Sequenzer - GEOCITIES.ws

Gasphasensequenzer
N-terminale Sequenzanalyse
EDMAN-ABBAU
•
•
Zyklischer Prozess
letzte N-terminale Aminosäure
abgespalten + identifiziert
•
Reaktion aus 3 Schritten:
1) Kupplung
2) Spaltung
3) Konvertierung
KUPPLUNG
• Edman-Reagenz:
Phenylisothiocyanat PITC an freie Nterminale Aminogruppe gekoppelt.
• bei 40-55 Grad / ca. 15-30 Minuten
• Addition nur an unprotonierte
Aminogruppe
• pH ca. 9 durch alkalische Puffer
KUPPLUNG
PTC = disubstituierter Thioharnstoff
(Phenylthiocarbamoylpeptid PTC)
KUPPLUNG
• Nebenreaktion:
alkal. katalysierte Hydrolyse v. PITC
zu Anilin.
- Anilin mit freier Aminogruppe mit
PITC zu Diphenylthioharnstoff
(DPTU) = Nebenprodukt des EA
NEBENREAKTION
DPTU = Diphenylthioharnstoff
KUPPLUNG
• Unpolares Lösungsmittel (z.B.
Essigsäureethylester) löst DPTU von
Protein/ PTC – Gemisch heraus
(Protein=hydrophil, löst sich nicht)
SPALTUNG
• wasserfreie Säure
(z.B.Trifluouressigsäure) zum
getrockneten PTC-Peptid
= nucleophiler Angriff d. Schwefels an
der Carbonylgruppe d. 1. Peptidbindung
 Abspaltung der 1. AS
(Heterozyklisches Derivat:
Anilinthiazolinon (ATZ)-AS)
SPALTUNG
Anilinthiazolinon (ATZ-AS)
SPALTUNG
• S=nucleophil genug zur Ringbildung,
O kann nur kuppeln, keinen Ring
bilden
• Inertgasatmosphäre, verhindert
Austausch S
O
• Abdampfen der flüchtigen Säure
SPALTUNG
• Kleine relativ hydrophobe ATZ-AS mit
hydrophoben Lösungsmittel extrahiert
(Chlorbutan, Essigsäureethylester)
Anderes Löslichkeitsverhalten der AS als
Peptid
KONVERTIERUNG
• ATZ- Aminosäure = instabil
wird in stabiles Derivat
Phenylthiohydantoin (PTH-AS) Aminsäure
umgewandelt.
• ATZ-AS mit wässriger Säure geöffnet
• bei erhöhter Temperatur zur stabileren
PTH-AS umgelagert.
KONVERTIERUNG
PTH-AS = Phenylthiohydantoin-Aminosäure
KONVERTIERUNG
• Peptid (um 1 AS gekürzt) getrocknet
 Neuer Reaktionszyklus
PTH-AS chromatographisch im Vergleich
zur Referenzprobe mit allen bekannten AS
identifiziert + quantifiziert.
IDENTIFIZIERUNG
Identifizierung der Aminosäuren:
• PTH-AS = typisches Absorbtionsspektrum:
269nm
e=33.000 mol –1
• Bestimmungsgrenze (noch sicher
quantifizierbar) = 1pmol
(mit chromatographischen Methoden)
EDMAN-ABBAU
• Seit 1950 Versuch Edman-Abbau in
Empfindlichkeit zu steigern.
fluoreszierende Isothiocyanate als
Kupplungsreagenzien
ABER keine bessere Reaktionsausbeute

• Allgemeines Problem:
Trennung der normalerweise großen und
sich durch Fluorophor chromatographisch
ähnlich verhaltenen fluoreszierenden ASDerivaten
EDMAN-ABBAU
• Neben chromatographischen
Identifizierungen auch Massenspektroskopie (MS)
• Ethylen-N,N,N trimethylamino-phenylisothiocyanat als Kupplungsreagenz (guter
Nachweis mit MS)
• Tsugita: statt Hydrolyse (Konvertierung) =
Aminolyse
- Einsatz von fluoreszenzmarkierten AS
- Nachweis bis in Attomol-Bereich!
ABER: Reaktionsbedingungen schwierig
AUSBEUTE
Qualität:
• Repetitive yield
• Problem: Anzahl der pro Zyklus
vollständig abgebauten Polypeptide
nehmen rapide ab.
• Nach einigen Abbauschritten sogar
größere Anzahl unvollst. abgebauter
Moleküle
Komplexes PTH-AS Gemisch
PTH-Analyse schwierig
AUSBEUTE
• Sequenzierungsgrenze:
15% der eingesetzten Peptidmenge
• je später 15% Grenze erreicht, desto
längere Sequenz erhalten.
• heutige Ausbeute (Automatisierung des
Edman Abbaus) mehr als 90%
(ca. 95% = 30-40AS)
AUSBEUTE
Repetitive Yield
EDMAN-ABBAU
• 1967: Automatisierung:
Verluste beim manuellen Hantieren
vermindert
• 1000 fache Empfindlichkeitssteigerung von
ca. 100nmol Ausgangsmaterial auf heute
10pmol durch:
Umstellung von Dünnschichtchromatographie
auf Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC)
techn. Verbesserung der Automaten
Gasphasensequenzierung
SEQUENATOR
Edman-Sequenator:
• Lösungsmittelfördereinheit
(transportiert Lösungsmittel + Reagenzien durch NDruck über elektronisch aussteuerbaren Ventilblock
zum Reaktionskompartiment)
• dort Kupplung und Spaltung
• abgespaltete ATZ-AS in gekühlten
Fraktionskollektor gesammelt
• Konvertierung und Identifizierung offline
SEQUENZER
• Moderne Sequenzer ähnlich:
1976 Wittmann-Liebold = automat.
Konvertierung
-ATZ-AS in Gefäß
-dort Konvertierung
-PTH-AS Identifizierung online
• Reaktionskompartiment geändert, soll
Protein immobilisieren
Kontrolle der Reaktion
SEQUENATOR
Aubau des Edman-Sequenators
PROBLEM
• Problem:
Proteine in vielen Lösungsmitteln oder
Reagenzien des Edman-Abbaus (Base,
Säure) gut löslich.
• Reagenzien, die Auswaschen des
Proteins verhindern
SEQUENZER
(1) Spinning Cup Sequenator
(2) Festphasensequenzer
(3) Gasphasensequenzer
(4) Biphasischer Säulenreaktor
Spinning Cup Sequenator: rotierender
Becher, Zentrifugalkraft hält Protein an der
Wand
Festphasen-Sequenator: Protein über ASSeitenkette o. freies C-Ende an Matrix
(Polystrol, Glas) gebunden
>96% Ausbeute,
Nachteil: gebundene AS nicht sequenziert
SEQUENZER
Biphasischer Säulenreaktor:
Reaktionskompartiment aus 2 chromat.
Säulen
1. Reversed-Phase: bindet Protein in
wässrigen Lösungsmitteln
2. Silikal: bindet Protein in organ.
Lösungsmitteln
Säure/Base:
Silikalsäule  Reversed-Phase
Org. Lösungsmittel:
Reversed-Phase  Silikalsäule
-für die Extraktion von kleinen hydrophoben
Nebenprodukten, >95% Ausbeute
SEQUENZER
Gasphasensequenzer: 1981 von Hewick
• Protein auf chemisch inerte Glasfritte
appliziert
(evtl. mit Trägersubstanz, z.B. Polybren)
• beide Reagenzien, in denen aufgetragenes
Protein löslich ist (Base/Säure)
= gasförmig gefördert
 Argon- oder N-Strom durch wässrige
Trimethylaminlösung bzw. Trifluoressigs.,
dann zur Reaktionskammer geleitet
SEQUENZER
• im Reaktionskompartiment gewünschte
Säure/Base Bedingungen, aber kein
Auswaschen!
• Reaktionsnebenprodukte und ATZ-AS
in organ. Lösungsmitteln (flüssige
Phase) extrahiert
Protein darin nicht löslich
• totvolumenfreie Ventilblöcke
optimale Anpassung an geringe
Proteinmengen (<100pmol )
SEQUENZER
Sonderform: Pulsed-Liquid –Sequenzer
= Gasphasensequenzer, Säure in flüssiger
Form, schnellere Spaltungsreaktion
• erfordert genaue Dosierung, um Protein mit
Säure zu benetzen, aber nicht wegzuspülen
Verkürzung des Edman-Abbaus auf 30 min
SEQUENZER
Reaktionskompartimente
PROBLEME
Probleme bei der Sequenzanalyse
a) Probleme der Probe
b) Probleme der Sequenzierung
- der Probe:
• Probe muss N-Terminal einheitlich (rein)
sein
•
Kontamination von Salzen, Detergentien,
freien AS interferieren schon in kleinen
Mengen mit Reaktionen des EdmanAbbaus oder verhindern Extraktion.
PROBLEME
Gasphasensequenzer:
• entsprechende Probenvorbereitung
• letzter Schritt der Peptidreinigung
möglichst salzfrei!
(Reversed-Phase-HPLC unter flüchtigen
Lösungsmitteln)
•
•
adsorbtive Immobilisierung an hydrophobe
Membran
durch Elektroblot des Proteingels auf
PVDF-Membran oder hydrophob
modifizierte Glasfasern)
PROBLEME
Probenaufgabe
• Glas, Eppis mit >95% Ameisensäure
behandeln, Proteine dürfen nicht binden!
N-terminale Blockierung
• kein freies N-Ende, keine Kupplung an
Aminogruppe
• ca. 50% aller natürl. Vorkommender
Proteine = N-terminal modifiziert
(Acetylierung, Formylierung)
• kann selten enzym. oder chem. entfernt
werden
Fragmentierung, nur innere Sequenzen
PROBLEME
Quantifizierung
• nur 50% der eingesetzten Proteinmenge
sequenzierbar
•
wenn geringere PTH-AS-Menge als
erwartet:
 Proteinmenge weniger als vermutet
 Proteingemisch mit N-terminaler
Blockierung,
Verunreinigung
PROBLEME
Probleme der Sequenzierung
• AS durch aggressive Reaktionsbeding.
des EA zerstört:  kleine Nebenpeaks im
HPLC-Chromatogramm
•
modifizierte AS durch basische/saure
Reaktionsbdeingungen täuschen
unmodifizierte vor!
•
Fehlinterpretation: von modifizierten AS
keine Standards
PROBLEME
•
zunehmender Untergrund durch labilere
Peptidbindung, bei Spaltung werden
Aspartylbindungen weniger hydrolysiert
(Spaltungsreaktion)
 freier N-Terminus
Sequenzierung
Detektion im HPLC-Chromatogramm
•
nicht gesamte Proteinmenge kann
sequenziert werden!
Anfangsausbeute: initial yield = ca. 50%
PROBLEME
Reaktionszeit, Menge, Lösungsmittel,
Durchflussgeschwindigkeit, Temperatur
= großen Einfluss auf Qualität!
Reinheit der Chemikalien:
-strenge Qualitätskontrollen, sonst Störpeaks
HPLC-Systems: (High Performance Liquid
Chromatography)
• für PTH-AS Trennung in hohem
Empfindlichkeitsbereich = technische
Schwierigkeiten
KONTROLLE
Microbore-Trennsäulen
•
•
•
•
ca. 1pmol
genaue Lösungsmittelgradienten und
Temperaturen, damit PTH-Laufverhalten
nicht geändert!
Finanzielle und zeitliche Schäden bei
falschen Sequenzen
Als Kontrolle: MS, Kapillarelektrophorese
PREISE
Gasphasensequenzierung
• Analyse der 5 ersten Aminsäuren
350 €
• Analyse der 6 bis 25 Aminsäuren
60 €
• SDS PAGE Trennung und
Übertragung auf PVDF
240 €