Intrazellulare Kalzium-Ionen und pH-Wert als sensitive

wr:"\
KURZMITTEILUNG
------------------------~~~-~0
.,.".
•
Intrazellulare Kalzium-Ionen und pH-Wert als
sensitive Parameter der Toxizitat in neuronalen
Zellkulturen
Tzyh-Shi Chen, Eleni Koutsilieri, Paul Kruzik und
Wolf-Dieter Rausch
Institut fur Medizinische Chemie, Veterinarmedizinische Universitat Wien
Zusammenfassung
Summary: Intracellular calcium and pH as sensitive
parameters of toxicity in neural cell culture
In der vorliegenden Studie werden Gehirnzellkulturen
(Mesenzephaton, C571Bl6 Mduse) und Synaptosomen
aus post mortem Gehirnen von Hunden fur neurotoxische Untersuchungen eingesetzt. In beiden Modellsystemen wird die Wirkung von MPTP, MPP+ und Paraquat
auf Kalzium-Homoostase
und pll» Wert untersucht. Im
Unterschied zu membranaktiven Toxinen wie z.B.
Ionomycin und Kaizium-Ionophor A23187 fuhrten diese
Substanzen zu keinem akuten Kalziumeinstrom. Erst bei
einer Langzeitinkubation
mit 10 j.iM MPP+ brw. 10 j.iM
MPTP, nicht aber Paraquat, konnte eine Erhohung der
Kalriumkonzentration
in der Mesenzephalon-Kuliur und
isolierten Synaptosomen aus dopaminerg innervierten
Arealen gezeigt werden. Die Toxine fuhrten im Gegensat; zu Ionomycin zu keinen Anderungen des pH;. Die
Ergebnisse werden dahingehend interpretiert, dajJ
MPTP u.a. nicht direkt zu einer Membranstorung fiihren,
sondern erst sekundar nach einer Storung der Energiebalance der Zelle.
Abkiirzungen: [Ca2+L Intrazellulare Kalziumkonzentration; pl-l.,
intrazellularer pH-Wert; MPTP,
1-Methyl-4-Phenyl-l,2,3,6-Tetrahydropyridin; MPP+, I-Methyl-4Phenylpyridinium; Paraquat,
1,1-Dimethyl-4,4-Bipyridinium;
Fura-2/AM, Fura-2 AcetoxyMethylester; BCECF/AM, 2', T-Bis(Carboxyethyl)-5(6)-Carboxyfluorescein Acetoxy-Methylester
Einleitung
MPTP und sein aktiver Metabolit
MPP+ bewirken beim Menschen und
bei Primaten neurodegenerative Ver216
Primary cell cultures and synaptosomes of brain serve
as tools to investigate neurotoxic compounds. Changes
of intracellular calcium and pH indicate cell injury. In
the present study, mesencephalic cell cultures were
prepared from embryonal C571Bl6 mouse brain and
intact synaptosomes from dog brain. In both model
systems, the effect of MPTP, MPP+ and paraquat on
intracellular calcium homeostasis and pH were studied.
Direct addition of these neurotoxins (10 j.iM) to fura-2labeled cells did not change intracellular calcium
concentration. Mesencephalic neurons were exposed to
10 j.iM MPP+ for 24 hours led to a 36 % calcium increase. Thus both in vitro models of changes of calcium
homeostasis and pH may serve to study prolonged toxic
effects oj substances and also means oj their prevention.
Keywords: Calcium homeostasis,
synaptosomes
anderungen der dopaminergen Zellen des Stammhirns (substantia
nigra). Dies fiihrt zu einer klinischen
Symptomatik, die der des idiopathischen Morbus Parkinson gleicht
(Chiueh et aI., 1985). In vitro Systeme wie Zellkulturen des Mesenzephalons erfahren gleichfalls neurodegenerati ve Veranderungen durch
MPTP und MPP+, wobei ebenfalls
selektiv dopaminerge Neuronen degenerieren (Friedman und Mytilineou, 1987). Sie eignen sich somit fur
screening Methoden potentiell neurotoxischer Substanzen. Paraquat ist
ein Herbizid und strukturell sehr
ahnlich dem MPTP. Die toxische
Wirkung yon Paraquat besteht in der
toxicity, cell culture,
exzessiven Entstehung
reaktiver
Sauerstoffradikale. In vitro kann Paraquat Sauerstoff zum Superoxidradikal reduzieren (Comporti, 1989).
Kalzium-Ionen besitzen eine Vielfalt yon biologischen Funktionen in
tierischen Zellen. Sie sind verantwortlich fur die Zellstrukturbildung,
die Erregbarkeit der Zellen und wirken als Kofaktor fur Enzyme sowie
als intrazellularer Regulator (Campbell, 1983). Komplexe Mechanismen
regulieren die raumliche Verteilung
der Kalzium-Ionen. Dazu zahlen in
der Zellmembran integrierte Natrium/Kalzium-Austauscher und Ionenpumpen, intrazellulare KalziumSpeicher (Mitochondrien, endoplasALTEX [1,4/94
wl"":'\
CHEN ET AL.
--~~~----------------------------~~
matisches Retikulurn, NukJeus, Vesikel und Kalziosomen) und KalziumBindungsproteine.
Mit Hilfe van verschiedenen Fluoreszenzindikatoren
(Tsien et al.,
1985), die in die lebenden Zellen
eingebraeht werden, konnen in Zellkulturen und in subzellularen Partikeln die Konzentrationen
der intrazellularen Kationen wie Na', K+, H+,
Ca2+, Mg2+ und Zn2+ ermittelt werden.
Pathologisehe
Veranderungen
der
Zelle zeigen sieh u.a. an Anderungen
der intrazellularen
Kalziumkonzentration. Eine Storung der KalziumHomoostase
wird z.B. bei der Ischarnie, der Hypoxie (Okada et aI.,
1990),
bei der Alzheimersehen
Krankheit und bei epileptisehen Vorgangen (Heizmann und Braun, 1992)
beobaehtet. In der vorliegenden Arbeit wurde versueht, die toxininduzierte Degeneration
dopaminerger
Neuronen, die durch Anderungen der
Morphologie und biochemischer Parameter der betroffenen Zellen charakterisiert ist, an Anderungen des
Kalziumstoffwechsels
und des pHiWertes zu erkennen.
Material und Methode
Praparation der Neuronen:
Primare Zellkulturen von Nervenzellen werden von fetalen C57/Bl6
Mausegehirnen
am 14. Tag der
Trachtigkeit gewonnen. Die Zellkulturen werden zuerst in serumhaltigem DMEM-Medium
tDulbecco's
Minimal Essential Medium) und danach in serumfreiem Medium kultiviert (Sebben et aI., 1990). Am 10.
Tag in Kultur wurden die Zellen
entweder direkt bei der Messung den
Neurotoxinen ausgesetzt oder damit
24 Stunden lang vorinkubiert. Selektive immunhistochemisehe
Farbernetho den erlauben die Differenzierung
von Neuronen (Neuronenspezifische
Enolase, Tyrosinhydroxylase)
und
Gliazellen
(glial fibrillary acidic
protein). Zu dem serumfreien Medium mit oder ohne Neurotoxin wurde
Fura-2/AM und BCECF/AM (End-
ALTEX 11,4/94
konzentration:
5 flM bzw. 1 )..1M)
zugesetzt
und
unter
standigem
Schutteln im Inkubator 45 min lang
bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte zweimaliges Wasehen
mit NaCI-Medium
(in mM; NaCl:
120, KCl: 2.5, MgC12: 0.1, NaH2P04:
1.2, NaHCO): 5, CaCI2: 1, Glukose:
20, Hepes: 20, pH = 7.4), und
ansehlieBend wurde das NaCl-Mediurn dureh 3 ml Kalziumfreies Medium ersetzt (Zusammensetzung
in
mM: NaCl: 145, KCl: 5, MgCI2: 1.2,
Glukose: 10, Hepes: 10, pH = 7.4).
Vor der Messung wurden die Zellen
schonend in diesem Medium resuspendiert.
Praparation der Synaptosomen:
Die Synaptosomen wurden aus Gehirnen von Hunden, die aus kliniseh
indizierten
Grunden eingeschlafert
werden muBten, isoliert. Dabei wurden striatale Synaptosomen
dureh
mehrfache
Dichtezentrifugationsschritte uber einen Pereollgradienten
prapariert (Nagy und Delgado-Escueta, 1984; Dunkley et al., 1986).
Die mit Fluoreszenz-Indikatoren
(5
)..1M Fura-2/AM und 1 )..1M BCECF/
AM)
inkubierten
Synaptosomen
wurden in kalziumfreiem
Medium
resuspendiert und deren Proteingehalt auf 3 mg/ml eingestellt. Fur
Langzeit-Behandlungen
(60 min) mit
den Neurotoxinen wurde die Zellsuspension in kalziumfreiem
Medium
bei 37°C unter standigern Schiitteln
vorinkubiert und vor der Messung
der Proteingehalt auf 0.4 mg/ml eingestellt.
Bestimmung der Kalziumkonzentration und des pH-Werts:
Fur jede einzelne Bestimmung wurden jeweils 1.5 ml Proben suspension
in einer Quarzkuvette vor der Messung 10 min lang bei 37°C unter
standi gem Riihren inkubiert. Mit einem Fluoreszenz-Spektralphotometer (Fa. Hitachi, F-2000) wurden die
intrazellulare freie Kalziumkonzentration (Tsien et a!., 1985) und der
intrazell ulare pH -Wert (Dennis et al.,
1989) bestimmt. Durch die Einstel-
lung der Wellenlangen Ex: 340/380
nm, Em: 510 nm fur [Ca2+1i und Ex:
440/500 nm, Em: 530 nm fur pHi'
war eine simultane Messung beider
Parameter moglich.
Wahrend des MeBvorganges (300
see) wurden zunachst bei einer Laufzeit von 50 see die Zellen durch
Zusatz von 15 ul 100 mM CaC12
stimuliert. Um Rm•x und Rmin zu bestimmen, wurde bei einer Laufzeit
von 200 see 7.5 !1l 10%ige SDS und
bei 250 sec 60 !1l 100 mM EGT A
injiziert. Die Autofluoreszenz
der
Proben wurden jeweils am Ende des
MeBvorganges durch Quenchen der
Fluoreszenz mit 15 !1l 0.5 M MnC12
bestimmt.
Die MeBwerte fur [Ca2+1 werden
nach folgender
Gleichung
(Grynkiewicz et al., 1985) computergestutzt mit Hilfe eines spezifischen
Auswerteprogrammes
bereehnet:
[Ca2+1
= x,
(R - Rm;n)
(Sf2/Sb2)
(Rmax - R)
Kd = 224 nM
R ist das Verhaltnis del' Fluoreszenzwerte bei 340 nm und bei 380 nm.
Rmax ist das Verhaltnis der Fluoreszenzwerte bei 340 nm und bei 380
nm, wenn alle in der Zelle befindliehe Kalzium-Ionen
mit Fura-2 besetzt sind.
Rmin ist das Verhaltnis del' Fluoreszenzwerte bei 340 nm und bei 380
nm, wenn alle freien Kalzium-Ionen
dureh EGT A komplexiert sind.
(Sr/Sb2) ist das Verhaltnis der Werte
del' Fluoreszenz zwischen den dureh
EGT A komplexierten
und den mit
Fura-Z gesattigten
Kalzium-Ionen
bei 380 nm.
Die pHi-Werte wurden durch Interpolation aus einer Standardkurve bestimmt. Eine Kalibrierung der pl-lWerte wurde in einem 130 mM K+Puffer mit 5 )..1M Nigeriein durchgefuhrt (Thomas et al., 1979).
Ergebnisse
Eine Mesenzephalon-Kultur
aus dem
Gewebe embryonaler C57/B16 Mau217
!!ir-;)
CHEN ET AL.
----------------------------h~'-¥~
se ist durch einen hohen Gehalt an
dopaminergen Neuronen eharakterisiert (725 ± 104 Zellen pro Kultursehale). Es wurde zuerst der Effekt
einer direkten Zugabe von MPTP,
MPP+ und Paraquat in Konzentration
von 10 ~
auf die intrazellulare
Kalziumkonzentration
untersueht.
Direkt zugesetzte Toxine anderten
die Kalziurnkonzentration
'nicht. Die
Ergebnisse
einer
V orinkubation
uber 24 Stunden sind in Abbildung 1
dargestellt.
Die intrazellulare Kalziumkonzentration in kalziumfreiem
Medium
(Basalwert) wurde 50 see gemessen
und danaeh CaCl2 (Endkonzentration: 1 mM) zugegeben. Der Wert
nach Zugabe von CaCl2 (Wert naeh
Stimulation) wurde registriert. Der
Basalwert der intrazellularen
Kalziumkonzentration betrug bei der Kontrollgruppe 325 nM, nach Zugabe
von CaC12 stieg der Wert nach Stimulation auf 993 nM an. Die Vorinkubation mit lO ~ MPP+ fuhrte zu
einer 36%igen Erhohung in Ca-freiem Medium und zu einer 47%igen
Erhohung in 1 mM CaCl2 enthaltendemMedium.
In Abbildung 2 werden die Veranderungen der intrazellularen
Kalziurnkonzentration
in SynaptosomenPraparationen aus dem Striatum von
Hunden gezeigt.
In der Kontrollgruppe ohne Vorinkubation mit Toxin betrug der Basalwert 169 nM und der Wert naeh
Stimulation 217 nM. Die untersuchten Neurotoxine (Konzentration:
10
~) fuhrten jeweils zu keiner Erhohung der Basalwerte.
Die Werte
nach Stimulation sind jedoch gleieherweise fur MPTP und MPP+ urn
25% erhoht. Ein Effekt von Paraquat
laSt sich bei den Werten naeh Stimulation nieht zeigen.
Die Wirkung dieser Neurotoxine
auf den intrazellularen pH-Wert wurde ebenfalls untersueht.
Die in kalziumfreiem Medium suspendierten
Synaptosomen
wurden
mit untersehiedliehen
Toxinen 60
min lang vorinkubiert. Naeh Zugabe
von CaCl2 (Endkonzentration:
I
mM) wurde die Anderung des pHiWerts registriert. Der pl-l, betrug bei
218
[Ca2+]i in nM
2000 ~=-~~~~--------------~-----------------------------,
in 1 mMCa-Medium
lIin Ca-freiem Medium
24 h Vorinkubation
1500
1000
500
o
Kontrolle
MPP+
MPTP
Paraquat
2
Abbildung 1: lntrazeuulare Kalziumkonzentrationen [Ca +]; in der MesenzephalonKultur embryonaler C57/BI6 Mause, Die Mesenzephalonzellen wurden mit unterschiedlichen Toxinen (10 ~M) 24 Stunden lang vorinkubiert. [Ca2+)iist als Mitlelwert
± S.D. in nM angegeben. Die Zahl in Klammern stellt die Fallzahl dar. Signifikanzen
sind angegeben als *<0.05, verglichen mit den Kontroliwerten (Student's t-test).
der Kontrollgruppe
6.38. MPTP,
MPP+ und Paraquat in Konzentration
von 10 ~
fuhrten zu keiner pHiAnderung
im Vergleieh
mit der
350
Kontrollgruppe.
5 ~
Ionomyein
zeigte einen signifikanten
prl-Anstieg urn 0.04 Einheiten erst in kalziumfreiem Medium.
[Ca2+]i in nM
CJin 1 mMCa-Medium
lIin Ca-freiem Medium
60 min Vorinkubation
300
250
----------------14)-------
200
150
100
50
0
Kontrolle
MPP+
MPTP
Paraquat
2
Abbildung 2: lntrazeliulare Kalziumkonzentrationen [Ca +)iin Synaptosomen aus dem
Striatum yon Hunden. Die durch mehrfache Dichtezentrifugationsschritte praparierten
Synaptosomen wurden mit unterschiedlichen Neurotoxinen (10 ~M) 60 min lang
vorinkubiert. [Ca2+1iist als Mittelwert ± S.D. in nM angegeben. Die Zahl in Klammern
stellt die Fallzahl dar. Signifikanzen sind im Vergleich mit den Kontrollwerten nach
dem Student's t-test berechnet: *<0.05, **<0.01.
ALTEX 11,4/94
__
CHEN ET AL.
_
w~
~~t
~~~
Diskussion
Anders als membranaktive
Toxine
fuhrten MPTP und MPP+ zu keiner
direkten Veranderung der Membranpermeabilitat
fiir Kalzium.
Somit
scheint eine Membrantoxizitat,
verglichen mit den bekannten Mechanismen fiir MPTP (d.h. MAO-Hemmung und Hemmung durch oxidative Phosphorylierung),
wenn uberhaupt, nur eine untergeordnete Rolle
zu spielen. MPP+ ist im Tierversuch
selektiv toxisch fur dopaminerge
Neuronen. In der MesenzephalonKultur fuhrte eine Langzeitinkubation uber 24 Stunden zu einer signifikanten
Kalzium-Erhohung.
Somit
fiihrt ein dopaminerges Neurotoxin,
das se1ektiv in dopaminerge Neuronen aufgenommen wird (Burns et a1.,
1983), zu einer Storung der CaHornoostase.
Im Gegensatz
dazu
zeigte MPTP und MPP+ bei der
Untersuchung in Kulturen des Kortexgewebes keinen EinfluB auf die
Anderung des intrazellularen Kalziums (Chen et al., 1994). Es scheint
daher die Ca-Anderung
in einem
direkten Zusammenhang
mit dem
V orhandensein
von dopaminergen
Neuronen zu stehen. Die MPP+-Vorstufe MPTP konnte den Effekt nicht
bewirken. Um toxisch zu wirken,
muf MPTP offenbar zuerst in die
Gliazellen
aufgenommen
werden
und enzymatisch zu MPP+ umgesetzt
werden. Die Konzentration an MPTP
in der Kultur scheint nicht fur die
Bildung einer zelltoxischen Menge
an MPP+ auszureichen.
In frisch
gewonnenen
Synaptosomenproben
aus dem Striatum von Hunden wurde
im Mittel eine freie intrazellulare
Kalziumkonzentration
von 169 nM
gefunden.
Dieser Wert entspricht
den in der Literatur angeflihrten
(Lambert und Bondy, 1989). Nach
60-minutiger Vorinkubation
mit 10
f.lM MPP+ oder 10 f.lM MPTP wird
die Ca-Hornoostase
gestort und dadurch die intrazellulare Kalziumkonzentration erhoht.
In der Zellkultur und in Synaptosomenpraparationen
lieS sich somit ein
EinfluB eines dopaminergen Neurotoxins auf die intrazellulare Kalzi-
ALTEX 11,4/94
umkonzentration zeigen. Eine Kalzium-Erhohung konnte uber verschiedene Wege zustande kommen: durch
Kalziurn-Einstrom
uber KalziumKanale,
Austauschsysteme
oder
Membranleakage,
durch Freisetzung
aus Speicherorganellen
oder Kalzium-Bindungsproteinen.
Auch wenn
diese Veranderung
erst nach einer
Zellschadigung eintritt, ist die Frage
von Bedeutung, ob eine Regulation
des Kalzium-Einstrorns
auch protektive Wirkung auf die Zellen haben
konnte. Eine neuroprotektive
Wirkung durch den Kalzium-Blocker
Verapamil wurde von Sitges et a1.
(1990) gezeigt. In unseren Zellkultursystemen wird derzeit an dieser
Fragestellung gearbeitet.
Literatur
Burns, R. S., Chiueh, C. C. und Markey
S. P. (1983). A primate model of
parkinsonism: selective destruction of
dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by Nmethyl-4-phenyl-I,2,3,6-tetrahydropyridine. Proc. Natl. A cad. Sci. USA
80, 4546-4550.
Campbell, A. K. (1983). Intracellular calcium: its universal role as regulator.
Chichester: John Wiley & sons limited.
Chen, T.-S., Koutsilieri, E. und Rausch,
W.-D. (1994). MPP+ selectively affects
calcium homeostasis in mesencephalic
cell cultures from embryonal C57/Bl6
mice. 1. Neural Transm. (accepted).
Chiueh, C. c.. Burns, R. S., Markey, S.
P., Jacobowitz, D. M. und Kopin, 1. J.
(1985). Primate model of parkinsonism: selective lesion of nigrostriatal neurons by I-methyl-4-phenyl1,2,3,6-tetrahydropyridine
produces
an extrapyramidal syndrome in rhesus
monkeys. Life Sci. 36, 213-218.
Comporti, M. (1989). Three models of
free radical-induced cell injury. Chern.
BioI. Interactions 72, 1-56.
Dennis, W. J., Davis, M. H. und Brierley, G. P. (1989). Estimation of matrix
pH in isolated heart mitochondria
using a fluorescent probe. Anal. Biochem. 178, 348-354.
Dunkley, P., Jarvie, P. E., Heath, J. W.,
Kidd, G. J. und Rostas, J. A. P. (1986).
A rapid method for isolation of synaptosomes on Percoll gradients. Brain
Res. 372, 115-129.
Grynkiewicz, G., Poenie, M. und Tsien,
R. Y. (1985). A new generation of
Ca2+ indicators with greatly improved
fluorescence properties. 1. BioI. Chem.
260,3440-3450.
Friedman, L. K. und Mytilineou, C.
(1987). The toxicity of MPTP to dopamine neurons in culture is reduced at
high concentrations. Neurosci. Leu.
79,65-72.
Heizmann, C. W. und Braun, K. (1992).
Changes in Ca2+ -binding proteins in
human neurodegenerative disorders.
TINS J 5(7), 259-264.
Lambert, C. E. und Bondy, S. C. (1989).
Effects of MPTP, MPP+ and paraquat
on mitochondrial potential and oxidative stress. Life sci. 44(18),1277-1284.
Nagy, A. und Delgado-Escueta,
A. V.
(1984). Rapid preparation of synaptosomes from mammalian brain using
nontoxic isoosmotic gradient material
(Percoll).l. Neurochem. 43(4), 11141123.
Okada, M., Mine, K. und Fujiwara, M.
(1990). Differential calcium dependence between the release of endogenous dopamine and noradrenaline
from rat brain synaptosomes. 1. Neurochem. 54(6),1947-1952.
Sebben, M, Gabrion, J, Manzoni, 0,
Sladeczek, F, Gril, C, Bockaert, J,
Dumuis, A (1990). Establishment of a
long-term primary culture of striatal
neurons. Dev. Brain Res. 52,229-239.
Sitges, M., Chiu, L. M. und de la Fuente,
J. R. (1990). The effect of verapamil
on GABA and dopamine release does
not involve voltage-sensitive calcium
channels. Brain Res. 534,51-59.
Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A. und Racker, E. (1979). Intracellular pH measurements in Ehrlich
ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry 18, 2210-2218.
Tsien, R. Y., Rink, T. J. und Poenie, M.
(1985). Measurement of cytosolic free
Ca2+ in individual small cells using
fluorescence microscopy with dual excitation wavelength. Cell Calcium 6,
145-157.
Korrespondenzadresse
Tzyh-Shi Chen
Institut fur Medizinische Chemie
Veterinarrnedizinische
U ni versitat
Wien
Linke Bahngasse 11
A-I030 Wien
219