Wirkung von Röntgenstrahlen und schnellen Elektronen auf
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INSTITUT F Ü RFILM U N D BILD IN WISSENSCHAFT U N D UNTERRICHT H O C H S C H U L F I L M C 616/1952 Aus der U n i v e r s i t ä t s - F r a u e n k l i n i k Tübingen (Prof. D r . W . BICKENBACH) Wirkung von Röntgenstrahlen und schnellen Elektronen auf Gewebekulturen (Hühnerherzfibroblasten) Von D r . HENRIETTE GÄRTNER (Mit 2 Abbildungen) Aus der Universitäts-Frauenklinik Tübingen (Prof. D r . W . BICKENBACH) Wirkung von Röntgenstrahlen und schnellen Elektronen auf Gewebekulturen (Hühnerherzfibroblasten) V o n D r . HENRIETTE GÄRTNER (Mit 2 Abbildungen) Die E i n w i r k u n g von R ö n t g e n s t r a h l e n (Spannung 8 7 k V ) und schnellen E l e k t r o n e n (Beschleunigung 5 M e V ) unter angeglichener Dosisleistung von 1 0 0 0 r / M i n . u n d einer einmaligen Gesamtdosis v o n 4 0 0 0 r wird unmittelbar nach der Bestrahlung an Zellen in Mitose und im Ruhestadium mit Hilfe des Phasenkontrastverfahrens in Zeitrafferaufnahmen dargestellt. Die für den P r i m ä r e f f e k t charakteristischen Abweichungen w ä h r e n d der Teilung konnten f ü r beide Strahlenarten als morphologisch gleichwertig festgestellt werden. Sie manifestieren sich a m deutlichsten in der B r ü c k e n b i l d u n g w ä h r e n d der A n a phase u n d Telophase. I m Gegensatz dazu tritt eine verschiedenartige W i r k u n g im Verhalten der Ruhezellen zutage. Schon w ä h r e n d der Zeitspanne des P r i m ä r e f f e k t s gehen nach R ö n t g e n bestrahlung Ruhezellen in g r ö ß e r e r A n z a h l spontan zugrunde, w ä h r e n d nach Elektronenbestrahlung die S c h ä d i g u n g in der Interphase weitaus geringer ist. Der F i l m ist f ü r den Hochschulunterricht bestimmt. D i e Schmalfilmkopie (16 m m - Stummfilm) hat eine L ä n g e von 134 m entsprechend 12 % Minuten V o r f ü h r d a u e r bei einer V o r f ü h r geschwindigkeit v o n 2 4 B / s . I. Allgemeine Vorbemerkungen Die G e w e b e z ü c h t u n g wurde, ausgehend v o n den grundlegenden Versuchen v o n H A R B I S O N (1907) u n d C A R R E L (1911) zu einer bio- logischen Arbeitsmethode entwickelt, die es ermöglicht, Gewebe i n vitro am Leben z u erhalten u n d ihre Zellen zur Vermehrung zu bringen. Derartige Gewebekulturen wachsen unter vereinfachten, kontrollierbaren Bedingungen u n d stellen nach einigen Passagen 3 R e i n k u l t u r e n der verwendeten Grundzellart dar. Sie sind zur Analyse v o n W a c h s t u m s v o r g ä n g e n sehr geeignet und erlauben, die E i n w i r k u n g chemischer u n d physikalischer N o x e n auf die Zellen zu untersuchen. F ü r diesen F i l m dienten R e i n k u l t u r e n von embryonalen H ü h n e r herzmuskelzellen, die Herzen von 8 — 9 Tage b e b r ü t e t e n H ü h n e r embryonen entstammten, als Testobjekte. D i e E x p l a n t a t e wurden unter Zusatz von H ü h n e r e m b r y o n a l e x t r a k t u n d H ü h n e r p l a s m a g e z ü c h t e t u n d alle 4 8 Stunden mit neuem N ä h r m e d i u m versehen. D i e Zeitrafferaufnahmen der bestrahlten u n d unbestrahlten K u l turen wurden jeweils i n der 5. Passage nach 2 4 s t ü n d i g e r B e b r ü t u n g begonnen. Die Beobachtung der lebenden Zellen erfolgte durch das Phasenkontrastverfahren. M i t Hilfe dieser Methode lassen sich alle wesentlichen Formbestandteile der Zelle ohne F ä r b u n g darstellen u n d die F o r m v e r ä n d e r u n g e n und die V o r g ä n g e bei der Zellteilung laufend beobachten. D i e Zellteilung läuft i n charakteristischen Phasen ab. I n der Prophase k o m m t es zur Spiralisierung der von diesem Zeitpunkt ab gut sichtbaren Chromosomen bei gleichzeitiger Auflösung der K e r n k ö r p e r chen. I n der darauffolgenden Metaphase erfolgt die Ordnung der Chromosomen bis zur teilungsgerechten Lagerung i n der Ä q u a t o r i a l e b e n e m i t gleichzeitiger Ausbildung der Tochterpole u n d der Zugfasern. I n der Anaphase werden die Chromosomen z u den Tochterpolen a u s e i n a n d e r g e f ü h r t . I n der Telophase erfolgt die A b s c h n ü r u n g des Zelleibes. D a m i t sind zwei Tochterzellen entstanden, die w ä h r e n d der nun anschließenden Rekonstruktionsphase durch Entspiralisierung der Chromosomen, B i l d u n g der K e r n m e m b r a n u n d der K e r n k ö r p e r chen den Charakter der Ruhezellen annehmen. — U n t e r zusätzlicher Verwendung der Zeitraff er methode lassen sich diese Wachstums- u n d T e i l u n g s v o r g ä n g e unter normalen u n d abg e ä n d e r t e n Bedingungen ü b e r l ä n g e r e Z e i t r ä u m e verfolgen ). 1 Aufgabe des vorliegenden Filmes war es, Unterschiede i n der biologischen W i r k u n g von R ö n t g e n s t r a h l e n u n d schnellen E l e k tronen einer Elektronenschleuder darzustellen. 1 ) Vgl. H . G Ä B T N E B , Zellteilung in Gewebekulturen (Hühnerherzfibro- blasten). Hochschulnlm C 615 des Instituts f ü r F i l m u n d B i l d , 1952. 4 Göttingen E s ist bekannt, d a ß kurzwellige Strahlungen eine schädigende W i r k u n g auf die Zellen a u s ü b e n . A u f diesem Effekt beruht die Strahlenbehandlung b ö s a r t i g e r Tumoren m i t R ö n t g e n s t r a h l e n und den Gamma-Strahlen des Radiums. Neuerdings eröffnen sich durch die Anwendung der schnellen Elektronen einer Elektronenschleuder neue Wege zu einer wirksamen Karzinombehandlung. Neben der zu vermutenden elektiven Beeinflussung der malignen Zellen ermöglichen diese energiereichen Elektronen infolge ihrer besonderen Absorptionsbedingungen eine gezielte Tiefendosierung und lassen somit eine bessere Schonung des den Tumor umgebenden gesunden Gewebes erhoffen. I n Teilung befindliche Zellen sind besonders strahlenempfindlich. D i e E i n w i r k u n g der kurzwelligen Strahlungen f ü h r t i m F a l l e eines oder mehrerer Treffereignisse i m strahlenempfindlichen Bereich der mitotischen Zelle zu typischen V e r ä n d e r u n g e n , die als P r i m ä r effekt bezeichnet werden. Schon i n der frühen Metaphase k o m m t es z u Verklebungen und Verklumpungen der Chromosomen, die i n der Anaphase und Telophase als sogenannte Brückenbildung in Erscheinung treten. Ü b e r die strahlenbiologische R e a k t i o n der Ruhezellen ist bisher wenig bekannt. E s stand zwar a u ß e r Zweifel, d a ß auch Interphasezellen durch die genannten Strahlenarten geschädigt werden. M a n neigte jedoch z u der Auffassung, d a ß diese p r i m ä r e Strahlens c h ä d i g u n g der Ruhekerne bis z u m Beginn der Zellteilung latent bliebe. I n den diesem F i l m vorausgehenden cytologischen Untersuchungen am fixierten und g e f ä r b t e n P r ä p a r a t ließ sich der statistische N a c h weis erbringen, d a ß nach einer Dosis v o n 4000 r R ö n t g e n s t r a h l e n (Dosisleistung 1000 r/Min.) auch Zellen i n der Interphase spontan zugrunde gehen. N a c h E i n w i r k u n g der gleichen Dosis schneller Elektronen ist dies jedoch nicht der F a l l . Die nekrobiotischen Zellv o r g ä n g e spielen sich hier vorwiegend an den w ä h r e n d der Teilung t ö d l i c h g e s c h ä d i g t e n Zellen ab. Diese Untersuchungen deuteten damit auf einen qualitativen Wirkungsunterschied beider Strahlenarten h i n und ließen eine Ü b e r p r ü f u n g mit Hilfe der Zeitraffermethode w ü n s c h e n s w e r t erscheinen. D i e Arbeiten wurden an der Medizinischen SIEMENS-6 MeV-Elektronenschleuder in Universitätsklinik Erlangen der (Dir.: Prof. D r . K . MATTHES) 5 unter Mitarbeit v o n P r i v . - D o z . D r . F . WACHSMANN d u r c h g e f ü h r t . F ü r die F o r s c h u n g s a u f n a h m e n fand das L E i T Z - F o r s c h u n g s m i k r o s k o p Phasenkontrasteinrichtung Verwendung. H e r r n Prof. D r . ( F i r m a E . LEITZ G . m . b . H . , Wetzlar) sei f ü r die freundliche besonders gedankt. B e i der Herstellung des Ortholuz mit GOTTSCHEWSKI Unterstützung F i l m s s t a n d ein finanzieller B e i t r a g der Deutsch-Schweizerischen Gemeinschaftsproduktion des Instituts für Wissenschaftliche F i l m e E r l a n g e n u n d der K e r n - F i l m A G . Basel zur Verfügung. II. E r l ä u t e r u n g e n z u m F i l m Zellteilung nach Röntgenbestrahlung ) 1 N a c h E i n s t r a h l u n g einer Einzeldosis v o n 4000 r R ö n t g e n s t r a h l e n bei einer Dosisleistung v o n 1000 r / M i n . lassen sich die verschiedenen für den F o r m e n k r e i s des P r i m ä r e f f e k t e s charakteristischen S c h ä d i gungen beobachten. Z u n ä c h s t werden 2 Zellen w ä h r e n d der Teilung gezeigt. D i e rechte der beiden M i t o s e n befand sich w ä h r e n d der Bestrahlung bereits i m S t a d i u m der s p ä t e n Metaphase u n d vermag die begonnene T e i l u n g anscheinend u n b e e i n f l u ß t z u beenden. D i e Nachbarzelle weist jedoch einen schweren Strahlenschaden auf. D i e z u beobachtende V e r k l u m p u n g der Chromosomen f ü h r t zur B r ü c k e n b i l d u n g i n der Anaphase (s. A b b . 1) u n d zur ungleichen Verteilung der A b b . 1. B r ü c k e n b i l d u n g in der Anaphase Die Teilung der rechten Zelle ist nahezu beendet; sie verläuft morphologisch normal 1 ) Die ifwrsif-Überschriften entsprechen den Zwischentiteln i m F i l m . Kernsubstanz auf die Tochterzellen. D i e D u r c h s c h n ü r u n g des Cytoplasmas vollzieht sich regelrecht, jedoch bleibt die C h r o m a t i n b r ü c k e zwischen beiden Tochterzellen bis i n die Rekonstruktionsphase hinein bestehen. (Mikroskopische V e r g r ö ß e r u n g 250fach; Aufnahmedauer 32 M i n u t e n ; Aufnahme mit 1 B i l d pro Sekunde, d . h . Zeitraffung auf /2i )-) 1 1 Die n ä c h s t e Aufnahme wurde 2 M i n u t e n nach Einstrahlung von 4000 r R ö n t g e n s t r a h l e n begonnen. Wiederum sind schwerwiegende morphologische V e r ä n d e r u n g e n m i t V e r k l u m p u n g und B r ü c k e n bildung zu beobachten. D i e Mitose läuft verzögert ab. Z u r P o l wanderung w ä h r e n d der Anaphase w i r d die doppelte Zeit b e n ö t i g t . (Vergr. 380fach; Dauer 24 M i n . ; Zeitraffung auf y . ) 2 4 A u c h die n u n folgende Zelle zeigt die charakteristischen Schädigungsbilder. Ü b e r die zunehmende V e r k l u m p u n g und B r ü c k e n bildung kommt es zwar zur Teilung, als zusätzliches P h ä n o m e n l ä ß t sich jedoch eine Mehrkernbildung i n den Tochterzellen feststellen. I n jeder Tochterzelle werden mehrere kleine K e r n e ungleicher G r ö ß e sichtbar, meist nur mit einem K e r n k ö r p e r c h e n . Die fortlaufende Beobachtung ergab, d a ß derartige Zellen nicht lebensfähig sind und durch Chromatolyse zugrundegehen. (Vergr. 380fach; Dauer 61 M i n . ; Aufnahme mit 30 B / M i n . , d.h. Zeitraffung auf y . ) 4 8 D i e n ä c h s t e Aufnahme wurde 5 M i n u t e n nach der Bestrahlung begonnen. Neben der zunehmenden Ansammlung von Fettropfen l ä ß t sich eine V e r k l u m p u n g der Chromosomen i n der frühen Metaphase nachweisen. D i e nunmehr notwendige Einordnung i n die Ä q u a t o r i a l e b e n e unterbleibt. Statt dessen w i r d erneut eine K e r n membran sichtbar. M a n ist z u n ä c h s t geneigt, eine R ü c k b i l d u n g nach begonnener Teilung anzunehmen. E i n zweiter kleinerer K e r n links deutet jedoch darauf hin, d a ß es sich u m eine Amitose mit ungleicher Verteilung der Kernsubstanz unter Ausbleiben der Plasmateilung handelt. (Vergr. 300fach; Dauer 120 M i n . ; Aufnahme mit 15 B / M i n . , d . h . Zeitraffung auf y . ) 9 6 x ) Die angegebenen Werte f ü r die mikroskopische des Abbildung Schmalfilmbilds. geschwindigkeit v o n — Die 24 B / s . Vergrößerung beziehen bei der A u f n a h m e , n i c h t Zeitraffung Die gilt f ü r die Vorführdauer auf sich auf die den Maßstab normale Vorführ- dieser Aufnahme b e t r ä g t demnach 80 Sekunden. 7 Zellteilung nach Elektronenbestrahlung Die K e r n s c h ä d i g u n g e n des Primäreffektes manifestieren sich nach Einstrahlung v o n 4000 r schneller Elektronen bei einer Dosisleistung v o n 1000 r / M i n . , wie an den beiden folgenden Teilungsaufnahmen zu sehen ist, morphologisch i n derselben Weise. (Vergr. 170- u. 250fach; Dauer 25 bzw. 97 M i n . ; Zeitraffung auf % bzw. 8 V..0 B e i der n ä c h s t e n Aufnahme ist die V e r k l u m p u n g der Chromosomen bereits i n der frühen Metaphase erfaßt. Die nunmehr notwendige B i l d u n g der Ä q u a t o r i a l e b e n e unterbleibt, der Spindelapparat erscheint g e s t ö r t . Das Vibrieren der Zelle zeigt, d a ß die K o o r d i n a t i o n der Bewegungen v o n Chromosomen und Zelleib aufgehoben ist. M i t heftigen Bewegungen werden verzweifelte Anstrengungen unternommen, gleichsam die Teilung noch zu erzwingen. D i e D u r c h s c h n ü r u n g ist jedoch u n m ö g l i c h . E s k o m m t lediglich zu einer vielfachen u n d völlig u n r e g e l m ä ß i g e n Trennung der Chromosomen mit B i l d u n g mehrerer K e r n e . Diese Zelle geht s p ä t e r durch Chromatolyse zugrunde. (Vergr. 250fach; Aufnahmedauer der versuchten Teilung 47 M i n . ; Zeitraffung auf y u . / ) ; Dauer der weiteren E n t w i c k l u n g mit B i l d u n g mehrerer Kerne 36 M i n . ; Zeitraffung 1 9 6 auf y 1 8 0 1 4 8 .) Ruhezellen nach Röntgenbestrahlung Wesentlich sind die Beobachtungen an Ruhezellen, da sie wichtige Unterschiede i n der biologischen W i r k u n g der beiden Strahlenarten i m verwendeten Dosisbereich aufzeigen. Die r ö n t g e n b e s t r a h l t e n K u l t u r e n zeigen ein völlig ungerichtetes W a c h s t u m . Die rasch zunehmende grobe Verfettung der Zellen ist A u s druck einer S t ö r u n g des Zellstoffwechsels. D i e Fibroblasten werden a u ß e r d e m schlanker und dunkler u n d bewegen sich schließlich wirr und aufgeregt durcheinander. (Vergr. 170- u . 250fach; Zeitraffung auf y u. y . ) Neben diesen S c h ä d i g u n g e n leichterer und z u m Teil zumindest reversibler A r t l ä ß t sich häufig ein Zelluntergang i n der Interphase beobachten, der zeitlich m i t dem Primäreffekt z u s a m m e n f ä l l t . E i n e z u n ä c h s t noch i n t a k t scheinende Zelle be¬ 3 6 0 *) Der i 8 0 Übergang zur geringeren Zeitraffung Schiebeblende kenntlich gemacht durch (senkrechte unscharfe links nach rechts ü b e r das B i l d wandert). 8 ist eine sogenannte Linie, die von ginnt plötzlich heftige Plasmabewegungen auszuführen, die schließlich zur Herausschleuderung des Zellkernes führen (Abb. 2). Der Tod der Zelle wird an der völligen Erstarrung des Zellgefüges sichtbar. Dieser Vorgang ließ sich zwanglos mehrfach filmen. Die Plasmabewegungen setzen spontan ein, und der Zellkern wird ruckartig eliminiert. Bei der oft nachfolgenden Blasenbildung handelt es sich möglicherweise um freigewordenes Wasser. (Vergr. 250fach; Zeitraffung auf y . ) 9 6 Abb. 2. U n t e r g e h e n d e Ruhezellen Die mit Pfeilen bezeichneten Zellkerne sind aus dem Zellgefüge eliminiert Die Buhezelle rechts von der Bildmitte geht später auf gleiche Weise zugrunde E i n e s p ä t e r e Ü b e r s i c h t s a u f n a h m e zeigt die nunmehr frei notierenden Z e l l t r ü m m e r i n m i t t e n der turbulenten wirren Zellbewegungen. (Vergr. 170fach; Aufnahme m i t 4 B / M i n . , d . h . Zeitraffung auf y o-) 36 Ruhezeiten nach Elektronenbestrahlung N a c h E i n s t r a h l u n g der g e w ä h l t e n Versuchsdosis v o n 4000 r schneller E l e k t r o n e n u n d einer Dosisleistung v o n 1000 r / M i n . konnte e i n derartiger Zelluntergang v o n Ruhezellen weder a m g e f ä r b t e n P r ä p a r a t noch m i t H i l f e der Zeitraffermethode beobachtet werden. E s setzen zwar S t ö r u n g e n e i n ; die Zellen werden auch nach E l e k tronenbestrahlung schlanker u n d dunkler u n d zeigen zunehmende Lipoidanreicherung. Neben dieser geringen u n d reversiblen Schädigung lassen sich sogar Teilungen feststellen, die ohne g r ö b e r e 9 morphologische V e r ä n d e r u n g e n ablaufen. (Vergr. raffung auf y . ) 130fach; Zeit- 3 6 0 Das wesentliche Ergebnis der Forschungsaufnahmen ist also: Schnelle Elektronen verursachen i n der Interphase geringere S c h ä digungen als R ö n t g e n s t r a h l e n gleicher Dosis und Dosisleistung. D i e E r k l ä r u n g dieses Wirkungsunterschiedes dürfte i n der verschiedenen Ionisationsdichte beider Strahlungen zu suchen sein. Schlußbemerkung Der Zeitrafferfilm hat sich hier i n Verbindung mit dem Phasenkontrastverfahren als eine wissenschaftliche Untersuchungsmethode erwiesen, die geeignet ist, cytologisch-statistisch gewonnene V e r suchsergebnisse zu ü b e r p r ü f e n . E r stellt überdies das einzige V e r fahren dar, das E i n b l i c k i n die D y n a m i k des mikrobiologischen Geschehens zu gewinnen erlaubt. Literatur Gewebezüchtung : 1. CAMEBON, G . , Tissue Culture Technique. New 2. FISCHER, A . , Gewebezüchtung. 3. FISCHER, I., G r u n d r i ß der York 1950. M ü l l e r & Steinicke, M ü n c h e n Gewebezüchtung. 1930. S. Fischer, J e n a 1942. Strahlenbiologie : 4. GÄBTNER, H . , Strahlenbiologische Untersuchungen mit tronen und S. 5. R ö n t g e n s t r a h l e n an schnellen E l e k - Gewebekulturen. Str. Ther. 82 (1950), 539. GÄRTNER, PL, Weitere Untersuchungen über die strahlenbiologische Wirksamkeit von schnellen E l e k t r o n e n und R ö n t g e n s t r a h l e n auf Gewebekulturen. Str. Ther. 86 6. (1952), S. 217. (Dort weitere Literaturangaben.) GÄRTNER, H . , Vergleichende Untersuchungen ü b e r den P r i m ä r e f f e k t nach E i n w i r k u n g von schnellen Elektronen und R ö n t g e h s t r a h l e n auf Gewebe- kulturen. Str. Ther. (1952, im 7. K E P P , Druck). R . K . , Grundlagen der Strahlentherapie. G . Thieme, Stuttgart 1952. (Eingegangen Die Herstellung des F i l m s erfolgte im Jahre durch Institut für F i l m und am 17.4. 1952) 1951 das B i l d in Wissenschaft und Unterricht Abteilung Hochschule und Forschung, G ö t t i n g e n (Dir.: D r . - I n g . G . W O L F ) Sachbearbeitung: G . B E K O W — Aufnahme: E . H E Y S E 10
