Ortmann MAP

Erfahrungen mit der Untersuchung von Einzel- und Sammelmilchproben auf
Antikörper gegen Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (M. ptb) im
SVANOVIR®-ELISA
GUDRUN ORTMANN1, MARTIN BEYERBACH², LOTHAR KREIENBROCK²
GERALD-FRIEDRICH GERLACH³, MATTHIAS HOMUTH4
1
Landesamt für Verbraucherschutz und Landwirtschaft, Laborbereich Frankfurt/Oder
²Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung,
Tierärztliche Hochschule Hannover
³Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin,
Tierärztliche Hochschule Hannover
4
Gesellschaft für Innovative Veterinärdiagnostik, Tierärztliche Hochschule Hannover
Einleitung
Die Paratuberkulose ist eine durch Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis
hervorgerufene, in Deutschland meldepflichtige, Tierkrankheit.
Durch M. ptb wird eine chronische granulomatöse, nicht therapierbare Enteritis
hervorgerufen. Die Infektion erfolgt in den ersten Lebensmonaten. Infizierte Rinder
zeigen keine klinischen Krankheitserscheinungen und bleiben so über Jahre im
Bestand als Keimträger unerkannt. Sie scheiden den Erreger intermittierend über Kot
und Milch aus, und sind damit ständige Infektionsherde im Bestand. In Deutschland
stellt die Paratuberkulose ein zunehmendes Problem dar, besonders in den Milch
produzierenden Betrieben entstehen durch erkrankte Tiere erhebliche wirtschaftliche
Schäden
Material und Methoden
Die Milchuntersuchung auf Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis wurde im
Oktober 2001 im LVL Frankfurt (Oder) begonnen.
Aus zwei Landkreisen des Landes Brandenburgs wurden insgesamt 10.900 Einzelmilchproben, die zur routinemäßigen Bestandsuntersuchung auf Leukose und
Brucellose eingesandt wurden, für die Paratuberkuloseuntersuchung genutzt.
Die Einzelmilchproben wurden dem Landesamt für Verbraucherschutz und
Landwirtschaft, Laborbereich Frankfurt/Oder durch den Landeskontrollverband
Brandenburg, einmal wöchentlich nach Fertigstellung seiner Untersuchungen im
gekühlten Zustand übergeben.
Da die meisten Milchkuh haltenden Bestände mehr als 100 Tiere besitzen, konnte in
Brandenburg die Tankmilchuntersuchung für anzeigepflichtige Tierseuchen nicht
angewendet werden.
Aus diesem Grund wurde seit 1995 die Milchuntersuchung über Einzelmilchproben,
die im Labor zu Pools zusammengestellt wurden, eingeführt.
Erstellung eines Laborpools:
Für die ELISA-Untersuchungen wurden nur Einzelmilchproben genommen, die nicht
sichtlich verändert waren.
Der Laborpool enthält bis zu 50 Einzelmilchproben. Von jeder Einzelmilchprobe
wurden mit einer Pipette möglichst fettfrei 500µl entnommen und in ein Poolgefäß
1
gegeben. Nach Fertigstellung aller Laborpools wurden diese 5 Minuten mit 3000 rpm
zentrifugiert. Der entstandene Sahnering wurde dann mit Wasserstrahlpumpe
abgesaugt. Die Laborpools wurden ein zweites Mal zentrifugiert und der Rahm
wiederum mit der Wasserstrahlpumpe entfernt.
Von Einzelmilchproben, die als Einzelansatz im ELISA untersucht wurden, wurden je
10ml in ein A-Röhrchen gegossen und wie der Laborpool aufgearbeitet.
Wichtig für das Untersuchungsmaterial Milch im Antikörper-ELISA ist, dass
das Fett zuvor entfernt werden muß.
Für die Paratuberkuloseuntersuchung nutzten wir die Laborpools, die für die
Brucellose- und Leukoseuntersuchung hergestellt wurden. Weiterhin wurden alle
10.900 Eizelmilchproben für den Einzelansatz aufgearbeitet und bei -20°C für die
weitere Untersuchung im Frühjahr 2002 gelagert.
1. Untersuchung von Sammelmilchproben
Die 10.900 Einzelmilchproben stammten aus 58 Beständen und wurden zu 248
Laborpools zusammengestellt.
Der kleinste Bestand sandte 4 und der größte 420 Einzelmilchproben ein.
Gepoolt wurden nur Einzelmilchproben innerhalb eines Bestandes. Ein Laborpool
enthielt bis zu 50 Einzelmilchproben.
Alle 248 Laborpools wurden im Doppelansatz mittels SVANOVIR®-ELISA
untersucht.
In der Tierärztlichen Hochschule Hannover erfolgte aus den ermittelten Daten der
Laborpools, die Einteilung der untersuchten Bestände zunächst (weil später nur 3
Kategorien, wegen zu geringer Differenz bei den OD-Werten >als inter- und intraAssy-Variation) in die Kategorien 1 bis 5.
Dabei zeigten die OD-Werte in Kategorie 1 die niedrigsten und in Kategorie 5 die
höchsten Werte auf.
Die Ergebnisse der Poolmilchuntersuchung zeigten, daß im SVANOVIR®-ELISA
Antikörper gegen Paratuberkulose angezeigt wurden.
Die insgesamt 58 untersuchten Bestände wurden wie folgt eingeteilt:
19
28
7
3
1
Kategorie
Kategorie
Kategorie
Kategorie
Kategorie
1
2
3
4
5
2. Untersuchung von Einzelmilchproben
Nach der Einteilung der Bestände in 5 Kategorien wurden die Bestände für die
Einzelmilchuntersuchung festgelegt. Die Einzelmilchproben wurden ebenfalls mittels
SVANOVIR®-ELISA im Doppelansatz untersucht.
Dabei wurden alle Bestände, die in Kategorie 3, 4 und 5 eingestuft wurden, mit
allen eingesandten Einzelmilchproben untersucht.
In der Kategorie 1 wurden 9 und in der Kategorie 2 13 Bestände untersucht, da
diese Anzahl für die Statistik ausreichend war. Aus diesen Beständen mußten nicht
2
alle eingesandten Proben je Einsender untersucht werden, es reichten 200
Einzelzelmilchproben pro Bestand.
Ergebnisse
Beurteilung der untersuchten Einzelmilchproben im SVANOVIR®-ELISA auf
Antikörper gegen M. ptb:
Berechnung der Einzelmilchproben erfolgte nach Vorschrift des Testherstellers
Probenwert (%)
Beurteilung
< 26
27 – 56
> 57
negati v
fraglich
positv
In die Untersuchung gelangten insgesamt 33 Bestände mit 5.069 Einzelmilchproben.
Tabelle1: Ergebnisse der Paratuberkuloseuntersuchung von Einzelmilchproben der
einzelnen Kategorien
Kategorie
Anzahl
unters.
Bestände
1
9
2
13
3
7
4
5
mit insgs.
zu unters.
Einzelmilchproben
negativ
positiv
zweifelhaft
nicht
untersucht
1.130
(1.464**)
976
(86,4%)
25
(2,2%)
69
(6,1%)
60
(5,3%)
1.760
(2.149**)
1.455
(82,7%)
113
(6,4%)
152
(8,6%)
40
(2,3%)
1.646
1.249
(75,9%)
119
(7,2%)
224
(13,6%)
54
(3,3%)
3
515
381
(73,9%)
60
(11,7%)
55
(10,7%)
19
(3,7%)
1
18
11
(61,1%)
4
(22,2%)
3
(16,7%)
0
* Proben durch Gefrieren verändert
** Gesamtzahl der eingesandten Proben
Die Untersuchung der Einzelmilchproben zeigte deutlich, dass in der Kategorie1 die
meisten negativen Einzelmilchproben mit 86,4% und die wenigsten positiven Proben
mit 2,2% sowie zweifelhaften mit 6,1% ermittelt werden konnten.
Demgegenüber wies die Kategorie 5 die wenigsten negativen mit 61,1% aber die
häufigsten positiven mit 22,2% und fraglichen mit 16,7% auf.
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Alle Daten der Einzelmilchuntersuchungen wurden, im Institut für Biometrie,
Epidemiologie und Informationsverarbeitung an der
Tierärztliche Hochschule
Hannover, statistisch ausgewertet und damit der SVANOVIR®ParatuberkuloseELISA auch für die Sammelmilchproben validiert.
Die Untersuchungsergebnisse erlauben
eine Einteilung von Sammel-/Tankmilchproben in Gefährdungsklassen.
Diskussion:
Der SVANOVIR®-ELISA ist für die Untersuchung von
Sammelmilchproben (bis zu 50 Einzelmilchproben je Pool) geeignet.
Einzel-
und
Mit Hilfe des ELISA kann durch Berechnung des prozentualen Probenwertes eine
quantitative Aussage über den Antikörpergehalt der Proben im Vergleich zu den
Kontrollwerten gemacht werden. Die Einzelmilchproben können entsprechend
positiv, zweifelhaft oder negativ eingestuft werden.
Im Fall der Untersuchung von Sammelmilchproben kann die Prävalenz des
untersuchten Betriebes geschätzt werden.
Einteilung der Sammelmilchprobe in Gefährdungsklassen:
Probenwert(%)
Kategorie
<5
5 – 15
>15
derzeit unbedenklich
überwachungsempfohlen
hochprävalent
Für die Statuserhebung eines Rinderbestandes ist Poolmilchuntersuchung (bis zu 50
Einzelmilchenproben je Pool) im Routinelabor ein schnell durchzuführendes
Verfahren, besonders wenn diese Milchproben zur Bestandsuntersuchung auf
Leukose, Brucellose, BHV1 oder BVD eingesandt werden.
Die Poolmilchuntersuchung auf Paratuberkuloseantikörper mittels ELISA ist
preisgünstig, was aus heutiger Sicht von großem Vorteil ist.
Eine Einteilung der untersuchten Bestände in verschiedene Gefährdungsstufen (in
die 3 Kategorien) ermöglicht eine objektive Einteilung aufgrund des Gefährdungspotentials im Hinblick auf eine eventuelle Restriktion bei der Milchabgabe.
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