Quantitative PCR für das Feline Herpesvirus

Oktober 2013
Diagnostic
Update
Quantitative PCR für das Feline Herpesvirus
Mehr Informationen ohne zusätzliche Kosten!
Ab dem 1. Oktober erhalten Sie für alle PCR-Tests auf felines Herpesvirus, die aus Konjunktival-,
Nasen- oder Pharyngealabstrichen durchgeführt werden, quantitative Ergebnisangaben. Dies
gilt sowohl für den Einzeltest als auch für PCR-Tests, die Bestandteil der PCR-Profile „Augenprofil
Katze“ oder „Oberer Atmungstrakt Katze“ sind.
Grundlagen
Das feline Herpesvirus Typ 1 (FHV-1) spielt bei Erkrankungen
der oberen Atemwege und Keratokonjunktivitiden der Katze
eine entscheidende Rolle. Die Infektion mit diesem Virus wird
mit zahlreichen Erkrankungen wie klassischer Rhinotracheitis,
chronischer Konjunktivitis und Keratitis, rezidivierender Rhinitis und chronischer Sinusitis sowie mit Aborten, neonatalen
Erkrankungen und Erkrankungen des Zentralnervensystems
in Verbindung gebracht. Eine gefürchtete Komplikation im
Zusammenhang mit der Reaktivierung des FHV-1 ist die
herpetische Stromakeratitis (HSK), die, wie man annimmt,
auf immunpathologischen Mechanismen beruht. Allerdings
kann auch ein chronischer Verlauf einer Primärinfektion zur
Entwicklung der HSK führen.
FHV-1 gehört zur Familie der Alphaherpesvirinae. Ein extrafelines Reservoir oder ein alternativer Wirt für FHV-1 sind
nicht bekannt. Um in der Natur zu überleben, verlässt sich
das FHV-1 wie andere Herpesviren auf die Ausbildung einer
Latenz mit intermittierenden Episoden der Reaktivierung und
Virusausscheidung.
Diagnose
Sowohl Fluoreszenz-Antikörpertests als auch Verfahren zur
Virusisolierung werden für die Diagnose von FHV-1 während der akuten Primärinfektion als verlässlich angesehen.
Allerdings liefern beide Tests bei chronischen und rezidivierenden Infektionen oft negative Ergebnisse. Daher haben
sich Verfahren zur Detektion der DNA, wie die PCR, für die
Diagnose einer FHV-1-Infektion als außerordentlich nützlich
erwiesen. Im Vergleich zu anderen Testmethoden ist die
PCR deutlich schneller und sensitiver. Zusätzlich ist die PCR
durch Quantifizierung der FHV-1-DNA-Menge in der Lage,
zwischen latenter und aktiver Infektion zu unterscheiden.
Ein weiterer großer Vorteil der neuen quantitativen IDEXX
RealPCR™ gegenüber der konventionellen/qualitativen
PCR und der Virusisolierung durch Titration zeigt sich bei
der Analyse mehrerer aufeinander folgender Proben. Die
FHV-1-DNA-Quantifizierung ermöglicht die Überwachung
des Infektionsverlaufes, ohne dass kostspielige, zeit- und
arbeitsintensive Virusisolierungen sowie Virustitrationsverfahren notwendig werden.
Ergebnis
Die zusätzlichen Informationen zum Infektionsverlauf liefern
entscheidende Anhaltspunkte für fundierte Therapieentscheidungen und prognostische Aussagen. Die Unterscheidung
zwischen einer aktiven, klinische Symptome verursachenden Infektion (Stadium 1 und 2) und einer latenten Infektion
Gewebeschädigung bestätigt. Nur das replizierende Virus
aktiviert das Immunsystem der Mukosa, was sich an der
Transkription von Zytokin- und Chemokin-Genen zeigt, die
in der Folge entweder zu immunpathologischen Prozessen
oder zu direkter Zytolyse führt. Zudem korrelierte das Vorhandensein von FHV-1-RNA auch mit hohen Konzentrationen an FHV-1-DNA. Dies zeigt, dass die DNA-Quantifizierung alleine als Marker für eine Virusreplikation verwendet
werden kann. Die quantitative PCR könnte somit zum
Schlüsselinstrument zur Unterscheidung zwischen aktiver
und latenter FHV-1-Infektion und zur Identifizierung von
FHV-1 als Ursache einer Erkrankung der oberen Atemwege
bei der einzelnen Katze werden.
(Stadium 3) ist nun mithilfe eines einzigen quantitativen
Datenpunktes möglich. Befindet sich das Untersuchungsergebnis einer Probe im Graubereich (Übergang von Stadium
2 zu Stadium 3), so sollte nach 5 Tagen eine weitere Probe
analysiert werden, um eine klare Unterscheidung zwischen
dem frühen Stadium 1 und dem späten Stadium 2 bzw.
dem frühen Stadium 3 der Erkrankung treffen zu können.
Eine vor Kurzem durchgeführte Studie1 bei Katzen mit
Atemwegserkrankungen hat früher veröffentlichte Beobachtungen über den Zusammenhang zwischen FHV-1-DNAMenge und klinischen Parametern, Virusreplikation, Virusisolierung in der Zellkultur, Immunreaktion, pathognomonischen Einschlüssen und histologischen Graden der
Übersicht über die drei FHV-1-Bereiche, die mittels real time-PCR ermittelt werden.
Hohe Konzentrationen an FHV-1-DNA werden als hohe FHV-1-Viruslast angesehen und weisen auf eine aktive Infektion
sowie auf eine ursächliche Beteiligung von FHV-1 an den klinischen Symptomen hin. Katzen in dieser Gruppe weisen
normalerweise eine histologische Gewebeschädigung vom Grad 3 – 5 auf und befinden sich im klinischen Stadium 1
oder 2. Zudem zeigen sie positive Ergebnisse bezüglich FHV-1-Replikation und Virusisolierung. Eine hohe Viruslast spricht
auch für ein aktiviertes Immunsystem und weist auf die Induktion einer FHV-1-spezifischen Immunreaktion hin. Niedrige
DNA-Konzentrationen sprechen für eine latente Infektion, einen histologischen Grad 1 – 2, ein nicht klinisches Stadium 3,
fehlende FHV-1-Replikation und negative Virusisolierung sowie das Fehlen einer FHV-1-spezifischen Immunaktivierung.
Bereich / Interpretation
Niedrig
Eine niedrige FHV-1-DNA-Menge
weist auf eine chronische Infektion
hin; FHV-1 ist wahrscheinlich nicht
am aktuellen Krankheitsgeschehen beteiligt. Andere Ursachen für
die klinischen Symptome sollten
abgeklärt werden.
Mittel
Unklarer Bereich.
Nachtestung nach 5 Tagen.
Hoch
Eine hohe FHV-1-DNA-Menge weist
auf eine aktive Infektion sowie eine
ursächliche Beteiligung des Virus
an der klinischen Symptomatik hin.
Histologischer
Score,
Rhinitis-Grad
Klinische
Stadien
1&2
3
3
2 oder 3
FHV-1Replikationsstatus
Immunstatus
Keine feststellbare FHV-1Replikation, Ausscheidung
latent infizierter Zellen;
Virusisolierung negativ
Inaktiver
Immunstatus
–
–
Erhöhte FHV-1-Replikation; Aktivierter
Virusisolierung möglich
Immunstatus
>3–5
1&2
Literaturnachweis:
Voegtlin et al., 2002
Burns et al., 2011
Literaturnachweis:
[1] Burns RE, Wagner DC, Leutenegger CM, Pesavento PA.
Histologic and molecular correlation in shelter cats with acute
upper respiratory infection. J Clin Microbiol. 2011 49(7):2454-60.
[2] Voegtlin A, Fraefel C, Albini S, Leutenegger CM, Schraner E,
Spiess B, Lutz H, Ackermann M. Quantification of feline herpesvirus 1 DNA in ocular fluid samples of clinically diseased cats by
real-time TaqMan PCR. J Clin Microbiol. 2002 40(2):519-23.
[3] Johnson LR, De Cock HE, Sykes JE, Kass PH, Maggs DJ,
Leutenegger CM. Cytokine gene transcription in feline nasal
tissue with histologic evidence of inflammation. Am J Vet Res.
2005 66(6):996-1001.
Johnson & Maggs, 2005
[4] Lynelle R. Johnson, David J. Maggs. Feline herpesvirus type-1
transcription is associated with increased nasal cytokine gene
transcription in cats. Veterinary Microbiology 2005 108 225–33
[5] Leutenegger CM, Mislin CN, Sigrist B, Ehrengruber MU, HofmannLehmann, R., Lutz, H., Quantitative real-time PCR for the measurement of feline cytokine mRNA. Vet. Immunol. Immunopathol.
1999 71, 291–305.
[6] Fontenelle, J.P., Powell, C.C., Veir, J.K., Radecki, S.V., Lappin, M.R.
Effect of topical ophthalmic application of cidofovir on experimentally
induced primary ocular feline herpesvirus-1 infection in cats.
Am. J. Vet. Res. 2008 69(2):289-93.
Interpretation der
quantitativen
FHV-1 Ergebnisse
<38.000 · NIEDRIG:
Interpretation/Bereich
FHV-1-DNA-Konzentration
pro Abstrich
niedrig
< 38.000
mittel
38.000 – 150.000
hoch
> 150.000
Dieses Stadium ist mit einer latenten FHV-1-Infektion vereinbar und weist auf keine Beteiligung an den klinischen Symptomen
hin. Das Stadium korreliert zudem mit einer fehlenden Replikation von FHV-1 (negativ für FHV-1-RNA), negativer Virusisolierung, dem Fehlen von FHV-1-spezifischen Einschlusskörperchen bei der immunhistochemischen Untersuchung von Bioptaten
und einer fehlenden Aktivierung des Immunsystems.
Latente Infektion:
EIN POSITIVES ERGEBNIS DER FELINEN HERPESVIRUS 1-PCR bedeutet, dass FHV-1-DNA in der Probe vorhanden war.
Das quantitative FHV-1-PCR-Ergebnis hilft bei der Beurteilung der klinischen Signifikanz der FHV-1-Infektion. Weitere Ursachen
der klinischen Symptome sollten gesondert untersucht werden. Die Impfung mit einem intranasalen oder modifizierten
Lebendimpfstoff kann bis zu einigen Wochen nach Applikation zu positiven Testergebnissen führen.
Die FHV-1-Viruslast ist gering, was auf eine latente oder chronische Infektion hinweist. Zeigt die Katze klinische
Symptome im Bereich des oberen Atmungstraktes und/oder der Augen, ist FHV-1 wahrscheinlich nicht am aktuellen Krankheitsgeschehen beteiligt. Bitte berücksichtigen Sie andere Differentialdiagnosen, um die Ursache der
klinischen Symptome festzustellen. Eine Reaktivierung der FHV-1-Infektion ist jederzeit möglich. Gegebenenfalls
sollte ein Ophthalmologe zu Rate gezogen werden.
38.000 – 150.000 · MITTEL:
Ein Ergebnis im unklaren Bereich erfordert eine Nachtestung nach 5 Tagen, um zu ermitteln, ob sich die Katze im frühen
Stadium 1 (akute Infektion) oder in der Übergangsphase von Stadium 2 zu Stadium 3 (latente Infektion) befindet.
Unklares Ergebnis:
EIN POSITIVES ERGEBNIS DER FELINEN HERPESVIRUS 1-PCR bedeutet, dass FHV-1-DNA in der Probe vorhanden war.
Das quantitative FHV-1-PCR-Ergebnis hilft bei der Beurteilung der klinischen Signifikanz der FHV-1-Infektion. Weitere Ursachen
der klinischen Symptome sollten gesondert untersucht werden. Die Impfung mit einem intranasalen oder modifizierten
Lebendimpfstoff kann bis zu einigen Wochen nach Applikation zu positiven Testergebnissen führen.
Die FHV-1-Viruslast ermöglicht keine Unterscheidung zwischen latenter und akuter Infektion. Eine Wiederholung
des Tests nach 5 Tagen wird empfohlen, um feststellen zu können, ob FHV-1 ursächlich an der bestehenden
klinischen Symptomatik beteiligt ist.
>150.000 · HOCH: Eine hohe DNA-Konzentration spricht für FHV-1 als Ursache der klinischen Atemwegserkrankung. Dieses Stadium korreliert
mit der Anwesenheit replizierender FHV-1-Viruspartikel, einer positiven Virusisolierung, dem Vorliegen von FHV-1-spezifischen
Einschlusskörperchen bei der immunhistochemischen Untersuchung und einer FHV-1-spezifischen Immunantwort.
Aktive Infektion:
EIN POSITIVES ERGEBNIS DER FELINEN HERPESVIRUS 1-PCR bedeutet, dass FHV-1-DNA in der Probe vorhanden war.
Das quantitative FHV-1-PCR-Ergebnis hilft bei der Beurteilung der klinischen Signifikanz der FHV-1-Infektion. Weitere Ursachen
der klinischen Symptome sollten gesondert untersucht werden. Die Impfung mit einem intranasalen oder modifizierten
Lebendimpfstoff kann bis zu einigen Wochen nach Applikation zu positiven Testergebnissen führen.
Die FHV-1-Viruslast ist hoch und spricht für eine aktive Infektion. FHV-1 ist wahrscheinlich ursächlich an den
Symptomen der Atemwegs- und/oder Augenerkrankung beteiligt. Die Verabreichung eines nasalen oder modifizierten Lebendimpfstoffes einige Wochen vor dem Test kann ebenfalls zu einer hohen Viruslast führen.
NEGATIV:
Kein Nachweis feliner Herpesvirus-DNA
Negativ:
EIN NEGATIVES ERGEBNIS DER FELINEN HERPESVIRUS 1-PCR bedeutet, dass keine FHV-1-DNA in der Probe nachgewiesen wurde, und dass FHV-1 höchstwahrscheinlich nicht die Ursache der klinischen Symptome bei dem getesteten
Patienten ist. Ein negatives PCR-Ergebnis kann jedoch auch aufgrund einer unter der Nachweisgrenze liegenden Anzahl
von Erregern, einer infolge einer Behandlung sowie bei Vorliegen eines chronischen Trägerstatus verringerten Erregeranzahl
oder dem Auftreten eines neuen Virenstammes zustande kommen.
Diagnostic
Update
Die Vorteile der real time-PCR gegenüber der
konventionellen PCR
Real time-PCR ist sicherer, schneller und bietet eine stabilere Methodik.
Während bei der konventionellen Methode die amplifizierte
DNA über eine Gelelektrophorese weiter prozessiert werden
muss, um den DNA-Abschnitt sichtbar zu machen, laufen
in einem real time-PCR-Test Amplifikation und Detektion
im gleichen Reaktionsgefäß ab. Das geschlossene System
reduziert somit Kontaminationen auf ein Minimum. Der
wesentliche Vorteil der real time-PCR gegenüber der konventionellen PCR ist zudem die Möglichkeit, die Messdaten
quantitativ zu bewerten. Über einen Bereich von bis zu 10
log-Stufen kann mit Hilfe der bei der real time-PCR emittierten Fluoreszenz ein linearer Zusammenhang mit der eingesetzten DNA Menge aufgestellt werden.
Sind entsprechende wissenschaftliche Erkenntnisse vorhanden, ist es z. B. möglich, über eine Quantifizierung der
Krankheitserreger-Nukleinsäuremenge den Infektionsstatus
eines Tieres in Kombination mit serologischen Daten genau
zu bestimmen (z. B. Leishmaniose) oder die Beteiligung
am Krankheitsgeschehen zu beurteilen (z. B. Clostridium
perfringens Toxin-Gene und FHV-1).
Eine quantitative Information über die Pathogen-Nukleinsäuremenge ermöglicht es auch, zwischen einer VakzineInterferenz und einer Infektion mit einem Wildtyp-Stamm des
Erregers zu unterscheiden, da die vorhandene Pathogenmenge während einer Infektion normalerweise exponentiell
höher ist als nach einer frischen Impfung (z. B. Staupe).
Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet quantitativer PCR
ist die Überwachung des Therapieerfolges.
Felines Herpesvirus-Diagnostik bei IDEXX Vet·Med·Labor
Felines Herpesvirus 1 (DNA, quantitativ)
Konjunktival-, Pharyngeal-, Nasenabstrich
Felines Herpesvirus 1 (DNA, qualitativ)
Genitalabstrich oder Abortmaterial
Augenprofil Katze Konjunktival-/Kornealabstrich
(Chlamydia felis, Mycoplasma felis,
FHV-1 (quantitativ))
Profil Oberer Atmungstrakt Katze (Chlamydia felis, Mycoplasma felis,
FHV-1 (quantitativ), felines Calicivirus)
Pharyngeal- + Konjunktivalabstrich
Felines Herpesvirus Typ 1
Virusneutralisationstest
Serum
Vet Med Labor GmbH
Division of IDEXX Laboratories
Mörikestr. 28/3
D – 71636 Ludwigsburg
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