In dieser Arbeit wird gezeigt, dass ein doppelter Basenaustausch an

Züchtungskunde, 76, (5) S. 381– 383, 2004, ISSN 0044-5401
© Eugen Ulmer Verlag GmbH & Co., Stuttgart
Kurzfassungen von Dissertationen aus dem Lehrstuhl für Tierzucht der Technischen Universität München
Genomic characterization of genes encoding diacylglycerol-acyltransferase activity in cattle and swine
ANDREAS WINTER
In dieser Arbeit wird gezeigt, dass ein doppelter Basenaustausch an den Positionen
10433 bzw. 10434 zu einer Änderung der Aminosäurensequenz (Lys232  Ala) im bovinen DGAT1 Gen führt. Diese Änderung ist mit der Variation der Zuchtwerte für den
Milchfettgehalt assoziiert. Damit ist es zum ersten Mal gelungen, einen bekannten QTL
in der Nutztierzucht positionell zu klonieren, d.h. die ursächliche Variante eindeutig auf
molekulargenetischer Ebene nachzuweisen. Das hier gefundene Ergebnis deckt sich mit
dem inzwischen auch von Grisart et al. (2002) festgestellten, die den gleichen Austausch
mit ähnlichen Konsequenzen nachweisen konnten.
Der Milchfettgehalt ist ein wichtiges Leistungsmerkmal in der Milchrinderzucht. Als
quantitatives Merkmal ist es sowohl durch die gemeinsame Wirkung mehrerer Gene als
auch von Umwelteffekten bestimmt. Die genetische Variation stellt das Substrat für die
züchterische Bearbeitung dar. Die Kenntnis der kausalen Gene bzw. Genvarianten auf
Wert bestimmende Merkmale ermöglicht die Einschätzung des genetischen Potentials
einzelner Tiere bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt unabhängig vom Geschlecht.
DGAT1 kodiert das Enzym Diacylglycerol-acyltransferase (EC 2.3.1.20), welches den
letzten Schritt der Triglyceridsynthese katalysiert. Dieser funktionelle Zusammenhang
sowie die Tatsache, dass DGAT1 ‚knock out‘ Mäuse keine Milch produzierten, machen
DGAT1 zu einem höchst interessanten Kandidatengen.
Die systematische Suche einer bovinen BAC Bank führte zu vier BAC Klonen, die
DGAT1 enthielten. Mit Hilfe einer durchgeführten physischen Kartierung wurde die chromosomale Lage von DGAT1 am zentromeren Ende des Rinderchromosoms 14 bestimmt.
Verschiedene Arbeitsgruppen hatten schon vorher mit einer hohen Wahrscheinlichkeit
einen QTL für den Milchfettgehalt im Bereich dieser Chromosomenregion postuliert. Als
Voraussetzung für das weitere Vorgehen wurden die Basensequenz und Genstruktur des
bovinen DGAT1 Gens ermittelt. Die kodierende Region erstreckt sich über 8.7 kb, und
das Genprodukt ist ein Protein bestehend aus etwa 490 Aminosäuren. Die Sequenzierung
ergab 21 Einzelbasenaustausche (SNPs) und eine Reihe von repetetiven Sequenzen mit
einer variierenden Anzahl an Wiederholungen (VNTR).
Für eine Assoziationsstudie wurden Bullen verwendet, die entweder sehr hohe oder
sehr niedrige Zuchtwerte für den Milchfettgehalt aufwiesen. Die untersuchten Bullen
entstammten den Rassen Deutsche Holstein (n: 2 x 32), Deutsches Fleckvieh (n: 2 x 32)
und Deutsches Braunvieh (n: 2 x 20). Allelfrequenzschätzungen basierend auf den Sequenzprofilen gepoolter DNA ergaben signifikante Assoziationen zwischen den meisten
der SNPs und den Zuchtwerten für den Milchfettgehalt. Einer der interessanten Polymorphismen im Exon 8 bewirkt einen Aminosäurenaustausch von Lysin nach Alanin an der
Position 232. Die Lysinvariante war in allen Rassen mit einem hohen Milchfettgehalt, die
Alaninvariante mit einem niedrigen Milchfettgehalt assoziiert ( = 0.001 für Holstein
und Fleckvieh,  = 0.05 für Braunvieh). Zwei Bullenväter eines Fleckviehmaterials, die
sich bei der QTL Kartierung als heterozygot herausstellten (Qq), waren auch am Austausch Lys232  Ala heterozygot, während 14 Bullen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit
den QTL Genotyp qq aufwiesen, auch homozygot für das Alanin kodierende Allel waren. Allerdings besaßen beim Fleckvieh nicht alle Bullen mit einem hohen Zuchtwert das
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Dissertationen
Lysin232 Allel, was auch für das Braunvieh zutrifft, bei dem nur zwei von 20 Bullen das
Lysin232 Allel aufwiesen. Beide Rassen hatten eine deutlich niedrigere Frequenz für das
Lysin232 Allel (7 % bzw. 2 %) als die Holsteinrasse (34 %). Diese Befunde decken sich mit
dem in der Tierzucht für quantitative Merkmale verwendeten polygenen Modell. Lysin
scheint dabei die ältere der beiden Genvarianten zu sein, da dieses Allel in den zusätzlich
untersuchten Bos indicus Rassen fixiert war und auch in den DGAT1 Genbanken anderer Säugetierarten, einschließlich des Menschen, vorkam.
Der mögliche Einwand, dass die gefundene Assoziation möglicherweise ein Artefakt
aufgrund der vorliegenden Populationsstruktur darstellt, ist unwahrscheinlich, da (i) die
Assoziation in allen drei untersuchten Rassen beobachtet wurde, (ii) die Rassengeschichte dies nicht bestätigt und (iii) erste Ergebnisse von Haplotypstudien dem entgegenstehen. Ein stärkeres Argument wider die aufgestellte Hypothese der Kausalität des Lys232
 Ala Austausches könnte sein, dass die beobachtete Assoziation durch ein Kopplungsungleichgewicht mit einer kausalen Mutation in einem gekoppelten Gen bedingt ist oder
andere DGAT1 Varianten wirksam sind.
Um andere Gene im Bereich von DGAT1 auszuschließen, wurde als erster Schritt ein
boviner BAC contig erstellt, der 576 kb der Chromosomenregion in der Umgebung von
DGAT1 abdeckte und 23 Gene enthielt. Annotierte Gene beim Menschen wurden verwendet, um homologe EST Sequences beim Rind zu suchen. Basierend auf diesen bovinen EST Sequenzen wurde mittels PCR die BAC Bank durchsucht und damit Gene
innerhalb des BAC contigs kartiert. 18 BAC Klone wurden von den Enden her sequenziert, und die darin enthaltenen Gene wurden zum Teil sequenziert und auf Sequenzvarianten untersucht. Die SNPs in den benachbarten Genen und in den BAC Enden wurden
genotypisiert und ermöglichen nun die Ableitung von Haplotypen für ein strukturiertes
Familienmaterial zur Untersuchung von Kopplungsungleichgewichten. Um die Effizienz
der SNP Genotypisierung zu steigern, wurde ein multiplex ‚single base extension (SBE)‘
Ansatz optimiert. Zudem wurden bovine BAC Klone für die weiteren Mitglieder der
DGAT Genfamilie DGAT2, DC2 and DC5 isoliert. Diese Gene wurden physisch auf den
Rinderchromosomen 15q23-25, 2q42-44 and 15q23-25 kartiert. Alle Exone und teilweise auch die Introne wurden sequenziert. Die bovinen DGAT2, DC2 und DC5 Gene
kodieren Proteine mit 61, 334 und 284 Aminosäuren. Sequenzvarianten wurden in allen
drei Genen nachgewiesen. Bei den über gepoolte DNA ermittelten Allelfrequenzen konnte keine signifikante Assoziation mit den Zuchtwerten für den Fettgehalt festgestellt
werden. DC2 und DC5 wurden als Gene identifiziert, die Monoacylglycerol-acyltransferase 1 (MGAT1) und Monoacylglycerol-acyltransferase 2 (MGAT2) kodieren.
Für die Gene DGAT1, DGAT2, DC5 and DC7 wurden außerdem BAC Klone des
Schweins isoliert. Die Gene wurden physisch kartiert; sie liegen auf den porcinen Chromosomen 4pter-p15, 9pter-p23, 9pter-p23 und 3pter-p15.
Das bovine DGAT2 und die porcinen DGAT2 sowie DC5 (MGAT2) Gene sind Kandidatengene des Fettansatzes für QTL beim Schwein, die im Bereich dieser Chromosomenregionen kartiert wurden.
Merkmale der Milchleistung von Kühen können mit Hilfe der Nutzung von DGAT1
Varianten bei der Selektion verbessert werden und stellen einen ersten Ansatz für genunterstützte Selektionsverfahren dar. Die Geneffekte der Milchleistungsmerkmale waren
allerdings negativ korreliert: Im Gegensatz zur Alanin232 Variante erhöht die Lysin232 Variante die Milchfettmenge, senkt aber die Milchprotein- und die Milchmenge.
Es kann vermutet werden, dass in naher Zukunft weitere Gene mit unterschiedlichen
Wirkungen auf wirtschaftlich bedeutende Merkmale zur Verfügung stehen. Die optimale Nutzung dieser molekulargenetischen Kenntnisse stellt eine neue Herausforderung für
die Zuchtplanung dar.
TU München, Weihenstephan 2003
Dissertationen
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Einfluss des Major Histocompatibility-Complex (MHC) auf die Nematodenanfälligkeit beim Schaf
PETRA FEICHTLBAUER-HUBER
Infektionen mit Magendarm-Nematoden wie O. circumcincta führen in der Schafhaltung
zu erheblichen Produktionsverlusten. Die sinkende Effizienz bei der Anwendung von
Anthelmintika zwingt die Züchter zur Entwicklung alternativer Kontrollstrategien wie
zum Beispiel der selektiven Zucht auf Resistenz.
Die Resistenz gegen Nematodeninfektionen ist genetisch beeinflußt. Als Maß der Resistenz dient die Eizahl im Kot. Da MHC-Gene bei der Immunabwehr gegen Parasiteninfektionen eine wichtige Rolle spielen, wurden beim Scottish Blackface Schaf Assoziationsanalysen zwischen Markern, die im sowie ausserhalb des MHC lokalisiert sind, und
der Eizahl von O. circumcincta durchgeführt.
Das Exon 2 des Hauptkandidatengens am DRB1-Locus wurde mittels allelspezifischer
Oligohybridisierung typisiert. Für die übrigen Marker wurde eine Mikrosatellitentypisierung durchgeführt.
Mit der ABI PRISM 377 DNA Sequencer unterstützten „Reference strand mediated
conformation analysis“ (RSCA) wurde erstmals ein System zur hochauflösenden Typisierung des zweiten Exons oviner DQB-Allele etabliert. Die dazu verwendeten Allele
wurden amplifiziert, kloniert und sequenziert. Anhand von Familientypisierungen und
DRB1-DQB-Haplotypenbildung konnte die Zuverlässigkeit dieses Systems bestätigt
werden.
Zur Assoziationsanalyse wurden zwei lineare Modelle verwendet. Das Regressionsmodell berücksichtigt additive Alleleffekte. Zum Test auf die Abweichung von additiven
Alleleffekten, Dominanz und Überdominanz wurden beim zweiten Modell die Genotypen direkt berücksichtigt.
Bei der Regressionsanalyse waren die DRB1-Allele D, F, G2 und T signifikant mit der
Reduktion der Eizahl assoziiert. Anhand der Analysen mit dem zweiten Modell wurde
gezeigt, daß die heterozygoten Genotypen IC, ID, IF und IL im Vergleich zu den dazugehörigen Homozygoten mit einer geringeren Eizahl assoziiert sind. Der Test auf Abweichung dieser Genotypen von additiven Alleleffekten war mit p < 0,006 hochsignifikant.
Dieses Resultat ist auf die dominante oder überdominante Wirkung der Heterozygoten
am DRB1-Locus zurückzuführen. Da MHC-Heterozygote ein größeres Repertoire von
parasitären Antigenen präsentieren, sind sie vor Infektionskrankheiten besser geschützt.
Alle anderen Marker zeigten keinen signifikanten Einfluß auf die Eizahl.
TU München, Weihenstephan 2002