Monecke Thomas Diplomarbeit

Inhaltsverzeichnis
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG ............................................................................................................................ 1
1.1
DIE FUNKTION DES M7G-CAPS IM ZELLULÄREN STOFFWECHSEL ....................................... 1
1.2
DAS SPLEIßEN VON MRNA...................................................................................................... 3
1.2.1
DIE BIOGENESE DER SNRNPS ................................................................................................ 3
1.2.2
DER SPLEIßVORGANG............................................................................................................. 7
1.3
DIE DIMETHYLIERUNG DES SNRNA/SNORNA-CAP .............................................................. 9
1.4
DIE SNRNA-M7G-CAP-SPEZIFISCHEN DIMETHYLTRANSFERASEN .................................... 11
1.4.1
STRUKTURELLE ANALYSE VON METHYLTRANSFERASEN ................................................... 11
1.4.1.1
PRIP interacting protein with methyltransferase domain (Homo sapiens) ...................... 13
1.4.1.2
Trimethylguanosin-Synthase1 (Saccharomyces cerevisiae)............................................. 15
1.5
2
AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG ........................................................................... 16
MATERIAL UND METHODEN ........................................................................................... 17
2.1
MATERIAL .............................................................................................................................. 17
2.1.1
FEINCHEMIKALIEN ............................................................................................................... 17
2.1.2
GERÄTE ................................................................................................................................ 17
2.1.3
CHROMATOGRAPHIESÄULEN ............................................................................................... 19
2.1.4
KIT-SYSTEME ....................................................................................................................... 19
2.1.5
ORGANISMEN ....................................................................................................................... 19
2.1.6
PLASMIDE ............................................................................................................................. 20
2.1.7
ENZYME UND INHIBITOREN ................................................................................................. 20
2.1.8
GRÖßENSTANDARDS............................................................................................................. 21
2.1.9
DNA-OLIGONUKLEOTIDE .................................................................................................... 21
2.1.10
MODIFIZIERTE RNA-NUKLEOTIDE .................................................................................... 23
2.1.11
GENBANKEN ....................................................................................................................... 23
2.1.12
KRISTALLISATIONSSCREENS .............................................................................................. 23
2.1.13
COMPUTERPROGRAMME .................................................................................................... 24
2.2
METHODEN ............................................................................................................................ 25
2.2.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ............................................................................... 25
2.2.1.1
2.2.1.1.1
Nukleinsäurebiochemische Methoden .............................................................................. 25
Polymerase-Kettenreaktion............................................................................................ 25
Inhaltsverzeichnis
II
2.2.1.1.2
Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen................................................... 26
2.2.1.1.3
DNA-Dephosphorylierung am 5´-Ende ......................................................................... 27
2.2.1.1.4
DNA-Ligation ................................................................................................................ 28
2.2.1.1.5
ortsgerichtete Mutagenese.............................................................................................. 28
2.2.1.1.6
DNA-Sequenzierung...................................................................................................... 29
2.2.1.1.7
Agarosegelelektrophorese.............................................................................................. 30
2.2.1.1.8
Visualisierung von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid ............................................... 31
2.2.1.1.9
DNA-Isolierung aus Agarosegelen ................................................................................ 31
2.2.1.2
Proteinbiochemische Methoden........................................................................................ 32
2.2.1.2.1
Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation .................................................... 32
2.2.1.2.2
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelktrophorese von Proteinen................................ 32
2.2.1.2.3
Visualisierung von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue...................................... 35
2.2.1.2.4
Perchlorsäurefällung von Proteinen ............................................................................... 35
2.2.1.2.5
Spaltung von Proteinen durch Proteasen ....................................................................... 36
2.2.1.3
Chromatographische Methoden ........................................................................................ 37
2.2.1.3.1
Affinitätschromatographische Reinigung von GST-Fusionsproteinen .......................... 37
2.2.1.3.2
Affinitätschromatographische Reinigung von Hexa-Histidin Fusionsproteinen ........... 38
2.2.1.3.3
Ausschlußchromatographie von Proteinen .................................................................... 39
2.2.1.3.4
Umkehrphasenchromatographie .................................................................................... 40
2.2.2
ZELLBIOLOGISCHE METHODEN............................................................................................ 41
2.2.2.1
Herstellung chemisch kompetenter Zellen........................................................................ 41
2.2.2.2
Transformation chemisch kompetenter Zellen.................................................................. 42
2.2.2.3
Präparation von Plasmid-DNA ......................................................................................... 42
2.2.2.4
Expression rekombinanter Proteine .................................................................................. 43
2.2.2.4.1
Überexpression von rekombinantem Protein in Escherichia coli.................................. 43
2.2.2.4.2
Ernte und Aufschluß einer Expressionskultur................................................................ 44
2.2.3
SPEKTROSKOPISCHE METHODEN ......................................................................................... 46
2.2.3.1
Absorption......................................................................................................................... 46
2.2.3.1.1
Bestimmung nativer molarer Extinktionskoeffizienten ................................................. 46
2.2.3.1.2
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen ............................................. 47
2.2.3.1.3
Konzentrationsbestimmung von Protein-Lösungen....................................................... 47
2.2.3.2
2.2.4
Fluoreszenzspektren.......................................................................................................... 48
KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN................................................................................... 49
2.2.4.1
Kristallisation von Proteinen............................................................................................. 49
2.2.4.2
Röntgenbeugungsexperimente .......................................................................................... 50
Inhaltsverzeichnis
3
III
ERGEBNISSE .......................................................................................................................... 52
3.1
EXPRESSION UND REINIGUNG VON PIMT ........................................................................... 52
3.2
FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN UND KRISTALLISATION DER METHYLTRANSFERASEDOMÄNE AUS PIMT............................................................................................................... 54
3.2.1
ÜBERPRÜFUNG UND KORREKTUR DER METHYLTRANSFERASE-SEQUENZ .......................... 54
3.2.2
EXPRESSION, ZELLERNTE UND AUFSCHLUß ........................................................................ 55
3.2.2.1
3.2.3
Expression der Methyltransferase-Domäne mit Affinitätssequenzen ............................... 55
REINIGUNG DER METHYLTRANSFERASE-DOMÄNE AUS PIMT............................................ 56
3.2.3.1
Affinitätschromatographische Reinigung über Glutathion-Sepharose ............................. 56
3.2.3.2
Affinitätschromatographische Reinigung über His-Trap-Säulen ..................................... 57
3.2.3.3
Spaltung des Fusionsproteins durch PreScission Protease ............................................... 59
3.2.3.4
Ausschlußchromatographische Reinigung der Methyltransferase-Domäne ..................... 62
3.2.4
INTERAKTIONSNACHWEISE ÜBER FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE ....................................... 65
3.2.5
NACHWEIS DER METHYLIERUNGSAKTIVITÄT ...................................................................... 68
3.2.6
KRISTALLISATION DER METHYLTRANSFERASE-DOMÄNE ................................................... 74
3.2.7
GENERIERUNG STABILER FRAGMENTE DER METHYLTRANSFERASE ................................... 75
3.3
EXPRESSION UND REINIGUNG DER ORTHOLOGEN METHYLTRANSFERASE TGS1 AUS
SACCHAROMYCES CEREVISIAE............................................................................................. 78
3.3.1
SEQUENZVERGLEICH VON TGS1 UND PIMT ........................................................................ 78
3.3.2
KLONIERUNG VERKÜRZTER TGS1-FRAGMENTE .................................................................. 79
3.3.3
EXPRESSION, ZELLERNTE UND AUFSCHLUß ........................................................................ 81
3.3.4
REINIGUNG DER TGS1-FRAGMENTE .................................................................................... 82
3.3.4.1
Affinitätschromatographische Reinigung über Glutathion-Sepharose ............................. 82
3.3.4.2
Spaltung des Fusionsproteins durch TEV-Protease........................................................... 83
4
DISKUSSION........................................................................................................................... 85
4.1
EXPRESSION UND BIOINFORMATISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PIMT ...................... 86
4.1.1
EXPRESSION VON PIMT IN DER VOLLEN LÄNGE ................................................................. 86
4.1.2
ANALYSE DER SEKUNDÄRSTRUKTUR VON PIMT ................................................................ 86
4.2
EXPRESSION, REINIGUNG UND KRISTALLISATION DER METHYLTRANSFERASE-DOMÄNE
AUS PIMT............................................................................................................................... 88
4.2.1
EXPRESSION UND REINIGUNG DER METHYLTRANSFERASE ................................................. 88
4.2.2
INTERAKTIONSNACHWEISE ÜBER FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE ....................................... 89
4.2.3
NACHWEIS DER METHYLIERUNGSAKTIVITÄT ...................................................................... 90
Inhaltsverzeichnis
IV
4.2.4
KRISTALLISATION DER METHYLTRANSFERASE-DOMÄNE ................................................... 91
4.2.5
GENERIERUNG STABILER FRAGMENTE DER METHYLTRANSFERASE-DOMÄNE ................... 92
4.3
EXPRESSION, REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON TGS1 ..................................... 94
4.3.1
KLONIERUNG UND REINIGUNG VON TGS1 ........................................................................... 95
4.3.2
SEQUENZVERGLEICH ORTHOLOGER DIMETHYLTRANSFERASEN ......................................... 95
4.3.3
VORHERSAGE DER DREIDIMENSIONALEN STRUKTUR VON TGS1 ........................................ 98
5
ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 101
6
SUMMARY ............................................................................................................................. 102
7
LITERATURVERZEICHNIS.............................................................................................. 103
8
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................... 112
9
DANKSAGUNG..................................................................................................................... 116
Einleitung
1
1 Einleitung
Die Proteinbiosynthese ist einer der zentralen Prozesse, welcher in allen Zellen abläuft.
Durch sie erfolgt die Übersetzung der genetischen Information.
Die prä-mRNA entsteht dabei im Zellkern als Produkt der Transkription der DNA, welche
die genetische Information trägt. Diese prä-mRNA wird in Eukaryoten mehrfach
modifiziert und von den nicht kodierenden Sequenzen befreit (Spleißen). Die gereifte
mRNA wird in das Zytoplasma transportiert und dort durch die Ribosomen in die
korrespondierende Aminosäuresequenz übersetzt.
1.1 Die Funktion des m7G-Caps im zellulären Stoffwechsel
Nach der Transkription der genetischen Information von der Sequenz der DNA auf die
Sequenz der RNA beinhaltet das einzelsträngige Ribonukleinsäuremolekül alle
kodierenden Bereiche (Exons) und nicht-kodierenden Bereiche (Introns). In diesem
Stadium erhält das Primärtranskript ein Cap an seinem 5´-Ende. Dabei wird durch das
Zusammenwirken einer 5´-Triphosphatase und der Guanylyltransferase eine Guaninbase
über eine 5´-5´-Triphosphatbindung an das 5´-Nukleotid der mRNA-Kette angehängt
(Cougot et al., 2004; Fresco et al., 1994; Tsukamoto et al., 1997). Es folgt die
Methylierung der Guaninbase am N7-Stickstoff durch die N7G-Methyltransferase (Fabrega
et al., 2004). An die 2´C-Hydroxylgruppen der zweiten und dritten Ribose können
ebenfalls Methylgruppen angefügt werden (Yang et al., 1976). Die Methylgruppen an den
verschiedenen Stellen der mRNA haben in den verschiedenen Stoffwechselwegen ganz
unterschiedliche Bedeutung und Wichtigkeit.
Neben der mRNA erhalten jedoch auch andere RNA-Moleküle solche Modifikationen. So
werden die snRNAs (small nuclear RNAs), welche den Nukleinsäure-Teil des
Spleißosoms repräsentieren, und die snoRNAs (small nucleolar RNAs), die bei der
Prozessierung von ribosomaler RNA eine wichtige Rolle spielen, nach ihrer Transkription
mit einem solchen Cap versehen. Im Gegensatz zur mRNA wird dieses Cap zusätzlich am
exozyklischen Stickstoff N2 dimethyliert (Mouaikel et al., 2002).
Einleitung
2
Diese Struktur am 5´-Ende der RNA-Moleküle hat verschiedene Aufgaben. So wird durch
das Vorhandensein des Caps die Polyadenylierung des 3´-Endes gefördert (Flaherty et al.,
1997) und das Spleißen der prä-mRNA ermöglicht (Izaurralde et al., 1994). Nach dem
Export der mRNA ins Zytoplasma bindet der eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E),
der an der Translationssteuerung beteiligt ist, an das Cap (Cormier et al., 2003; Wilusz et
al., 2001).
Der Export der kleinen nukleären RNAs (snRNAs), wird durch die Erkennung des einfach
methylierten Caps durch das Cap-Bindeprotein (CBC) vermittelt (Izaurralde et al., 1994)
Schließlich ist die 5´-5´-Triphosphatbindung zwischen der Guaninbase und der ersten Base
der mRNA ein sehr wirksamer Schutz gegen 5´-Exonukleasen, was zu einer höheren
Stabilität der so modifizierten Transkripte führt (Wilusz et al., 2001).
Abbildung 1: Struktur des m7G-RNA-Cap. Die angehängte Guaninbase ist blau unterlegt und die
Methylgruppe am Stickstoff N7 rot hervorgehoben, die 5´-5´-Triphosphatbindung zwischen dem Guanin und
der ersten Base der mRNA ist grün unterlegt, die Basen der Nukleotide zwei und drei variieren und die
Methylgruppen an ihren Ribosen sind rot unterlegt (ChemSketch).
Aufgrund dieser Wichtigkeit des Cap im Metabolismus der Zelle haben viele Viren
Mechanismen entwickelt, um ihre Primärtranskripte mit einer solchen Struktur zu versehen
(Cougot et al., 2004). So nutzen verschiedene Retroviren die RNA-Polymerase II der
Wirtszelle als Transkriptionsapparat, um sicherzustellen, daß die viralen Transkripte mit
einem Cap versehen werden. Vertreter der Orthomyxoviridae und das Influenzavirus
Einleitung
3
schneiden die ersten 13 5´-Nukleotide der Wirts-mRNA ab, um diese Sequenz auf die
eigenen Transkripte zu übertragen (cap snatching) (Caton et al., 1980; Rao et al., 2003).
An diesen Beispielen läßt sich die Wichtigkeit dieser Modifikation verschiedener RNAs
gut erkennen.
1.2 Das Spleißen von mRNA
Das Spleißen wird durch makromolekulare Komplexe, bestehend aus RNA und Proteinen,
den Spleißosomen, bewerkstelligt. Diese setzen sich aus verschiedenen Untereinheiten
zusammen und assemblieren während des Spleißvorganges zum aktiven Spleißosom. Die
einzelnen Untereinheiten werden als snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins)
bezeichnet und setzen sich aus einer snRNA (100-200bp) und verschiedenen Proteinen
zusammen. Es wurden zwei verschiedene Formen des Spleißosoms entdeckt. Das major
spliceosome (Hauptspleißosom) und das minor spliceosome (Nebenspleißosom) (Burge et
al., 1999). Das Hauptspleißosom ist für die Entfernung von Typ-U2 Introns (5´-GT...AG3´) verantwortlich und setzt sich aus den fünf kleinen Ribonukleoproteinen (snRNPs) U1,
U2, U4, U5 und U6 und mehreren anderen nicht-spleißosomalen Proteinen zusammen
(Hartmuth et al., 2002). Das Nebenspleißosom entfernt die sehr seltenen Typ-U12 Introns
(5´-AT...AC-3´) aus Primärtranskripten (Tarn & Steitz, 1996).
1.2.1
Die Biogenese der snRNPs
Während der Biogenese von U snRNAs zu gereiften U1, U2, U4 und U5 snRNPs müssen
die U snRNAs ins Zytoplasma und die fertig gereiften U snRNPs zurück in den Zellkern
transportiert werden, wo sie wahrscheinlich in den cajal bodies funktionell assemblieren
(Sleeman et al., 2001; Sleeman & Lamond, 1999). Nach der Transkription, dem Transfer
des 5´-terminalen m7G-Caps und der Modifikation des 3´-Terminus werden die m7GsnRNAs durch verschiedene Proteine ins Zytoplasma exportiert. Im Zytoplasma
assemblieren 7 Sm-Proteine (Steven Miller) an der Sm-site, und sowohl der 5´- als auch
der 3´-Terminus werden erneut modifiziert. Das 3´-Ende wird gekürzt und das
monomethylierte m7G-Cap am 5´-Ende zu einem m2,2,7G-Cap hypermethyliert. Nach dem
Einleitung
4
Reimport der snRNP-core-Komplexe werden diese im Nukleus erneut modifiziert, um eine
Anlagerung spezifischer Proteine zu gewährleisten. Während beider Transportprozesse
übernimmt das Cap der snRNAs eine Signalfunktion, wodurch der Transport vermittelt
wird.
In Abbildung 2 ist die Biogenese der U snRNPs am Beispiel des U1 snRNPs dargestellt.
Die U1 snRNA interagiert mit den 7 Sm-Proteinen (B, B´, D1, D2, D3, E, F, G) und den
spezifischen Proteinen 70k, A und C.
Abbildung 2: Vereinfachte Darstellung der Biogenese des U1 snRNPs aus H. sapiens. Export der
transkribierten und modifizierten U1 snRNA ins Zytoplasma (linke Seite) und Reimport des modifizierten
und assemblierten U1 snRNPs ins Nukleoplasma (rechte Seite). Chromosome region maintenance (Crm1);
Cap binding complex (CBC); Phosphorylated adapter for RNA export (PHAX); Importin (Imp ); Survival
of motor neuron (SMN); Snurportin1 (SPN1); U1 snRNP spezifische Proteine (70k, C, A).
Die Transkription der U snRNAs findet im Nukleus statt. U1, U2, U4 und U5 snRNAs
werden analog zur mRNA durch die RNA-Polymerase II synthetisiert (Hernandez, 2001)
und die primären Transkripte an beiden Enden modifiziert.
Das Anfügen des m7G-Caps erfolgt durch das Zusammenwirken der Triphosphatase, der
Guanylyltransferase und der N7G-Methyltransferase (Salditt-Georgieff et al., 1980). Nach
Einleitung
5
der Erkennung des m7G-Caps durch den Cap binding complex (CBC) (Ohno et al., 1990),
der sich als Heterodimer aus den Cap-Bindeproteinen 20 und 80 zusammensetzt, erfolgt
der Export der snRNA ins Zytoplasma. Phosphoryliertes PHAX (Phosphorylated adapter
for RNA export) vermittelt dabei den Kontakt zwischen dem Exportfaktor Crm1
(Chromosome region maintenance1) und dem CBC-snRNA-Komplex (Ohno et al., 2000;
Segref et al., 2001). Die Direktionalität dieses Exportes wird durch einen Gradienten an
Ran-GTP gewährleistet (Görlich & Kutay, 1999; Lei & Silver, 2002; Macara, 2001; Mattaj
& Englmeier, 1998; Becskei & Mattaj, 2002). Im Zytoplasma dissoziiert Crm1 durch die
Dephosphorylierung von PHAX, wobei PHAX und CBC zunächst an der snRNA
gebunden bleiben. Der SMN-Komplex mit den bereits gebundenen Sm-Proteinen
vermittelt dessen Assemblierung an die snRNA im Zytoplasma (Meister et al., 2000;
Meister et al., 2001). Nach der Dissoziation von CBC und PHAX bindet die
Dimethyltransferase an das m7G-Cap des snRNP und hypermethyliert dieses zum m2,2,7GCap (Meister et al., 2002). Dabei spielen auch die Interaktionen zwischen der
Dimethyltransferase und SMN bzw. SmB, D1 und D3 eine wichtige Rolle (Mattaj, 1986;
Plessel et al., 1994; Raker et al., 1996). Das trimethylierte Cap und der Sm-core bilden ein
zweigeteiltes Importsignal (Fischer et al., 1990; Fischer et al., 1993; Hamm et al., 1990;
Plessel et al., 1994). Dabei wird das hypermethylierte Cap von Snurportin1, dem
Importadapter des m2,2,7G-Caps für Importin
erkannt und in den Zellkern reimportiert
(Huber et al., 1998). Im Nukleus können sich die U1-spezifischen Proteine 70k, A und C
an das assemblierte und trimethylierte U1 snRNP anlagern (Bringmann et al., 1983;
Lührmann et al., 1990).
Einleitung
6
In Abbildung 3 ist die Assemblierung der Sm-Proteine an die uridinreiche Sm-site, sowie
die Hypermethylierung des Caps genauer dargestellt.
Abbildung 3: Assemblierung des snRNP-core und Hypermethylierung des m7G-Cap. Die Sm-Proteine
B/B´, D1-3, E, F und G bilden den Sm-core Mithilfe des SMN-Komplexes; daraufhin wird das m7G-Cap
dimethyliert, der SMN-Komplex und die Dimethyltransferase PIMT binden an die C-terminalen Domänen
von Sm B/B´, D1 und D3, an denen dimethylierte Arginine vorliegen. Cap binding complex (CBC);
Phosphorylated adapter for RNA export (PHAX); Survival of motor neuron (SMN); PRIP-interacting
protein with methyltransferase domain (PIMT); WD repeat containing protein 45 (WD45); Nucleotide
sensitive component of chloride channels (pICln); Methyltransferase (JBP1).
Die Sm-Proteine bilden drei Subkomplexe, die aus SmE/F/G, SmB/D3 und SmD1/D2
bestehen (Lehmeier et al., 1994; Raker et al., 1996; Hermann et al., 1995). Durch das
Methylosom, welches sich aus WD45, JBP1 und PICl1 zusammensetzt, werden bestimmte
Argininreste am C-Terminus von SmB, D1 und D3 symmetrisch dimethyliert. Diese
Dimethylarginine sind für die Interaktion mit SMN und PIMT/Tgs1 wichtig (Brahms et
al., 2001). Die Subkomplexe werden durch SMN gebunden. In mehreren Schritten werden
diese durch Umlagerungen von SMN auf die Sm-site der U snRNA übertragen (Meister et
al., 2002, Kambach et al., 1999). Der SMN-Komplex bleibt nach der Assemblierung an
die Sm-Proteine gebunden und interagiert ebenfalls mit PHAX und CBC. PIMT/Tgs1
bindet an das einfach methylierte Cap und interagiert gleichsam mit SMN und den
symmetrisch dimethylierten Sm-Proteinen B, D1 und D3 (Mouaikel et al., 2002; Meister et
al., 2002). Nach erfolgter Methylierung des Caps wird PIMT/Tgs1 freigesetzt (Mouaikel
et al., 2003b).
Einleitung
7
Die U6 snRNA wird im Gegensatz zu den U1, U2, U4 und U5 snRNAs durch die RNA
Polymerase III transkribiert und erhält ein ungewöhnliches -Monomethyltriphosphat-Cap
(Krol et al., 1987; Kunkel et al., 1986; Reddy et al., 1987). Die Reifung des U6 snRNP
findet wahrscheinlich im Nukleus statt, wobei die snRNA mit einem heptameren Ring aus
Sm-ähnlichen Proteinen (LSm-Proteine) assembliert. Es wurden acht LSm-Proteine
identifiziert, und die Lokalisation der U6 snRNP Partikel hängt von der Zusammensetzung
des LSm-Ringes ab. Assembliert die U6 snRNA mit LSm 1-7 nimmt das reife U6 snRNP
an der Spleißreaktion teil, während LSm 2-8 tragende snRNPs in zytoplasmatischen
Ansammlungen gefunden wurden. Die zytoplasmatische Form spielt wahrscheinlich, wie
das decapping enzyme hDcP1/2 und die Exonuklease hXrn1, eine Rolle bei der mRNADegradierung (Ingelfinger et al., 2002).
1.2.2
Der Spleißvorgang
Zu der Wichtigkeit des snRNA-Cap beim Spleißvorgang an sich gibt es verschiedene
Ansichten und Ergebnisse (Yu et al., 1998; Ségault et al., 1995; Will et al., 1996; 1.3).
Die zum Spleißosom assemblierten U snRNPs (U1, U2, U4, U5 und U6), welche sich
zunächst in den intranukleären Granula (intranuclear granules) befinden, katalysieren das
Entfernen der nicht-kodierenden Bereiche (Introns) aus den Primärtranskripten der mRNA.
Dazu müssen sie sich in einem Prozeß, der mehrere Schritte umfaßt, zusammenlagern, um
das aktive Spleißosom zu bilden.
Einleitung
8
Abbildung 4: Spleißen von U2-Typ Introns durch das Hauptspleißosom. Assemblierung der
uridylreichen spleißosomalen Untereinheiten U1, U2, U4, U5 und U6 an ein U2-Typ Intron und Freisetzung
der mRNA, der gespleißten Introns (Lasso) und der Untereinheiten (modifiziert nach Makarov et al., 2002).
Die Assemblierung des Spleißosoms wird durch die Interaktion des U1 snRNP mit der 5´Spleißstelle und des U2 snRNP mit der Verzweigungsstelle im Intron initiiert. Dadurch
entsteht der prä-spleißosomale Komplex A (Abbildung 4) (Makarov et al. 2002). An
Komplex A bindet der zuvor assemblierte U4-U6/U5 tri-snRNP, in dem U4 und U6
Basenpaarungen eingehen. Das gereifte Spleißosom wandelt sich durch Umlagerungen der
Partikel zum aktivierten Spleißosom (Komplex B*) um, wobei U1 und U4 snRNP das
Spleißosom verlassen. Dabei bindet der U6 snRNP die 5´-Spleißstelle, und bildet
Basenpaarungen mit dem U2 snRNP aus. Daraufhin katalysiert der Komplex B* die erste
Umesterung, wobei der Komplex C entsteht. Nach dem zweiten Schneiden wird die
verknüpfte, intronlose mRNA aus dem Komplex entlassen. Das Spleißosom, welches das
geschnittene Intron in Lassoform und U2, U5, sowie U6 snRNP enthält, zerfällt. Die
snRNPs werden regeneriert, die mRNA wird ins Zytoplasma transportiert und dort durch
die Ribosomen translatiert.
Einleitung
9
1.3 Die Dimethylierung des snRNA/snoRNA-Cap
Bei den meisten snRNAs (U1, U2, U4, U5) und manchen snoRNAs (U3, snR10, snR30)
wird das während der Transkription angehängte m7G-Cap am Stickstoff N2 der
Guaninbase hypermethyliert, wobei das trimethylierte m2,2,7G-Cap entsteht (Maxwell &
Fournier, 1995; Mattaj, 1986; Plessel et al., 1994). Dies geschieht bei den snRNAs im
Zytoplasma. Das trimethylierte Cap dient dann als Importsignal, welches durch
Snurportin1 (SPN1) erkannt und durch Importin
transportiert wird (1.2.1). Es ist unklar,
welche Funktion das Cap beim Spleißvorgang an sich haben könnte. Einerseits wurde
gezeigt, daß das m2,2,7G-Cap des U2 snRNPs in vivo eine wichtige Rolle beim Spleißen hat
(Yu et al., 1998), andererseits waren U1 und U5 snRNPs ohne m2,2,7G-Cap beim Spleißen
von prä-mRNA voll funktionell (Ségault et al., 1995; Will et al., 1996). Die snoRNAs,
welche ausschließlich im Nukleus reifen, können in zwei Klassen unterteilt werden. Die
boxC/D bzw. boxH/ACA snoRNAs wirken als sogenannte guideRNAs, die an der
Erkennung von 2´O-Methylierungsstellen (boxC/D) und Pseudouridylierungsstellen
(boxH/ACA) an rRNA und manchen snRNAs beteiligt sind (Venema & Tollervey, 1999).
Manche dieser snoRNAs sind in die Prozessierung von rRNA involviert (Maxwell &
Fournier, 1995; Tollervey & Kiss, 1997). Dabei assemblieren sie mit einer Reihe von für
sie spezifischen Proteinen und bilden so die snoRNPs (Terns & Dahlberg, 1994; Terns et
al., 1995; Speckmann et al., 1999).
Neben den snRNAs und snoRNAs, wurden auch noch andere RNA-Typen gefunden,
welche in vivo mit einem m2,2,7G-Cap versehen sind. So wurde gezeigt, daß manche
mRNAs in Trypanosomen, Nematoden und Trematoden ebenfalls ein 5´-m2,2,7G-Cap
besitzen (Rajkovic et al., 1990). Dieses wird jedoch nicht an der mRNA generiert, sondern
zusammen mit einer 22 bp langen spliced leader Sequenz (slRNA), die Ähnlichkeit mit
snRNAs hat, auf das 5´-Ende der transkribierten mRNA übertragen. Dieser Vorgang wird
als trans-Spleißen bezeichnet. In diesem Spleißvorgang ist der U1 snRNP durch die mit
verschiedenen Proteinen assemblierte slRNA (slRNP) ersetzt und die anderen snRNPs U2,
U4/U6 und U5 sind vorhanden (Hannon et al., 1991). Dieser Fakt und die Ähnlichkeit von
snRNAs und slRNA führten zu der Hypothese, daß snRNAs sich aus der slRNA
entwickelt haben könnten.
Einleitung
10
In Abbildung 5 ist die Dimethylierung der zuvor einfach methylierten Guaninbase gezeigt.
Es werden zwei Methylgruppen auf den exozyklischen Stickstoff N2 übertragen, wobei SAdenosyl-L-Methionin als Methylgruppendonor fungiert.
Abbildung 5: Katalyse der Übertragung zweier Methylgruppen auf das m7G-Cap durch die snRNAm7G-Cap-spezifische Dimethyltransferase (PIMT/Tgs1). Die Methylgruppe am Stickstoff N7 ist rot, die
übertragenen Methylgruppen am Stickstoff N2 sind grün dargestellt. N7-Methylguanosin (m7G); N7-MethylN2,2-Dimethylguanosin (m2,2,7G); S-Adenosyl-L-Methionin (AdoMet); S-Adenosyl-Homocystein (SAHcy)
(vgl. Abbildung 1).
Das hypermethylierte Cap wird von Snurportin1 (SPN1) gebunden. So wird der Reimport
der assemblierten U snRNPs in den Nukleus ermöglicht. Ein weiteres Importsignal stellt
der Sm-core dar, dessen Funktion beim Import jedoch noch nicht bis ins Detail geklärt ist.
Es wurde gezeigt, daß der SMN-Komplex mit dem Sm-core und Importin
Importin
interagiert.
seinerseits kann ebenfalls mit Snurportin1 wechselwirken (Narayanan et al.,
2002). So ist ein Zusammenspiel beider Importsignale (Cap und Sm-core) über diese
Adapter wahrscheinlich (Abbildung 2).
Einleitung
11
1.4 Die snRNA-m7G-Cap-spezifischen Dimethyltransferasen
Die Hypermethylierung des snRNA-Cap wird in verschiedenen Organismen von
orthologen Proteinen durchgeführt. Die Orthologe aus Homo sapiens und Saccharomyces
cerevisiae, sowie ihre Zuordnung innerhalb der Methyltransferasen, sind im Folgenden
beschrieben.
1.4.1
Strukturelle Analyse von Methyltransferasen
S-Adenosyl-L-Methionin
(AdoMet)
ist
neben
Adenosintriphosphat
(ATP)
das
zweithäufigst verwendete Substrat für Enzyme. Methyltransferasen, die S-Adenosyl-LMethionin als Methylgruppendonor verwenden sind in Biosynthesen, Signaltransduktion,
sowie Chromatin- und Genregulation involviert. Sie können in fünf unterschiedliche
Klassen eingeteilt werden, die sich durch ihre Strukturelemente, die Art der S-Adenosyl-LMethionin-Bindung und ihre unterschiedlichen Substrate charakterisieren. Die hohe
funktionelle
Konvergenz
zeigt
die
Flexibilität
der
Katalyse
der
Methylgruppenübertragung, welche nur durch die Klasse der ATP-nutzenden Enzyme
übertroffen wird (Schubert et al., 2003). Dabei liegt die Präferenz für AdoMet als
Methylgruppendonor gegenüber zum Beispiel Methylen-Tetrahydrofolat (ThymidylatSynthase) in der energetischen Günstigkeit der Reaktion. Nachdem 1993 die erste Struktur
einer Methyltransferase (DNA C5-Cytosin Methyltransferase, M.HhaI) bestimmt worden
war, folgten über 50 andere Strukturen dieser Enzymklasse (Schubert et al., 2003). In
Abbildung 6 sind charakteristische Faltungsmotive jeder Klasse mit der Tertiärstruktur und
im Topologiediagramm gezeigt.
Einleitung
12
Abbildung 6: Tertiärstrukturen (links) und Topologiediagramme (rechts) der fünf Klassen von
Methyltransferasen. (A) Klasse I: typisches 7-Strang -Faltblatt flankiert von -Helices (
-sandwich)
(M.HhaI), (B) Klasse II: die Reaktivierungsdomäne der Methionin Synthase enthält eine Reihe langer Stränge und bindet AdoMet in einer flachen Furche auf der Domänenoberfläche (MetH), (C) Klasse III:
zweiteilige Struktur von CbiF enthält eine AdoMet-Bindestelle zwischen zwei
-Domänen, (D) Klasse IV:
Struktur von YibK (rRNA/tRNA Methyltransferase) mit knot-Struktur am C-Terminus (Magenta), an die SAdenosyl-Homocystein gebunden ist, (E) Klasse V: Histon-Methyltransferase Set7/9 mit drei kleinen Strängen, die AdoMet-Bindestelle liegt in einer flachen Furche, das katalytische Zentrum ist am C-Terminus
lokalisiert, -Helices: blau, -Stränge: grün, knot-Strukturen: Magenta, die Proteine sind im cartoon-Modus
und AdoMet bzw. SAHcy als Stab-Modell dargestellt (links), AdoMet ist im Topologiediagramm gelb
eingezeichnet, N- und C-Terminus sind beschriftet (Schubert et al., 2003)
Bei einem Vergleich der Sekundärstrukturvorhersage (4.1.2) mit dem dreidimensionalen
Modell von PIMT/Tgs1 (4.3.3) wird klar, daß es sich um ein Enzym der
Methyltransferase-Klasse I handelt (Abbildung 6A). Hinweise hierfür gibt die Bindung
von AdoMet in einer gestreckten, 2´C-Endokonformation und das siebensträngige
-
Faltblatt, welches einen zentralen topologischen Drehpunkt besitzt (Mouaikel et al.,
2003a). Durch die flankierenden -Helices entsteht ein
-sandwich. Diese Faltung weist
Einleitung
13
eine gewisse Ähnlichkeit mit dem Rossmann-fold auf, welcher für NAD bzw. NADPbindende Proteine bekannt ist. Die Nukleotidbindungsregion dieses Motivs besteht aus vier
-Helices und einem aus sechs Strängen zusammengesetzten parallelen -Faltblatt.
Es sind Methyltransferasen der Klasse I bekannt, die DNA, RNA, Proteine und kleinere
chemische Substanzen (z.B. Catechol) methylieren. Auch die Arginin-Methyltransferase
PRMT aus dem Methylosom (Abbildung 3), welche die Argininreste der Sm-Proteine B,
D1 und D3 symmetrisch dimethyliert, gehört zu dieser Klasse I von Methyltransferasen.
1.4.1.1 PRIP interacting protein with methyltransferase domain (Homo sapiens)
PIMT (PRIP interacting protein with methyltransferase domain) wurde durch die
Interaktion mit PRIP (peroxisome proliferator-activated receptor-(PPAR)-interacting
protein) in einem yeast two-hybrid screen identifiziert (Zhu et al., 2001). Es ist auf dem
Chromosom 8q11 lokalisiert, erstreckt sich über mehr als 40 kb und besteht aus 13 Exons.
Es besitzt eine 5´ untranslated region (UTR) von 165 bp und eine 3´ UTR von 743 bp.
Dabei handelt sich um ein Protein, welches RNA und S-Adenosyl-L-Methionin bindet,
eine Methyltransferase-Domäne und ein theoretisches Molekulargewicht von 96 kDa
besitzt. Es ist zu einem neu identifizierten Protein aus Drosophila melanogaster, DTL
(Drosophila Tat-like) homolog, welches durch die Fähigkeit, HIV-TAR-RNA zu binden,
identifiziert wurde (Enünlü et al., 2003; Komonyi et al., 2005).
PIMT ist durch PRIP in der Lage den Ligand-regulierten Transkriptionsfaktor PPAR
(peroxisome proliferator-activated receptor) zu aktivieren (Zhu et al., 2001). Dazu ist nur
die N-terminale Domäne des Proteins nötig. PPAR gehört zur Superfamilie der nukleären
Rezeptoren. Diese Rezeptoren sind in die Kontrolle der Genexpression, durch Interaktion
mit DNA-response-Elementen involviert. Die dadurch gesteuerten Prozesse reichen von
der frühen Entwicklung über die Zell-Proliferation, die Differenzierung und Apoptose bis
zur Homoeostase. Es wurde gezeigt, daß PIMT in vitro und in vivo zusätzlich mit den
Transkriptions-Koaktivatoren CBP, p300 und PBP interagiert (Misra et al., 2002). Das
Ausschalten des Genes durch RNA-Interferenz (RNAi) führte zu Zellen, die vornehmlich
in der G2/M-Phase des Zellzyklus arretieren (Enünlü et al., 2003).
Die Methyltransferase-Domäne von PIMT ist im C-terminalen Teil des Proteins
(Aminosäuren 652-852) lokalisiert. Es wurde gezeigt, daß der N-terminale Teil von PIMT
Einleitung
14
RNA bindet (Zhu et al., 2001). Das Methyltransferase-Motiv I (VDAFCGVGG)
beinhaltet in PIMT die Aminosäuren 693-701 und ist an der Bindung des Adenosyl-Teils
von
S-Adenosyl-L-Methionin
beteiligt.
Das
Methyltransferase-Motiv II
mit
den
Aminosäuren 755-761 hat die Sequenz KADVVFLS und Motiv III (Aminosäuren 781789) umfaßt die Sequenz SPDGFEIF. Das POST I-Motiv mit der Sequenz VIAIDID ist in
der Sequenz der Aminosäuren 714-718 zu finden (Zhu et al., 2001). Stark konservierte
Aminosäuren sind fett gedruckt. Die S-Adenosyl-L-Methionin-Bindung und die
Koordination der zu modifizierenden Basen der RNA erfolgen in der MethyltransferaseDomäne. In Abbildung 7 ist die Domänenstruktur von PIMT in der vollen Länge
dargestellt.
Abbildung 7: Domänenstruktur von PIMT. Blau: N-terminale Domäne, gelb: C-terminale
Methyltransferase-Domäne, rot: Methyltransferase-Motive I, II, III, grün: POST I Methyltransferase-Motiv,
die jeweiligen Aminosäurepositionen sind angegeben.
Das Protein bindet wahrscheinlich über Interaktionen mit den Sm-Proteinen SmB/B´ und
SmD3 aus dem Sm-core, sowie SMN an das U snRNP und vermittelt so die
Hypermethylierung des 5´-Caps (Plessel et al., 1994; Raker et al., 1996).
PIMT wurde in verschiedenen Geweben und zellulären Kompartimenten in zwei
Isoformen gefunden (Enünlü et al., 2003). So wurde in Gehirn und den Testes von Rattus
norvegicus eine 90 kDa Isoform des Proteins identifiziert, wogegen eine 55 kDa Isoform
in allen Geweben (Gehirn, Niere, Leber, Testes, Herz, Milz, Lunge) exprimiert wird. In
HeLa-Zellen wurde die 55kDa Isoform im Zytoplasma und die 90 kDa Isoform im
Nukleus lokalisiert. Dabei wird vermutet, daß es sich hierbei um alternative Spleiß-Formen
handelt. Die verkürzte Form des Proteins könnte im Zytoplasma nur die Dimethylierung
von snRNPs katalysieren, wogegen sie im Zellkern, zusätzlich zur Methylierung der
snoRNPs, die Aufgabe der Aktivierung von Transkriptions-Koaktivatoren hat.
Einleitung
15
1.4.1.2 Trimethylguanosin-Synthase1 (Saccharomyces cerevisiae)
Ein Ortholog der snRNA-m7G-Cap-spezifischen Dimethyltransferase PIMT ist die
Trimethylguanosin-Synthase1 aus S. cerevisiae. Dieses Enzym wurde durch seine
Interaktion mit dem C-Terminus von SmB in einem yeast two-hybrid screen entdeckt und
seine Fähigkeit, das snRNA-m7G-Cap zu dimethylieren, wurde nachgewiesen (Mouaikel
et al., 2002). Das Genprodukt (accession number Z73513 (NCBI)) zeigt, wie PIMT, die
konservierten Methyltransferase-Motive I, II und III, sowie POST I und ist eine von 26
putativen S-Adenosyl-L-Methionin-abhängigen Methyltransferasen in Hefe. Tgs1 fehlt der
ausgedehnte N-Terminus, der bei PIMT die Aminosäuren 1-635 umfaßt, komplett. Dieser
Teil von PIMT dient der Transkriptionsregulation (1.4.1.1). Die Identität zwischen den
Methyltransferase-Domänen aus PIMT (Aminosäuren 635-852) und Tgs1 (Aminosäuren
1-315) beträgt jedoch 38 %. Es ist daher wahrscheinlich, daß die N-terminale
Verlängerung
von
PIMT
im
Laufe
der
Evolution
mit
der
entsprechenden
Methyltransferase fusioniert ist.
Tgs1 besitzt ein theoretisches Molekulargewicht von 36,5 kDa und interagiert mit dem Cterminalen Teil von SmB (Aminosäuren 104-196) und mit SmD1. Die Bindung erfolgt
wahrscheinlich durch die basischen, C-terminalen Teile von SmB und SmD1 (Mouaikel et
al., 2002; Plessel et al., 1994).
Eine Mutante, in der das Gen für Tgs1 (Tgs1/tgs1::KAN) deletiert wurde, zeigte bei 16 °C
kein Wachstum mehr (cold-sensitive phenotype). Das Wachstum der Ascosporen bei 28 °C
in einer Tetradenanalyse wurde hingegen nicht beeinflußt. Auch die Spleißaktivität dieser
Deletionsmutante war Temperaturabhängig. Daraus kann man schließen, daß Tgs1 beim
Spleißen offensichtlich nur bei niedrigen Temperaturen (16 °C) benötigt wird und dieser
Defekt direkt das Wachstum beeinflußt (Mouaikel et al., 2002). Mit diesem Wachstumssensitiven Phänotyp bei 16 °C geht weiterhin eine Mislokalisation der U1 snRNA einher,
da diese bei 16 °C im Nukleolus gefunden wurde. Unter normalen Bedingungen (28 °C) ist
diese ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert. Das Fehlen von Tgs1 scheint also
erhebliche Auswirkungen auf die Reifung und Lokalisation der snRNAs zu haben.
Auch für snoRNAs der Klassen C/D (U3, snR4) und H/ACA (snR8, snR11, snR31, snR33,
snR35, snR42) wurde nachgewiesen, daß Tgs1 deren m7G-Caps hypermethyliert. Hierbei
interagiert die Trimethylguanosin-Synthase 1 analog den Sm-Proteinen bei snRNAs, mit
Einleitung
16
C-terminalen, basischen Regionen (KKX-repeats) von snoRNA-assoziierten Proteinen,
wie Nop58 (boxC/D) und Cbf5 (boxH/ACA).
Colau et al. wurde zeigten, daß die Deletion von Tgs1 weiterhin Effekte auf die Synthese
der kleinen Untereinheit des Ribosoms und die intakte Zellkern-Morphologie hat (Colau et
al., 2004). Die snoRNPs spielen bei der Prozessierung der prä-rRNA eine wichtige Rolle.
Durch die Beeinträchtigung der Funktion von snoRNPs könnten Störungen bei der
Ribosomensynthese erklärt werden (Colau et al., 2004). Dabei besteht die Möglichkeit,
daß Tgs1 evolutionär zur Anreicherung von RRPs (RNA-processing factors), die sehr
gehäuft in Nukleoli auftreten und an der Ribosomensynthese- und Prozessierung beteiligt
sind, beigetragen haben könnte. Durch die kurzzeitige, lockere Bindung an die basischen,
C-terminalen Bereiche, die viele RRPs zeigen, und die Akkumulation dieser, könnte die
Bildung eines Ur-Nukleolus erklärt werden (Colau et al., 2004).
1.5 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Die Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit bestand in der Etablierung der Expression und
Reinigung der snRNA-spezifischen Dimethyltransferase PIMT aus Homo sapiens.
Fragmente des Orthologs Tgs1 aus Saccharomyces cerevisiae sollten zusätzlich kloniert,
exprimiert und gereinigt werden.
Die gereinigte Methyltransferase sollte charakterisiert und kristallisiert werden. Im Zuge
der Charakterisierung standen der Nachweis der Substratbindung und weiterhin die
Entwicklung eines geeigneten, nicht-radioaktiven Tests, der es ermöglicht, die
Dimethyltransferase-Aktivität in vitro zweifelsfrei nachzuweisen, im Vordergrund.
Material und Methoden
17
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1
Feinchemikalien
Alle Feinchemikalien und organischen Substanzen werden von den Firmen AppliChem
(Darmstadt), BioRad (München), Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Mettler-Toledo
(Steinbach), MWG Biotech (München), Oxoid (Basingstoke, GB), Roth (Karlsruhe) oder
Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen und besitzen den Reinheitsgrad pro analysis. Dabei
wird in der Regel der günstigste Anbieter gewählt.
2.1.2
Geräte
AbiPrism 3100 DNA Sequencer
Applied Biosystems, Darmstadt
Agarose-Gelelektrophoresekammer
BioRad, München
Äkta Prime
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Äkta Purifier
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Binokulare
Carl Zeiss, Jena
Inkubator Mytron
Schütt, Göttingen
Fluorimeter Fluoromax III
Jobin Yvon, Grasbrunn
Fraktionssammler Frac900
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
GelDoc Geldokumentationsgerät
BioRad, München
Gelschüttler Promax 1020
Heidolph, Schwabach
Heizbad
IKA, Staufen
Heizblock Dri-Block CB-2A
Techne, Minneapolis, USA
Innova 4230 Schüttelinkubator
New Brunswick Scientific, Nürtingen
Magnetrührer IKAMAG REO
IKA, Staufen
Microfluidizer 110 S
Microfluidics, USA
Material und Methoden
18
Microtip 102 C
Branson, USA
PCR-Thermocycler
Biometra, Göttingen
Peristaltic pump P-1
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
pH-Meter
Beckman Coulter, Krefeld
Photometer
Biometra, Göttingen
Pipettierhilfe Accu-Jet
Brand, Wertheim
Röntgendiffraktometer RU-H3R
Rigaku, Japan
Rotationsschüttler
Karl Hecht, Staufen
Rotor JA-20 / JA-30.50 Ti
Beckman Coulter, Krefeld
Rotor JLA 8.1000
Beckman Coulter, Krefeld
Rotor S4180
Beckman Coulter, Krefeld
SDS-Gelelektrophoresekammer
Biometra, Göttingen
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Sonifier 250
Branson, USA
Vakuumkonzentrator 5301
Eppendorf, Hamburg
Spektralphotometer
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Auftragsschleifen (10 ml, 50 ml, 150 ml)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Taumelrollenmischer RM5
Schütt, Göttingen
Thermomixer comfort
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 5417 R
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge Micro centrifuge II
Sylvania, Ohio, USA
Ultraschallbad Sonorex Super RK 510
Bandelin, Berlin
Unitron Schüttelinkubatoren
Infors, Einsbach
Vortexer
Schütt, Göttingen
Zentrifuge Allegra 21R
Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti J-20 XPIJA-20
Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti J-30 I
Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti JA-20
Beckman Coulter, Krefeld
Material und Methoden
2.1.3
19
Chromatographiesäulen
Column PD-10
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Einweg-Leersäulen
BioRad, München
GSH-Sepharose Säule (30ml)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
HisTrap Chelating Ni-NTA-Sepharose (5ml)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
PRONTOSIL C18 4/125mm AQ
Bischoff Chromatography, Leonberg
Superdex 75 (26/60, 10/300)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
2.1.4
Kit-Systeme
Big Dye Terminator v1.1 Mix
Applied Biosystems, Darmstadt
NucleoSpin Plasmid
Macherey-Nagel, Düren
QIAquick Gelextraktionskit
QIAGEN, Hilden
QIAquick PCR Reinigungskit
QIAGEN, Hilden
QIAGEN Plasmid Mini, Maxi Kit
QIAGEN, Hilden
2.1.5
Organismen
E. coli BL21
E. coli BL21(DE3)
E. coli BL21(DE3) RIL
E. coli BL21(DE3) RP
E. coli BL21(DE3) Rosetta 2
E. coli BL21(DE3) STAR
E. coli HMS174 (DE3)
E. coli Tuner (DE3)
E. coli XL1-Blue
E. coli XL10-Gold
Stammsammlung der AG Ficner
Material und Methoden
2.1.6
20
Plasmide
pETM10-Tgs1
A. Strasser, Universität Göttingen
pETM30-Tgs1
A. Strasser, Universität Göttingen
pETM40-Tgs1
A. Strasser, Universität Göttingen
pETM10-Tgs1 (AS 1-268)
pETM30-Tgs1 (AS 1-268)
pETM40-Tgs1 (AS 1-268)
pETM10-Tgs1 (AS 57-268)
pETM30-Tgs1 (AS 57-268)
pETM40-Tgs1 (AS 57-268)
pETM10-Tgs1 (AS 57-315)
pETM30-Tgs1 (AS 57-315)
pETM40-Tgs1 (AS 57-315)
pET28a-PIMT (AS 635-852)
U. Fischer, Universität Würzburg
pGEX-6P-1-PIMT
U. Fischer, Universität Würzburg
pGEX-6P-1-PIMT (AS 635-852)
U. Fischer, Universität Würzburg
2.1.7
Enzyme und Inhibitoren
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)
New England Biolabs, Frankfurt
Elastase
Serva Electrophoresis, Heidelberg
GluC-Protease (S.aureus)
New England Biolabs, Frankfurt
Pfu-DNA-Polymerase
New England Biolabs, Frankfurt
Pfu-DNA-Polymerase Turbo
Stratagene, USA
PreScission-Protease
Universität Göttingen
Protease Inhibitor Cocktail Tabletten
Roche, Mannheim
EDTA-free
Restriktionsenzyme
Fermentas, St. Leon-Rot
(BamHI, NcoI, XhoI, KpnI)
T4-DNA-Ligase
Fermentas, St. Leon-Rot
Taq-DNA-Polymerase
Universität Göttingen
Material und Methoden
21
TEV-Protease
Universität Göttingen
Thrombin
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Trypsin
AppliChem, Darmstadt
2.1.8
Größenstandards
BR(broad range)-Protein-Standard
New England Biolabs, Frankfurt
Eigener Proteinstandard
Annette Berndt, Universität Göttingen
DNA-Standard 1kb-ladder
New England Biolabs, Frankfurt
2.1.9
DNA-Oligonukleotide
Die Berechnung der Schmelztemperaturen Tm für die verwendeten DNA-Oligonukleotide
erfolgte nach den unten angegebenen Formeln. Die Berechnung der Schmelztemperatur
der Mutagenese-Oligonukleotide (T(mut)m) ist ebenfalls dargestellt.
Die DNA-Oligonukleotide werden von 5´ nach 3´ dargestellt.
Tm = 81,5 + 0,41 [%GC]
(675/N)
T(mut)m = 81,5 + 0,41 [%GC]
(675/N) - % mismatch, für Punktmutationen
N = Anzahl der Nukleotide
MT_mut_f
IBA, Göttingen
CAGTTACACCCGAGAAGATTGCTGAACAC
MT_mut_r
IBA, Göttingen
GTGTTCAGCAATCCTCTCGGGTGTAACTG
pETM70_f
GGGAATTGTGAGCGGATAACAATT
MWG Biotech, München
Material und Methoden
pETM70_r
22
MWG Biotech, München
TCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCA
pGEX_f
MWG Biotech, München
GCTGGCAAGCCACGTTTGGT
pGEX_r
MWG Biotech, München
CGTCTCCGGGAGCTGCATGT
PIMT_622_f
Purimex, Wesel
GGAGGACTATTGTGGCAAAGTTGGC
PIMT_1198_f
Purimex, Wesel
GACAGACCACATGCCAGTGGTACTG
PIMT_2194_r
Purimex, Wesel
CTTCTGCATTATTGCGAGCAAGGGC
PIMT_BamHI_f
MWG Biotech, München
CGCGGATCCATGTGCTGCGAGAAGTGGAGCCGC
PIMT_XhoI_r
MWG Biotech, München
CCGCTCGAGTTAGGTTTCAGAGGCTGGTCTTCG
Tgs1_NcoI_f
MWG Biotech, München
CATGCCATGGGAAGGACATTTATTCATGCTTCG
Tgs1_57_f
Purimex, Wesel
CATGCCATGGATAGGCGTAGATTGTTTTCAAAG
Tgs1_268_r
Purimex, Wesel
CGCGGATCCTTATTCGTAGTTAAAAAAGCATTCCCC
Tgs1_KpnI_r
CGGGGTACCTTAACCATTTACGTCGTAAATGTC
MWG Biotech, München
Material und Methoden
23
2.1.10 Modifizierte RNA-Nukleotide
m2,2,7-G5´ppp5´A
7
KEDAR, Polen
m -G5´ppp5´A
KEDAR, Polen
m7-G5´ppp
Sigma-Aldrich, Steinheim
2.1.11 Genbanken
Human HeLa Marathon-Ready cDNA
Clontech, USA
Uni ZAP XR cDNA Libary
Stratagene, USA
2.1.12 Kristallisationsscreens
Alle aufgeführten Screens werden von Mitarbeitern der Abteilung für Molekulare
Strukturbiologie an der Universität Göttingen angesetzt.
Crystal Screen 1
Hampton Research, USA
Crystal Screen 2
Hampton Research, USA
Crystal Screen Lite
Hampton Research, USA
Crystal Screen Cryo
Hampton Research, USA
Crystal Screen PEG/Ion
Hampton Research, USA
JB Screens 1-10
Jena Bioscience, Jena
Magic Screens 1-4
Biogenova, Kanada
Footprint Screens 1-3
Stura et al., 1999
Structure Screens 1-3
Molecular Dimensions, England
Material und Methoden
24
2.1.13 Computerprogramme
Lasergene (Protean, Seqman, Megalign)
DNAStar, Madison, US
PyMol 0.97
DeLano Scientific, San Carlos, USA
SigmaPlot 8.0
SYSTAT Software, Erhrath
SWIFT II
Biochrom Ltd., England
ClustalW
EMBL-EBI, Pearson & Lipman, 1988
ESPript 2.2
Gouet et al., 1999
PSIPredict
ExPASy
Material und Methoden
25
2.2 Methoden
2.2.1
Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1 Nukleinsäurebiochemische Methoden
2.2.1.1.1
Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) dient zur
spezifischen Amplifikation von Desoxyribonukleinsäuren (DNA). Da das Enzym DNAPolymerase die Nukleinsäurekette jedoch nicht de novo synthetisieren kann, werden kurze
DNA-Oligonukleotide benötigt (20-30 Basen), die das 3´- und das 5´-Ende der zu
amplifizierenden DNA-Sequenz flankieren und zu ihr komplementär sind. Darüber hinaus
werden alle Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), die zu amplifizierende Sequenz
(Matrize) und eine hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. aus Thermus aquaticus) benötigt.
Ein Reaktionszyklus besteht aus drei Schritten:
1.
Die DNA-Doppelhelix muß zunächst durch die Erhöhung der Temperatur auf
95 °C in ihre beiden komplementären Stränge zerlegt werden (Denaturierung).
2.
Durch die Senkung der Temperatur 5 °C unter den Schmelzpunkt der DNAOligonukleotide können sich diese hochspezifisch an die zu amplifizierende DNASequenz anlagern (Hybridisierung).
3.
Die DNA-Synthese erfolgt durch Änderung der Temperatur auf das Optimum der
jeweilig verwendeten DNA-Polymerase (Elongation).
Diese drei Schritte laufen mehrmals hintereinander ab, so daß die im vorherigen Zyklus
generierten DNA-Fragmente im Folgezyklus wieder als Matrizen dienen können. Durch
diese periodische Anordnung der Schritte nimmt die Zahl der DNA-Moleküle nahezu
exponentiell zu.
Material und Methoden
26
Diese Technik ist die Grundlage zu mehreren Anwendungen. So wird sie zum Beispiel
benutzt, um ein Zielgen aus einer cDNA-Bank zu isolieren oder um nachzuweisen, daß
eine Insertion eines bestimmten Gens in einen Vektor erfolgreich war.
Im Folgenden wird ein typischer Ansatz für eine Polymerase-Kettenreaktion dargestellt:
1-50 ng
DNA (Matrize oder Zielsequenz)
1x
PCR-Puffer
10 mM
je dATP, dGTP, dCTP, dTTP
0-10 % (v/v)
DMSO
10 pmol
DNA-Oligonukleotide (Primer)
1-2 U
Pfu-Polymerase / Taq-Polymerase / Pfu-Turbo-Polymerase
ad 50 µl
H2O
Ein typisches PCR-Programm ist im Folgenden beschrieben:
1.
Denaturierung
95 °C
5 Minuten
2.
Denaturierung
95 °C
30 Sekunden
3.
Primer-Hybridisierung
x °C
30 Sekunden
4.
Elongation
y °C
1-3 Minuten
5.
Abschlußelongation
72 °C
10 Minuten
20-40 Zyklen
Die Temperatur x bei der die Hybridisierung der DNA-Oligonukleotide stattfindet, hängt
von der Schmelztemperatur derselben ab. Dabei wird die Hybridisierungstemperatur in der
Regel 5 °C unter der Schmelztemperatur der Oligonukleotide gewählt.
Die optimale Elongationstemperatur y variiert zwischen den Polymerasen. So liegt sie
für die Taq-Polymerase bei 72 °C, wogegen sie für die Pfu-Polymerase 68 °C beträgt.
Abweichungen
von
diesem
Programm
und
die
Spezifizierung
der
Hybridisierungstemperatur werden im Ergebnisteil angegeben.
2.2.1.1.2
Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Basensequenzen in DNA-Doppelhelices
und hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden. Man findet
Material und Methoden
27
diese Enzyme in Prokaryoten, wo sie dem Abbau von Fremd-DNA dienen. Dabei bleibt
die eigene DNA aufgrund von Methylierungen an spezifischen Stellen ungeschnitten.
Die Nukleasen erkennen dabei meist Sequenzen mit zweifacher Rotationssymmetrie
(Palindrome) und schneiden die Doppelhelix so, daß überhängende Enden (sticky ends)
entstehen. Diese überhängenden DNA-Enden hybridisieren leicht mit komplementären
Sequenzen. So wird das gerichtete Einsetzen der mit bestimmten Restriktionsenzymen
geschnittenen Zielsequenz in einen mit denselben Enzymen geschnittenen Vektor
ermöglicht.
Ein typischer Ansatz von 20 µl enthält:
1 µg
DNA
1x
Restriktionsenzympuffer
1U
Restriktionsendonuklease für 3 Schnittstelle
1U
Restriktionsendonuklease für 5 Schnittstelle
ad 20 µl
H2O
Der Ansatz wird für eine Stunde bei 37 °C inkubiert und zur anschließenden Inaktivierung
der Restriktionsenzyme für 5 Minuten bei 95 °C belassen. Danach werden die
geschnittenen Fragmente durch Agarosegelelektrophorese (2.2.1.1.7) analysiert und
gegebenenfalls für folgende Schritte aus dem Gel isoliert (2.2.1.1.9).
2.2.1.1.3
DNA-Dephosphorylierung am 5´-Ende
Um Rezirkularisierungen von bereits geschnittenem Vektor zu vermeiden, wird jeweils das
5´-Phosphat der überhängenden Enden entfernt. Die Religation kann ausgeschlossen
werden, da die T4-DNA-Ligase nur 5´-Phosphate mit 3´-Phosphaten verknüpfen kann. So
wird die Ligationseffizienz des gewünschten Fragmentes erheblich gesteigert.
Nach der Spaltung des Vektors mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen werden
zu dem hitzeinaktivierten Ansatz 2 U CIP (calf intestinal alkaline phosphatase) pro µg
Vektor-DNA hinzugegeben und derselbe für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Danach
erfolgt die Isolation des geschnittenen und dephosphorylierten Vektors durch
Material und Methoden
28
Agarosegelelektrophorese (2.2.1.1.7) und anschließende Elution der DNA aus dem
Agarosegel (2.2.1.1.9).
2.2.1.1.4
DNA-Ligation
DNA-Ligasen katalysieren die Bildung einer Phosphodiesterbindung benachbarter
Nukleotide. Dabei werden zwei DNA-Einzelstränge zu einem einzigen verknüpft. In der
Natur spielen sie deshalb bei der DNA-Replikation eine entscheidende Rolle.
In der Molekularbiologie werden sie benutzt, um DNA-Fragmente nach der
Hybridisierung der überhängenden Enden von Fragment und Vektor zu verknüpfen.
Sie ermöglichen auf diese Weise das Einsetzen von Zielsequenzen in ein geschnittenes
Plasmid an genau dafür vorgesehenen Stellen.
Ein typischer Ligationsansatz setzt sich wie folgt zusammen:
2U
T4-DNA-Ligase
xM
Plasmid
yM
Zielsequenz
1x
T4-DNA-Ligase-Puffer
ad 20 µl
H2O
Dabei wird das Zielgen in 4-fach molarem Überschuß in Relation zum Plasmid eingesetzt.
2.2.1.1.5
ortsgerichtete Mutagenese
Die ortsgerichtete Mutagenese dient der Sequenzkorrektur von DNA-Fragmenten, welche
zum Beispiel durch Fehler der Polymerasen entstehen können. Des Weiteren wird sie zur
gezielten Punktmutagenese eingesetzt, um einen Aminosäureaustausch zu erzielen.
Bei dieser Methode binden die DNA-Oligonukleotide, welche die gewünschte Mutation
enthalten an der zu mutierenden DNA-Sequenz in 5´ nach 3´ und 3´ nach 5´-Richtung.
Dabei wird der ganze Vektor mit der Pfu-Turbo-Polymerase amplifiziert. Diese PfuPolymerasen besitzen zusätzlich zu ihrer Polymeraseaktivität eine Aktivität die zur
Fehlerkorrektur dient (proofreading activity, 3´-5´-Exonukleaseaktivität). Die isolierten
Material und Methoden
29
Ursprungsplasmide aus den Bakterienzellen, sind aufgrund bestimmter zellulärer
Vorgänge methyliert. Diese werden mit dem Restriktionsenzym DpnI zerschnitten,
welches lediglich die methylierte DNA der Ursprungsvektoren abbaut. Die mutierten,
amplifizierten Plasmide werden in Bakterienstämmen vermehrt. Anschließend müssen die
Vektoren aus einzelnen Kolonien isoliert werden. Solche, die die gewünschte Mutation
enthalten, werden durch Sequenzierung (2.2.1.1.6) identifiziert.
Die Amplifikation wird wie unter 2.2.1.1.1 beschrieben durchgeführt, wobei der gesamte
Vektor amplifiziert wird. Es werden 5 U DpnI hinzugegeben und der Ansatz für eine
Stunde bei 37 °C inkubiert. Es folgt eine Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms für
zehn Minuten bei 95 °C und die Transformation des gesamten Ansatzes in E. coli XL1Blue.
2.2.1.1.6
DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung von DNA wird in Anlehnung an die didesoxy-Methode nach Sanger
(1977) durchgeführt. Dabei werden bei der Amplifikation der zu sequenzierenden DNA in
einer Reaktion Kettenabbrüche der Polymerase-Reaktion durch den zufälligen Einbau
eines fluoreszenzmarkierten ddNTPs (didesoxy-Ribonukleosidtriphosphat) erzeugt. Da
hier die 3´-OH-Gruppe fehlt, kommt es zum Kettenabbruch. Der Statistik folgend ist damit
jedes mögliche, auf ddNTP-endende Fragment im Ansatz enthalten. Die entsprechenden
Fragmente unterschiedlicher Länge mit den jeweils fluoreszenzmarkierten ddNTP-Enden,
werden durch lange Kapillaren getrennt und detektiert. Mit dem Seq-Mix BigDye
Terminator v1.1 von Applied Biosystems kann die komplette Reaktion in einem einzigen
Ansatz durchgeführt werden.
Für einen typischen Sequenzierungsansatz werden pipettiert:
200 ng
zu sequenzierendes Fragment (Template)
8 pmol
DNA-Oligonukleotid (Primer)
1 µl
Seq-Mix
1 µl
Seq-Puffer
ad 10 µl
H2O
Material und Methoden
30
Das Programm für Sequenzierungsreaktionen ist dem unter 2.2.1.1.1 genannten Programm
analog, wobei die optimale Temperatur für die Polymerisation bei 60 °C liegt. Die
Hybridisierungstemperatur ist abhängig von den verwendeten DNA-Oligonukleotiden und
die Elongationszeit von der Länge des zu sequenzierenden DNA-Fragmentes.
Nach der Reaktion werden die Produkte für den Sequenzierungsautomaten gereinigt, um
störende Faktoren wie DNA-Oligonukleotide, Polymerase und restliche ddNTPs zu
entfernen.
Hierzu wird dem Ansatz hinzupipettiert:
1 µl
0,125 M EDTA
1 µl
3 M Natriumacetat
50 µl
Ethanol (96 %)
Der Ansatz wird vorsichtig durchmischt, für 5 Minuten inkubiert und anschließend bei
20000 x g für 15 Minuten und bei 4 °C zentrifugiert.
Der Überstand wird abgenommen, das Pellet in 70 µl Ethanol (70 %) gewaschen und
erneut für 5 Minuten zentrifugiert.
Das Pellet wird 2 Minuten an der Luft getrocknet und schließlich in 30 µl Wasser
aufgenommen.
Die gereinigten DNA-Fragmente werden in einem Kapillarsequenzierer von Applied
Biosystems (2.1.2) analysiert.
2.2.1.1.7
Agarosegelelektrophorese
Bei der elektrophoretischen Trennung von Nukleinsäuren nutzt man aus, daß sich diese,
durch das Phosphatrückgrat negativ geladenen Moleküle in einem elektrischen Feld zum
positiv geladenen Pol bewegen. Durch ihre unterschiedliche Größe und Konformation
bewegen sie sich hierbei unterschiedlich schnell durch die gleichmäßig vernetzte Agarose.
Diese Technik wird deshalb zur präparativen Reinigung von DNA und zur Analyse der
Längen von Fragmenten durchgeführt. Es werden im Zuge dieser Arbeit ausschließlich
1 %ige Agarosegele benutzt. Die Agarose wird dazu mit TBE-Puffer versetzt und in der
Material und Methoden
31
Mikrowelle zum Kochen gebracht. Für das Gel wird eine Flachbettkammer abgedichtet
und die Agaroselösung hineingegossen. Luftblasen werden entfernt und ein Probenkamm
wird in das Gel gesteckt. Nach etwa einer halben Stunde ist das Gel erstarrt und wird in
eine mit 1x TBE gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Zum Laden der DNA-Proben
werden diese mit Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Die
elektrophoretische Trennung erfolgt bei 12 mA/cm2 Gelfläche.
Laufpuffer (TBE)
DNA-Probenpuffer (6x)
0,09 M
TrisBase
0,5 % (w/v)
Bromphenolblau
0,09 M
Borsäure
0,5 % (w/v)
Xylencyanol FF
0,01 M
EDTA pH 8,0
60 % (v/v)
Glycerin
2.2.1.1.8
Visualisierung von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid
Elektrophoretisch getrennte Nukleinsäuren können mit Ethidiumbromid im UV-Licht
sichtbar gemacht werden. Hierzu wird das Gel 15-20 Minuten im Ethidiumbromidbad
(1 µg/ml Ethidiumbromid) inkubiert, kurz im Wasserbad gewaschen und anschließend
unter UV-Licht bei 254 beziehungsweise 365 nm detektiert. Ethidiumbromid interkaliert
dabei zwischen die gestapelten Basen der DNA und fluoresziert intensiv orange. Bei
365 nm wird vor allem DNA detektiert, die noch für weitere Reaktionen zur Verfügung
stehen soll, also z. B. durch Restriktionsverdau gewonnene DNA-Fragmente. Die
energiereichere UV-Strahlung bei 254 nm kann zur Dimerisierung von Thymidinen und zu
Einzelstrangbrüchen führen.
2.2.1.1.9
DNA-Isolierung aus Agarosegelen
Diese Methode eignet sich, um DNA-Fragmente einer Länge von 70-10000 Basenpaaren
aus Agarosegelen zu isolieren. Damit kann die DNA von Enzymen und anderen
Verunreinigungen, die im weiteren Verlauf der experimentellen Prozedur stören könnten,
befreit werden. In dieser Arbeit wird dazu das QIAquick Gelextraktionskit der Firma
Qiagen benutzt. Die durch Ethidiumbromid angefärbte DNA (2.2.1.1.8) wird zunächst
möglichst knapp aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Dann wird die DNA aus der Agarose
Material und Methoden
32
herausgelöst und anschließend an eine Einweg-Säule gebunden. Dabei handelt es sich bei
diesem Kit um einen schwachen Anionenaustauscher. Nach einem Waschschritt wird sie
von der Säule eluiert. Dabei wird nach Angaben des Herstellers verfahren.
2.2.1.2 Proteinbiochemische Methoden
2.2.1.2.1
Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation
Eine einfache und schnelle Methode um Proteinlösungen zu konzentrieren ist die
Zentrifugation der Lösung in Gefäßen, welche am Boden eine Membran mit definierter
Porengröße besitzen (Konzentratoren). Unter dieser Membran ist ein weiteres Gefäß
aufgesetzt,
welches
den
Durchfluß
auffängt.
Bei
einem
ideal
kugelförmigen
Proteinmolekül korreliert die Anzahl der Aminosäuren mit dem Durchmesser in einem
definierten Verhältnis. Dadurch können sich Proteinmoleküle, welche kleiner sind als der
Durchmesser der Pore, Wasser und gelöste Ionen durch diese in das Auffanggefäß
bewegen. Das zu konzentrierende Protein wird hierbei zurückgehalten, wodurch sich seine
Konzentration stetig erhöht. Die Zentrifugationen erfolgen dabei, je nach Art und
Hersteller der Gefäße bei 3000-4500 x g bei 4 °C. Es wird jeweils die Konzentration der
Proteinlösung nach der Zentrifugation bestimmt (2.2.3.1.3).
Beim Einengen von Proteinlösungen in dieser Arbeit werden Vivaspin-Konzentratoren der
Firma Vivascience verwendet.
2.2.1.2.2
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelktrophorese von Proteinen
Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (1970) wird zur analytischen
Trennung von Proteinen benutzt. Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sufate, SDS) ist
ein Detergenz, welches aus einer aliphatischen Kette von 12 Kohlenstoffatomen besteht
und eine hydrophile Sulfatgruppe besitzt. SDS lagert sich gleichmäßig an Aminosäuren an
und entfaltet dabei das Protein. Zusätzlich werden Disulfidbrücken durch 2Mercaptoethanol, das im Probenpuffer enthalten ist, reduziert und dadurch gespalten. Es
entsteht ein SDS-Protein-Komplex mit nach außen gerichteten negativen Ladungen. Die
Material und Methoden
33
Eigenladung des Proteins ist jetzt vernachlässigbar und der entstandene Komplex besitzt
ein konstantes Masse-Ladungs-Verhältnis. Unter diesen Bedingungen sind Proteine
unabhängig von ihrer Faltung und Eigenladung in einem Molekularsieb, wie dem
Polyacrylamidgel, nach ihrem Molekulargewicht trennbar.
Das Prinzip der diskontinuierlichen Gelelektrophorese beruht auf der Fokussierung von
Proteinen durch einen Sprung des pH-Wertes von zwei übereinander geschichteten
Polyacrylamidgelen. Das untere Trenngel enthält einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,8
und einem Leition hoher Ionenbeweglichkeit. Der pH-Wert des darüber geschichteten
Sammelgels liegt deutlich tiefer bei 6,8. Das Leition des Sammelgels besitzt eine geringere
Ionenbeweglichkeit.
Der
Elektrodenpuffer
enthält
ein
Folgeion
geringer
Ionenbeweglichkeit, dessen Ladung allerdings abhängig vom pH-Wert ist.
Durch das Einschalten des Stromes bewegen sich die Leitionen des Laufpuffers mit hoher
Geschwindigkeit durch das elektrische Feld und überholen dabei die aufgetragenen
Proteine. Daraus resultiert hinter den Proteinen eine Zone geringerer Ionendichte und
erhöhter Feldstärke, aufgrund dessen die Proteine und Folgeionen beschleunigt werden.
Die Geschwindigkeit der Proteine ist dabei größer als die der Folgeionen, aber langsamer
als die der Leitionen. Es resultiert die Fokussierung der Proteine als scharfe Front an dem
Feldstärkesprung.
Beim Auftreffen auf das Trenngel ändern die Folgeionen aufgrund des erhöhten pHWertes ihre Ladung und damit ihre Ionenbeweglichkeit. Sie überholen die Proteine, die
sich dann wieder in einem Gebiet konstanter Feldstärke bewegen. Die Folge ist eine
Auftrennung der am Trenngel komprimierten Proteinfront. Das Trenngel wirkt dabei als
Molekularsieb, da die Proteine durch die weit engeren Poren des Trenngels in
Abhängigkeit ihrer Masse verlangsamt und so ihrer Größe nach getrennt werden.
Für die Vorbereitung einer SDS-PAGE werden zwei Glasplatten mit Ethanol gereinigt und
staubfrei trockengerieben. Zwei 1 mm dicke Abstandshalter werden an den Rändern
angebracht.
Die
Glasplatten
mit
den
Abstandshaltern
werden
in
eine
Elektrophoresekammer, welche am Boden eine Gummidichtung besitzt eingesetzt. Die
Schrauben, welche die Platten fixieren sollen, werden angezogen. Jetzt wird das Trenngel
zwischen die Glasplatten bis ca. 2 cm unter den oberen Rand gegossen und für die Dauer
der Polymerisation mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Polymerisieren wird das
Isopropanol abgegossen und mit Wasser nachgespült. Das Sammelgel wird in den
Material und Methoden
34
verbleibenden Raum bis zur oberen Kante gegossen und schließlich der Kamm zwischen
die Glasplatten gesteckt.
Zur Durchführung der Elektrophorese wird nun die Gelhalterung in den Tank eingesetzt
und oberes bzw. unteres Reservoir mit SDS-Laufpuffer gefüllt. Der Kamm wird vorsichtig
gezogen. Die Proteinproben werden 1:1 (v/v) mit SDS-Probenpuffer versetzt, bei 95 °C für
zwei Minuten gekocht und in die Taschen des Gels geladen. Für die Analyse von
Zellsuspensionsproben mittels SDS-PAGE werden 500 µl Kultur zentrifugiert, und mit
2x SDS-Probenpuffer versetzt. Dabei wird das Volumen an Probenpuffer nach folgender
Formel berechnet:
VProbenpuffer [µl] = OD600 × 100
Die Proben werden anschließend bei 95 °C für 2 Minuten gekocht. Für den
Größenvergleich wird ein Proteingrößenstandard mit aufgetragen. Nach dem Auftragen
auf das Gel, werden die Proteine bei einer Stromstärke von 25 mA im Sammelgel zu einer
schmalen Bande fokussiert und dann separiert.
Trenngel (10 oder 15 %)
Sammelgel (5 %)
10/15 % Acrylamid, 0,26/0,4 % Bisacrylamid
5% Acrylamid, 0,13 % Bisacrylamid
0,375 M Tris/HCl pH 8,8
0,125 M Tris/HCl pH 6,8
0,1 % (w/v) SDS
0,1 % (w/v) SDS
0,1 % (v/v) TEMED
0,1 % (v/v) TEMED
0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat
0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat
Protein-Laufpuffer
SDS-Probenpuffer (2x)
0,025 M
Tris-HCl
0,0625 M
Tris-HCl pH 6,8
0,192 M
Glycin
0,07 M
SDS
0,1 % (w/v)
SDS
50 % (v/v)
Glyzerin
0,1 % (w/v)
Bromphenolblau
5 % (v/v)
2-Mercaptoethanol
Material und Methoden
2.2.1.2.3
35
Visualisierung von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue
Elektrophoretisch getrennte Proteine können mittels einer Coomassie Brilliant Blue G
250/R250-Lösung sichtbar gemacht werden, wobei die Nachweisgrenze 0,3 µg Protein pro
Bande beträgt. Dabei wird das Gel nach der Elektrophorese für eine Stunde in einem
Färbebad geschwenkt. Das Entfärben erfolgt danach für mehrere Stunden in Wasser.
Färbelösung
10 % (v/v)
Ethanol (96 %)
5 % (v/v)
Essigsäure
0,002 % (w/v)
Coomassie G/R250
2.2.1.2.4
Perchlorsäurefällung von Proteinen
Proteine können durch Hitzedenaturierung oder Säurefällung aus Lösungen und
Reaktionsansätzen entfernt werden. Dabei wird das Protein durch den extrem sinkenden
pH-Wert nahezu vollständig protoniert. Dadurch werden sämtliche Sekundärstrukturen
zerstört, die auf Wechselwirkungen zwischen Aminosäuren, wie zum Beispiel
Wasserstoffbrückenbindungen
beruhen.
Das
Protein
aggregiert
im
entfalteten,
denaturierten Zustand vornehmlich über hydrophobe Bereiche und bildet große Komplexe,
die aus der Lösung ausfallen.
Dabei wird in dieser Arbeit die Proteinfällung durch Perchlorsäure benutzt, um einen
in vitro Methylierungsansatz von der entsprechenden Methyltransferase zu befreien.
Dazu werden 10 µl Proteinsuspension mit 1 µl 1 M Perchlorsäure (HClO4) gemischt und
für eine Minute auf Eis belassen. Nach Zugabe von 20 µl 2 M Kaliumacetat wird die Probe
für fünf Minuten bei 16000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation
ist frei von Protein und kann zur weiteren Analyse herangezogen werden.
Material und Methoden
2.2.1.2.5
36
Spaltung von Proteinen durch Proteasen
Proteasen dienen in vivo dem kontrollierten Proteinabbau in der Zelle, der Spaltung von
mit der Nahrung aufgenommenen Proteinen oder als Aktivatoren in Enzymkaskaden.
Die Spaltung von Proteinen durch Proteasen wird im Zuge dieser Arbeit zu zwei Zwecken
durchgeführt.
Zunächst dient diese Methode dazu, Affinitätssequenzen von den Zielproteinen zu
entfernen. Affinitätssequenzen werden bei der Expression an das Zielprotein angehängt,
binden an bestimmte Säulenmatrices und ermöglichen so das Abtrennen unerwünschter
bakterieller Proteine. Dabei befindet sich zwischen Zielprotein und Affinitätssequenz eine
Proteaseschnittstelle
mit
einer
definierten
Aminosäureabfolge.
Die
Spezifität,
Geschwindigkeit und optimale Temperatur der Spaltungsreaktion, sowie die Sequenz der
Proteaseschnittstelle hängen dabei von der jeweiligen Protease ab.
Im zweiten Fall wird diese Methode eingesetzt, um bereits gereinigtes Protein in kleinere,
stabile Fragmente zu zerlegen, diese erneut zu separieren und zu kristallisieren. Dabei
werden mehrere Proben nach bestimmten Zeiten genommen, um die Spaltungsreaktion
und entstandene Produkte genau verfolgen und analysieren zu können.
In dieser Arbeit werden zur Abtrennung der Affinitätssequenzen die PreScission-Protease
und die TEV-Protease (engl. tobacco etch virus) verwendet, um die Glutathion-STransferase-Affinitätssequenz vom Zielprotein zu entfernen.
Zur Erhaltung kleinerer, stabiler Fragmente der Methyltransferase-Domäne werden die
Proteasen GluC (V8), Thrombin, Trypsin und Elastase verwendet.
Das Vorgehen und das Ansetzen der Spaltungsreaktionen verlaufen für alle Proteasen nach
demselben Muster. Es werden jeweils 0,1 mg Protease pro mg Fusionsprotein zugegeben
und diese Lösung bei 4 °C auf dem Taumelrollenmischer belassen.
Nach der Behandlung mit der Protease wurde die Proteinlösung durch SDSPolyacrylamidgelelektrophorese (2.2.1.2.2) analysiert.
Material und Methoden
37
2.2.1.3 Chromatographische Methoden
Es
gibt
zahlreiche
chromatographische
Trennmethoden,
wie
z.B.
Affinitäts-,
Größenausschluß-, Ionenaustausch-, Dünnschicht- oder Gaschromatographie. Bei der
nativen Trennung von Proteinen wird meist auf Affinitäts-, Ionenaustausch- und
Ausschlußchromatographie zurückgegriffen.
Die Affinitätschromatographie beruht auf spezifischen und reversiblen Interaktionen von
Säulenmaterial und Protein. Abhängig von der Beschaffenheit des Säulenmaterials und der
Probe binden die Moleküle an die Matrix. Das Adsorbens kann von der Säule durch
kompetetive Verdrängung, Konformationswechsel durch Änderung des pH-Wertes oder
durch Änderung der Ionenstärke eluiert werden. Die Affinitätschromatographie stellt eine
sehr spezifische und selektive Trennmethode für Biomoleküle dar.
Die Ausschlußchromatographie trennt Moleküle nach ihrer Größe. Die hierbei
verwendeten Chromatographiesäulen bestehen aus einem porösen Gelmaterial (Sepharose)
mit definierter Porengröße. Das Trennverhalten basiert auf den unterschiedlichen
hydrodynamischen Volumina der Probenmoleküle. Je nach Molekülgröße, Molekülgestalt
und gewählten Säuleneigenschaften dringen die Moleküle unterschiedlich tief in die
Gelmatrix ein. Kleineren und globulären Molekülen steht dabei mehr Raum zur Verfügung
als größeren und ungeordneteren. Daher erfahren kleinere Moleküle durch das tiefere
Eindringen in die Gelmatrix eine Verzögerung und eluieren später von der Säule als
größere. Die Ausschlußchromatographie ist daher eine Methode, um Proteine nach den
ersten Reinigungsschritten von weiteren Verunreinigungen zu trennen.
Die Auflösung ist abhängig von der Fließgeschwindigkeit und dem aufgetragenen
Probenvolumen. Eine niedrige Fließgeschwindigkeit und kleine Probenvolumina erzielen
bessere Auflösungen.
2.2.1.3.1
Affinitätschromatographische Reinigung von GST-Fusionsproteinen
Die Glutathion-S-Transferase ist ein Enzym, welches in der Lage ist sein Substrat,
Glutathion ( -Glutamylcysteinylglycin), hochaffin und spezifisch zu binden. In der Natur
dient sie dazu reduziertes Glutathion auf andere Moleküle zu übertragen.
Material und Methoden
38
Das macht man sich bei dieser Methode zunutze, indem bei der Expression an das
Zielprotein, durch eine Verbindungssequenz getrennt, die Glutathion-S-Transferase
angehängt wird. Das so entstandene Fusionsprotein kann nun über eine Säule mit
Glutathion-Sepharose 4B (GSH-Sepharose) vom Rest der Proteinsuspension separiert
werden. Dabei bindet die Affinitätssequenz des Fusionsproteins an das mit der
Säulenmatrix gekoppelte Glutathion, wodurch das Fusionsprotein immobilisiert wird.
Nach einem Waschschritt wird das immobilisierte Zielprotein durch Zugabe von
reduziertem Glutathion wieder in die mobile Phase überführt und somit von der Säule
eluiert.
Die in dieser Arbeit verwendete 30 ml GSH-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech)
muß zunächst mit Wasch- und Bindepuffer äquilibriert werden. Der Überstand des
zentrifugierten Aufschlusses (100000 x g, 4 °C, 45 Minuten) wird über die Säule gegeben.
Es folgt ein Waschschritt, um alles nicht gebundene Protein zu entfernen. Die kompetetive
Verdrängung, und damit die Elution, erfolgt mit einem Elutionspuffergradienten von 0100 %, wobei das Eluat fraktioniert wird. Die Lagerung der Säule erfolgt in 20 %
Ethanol/Wasser (v/v). Alle Affinitätschromatographien von GST-Fusionsproteinen mit
GSH-Sepharose 4B werden bei 4 °C und einer angemessenen Flussrate durchgeführt.
Wasch- und Bindepuffer
Elutionspuffer
0,1 M
NaCl
0,1 M
NaCl
0,05 M
Tris-HCl pH 7,5
0,05 M
Tris-HCl pH 7,5
2 mM
DTT
2 mM
DTT
2 mM
EDTA
2 mM
EDTA
0,03 M
reduziertes Glutathion
2.2.1.3.2
Affinitätschromatographische Reinigung von Hexa-Histidin Fusionsproteinen
Proteine, die mit N- oder C-terminaler His-Sequenz exprimiert werden, lassen sich selektiv
über eine Affinitätschromatographie mittels immobilisierter Metallchelatkomplexe
reinigen (engl. immobilized metal chelating affinity chromatography, IMAC). Hierbei
bilden zwei Histidine über die freien Elektronenpaare ihrer Stickstoffatome koordinative
Bindungen zu einem immobilisierten Metallion aus. Dabei bildet sich ein Chelatkomplex,
Material und Methoden
39
der kompetetiv durch Imidazol aufgelöst werden kann. Die Metallionen (z. B. Nickel)
müssen dabei zweiwertig sein und sind meist an Nitrilotriessigsäure-Sepharose (NTA)
gebunden. Bei der IMAC dürfen die verwendeten Puffer kein EDTA enthalten, da
chelatkomplexbildende Substanzen die Kopplung der Proteine stören. Statt 2 mM DTT
wird 2 mM 2-Mercaptoethanol eingesetzt, um die Reduktion des Nickels zu vermeiden.
In dieser Arbeit werden für die Reinigung von Proteinen mit Hexa-Histidin-Sequenz die
HiTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säulen (5 ml, Amersham Pharmacia Biotech)
benutzt. Als Metallion wird Nickel eingesetzt, das über vier koordinative Bindungen an
NTA gebunden ist. NTA ist seinerseits kovalent an die Sepharose-Trägermatrix gebunden.
Die reversible Wechselwirkung von Metallion und Histidin-Sequenz am Zielprotein wird
durch einen linearen Gradienten von 0-100 % Elutionspuffer gelöst. Dabei ist das
Vorgehen dem unter 2.2.1.3.1 analog. Alle Chromatographien dieser Art werden ebenfalls
bei 4 °C und einer Flussrate von 2 ml/Minute durchgeführt.
Wasch- und Bindepuffer
Elutionspuffer
0,1 M
NaCl
0,1 M
NaCl
0,05 M
Tris-HCl pH 7,5
0,05 M
Tris-HCl pH 7,5
2 mM
2-Mercaptoethanol
2 mM
2-Mercaptoethanol
0,5 M
Imidazol
2.2.1.3.3
Ausschlußchromatographie von Proteinen
Die HiPrep 26/60 Superdex75 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) eignet sich zur
Trennung von Proteinen mit einer Molekülmasse von weniger als 75 kDa. Ihre Gelmatrix
besteht aus Allyldextran, das kovalent zu N,N -Methylenbisacrylamid verknüpft ist. Nach
Äquilibrierung der Säule mit 1,5-fachem Säulenvolumen S75-Puffer wird die Probe über
eine 5 ml-Auftragsschleife injiziert. Die Proteinprobe wird von der Säule mit Puffer eluiert
und das Eluat wird in 5 ml Fraktionen aufgefangen. Die Ausschlußchromatographie erfolgt
für alle Proteine bei 4 °C und einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute. Die Analyse
der
Fraktionen
(2.2.1.2.2).
erfolgt
anschließend
durch
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Material und Methoden
40
S75-Puffer
0,02 M
Tris-HCl pH 7,5
0,1 M
NaCl
2 mM
DTT
2.2.1.3.4
Umkehrphasenchromatographie
Die Umkehrphasenchromatographie (reversed phase chromatography) in Verbindung mit
HPLC (high performance liquid chromatography) hat sich in den letzten Jahren zu einem
Standardverfahren in der Analytik von polaren Verbindungen entwickelt. Im Gegensatz
zur Normalphasenchromatographie, bei der die stationäre Phase polar ist, ist diese bei der
Umkehrphasenchromatographie unpolar. Die Trennung erfolgt durch Wechselwirkungen
zwischen dem hydrophoben Trägermaterial der Säule und entsprechenden Bereichen der
Moleküle. Dabei werden hydrophobere Moleküle besser als weniger hydrophobe
reversibel an die Alkylketten (C18) des Säulenmaterials gebunden und immobilisiert.
Durch die Erhöhung des organischen Anteils im Elutionspuffer kommt es zur Veränderung
der Molekülwechselwirkungen mit dem Säulenmaterial bedingt durch die Verringerung
der Molekülhydrathüllen. Damit kommt es zur Desorption und zur chromatographischen
Auftrennung der entsprechenden Substanzen.
Über eine 10 µl Auftragsschleife wird die Probe auf die zuvor äquilibrierte Säule injiziert.
Die Bindung erfolgt in Laufpuffer an die C18-Alkylketten der Säule. Die Elution wird
durch
einen
Gradienten
von
0-100 %
Elutionspuffer
(organische
Komponente
ausschließlich Acetonitril) gestartet. Dabei findet der gesamte Lauf bei 20 °C statt und die
anschließende Lagerung der Säule erfolgt in 50 % Acetonitril / 50 % Wasser (v/v).
Laufpuffer
Elutionspuffer
0,1 M
0,1 M
KH2PO4 / K2HPO4 pH 6,5
50 % (v/v)
Acetonitril
KH2PO4 / K2HPO4 pH 6,5
Material und Methoden
2.2.2
41
Zellbiologische Methoden
2.2.2.1 Herstellung chemisch kompetenter Zellen
Für die Transformation von E. coli mit einem gewünschten Vektor muß der entsprechende
Bakterienstamm zuerst kompetent für die Aufnahme von Plasmid-DNA gemacht werden.
Dabei wird die Zellmembran des Bakteriums durch eine chemische Behandlung perforiert.
Durch diese poröse Membran können nun Plasmide in das Bakterium eingeschleust
werden.
Zunächst wird ein Aliquot des Stammes, der kompetent gemacht werden soll, auf einer
antibiotikafreien LB-Agar-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Eine
Kolonie wird in 5 ml LB-Medium überimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die 5 ml
Vorkultur wird 1:100 in 500 ml LB-Medium verdünnt und bei 37 °C bis zu einer OD600
von 0,6 wachsen gelassen. Die Ernte erfolgt durch Zentrifugation bei 3.000 x g für
10 Minuten und 4 °C. Das Pellet wird in 150 ml eiskaltem TFB1-Puffer resuspendiert und
fünf Minuten auf Eis belassen. Nach einer weiteren Zentrifugation bei 6.000 x g für
10 Minuten bei 4 °C wird das Pellet in 5 ml eiskaltem TFB2-Puffer vorsichtig
resuspendiert. Die kompetenten Zellen werden nun aliquotiert, in flüssigem Stickstoff
gefroren und bei -80°C gelagert.
LB-Medium
1 % (w/v)
LB-Agar-Selektionsplatten
Trypton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
1 % (w/v)
250 ml
LB-Medium
1,2 % (w/v)
Agar-Agar
NaCl
Sterilisation durch Autoklavieren
Sterilisation durch Autoklavieren
Beim Gießen von LB-Agar in Petrischalen wird das autoklavierte Gemisch zunächst
erhitzt bis sich der Agar wieder vollständig gelöst hat. Nach Abkühlen der Platten auf etwa
40 °C wird das Antibiotikum unter Rühren hinzugegeben und das noch flüssige
Agargemisch in die Petrischalen gegossen.
Material und Methoden
42
TFB1-Puffer
TFB2-Puffer
0,03 M
Kaliumacetat pH 7,0
0,01 M
NaMOPS pH 7,2
0,05 M
MnCl2
0,075 M
CaCl2
0,01 M
CaCl2
0,01 M
RbCl2
0,1 M
RbCl2
15 % (v/v)
Glyzerin
15 % (v/v)
Glyzerin
pH 5,8 mit 0,2 M Essigsäure einstellen
pH 6,5 mit 1 M NaOH einstellen
Sterilfiltrieren
Sterilfiltrieren
2.2.2.2 Transformation chemisch kompetenter Zellen
Zum
Einbringen
von
modifizierten
Vektoren
in
Bakterien-Zellen
werden
Transformationen durchgeführt. Da jedoch E. coli nicht, wie zum Beispiel Bacillus
subtilis, eine natürliche Kompetenz aufweist, müssen die Zellen mit bestimmten Puffern
chemisch kompetent gemacht werden (2.2.2.1).
Zu 50 µl kompetenten Zellen werden 20 µl Ligationsansatz oder 150 ng Plasmid-DNA
pipettiert. Der Ansatz wird gemischt und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Für die DNAAufnahme werden die Zellen bei 42 °C für 45 Sekunden einem Hitzeschock unterzogen
und anschließend zwei Minuten auf Eis belassen. Nach Zugabe von 450 µl
antibiotikafreiem LB-Medium werden die Zellen 60 Minuten bei 37 °C unter Schütteln
inkubiert. Von diesem Transformationsansatz werden 150 µl auf einer Selektions-AgarPlatte (2.2.2.1) ausgestrichen. Die Agarplatte wird bei 37 °C über Nacht im Inkubator
umgedreht zur Bildung einzelner Kolonien gelagert.
2.2.2.3 Präparation von Plasmid-DNA
Zur Amplifikation ganzer Plasmide werden während dieser Arbeit ausschließlich
Plasmidpräparationen im kleinen (Mini-Präparation) und großen (Maxi-Präparation)
Maßstab durchgeführt. Dabei werden die Vektoren in E. coli XL1-Blue-Zellen
transformiert (2.2.2.2) und diese wachsen gelassen. In einer Prozedur, welche vom
Hersteller (Qiagen) genau beschrieben ist, werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen.
Material und Methoden
43
Die Plasmid-DNA wird von der genomischen DNA und anderen Zelltrümmern, sowie
Proteinen über Einweg-Säulen befreit.
Für die Präparation im kleinen Maßstab werden 10 ml Übernacht-Kultur aufgeschlossen
und die DNA nach Herstellerangaben präpariert. Im großen Maßstab sollen hierzu 500 ml
Übernachtkultur verwendet werden.
2.2.2.4 Expression rekombinanter Proteine
Transformierte E. coli-Zellen enthalten nach der Transformation einen Vektor, der das
Zielgen, ein oder mehrere Gene für Antibiotikaresistenzen und einen eigenen
Replikationsursprung besitzt. Die Antibiotikaresistenzen auf dem eingebrachten Plasmid
ermöglichen das Wachstum der plasmidtragenden Bakterien auf einem antibiotikahaltigen
Medium, das gleichzeitig bakteriostatisch oder bakteriozid auf andere Bakterien, die das
Plasmid nicht enthalten, wirkt. So können plasmidtragende Zellen durch solche
Antibiotika positiv selektiert und Kontaminationen mit fremden Bakterien vermieden
werden. Das eingebrachte Zielgen ist bei den hier verwendeten Plasmiden so lokalisiert,
daß die Expression unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Lac-Promotors steht und
gleichzeitig das Gen im offenen Leserahmen zu liegen kommt. Das eingebrachte Plasmid
erlaubt unter diesen Bedingungen die selektive Expression des Zielgens in großen
Mengen.
2.2.2.4.1
Überexpression von rekombinantem Protein in Escherichia coli
Für eine Bakterienkultur, die zur Überexpression von rekombinanten Proteinen
herangezogen werden soll, wird zunächst eine Vorkultur angezogen. Dazu werden in
einem sterilen Glasgefäß 10 ml 4 YT- oder 2 YT-Medium mit dem entsprechenden
Antibiotikum gemischt und mit etwas Zellmaterial beimpft. Die Vorkultur wird zwei
Stunden bei 37 °C wachsen gelassen.
Für die Hauptkultur wird ein Liter 4 YT- oder 2 YT-Medium mit dem Antibiotikum
gemischt und mit der gesamten Vorkultur 1:100 angeimpft. Die Hauptkultur wird bis zu
einer optischen Dichte (OD600) von 0,5 bei 37 °C geschüttelt. Es folgt das Umsetzen der
gesamten Kultur auf 16 °C und Inkubation unter Schütteln bis zu einer OD600 von 0,8. Die
Material und Methoden
44
Expression des Zielgens wird durch Zugabe von 0,5 bis 1 mM IPTG für 14-16 Stunden bis
zu einer OD600 von etwa 2-4 gestartet.
Bei der Expression der Proteine, die im Rahmen dieser Arbeit eine Rolle spielen, wurden
zwei
Maßnahmen
zur
Vermeidung
der
Bildung
von
so
genannten
Protein-
Einschlußkörpern (inclusion bodies) getroffen.
Der Hauptkultur werden 2 % Glukose zugesetzt, um die Basisexpression des Zielgens zu
reprimieren. Da Glukose für diese Organismen weitaus effizienter zu verwerten ist, wird
diese bei gleichzeitigem Angebot von anderen Zuckern bevorzugt abgebaut. Dieser als
Diauxi bekannte Effekt bewirkt zusammen mit der Katabolitrepression die zusätzliche
Repression des Zielgens unter dem Lac-Promotor.
Die zweite Maßnahme ist die Zugabe von 2 bis 4 % Ethanol bei der Induktion, um
Hitzeschockproteine zu induzieren, welche bei der Faltung des rekombinanten Proteins
helfen.
4 YT-Medium (Superbroth)
2 YT-Medium
4 % (w/v)
Trypton
2 % (w/v)
Trypton
2 % (w/v)
Hefeextrakt
1 % (w/v)
Hefeextrakt
1 % (w/v)
NaCl
1 % (w/v)
NaCl
Sterilisation durch Autoklavieren
2.2.2.4.2
Sterilisation durch Autoklavieren
Ernte und Aufschluß einer Expressionskultur
Um rekombinante Proteine aus Bakterienzellen zu isolieren, müssen die Zellen geerntet
und aufgebrochen werden. Die Ernte erfolgt durch Zentrifugation bei 5.000 x g für
20 Minuten und bei 4 °C. Das so entstandene Bakterien-Pellet wird einmalig in kaltem
PBS (phosphate buffered saline) resuspendiert und erneut bei 4000 x g für 30 Minuten und
bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das geerntete Zellpellet entweder
gleich aufgeschlossen oder in flüssigem Stickstoff gefroren und gelagert.
Zum Aufschluß wird das Bakterien-Pellet aus einem Liter Schüttelkultur (2.2.2.4.1) in
40 ml Lysepuffer aufgetaut und resuspendiert. Um proteolytische Enzyme zu inaktivieren,
wird dem Ansatz eine halbe Tablette Protease-Inhibitor (protease inhibitor cocktail
Material und Methoden
45
complete EDTA-free) zugegeben und diese gelöst. Der Zellaufschluß im pneumatischen
Zelldesintegrator (Fluidizer) wird bei 80-90 psi in 5-7 Zyklen durchgeführt.
Nach dem Aufbruch der Zellen wird die Suspension in JA30-Zentrifugenröhrchen
überführt und bei 100000 x g für 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Trennung
des Lysates in Zelltrümmer und Überstand werden die Proben über SDSPolyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
PBS
Lysepuffer
0,14 M
NaCl
0,1 M
NaCl
0,01 M
NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,4
0,05 M
Tris-HCl pH 7,5
2 mM
DTT
2 mM
EDTA
Die weitere Verarbeitung und Trennung des Überstandes erfolgt durch die in 2.2.1.3
beschriebenen Methoden.
Material und Methoden
2.2.3
46
Spektroskopische Methoden
2.2.3.1 Absorption
Alle Absorptionsmessungen werden an einem Ultraspec2100pro Spektrophotometer in
0,5 x 1 cm2 Küvetten durchgeführt.
2.2.3.1.1
Bestimmung nativer molarer Extinktionskoeffizienten
Extinktionskoeffizienten nativer Proteine bei 280 nm (
280)
werden nach Gill und von
Hippel, ausgehend vom Lambert-Beerschen Gesetz errechnet:
A
c d
Dabei entspricht
dem molaren Extinktionskoeffizienten [M-1cm-1], c der Konzentration
[M] und d der Schichtdicke der Küvette [cm]. Der Extinktionskoeffizient eines
denaturierten Proteins (
280denat)
läßt sich von der Aminosäuresequenz ableiten (DNAstar,
Lasergene), während die Absorption bei 280 nm (A280) einer nativen und einer
denaturierten Proteinprobe gleicher Konzentration (c) in einer Küvette gleicher
Schichtdicke (d) meßbar sind. Dabei gilt:
denat
nat
Es
Anat
Adenat
werden
Proteinlösungen
einer
Konzentration
von
2,5 µM
in
20 mM
Kaliumphosphatpuffer pH 6,5 eingesetzt, wobei die denaturierte Probe zusätzlich mit 6 M
Guanidiniumhydrochlorid versetzt und für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert wird. Die
Messungen werden jeweils drei Mal und bei 20 °C durchgeführt.
Material und Methoden
2.2.3.1.2
47
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen
Die Konzentration wäßriger Nukleinsäurelösungen wird quantitativ im Photometer bei
260 nm gegen einen Leerwert bestimmt. Folgende Umrechnungswerte werden hierbei
herangezogen:
1 A 260nm
=
50 µg/ml doppelsträngige DNA
1 A 260nm
=
40 µg/ml einzelsträngige DNA
1 A 260nm
=
33 µg/ml Oligonukleotid
Die Reinheit der Nukleinsäurelösung wird über den Quotient der Extinktionen bei 260 nm
und 280 nm ermittelt.
Während die aromatischen Basen der Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum bei 260 nm
besitzen, absorbieren die aromatischen Aminosäuren der Proteine vor allem im Bereich
von 280 nm. Reine DNA liegt bei einem Quotienten von 1,8 bis 2,0 vor. Mit Proteinen
verunreinigte DNA-Lösungen besitzen einen kleineren Quotienten der Absorptionen bei
260 nm bzw. 280 nm.
2.2.3.1.3
Konzentrationsbestimmung von Protein-Lösungen
Die quantitative Bestimmung von Proteinlösungen erfolgt nach der Methode von Bearden
et al. (1978). In phosphosaurer Lösung lassen sich Proteine mit dem Farbstoff Coomassie
Brilliant Blue anfärben. Die Proteinkonzentration kann durch die Absorption bei 595 nm
photometrisch bestimmt werden, da sich das Absorptionsspektrum des Farbstoffes in
einem Bereich von OD595=0,1-0,9 proportional zur Proteinkonzentration ändert.
20 µl Proteinprobe werden mit 980 µl 1:5 in Wasser verdünnter Bradfordreagens (1 mg/ml
Coomassie Brilliant Blue G 250 in 85 %iger H3PO4) versetzt. Nach 10 Minuten wird die
Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen. Aus dem Vergleich zu einer
durch verschiedene Konzentrationen an Rinderserumalbumin erstellten Standardkurve läßt
sich die Proteinmenge der unbekannten Probe ermitteln. Bei höher konzentrierten
Proteinlösungen wird die Probe zuvor 1:2 bis 1:20 im entsprechenden Puffer verdünnt, um
den linearen Bereich dieser Funktion nicht zu verlassen.
Material und Methoden
48
2.2.3.2 Fluoreszenzspektren
Fluoreszenzmessungen werden an einem Spektrofluorimeter Fluoromax III (Jobin Yvon)
bei 20 °C in 100 mM Tris-HCl pH 7,5 in 0,5 x 1 cm2 Küvetten durchgeführt. Vor dem
Einsatz
in
die
Fluoreszenzspektroskopie
werden
die
Absorptionseigenschaften
verwendeter Proteine und Cap-Oligonukleotide getestet. Absorptionsspektren von 220350 nm werden von je 20 µM Cap-Dinukleotid und je 1 µM Protein aufgenommen.
Emissionsspektren werden nach Anregung des Fluorophors bei 295 nm (Tryptophan) mit
1 nm Bandbreite (Anregung), einer Integrationszeit von 0,5 Sekunden und einer
Schrittweite von 0,5 nm und 10 nm Bandbreite (Emission) aufgenommen. Es werden drei
Messungen pro Probe durchgeführt, um die Fehler der Mittelwerte gering zu halten. Alle
Spektren werden um den Pufferbeitrag korrigiert. Zur Korrektur der Cap-Eigenfluoreszenz
werden Spektren des Komplexes um den Fluoreszenzbeitrag des Caps korrigiert, wobei
die Änderung der Cap-Eigenfluoreszenz bei Proteinbindung hier nicht berücksichtigt wird.
Material und Methoden
2.2.4
49
Kristallographische Methoden
2.2.4.1 Kristallisation von Proteinen
Bei der Kristallisation eines Proteins wird mit der Hilfe von Salzen, Puffern und
Präzipitantien eine Proteinlösung in den übersättigten Zustand überführt. In diesem
metastabilen Zustand gibt es zwei Möglichkeiten, wie sich ein Protein verhalten kann:
1.
Es fällt aus, die Konzentration an gelöstem Protein sinkt dadurch drastisch ab.
Dieser Vorgang ist stark exergonisch, da so der höchste Grad an Entropie erreicht
werden kann.
2.
Das Protein bildet Kristallisationskeime aus, aus denen Proteinkristalle wachsen
können. Dieser Prozeß geschieht in der Regel deutlich langsamer als die
Präzipitation und ist energetisch auch nicht so günstig, da nicht die maximale
Entropie erreicht wird.
In der Kristallographie werden Bedingungen gesucht, die den zweiten Fall ermöglichen.
Dazu
werden
zu
Beginn
Kristallisationsbedingungen
initiale
für
ein
Kristallisationstests
Protein
zu
durchgeführt,
finden.
Bei
diesen
um
erste
initialen
Kristallisationsansätzen handelt es sich um eine Sammlung von empirisch ermittelten
Eingangsbedingungen, die relativ häufig zur Kristallisation verschiedener Proteine geführt
haben. Das gereinigte Protein wird dabei zu Anfang meist in einer Konzentration von
10 mg/ml eingesetzt.
Sobald Bedingungen gefunden sind, die für eine Kristallisation günstig sind, wird in einem
Raster um die Bedingungen herum optimiert. Dabei können die Konzentrationen der
enthaltenen Salze, Puffer und Präzipitantien variiert werden, es können aber auch
Substitutionen getestet werden.
Für die Kristallisation im so genannten sitzenden Tropfen werden Kristallisationsplatten
mit 24 Ansätzen verwendet, deren einzelne Kammern eine zentrale Säule mit darin
liegender Vertiefung, dem so genannten well, und ein darunter liegendes Reservoir
besitzen. In das Reservoir wird eine Bedingung vorgelegt, die dann in der zentralen
Vertiefung mit dem Protein zu einem Tropfen vermischt wird. Es besteht also ein
Material und Methoden
50
Konzentrationsgradient an Salzen und Präzipitantien zwischen Tropfen und Reservoir, da
der Tropfen neben dem Protein nur 50 % der Salz- und Präzipitans-Konzentration des
Reservoirs enthält. Durch die Dampfdiffusion des Wassers aus dem Tropfen in das
Reservoir wird das Volumen des Tropfens in der zentralen Vertiefung nun langsam
verringert und das enthaltene Protein konzentriert. Dabei wird der Punkt der Übersättigung
erreicht
und
es
kann
als
Ausweg
aus
diesem
metastabilen
Zustand
eine
Proteinkristallisationskeimung stattfinden.
Zunächst werden 500 µl der zu testenden Kristallisationsbedingung in das Reservoir
pipettiert. Aus diesem wird nun 1 µl entnommen und in die Vertiefung überführt.
Anschließend
wird
1 µl
der
Proteinlösung
hinzupipettiert
und
die
gesamte
Kristallisationsplatte mit Klarsichtklebeband verschlossen, um einem Austrocknen
vorzubeugen. Der Tropfen wird in regelmäßigen Abständen auf beginnende Kristallisation
kontrolliert. Bilder der verschiedenen Tropfen werden mit einer Digitalkamera, die auf ein
Binokular aufgesetzt wird, aufgenommen und am Computer bearbeitet.
2.2.4.2 Röntgenbeugungsexperimente
Für die Durchführung eines Röntgenbeugungsexperimentes mit einem Proteinkristall wird
dieser in einem Röntgendiffraktometer den Röntgenstrahlen ausgesetzt, die durch die
Elektronen im Kristallgitter abgelenkt werden. Im Kristallgitter läßt sich jede Struktur, die
größer als die Einheitszelle ist, durch Translation oder Addition dieser Einheitszelle
erzeugen. Dadurch entsteht eine unendliche Periodizität, weshalb gebeugte Strahlen eine
konstruktive Interferenz aufbauen und daher als an theoretischen Ebenen durch den
Kristall gebeugt betrachtet werden können. Das aus einem Röntgenbeugungsexperiment
resultierende Beugungsmuster stellt daher viele einzelne Punkte dar, die die
Raumkoordinaten der theoretischen Ebenen im reziproken Raum, genauer die
Schnittstellen dieser Ebenen mit den drei Raumachsen, wiedergeben, an denen der
Röntgenstrahl gebeugt wird. So kann aus einem Datensatz mit vielen solcher
Röntgenbeugungsmuster durch reverse Fourier-Transformation eine so genannte
Elektronendichtekarte der Einheitszelle im Kristall berechnet werden. In diese wird durch
Analysemethoden durch den Computer, oder per Hand, die Aminosäuresequenz des
Material und Methoden
51
Proteins eingebaut, so daß schließlich eine dreidimensionale Struktur des untersuchten
Proteins auf atomarer Ebene dargestellt werden kann.
Für die Durchführung eines Röntgenbeugungsexperiments wird der Proteinkristall mit
einer kleinen Nylon-Schlinge aus dem Kristallisationstropfen entnommen und auf den
Goniometerkopf des Diffraktometers gesetzt. Der Kristall wird während der Messung in
einem Stickstoffgasstrahl gekühlt. Dabei rotiert er zweidimensional um vorher definierte
Gradzahlen, um so durch die Drehung der theoretischen Ebenen des Kristalls ein
Beugungsspektrum zu erhalten. Für Testzwecke, also um zu verifizieren, ob der Kristall
aus Protein oder Salz besteht, wird oft um 5 Grad binnen einer Minute gedreht. Das
Beugungsmuster wird über einen strahlungssensitiven Schirm (Detektor) aufgenommen
und am Computer ausgewertet.
Ergebnisse
52
3 Ergebnisse
Der Ergebnisteil ist in drei Abschnitte gegliedert.
Der erste Abschnitt enthält die Ergebnisse der Expression der Methyltransferase PIMT
(PRIP-interacting
protein
with
methyltransferase
domain)
aus
Homo
sapiens
(Aminosäuren 1-852).
Im zweiten Abschnitt werden Ergebnisse, die im Zusammenhang mit der Expression, der
Reinigung und Kristallisation der Methyltransferase-Domäne von PIMT (Aminosäuren
635-852) stehen, dargestellt. In diesem Abschnitte wird auch auf den Nachweis der
Methylierungsaktivität und der Bindung von Substraten durch die MethyltransferaseDomäne eingegangen.
Im dritten Teil werden die Ergebnisse beschrieben, welche sich mit der Klonierung, der
Expression, sowie der Reinigung des orthologen PIMT aus Saccharomyces cerevisiae,
Tgs1, befassen.
3.1 Expression und Reinigung von PIMT
Zu Beginn dieser Diplomarbeit wurde von U. Fischer (Universität Würzburg) der Vektor
pGEX-6P-1-PIMT zur Verfügung gestellt, welcher die kodierende Sequenz von PIMT und
zusätzlich eine N-terminale Glutathion-S-Transferase (GST)-Affinitätssequenz enthält.
Dabei wurde die cDNA von PIMT (accession number AY028423; NCBI) über BamHIund XhoI-Schnittstellen in den entsprechend geschnittenen Vektor inseriert. Die GSTAffinitätssequenz ist durch einen Abstandshalter, welcher eine Proteaseschnittstelle
enthält, mit dem Zielprotein verbunden. Durch die Protease PreScission kann diese
Affinitätssequenz vom Rest des Zielproteins abgeschnitten werden.
Der Vektor wurde durch Transformation chemisch kompetenter E. coli XL1-Blue-Zellen
(2.2.2.2) und anschließender Maxi-Präparation (2.2.2.3) amplifiziert.
Das Amplifikat wurde einer Sequenzanalyse (2.2.1.1.6) unterzogen, um die Fehlerfreiheit
des Gens zu bestätigen. Dazu wurden die DNA-Oligonukleotide pGEX_f, PIMT_622_f,
PIMT_1198_f,
PIMT_2194_r
und
pGEX_r
verwendet
(2.1.9).
Bei
einem
Datenbankabgleich (NCBI) wurde jedoch festgestellt, daß die inserierte, kodierende
Ergebnisse
53
Sequenz sechs Fehler enthält. Dennoch wurde versucht, die fehlerhafte Sequenz zu
exprimieren.
Für die Überexpression von PIMT wurde zunächst ein geeigneter Expressionsstamm
gesucht.
Dazu
wurden
mehrere
E. coli-Stämme
(BL21 DE3,
HMS174 DE3,
BL21 DE3 RIL, BL21 DE3 RP) mit dem amplifizierten Plasmid transformiert (2.2.2.2).
Die Expression des Zielproteins erfolgte nach der Beschreibung unter 2.2.2.4.1.
Bei Proben, welche vor und nach der Induktion genommen wurden, war das Protein
mittels SDS-PAGE nicht zu lokalisieren.
Die Expressionskulturen wurden durch Zentrifugation bei 5000 x g für 20 Minuten und bei
4 °C geerntet und aufgeschlossen (2.2.2.4.2).
Der Aufschluß, der Überstand und das Pellet wurden über eine SDS-PAGE (Abbildung 8)
analysiert.
Abbildung 8: SDS-PAGE von Aufschluß (A), Überstand (Ü) und Pellet (P) der Expression von PIMT
in voller Länge in verschiedenen Expressionsstämmen. (M=Größenstandard BR, 10 %iges SDS-Gel).
Eine Bande, die PIMT in der vollen Länge mit Affinitätssequenz darstellen könnte (etwa
122 kDa) ist markiert. Bei der folgenden Reinigung des Überstandes konnte jedoch keine
Bande mehr identifiziert werden.
Ergebnisse
54
3.2 Funktionelle
Untersuchungen
und
Kristallisation
der
Methyltransferase-Domäne aus PIMT
Da sich das Zielprotein PIMT in der vollen Länge nicht exprimieren ließ, wurde versucht
ein verkürztes Fragment, welches lediglich die Methyltransferase-Domäne (Abbildung 7,
Aminosäuren 635-852) enthält, zu reinigen.
Die cDNA der Methyltransferase-Domäne von PIMT, wurde in die zwei Vektoren pET28a
und pGEX-6P-1 über BamHI und XhoI-Schnittstellen inseriert und ebenfalls von U.
Fischer (Universität Würzburg) zur Verfügung gestellt. Es entsteht so bei einer Expression
im einen Fall die Methyltransferase-Domäne mit N-terminaler GST-Affinitätssequenz
(pGEX-6P-1) und im anderen Fall das Zielprotein mit N-terminaler Hexa-HistidinAffinitätssequenz (pET28a).
Der Vektor wurde durch Transformation chemisch kompetenter E. coli XL1-Blue-Zellen
(2.2.2.2) und anschließender Maxi-Präparation (2.2.2.3) amplifiziert.
3.2.1
Überprüfung und Korrektur der Methyltransferase-Sequenz
Der Vektor wurde zur Bestätigung der Fehlerfreiheit einer Sequenzanalyse (2.2.1.1.6)
unterzogen. Dazu wurden die DNA-Oligonukleotide pGEX_f und pGEX_r für das
Konstrukt in pGEX-6P-1 und pETM70_f und pETM70_r für das pET28a-Konstrukt
benutzt (2.1.9). Es wurden nach einem Datenbankabgleich (NCBI) zwei Fehler in der
Basensequenz festgestellt. Bei einem dieser Fehler handelt es sich um eine so genannte
stille Mutation , da die eingebaute Aminosäure an dieser Stelle aufgrund der WobbleBase
dieselbe bleibt. Die andere Mutation jedoch substituiert ein Glutamat an
Position 675 zu einem Lysin. Dieser Austausch wurde durch ortsgerichtete Mutagenese
rückgängig gemacht (2.2.1.1.5). Es wurden die HPLC gereinigten Mutagenese-Primer
MT_mut_f und MT_mut_r benutzt.
Eine erneute Sequenzierung der transformierten Ansätze nach der Mutagenese bestätigte
die Korrektur des genannten Austausches. Die korrigierten Konstrukte (pET28a-MTase,
pGEX-6P-1-MTase) wurden für alle folgenden Untersuchungen an der MethyltransferaseDomäne aus PIMT verwendet.
Ergebnisse
3.2.2
55
Expression, Zellernte und Aufschluß
3.2.2.1 Expression der Methyltransferase-Domäne mit Affinitätssequenzen
Für die Expression der Methyltransferase-Domäne aus PIMT standen zwei Systeme zur
Verfügung. Es wurden zusätzlich zu den Konstrukten Informationen über den
Expressionsstamm und die Expressionsbedingungen (Temperatur, Induktionszeit) erhalten
(A. Chari, persönliche Mitteilung).
Die Expression der Zielproteine erfolgte in mit dem Vektor transformierten E. coli
BL21 DE3-Zellen
(2.2.2.4.1).
Eine
Expression
derselben
Proteine
in
anderen
Expressionsstämmen brachte keine größere Ausbeute oder bessere Löslichkeit. Die
Induktion erfolgte für 18 Stunden bei 16 °C.
Die folgende Abbildung 9 zeigt die Expression der Methyltransferase-Domäne mit GSTund Hexa-Histidin-Affinitätssequenz bei verschiedenen IPTG-Konzentrationen in der
Expressionskultur.
Abbildung 9: SDS-PAGE der Expressionstests der Methyltransferase mit GST- und Hexa-HistidinAffinitätssequenz bei verschiedenen IPTG-Konzentrationen. (0,5 bzw. 1 mM), roter Pfeil:
Methyltransferase-Domäne-Histidin, grüne Pfeile: Methyltransferase-Domäne-GST (oben) bzw. GST allein
(unten) (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).
Die Analyse über SDS-PAGE zeigte, daß sowohl die Methyltransferase-Domäne mit GSTals auch diejenige mit Hexa-Histidin-Sequenz gut exprimiert wurden. Die beobachteten
Molekulargewichte der Fusionsproteine entsprechen den theoretischen. Das Protein mit
Histidin-Sequenz wurde in geringeren Mengen produziert, als das mit GST-
Ergebnisse
56
Affinitätssequenz. Die Methyltransferase mit Hexa-Histidin-Sequenz ist mit einem roten
Pfeil markiert. Der obere grüne Pfeil markiert die Methyltransferase mit GST-Sequenz, der
untere die freie Glutathion-S-Transferase.
Die Veränderung der Konzentration an IPTG bei der Induktion der Expression von 0,5 auf
1 mM hatte keine nennenswerte Auswirkung auf die Ausbeute des Proteins.
Um die Löslichkeit der exprimierten Methyltransferase-Domäne zu testen wurden die
Kulturen geerntet und anschließend aufgeschlossen (2.2.2.4.2).
3.2.3
Reinigung der Methyltransferase-Domäne aus PIMT
3.2.3.1 Affinitätschromatographische Reinigung über Glutathion-Sepharose
Der Überstand der Zentrifugation wurde über eine 30 ml GSH-Sepharose 4B gereinigt
(2.2.1.3.1). In Abbildung 10 ist das Chromatogramm des Säulenlaufes gezeigt.
Abbildung 10: Chromatogramm des 30 ml GSH-Sepharose 4B-Säulenlaufs. Der schwarze Pfeil markiert
den Elutionsbeginn (blau: UV-Absorption 280 nm, rot: UV-Absorption 260 nm, grün: Anteil Elutionspuffer).
Das Chromatogramm zeigt die Bindung (ca. 3000 mAU) und Elution (ca. 2500 mAU) der
Methyltransferase über die GST-Affinitätssequenz. Es wurde mit einem linearen
Gradienten von 0-100 % Elutionspuffer eluiert. Dabei entspricht die blaue Funktion der
UV-Absorption bei 280 nm (Protein), die rote der UV-Absorption bei 260 nm (v.a.
Ergebnisse
57
Nukleinsäuren). Das Elutionsmaximum besitzt eine kleine Schulter im vorderen Bereich
und ist ansonsten relativ einheitlich symmetrisch.
Die Proben von Aufschluß, Überstand, Pellet und den Fraktionen der Säule wurden über
ein SDS-Gel (Abbildung 11) analysiert.
Abbildung 11: SDS-PAGE von Aufschluß (A), Überstand (Ü), Pellet (P), Fraktionen der Beladung (F)
und Elutionsfraktionen (F´). Roter Pfeil: Methyltransferase-Domäne-GST (M=Größenstandard BR,
15%iges SDS-Gel).
Die Elutionsfraktionen sind mit F´ bezeichnet und sie beginnen mit dem schwarzen Pfeil
im Chromatogramm (Abbildung 10). Die Methyltransferase-Domäne-GST besitzt ein
apparentes Molekulargewicht von etwa 50 kDa. Man kann erkennen, daß immer noch etwa
50 % des Fusionsproteins unlöslich im Pellet vorlagen. Ohne den Zusatz von Ethanol und
Glukose (3.2.2.1) waren hier etwa 70 % des Proteins im Pellet vorhanden. Dabei war aber
immer noch genug lösliches Protein im Überstand zu finden, welches nachfolgend weiter
bearbeitet werden konnte. Da die Methyltransferase in den Durchfluß-Fraktionen nicht
vorhanden war, war die Kapazität der Säule groß genug, um das gesamte Fusionsprotein
zu binden.
3.2.3.2 Affinitätschromatographische Reinigung über His-Trap-Säulen
Der Überstand der Zentrifugation wurde über eine HiTrapChelating Ni-NTA-SepharoseSäule gereinigt (2.2.1.3.1). Abbildung 12 zeigt das Chromatogramm des Säulenlaufes.
Ergebnisse
58
Abbildung 12: Chromatogramm der Beladung und Elution der HiTrapChelating Ni-NTA-SepharoseSäule. Der schwarze Pfeil markiert den Elutionsbeginn (blau: UV-Absorption 280 nm, rot: UV-Absorption
260 nm, grün: Anteil Elutionspuffer).
Es wurde nach der Beladung zunächst ein Waschschritt mit 3 % Elutionspuffer
(Endkonzentration 3 mM Imidazol) durchgeführt. Hierbei ergab sich ein erstes Maximum
mit einer Netto-Höhe von etwa 1000 mAU. Der eigentliche Elutionsbeginn mit einem
Gradienten von 3-100 % Elutionspuffer ist mit einem Pfeil gekennzeichnet und führt zu
einem Elutionsmaximum von etwa 1200 mAU mit einer leichten Schulter im hinteren
Bereich. Danach flacht die Kurve wieder ab und zeigt kein weiteres Maximum.
Die Analyse des Aufschlusses und der Fraktionen des Säulenlaufes durch SDS-PAGE sind
in Abbildung 13 dargestellt.
Abbildung 13: SDS-PAGE von Aufschluß (A), Überstand (Ü), Pellet (P) und den Fraktionen (F) des
Säulenlaufes der Expression und Reinigung der Methyltransferase-Domäne mit Hexa-HistidinSequenz. gelber Pfeil: Protein bei etwa 28 kDa, grüner Pfeil: Protein bei etwa 50 kDa, roter Pfeil: Protein bei
etwa 66 kDa (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).
Ergebnisse
59
Die Methyltransferase-Domäne ist auf dem gezeigten Gel nicht eindeutig zu identifizieren.
Ihr theoretisches Molekulargewicht beträgt 25 kDa. Auf dieser Höhe ist auf dem Gel aber
weder im Aufschluß noch in den Wasch- und Elutionsfraktionen eine eindeutige Bande zu
sehen. Dafür haben viele andere Proteine an die Nickel-Säule gebunden, wie die Elution
zeigt. Es wurden hier vor allem Proteine um 66 kDa (roter Pfeil) und etwa 50 kDa (grüner
Pfeil) eluiert. Die im Aufschluß, Überstand und Pellet vorhandene Protein-Bande bei etwa
28 kDa (gelber Pfeil) taucht in den Wasch- und Elutionsfraktionen nicht wieder auf.
Die Methyltransferase-Domäne mit Hexa-Histidin-Affinitätssequenz konnte, im Gegensatz
zu dem GST-Fusionsprotein, nicht gereinigt werden. Aus diesem Grund wurde im
Folgenden mit dem GST-Fusionsprotein weitergearbeitet.
3.2.3.3 Spaltung des Fusionsproteins durch PreScission Protease
Nach diesem ersten Schritt der Reinigung des Überstandes lag die MethyltransferaseDomäne mit der GST-Affinitätssequenz schon relativ rein in Lösung vor (Abbildung 11).
Jetzt mußte die Affinitätssequenz von dem rekombinanten Protein getrennt werden. Dazu
wurde die PreScission-Protease verwendet, welche die Aminosäureabfolge Leu-Phe-GlnGly-Pro erkennt und zwischen Glutamin (Gln) und Glycin (Gly) schneidet (2.2.1.2.5).
Zunächst wurde initial ein Probenansatz bei 20 °C durchgeführt, um das Schneiden
qualitativ und quantitativ darzustellen. Es wurden 0,1 mg Protease pro mg Fusionsprotein
zugegeben und nach verschiedenen Zeiten Proben genommen, die sofort 1:1 mit SDSProbenpuffer versetzt wurden, um die Reaktionen zu stoppen. In Abbildung 14 ist die
Analyse der Proben zu verschiedenen Zeiten durch SDS-PAGE dargestellt.
Ergebnisse
60
Abbildung 14: SDS-PAGE der Proben des geschnittenen Fusionsproteins nach verschiedenen Zeiten.
Zeitangaben in Minuten oder Stunden (h), roter Pfeil: Fusionsprotein, grüner Pfeil: GST, gelber Pfeil:
Methyltransferase-Domäne (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).
Der rote Pfeil markiert das Fusionsprotein (etwa 50 kDa), welches in die Reaktion
eingesetzt wurde. Der grüne Pfeil zeigt die gespaltene Glutathion-S-Transferase (etwa
27 kDa) und der gelbe die Methyltransferase-Domäne ohne GST. Bereits nach 15 Minuten
Inkubationszeit ist zu erkennen, daß ein Teil des Fusionsproteins geschnitten wurde. Das
Fusionsprotein wird langsam gespalten, wodurch die Stärke der Banden von GST und
Methyltransferase kontinuierlich zunehmen. Nach einem Tag Inkubation bei 20 °C ist
kaum noch Fusionsprotein zu sehen.
Das Protein präzipitierte während der Reinigung und Spaltung aus der Lösung langsam
aber kontinuierlich. Die Suspension wurde für 5 Minuten bei 16000 x g und 4 °C
zentrifugiert, um ausgefallenes Protein von solchem in der Lösung zu trennen. Die Proben
(Überstand und Pellet) wurden 1:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und über eine SDSPAGE analysiert, um zu prüfen, ob das Präzipitat tatsächlich der Methyltransferase
entspricht. Abbildung 15 zeigt die Analyse der Fraktionen.
Ergebnisse
61
Abbildung 15: SDS-PAGE von Überstand und Pellet der Zentrifugation des Ansatzes nach
PreScission-Protease Spaltung. Roter Pfeil: Fusionsprotein, grüner Pfeil: GST, gelber Pfeil:
Methyltransferase-Domäne (M=eigener Größenstandard, 15%iges SDS-Gel).
Man kann erkennen, daß ein Großteil der geschnittenen Methyltransferase, GST und
Fusionsprotein ausgefallen war.
Aus diesem Grund wurde versucht durch den Zusatz von 2 % Glukose vor der Induktion
und / oder 2 % Ethanol nach der Induktion die Löslichkeit des Proteins zu verbessern. Die
Analyse von Überstand und Pellet ist in Abbildung 16 gezeigt.
Abbildung 16: SDS-PAGE der Proben von Überstand (Ü) und Pellet (P) der Expressionskulturen mit
2 % Glukose (Gluk) und/oder 2 %Ethanol (Et). Roter Pfeil: Methyltransferase-GST (M=Größenstandard
BR, 15%iges SDS-Gel).
Diese Modifikation brachte eine Erhöhung der Löslichkeit des Proteins, was sich an
höheren Endausbeuten zeigte.
Ergebnisse
62
Im Folgenden wurde daher die Expression des GST-Fusionsproteins unter Zugabe von 2 %
Ethanol und 2 % Glukose durchgeführt. Die Reinigung und Spaltung des Fusionsproteins
erfolgten bei 4 °C.
3.2.3.4 Ausschlußchromatographische Reinigung der Methyltransferase-Domäne
Der letzte Schritt der Reinigung bestand in einer ausschlußchromatographischen
Auftrennung des Ansatzes (2.2.1.3.3). Dabei sollten alle weiteren Fremdproteine, die in
der Affinitätschromatographie mit eluierten, sowie GST und nicht gespaltenes
Fusionsprotein abgetrennt werden. Die filtrierte Probe (0,2 µm Porendurchmesser) wurde
auf die Säule injiziert und der Lauf bei einem Fluß von 1,5 ml/Minute und bei 4 °C
durchgeführt.
Ein
typisches
Chromatogramm
der
Ausschlußchromatographie
von
zuvor
affinitätschromatographisch gereinigtem und geschnittenem Fusionsprotein ist in
Abbildung 17 zu sehen.
Abbildung 17: Chromatogramm der Ausschlußchromatographie von geschnittenem Fusionsprotein
über eine Superdex 75 XK 26/60-Säule. Roter Pfeil: Ausschlußmaximum, grüner Pfeil: GST-Maximum,
blauer Pfeil: Methyltransferase-Maximum, schwarzer Pfeil: Glutathion, blau: Absorption 280 nm in mAU.
Das erste Maximum entspricht dem Ausschlußvolumen der Säule bei etwa 110 ml.
Proteine und Proteinkomplexe, die größer als etwa 120 kDa sind, werden in diesem
Ausschlußmaximum eluiert. Das zweite Maximum (grüner Pfeil) stellt das Dimer der vom
Fusionsprotein abgeschnittenen Glutathion-S-Transferase dar. Das dritte Maximum, mit
Ergebnisse
63
dem blauen Pfeil markiert, entspricht der geschnittenen Methyltransferase-Domäne aus
PIMT. Es ist zu erkennen, daß das Protein ein regelmäßiges Maximum ausbildet, welches
deutlich von allen anderen separiert ist.
Die gesammelten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und sind in Abbildung
18 dargestellt.
Abbildung 18: SDS-PAGE der Fraktionen der Superdex 75 26/60. Grüner Pfeil: GST, blauer Pfeil:
Methyltransferase-Domäne (M=Größenstandard BR, F=Fraktionen aus Abbildung 17, 15%iges SDS-Gel).
Die im SDS-Gel beschrifteten Fraktionen entsprechen den Fraktionen in Abbildung 17.
Dabei zeigt die erste Spur (F23) das Ausschlußmaximum, welches bei einem
Elutionsvolumen von etwa 110 ml auftritt. Die enthaltenen, meist mißgefalteten Proteine,
lagern sich über hydrophobe Bereiche zusammen (Komplexe) und verursachen das erste
Maximum im Chromatogramm. In der zweiten Spur (F28) ist eine Probe aufgetragen, die
ein kleines Maximum zwischen dem Ausschlußmaximum und dem Maximum des GSTDimers hervorruft. Dabei ist eine definierte Bande bei etwa 70-80 kDa zu beobachten. Die
Spur drei (F34) zeigt das bei etwa 160 ml von der Säule eluierte GST-Dimer (grüner Pfeil
in Abbildung 17 und Abbildung 18). In der fünften Spur des SDS-Geles ist eine Probe der
Fraktion 37 aufgetragen, die dem Übergang des GST-Maximums zum MethyltransferaseMaximum entspricht. Hier kann man beide Proteine nebeneinander beobachten. Spur 6
und 7 sind Proben von den Fraktionen 40 und 41, die dem Methyltransferase-Maximum
entsprechen; dabei ist gut die Reinheit des Proteins zu erkennen. Auf der letzen Spur ist
eine Probe der vereinigten Fraktionen des Methyltransferase-Maximums (blauer Pfeil) zu
sehen. Man kann hier noch die Glutathion-S-Transferase erkennen, die jedoch nur etwa 1-
Ergebnisse
64
5 % des Gesamtproteins ausmacht. Die Ausbeute lag bei 8 mg reinem Protein aus einem
Liter
Expressionskultur.
Die
Probe
ist
rein
genug
um
damit
biochemische
Charakterisierungen, wie Bindungsnachweise und Aktivitätstests durchzuführen. Des
Weiteren wurde sie benutzt, um Kristallisationsansätze zu pipettieren (3.2.6).
Zur Überprüfung der Reinheit der Methyltransferase-Domäne im Bezug auf Nukleinsäuren
und zur Bestimmung des nativen, molaren Extinktionskoeffizienten (2.2.3.1.1) wurden
UV-Absorptionsspektren
von
nativem
und
denaturiertem
Protein
über
einen
Wellenlängenbereich von 250-330 nm aufgenommen. Abbildung 19 zeigt die Spektren als
Funktion der Wellenlänge. Es wurden 5 µM Methyltransferase in S75-Puffer (nativ) bzw.
5 µM Protein in 6 M Guanidiniumhydrochlorid (denaturiert) eingesetzt. Die Proben
wurden bei 20 °C gegen einen Leerwert im genannten Bereich gemessen.
0,165
0,140
Absorption
0,115
0,090
0,065
0,040
5 µM MTase nativ
0,015
5 µM MTase de naturie rt
-0,010
250
270
290
310
330
Wellenlänge [nm]
Abbildung 19: Auftragung der Absorption gegen die Wellenlänge. 5 µM Methyltransferase in S75-Puffer
(nativ, rote Funktion) und in 6 M Guanidiniumhydrochlorid (denaturiert, blaue Funktion), (SWIFT II, Excel).
Beim Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren bzw. RNA (254 nm) ist kein Maximum in
der Auftragung zu sehen. Das gereinigte Protein ist also frei von Nukleinsäuren.
Der denaturierte, molare Extinktionskoeffizient kann aus der Aminosäuresequenz
errechnet werden. Die Berechnung der Konzentration des Proteins über diesen
Extinktionskoeffizient ist jedoch fehlerbehaftet.
Für die Methyltransferase aus PIMT wurde der native, molare Extinktionskoeffizient aus
den Werten der Funktionen aus Abbildung 19 bestimmt (2.2.3.1.1). Dies ist zur
Bestimmung der Konzentration von Proteinen über die Absorption bei 280 nm der
Ergebnisse
65
genauere Extinktionskoeffizient. Es wurden jeweils drei Messungen von denaturiertem
und nativem Protein durchgeführt. Die Standardabweichungen an den Maxima (280 nm)
betragen 2,9 % für die denaturierten Proben und 8,5 % für die nativen Proben. Nach der in
2.2.3.1.1 angegebenen Formel wurde der native Extinktionskoeffizient berechnet. Der
denaturierte, molare Extinktionskoeffizient (berechnet) beträgt 25110 M-1cm-1, im
Gegensatz zum nativen, molaren Extinktionskoeffizienten von 23889,4 M-1cm-1. Dies
entspricht einer Abweichung von etwa 4,9 %.
3.2.4
Interaktionsnachweise über Fluoreszenzspektroskopie
Um die Interaktionen der Methyltransferase-Domäne mit ihren Substraten und Produkten
zu analysieren, wurde die Fluoreszenzspektroskopie angewendet.
Dabei wurden die Proteinproben mit dem entsprechenden Substrat oder Produkt gemischt,
und der Ansatz wurde in Fluoreszenzküvetten gemessen. Die Anregung erfolgte bei
295 nm, um lediglich Tryptophane anzuregen. Die emittierte Fluoreszenz einer höheren
Wellenlänge wurde in Spektren analysiert. Durch die Bindung von Substraten an das
Protein ändern meist auch die Tryptophane, die an ihrer Bindung beteiligt sind ihre
Position und damit ihre lokale Umgebung. Da die Fluoreszenzintensität aber zu einem
großen Teil auch von ihrer lokalen Umgebung abhängig ist, ändert sich bei
Substratbindung auch die zu messende Fluoreszenzintensität. Zusätzlich kann sich das
Maximum des Spektrums verschieben.
Dabei wurden für alle Ergebnisse jeweils Dreifachmessungen durchgeführt und der
Mittelwert gegen die Wellenlänge aufgetragen.
Die Eigenfluoreszenzen von je 20 µM m7Gppp und m7GpppA wurden einzeln bestimmt,
um die Ansätze später um ihren Fluoreszenzbeitrag korrigieren zu können. Die
Eigenfluoreszenz
der
modifizierten
Wellenlänge ist in Abbildung 20 gezeigt.
RNA-Nukleotide
in
Abhängigkeit
von
der
Ergebnisse
Abbildung 20: Emissions-Fluoreszenzspektren.
(Eigenfluoreszenzen) von 20 µM Lösungen (Excel).
66
Substrate
m7GpppA
(A)
und
m7Gppp
(B)
Die Eigenfluoreszenz des Mononukleotides ist etwa doppelt so hoch wie die des
Dinukleotides. Beide Substanzen zeigen Absorptionsmaxima bei etwa 390 nm. SAdenosyl-L-Methionin als Substrat und S-Adenosyl-Homocystein als Produkt der
Reaktion wiesen keine Eigenfluoreszenzen auf und mußten demnach nicht beachtet
werden. In Abbildung 21 sind die Fluoreszenz-Spektren von 1 µM MethyltransferaseDomäne jeweils mit und ohne m7GpppA (A), m7Gppp (B), S-Adenosyl-L-Methionin
(AdoMet (C)) und S-Adenosyl-Homocystein (SAHcy (D)) zu sehen. Diese wurden bereits
um den Pufferbeitrag und den Beitrag der RNA-Nukleotide zur Fluoreszenz korrigiert.
Ergebnisse
67
Abbildung 21: Emissions-Fluoreszenzspektren der Methyltransferase-Domäne mit Substraten und
Produkten. Anregungswellenlänge = 295 nm, (A) 1 µM Methyltransferase mit und ohne 20 µM m7GpppA,
(B) 1µM Methyltransferase mit und ohne 20 µM m7Gppp, (C) 1 µM Methyltransferase mit und ohne 20 µM
S-Adenosyl-L-Methionin (AdoMet), (D) 1 µM Methyltransferase mit und ohne 20 µM S-AdenosylHomocystein (SAHcy), (Sigma Plot).
Bei allen Auftragungen in kann man eine unterschiedliche Verringerung der
Fluoreszenzintensität nach Zugabe des jeweiligen Interaktionspartners beobachten. Nach
Zugabe
des
m7GpppA-Dinukleotides
oder
S-Adenosyl-L-Methionin
nimmt
die
Fluoreszenz, um etwa 20-25 % ab. Nach der Zugabe von m7Gppp liegt die Abnahme der
Fluoreszenz bei 30 % und für S-Adenosyl-Homocystein bei fast 40 %.
Zur späteren Wertung der Ergebnisse wurde für jedes Spektrum am jeweiligen Maximum
die Standardabweichung berechnet. Die Mittelwerte, die Standardabweichungen, die
Wellenlänge
des
Maximums
und
die
prozentuale
Einzelmessungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Abweichung
(Fehler)
der
Ergebnisse
68
Tabelle 1: Darstellung der Maxima und deren Mittelwerte ( ) bzw. Standardabweichungen (STABW,
) der Spektren. (Abbildung 20 und Abbildung 21), MTase=Methyltransferase-Domäne, AdoMet=SAdenosyl-L-Methionin, SAHcy=S-Adenosyl-Homocystein, cps=counts per second, =Wellenlänge).
Maximum
[nm]
Spektrum
Mittelwert
[cps]
STABW
[cps]
STABW
[%]
20 µM m7GpppA
393
11835860
699717
5,9
20 µM m7Gppp
386
21615891
343342
1,6
1 µM MTase
352
29854225
1374439
4,6
1 µM MTase + 20 µM AdoMet
351
22274132
1365602
6,1
1 µM MTase + 20 µM SAHcy
352
18803867
1249881
6,1
1 µM MTase + 20 µM m7Gppp
367
37244605
2776927
7,4
1 µM MTase + 20 µM m7GpppA
360
29743089
1328710
4,4
Die Standardabweichungen der gemittelten Meßwerte am Absorptionsmaximum des
jeweiligen Spektrums liegen zwischen 1,6 und 7,4 %. Nach der Zugabe von 20 µM
m7Gppp und m7GpppA findet eine Verschiebung der Absorptionsmaxima von 352 auf 367
bzw. 360 nm statt.
3.2.5
Nachweis der Methylierungsaktivität
Um die Aktivität der gereinigten Methyltransferase-Domäne nachzuweisen, wurde ein
in vitro Methylierungstest entwickelt.
Es wurde die Methyltransferase mit den Substraten S-Adenosyl-L-Methionin (AdoMet,
Methylgruppendonor)
und
7-Methylguanosin-5´-Adenosintriphosphat
(m7GpppA,
Methylgruppenakzeptor) gemischt. Der Ansatz wurde in 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer für
unterschiedliche Zeiten bei 20 °C inkubiert. Nach erfolgter Proteinfällung durch
Perchlorsäure (2.2.1.2.4), um die Methyltransferase aus dem Ansatz zu entfernen, wurden
die Reaktionsprodukte über Umkehrphasenchromatographie getrennt (2.2.1.3.4). Es war
möglich, alle verwendeten Substanzen zu trennen.
Zunächst wurden die Zugehörigkeiten der Maxima zu den entsprechenden Komponenten
geklärt. Die verschiedenen HPLC-Einzelläufe sind in Abbildung 22 in einem Diagramm
übereinandergelegt.
Ergebnisse
69
Abbildung 22: Chromatogramm der übereinandergelegten HPLC-Einzelläufe. m7GpppA (blau),
m2,2,7GpppA (grau), AdoMet (rot) und SAHcy (schwarz), das Zusatzmaximum am Ende (rot) ist dem
AdoMet zugehörig, der Elutionsgradient ist in grün dargestellt, Absorption bei 260 nm in mAU (Excel).
S-Adenosyl-Methionin eluiert bei etwa 4,5 ml und zeigt eine Schulter, sowie eine weiteres
Maximum bei etwa 12,5 ml, welches durch eine Verunreinigung hervorgerufen wird. Die
Dinukleotide eluieren nacheinander bei etwa 8 und 9 ml und S-Adenosyl-Homocystein
verursacht ein Maximum bei 9,5 ml.
Anschließend wurde eine Auftrennung durchgeführt, bei der alle Substrate (7Methylguanosin-5´-Adenosintriphosphat
und
S-Adenosyl-L-Methionin),
sowie
alle
Produkte der Reaktion (S-Adenosyl-Homocystein und 2,2,7-Trimethylguanosin-5´Adenosintriphosphat) in separaten Ansätzen vorhanden waren. Dieser Ansatz wurde
gefällt um die Stabilität der Komponenten gegenüber Perchlorsäure zu zeigen. Das
Chromatogramm des Säulenlaufes ist in Abbildung 23 dargestellt.
Ergebnisse
70
Abbildung 23: Chromatogramm der Trennung von AdoMet (roter Pfeil), m7GpppA (grüner Pfeil),
m2,2,7GpppA (schwarzer Pfeil) und SAHcy (blauer Pfeil). Der Elutionsgradient ist in grün dargestellt,
Absorption bei 260 nm in mAU (Excel).
Es wurde so nachgewiesen, daß die Komponenten dieses Methylierungstests S-AdenosylL-Methionin, m7GpppA, m2,2,7GpppA und S-Adenosyl-Homocystein auch nach der
Säurefällung, durch gleichbleibende Retentionsvolumina, gut voneinander trennbar sind
und nicht beeinträchtigt werden.
Damit ist es möglich die Aktivität der Methyltransferase-Domäne, durch die Entstehung
von Produkten und den Verbrauch von Substraten, nachzuweisen.
Der Methylierungsansatz mit 360 µM m7GpppA, 22,5 µM Methyltransferase und 2,5 mM
S-Adenosyl-L-Methionin wurde gemischt und bei 20 °C inkubiert. Es wurden Proben zu
Beginn (0 Minuten), nach 60 Minuten und 120 Minuten genommen, diese durch
Perchlorsäure gefällt (2.2.1.2.4) und chromatographisch getrennt (2.2.1.3.4). Die
Chromatogramme der Läufe nach 0, 60 und 120 Minuten sind in Abbildung 24 gezeigt.
Ergebnisse
71
Abbildung 24:
Chromatogramme der Umkehrphasenchromatographie der gefällten
Methylierungsansätze. 22,5 µM Methyltransferase-Domäne, 360 µM m7GpppA und 2,5 mM S-AdenosylL-Methionin von Proben, die nach (A) 0 Minuten, (B) 60 Minuten und (C) 120 Minuten genommen wurden,
rote Pfeile: AdoMet, grüne Pfeile: m7GpppA, graue Pfeile: Übergangsprodukt, schwarze Pfeile: m2,2,7GpppA,
blaue Pfeile: SAHcy, der Elutionsgradient ist in grün dargestellt, Absorption bei 260 nm in mAU (Excel).
Ergebnisse
72
Die Menge an S-Adenosyl-L-Methionin nimmt im Lauf der Zeit ab, da es als
Methylgruppendonor fungiert. Gleichzeitig nimmt die Menge an S-Adenosyl-Homocystein
zu, da es sich hierbei um das aus S-Adenosyl-L-Methionin entstehende Reaktionsprodukt
handelt. Die Menge an m7GpppA (grüner Pfeil) reduziert sich ebenfalls, wobei die Menge
des entsprechend entstehenden Reaktionsproduktes, m2,2,7GpppA steigt. Weiterhin tritt ein
Maximum zwischen diesen beiden auf, welches auch zum Reaktionsbeginn schon
vorhanden ist.
Das gereinigte Protein ist katalytisch aktiv und somit in der Lage die zugegebenen
Substrate in die entsprechenden Produkte umzusetzen.
In Tabelle 2 sind die durch Integration berechneten Flächen unter den Maxima sowie deren
Veränderungen aufgelistet.
Tabelle 2: Zusammenfassung der Flächen unter den Maxima, der Gesamtfläche und des daraus
resultierenden Flächenanteils. (aus Abbildung 24) (FE=Flächeneinheiten, %=prozentualer Anteil jeder
Einzelfläche an der Gesamtfläche).
Komponente
VElution
[ml]
Fläche A (t=0min)
Fläche A (t=60min)
Fläche A (t=120min)
[FE]
[%]
[FE]
[%]
[FE]
[%]
AdoMet
4,25
103,5
64,3
72,6
46,3
42,1
35,1
m7GpppA
8,8
31,5
19,6
14,5
9,3
6,1
5,1
Zwischenprodukt
9,3
1,2
0,7
10,0
6,4
5,9
4,9
m2,2,7GpppA
9,7
0,3
0,2
15,0
9,6
20,8
17,3
SAHcy
10,0
6,0
3,7
27,4
17,5
30,8
25,6
Maximum 13,7 ml
13,7
18,4
11,4
17,2
10,9
14,3
11,9
Summe
-
160,9
99,9
156,7
100
120,0
99,9
Es wurden die Einzelflächen unter den Maxima durch Integration berechnet, um
quantitative Aussagen treffen zu können. Diese Flächen wurden summiert und dann
prozentual auf die Gesamtfläche bezogen. So ist eine Relativierung jeder Fläche möglich,
um den Fehler zu minimieren. Die relative Fläche unter einem Maximum ist dann direkt
proportional zu der Konzentration der Substanz die es hervorruft.
Die Fläche unter dem Maximum, welches S-Adenosyl-L-Methionin hervorruft nimmt von
64 % (0 Minuten) bis 35 % (120 Minuten) ab. Dies ist eine Gesamtabnahme von 18 % in
120 Minuten, was vereinbar mit dem Verbrauch des Methylgruppendonors ist. Die
Ergebnisse
73
deutliche Schulter im hinteren Teil des Maximums bleibt während der gesamten Zeit,
innerhalb gewisser Schwankungen, gleich. Dies stützt die Hypothese, daß diese
Unregelmäßigkeit durch das Enantiomer S-Adenosyl-D-Methionin hervorgerufen wird, da
die Methyltransferase eine hohe Substratspezifität für S-Adenosyl-L-Methionin besitzt.
Die Flächenabnahme unter dem Maximum von S-Adenosyl-L-Methionin (AdoMet) sollte
etwa
der
Flächenzunahme
des
S-Adenosyl-Homocystein-Maximums
(SAHcy)
entsprechen, da dies nach der Methylierung aus ersterem entsteht. Zu Beginn der Reaktion
sind bereits 3,7 % der Gesamtfläche dem SAHcy zuzuordnen. Dies liegt daran, daß
AdoMet unstabil ist und spontan die Methylgruppe unter Bildung von SAHcy abgeben
kann. Die Differenz der prozentualen Fläche vor der Reaktion (0 Minuten) und nach 120
Minuten beträgt 21,9 %. Wenn beachtet wird, daß dieser Abbau die ganze Inkubationszeit
fortschreitet, so ist die Relation zu der Abnahme der AdoMet-Fläche von 18 % über die
Zeit gegeben. Die Fläche des AdoMet-Maximums nimmt also in der Weise ab, wie die des
SAHcy-Maximums zunimmt.
Das Substrat m7GpppA nimmt im Lauf der Zeit (0-120 Minuten) um 14,5 % im Bezug auf
die Gesamtfläche ab. Dies entspricht dem Umsatz zum dreifach methylierten Zustand
(m2,2,7GpppA), dessen Fläche gleichsam um etwa 17 % zunimmt. Auch diese Werte
entsprechen sich in etwa, wenn Schwankungen berücksichtigt werden.
Das möglicherweise entstehende Zwischenprodukt (m2,7GpppA) schwankt im Anteil an
der Gesamtfläche über die Zeit. Dies ist ein Verhalten, das man für ein stabiles
Zwischenprodukt erwarten würde. Die Identität des Maximums ist jedoch nicht eindeutig
geklärt, lediglich das Veränderungsverhalten des Maximums über die Zeit und die Elution
zwischen mono- und trimethyliertem Nukleotid weisen auf ein solches Zwischenprodukt
hin. Eine endgültige Zuordnung könnte zum Beispiel durch Massenspektrometrie oder
Gaschromatographie erfolgen.
Ergebnisse
3.2.6
74
Kristallisation der Methyltransferase-Domäne
Im Vordergrund der vorliegenden Diplomarbeit stand der Versuch der Kristallisation von
PIMT in der vollen Länge und der Methyltransferase-Domäne aus PIMT.
Da das Protein in der vollen Länge aber nicht exprimiert werden konnte, wurden diese
Versuche
ausschließlich
mit
der
24,2 kDa
Methyltransferase-Domäne,
die
die
Aminosäuren 635-852 enthält, durchgeführt.
Es wurden 500 µl der Bedingung in das Reservoir vorgelegt. Dann wurde 1 µl der
Bedingung in die zentral liegende Vertiefung pipettiert und dies mit 1 µl der Proteinlösung
gemischt. Die Kristallisationsplatten wurden verschlossen, bei der entsprechenden
Temperatur gelagert und in regelmäßigen Abständen auf das Auftreten von Kristallen
kontrolliert. Dabei wurde die Temperatur, sowie die Konzentration des Proteins variiert.
Es wurden verschiedene Bindungspartner (S-Adenosyl-L-Methionin, m7Gppp, m7GpppA)
zugegeben, um die Methyltransferase-Domäne zu stabilisieren.
Im Einzelnen wurden pipettiert:
Tabelle 3: Darstellung aller pipettierten Bedingungen. (Verschiedene Temperaturen, Konzentrationen
und mit verschiedenen Interaktionspartnern) (Screens vgl. 2.1.12).
9mg/ml
9mg/ml
10xAdoMet
9mg/ml
10x m7Gppp
7mg/ml
6 mg/ml
5x m7GpppA
5mg/ml
CS I
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4°C
20 °C
20, 4 °C
CS II
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4 °C
20 °C
20, 4 °C
CS Lite
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4 °C
20 °C
20, 4 °C
CS Cryo
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4°C
20 °C
20, 4 °C
CS PEG/Ion
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4 °C
20 °C
20, 4 °C
JB 1-10
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4 °C
20 °C
20, 4 °C
Magic 1-4
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4°C
20 °C
20, 4 °C
Structure 1-3
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4 °C
20 °C
20, 4 °C
Footprint 1-3
4 °C
4 °C
4 °C
20, 10, 4 °C
20 °C
20, 4 °C
Die pipettierten Screens stehen in der linken, ersten Spalte. Im Tabellenkopf sind die
Konzentrationen der Methyltransferase-Domäne, sowie eventuell zugegebene Additive
Ergebnisse
75
(Interaktionspartner) angegeben. Die einzelnen Zellen der Tabelle enthalten die
Temperaturen, bei denen die Ansätze gelagert wurden.
Zunächst wurde versucht das Protein allein in den Konzentrationen 9, 7 und 5 mg/ml bei
verschiedenen Temperaturen (20, 10 und 4 °C) zu kristallisieren. Das Auftreten von
Präzipitat direkt nach dem Ansetzen der Bedingungen nahm in seiner Häufigkeit von
hohen zu niedrigen Proteinkonzentrationen und Temperaturen ab. So präzipitierte das
Protein in fast 90 % der Bedingungen bei 9 mg/ml, über etwa 80 % bei 7 mg/ml und
schließlich nur noch 50 % bei 5 mg/ml. Neben reinem Präzipitat wurden jedoch auch
mehrfach gelartige Strukturen und Zusammenlagerungen beobachtet, die auf erste
geeignete Bedingungen zur Kristallisation hinweisen könnten. Es wurden mehrfach
kristallartige
Strukturen
gefunden,
die
sich
jedoch
nach
Überprüfung
durch
röntgenkristallographische Methoden als Salzkristalle identifizieren ließen.
Um die vielleicht ungeordnete Methyltransferase-Domäne in der Lösung zu stabilisieren,
wurden
verschiedene
Interaktionspartner,
bei
verschiedenen
Temperaturen
und
Konzentrationen des Proteins zugegeben. Die Interaktion des Proteins mit diesen wurde
zuvor durch Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen (Abbildung 21). Im Einzelnen wurde
die Methyltransferase-Domäne in der Konzentration 9 mg/ml (0,37 mM) mit einem 10fachen Überschuß an S-Adenosyl-L-Methionin (3,4 mM) und einem 10-fachen Überschuß
an m7Gppp (3,5 mM) pipettiert. Das Dinukleotid m7GpppA wurde im 5-fachen Überschuß
(1,2 mM) mit der Methyltransferase (6 mg/ml, 0,24 mM) pipettiert. Es war zu erkennen,
daß die Zugabe von Interaktionspartnern zusätzlich zur Stabilität des Proteins beitrug.
Bis jetzt ergaben die in Tabelle 3 dargestellten Kristallisationsansätze keine Kristalle.
3.2.7
Generierung stabiler Fragmente der Methyltransferase
Da sämtliche Kristallisationsansätze, die pipettiert wurden, nicht zu Kristallen führten,
wurde versucht, durch Spaltung der gereinigten Methyltransferase kleinere, stabile
Fragmente zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Proteasen mit der
Methyltransferase gemischt und zu verschiedenen Zeiten Proben der Spaltung genommen
(2.2.1.2.5). Die Spaltung erfolgte bei Raumtemperatur auf dem Taumelrollenmischer. Es
wurden jeweils 10 µl Proben aus dem Ansatz entnommen und diese mit 10 µl SDSProbenpuffer versetzt. Nach Erhitzen der Proben auf 95 °C für 2 Minuten wurden diese
Ergebnisse
76
über ein 15%iges SDS-Gel analysiert. Die SDS-Gele der Spaltungen sind in Abbildung 25
dargestellt.
Abbildung 25: SDS-PAGE der Spaltung der Methyltransferase-Domäne durch verschiedene
Proteasen. (A) Spaltung durch GluC-Protease, (B) Spaltung durch Elastase, (C) Spaltung durch Thrombin,
(D) Spaltung durch Trypsin, die roten Pfeile markieren die ungeschnittene Methyltransferase-Domäne
(M=Größenstandard BR, Zeitangaben in Minuten oder Tagen (d), MT=gereinigte Methyltransferase ohne
Protease, GluC=GluC-Protease, Ela=Elastase, Thr=Thrombin, Try=Trypsin, 15%ige SDS-Gele).
Die Proteasespaltung mit GluC (V8-Protease), die in Abbildung 25A zu sehen ist
generierte etwa sechs verkürzte Fragmente. Das Auffälligste tritt schon nach 10 Minuten
bei etwa 22 kDa auf und scheint stabil zu sein. Dies ist deshalb ein Fragment, das zur
Reinigung und Kristallisation herangezogen werden könnte. Die Fragmente, die hier
ebenfalls entstehen und bei etwa 21, 16, 14 und 5 kDa liegen, kommen nicht in Betracht,
da sie in zu kleinen Mengen vorliegen.
Ergebnisse
77
In Abbildung 25B ist die Spaltung durch die Elastase gezeigt. Hier entsteht ein etwa
23 kDa großes Fragment, welches allerdings erst relativ spät und in geringen Mengen
auftaucht (60-90 Minuten). Weitere Fragmente liegen hier bei etwa 12 und 7 kDa.
Die Proteasespaltung durch Thrombin (Abbildung 25C), zeigte keine erkennbaren,
verkürzten Fragmente. Die Methyltransferase-Domäne blieb hier über die gesamte Zeit
ungeschnitten.
In Abbildung 25D ist die Spaltung durch Trypsin dargestellt. Bereits nach 10 Minuten
(erste Probe) wurde fast die gesamte Methyltransferase in zwei kleinere Fragmente
gespalten. Diese liegen mit etwa 23 und 22 kDa sehr nahe beieinander. Die resultierenden
kleinen Fragmente aus dieser Spaltung (1 und 2 kDa) sind aufgrund ihrer Größe nicht zu
sehen. Im Laufe der Zeit verlagert sich das anfängliche Gleichgewicht dieser beiden
Fragmente immer weiter zugunsten des kleineren 22 kDa Fragmentes. Auch dies könnte
ein Fragment zur weiteren Reinigung und Kristallisation darstellen.
Als Kontrollen sind hier jeweils die Proteasen allein ohne Methyltransferase-Domäne
(GluC, Ela, Thr, Try) und die Methyltransferase-Domäne allein ohne die Protease (MT)
gezeigt. Dabei gibt es keine Interferenzen der entstehenden Fragmente mit den Proteasen.
Ergebnisse
78
3.3 Expression und Reinigung der orthologen Methyltransferase Tgs1 aus
Saccharomyces cerevisiae
Bei Problemen der Expression, Reinigung oder Kristallisation von Proteinen werden
häufig orthologe Proteine aus anderen Organismen herangezogen, um diese zu reinigen
und zu kristallisieren.
Da die Methyltransferase-Domäne aus PIMT nicht zu Kristallen führte, wurde versucht
das Ortholog des Proteins aus Saccharomyces cerevisiae, die TrimethylguanosinSynthase1 (Tgs1), zu exprimieren und zu reinigen.
3.3.1
Sequenzvergleich von Tgs1 und PIMT
Die Trimethylguanosin-Synthase1 aus Saccharomyces cerevisiae zeigt eine große
Ähnlichkeit zu der C-terminalen Methyltransferase-Domäne (Aminosäuren 635-852) aus
PIMT. Dabei fehlt Tgs1 der gesamte N-terminale Bereich, der bei PIMT die Aminosäuren
1-635
umfaßt.
Dieser
erfüllt
in
Homo
sapiens
Aufgaben
wie
z.B.
die
Transkriptionsregulation und die Bindung von RNA. In Abbildung 26 ist ein
Sequenzvergleich von PIMT und Tgs1 gezeigt. Dabei wird die Ähnlichkeit der Proteine in
diesem
Bereich
ersichtlich.
Besonders
auffallend
ist
die
Methyltransferase-Motive I, II und III, sowie des Motivs POST I.
Konservierung
der
Ergebnisse
79
Abbildung 26: Sequenzvergleich der Trimethylguanosin-Synthase1 aus Saccharomyces cerevisiae und
PIMT aus Homo sapiens. MT-Motiv=Methyltransferase-Motiv, Aminosäuren am Anfang und Ende jeder
Zeile sind numeriert, gleiche Aminosäuren sind zusätzlich zwischen den Zeilen angegeben, ähnliche
Aminosäuren sind mit einem + zwischen den Sequenzen markiert.
Der C-Terminus von Tgs1 weist im Vergleich zu PIMT 50 zusätzliche Aminosäuren auf.
Die Sequenzidentität der C-terminalen Methyltransferase-Domäne aus PIMT (Aminosäure
635-852) und Tgs1 (Aminosäure 1-315) beträgt 35 %.
3.3.2
Klonierung verkürzter Tgs1-Fragmente
Tgs1 bereitete in der vollen Länge (Aminosäuren 1-315) mit verschiedenen
Affinitätssequenzen
(Hexa-Histidin,
Glutathion-S-Transferase,
Maltose-Bindeprotein
(MBP)) Schwierigkeiten bei der Expression und der Reinigung (A. Strasser, persönliche
Mitteilung). Die Konstrukte (pETM10, 30, 40), die Tgs1 enthalten, wurden von A. Strasser
(Universität Göttingen) zur Verfügung gestellt. Es wurden kleinere Fragmente des Proteins
in verschiedene Vektoren kloniert.
Dazu wurden diese verkürzten Fragmente aus dem Konstrukt pETM30-Tgs1 volle Länge
durch die Polymerase-Kettenreaktion (2.2.1.1.1) isoliert. Es wurden die DNAOligonukleotide Tgs1_NcoI_f, Tgs1_57_f, Tgs1_268_r und Tgs1_KpnI_r (2.1.9) benutzt.
Die Hybridisierungstemperatur lag bei 63 °C und die Elongationstemperatur bei 68 °C
(Pfu-Polymerase). Es wurden zur Isolierung der Fragmente Reaktionen mit 1 bzw. 5 %
Ergebnisse
80
DMSO angesetzt. Die Analyse der Polymerase-Kettenreaktion durch ein Agarosegel ist in
Abbildung 27 dargestellt.
Abbildung 27: Agarosegel der Isolierung von Tgs1 Fragmenten. Mit 1 % und 5 % DMSO aus dem
pETM30-Tgs1 (volle Länge)-Konstrukt (M=Größenstandard 1kb-ladder, 1%iges Agarosegel).
Pro Spur ist jeweils nur ein Fragment zu sehen. Die theoretischen Längen betragen für
Spur eins und zwei (Tgs1 1-268) 804 Basenpaare, für Spur drei und vier (Tgs1 57-268)
633 Basenpaare und für Tgs1 57-315 (Spur fünf und sechs) 783 Basenpaare. Diese
theoretischen Längen entsprechen denen, die im Agarosegel beobachtet werden können.
Die Fragmente wurden nach der PCR aus dem Gel ausgeschnitten, eluiert (2.2.1.1.9) und
in den zuvor mit denselben Enzymen geschnittenen Zielvektor pETM30 ligiert (2.2.1.1.9).
Die ligierten Konstrukte wurden in E. coli XL1-Blue transformiert (2.2.2.2), durch MiniPräparationen amplifiziert und aus den Zellen isoliert (2.2.2.3).
Die amplifizierten und isolierten Plasmide wurden einer Kontrollrestriktion durch die
Restriktionsendonukleasen NcoI und KpnI unterzogen, um die erfolgte Ligation und die
Längen der ligierten Fragmente zu verifizieren. Das Agarosegel der Restriktion ist in
Abbildung 28 zu sehen.
Ergebnisse
81
Abbildung 28: Klonierung der Tgs1-Fragmente. Agarosegel der Kontrollrestriktion der in pETM30
ligierten Fragmente von Tgs1 (A) und als Kontrollen isolierte Fragmente (B), roter Pfeil: geschnittener
Vektor pETM30, gelbe Pfeile: geschnittene Fragmente (M=Größenstandard 1kb-ladder, 1%iges Agarosegel).
Die Kontrollrestriktion zeigte, daß die Insertion der Fragmente in den Vektor erfolgreich
war. Die Längen der Fragmente, die aus den Vektoren ausgeschnitten wurden (Abbildung
28A) entsprechen denen, die im Kontrollgel erhalten wurden (Abbildung 28B).
Es wurde eine Sequenzierung aller Fragmente mit den entsprechenden DNAOligonukleotiden durchgeführt (2.2.1.1.6), die die Richtigkeit der Sequenzen bestätigte.
Die Vektorkonstrukte Tgs1 1-268 in pETM30, Tgs1 57-268 in pETM30 und Tgs1 57-315
in pETM30 wurden für die Expression in E. coli HMS174 DE3 transformiert. Die Wahl
dieses Stammes erfolgte aufgrund von Erfahrungen bei der Expression von Tgs1 in der
vollen Länge (A. Strasser, persönliche Mitteilung).
3.3.3
Expression, Zellernte und Aufschluß
Die Expression der verkürzten Fragmente erfolgte in E. coli HMS174 DE3, wie in
2.2.2.4.1 beschrieben. Es wurden 500 ml Kulturen angesetzt und die Expression erfolgte
bei 16 °C. Dabei wurden jeweils Proben vor und nach der Induktion durch 1 mM IPTG
genommen.
Die Ernte und der Aufschluß erfolgten wie unter 2.2.2.4.2 beschrieben durch pneumatische
Zelldesintegration im Fluidizer. Es wurden Proben vom Lysat (Aufschluß), sowie vom
Überstand und vom Pellet der Zentrifugation (100000 x g, 45 Minuten, 4 °C) genommen.
Ergebnisse
82
Die Analyse der Expression und des Aufschlusses der Kulturen durch SDS-PAGE ist in
Abbildung 29 gezeigt.
Abbildung 29: SDS-PAGE von Expression und Aufschluß der 500 ml Kulturen der drei Tgs1Fragmente in E. coli HMS174 DE3. Roter Pfeil: Tgs1 1-268-GST, grüner Pfeil: Tgs1 57-268-GST, blauer
Pfeil: Tgs1 57-315-GST (M=Größenstandard BR, v.I.=vor Induktion, n.I.=nach Induktion, A=Aufschluss,
Ü=Überstand, P=Pellet, 15 %iges SDS-Gel).
Alle Tgs1-Fragmente wurden gut exprimiert. Es sind nach der Induktion (n.I.) deutliche,
zusätzliche Protein-Banden bei etwa 57 kDa (Tgs1 1-268, Spur 2), 51 kDa (Tgs1 57-268,
Spur 8) und 56 kDa (Tgs1 57-315, Spur 12) zu sehen. Die Löslichkeit war bei Tgs1 1-268,
sowie Tgs1 57-315 moderat (etwa die Hälfte des Proteins löslich) und bei Tgs1 57-268
eher schlecht (etwa ein Achtel des Proteins löslich).
3.3.4
Reinigung der Tgs1-Fragmente
3.3.4.1 Affinitätschromatographische Reinigung über Glutathion-Sepharose
Zur Reinigung der Fragmente von Tgs1 wurden die Überstände der Zentrifugation (3.3.3)
affinitätschromatographisch über Glutathion-Sepharose gereinigt (2.2.1.3.1). Die Analyse
der Reinigung durch SDS-PAGE ist in Abbildung 30 gezeigt.
Ergebnisse
83
Abbildung 30: SDS-PAGE der affinitätschromatographischen Reinigung und der TEVProteasespaltung der Tgs1 Fragmente. Rote Pfeile: GST-Fusionsproteine, grüne Pfeile: GST, gelbe Pfeile:
Tgs1-Fragmente ohne GST (M=Größenstandard BR, D=Durchfluss, E=Eluat, TEV=Spaltung durch TEVProtease, 15 %ige SDS-Gele).
Die SDS-PAGE zeigt die Bindung und Elution aller drei Tgs1-Fragmente bezüglich der
GSH-Sepharose (rote Pfeile). Neben den Zielproteinen sind auch noch andere Proteine von
der Säule eluiert worden. Es bedarf daher weiterer Reinigungsschritte, um die für die
Kristallisation und biochemische Charakterisierung nötige Reinheit, zu erhalten.
3.3.4.2 Spaltung des Fusionsproteins durch TEV-Protease
Um die GST-Affinitätssequenz vom Rest der Proteine zu entfernen, wurde das Eluat durch
die TEV-Protease gespalten (2.2.1.2.5). Die Fraktionen der Elution wurden vereinigt und
mit der TEV-Protease gemischt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C auf dem
Taumelrollenmischer. Die Ansätze wurden über SDS-PAGE (Abbildung 30, Spuren
TEV ) analysiert. Die Spaltungseffizienz ist bei allen Fragmenten relativ schlecht, was
auch schon für Tgs1 in der vollen Länge berichtet wurde (A. Strasser, persönliche
Mitteilung). Das geschnittene Tgs1-Fragment ist jeweils mit einem grünen Pfeil und GST
mit einem gelben Pfeil markiert.
Es wurde versucht die die gespaltenen Tgs1-Fragmente durch Ausschlusschromatographie
über eine Superdex 75 26/60 zu separieren. Es ergaben sich jedoch keine Maxima, denen
die Tgs1-Fragmente oder GST zugeordnet werden könnten und die Analyse über SDSPAGE zeigte, daß diese nicht getrennt werden konnten.
Ergebnisse
84
Es ist also eine weitere Optimierung der Bedingungen bei der Spaltung und Expression
oder das Suchen einer anderen Strategie nötig.
Diskussion
85
4 Diskussion
Das Ziel dieser Diplomarbeit bestand in der Etablierung einer Expressions- und
Reinigungsstrategie der snRNA-m7G-Cap spezifischen Dimethyltransferase, um das
hochreine,
lösliche
Protein
zu
kristallisieren.
Dies
stellt
die
Grundlage
zu
röntgenkristallographischen Analysen der Struktur des Proteins dar. Weitere Schwerpunkte
lagen in der Entwicklung eines geeigneten Aktivitätstests und dem Nachweis der
Interaktion zu Substraten und Produkten.
Zur Expression und Reinigung des Proteins wurden mehrere Systeme entwickelt, zum
einen das Protein PIMT (PRIP interacting protein with methyltransferase domain) aus
Homo sapiens in der vollen Länge (Aminosäuren 1-852) mit einer N-terminalen
Glutathion-S-Transferase-Affinitätssequenz (GST), zum anderen die MethyltransferaseDomäne aus PIMT (Aminosäuren 635-852) mit N-terminaler GST- bzw. Hexa-HistidinAffinitätssequenz. Das dritte System bestand aus dem Ortholog von PIMT aus
Saccharomyces cerevisiae, Tgs1, in verschiedenen Längen (Aminosäuren 1-268, 57-268,
57-315) mit N-terminaler GST-Affinitätssequenz.
Es war im Rahmen dieser Diplomarbeit nicht möglich, das Protein PIMT in der vollen
Länge mit GST-Affinitätssequenz zu exprimieren und zu reinigen (3.1).
Die Methyltransferase-Domäne aus PIMT mit GST-Affinitätssequenz konnte durch
mehrere Schritte in hochreiner Form gewonnen werden (3.2.3.1, 3.2.3.3, 3.2.3.4). Der
Einsatz des geschnittenen Fusionsproteins in Kristallisationsansätze führte allein und auch
mit verschiedenen Interaktionspartnern nicht zu Kristallen (3.2.6). Lösungsansätze für
dieses Problem bestanden in der Generierung stabiler, verkürzter Fragmente des Proteins
durch Protease-Spaltung (3.2.7).
Die Reinigung und Kristallisation der orthologen Proteinfragmente aus Tgs1 scheiterten
bisher an der niedrigen Spaltungseffizienz der TEV-Protease nach der GSTAffinitätschromatographie (3.3.4.2).
Es wurde ein geeigneter Test zum Nachweis der Methylierungsaktivität der
Methyltransferase-Domäne aus PIMT etabliert und die Aktivität derselben nachgewiesen
(3.2.5). Dieser beruht auf der Trennung der eingesetzten Substrate und entstehenden
Produkte. Die Bindung dieser Komponenten an das gereinigte Enzym wurde zuvor über
Fluoreszenzspektroskopie gezeigt (3.2.4).
Diskussion
86
4.1 Expression und bioinformatische Charakterisierung von PIMT
4.1.1
Expression von PIMT in der vollen Länge
Es wurde versucht, das Protein in der vollen Länge (Aminosäuren 1-852) mit GSTAffinitätssequenz zu exprimieren und zu reinigen. Bereits die Expression der kodierenden
Sequenz in pGEX-6P-1 gestaltete sich schwierig. Bei Proben, die vor und nach der
Induktion genommen wurden, zeigte sich auf dem SDS-Gel keine Bande, die dem
theoretischen Molekulargewicht von PIMT (122 kDa) entsprechen könnte. Nach dem
Aufschluß der pelletierten Expressionskulturen konnte lediglich bei HMS174 DE3 eine
sehr schwache Bande bei etwa 120 kDa identifiziert werden (3.1). Es war nicht möglich,
dieses Protein durch GST-Affinitätschromatographie zu isolieren.
Daraufhin
wurde
versucht,
die
Expressionsbedingungen,
wie
Temperatur
und
Induktionszeit, zu variieren, wobei sich auch hier die betreffende Protein-Bande nicht
verstärkte.
Neben dem Zielprotein mit GST-Affinitätssequenz kann es sich bei diesem Protein jedoch
auch um z.B. die -Galaktosidase handeln, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa
116 kDa besitzt und ebenfalls durch den Induktor der Expression, IPTG, induziert wird.
Aufgrund der geringen Expression von PIMT und der Möglichkeit, daß es sich bei der
beobachteten Proteinbande nicht um PIMT handelt, wurde nach alternativen Strategien
gesucht.
4.1.2
Analyse der Sekundärstruktur von PIMT
Es wurde eine Sekundärstrukturvorhersage von PIMT durchgeführt, um eventuelle
Ähnlichkeiten zu z.B. Tgs1 (Abbildung 35) darzustellen und die Wahl von verkürzten
Fragmenten der Methyltransferase zu erleichtern. Die Vorhersage wurde mit PSIpredict
(ExPASy) durchgeführt und ist in Abbildung 31 gezeigt.
Diskussion
87
Abbildung 31: Sekundärstrukturvorhersage für PIMT durch PSIpredict. Grüne Zylinder, H: Helices, gelbe
Pfeile, E: Faltblätter, C: Schleife, Höhe der blauen Balken: Konfidenz der Vorhersage, die Aminosäurepositionen sind
unterhalb der Sekundärstruktur numeriert, roter Pfeil: erste Aminosäure der Methyltransferase-Domäne (Prolin 635).
Diskussion
88
Von den 36
-Helices und 20
-Faltblattstrukturen, die PIMT laut der Vorhersage
beinhaltet, befinden sich 9 Helices und 8 Faltblätter in der Methyltransferase-Domäne. Die
klonierte Methyltransferase-Domäne beginnt mit dem Anfang einer
-Helix. Dies ist
insofern gut gewählt, als daß der Beginn eines Fragmentes in einer Helix ungünstig ist, da
so stabilisierende Bereiche fehlen könnten. Der Beginn eines Fragmentes weit vor einer
Helix in einer Schleife kann zu instabilen, ungeordneten Segmenten führen. Eine dadurch
entstehende
ungeordnete
Struktur
kann
eine
Kristallisation
durch
strukturelle
Inhomogenität verhindern. Dies sollte in Bezug auf die Methyltransferase-Domäne
untersucht werden und eventuelle weitere Klonierungen von PIMT-Fragmenten
erleichtern.
4.2 Expression, Reinigung und Kristallisation der MethyltransferaseDomäne aus PIMT
Da PIMT in der vollen Länge nicht exprimiert und gereinigt werden konnte, wurde
versucht, einen Teil des Proteins, die Methyltransferase-Domäne (Aminosäuren 635-852),
mit N-terminaler GST- bzw. Hexa-Histidinsequenz zu exprimieren und zu reinigen. Das
Fragment sollte kristallisiert und seine Aktivität nachgewiesen werden.
4.2.1
Expression und Reinigung der Methyltransferase
Es wurde versucht die Methyltransferase-Domäne mit Hexa-Histidin-Sequenz zu
exprimieren und zu reinigen. Die Quantität der Expression ist schlechter als die des GSTFusionsproteins und die Reinigung des Proteins gelang nicht (3.2.3.2). Aufgrund dieser
Schwierigkeiten wurde der Reinigung über GST-Affinitätssequenz zunächst der Vorzug
gegeben.
Die Expression und die Reinigung der Methyltransferase-Domäne über GSTAffinitätschromatographie gelangen. Nach dem Entfernen der GST-Affinitätssequenz
präzipitierte das Protein jedoch langsam aber stetig aus dem Ansatz (3.2.3.3). Damit
gestaltete sich auch die Ausschlusschromatographie schwierig.
Diskussion
89
Das Problem der Präzipitation konnte durch Zugabe von 2 % Glukose vor der Induktion
und 2 % Ethanol nach der Induktion, sowie der Durchführung der gesamten Reinigung bei
4 °C behoben werden. Glukose reprimiert die Basisexpression des Zielgens vor der
Induktion. Ethanol induziert in geringen Konzentrationen die Synthese verschiedener
Faltungshelfer (Chaperone) und Hitzeschockproteine. Diese können die Bildung von
Protein-Einschlußkörpern verringern oder verhindern und so die Löslichkeit und Ausbeute
erhöhen.
Bei der Bestimmung des nativen, molaren Extinktionskoeffizienten (3.2.3.4) lagen die
Standardabweichungen bei 2,9 % (denaturierte Messungen) und 8,5% (native Messungen).
Die Funktion der denaturierten Messung zeigt im Bereich von 250-265 nm große
Schwankungen. Diese sind größtenteils auf das in der Lösung vorliegende 6 M
Guanidiniumhydrochlorid zurückzuführen, welches in diesen Wellenlängen interferiert.
4.2.2
Interaktionsnachweise über Fluoreszenzspektroskopie
Um die Bindung von Interaktionspartnern (m7Gppp, m7GpppA, S-Adenosyl-L-Methionin,
S-Adenosyl-Homocystein) nachzuweisen, wurden Lösungen der Methyltransferase jeweils
mit und ohne die Interaktionspartner fluorometrisch gemessen (3.2.4).
Die Standardabweichungen der Mittelwerte am Maximum liegen zwischen 1,6 und 7,4 %
und sind damit akzeptabel. Sie sind zu gering, um die Abweichungen zwischen der
Methyltransferase allein und dem Protein mit Interaktionspartner hervorzurufen.
Die Fluoreszenzen nehmen nach Zugabe der verschiedenen Interaktionspartner
unterschiedlich stark ab. Das liegt daran, daß jeder Ligand (z.B. m7GpppA) die
Tryptophane, die an seiner Bindung beteiligt sind, unterschiedlich stark beeinflußt.
Dadurch wird die lokale Umgebung der Tryptophane in Abhängigkeit vom
Interaktionspartner verändert und somit auch ihr Absorptions- und Emissionsverhalten.
Die Änderung der Fluoreszenzintensitäten könnte also auf die Bindung der untersuchten
Interaktionspartner an das Protein zurückzuführen sein, sofern die Bindung des Cap über
die in dem Modell postulierten Tryptophane stattfindet.
Nach der Bindung der Nukleotide (m7Gppp, m7GpppA) an das Protein, gibt es eine
Verschiebung der Maxima in Bezug auf die Wellenlänge um 15 nm (m7Gppp) und 8 nm
(m7GpppA). Es handelt sich um eine Verschiebung in den längerwelligen, also
Diskussion
90
energieärmeren
Bereich
(Rotverschiebung).
Dies
ist
wahrscheinlich
auf
die
Eigenfluoreszenz der Nukleotide zurückzuführen, da diese im längerwelligen Bereich (390
nm, Abbildung 20) absorbieren. Die Spektren wurden zwar um den Nukleotidbeitrag
korrigiert, Ungenauigkeiten in der Konzentration der Nukleotide können trotzdem zu
Abweichungen führen, die eine Verschiebung des Gesamtspektrums verursachen. Eine
andere Erklärung für die Verschiebung der Maxima wäre die Änderung der
Eigenfluoreszenz der Nukleotide durch die Bindung, die nicht gemessen und
berücksichtigt werden kann.
Nachdem die Fluoreszenzspektren zusammen mit dem Strukturmodell (Mouaikel et al.,
2003a; 4.3.3) Hinweise auf die Bindung der Substraten zum Enzym lieferten, sollte nun
die Aktivität der gereinigten Methyltransferase-Domäne nachgewiesen werden.
4.2.3
Nachweis der Methylierungsaktivität
Zum Nachweis der Aktivität einer Methyltransferase ist derzeit kein in vitro-Test etabliert,
der nicht auf der Detektion von Radioaktivität beruht. Aus diesem Grund wurde ein Test
entwickelt, der es erlaubt die Methylierungsaktivität ohne die radioaktive Markierung in
vitro qualitativ und quantitativ nachweisen zu können. Weiterhin ist es mit diesem Ansatz
möglich, eventuell auftretende Zwischenprodukte, die bei der Katalyse der Übertragung
von zwei Methylgruppen auf einen Akzeptor entstehen können, nachzuweisen.
Es werden die gereinigte Dimethyltransferase-Domäne aus PIMT und ihre Substrate m7G
und S-Adenosyl-L-Methionin gemischt und bei 20 °C inkubiert. Der Ansatz wird gefällt,
um das Enzym aus dem Ansatz zu entfernen. Die Reaktionsprodukte und nicht umgesetzte
Substrate können danach durch Umkehrphasenchromatographie getrennt werden (3.2.5).
Durch die Berechnung der Flächen unter den auftretenden Maxima ist es möglich die
Auswertung quantitativ durchzuführen.
Die Umstellung des Elutionsgradienten von 0-100 % bei initialen Trennungen auf 0-60 %
bei den Methylierungsansätzen (3.2.5) erfolgte, um eine bessere Trennung der einzelnen
Substanzen zu erhalten. Die Retentionsvolumina verschoben sich dadurch nahezu parallel
um etwa 0,5 ml nach hinten.
Die gereinigte Methyltransferase-Domäne ist aktiv (3.2.5), wurde jedoch in diesem
Methylierungstest in einer Konzentration von 22,5 µM eingesetzt. Dies ist weit über der
Diskussion
91
Konzentration, in der das Protein innerhalb der Zelle vorliegt. Bei Methylierungsansätzen
mit Konzentrationen von 1 µM oder 5µM konnten keine Aktivitäten festgestellt werden.
Dafür kann es mehrere Gründe geben. Ist ein Teil des gereinigten Proteins falsch gefaltet,
so ist es nicht katalytisch aktiv und kann somit nicht zur Umsetzung der Substrate
beitragen. Außerdem muß man beachten, daß im Methylierungsansatz nur die
Methyltransferase-Domäne vorhanden ist. Es könnte sein, daß ein Teil des N-Terminus
von PIMT eine aktivierende Funktion auf die Methylierung hat. Ein weiterer Faktor, der
die Aktivität negativ beeinflussen könnte sind die Reaktionsbedingungen. Das Problem der
langsamen Methylierung von Substraten durch eine Methyltransferase in hohen
Konzentrationen wurde schon von Edqvist et al., 1994 beschrieben. Die niedrige Aktivität
war hier auf die Wahl des Substrates zurückzuführen, welches nicht mit dem natürlichen
übereinstimmte. Es könnte sein, daß zu einer effektiven Methylierung und Koordination
des Nukleotides mehrere Basen als die hier verwendeten zwei ersten nötig sind.
Es wurde gezeigt, daß die Assemblierung des U snRNPs und speziell das Vorhandensein
von SmB eine Vorraussetzung für die Hypermethylierung des snRNA-Caps ist (Mattaj,
1986; Raker et al., 1996). Die Methylierung der Guaninbase an sich benötigt aber, wie in
diesem Test gezeigt, keine weiteren Faktoren. Es ist möglich, daß die Aktivität des
Enzyms durch weitere Faktoren, wie SmB, SMN oder ein Cap mit mehreren Basen,
positiv beeinflußt wird.
Bei der quantitativen Betrachtung der Umsetzung muß beachtet werden, daß dies nur
Näherungswerte sind. Die unterschiedliche Beschaffenheit der Chromophoren in den
Substanzen (Adenosyl-Teil des AdoMet und SAHcy, Guanosin-Teil der Nukleotide) und
Konzentrationsschwankungen führen zu Abweichungen.
4.2.4
Kristallisation der Methyltransferase-Domäne
Zusätzlich
zu
der
Charakterisierung
der
Methyltransferase-Domäne
durch
Interaktionsstudien und dem Nachweis der Aktivität, wurde versucht, die hochreine,
präparierte Methyltransferase zu kristallisieren (3.2.6). Die Kristallisationsansätze wurden
mit verschiedenen Proteinkonzentrationen, bei verschiedenen Temperaturen mit und ohne
Interaktionspartner pipettiert. Bislang konnte in keinem Kristallisationsansatz eine
Kristallbildung beobachtet werden.
Diskussion
92
Aus der Fülle von pipettierten und beobachteten Kristallisationsansätzen, können jedoch
einige allgemeingültige Aussagen für die Methyltransferase-Domäne im Bezug auf
einzelne Komponenten gemacht werden. Zweiwertige Metallionen, wie Magnesium-,
Natrium-, Lithium-, Kalzium- und Zinkionen scheinen das Protein zu stabilisieren. Das
Auftreten von Präzipitat wird deutlich verringert, wenn solche zweiwertigen Ionen in
Konzentrationen von etwa 20-150 mM vorhanden sind. Diese Stabilisierung könnte durch
die Bindung der Ionen an Oberflächen des Proteins und der damit einhergehenden
Erhöhung der Löslichkeit erfolgen. Das Vorhandensein von Alkoholen, wie Butanol,
Isopropanol und MPD scheint in Konzentrationen von 20-40 % ebenfalls positive Effekte
auf das Löslichkeitsverhalten des Proteins zu haben. Polyethylenglykole, wie PEG 4002000 beeinflussen das Löslichkeitsverhalten ebenso günstig, wie niedrige pH-Werte
(pH 4,6 Natriumacetat).
In
Zukunft
sollten
aufgrund
des
Trends
der
Präzipitation
noch
niedrigere
Proteinkonzentrationen (4-5 mg/ml) mit Interaktionspartnern unter der Verwendung von
günstigen Bedingungen pipettiert werden.
4.2.5
Generierung stabiler Fragmente der Methyltransferase-Domäne
Die Kristallisation der Methyltransferase-Domäne (Aminosäuren 635-852) gelang bisher
nicht. Dies kann zum Beispiel daran liegen, daß ungeordnete Strukturen an der Oberfläche
des Proteins spezifische, periodische Zusammenlagerungen, die zur Bildung von Kristallen
nötig sind verhindern. Diese Strukturen können durch Proteasen, die eine geringe
Substratspezifität besitzen entfernt werden. So können Fragmente generiert werden, die die
Kristallisation erlauben.
Die Methyltransferase-Domäne wurde mit den Proteasen Elastase, GluC (V8), Thrombin
und Trypsin verdaut (3.2.7).
Um entstandene Fragmente zuordnen zu können, wurden Vorhersagen getroffen (peptide
cutter, ExPASy), die es erlauben, Schnittstellen anhand ihrer Sequenz zu identifizieren und
zu lokalisieren. Diese putativen Schnittstellen der verwendeten Proteasen GluC (V8),
Thrombin und Trypsin sind in Abbildung 32 dargestellt.
Das bei der Spaltung mit GluC entstehende 22 kDa Fragment eignet sich aufgrund des
geringen Unterschiedes im Molekulargewicht zu der Methyltransferase-Domäne besonders
Diskussion
93
zur weiteren Reinigung, da es wahrscheinlich alle zur Aktivität wichtigen Motive und
Aminosäuren aufweist.
Abbildung 32: Schematische Darstellung der putativen Schnittstellen der Proteasen. (vgl. Abbildung
25) Dargestellt ist die Methyltransferase-Domäne in verschiedenen Farben mit den Aminosäuren 1-218 (635852), putative Schnittstellen sind durch Striche gekennzeichnet und mit der Aminosäureposition markiert.
Vergleicht man dieses Molekulargewicht mit dem Schema (Abbildung 32, GluCSpaltung), so handelt es sich möglicherweise um die an Aminosäureposition 8
geschnittene Methyltransferase. Auch ein Fragment von Position 2-217 oder 8-217 wäre
denkbar. Diese Vermutung muß eine N-terminale Sequenzierung des gereinigten
Fragmentes bestätigen. Die optimale Inkubationszeit, um größere Mengen des Fragmentes
zu erhalten, liegt zwischen 240 Minuten und 24 Stunden, da die Banden hier am stärksten
sind.
Das etwas kleinere Fragment bei etwa 20-21 kDa könnte eine an Position 192 oder 32
geschnittene Methyltransferase darstellen. Dieses Fragment entsteht jedoch relativ spät
und in nicht ausreichenden Mengen, um eine weitere Reinigung durchzuführen.
Die Spaltung durch die Elastase generierte relativ wenige Fragmente. Das ist
überraschend, da die Vorhersage mehr als 70 putative Schnittstellen postuliert. Hier ist
entweder die Effizienz der Spaltung sehr gering (wenig Elastase) oder das Protein zu
kompakt gefaltet. Ein etwa 23 kDa großes Stück stellt hier das auffälligste Fragment dar.
Diskussion
94
Die Protease Thrombin war nicht in der Lage, an der in Abbildung 32 (ThrombinSpaltung) dargestellten Aminosäureposition 172 zu spalten (Abbildung 25). Das
entstehende Fragment mit den Aminosäuren 1-172 hätte sich gut zur weiteren Reinigung
geeignet. Das Ausbleiben der Spaltung könnte auf eine zu niedrige Konzentration der
Protease oder auf eine für das Enzym nicht zugängliche Schnittstelle zurückzuführen sein.
Die Protease-Spaltung durch Trypsin generierte hauptsächlich 23 und 22 kDa große
Fragmente (Abbildung 25). Diese treten bereits nach 10 Minuten Inkubationszeit in etwa
gleichen Mengen auf, sind jedoch im Lauf der Zeit relativ unstabil. Sie werden in immer
kleinere Fragmente zerlegt, könnten aber durch ein Stoppen der Reaktion nach 10 oder
20 Minuten, durch PMSF (Serin-Protease-Inhibitor, Phenylmethylsulfonylfluorid) dennoch
gereinigt und zur weiteren Charakterisierung herangezogen werden. Es könnte sich bei
diesen Fragmenten um die an Position 11 und 212 bzw. 11 und 200 gespaltenen
Methyltransferasen handeln.
Die Bestätigung der Identität von Fragmenten kann zum Beispiel durch N-terminale
Sequenzierung
erfolgen,
während
der
C-Terminus
zum
Beispiel
durch
Massenspektroskopie identifiziert werden kann.
4.3 Expression, Reinigung und Charakterisierung von Tgs1
Da weder die snRNA-m7G-Cap-spezifische Dimethyltransferase PIMT aus Homo sapiens
(Aminosäuren 1-852) noch ihre Methyltransferase-Domäne allein (Aminosäuren 635-852)
kristallisierten, wurde das Ortholog des Proteins aus Saccharomyces cerevisiae, Tgs1,
herangezogen.
Für Tgs1 (Aminosäuren 1-315) war bekannt, daß je nach Affinitätssequenz Probleme bei
der Expression, der Reinigung oder bei der Spaltung der Fusionsproteine auftraten
(A. Strasser, persönliche Mitteilung). Tgs1 mit N-terminaler Hexa-Histidin-Sequenz zeigte
nach dem Aufschluß eine sehr geringe Löslichkeit. Tgs1-GST konnte nicht gespalten
werden und Tgs1 mit N-terminalem Maltose-Bindeprotein zeigte eine sehr geringe
Expression.
Aufgrund dieser Schwierigkeiten wurden neue, verkürzte Fragmente kloniert und versucht,
diese zu exprimieren und zu reinigen.
Diskussion
4.3.1
95
Klonierung und Reinigung von Tgs1
Es wurden drei Fragmente von Tgs1 anhand der Sekundärstrukturvorhersage ausgewählt
und kloniert. Es handelt sich dabei um die Fragmente Tgs1 AS 1-268, Tgs1 AS 57-268
und Tgs1 AS 57-315, die jeweils in den Vektor pETM30 ligiert wurden (3.3.2, 3.3.3,
3.3.4).
Es war möglich die Fragmente zu exprimieren und über GST-Affinitätschromatographie
zu reinigen. Schwierigkeiten bereitete dagegen immer noch das Schneiden der Fragmente
durch die TEV-Protease. Selbst der Versuch das an die GSH-Sepharose gebundene
Fusionsprotein auf der Säule zu spalten brachte keinen Erfolg.
Eine Erklärung dafür wäre, daß die Schnittstelle für die Protease nicht zugänglich ist. Die
Schnittstelle kann durch GST oder Tgs1 maskiert sein, was zu einer uneffektiven Spaltung
führt. Da die Bedingungen unter denen die Spaltung durchgeführt wurde, den optimalen
für die TEV-Protease entsprechen kann ein methodischer Fehler ausgeschlossen werden.
Die Aktivität der TEV-Protease wurde durch mehrere Mitarbeiter bestätigt.
4.3.2
Sequenzvergleich orthologer Dimethyltransferasen
Ein Sequenzvergleich zwischen der Methyltransferase-Domäne aus PIMT und Tgs1 ist
bereits in Abbildung 26 dargestellt. Um die Konservierung des Proteins über einen weiten
Bereich zu zeigen wurde ein multipler Sequenzvergleich durchgeführt. Dieser vergleicht
die Aminosäuresequenzen zwischen Homo sapiens (Mensch), Mus musculus (Hausmaus),
Caenorhabditis elegans (Fadenwurm), Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) und
Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe).
In Abbildung 33 ist der Sequenzvergleich dargestellt.
Diskussion
96
Abbildung 33: Sequenzvergleich von PIMT aus Homo sapiens (Mensch), Mus musculus (Hausmaus),
Caenorhabditis elegans (Fadenwurm), Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) und Saccharomyces
cerevisiae (Bäckerhefe). Identische Aminosäuren sind weiß auf rotem Hintergrund dargestellt,
Abweichungen in einer Aminosäure zwischen den Sequenzen sind rot auf weißem Hintergrund und blau
umrandet gezeigt, die Ähnlichkeit der Sequenzen liegt bei etwa 38 %, die Methyltransferase-Motive I, II, III
und POST I sind schwarz umrandet und beschriftet, wichtige Aminosäuren sind durch Pfeile gekennzeichnet,
Aminosäurepositionen sind am Anfang jeder Zeile angegeben, (ClustalW, ESPript 2.2).
Im Sequenzvergleich dieser Orthologe sind nur die Methyltransferase-Domänen der
jeweiligen Proteine miteinander verglichen. Viele Aminosäuren sind zwischen allen
Organismen von niederen bis zu den höchsten Eukaryoten konserviert. Die
Sequenzähnlichkeit der Methyltransferase-Domänen liegt bei 38 %. Vor allem die
gemeinsamen Motive sind hochkonserviert (MT-Motiv I, II). Aminosäuren, denen eine
funktionelle Wichtigkeit bei der Bindung der zu modifizierenden Base zugeordnet wurde,
wie die Tryptophane 75 und 178, oder solche, die bei der Koordination des S-Adenosyl-LMethionin essentiell sind, wie die Aspartate 103 und 126, sind markiert (Mouaikel et al.,
2003a). Serin 175 ist im Modell im aktiven Zentrum zwischen der zu modifizierenden
Base und der Methylgruppe des AdoMet lokalisiert. Andere konservierte Aminosäurereste
könnten für die strukturelle und funktionelle Bildung der katalytischen Tasche, für die
Koordination von Substraten oder für die Unterdrückung von unerwünschten
Nebenreaktionen verantwortlich sein. Alle diese wichtigen Aminosäuren sind konserviert
und in keiner der Sequenzen verändert.
Diskussion
97
Die beschriebene Ähnlichkeit trifft jedoch in Sequenz und Länge nur auf die
Methyltransferase-Domänen zu. Die N-terminalen Bereiche zeigen weder große
Ähnlichkeit noch vergleichbare Längen. Dies deutet auf möglicherweise unterschiedliche
Funktionen dieser Bereiche hin. In Abbildung 34 sind die Längen der orthologen Proteine
aus verschiedenen Organismen gegenübergestellt.
Abbildung 34: Vergleich der Proteinlängen von PIMT in H. sapiens, M. musculus, C. elegans, A.
thaliana und S. cerevisiae. Die Methyltransferase-Domäne ist gelb dargestellt, Methyltransferase-Motive I,
II, III= I, II, III (rot), POST I=P (grün), Gesamtlängen in Aminosäuren und N- bzw. C-Terminus sind
markiert.
Bei höheren Eukaryoten, wie H. sapiens und M. musculus sind die Längen der Nterminalen Bereiche vergleichbar und die Sequenzidentität bzw. -ähnlichkeit liegt bei 73 %
bzw. 84 %. Das Protein aus der Hausmaus ist lediglich um eine Aminosäure länger als das
des Menschen. Der Fadenwurm zeigt einen um 286 Aminosäuren verkürzten N-Terminus,
wobei auch hier die Methyltransferase-Domäne in der Sequenz und Länge sehr ähnlich ist
(Abbildung 33). Bei A. thaliana ist die Methyltransferase-Domäne dupliziert, wobei der NTerminus komplett fehlt (Mouaikel et al., 2002). Das Ortholog Tgs1 aus der Bäckerhefe
weist nur die Methyltransferase-Domäne auf und ist C-terminal um 50 Aminosäuren
verlängert, wobei auch hier große Ähnlichkeiten zu den anderen Domänen bestehen.
Die Länge der N-terminalen Bereiche scheint also evolutionär zu höher organisierten
Organismen gewachsen zu sein. Dies geht oft mit einer Fusionierung zweier
unterschiedlicher Proteine einher, die funktionell verschieden sind aber in ähnlichen
Bereichen wirken (Transkriptionsregulation und RNA-Modifikation).
Diskussion
4.3.3
98
Vorhersage der Dreidimensionalen Struktur von Tgs1
Die dreidimensionale Struktur eines Teils von Tgs1 (Aminosäuren 70-267) wurde anhand
von Sequenz- und Strukturvergleichen mit ähnlichen Proteinen vorhergesagt (Mouaikel et
al., 2003a). Dieses dreidimensionale Modell wurde unter anderem verwendet, um die
Position und Aufgabe verschiedener Aminosäurereste zu verstehen. Das Modell ist in
Abbildung 35 dargestellt.
Abbildung 35: Darstellung des Modells der Dimethyltransferase Tgs1 (nach Mouaikel et al., 2003a). Das
Protein ist im Cartoon-Modus, Nukleotid und AdoMet sind im Kugel-Stab-Modus dargestellt, (A)
vollständige Ansicht mit den AdoMet koordinierenden Aspartaten 103 und 126 (hellrot), (B) SubstratBindung, (C) katalytisches Zentrum mit Substraten, (D) Sicht durch die das Nukleotid koordinierenden
Tryptophane (orange) mit Serin175 (hellgrün), für die Bindung wichtige Aminosäuren sind im Kugel-StabModus mit ihren Positionen gezeigt, weißer Pfeil: exozyklischer Stickstoff N7 (Methylgruppenakzeptor),
roter Pfeil: Methylgruppe am AdoMet (Methylgruppendonor), schwarzer Pfeil: Übertragung der
Methylgruppen, (PyMol).
Diskussion
99
In Abbildung 35A ist die Gesamtansicht des Modells gezeigt. Es weist alternierende Helices
und
-Stränge
auf.
Der
Vergleich
dieses
Modells
mit
der
Sekundärstrukturvorhersage für PIMT (Abbildung 31) zeigt eine nahezu vollständige
Übereinstimmung. Die Vorhersagen postulieren auch für die Sekundärstrukturen der
Methyltransferase-Domänen große Ähnlichkeiten, was die Annahme der evolutionären
Konservierung dieser Domäne unterstützt. Die Methyltransferase PIMT und ihr Ortholog
Tgs1 gehören aufgrund der Sekundär- und Tertiärstruktur zur Klasse I der
Methyltransferasen (1.4.1). Diese charakterisiert ein -Faltblatt, welches aus sieben Strängen aufgebaut ist und in der Tertiärstruktur eine Faltblattstruktur mit zentralem,
topologischem Drehpunkt bildet. In der Mitte dieser Struktur wird das AdoMet gebunden.
Dieses Faltblatt wird durch
gewundenen, offenen
-Helices flankiert, was zur Bildung eines doppelt
sandwiches führt (1.4.1).
Die Tryptophane 75 und 178 koordinieren der Vorhersage nach das einfach methylierte
Nukleotid
durch
eine
Kationen- -Interaktion.
Diese
Koordination
und
die
Wechselwirkungen von Base und aromatischen Aminosäuren (Kationen- -sandwich) sind
vielfach beschrieben worden (Calero et al., 2002; Miyoshi et al., 2002). Dabei muß
mindestens eine Aminosäure ein Tryptophan oder Tyrosin sein, die andere kann durch
Phenylalanin, Tyrosin oder eine andere planare, unpolare Aminosäure gestellt werden
(Hsu et al., 2000).
Die Bindung von S-Adenosyl-L-Methionin wird durch die Aspartate 103 (MT-Motiv I)
und 126 (POST I) ermöglicht, da Aspartatmutanten, bei denen diese Aspartate zu Alaninen
mutiert wurden (D103A, D126A), kein AdoMet mehr binden (Mouaikel et al., 2002;
Niewmierzycka & Clarke, 1999). Die Bindung des S-Adenosyl-L-Methionins könnte
durch das oberhalb liegende Tryptophan 155, welches mit dem Adenosyl-Teil interagiert,
weiter stabilisiert werden.
In Teil C der Abbildung ist die Nähe der Methylgruppe am AdoMet zum exozyklischen
Stickstoff N7 der Base gut zu erkennen. Der Abstand der Methylgruppe des S-AdenosylL-Methionin zum Stickstoff der Base beträgt laut Modell 4,9 . Aus dem Modell kann
keine Schlußfolgerung gezogen werden, wie die Zweifachmethylierung katalysiert wird.
Möglicherweise erfolgt die Übertragung der ersten Methylgruppe auf die einfach
methylierte Base und die anschließende Freisetzung der Produkte m2,7G und S-AdenosylHomocystein. Die Existenz eines solchen stabilen Zwischenproduktes (m2,7G) wurde
bereits durch das Auftreten eines Maximums zwischen dem einfach methylierten und
Diskussion
100
dreifachmethylierten Zustand postuliert (3.2.5; Hausmann et al., 2004). In einem weiteren
Reaktionszyklus könnte ein weiteres AdoMet und das Zwischenprodukt gebunden, und die
zweite Methylgruppe auf das Nukleotid übertragen werden. Eine Bestätigung des
Strukturmodells kann nur durch die röntgenkristallographische Analyse des Proteins
erfolgen.
Zusammenfassung
101
5 Zusammenfassung
Während der Biogenese spleißosomaler Untereinheiten (U snRNPs) wird die U snRNA
nach der Transkription ins Zytoplasma exportiert. Dort findet die Assemblierung der
sieben Sm-Proteine an die snRNA zum Sm-core und nachfolgend die Hypermethylierung
des m7G-Caps zu einem m2,2,7G-Cap statt. Tgs1 (S. cerevisiae) und PIMT (H. sapiens)
vermitteln diese Dimethylierung des RNA-Caps. Dabei werden auf den exozyklischen
Stickstoff N2, der Guaninbase, die bereits am Stickstoff N7 methyliert ist, zwei weitere
Methylgruppen von S-Adenosyl-L-Methionin als Methylgruppendonor übertragen. Das so
entstandene m2,2,7G-Cap und der Sm-core bilden nun ein zweiteiliges Importsignal,
welches schließlich den Reimport der U snRNPs in den Zellkern vermittelt.
In dieser Diplomarbeit wurden Fragmente der snRNA-m7G-Cap-spezifischen Dimethyltransferase Tgs1 kloniert und exprimiert, da die Reinigung von Tgs1 in voller Länge in
früheren Arbeiten nicht gelungen war. Die Reinigung dieser Fragmente konnte jedoch
bisher nicht etabliert werden, da sich die jeweiligen Fusionsproteine nicht spalten ließen.
Daraufhin wurde die Expression und Reinigung der Methyltransferase-Domäne aus PIMT,
dem Ortholog von Tgs1 etabliert. Die Methyltransferase konnte in hochreiner Form und
großen Mengen präpariert werden.
Zusätzlich konnte die Interaktion der Methyltransferase-Domäne mit den Cap-Analoga
m7GpppA, m7Gppp und dem Methylgruppendonor S-Adenosyl-L-Methionin, sowie dem
Reaktionsprodukt S-Adenosyl-Homocystein durch Fluoreszenzspektroskopie gezeigt
werden. Da darüber hinaus kein quantifizierbarer Aktivitätstest für die Dimethylierung am
Stickstoff N2 der Guaninbase durch die Methyltransferase vorlag, wurde ein Test
entwickelt, der es unter Verzicht auf eine radioaktive Markierung erlaubt, die
Reaktionsprodukte von den Edukten zu trennen und erste Quantifizierungen vorzunehmen.
Basierend auf den Daten des Aktivitätstests und der Interaktionsstudien wurde versucht,
die Dimethyltransferase in An- und Abwesenheit der Interaktionspartner m7GpppA,
m7Gppp und S-Adenosyl-L-Methionin zu kristallisieren. Bislang konnte keine
Kristallbildung beobachtet werden.
Die Interaktionsstudien und der etablierte Aktivitätstest können jedoch in Zukunft
herangezogen werden, um funktionelle Fragmente von PIMT für die Ko-Kristallisation mit
Interaktionspartnern zu identifizieren.
Summary
102
6 Summary
During the biogenesis of spliceosomal subunits (snRNPs) the U snRNA is posttranscriptionally exported to the cytoplasm. Here the assembly of the seven sm-proteins
onto the sm-site of the U snRNA and thus the building of the sm-core takes place.
Furthermore the m7G-cap is hypermethylated to a m2,2,7G-cap. Tgs1 (S. cerevisiae) and
PIMT (H. sapiens) mediate this dimethylation of the RNA-cap. Thereby two methylgroups
are transferred from S-adenosyl-L-methionine as methylgroup donor on the exocyclic
nitrogen N2 of the monomethylated guanine-base. The originated m2,2,7G-cap and the smcore now serve as a bipartite import signal, which mediates the reimport of the U snRNPs
into the nucleus.
In this work fragments of the snRNA-m7G-cap-specific dimethyltransferase Tgs1 were
cloned and expressed, since the expression and purification of Tgs1 in full length did not
succeed in previous works. However, the purification of those fragments could not be
established so far, as the fusion protein could not be cleaved.
Hereupon the expression and purification of the methyltransferase domain of PIMT, the
ortholog of Tgs1 was established. The methyltransferase could be prepared ultrapure and
in huge amounts.
The interaction of the methyltransferase domain with cap-analoga m7Gppp, m7GpppA and
the methylgruop donor S-adenosyl-L-methionine as well as the reaction product Sadenosyl-homocysteine could be shown using fluorescence spectroscopy.
As furthermore because a quantifiable assay for the dimethylation on the nitrogen N2 of
the guanine base by the dimethyltransferase had not been established yet, an assay was
developed, which allows the separation of reaction educts and products and initial
quantifications of them.
Based on the data of the activity assay and the interaction studies crystallisation trials of
the methyltransferase-domain with and without the interaction partners m7Gppp,
m7GpppA and S-adenosyl-L-methionine were carried out. However a formation of crystals
has not been observed so far.
In the future, the interaction studies and the established activity assay can be used to
identify functional fragments of the methyltransferase PIMT/Tgs1 and to co-crystallise
them with interaction partners.
Literaturverzeichnis
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Abkürzungsverzeichnis
112
8 Abkürzungsverzeichnis
alpha
A
Absorption
A. thaliana
Arabidopsis thaliana
Å
Angström [1 Å = 0.1 nm]
AdoMet
S-Adenosyl-L-Methionin
AS
Aminosäuren
ATP
Adenosintriphosphat
beta
bp
Basenpaare
c
Konzentration [M]
C
Cytosin
°C
Grad Celsius
C. elegans
Caenorhabditis elegans
CBC
cap binding complex
CBP
cap binding protein
CBP 20
cap binding protein 20
CIP
calf intestine phosphatase
cm
Zentimeter
cps
counts per second
Crm1
chromosome region maintenance 1
d
Tage
Da
Dalton [g/mol]
ddH2O
bidestilliertes Wasser
ddNTP
Didesoxynukleotidtriphosphat
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dsDNA
doppelsträngige DNA
DTT
Dithiothreitol
E. coli
Escherichia coli
EDTA
N, N, N´, N´ Ethylendiamintetraactetat
Abkürzungsverzeichnis
113
eIF4E
eukaryotischer Initiationsfaktor 4E
et al.
et altera
EtOH
Ethanol
gamma
G
Guanin
GSH
reduziertes Glutathion
GST
Glutathion-S-Transferase
GTP
Guanosintriphosphat
h
Stunden
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
H. sapiens
Homo sapiens
IMAC
Ion-Metal-Affinity-Chromatography
Imp
Importin
IPTG
Isopropyl- -D-isothiogalactosid
k
kilo (als präfix)
kb
Kilobasen
Wellenlänge [nm]
LB
Luria Bertani
mikro (als Präfix)
m
milli (als präfix)
M
Molarität
m2,2,7G
N7-Methyl-N2,2-Dimethylguanosin
m7G
N7-Methylguanosin
mAU
Milliabsorptionseinheiten
M. musculus
Mus musculus
mRNA
Messenger RNA
MTase
Methyltransferase
MW
Molekulargewicht [g/mol]
n
nano (als Präfix)
NPC
nuclear pore complex, Kernporenkomplex
OD
Optische Dichte
PBS
Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR
Polymerasekettenreaktion
Abkürzungsverzeichnis
114
PHAX
Phosphorylated adapter for RNA export
PIMT
PRIP-interacting protein with methyltransferase domain
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
prä-mRNA
mRNA-Vorläufer
PRIP
peroxisome proliferator-activated receptor interacting protein
Ran
Ras-related nuclear antigen
RanBP
Ran binding protein
RanGAP
Ran GTPase activating protein
RanGEF
Ran guanine nucleotide exchange factor
RNA
Ribonukleinsäure
rRNA
ribosomal RNA
SAHcy
S-Adenosylhomocystein
S. cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
SDS
Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
sl
spliced leader
Sm
Steven Miller
SMN
survival of motor neuron
snRNA
small nuclear RNA
snRNP
small nuclear Ribonucleoprotein
SPN1
Snurportin 1
Taq
Thermus aquaticus
TBE
Tris-Borsäure-EDTA-Puffer
TEMED
N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin
Tgs1
Trimethylguaninsynthase 1
Tm
Schmelztemperatur
Tris
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
tRNA
transfer RNA
U
Unit (Einheit der Enzymaktivität)
U snRNP
Uridinrich small nuclear ribonucleoprotein
UV
Ultraviolett
V
Volumen
vgl.
vergleiche
Abkürzungsverzeichnis
115
v/v
Volumenprozent (volume per volume)
w/v
Gewichtsprozent (weight per volume)
X. laevis
Xenopus laevis
xg
Vielfaches der Erdbeschleunigung (g = 9,81 m/s2)
z.B.
zum Beispiel
molarer Extinktionskoeffizient [M-1 cm-1]
Danksagung
116
9 Danksagung
Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner möchte ich für die interessante Aufgabenstellung und die
Kompetenz bei fachlichen Fragen und theoretischen Problemen danken.
Herrn Prof. Dr. Oliver Einsle danke ich sehr herzlich für die Übernahme des Korreferates.
Dr. Achim Dickmanns bin ich für die mir entgegengebrachte Diskussionsbereitschaft,
Motivation und abschließende Durchsicht der Arbeit sehr dankbar.
Dr. Markus Rudolf möchte ich für zahlreiche Hilfestellungen im theoretischen und
praktischen Bereich, vor allem im Bezug auf die Durchführung der HPLC und des
Aktivitätstests, danken.
Frau Dr. Anja Strasser bin ich sehr dankbar für die großartige Betreuung der Diplomarbeit,
sowie die dem Projekt (auch in ungünstigen Momenten) entgegengebrachte Begeisterung
und ihrem unerschöpflichen Ideenreichtum. Weiterhin danke ich ihr, wie auch Daniel
Wohlwend und Denis Kudlinzki für die kritische Durchsicht der Arbeit und zahlreiche
Diskussionen, Anregungen, Hilfestellungen, Kaffeepausen und lustige Abende.
Utz Fischer danke ich für die Bereitstellung der klonierten Vektoren mit PIMT und der
Methyltransferase-Domäne.
Meiner ganzen Familie und im besonderen meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht
haben, bin ich für die ständige Unterstützung und Geduld sehr dankbar.
Christine Kunze möchte ich an dieser Stelle ganz besonders für den emotionalen Beistand
in weniger erfolgreichen Momenten und unzählige schöne Tage danken.