrifugate von 56 Patienten mit dem
5-Methylcytosin Antikörper inkubiert. Da eine mangelnde Anfärbung einen positiven
Tumorbefund liefert, wurden nur Immunreaktionen evaluiert, die eine Anfärbung von
mindestens 90% der Referenzzellen aufwiesen. Letztendlich konnten daher nur 27 von
56 Präparaten ausgewertet werden. Eine starke globale DNA Hypomethylierung der
Tumorzellen im Vergleich zu den Referenzzellen konnte bei 16/27 (56%) Präparaten
visuell wahrgenommen werden.
Plattenepithelzelle
Granulozyten
Tumorzellen
a
b
Abbildung 3.12a, b: 5-Methylcytosin-Antikörper. Immunzytochemische Anfärbung von Plattenepithelkarzinomzellen und Granulozyten aus Bronchialsekreten von zwei Patienten. Bild a zeigt einen vom Hämatoxilin bläulich gefärbten Kern einer Tumorzelle mit folglich niedrigem 5-Methylcytosingehalt und
mehrere durch den Antikörper stark bräunlich angefärbte Granulozyten mit einem hohen 5Methylcytosingehalt. Bild b zeigt eine starke Anfärbung sowohl der Tumorzelle als auch der Granulozyten und des oralen Plattenepithels mit dem Antikörper.
Die Abbildung 3.12 a zeigt eine Tumorzelle mit einem geringen 5-Methylcytosin Gehalt (Kern bläulich gefärbt) im Verbund mit stark vom Antikörper angefärbten – folglich hypermethylierten – Referenzzellen (Kern bräunlich gefärbt). In Abbildung 3.12b
wiesen sowohl die Tumor- als auch die Referenzzellen eine starke Hypermethylierung
auf. Eine Etablierung der Immunreaktion an bereits aus der Routine vorhandenen Ausstrichpräparaten war nicht möglich, es konnten nur frisch angefertigte Zytozentrifugate
verwendet werden.
3. Ergebnisse
63
3.5.2 DNA Hypomethylierung in histologischen Präparaten von Lungenkarzinomen
Insgesamt wurden 18 Tumoren von Patienten mit Lungenkarzinomen (11 SCC,
7 SCLC) auf DNA Hypomethylierung untersucht. Von jeder Tumorbiopsie wurden
zwei 4 µm Schnitte angefertigt. Der erste Schnitt wurde mit einer Feulgenfärbung und
der zweite mit dem 5-Methylcytosin-Antikörper angefärbt. Als Referenzzellen wurden
Lymphozyten und als Analysezellen Tumorzellen definiert. Morphologisch unauffälliges Bronchialepithel eignete sich nicht als Referenz, da bei Rauchern dieses Epithel
eine Reservezell-Hyperplasie aufweist, die Kerne sich in den histologischen Schnitten
stark überlagern und sich oft in der S-Phase befinden (s. Abb. 3.13b, c). Mittels BildZytometrie wurde zunächst der durchschnittliche DNA-Gehalt der Referenz- und Tumorzellen und anschließend die Intensität der Antikörper Färbung bei den einzelnen
Schnittpräparaten bestimmt. Für die Auswertung wurde der Wert der Färbeintesität des
Antikörpers bei den Analysezellen um den durchschnittlichen DNA-Gehalt der Tumorzellen korrigiert. Nur Präparate von Plattenepithelkarzinomen konnten ausgewertet
werden, da sich bei den SCLC die einzelnen Tumorzellen – wie in Abbildung 3.14 gezeigt – nicht voneinander abgrenzen ließen und somit eine zytometrische Messung unmöglich durchzuführen war. Einer der elf SCC-Präparate konnte auf Grund zu weniger
Lymphozyten im Präparat nicht gemessen werden. Bei den 10 gemessenenen Präparaten
wiesen die SCC-Tumorzellen eine mittlere DNA-Ploidie von 2,5 bis 5,7c1 (Median von
1,797) auf. DNA Hypomethylierung wurde in 8/10 Lungenkarzinomen nachgewiesen.
In diesen 8 Fällen lag der 5-Methylcytosin-Gehalt der Tumorzellen im Median bei
70,6% der Referenzzellen (Spannweite: 35,8% bis 89,9%). In Abbildung 3.13 ist exemplarisch die Immunfärbung an Schnittpräparaten von drei hypomethylierten SCCBiopsien gezeigt. Allgemein variiert die Anfärbung einzelner Zelltypen in einem gewissen Maße je nach Anschnittebene der Zellen. Optisch dunkler erscheinende Zellen müssen nicht zwingend einen höheren DNA- bzw. Methylgruppen-Gehalt als hell gefärbte
Zellen aufweisen, da auch die Zellfläche berücksichtigt werden muß. Bei der Bestimmung des DNA-Gehalts und der Färbeintensität des Antikörpers wurde aus diesem
Grund die integrierte – also auf die Fläche bezogene – optische Dichte ermittelt. In Abbildung 3.13a sind durchweg schwach gefärbte Tumorzellen und drei stark gefärbte
Mitosen zu sehen. Die Mitose unten rechts im Bild liegt in einer anderen Schnittebene.
1
1c entspricht einem haploiden Chromosomensatz.
3. Ergebnisse
64
Mitosen
a
Bronchialepithel
Entzündungszellen
Tumorzellen
b
Bronchialepithel
Entzündungszellen
Tumorzellen
c
Abbildung 3.13a, b, c: 5-Methylcytosin Antikörper. Immunhistochemische Anfärbung von histologischen
Schnitten von Plattenepithelkarzinom-Biopsien dreier unterschiedlicher Patienten. Bild a zeigt eine Reihe
blaß gefärbter Tumorzellen und drei stark angefärbte Mitosen. Bild b und c zeigen eine starke Anfärbung
sowohl des Bronchialepithels als auch der Entzündungszellen. Die Tumorzellen weisen eine schwächere
Anfärbung auf.
3. Ergebnisse
65
Aus diesem Grund ist die Färbung nicht so prägnant. Der 5-Methylcytosingehalt dieses
Tumors war um 30% verringert. Rechts im Bild von Abbildung 3.13b ist ein gut angefärbtes Bronchialepithel mit Reservezellhyperplasie zu sehen. Die Zellen überlagern
sich teils stark. Links im Bild befinden sich schwächer gefärbte Tumorzellen. Der Tumor wies einen um 29% verminderten 5-Methylcytosingehalt auf. Zwischen Tumorzellen und Bronchialepithel liegen bandförmig stark angefärbte Entzündungszellen, dabei
handelt es sich vornehmlich um Lymphozyten. Das Zellband oben in Abbildung 3.13c
zeigt ein Bronchialepithel mit Reservezellhyperplasie. Darunter liegt bandförmig eine
Schicht von stark angefärbten Entzündungszellen. Dabei handelt es sich sowohl um
Lymphozyten als auch um Granulozyten. Der untere Teil der Abbildung zeigt
blasser gefärbte Tumorzellen. Der Fall hatte einen um 32% verminderten 5-Methylcytosingehalt.
Bronchialepithel
Kleinzelliges Karzinom
Abbildung 3.14: Immunhistochemische Anfärbung eines histologischen Schnitts von einer KleinzelligenLungenkarzinom-Biopsie. Links von der weiß eingezogenen Linie sind basale Anteile des Bronchialepithels mit Reservehyperplasie zu sehen. Nach rechts folgen Tumorzellen eines Kleinzelligen-Karzinoms
mit ausgeprägten Zellüberlagerungen und Quetschungsartefakten. Die Karzinomzellen weisen den für
Kleinzeller charakteristischen „Schmier“ auf, d. h. die Tumorzellen sind nicht mehr voneinander abgrenzbar und somit nicht zytometrisch meßbar.
3. Ergebnisse
66
Es ist bekannt, daß in Tumoren eine globale Hypomethylierung der DNA mit einer
lokalen Hypermethylierung von Promotorregionen einhergehen kann. Durch einen Vergleich der Ergebnisse zur Hypomethylierung mit denen zur Promotor Hypermethylierung sollte festgestellt werden, ob ein Zusammenhang bei den hier untersuchten Fällen
zu finden ist. Aus dem Biopsiematerial der beschriebenen histologischen Präparate
wurde DNA isoliert und der Methylierungsstatus der Promotorregionen der Gene APC,
p16INK4a, RARB2 und RASSF1A bestimmt. Eine Hypermethylierung konnte 3x in 0/4, 3x
in 1/4 und 4x in 2/4 Promotorregionen nachgewiesen werden. Ein Zusammenhang zwischen aberranter Promotormethylierung und globaler Hypomethylierung konnte nicht
gefunden werden.
3.6 Aberrante Promotormethylierung in Sputen
Im Fall-Kontroll-Studien Design wurde die Hypermethylierung in Sputen von insgesamt 10 Patienten untersucht. Mit den Markern APC, p16INK4a und RASSF1A konnte
einer von sechs Fällen mit dringendem zytologischen Tumorverdacht erhärtet werden.
Von den vier Sputen mit Tumorzellen wurden zwei mit drei Markern detektiert. Die
Hinzunahme von RARB2 als Marker brachte nur bei einem Fall mit dringendem
Tumorverdacht einen weiteren Zugewinn.
4. Diskussion
67
4. Diskussion
4.1 Extraktions-Studie
4.1.1 DNA Extraktion aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten
Die meisten bisherigen Studien, die den Einfluß verschiedener Fixative und DNA Extraktionsmethoden auf die Qualität der DNA untersuchten, verwendeten dazu Routinematerial aus der Histologie. An zytologischen Material wurden keine systematischen
Studien an Saccomanno Fixativ, das ein Standard Fixativum der extragenitalen Zytologie ist, durchgeführt (Garcia Closas et al. 2001, Kerstens et al. 2000, Tobal et al. 1989).
In der vorliegenden Arbeit wurde aus 45 Bronchialsekreten mit je vier verschiedenen
Extraktionsprotokollen DNA isoliert. Diese wurde hinsichtlich ihrer Ausbeute, Reinheit,
Fragmentlänge und Amplifizierbarkeit überprüft. Alle Bronchialsekrete wurden direkt
nach der Bronchoskopie mit auf Alkohol basierendem Saccomanno Fixativ fixiert, da es
die Zellmorphologie gut erhält und dem Bakterienwachstum bis zur Verarbeitung des
Materials entgegenwirkt. Es konnte gezeigt werden, daß das Fixativ die DNA in einem
hochmolekularen, unfragmentierten Zustand bewahrt. Auf Agarosegelen konnten Fragmentlängen von > 40 kb ermittelt werden. Die Ergebnisse werden auch von Untersuchungen, die Tobal und Mitarbeiter durchführten, unterstützt (Tobal et al. 1989). Sie
verwendeten 14,3%igen Alkohol zum Fixieren ihrer Proben und überprüften die Länge
ihrer DNA-Fragmente mit der Pulsfeld-Gelelektrophorese. Der Großteil der Fragmente
hatte eine Größe von 35-63 kb (Range>15-97 kb).
Alle vier getesteten Extraktionsprotokolle isolierten DNA, die intakt genug war, um
größere PCR-Fragmente von bis zu 989 bp zu amplifizieren. Kerstens und Mitarbeiter
verwendeten ebenfalls das Saccomanno Fixativ für Zervixabstriche und führten erfolgreich ein HPV Screening mit LiPA-PCR durch (Kerstens et al. 2000). Auch an histologischem Material konnte gezeigt werden, daß 95%iger Alkohol von verschiedenen untersuchten Fixativen zu dem erfolgreichsten in Bezug auf die Amplifikation mittels PCR
zählte (Greer et al. 1991, Greer et al. 1994).
Unabhängig von dem verwendeten Extraktionsprotokoll variierte die DNA-Ausbeute
zwischen den einzelnen Bronchialsekreten stark. Diese Schwankungen waren nicht abhängig vom Entzündungsgrad, sondern zurückzuführen auf zu wenig Restmaterial.
4. Diskussion
68
Bei der Planung von Studien mit Bronchialsekreten ist daher zu bedenken, daß ein Teil
der Sekrete wegen ungenügender DNA-Menge aus den zu untersuchenden Kollektiven
heraus fällt.
Diese Studie zeigte, daß DNA-Ausbeute, -Reinheit und -Fragmentgröße signifikant abhängig von dem verwendeten Extraktionsprotokoll waren. Die Aufreinigung mit Phenol-Chloroform erreichte die höchste DNA-Ausbeute und größten DNA-Fragmente. Die
DNA-Reinheit war geringfügig schlechter als bei den anderen Extraktionsmethoden.
Ein Vorteil der Phenol-Chloroform Aufreinigung gegenüber den auf Silikamembran
basierenden Methoden liegt in der besseren Anpaßbarkeit der nötigen Chemiklienmenge
auf die wechselnden Ausgangsmengen von Zellen in Bronchialsekreten. Jedoch war die
Extraktion zeitaufwendiger und forderte die Verwendung toxischer Chemikalien. Ob in
der extrahierten DNA-Lösung Phenol verblieben war, mußte bei einer Wellenlänge von
230 nm zusätzlich überprüft werden und ggf. die Extraktion wiederholt werden.
Das Puregene DNA Extraktionskit reinigt die DNA mittels Proteinpräzipitation mit
Ammonium Acetat. Diese Methode erzielte die zweitbesten Ergebnisse in Bezug auf
DNA-Ausbeute, -Reinheit und -Fragmentlänge. In 50% aller Fälle lag die Fragmentlänge hier bei >40 kb. Das Protokoll ließ sich gut auf variierende Ausgangszellmengen
einstellen und verwendete keine toxischen Chemikalien.
Das NucleoSpin Tissue Kit und QIAamp DNA Mini Kit funktionieren nach dem selben
Prinzip. Die DNA wird an einer Silikamembran gebunden, gereinigt und eluiert. Die
Protokolle waren schnell und einfach durchzuführen, jedoch erzielten beide eine geringere DNA-Ausbeute. Dies ist wohl darauf zurückzuführen, daß die DNA sich nicht
vollständig bei der Elution von der Silikamembran lösen läßt. Außerdem wurde die
DNA wesentlich stärker fragmentiert als bei der Extraktion mit Phenol-Chloroform oder
Puregene. Diese Beobachtungen wurden auch von anderen Arbeitsgruppen bestätigt
(Garcia-Closas et al. 2001, Tobal et al. 1986). Beide Kits scherten die DNA stark, der
Median der Fragmentlängen für die Extraktion mit NucleoSpin Tissue lag bei 26 kb und
für QIAamp bei 23 kb. Die mit QIAamp isolierten Proben wiesen die höchste DNAReinheit auf. Bei genügend Material eignen sich die auf Silikamembran-basierenden
Kits gut für eine schnelle und einfache DNA-Extraktion.
Zusammenfassend läßt sich festhalten, daß das Saccomanno Fixativ die DNA in Bronchialsekreten in einem für PCR-basierte Untersuchungen geeigneten Zustand erhält.
Eine chemische Veränderung der DNA wurde bisher noch nicht beobachtet. Grundsätzlich eignen sich alle vier für die Studie verwendeten Extraktionsprotokolle zum Isolie-
4. Diskussion
69
ren der DNA aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten. Für die in der hier vorliegenden Arbeit durchgeführten Versuche wurde die DNA mit dem Puregene DNA Isolation Kit extrahiert. Zu dieser Entscheidung führten folgende Eigenschaften dieses Extraktionsverfahrens: a) zweithöchste Ausbeute, b) zweithöchste Reinheit, c) Fragmentgröße > 40 kb, d) keine giftigen Chemikalien, e) gut anpaßbar auf wechselnde Ausgangsmengen, f) einfache und schnelle Handhabung.
4.1.2 DNA Extraktion aus Formalin fixiertem, Paraffin eingebetteten Gewebe
Die DNA Extraktion aus Gewebe wurde mit dem Puregene DNA Extraktionskit durchgeführt. Die Qualität der isolierten DNA variierte in Abhängigkeit von der dem verwendeten Formalin. DNA aus Proben, die mit gepuffertem Formalin fixiert wurden,
waren weniger fragmentiert als Proben aus ungepufferten Formalin. Die stärkere Fragmentierung der DNA bei ungepufferten Proben läßt sich auf die Bildung von Ameisensäure unter Lichteinfluß erklären. Dadurch sinkt der pH-Wert im Fixativ ab, das Gewebe und die DNA werden stärker angegriffen. Mit Phosphatpuffer versetztes Formalin
bleibt auch unter Lichteinfluß im neutralen pH-Wert-Bereich, das Gewebe wird in einem intakteren Zustand bewahrt. Da Formalin ein stark chemisch reaktives Reagenz ist,
bewirkt seine Aldehydgruppe nicht nur eine Fragmentierung der DNA, sondern erzeugt
auch artifizielle Mutationen (Srinivasan et al. 2002). Eine Veränderung des Methylierungsmusters der DNA in Formalin fixierten Proben wurde bisher allerdings nicht beschrieben und auch in den Untersuchungen dieser Studie nicht festgestellt.
4.2
Aberrante
Promotormethylierung
als
molekularbiologischer
Tumormarker für die Lungenkarzinom Diagnostik
Bislang
ist
noch
nahezu
unbekannt,
welcher
Mechanismus
der
DNA-
Hypermethylierung von Genen in Tumoren zugrunde liegt. Häufig wird eine Überexpression der DNA-Methyltransferase impliziert (Belinsky et al. 1996, Baylin und
Herman et al. 2000), jedoch wird diese nicht in allen Tumoren beobachtet, in denen
Hypermethylierung auftritt (Robertson und Jones 2000). Seit längerer Zeit wird die
Hypothese vertreten, daß Karzinogene Hypermethylierung auslösen. Beispiele dafür
sind Stoffe wie Nickel und Arsen, die Hypermethylierung hervorrufen und damit Veränderungen der Chromatinstruktur induzieren könnten (Mass und Wang et al. 1997).
Smith hat in diesem Zusammenhang postuliert, daß es ausgehend von der Basenspezifität der DNA-Methyltransferase zur Aktivierung des Enzyms kommen kann, wenn die
4. Diskussion
70
Replikation durch Karzinogen-Addukte an DNA-Basen angehalten wird (Activation by
Stalling, Smith 1998). Das Lungenkarzinom ist ein bekanntermaßen durch Exposition
der Lunge gegenüber Karzinogenen hervorgerufener Tumor, daher sollte diese Möglichkeit nicht vernachlässigt werden.
Nach der Two-Hit-Hypothese von Knudson erfolgt die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen durch mindestens zwei gravierende Veränderungen, die beide Allele
funktionell ausschalten (Knudson 1971). So kann die Funktion eines Allels z.B. durch
Missense-Mutationen oder Deletionen zerstört oder eingeschränkt werden. Darüberhinaus muß allerdings eine zweite Veränderung im zweiten Allel auftreten. Die
Inaktivierung des zweiten Allels kann durch epigenetische Veränderungen erfolgen,
beispielsweise durch die Methylierung einer CpG-reichen Promotorregion. Welcher
Mechanismus bei der Inaktivierung zu finden ist, variiert in Abhängigkeit von den betroffenen Genen und hängt außerdem stark von Tumortyp und -klasse ab (Bishop und
Schiestl 2000). Diese Feststellungen mögen die Unterschiede in der Methylierungsfrequenz unterschiedlicher Tumorsuppressorgene innerhalb eines Tumors erklären.
4.2.1 Etablierung der Bisulfitkonversion und QMSP
Die Bisulfitkonversion von DNA aus Saccomanno fixierten Bronchialsekreten ließ sich
in Anlehnung an das von Herman und Mitarbeitern publizierte Protokoll etablieren
(Herman et al. 1996). Bei den Formalin fixierten Geweben zeigte sich allerdings, daß
die Art der Fixation einen großen Einfluß auf den Erfolg der im Anschluß an die
Bisulfitkonversion durchgeführten PCR hatte. DNA aus mit ungepuffertem Formalin
fixierten Gewebe ließ sich nur mühevoll und qualitativ unbefriedigend in ca. 20% der
Fälle mit einer QMSP amplifizieren. Die Ergebnisse waren bei in gepuffertem Formalin
fixierten Gewebe mit ca. 90% entschieden besser. Bei den nachfolgenden Untersuchungen wurde nur noch Gewebe, das in gepuffertem Formalin fixiert wurde, verwendet.
Die Behandlung der DNA mit Natriumbisulfit im Vorfeld zu den QMSP-Läufen führte
zu einer zusätzlichen Fragmentierung der isolierten DNA. In einer umfangreichen Studie überprüften Grunau und Mitarbeiter den Einfluß verschiedener Parameter auf die
Effizienz der Bisulfitkonversion und den Erhaltungszustand der DNA. Sie fanden heraus, daß die Bisulfitbehandlung bei 55°C für 4-18 Stunden eine Effizienz von 99% besaß, gleichzeitig wurden 84-96% der DNA degradiert (Grunau et al. 2001). Durch die
Sequenzierung einiger Bisulfit-behandelter Promotorregionen konnte die von Grunau
und Mitarbeitern beschriebene Effizienz der Bisulfitkonversion in dieser Arbeit bestä-
4. Diskussion
71
tigt werden. Von diesem Standpunkt aus entwickelte sich die Arbeitshypothese, daß
eine schonendere Bisulfitkonversion die PCR-Erfolgsquote bei in ungepuffertem Formalin fixierten Proben erhöhen könnte. Sowohl der DNA Denaturierungsschritt als auch
die Desaminierungsreaktion wurden durch Senkung der Reagenzienkonzentration, der
Reaktionszeit und -temperatur abgemildert. Trotzdem ließ sich keine Steigerung der
PCR-Erfolgsquote erzielen.
In Fall-Kontroll-Studien sollten Methylierungen verschiedener Promotoren auf ihre
potentielle Eignung als diagnostischer Marker in Bronchialsekreten überprüft werden.
Insgesamt wurden Primer/TaqMan®-Paare für sechs verschiedene Gen-Promotoren
(APC, MYOD1, p16INK4a, RARB2, RASSF1A, SEMA3B) etabliert. Die Spezifität der
Primer/Sonden-Paare wurde zum einen an 89 Bronchialsekreten von Patienten mit
benigner Lungenerkrankung ermittelt und zum anderen über die Klonierung und anschließende Sequenzierung von entsprechenden Promotorregionen überprüft. Bislang
gibt es in der Literatur nur wenig Daten zur Sequenzierung einzelner Promotorregionen.
Das Erzeugen eines transformierbaren PCR Produkts stellte sich bei den Versuchen als
kritisch dar. So sind die CpG-freien Regionen, die groß genug sind um SequenzierungsPrimer an diese Stelle zu legen, in CpG-Inseln selten. Eine weitere Schwierigkeit beim
Primer-Design - sowohl für die methylierungsspezifischen Primer/TaqMan®-Paare als
auch für die Sequenzierungs-Primer - stellt die DNA-Sequenz an sich dar, die auf
Grund der chemischen Modifikation der DNA mittels Natriumbisulfit lange poly-Abzw. poly-T-Sequenzen beinhaltet. Eine längere Sequenzfolge einer Base im Primer
senkt die Spezifität des Oligonukleotids. Außerdem „stolpert“ die Polymerase bei polyA- bzw. poly-T-Sequenzen bei der Synthese eines PCR-Produkts häufiger, was zu Abbrüchen der Amplifikation oder zu Fehlern in der Amplikonsequenz führen kann. Die
genannten Aspekte bieten eine Erklärung dafür, warum für den Promotor von p16INK4a
kein transformierbares PCR-Produkt erzeugt werden konnte. PCR-Produkte von jeweils
fünf Fällen der Promotoren von APC, RARB2 und RASSF1A wurden in E.coli transformiert. Die Sequenzierungen einzelner Klone ergab für die Promotorregionen der Gene
APC, RARB2 und RASSF1A, daß QMSP negative Fälle keine oder ein methyliertes CpG
aufwiesen. QMSP positive Fälle hingegen besaßen einen hohen Anteil methylierter
CpG-Dinukleotide. Die untersuchten Promotor-Regionen von APC und RASSF1A wiesen bei positiver QMSP ein homogenes Methylierungsmuster auf. Dieses Ergebnis erlangten auch Esteller und Dammann, die DNA aus Lungentumoren klonierten (Esteller
et al. 2000, Dammann et al. 2000). Die Sequenzierung der Klone von RARB2 wies in 2
4. Diskussion
72
von 3 QMSP positiven Fällen ein sehr heterogenes Methylierungsmuster auf. Obwohl
bei der Konstruktion der Primer/TaqMan®-Paare zunächst von komplett methylierten
CpG-Inseln ausgegangen wurde, scheinen auch heterogen methylierte CpG-Regionen –
wie sie mittels Sequenzierung bei zwei RARB2-Fällen gefunden wurden – von den
Oligonukleotiden erfaßt zu werden. Die durch die Klonierung und Sequenzierung der
Promotorregion erlangten Ergebnisse bestätigen die hohe Spezifität der methylierungsspezifischen Primer/TaqMan®-Sonden Paare. Ein Rückschluß auf die Methylierungsmuster in den Tumoren ist allerdings nur bedingt möglich, da die untersuchten
Biopsien nur einen kleinen Teil des Tumors wiederspiegeln.
Die Sensitivität der Oligonukleotide für die QMSP wurde in Verdünnungsreihen getestet und lag bei allen etablierten Primer/Sonden-Paaren bei 1:5.000. Dieser Wert entspricht durchaus der in der Literatur beschriebenen durchschnittlichen Sensitivität (Eads
et al. 2000).
4.2.2 Aberrante Methylierung des APC Promotors 1A
Der APC Promotor 1A wies eine Hypermethylierung2 in 71% der untersuchten Bronchialsekrete von Tumorpatienten auf und zeigte eine präferenzielle Methylierung bei
NSCLC Patienten. Damit liegt die Methylierungsfrequenz in Bronchialsekreten unter
den Beobachtungen vergleichbarer Studien, die unter Verwendung einer QMSP Tumorresektate und Zellinien von NSCLC untersuchten. Sie fanden eine Hypermethylierung
des APC Promotors in 72-96% (Median 84%) der NSCLC und 58% der SCLC (Brabender et al. 2001, Virmani et al. 2002, Usadel et al. 2002, Harden et al. 2003). Andere
Arbeiten, in denen eine traditionelle MSP verwendet wurde, detektierten APC Hypermethylierung in 0 bis 53% (Median 45%) der NSCLC und 26% der SCLC (Virmani et
al. 2001, Toyooka et al. 2003, Esteller et al. 2001, Yanagawa et al. 2003). Topaloglu
und Mitarbeiter untersuchten die Methylierung des APC Promotors an 31 Bronchialsekreten von NSCLC Patienten mittels QMSP. Sie fanden eine Methylierungsfrequenz von
16% (Topaloglu et al. 2004). Die deutliche Abweichung der Ergebnisse dieser Arbeit
von Topaloglus Daten mag durch die Verwendung anderer Primer/Sonden-Paare und
durch das Untersuchen eines kleineren Kollektivs erklärt werden.
2
Ein Promotor wurde als aberrant methyliert oder hypermethyliert bezeichnet, wenn mit dem Pri-
mer/Sonden-Paar ein PCR-Produkt erzeugt werden konnte. Um die aberrante Methylierung von APC und
RARB2 als diagnostischen Marker zu verwenden, wurde die QMSP quantitativ ausgewertet und ein
Schwellenwert von ≥ 35 bzw. ≥ 30 eingeführt.
4. Diskussion
73
Bislang sind Informationen über eine mögliche physiologische, altersabhängige Methylierung des APC Promotors im Lungenepithel begrenzt. Brabender und Mitarbeiter
fanden eine APC Hypermethylierung in 2 von 10 Fällen mit histologisch normalen Lungengewebe. Allerdings waren die untersuchten Personen signifikant jünger als die hier
beschriebene Kontrollgruppe, die eine APC Hypermethylierung in 46% der Fälle
aufwies (Brabender et al. 2001). Waki und Mitarbeiter überprüften den Methylierungsstatus des nicht-neoplastischen Lungengewebes von 30 Autopsiefällen mit einer
konventionellen MSP. Sie detektierten eine APC Promotormethylierung in 33% der
untersuchten Fälle, die ein Alter zwischen 22 und 87 Jahren besaßen (Waki et al. 2003).
Allgemein wird eine altersabhängige Methylierung des APC Promotors im Lungengewebe vermutet, so wie sie in nicht tumoröser Darmmukosa beschrieben ist (Waki et al.
2003, Ahuja und Issa 2000, Brabender et al. 2001). Dazu paßt auch der in dieser Studie
gefundene Zusammenhang zwischen Alter und quantitativen APC Methylierungslevel
sowohl in der Kontroll- als auch in der Tumorgruppe (p<0.01 bzw. p<0,001). Das Lungengewebe mag durch Umwelteinflüsse während der Lebenszeit beschädigt werden. Ob
Zigarettenrauch in diesem Zusammenhang eine Rolle spielt, bleibt noch zu erkunden
(Brabender et al. 2001).
Die hohe Methylierungsfrequenz des APC Promotors 1A in der Kontrollgruppe dieser
Arbeit ist möglicherweise ein Hinweis darauf, daß die aberrante Methylierung von APC
ein früher Schritt in der Karzinogenese ist. Man muß daran denken, daß die hier untersuchte Kontrollgruppe zunächst unter Tumorverdacht bronchoskopiert wurde und die
meisten Patienten Raucher oder Exraucher waren. Frühere Studien an Vorläuferläsionen
eines Karzinoms des Verdauungsapparat - wie z.B. Barrett-Ösophagus und DickdarmAdenom - untermauern, daß Veränderungen der Methylierung und damit verbunden der
Expression des APC Gens früh in der Tumorgenese entstehen können (Kawakami et al.
2000, Esteller et al. 2000).
Um den Marker APC für einen diagnostischen Test verwenden zu können, wurden die
PCR-Läufe quantitativ ausgewertet. Signifikante quantitative Unterschiede des Methylierungslevels von APC zwischen der Kontroll- und der Tumorgruppe ermöglichten die
Setzung eines Schwellenwertes (Cut-off) bei ≥ 35. Damit gelang es, die Spezifität von
54% auf 99% zu steigern. Nur ein Fall in der Kontrollgruppe wies nach Einführung des
Schwellenwertes eine aberrante Promotormethylierung von APC auf. Möglicherweise
besteht bei diesem Patient ein erhöhtes Karzinom-Risiko. In der Literatur konnten
4. Diskussion
74
aberrante Methylierungen bis zu 3 Jahre vor der Tumormanifestation nachgewiesen
werden (Honorio et al. 2003, Palmisano et al. 2000). Leider konnte der APC positive
Kontrollpatient nur bis November 2002 weiter verfolgt werden, zu diesem Zeitpunkt
wurde noch kein Tumor diagnostiziert.
4.2.3 Aberrante Methylierung des p16INK4a Promotors
Eine aberrante Methylierung des p16INK4a Promotors wurde in dieser Arbeit besonders
häufig in Bronchialsekreten von Patienten mit SCC (41%) detektiert. Dagegen zeigten
sowohl AC als auch SCLC mit 18% bzw. 0% eine deutlich niedrigere Methylierungsfrequenz. Die Ergebnisse lassen sich mit denen bisheriger Studien an reseziertem
Lungenkarzinomgewebe korrelieren. So wurde die Methylierung des p16INK4a Promotors in 21-68% (Median 44%) der SCC, in 9-55% (Median 24%) der AC und in 5-9%
der SCLC beschrieben (Chan et al. 2002, Toyooka et al. 2001a, Toyooka et al. 2003,
Ahrendt et al. 1999, Chen et al. 2002, Harden et al. 2003, Kim et al. 2001b, Yanagawa
et al. 2003, Topaloglu et al. 2004).
Die Methylierungsrate von p16INK4a liegt interessanterweise im Sputum von NSCLC mit
35-90% (Median 69%) deutlich höher als im Tumorgewebe (Palminsano et al. 2000;
Chen et al. 2002; Kersting et al. 2000). Im Gegensatz dazu zeigten die Ergebnisse der
Studien, die Bronchialsekrete von NSCLC untersuchten, deutlich niedrigere Methylierungsfrequenzen im Median von 23% (Ahrendt et al. 1999, Topaloglu et al. 2004, Kurakawa et al. 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte keine aberrante Promotormethylierung von p16INK4a in der Kontrollgruppe festgestellt werden, obwohl die Patienten zu
einer Risikogruppe zählten und mit dem Verdacht auf ein Lungenkarzinom bronchoskopiert wurden. Dieses Ergebnis unterstreicht die hohe Spezifität, die mit der
QMSP erlangt werden kann. Andere Autoren beschrieben ebenfalls eine niedrige
Methylierungsrate des p16INK4a Promotors von 0-3% bei Patienten ohne Lungenkarzinom (Waki et al. 2003, Zöchbauer-Müller et al. 2003). Jedoch gibt es auch Publikationen, die eine aberrante Methylierung in bis zu 35% (Median 14%) der Patienten mit
gutartigen Lungenerkrankungen nachgewiesen haben (Palminsano et al. 2000, Kersting
et al. 2000, Belinsky et al. 2002, Gilliland et al. 2002, Soria et al. 2002). Der Grund für
die stark unterschiedlichen Ergebnisse bleibt unklar. Es gibt keine offensichtlichen Unterschiede in den verwendeten Methoden. Bis zu einem gewissen Grad mögen die Wahl
der untersuchten CpG-Dinukleotide und die Kollektivzusammenstellung eine Rolle
spielen.
4. Diskussion
75
4.2.4 Aberrante Methylierung des RARB2 Promotors
Bei der Etablierung der QMSP wurde eine aberrante Methylierung des RARB2 Promotors in 78% der Bronchialsekrete von Patienten mit einem Lungenkarzinom und in 40%
der Bronchialsekrete der Kontrollgruppe gefunden. Im Gegensatz dazu wurde in bisherigen Studien an reseziertem Lungenkarzinomgewebe eine Methylierungsfrequenz von
35-55% beschrieben (Toyooka et al. 2001a, Toyooka et al. 2003, Virmani et al. 2000,
Zöchbauer et al. 2001a). Eine aberrante Promotormethylierung von RARB2 wurde außerdem bei bis zu 14% der Patienten mit einem Lungenkarzinom auch in nichtmalignem Lungengewebe und in Sputen von Kontrollpatienten nachgewiesen (Toyooka
et al. 2003, Virmani et al. 2000, Zöchbauer et al. 2001a, Zöchbauer et al. 2003). Chan
und Mitarbeiter ermittelten eine zu den Daten dieser Arbeit vergleichbare Methylierungsfrequenz von RARB2 in Lungentumoren und Bronchialsekreten von chinesischen
Patienten (Chan et al. 2002). Sie führten ethnische Unterschiede als Grund für eine
höhere Methylierungsfrequenz im Vergleich zur Literatur an. Jedoch widerspricht dies
den Ergebnissen der Arbeit von Toyooka und Mitarbeitern, die die Methylierungsfrequenz verschiedener Gene in vier unterschiedlichen Ländern (USA, Australien, Japan,
Taiwan) untersucht haben. Sie konnten keinerlei geographisch bedingte Unterschiede
in Bezug auf die Methylierung von RARB2 nachweisen (Toyooka et al. 2003). Daher ist
anzunehmen, daß unterschiedliche Methylierungsfrequenzen für den RARB2-Promotor
aufgrund verschiedener Kollektive und Methoden zustande kommen. Die meisten Arbeiten verwendeten bislang die konventionelle MSP. Eine sensitivere Methode wie die
QMSP bietet eine Erklärung für die erhöhte Methylierungsfrequenz des RARB2 Promotors. Interessanterweise fanden Zöchbauer und Mitarbeiter eine erhöhte RARB2 Methylierungsrate in Sputen von Rauchern mit dysplastischen Veränderung des Bronchialepithels (Zöchbauer et al. 2003). Ob die Patienten aus der in dieser Arbeit untersuchten
Kontrollgruppe ein durch die RARB2 Methylierung erhöhtes Risiko haben, ein Lungenkarzinom zu entwickeln, bleibt noch unklar und muß durch eine weiteres follow-up der
Patienten geklärt werden. Eine weitere mögliche Erklärung für die variierenden Angaben zur RARB2 Methylierung mag die Wahl der untersuchten CpG Inseln sein. So
fanden Topaloglu und Mitarbeiter trotz Verwendung einer QMSP keine aberrante
RARB2 Promotormethylierung in Bronchialsekreten von Patienten mit NSCLC (Topaloglu et al. 2004).
Um die Promotormethylierung von RARB2 als Tumormarker zu verwenden, wurden
– wie bereits bei APC – die PCR-Läufe quantitativ ausgewertet und ein Cut-off bei ≥ 30
4. Diskussion
76
festlegt. Dadurch konnte die Spezifität von 56% auf 84% gesteigert werden. Wie bereits
für den APC Promotor diskutiert, könnte auch die nachgewiesene Methylierung von
RARB2 in Bronchialsekreten von Risikopatienten der Diagnose eines Lungenkarzinoms
einige Zeit vorausgehen. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Nicht-Tumorpatienten
mit RARB2 Methylierung wurde bislang noch kein Lungentumor nachträglich diagnostiziert. Die Nachverfolgungszeit der Patienten mag aber mit maximal 3 Jahren noch
nicht lang genug sein.
4.2.5 Aberrante Methylierung des RASSF1A Promotors
Eine aberrante Methylierung des RASSF1A Promotors wurde in dieser Arbeit besonders
häufig in Bronchialsekreten von Patienten mit einem SCLC (88%) aber auch mit
NSCLC (26%) nachgewiesen. Patienten mit gutartigen Lungenerkrankungen zeigten
keine Hypermethylierung. In bisherigen Arbeiten an reseziertem Tumorgewebe und an
Zellinien wurde für den RASSF1A Promotor eine Hypermethylierung in 72-100% bei
SCLC detektiert (Dammann et al. 2000, Agathanggelou et al. 2001, Burbee et al. 2001,
Dammann et al. 2001, Sato et al. 2002). In NSCLC Tumorgewebe wurde eine Hypermethylierung in 30-38% der Fälle und in NSCLC-Zellinien in 36-88% beschrieben
(Dammann et al. 2000, Agathanggelou et al. 2001, Burbee et al. 2001, Sato et al. 2002,
Kim et al. 2003, Toyooka et al. 2003, Tomizawa et al. 2002). Damit sind die in dieser
Arbeit an Bronchialsekreten ermittelten Daten mit den in der Literatur berichteten Methylierungsfrequenzen von Tumoren und Zellinien vergleichbar. Weiterhin fanden auch
andere Autoren nur selten eine Hypermethylierung von RASSF1A in nicht kanzerösem
Gewebe. Waki und Mitarbeiter fanden eine RASSF1A-Promotormethylierung nur in 3%
(1/29) der untersuchten Autopsiefälle (Waki et al. 2003). Einige andere Studien untersuchten nicht kanzeröses Lungengewebe von Lungenkarzinompatienten und wiesen
ebenfalls eine RASSF1A Methylierung bei durchschnittlich 3% der Fälle nach (Dammann et al. 2000, Agathanggelou et al. 2001, Burbee et al. 2001, Dammann et al. 2001,
Toyooka et al. 2003).
Die Methylierung des RASSF1A Promotors wurde bereits an Sputen und Bronchialsekreten von Tumor- und Nicht-Tumorpatienten untersucht. In Sputen wurde eine Hypermethylierung in 50% (4/8) der SCLC und in 21% (5/24) der NSCLC nachgewiesen
(Honorio et al. 2003). Topaloglu und Mitarbeiter fanden Methylierung von RASSF1A in
13% der untersuchten Bronchialsekrete von NSCLC (Topaloglu et al. 2004). Sie verwendeten dazu eine QMSP. Die Unterschiede in der Methylierungsfrequenz zwischen
4. Diskussion
77
der hier vorliegenden Arbeit und der Publikation von Topaloglu und Mitarbeitern haben
ihre Ursache möglicherweise – wie bereits zuvor schon diskutiert – in der unterschiedlichen Zusammensetzung der Kollektive und der Untersuchung verschiedener Promotorregionen von RASSF1A. Einige Studien an Sputen von Patienten ohne Tumor wiesen
ebenfalls eine Methylierung des RASSF1A Promotors auf. Diese Arbeiten verwendeten
die konventionelle MSP bzw. die sensitivere zwei-Schritt MSP. Damit konnte eine aberrante Methylierung von RASSF1A in bis zu 3% der untersuchten Sputen und Bronchialsekrete von Nicht-Tumorpatienten detektiert werden (Zöchbauer et al. 2003, Honorio et
al. 2003, Belinsky et al. 2002). Bei einem Teil dieser scheinbar falsch-positiven Patienten wurde bis zu drei Jahre später ein Lungenkarzinom diagnostiziert (Honorio et al.
2003). Die in der vorliegenden Arbeit gefundene Spezifität von 100% zeigt, daß die
Methylierung des RASSF1A Promotors ein guter Tumormarker für Lungenkarzinome ist.
4.2.6 Aberrante Methylierung des SEMA3B Promotors
Für das Gen SEMA3B, einem Mitglied der Semaphorin Familie, wurde gezeigt, daß es
in der Tumorgenese von Lungenkarzinomen eine Rolle spielt und durch Methylierung
der Promotorregion insbesondere in SCLC häufig inaktiviert wird (Kuroki et al. 2003,
Tomizawa et al. 2001, Sekido et al. 1996). Bislang gibt es wenig Daten bezüglich der
Methylierung von SEMA3B in nicht neoplastischen Lungengewebe. Kuroki und Mitarbeiter untersuchten NSCLC und dazugehöriges nicht kanzeröses Gewebe und wiesen
eine Methylierung in 41% bzw. 11% der Fälle nach (Kuroki et al. 2003). In der
vorliegenden Arbeit wurde bei Nicht-Tumorpatienten in Bronchialsekreten eine wesentlich höhere Methylierungsrate von 92% detektiert. Offensichtlich befinden sich in
Bronchialsekreten nicht neoplastische Zellen mit aberranter SEMA3B Methylierung.
Diese bislang nicht näher charakterisierten Zellen überlagern eine mögliche Methylierung von Tumorzellen in Bronchialsekreten. Folglich eignet sich der Methylierungsstatus von SEMA3B nicht als diagnostischer Marker.
4.2.7 Kombination verschiedener Methylierungsmarker als diagnostischen Test
Die einzeln etablierten und evaluierten Methylierungsmarker wurden in einem drei bzw.
Vier-Marker-Panel kombiniert. Für die Routinediagnostik eignete sich ausschließlich
das Drei-Marker-Panel bestehend aus APC, p16INK4a und RASSF1A, da diese Kombination eine Spezifität von 99% besitzt. Die Hinzunahme von RARB2 zum Markerset führte
4. Diskussion
78
zu einer enormen Einbuße der für einen effizienten Test notwendigen hohen Spezifität.
Damit eignete sich RARB2 nicht als Marker für eine definitive Tumordiagnose.
Unter Verwendung des Drei-Marker-Panels konnten Lungenkarzinome aus den FallKontroll-Studien mit einer Sensitivität von 59,7% bei einer Spezifität von 99% diagnostiziert werden. Bislang wurden zwar Promotormethylierungen verschiedener Gene an
Tumoren, Zellinien und auch zytologischem Material getestet, jedoch wurde noch nicht
eine geeignete Kombination von Markern an verschiedenen diagnostischen Gruppen
systematisch überprüft. Die Ergebnisse stellen folglich den ersten molekularen für die
Lungenkarzinom-Diagnostik praktisch nutzbaren Test dar, der aberrante Promotormethylierung als Biomarker einsetzt. Die Besonderheit des in der vorliegenden Arbeit
entwickelten diagnostischen Tests liegt in seiner Spezifität. Es gelang hierbei zum
ersten mal Methylierung als definitiver Diagnosemarker und nicht nur als Risikomarker
zu nutzen. Um die Ergebnisse zu validieren und den Test auf seine „Alltagstauglichkeit“
zu überprüfen, wurde eine retrospektive Kohorten-Studie durchgeführt.
4.2.8 Retrospektive Kohorten-Studie – Methylierung zur Erweiterung der bisherigen Lungenkarzinom-Diagnostik
In der retrospektiven Kohortenstudie wurden 235 kontinuierlich gesammelte und nicht
vorselektierte Bronchialsekrete ohne Kenntnis der finalen Diagnose mittels QMSP untersucht. Mit dem Vier-Marker-Panel konnten Lungenkarzinome und deren Rezidive
mit einer Sensitivität von 78,5% bei einer Spezifität von 79% nachgewiesen werden.
Der Verzicht auf den Marker RARB2 erhöhte die Spezifität auf 99% bei einer Sensitivität von 52%. Wie bereits weiter oben diskutiert ist für die Anwendung der Marker in der
Lungenkarzinom-Diagnostik eine hohe Spezifität notwendig. Damit bestätigte sich, daß
die Promotormethylierung des Gens RARB2 nicht nutzbarer als Tumormarker ist.
Dennoch erscheint die aberrante Methylierung von RARB2 durchaus informativ für die
Abschätzung eines Risikos zu sein. So wiesen Tumorpatienten doppelt so häufig eine
RARB2 Hypermethylierung auf wie Nicht-Tumorpatienten. In diesem Zusammenhang
ist der Beitrag von Belinsky 2004 interessant, der ein Modell zur Risikoabschätzung bei
Patienten mit Lungenkarzinom-Risiko vorgeschlägt (Belinsky 2004). Dieses Modell
beruht ebenfalls auf der Untersuchung von Promotorhypermethylierungen, allerdings an
Sputen. Belinsky geht davon aus, daß die steigende Häufigkeit von Methylierungen von
verschiedenen Gen-Loci mit einem steigenden Risiko, ein Lungenkarzinom zu entwickeln, einhergeht. Die Ergebnisse zur Hypermethylierung des APC Promotors 1A und
4. Diskussion
79
des RARB2 Promotors in dieser Arbeit unterstützen Belinsky´s Gedanken durchaus, da
sie den Grad einer Schädigung des Epithels und nicht unbedingt die Methylierung im
Tumor messen. Eine kleine Serie von 10 Sputen zeigte, daß die an Bronchialsekreten
etablierten Marker prinzipiell als Risikomarker für die Sputum-Diagnostik einsetzbar
sind.
In der Kohorten-Studie wies ein Patient unter 103 Nicht-Tumorpatienten mit dem DreiMarker-Panel eine aberrante Methylierung des APC Promotors 1A auf. Dieser Fall
wurde bereits im Fall-Kontroll-Kollektiv untersucht und unter 4.2.2 entsprechend diskutiert. Unter den Patienten mit sonstigen Malignomen wiesen zwei eine aberrante Methylierung mit dem Drei-Marker-Panel auf. Der erste Fall hatte ein Pharynx-Karzinom.
Aus dem zytologischen Routinealltag weiß man, daß Pharynx-Karzinomzellen durchaus
in die Lunge aspiriert werden können. Vermutlich wurde hier die aberrante Methylierung von Pharynx-Karzinomzellen nachgewiesen. Jedoch bleibt diese Aussage spekulativ, da in der Litertur bislang noch nicht die Methylierung des APC Promotors für dieses
Organ untersucht wurde. Der zweite Patient hatte ein epitheliales Mesotheliom und war
p16INK4a positiv. Auch hier ist davon auszugehen, daß die aberrante Methylierung von
Mesotheliomzellen nachgewiesen wurde. Mesotheliome sind maligne Erkrankungen der
die Lunge umgebenden serösen Häute. Somit ist nicht auszuschließen, daß in diesem
Fall Mesotheliomzellen in die Alveolen der Lunge abgeschilfert sind und mittels QMSP
meßbar wurden. In der Literatur ist die aberrante Methylierung von p16INK4a für Mesotheliome mit 8,8% beschrieben (Hirao et al. 2002). Ein Patient mit Morbus Hodgkin
und einer zufällig nachgewiesenen mittlerern Dysplasie des Trachealepithels wies eine
aberrante Methylierung des RASSF1A Promotors auf. Nicht invasive Krebsvorstufen
des Bronchialepithels lassen sich im Rahmen einer konventionellen Bronchoskopie
nicht gezielt biopsieren. Insofern ist nicht auszuschließen, daß bei den Patienten auch
stärker gradige dysplastische Veränderungen des Bronchialepithels vorliegen, die eine
RASSF1A Hypermethylierung erklären könnten. Mit dem Drei-Marker-Panel wurde
außerdem eine aberrante Promotormethylierung in 7/27 Nachsorgefällen nachgewiesen.
Zwei dieser Nachsorgepatienten zeigten 14 bzw. 16 Monate nach dem positiven QMSP
Befund einen erneuten Tumorprogress. Die restlichen 5 QMSP positiven Nachsorgepatienten wurden bislang 0-11 Monate nachverfolgt. Die 5 Jahres-Überlebensrate von
Lungenkarzinompatienten ist niedriger als 11% (Parkin et al. 2001), daher ist es durchaus wahrscheinlich, daß die verbliebenen 5 QMSP positiven Nachsorgepatienten in
4. Diskussion
80
absehbarer Zeit erneut einen Tumor entwickeln werden. Um genauere Aussagen über
die Nutzbarkeit der Marker APC und RASSF1A als Prognosemarker treffen zu können,
ist eine weitere Nachbeobachtung der Patienten notwendig.
Die Sensitivität des Drei-Marker-Panels lag in der Fall-Kontroll Studie etwas höher als
in der retrospektiven Kohorten-Studie (52% versus 59,7%). Die Schwankungen kommen durch Unterschiede in der zahlenmäßigen Zusammensetzung von Patienten einzelner Diagnosegruppen und Tumortypen zustande. In den Fall-Kontroll Studien wurden
für das Kollektiv optimale Fälle ausgewählt, die retrospektive Kohortenstudie dagegen
setzte sich aus einem kontinuierlich gesammelten Kollektiv von Routine-Einsendegut
innerhalb eines festgelegten Zeitfensters zusammen. Damit sind die Ergebnisse der Kohorten-Studie den zu erwartenden Ergebnissen in der alltäglichen Anwendung des DreiMarker-Panels gleichzusetzen.
Bislang gibt es als adjuvanten Methoden für die Unterstützung der LungenkarzinomDiagnostik die Fluoreszenz in situ Hybridisierungs (FISH)-Analyse und die Immunzyto- bzw. Immunhistochemie. Ein PCR-gestützter molekularbiologischen existiert bislang noch nicht. Die FISH ist teuer und muß zeitaufwendig ausgewertet werden. Sowohl für die FISH als auch für die Immunfärbungen müssen morphologisch auffällige
Zellen vorhanden sein. Beide Methoden werden nur zum Ausschluß bzw. zur Bestätigung von einem zytomorphologischen Tumorverdacht verwendet. Die zusätzliche Anwendung des methylierungsspezifischen Drei-Marker-Panels zur bisherigen zytologischen und histologischen Diagnostik könnte den Nachweis von Lungenkarzinomen bei
der ersten Bronchoskopie auf 88% steigern. Insbesondere bei der in den letzten Jahren
starken Zunahme von Adenokarzinomen der Lunge, die auf Grund ihrer peripheren
Lage für die Histologie schwerer zu diagnostizieren sind als zentral gelegene Tumoren,
ist ein die Zytologie ergänzender diagnostischer Test an Spülflüssigkeit der Lunge wünschenswert und wird vermutlich in näherer Zukunft noch an Bedeutung gewinnen.
Die retrospektive Kohorten-Studie zeigte außerdem, daß sich die DNA-Extraktion aus
den Bronchialsekreten, die Bisulfitkonversion und die anschließenden diagnostischen
QMSP-Läufe zeitnah durchführen lassen. Bei einem optimalen Zeitmanagement und
entsprechender Laborausrüstung kann man für eine Probe das Ergebnis innerhalb von
drei Tagen erhalten. Dies bedeutet einen entscheidenden Vorteil gegenüber früheren
Bemühungen bis in die 90ger Jahre z.B. Mutationen als molekulare Marker einzusetzen
(Grote et al. 2003b).
4. Diskussion
81
4.3 Methylierungsmarker: Tumor- oder Risikomarker?
Bislang gibt es in der Literatur nur wenig Angaben über den Vergleich von Methylierungsfrequenzen in Tumorgewebe und dazugehörigem Bronchialsekret. Dieser Vergleich sollte in der vorliegenden Arbeit für die Promotoren APC, p16INK4a, RARB2 und
RASSF1A zeigen, ob die an zytologischen Material gewonnenen Ergebnisse mit dem
Tumor selber zu korrelieren sind. Die am Gewebe gefundenen Methylierungsfrequenzen der einzelnen Promotoren passen zu den oben diskutierten Angaben aus der Literatur. Die aberrante Methylierung des APC Promotors wurde in der vorliegenden Arbeit
in Bronchialsekreten häufiger als in Tumoren gefunden (8% versus 44%). Daraus läßt
sich schließen, daß die Methylierung von APC vornehmlich eine Vorschädigung des
Lungenepithels widerspiegelt und nicht unbedingt die epigenetische Veränderung im
Tumor mißt. Dieses Ergebnis wurde von den Sequenzierungen nach Klonierung von
APC verifiziert. Folglich sollte der Marker APC als Risiko- und nicht als Tumormarker
eingestuft werden. Trotzdem gelang es über die Setzung eines Schwellenwertes den
Risikomarker APC vergleichbar einem Tumormarker mit einer Spezifität von 99% zu
nutzen. Auch bei RARB2 handelt es sich um einen Risikomarker. Der
Methylie-
rungsstatus von RARB2 im Tumorgewebe korrelierte nicht zwingend mit dem Status des
zugehörigen Bronchialsekrets. Topaloglu und Mitarbeiter überprüften die Methylierungsfrequenz der Promotoren APC und RARB2 an Bronchialsekreten von Patienten mit
APC bzw. RARB2 positiven Tumorgewebe. Sie machten ähnliche Beobachtungen und
fanden eine korrelierende Methylierung nur in 29% (4/14) für APC und 0% (0/3) für
RARB2 (Topaloglu et al. 2004). Eine aberrante Methylierung von p16INK4a und
RASSF1A im Bronchialsekret wurde stets auch im Tumor gefunden. Bei den beiden
Markern handelt es sich um Tumor spezifische Marker. Die Methylierung von p16INK4a
im Tumor wurde nicht immer in Bronchialsekreten detektiert. Da Tumorzellen in den
untersuchten Bronchialsekreten vorhanden waren, wäre es durchaus denkbar, daß die
äußeren Zellen, die leichter abschilfern und sich somit häufiger als tiefer im Tumor liegende Zellen im Bronchialsekret wiederfinden, eine schwächere oder gar fehlende Methylierung aufweisen. Tumoren könnten also hinsichtlich ihres Methylierungsmusters
heterogen sein. Topaloglu und Mitarbeiter fanden ebenfalls nur eine geringe Methylierung des p16INK4a Promotors in Bronchialsekreten von methylierten Tumorgewebe (in
14% bei 1/7 BRS; Topaloglu et al. 2004) Bei dem Marker RASSF1A korrelierte die Methylierung im zytologischen und histologischen Material in allen Fällen. Dieses Ergebnis wird auch von Ahrendt und Mitarbeitern bestätigt (Ahrendt et al. 1999).
4. Diskussion
82
4.4 Globale DNA-Hypomethylierung
In den letzten Jahren kristallisierte sich heraus, daß die globale DNA Hypomethylierung
eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von Karzinomen spielt. Sie führt zu genetischer Instabilität, reaktiviert transponierbare Elemente und erhöht die Mutationsrate in
der DNA (Feinberg 2004). Bislang gibt es nur wenige Publikationen zum globalen Methylierungsstatus von Lungenkarzinomen, der ausschließlich an histologischem Material
untersucht wurde. Unter Verwendung verschiedener Methoden (Southern Blot Analyse,
high performance Kapillarelektrophorese, visueller Beurteilung) wurde eine globale
DNA Hypomethylierung bei 70-100% der Lungenkarzinom-Zellen im Vergleich zu
dazugehörigem Nicht-Tumorgewebe beschrieben (Benfield et al. 1988, Paz et al. 2002,
Piyathilake et al. 2001, Piyathilake et al. 2003). Die Untersuchung der globalen Hypomethylierung mit einem Antikörper ermöglichte in dieser Arbeit die Korrelation des
Methylierungsstatus mit der Morphologie einzelner Zellen.
4.4.1 Hypomethylierung als Tumormarker
In dieser Arbeit wurde an zytologischen Präparaten aus Bronchialsekreten mit reichlich
Plattenepithelkarzinom-Zellen die globale DNA Hypomethylierung der Tumorzellen im
Vergleich zu den Granulozyten als Referenz-Zellen untersucht. Dabei sollte die Tauglichkeit eines Antikörpers gegen die Base 5-Methylcytosin als Tumormarker evaluiert
werden. DNA Hypomethylierung konnte in 59% der zytologischen Plattenepithelkarzinom-Präparate nachgewiesen werden. Aus folgenden Gründen eignete sich jedoch der
5-Methylcytosin Antikörper nicht als Tumormarker für die Routine. 1. Bei der Verwendung von Tumormarkern, die einen positiven Befund mit einem negativen Signal – also
einer mangelnden Anfärbung der Tumorzellen – anzeigen, ist die Gefahr falsch positive
Befunde zu erzeugen sehr hoch. Um dieses Problem einzuschränken wurden die Präparate nur ausgewertet, wenn die Anfärbung der Referenzzellen mindestens 90% betrug.
Dieses Kriterium erfüllten nur knapp 60% der gefärbten Präparate. Daher war der Anteil
nicht auswertbarer Fälle mit 41% zu hoch. 2. Aufgrund des negativen Signals eignete
sich der Antikörper nicht für ein Massenscreening und könnte allenfalls bei der Bewertung von Fällen mit unklarer Zellmorphologie dienlich sein. Der Antikörper ließ sich
jedoch nicht an Routinepräparaten etablieren. Bei unklarer Morphologie müßte folglich
ein neues Zytozentrifugat für die Immunfärbung angefertigt werden. Jedoch lassen sich
in neuen Präparaten die morphologisch unklaren Zellen meist nur schwer wieder identifizieren und bewerten. 3. Die Vorbehandlung der Zellen aus den Bronchialsekreten und
4. Diskussion
83
die Immunfärbung dauerten eine Woche. Für eine Anwendung des Antikörpers im Routine-Alltag ist die Bearbeitung methodisch zu aufwendig und zeitlich zu langwierig.
Abschließend läßt sich festhalten, daß der 5-Methylcytosin Antikörper als Tumormarker
für den Einsatz in der Routine nicht geeignet ist, wohl aber für die Forschung von Interesse sein könnte.
4.4.2 DNA Hypomethylierung in histologischen Präparaten von Lungenkarzinomen
Die Untersuchungen mit dem 5-Methylcytosin Antikörper wurden vom zytologischen
auf histologisches Material ausgeweitet. Die Verwendung von Lungenkarzinomgewebe
als Untersuchungmaterial ermöglichte es, zwei Methoden an einem Material durchzuführen und die Ergebnisse miteinander zu korrelieren. So wurde der DNA-Gehalt von
Zellen bzw. die integrierte optische Dichte der Antikörperfärbung an zwei aufeinanderfolgenden 4 µm Gewebeschnitten mit Hilfe der Bild-Zytometrie gemessen. Tumorzellen
weisen in der Regel einen im Vergleich zu Normalgewebe erhöhten DNA-Gehalt auf.
Damit besitzt eine Tumorzelle auch mehr Substrat, das vom 5-Methylcytosin Antikörper gebunden werden kann. Folglich führt die Einführung der DNA-Ploidie als Korrekturfaktor zu einer genaueren Quantifizierung des 5-Methylcytosin-Gehalts. Dieser
Aspekt wurde in bisherigen Arbeiten nicht berücksichtigt. Als Referenz-Zellen wurden
Lymphozyten verwendet, da das morphologisch unauffällige Bronchialepithel der Lungenkarzinompatienten eine Reservezell-Hyperplasie aufwies. Weiterhin überlagerten
sich die einzelnen Zellen oft stark und ein hoher Prozentsatz der Kerne befand sich in
der S-Phase. Die Verwendung von Lymphozyten als Referenz-Zellen erscheint durchaus legitim, da es sich um diploide, nicht proliferierende Zellen handelt, die einen
durchschnittlichen 5-Methylcytosin-Gehalt aufweisen (Bariol et al. 2003). In den bisherigen immunhistochemischen Arbeiten zum 5-Methylcytosin Antikörper wurde die
Färbeintensität der Tumor- und Referenz-Zellen entweder durch ein Scoresystem visuell
bewertet oder durch die Messung der optischen Dichte in Bezug auf die Zellgröße bestimmt (Piyathilake et al. 2001, Piyathilake et al. 2003, de Capo et al. 2003, HernandezBlazguez et al. 2000). Keiner der Autoren hatte bislang zusätzlich den DNA-Gehalt der
gemessenen Zellen berücksichtigt, um den verminderten 5-Methylcytosin Gehalt quantifizieren zu können. In der Literatur findet sich nur eine Arbeit, die den
5-Methylcytosin Gehalt in Lungenkarzinomzellen quantifizierte. Unter Verwendung
einer high performence Kapillarelektrophorese konnten Paz und Mitarbeiter eine
4. Diskussion
84
Verringerung des Methylcytosingehaltes um 22% gegenüber dazugehörigem Normalgewebe nachweisen (Paz et al. 2002). Außderdem fanden sie globale Hypomethylierung
nur in 70% aller untersuchten Adenokarzinome. Diese Angaben werden durchaus von
den Ergebnissen dieser Studie – globale Hypomethylierung der DNA von SCC in 80%
der Fälle um im Median 29,4% - untermauert.
Die Färbungen der SCLC konnten nicht ausgewertet werden, da die Tumorzellen nicht
klar voneinander abgrenzbar waren. Das „Schmieren“ der Tumorzellen im histologischen Schnitt ist charakteristisch für SCLC-Tumoren und läßt sich auch nicht beheben.
Damit eignet sich die oben diskutierte Methode nicht für SCLC.
Ein Zusammenhang zwischen globaler Hypomethylierung und Promotor-spezifischer
Hypermethylierung konnte in dieser Arbeit nicht entdeckt werden. Zu den gleichen
Ergebnissen kamen auch Kaneda und Mitarbeiter beim Magenkarzinom (Kaneda et al.
2004). Inwieweit und ob ein solcher Zusammenhang zwischen globaler Hypomethylierung und Promotor-spezifischer Hypermethylierung in Tumoren Bedeutung hat, bleibt
zur Zeit noch unklar.
5. Zusammenfassung
85
5. Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde ein diagnostischer Test für Lungenkarzinome entwickelt, der
aberrante Promotormethylierungen als Tumormarker nutzt. Der Nachweis der Promotormethylierungen erfolgte an DNA aus Bronchialsekreten nach Bisulfitkonversion mittels quantitativer methylierungsspezifischer real-time PCR (QMSP). Hierfür wurden
Primer/TaqMan®-Sonden-Paare für verschiedene Promotorregionen konstruiert und in
Fall-Kontroll-Studien an insgesamt 297 Bronchialsekreten (112 Lungenkarzinome, 85
Nicht-Tumor-Fälle) untersucht. Durch den Vergleich von DNA aus Bronchialsekreten
und Formalin fixierten Tumorgeweben mittels QMSP sowie Sequenzierung der Promotorregionen konnte gezeigt werden, daß die Marker APC und RARB2 eine Schädigung
des Bronchialepithels nachweisen und als Risikomarker einzustufen sind. RASSF1A und
p16INK4a erwiesen sich hingegen als spezifische Tumormarker. Letztendlich wurden drei
für diagnostische Zwecke geeignete Marker zu einem Panel zusammengestellt (APC,
p16INK4a und RASSF1A). In einer retrospektiven Kohortenstudie an 235 Bronchialsekreten (111 Lungenkarzinome, 103 Nicht-Tumor-Fälle, 21 sonstige Tumoren) konnten die
Ergebnisse der Fall-Kontroll-Studien verifiziert werden. Lungenkarzinome wurden mit
einer Sensitivität von 52% bei einer Spezifität von >99% detektiert. Durch die Kombination des molekularbiologischen Tests mit der herkömmlichen zytologischen und histologischen Diagnostik gelang es, 88% der Lungenkarzinome bei der ersten Bronchoskopie zu diagnostizieren. Die QMSP mit einem drei Marker Panel stellt den ersten
praxistauglichen von der Morphologie unabhängigen molekularbiologischen Lungenkarzinom-Test dar. So konnten 40% der Lungenkarzinomfälle mit Bronchialsekreten
ohne morphologisch sichtbare Tumorzellen identifiziert werden. Weiterhin wurde bei
80% der zytologisch als dringend verdächtig eingestuften Befunde ein Karzinom nachgewiesen. Da der Test an Restmaterial der regulären Zytologie durchgeführt wird, ist er
ohne Umstellung der Routineabläufe optimal in die Diagnostik integrierbar. Damit besitzt der Test ein sehr großes Potential bei diagnostischen Problemfällen.
Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die Base 5-Methylcytosin
gelang es mittels Bild-Zytometrie erstmals, Hypomethylierung an histologischen
Schnittpräparaten von Plattenepithelkarzinomen bei Erhalt der Zellmorphologie zu
quantifizieren. Die Plattenepithelkarzinome wiesen in 80% der untersuchten Fälle eine
globale Hypomethylierung auf, wobei der 5-Methylcytosingehalt durchschnittlich
29,4% geringer als bei den Referenzzellen war.
6. Literatur
86
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7. Abkürzungen
7. Abkürzungen
AC
Adenokarzinom
Amp
Ampicillin
bp
Basenpaare
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleinsäure
dNTP
Desoxyribonucleotidtriphospat
DTT
Dithiothreitol
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EtOH
Ethanol
FCS
fötales Kälberserum
h
Stunden
IPTG
Isoproyl-beta-D1-thiogalactopyranosid
kb
Kilobase
LB
Luria Broth
min
Minuten
NSCLC
Nicht-Kleinzelliges Lungenkarzinom
NT
Nicht-Tumorpatient
OD
optische Dichte
PBS
Phospat gepufferte Saline
rpm
rotation per minute
RT
Raumtemperatur
SCC
Plattenepithelkarzinom
sek
Sekunden
SCLC
Kleinzelliges-Lungenkarzinom
TBE
Tris-Borat-EDTA-Puffer
Tm
Schmelztemperatur
Tris
Tris-(Hydroxymethyl)aminomethan
Tu
Tumor
U
Units
UV
Ultaviolett
X-Gal
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-ß-galactosid
102
Anhang
103
8. Anhang
Methylation of RAS association domain family protein 1A as a molecular marker
for lung cancer
Hans J. Grote1, Viola Schmiemann1, Helene Geddert2, Alfred Böcking1, Rainer
Kappes3, Helmut E. Gabbert2 and Mario Sarbia2,4
1
Institute of Cytopathology, H.-Heine-University, D-40225 Duesseldorf, Germany;
2
Institute of Pathology, Heinrich-Heine-University, D-40225 Duesseldorf, Germany;
3
Department of Pulmonology, Florence-Nightingale-Hospital, D-40489 Duesseldorf,
Germany; 4Institute of Pathology, Technical University, D-81675 Munich, Germany
Abstract
Rationale: Aberrant methylation of CpG islands in gene promoter regions is an important mechanism for silencing tumor suppressor genes in cancer and offers a promising
tool for the development of molecular biomarkers. Objectives: To determine the prevalence of aberrant promoter methylation of the RAS association domain family protein
1A gene in bronchial aspirates of patients who underwent bronchoscopy for suspected
lung cancer, and to test whether such a methylation assay is suitable as a diagnostic adjunct to conventional cytology. Methods: We analyzed 221 bronchial aspirates from
patients with suspected lung cancer using a sensitive quantitative methylation specific
PCR. Measurements and Main Results: Aberrant methylation was found in 88% (35/40)
of small cell lung cancer, 28% (31/109) of non-small cell lung cancer and 100% (6/6) of
combined small cell lung cancer independent from clinical tumor stage. No aberrant
methylation was detected in patients finally diagnosed for non-neoplastic lung disease
(0/66). Depending on histological subtype, up to 88% of cases presenting with a negative histology showed a positive methylation assay, thus confirming cytological diagnosis of lung cancer with a 100% specificity. Conclusion: The analysis of aberrant methylation of RAS association domain family protein 1A using a quantitative methylation
specific PCR enabled a sensitive and highly specific distinction between lung cancer
and non-neoplastic lung disease. These results suggest that our methylation assay is a
promising molecular tool for diagnosis of primary lung cancer.
Anhang
104
Aberrant promoter methylation of p16INK4a, RARB2 and SEMA3B in bronchial
aspirates from patients with suspected lung cancer
Hans J. Grote1, Viola Schmiemann1, Helene Geddert2, Ulrich P. Rohr3, Rainer Kappes4,
Helmut E. Gabbert2 and Alfred Böcking1
1
Institute of Cytopathology, H.-Heine-University, D-40225 Duesseldorf, Germany
2
Institute of Pathology, Heinrich-Heine-University, D-40225 Duesseldorf, Germany
3
Department of Hematology, Oncology, and Clinical Immunology, Heinrich-Heine-
University, D-40225 Duesseldorf, Germany
4
Department of Pulmonology, Florence-Nightingale-Hospital, D-40489 Duesseldorf,
Germany
Abstract
Aberrant promoter methylation of normally unmethylated CpG-islands offers a promising tool for the development of molecular biomarkers. We investigated bronchial aspirates of patients admitted for suspected lung cancer with regard to the prevalence of
aberrant methylation of potential marker genes. Applying quantitative methylation specific PCR (QMSP) we analyzed bronchial aspirates from 75 patients with primary lung
cancer and 64 bronchial aspirates of patients diagnosed with benign lung disease for
promoter methylation of three candidate marker genes (p16INK4a, RARB2, SEMA3B).
Hypermethylation of p16INK4a detected 18/75 (24%) cases with primary lung cancer and
was present predominantly in squamous cell carcinomas (14/25, 56%). RARB2 QMSP
at an assay threshold greater than 30 was found in 42/75 (56%) patients with lung cancer without relation to histological subtype. Patients with benign lung disease showed
methylation of p16INK4a and a RARB2 QMSP at an assay threshold greater than 30 in
0/64 (0%) and 8/64 (13%) cases, respectively. Combining the two methylation markers,
p16INK4a and RARB2, yielded a sensitivity of 69% and a specificity of 87% for the diagnosis of pulmonary malignancy. In contrast, SEMA3B displayed frequent promoter methylation (around 90%) both in bronchial aspirates of tumor and non-tumor cases and
thus was not suited as a biomarker. The results of this study indicate that QMSP analysis of p16INK4a and RARB2 may aid the diagnosis of primary lung cancer in bronchial
aspirates. In particular, detection of p16INK4a methylation by QMSP may serve as a highly specific marker of pulmonary squamous cell carcinoma.
Anhang
105
Aberrant methylation of the Adenomatous Polyposis Coli promoter 1A in bronchial aspirates from patients with suspected lung cancer
Hans J. Grote1, Viola Schmiemann1, Sibylle Kiel2, Alfred Böcking3, Rainer Kappes3,
Helmut E. Gabbert2 and Mario Sarbia2
1
Institute of Cytopathology, Heinrich-Heine-University, Duesseldorf, Germany
2
Institute of Pathology, Heinrich-Heine-University, Duesseldorf, Germany
3
Department of Pulmonology, Florence-Nightingale-Hospital, Duesseldorf, Germany
Abstract
Promoter hypermethylation is a major mechanism for gene silencing and offers a promising starting point for developing molecular biomarkers. The purpose of our study was
to determine aberrant methylation of the adenomatous polyposis coli (APC) gene promoter 1A with respect to its prevalence and quantitative level in bronchial aspirates
from patients with suspected lung cancer. Applying quantitative methylation specific
PCR (QMSP), 155 bronchial aspirates from patients with non-small cell cancer
(NSCLC) and small cell cancer (SCLC) of the lung as well as 67 bronchial aspirates
from patients diagnosed for non-neoplastic lung disease were examined in a retrospective case-control-study. Aberrant APC promoter 1A methylation was seen in 71% of
NSCLC, 38% of SCLC, and 42% of patients with non-neoplastic lung disease being,
therefore, not specific for the presence of primary lung cancer. In contrast, quantitative
analysis showed a significantly higher methylation level of bronchial aspirates from
NSCLC as compared to patients without neoplastic lung disease. Introducing a cut-off
point which defined high level of APC hypermethylation NSCLC could be discriminated from cases without neoplastic disease with a specificity of 98.5% and a sensitivity
of 39%. The data suggests that quantitative analysis of APC hypermethylation may
serve as a biomarker of primary lung cancer.
Anhang
106
DNA extraction from bronchial aspirates for molecular cytology: Which method
to take?
Hans Jürgen Grotea, Viola Schmiemanna, Mario Sarbiab and Alfred Böckinga
a
Institute of Cytopathology, Heinrich-Heine-University, Moorenstrasse 5, D-40225
Düsseldorf, Germany
b
Institute of Pathology, Heinrich-Heine-University, Moorenstrasse 5, D-40225 Düssel-
dorf, Germany
Abstract
Objective: To evaluate the ability of 50% ethanol / 2% carbowax (Saccomanno fixative)
to preserve bronchial secretions with high quality genomic DNA as well as to compare
different DNA extraction methods.
Methods: DNA was extracted from 45 bronchial aspirates by four different extraction
protocols. Beside DNA yield, DNA quality with regard to purity, integrity, and PCR
success rate were investigated.
Results: No fragmentation of sample DNA due to the fixative was detected. It was preserved as high molecular weight DNA. DNA yield, purity, and integrity were dependent
on the DNA extraction method to some extend. Irrespective of the DNA extraction
method the PCR success rate for amplification of β-globin gene fragments (268, 536,
and 989 bp) was 100%.
Conclusions: A fixative containing 50% ethanol / 2% carbowax preserves high quality
DNA which is well suited for PCR-based assays regardless of the extraction protocol
used. The selection of the DNA extraction protocol has to be adjusted to the circumstances of application.
Eidesstattliche Erklärung
107
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere, daß ich die von mir vorgelegte Dissertation selbständig angefertigt, die
benutzten Quellen und Hilfmittel vollständig angegeben und die Stellen der Arbeit –
einschließlich Tabellen, Karten und Abbildungen –, die anderen Werken im Wortlaut
oder dem Sinn nach entnommen sind, in jedem Einzelfall als Entlehnung kenntlich gemacht habe; daß diese Dissertation noch keiner anderen Fakultät oder Universität zur
Prüfung vorgelegen hat; daß sie – abgesehen von unten angegebenen Teilpublikationen
(s. S. 108) – noch nicht veröffentlicht worden ist sowie, daß ich eine solche Veröffentlichung vor Abschluß des Promotionsverfahrens nicht vornehmen werde.
Die Bestimmungen dieser Promotionsordnung sind mir bekannt. Die von mir vorgelegte
Dissertation ist von Prof. Dr. R. Jürgen Dohmen betreut worden.
Köln, Februar 2005
Viola Schmiemann
Teilpublikationen dieser Arbeit
108
Teilpublikationen dieser Arbeit
Grote HJ, Schmiemann V, Geddert H, Böcking A, Kappes R, Gabbert HE, Sarbia M:
Methylation of RAS association domain family protein 1A as a molecular marker for
lung cancer. 2004 (submitted)
Grote HJ, Schmiemann V, Geddert H, Kappes R, Rohr U, Gabbert HE, Böcking A:
Aberrant promoter methylation of p16INK4a, RARB2 and SEMA3B in bronchial aspirates
from patients with suspected lung cancer. Int J Cancer 2004, (accepted)
Grote HJ, Schmiemann V, Kiel S, Böcking A, Kappes R, Gabbert HE, Sarbia M: Aberrant methylation of the APC gene promoter 1A in bronchial aspirates from patients with
suspected lung cancer. Int J Cancer 2004, 110: 751-755
Grote HJ, Schmiemann V, Sarbia M, Böcking A: DNA extraction from bronchial aspirates for molecular cytology: Which method to take? Anal Cell Pathol 2003, 25: 83-88