Laborgemeinschaft 1

Laborgemeinschaft
Institut für medizinische & molekulare
Diagnostik AG. Zürich
Helicobacter pylori - Clarithromycin-Resistenz
Info
Nachweis mittels PCR und Sequenzierung
1. Bedeutung
Die Australier J.R. Warren und B.J. Marshall wurden 2005 "for their discovery of the bacterium Helicobacter
pylori and its role in gastritis and peptic ulcer disease" mit dem Nobelpreis geehrt [1]. Sie haben 1983 den
Mikroorganismus als erste kultiviert [1]. 1994 empfahl das NIH, alle Patienten mit peptischen Ulcera und
gesicherter Helicobacter pylori Infektion antibiotisch zu behandeln [3] und die International Agency for Research
on Cancer Working Group der WHO erklärte Helicobacter pylori zum Karzinogen [4].
Die kulturellen Ansprüche des Erregers erschweren die für eine gezielte antibakterielle Therapie
wünschenswerte Resistenzprüfung, so wird denn eine empirische, auf der klinischen Erfolgsrate basierende
empfohlen. Primär soll blind mit Amoxicillin und Clarithromycin, kombiniert mit einem Protonenpumpenhemmer
behandelt werden. Dabei sei die regionale Resistenzlage mit zu berücksichtigen [5]. Die zahlreichen Studien
erlauben aber höchstens eine Einschätzung der epidemiologischen Situation [Übersicht in 6], denn systematische
Resistenzprüfungen mit einheitlichen Methoden an einer grossen Zahl von Isolaten sind sehr selten. Im Rahmen
einer solchen Studie wurden 1998 in 17 europäischen Ländern an 22 Zentren 1274 Isolate mit dem Epsilon-Test
untersucht. Man fand bei Erwachsenen durchschnittlich 9.9% primär Clarithromycin resistente (ClaR) Stämme mit
signifikanten Unterschieden in der Prävalenz zwischen Nord- (4.2%), Zentral-/Ost- (9.3%) und Südeuropa (18%)
[7]. Für die Schweiz sind auch einige Zahlen bekannt: am Kantonsspital Basel erwiesen sich 1994 3% und im Jahr
2000 7.5% der Kulturen als ClaR [8,9], im Kanton Tessin 12% im Jahr 2000 [10] und in der 2005 publizierten Arbeit
aus dem Raum Zürich ist von 22% ClaR die Rede [11].
Seitdem die Experten die sogenannt "nicht invasiven Teste" als dem diagnostischen Goldstandard ebenbürtig
erklärt haben [5], erfolgt die Behandlung der Infektion oft nicht mehr durch den Spezialisten, der die Diagnose
mittels Gastroduodenoskopie und Biopsie stellt, sondern beim Hausarzt. Die Frage, ob dadurch nicht etwas
grosszügig Eradikationstherapien verordnet werden, ist berechtigt [10]. Jedenfalls werden zunehmend klinische
Misserfolge beobachtet. Dazu trägt zur Hauptsache die primäre ClaR bei, deren Prävalenz tendenziell ansteigt. Es
ist erwiesen, dass der Prozentsatz an ClaR Stämmen bei Patienten, die ein- oder mehrmals behandelt wurden,
signifikant höher liegt als bei nicht behandelten, nämlich bei 50 bis >80% [6,7,10,12].
1996 wurde bekannt, dass Punktmutationen im 23S rRNA Gen mit ClaR assoziiert sind [13]. Inzwischen sind
diverse Protokolle publiziert, die es ermöglichen, die ClaR molekularbiologisch direkt an der Probe zu bestimmen
[Referenzen in 6].
2. Nachweismethoden
Die bis heute beschriebenen, für ClaR verantwortlichen Mutationen liegen im 23S rRNA Gen, das für die 50S
Untereinheit der Ribosomen in der Nähe des Peptidyltransferase-Zentrums codiert, dem Angriffspunkt von
Clarithromycin. Die Punktmutationen führen zur verminderten Bindung des Makrolids und damit zur Resistenz.
Auf der Basis publizierter Daten haben wir im Rahmen einer Diplomarbeit eine PCR entwickelt, mit der der
betreffende Abschnitt in dieser Region amplifiziert wird. Der Nachweis der Mutationen erfolgt danach durch
Sequenzierung des Produkts und Vergleich der Sequenz mit derjenigen des Referenzstamms U27270 [13,14,15,16].
66 asservierte, für DNA von Helicobacter pylori bekannt positive Proben wurden auf
ClaR untersucht, 26 Biopsien und 40 Stuhlproben. Ob sie von nicht oder (erfolglos) therapierten Patienten
stammten, war nicht bekannt.
WebSite www.lg1.ch
Konsilium
All Content Copyright© LG1/IMD Okt. 2006/190506
1
25 der 26 Biopsien ergaben ein mit Erfolg sequenzierbares Amplifikat (Sensitivität 96%). Von den lediglich 24 aus
40 Stuhlproben erzielten PCR Produkten waren dann nur 17 Sequenzen auswertbar. Demnach ist diese Methode
zum Nachweis von ClaR in Stuhlproben nicht geeignet, da in weniger als 50% mit einem brauchbaren Resultat
gerechnet werden kann. Die Spezifität liegt bei 100%, weil nur Proben auf ClaR getestet werden, in denen
vorgängig Helicobacter pylori DNA nachgewiesen wurde.
In 12 der schliesslich 42 verwertbaren Proben wurden ClaR Mutationen gefunden (28%), und zwar in 5 (12%) die
weltweit häufigsten in Position 2143 und 2142 (AÆG) und in 6 die Mutation T2182C (14%). In 1 Probe (2%) lagen
zwei Mutationen vor, nämlich A2143G und T2182C. T2182C wurde erst kürzlich in Korea entdeckt [17]. Diese wurde
mit den in der westlichen Welt bislang verwendeten PCR Protokollen nicht erfasst, ihre Bedeutung wird noch
diskutiert [18]. Davon abgesehen, enthalten noch immer 14% unserer Proben ClaR Stämme. Bei einer kürzlich im
Kanton Aargau mit molekular-biologischen Methoden durchgeführten Untersuchung, die nicht auf den Nachweis
von T2182C angelegt waren, wurden von 130 Magenbiopsien ClaR Mutationen in 9% der Proben von
unbehandelten und in 90% von behandelten Patienten mit persistierender Infektion gefunden [19].
Was die anderen für die empirische Therapie vorgeschlagenen Antibiotica anbetrifft: die Resistenz gegenüber
Amoxicillin liegt weltweit bei 0 bis <1%. Metronidazol resistent sind in Europa 30 bis >50% der Stämme [12,
Übersicht in 6]. In unserem Land sind 25 bis 31% primär resistent [8,9,10], Metronidazol sollte daher nicht zur
Therapie von Helicobacter pylori Infektionen eingesetzt werden [19].
Unsere Methode beansprucht 1-2 Tage. ClaR Populationen werden erfasst, auch wenn sie in der Probe mit
sensiblen gemischt vorliegen. Die Koexistenz von mutanten und Wildtyp-Stämmen ist bekannt und nicht selten,
was auch die Aargauer Forscher wieder bestätigten [19]. Es ist zu hoffen, dass die bereits verfügbaren und
bestimmt noch zu erwartenden Möglichkeiten der molekularen Resistenzprüfung dazu führen werden, die derzeit
gängige "Test und Therapie"-Strategie zu überarbeiten, damit die Infektion gezielt behandelt wird, wie dies den
Regeln der medizinisch mikrobiologischen Kunst entspricht.
3. Untersuchungsmaterialien
Folgende Materialien sind für die Untersuchung auf ClaR geeignet:
• Biopsien der Schleimhaut von Magen und Duodenum
• Isolate
4. Literatur
1] http://www.nobelprize.org/medicine/laureates/2005/
[2] J.R. Warren, B.J. Marshall. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis.
Lancet 1983, 1:1273-1275.
[3] National Institute of Health 1994. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease.
NIH Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA 1994, 272:65-69.
[4] http://www.inchem.org/documents/iarc/vol61/m61-3.html
[5] P. Malfertheiner, F. Mégraud, C. O’Morain et al. Current concepts in the management of Helicobacter pylori
infection - The Maastricht 2-2000 Consensus Report. Aliment. Pharmacol. Ther. 2002, 16:167-180.
[6] F. Mégraud. H. pylori antibiotic resistance: prevalence, importance, and advances in testing. Gut 2004,
53:1374-1384.
[7] Y. Glupczynski, F. Mégraud, M. Lopez-Brea, L. Andersen. European multicenter survey of in vitro antimicrobial
resistance in Helicobacter pylori. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001, 20:820-823.
[8] F.S. Lehmann, J. Drewe, L. Terracciano, C. Beglinger. Effect of ornidazole and clarithromycin resistance on
eradication of Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 2000, 14:305-309.
[9] C.C. Sieber, R. Frei, C. Beglinger, S. Mossi, J. Binek, H. Schaufelberger, R. Fried, G. Stalder. Helicobacter pylori
resistance against metronidazol in Switzerland: implications for eradication therapy? Schweiz. Med. Wchschr.
1994, 124:1381-1384.
[10] N. Maggi-Solcà, C. Valsangiacomo, J.-C. Piffaretti. Prevalence of Helicobacter pylori resistant strains in the
southern part of Switzerland. Clin. Microbiol. Infect. 2000, 6:38-40.
[11] B. Yuen, R. Zbinden, M. Fried, P. Bauernfeind, M. Bernardi. Cultural recovery and determination of antimicrobial
susceptibility in Helicobacter pylori by using commercial transport and isolation media. Infection 2005, 33:77-81.
[12] Nationales Referenzzentrum für Helicobacter. Epidemiologisches Bulletin 2005, Nr. 24.
http://www.ukl.uni-freiburg.de/microbio/nrz-helico/
[13] J. Versalovic, D. Shortridge, K. Kibler, M.V. Griffy, J. Beyer, R.K. Flamm, S.K. Tanaka, D.Y. Graham, M.F. Go.
Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents
Chemother. 1996, 40:477-480.
[14] M. Matsumura, Y. Hikiba, K. Ogura, G. Togo, I. Tsukuda, K. Ushikawa, Y. Shiratori, M. Omata. Rapid detection of
mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori that confers resistance to clarithromycin treatment to the
bacterium. J. Clin. Microbiol. 2001, 39:691-695.
[15] D.E. Taylor, Z. Ge, D. Purych, T. Lo, K. Hiratsuka. Cloning and sequence analysis of two copies of a 23S rRNA
WebSite www.lg1.ch
Konsilium
All Content Copyright© LG1/IMD Okt. 2006/190506
2