n=16 - Sarkomkonferenz

Probleme bei der Referenzpathologie
und bei Ringversuchen
Prof. Dr. med. Eva Wardelmann
Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Köln
Berlin, den 19. März 2011
The efficacy of treatment of sarcomas
depends on the correct
histopathological diagnosis!
Fragestellungen in der Referenzpathologie
mesenchymaler Tumoren
• Ausschluss/Nachweis eines gastrointestinalen
Stromatumors, ggf. Mutationsanalyse
• Festlegung der Tumorentität
• Dignitätsbestimmung
• Grading
Einsendungen mesenchymaler Tumoren im Bonner SarkomRegister (Einsendungen von 1990 bis 2009)
700
600
500
400
300
200
100
0
19902002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
GISTs (n=2958)
138
173
174
180
247
385
449
608
604
Non-GISTs (n=1776)
31
33
46
85
119
271
345
380
466
Cases per year
GISTs (n=2958)
Non-GISTs (n=1776)
Limitationen I
• häufig Übersendung von nur einem Block:
repräsentativ?
alle Tumorkomponenten erfasst?
Heterogenität immunhistochemischer
Marker
Ausdehnung der Nekrosen nicht
beurteilbar
Limitationen II
• mangelhafte klinische Angaben (Primärtumor oder Rezidiv; Vorbehandlung…)
• Keine Bildgebung
• Keine interdisziplinäre Diskussion möglich
Anforderungen an die Referenzpathologie
bei Weichgewebstumoren
• Valide reproduzierbare Immunhistochemie
• Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und
kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums
• Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden
(FISH, rt-PCR, CGH)
Anforderungen an die Referenzpathologie
bei Weichgewebstumoren
• Valide reproduzierbare Immunhistochemie
• Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und
kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums
• Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden
(FISH, rt-PCR, CGH)
Relevanz des immunhistochemischen
KIT-Rezeptor-Nachweises
Wichtigster diagnostischer
Marker
KIT
Therapietarget
Masterblock
Auswerteschema
   
  
 

HE-Schnitt
 Start
       
     
   
 
Ende
GIST des Magens
604-RV CD117
604-RV CD117-3
KIT
Bewertungskriterien
• Qualität der Färbung
• Qualität der Auswertung
Ergebnismitteilung
1 = für die Diagnostik unzureichend
2 = für die Diagnostik brauchbar, aber technisch verbesserungswürdig
3 = gut/sehr gut
• Teilnahme (Wiederholung empfohlen)
• Teilnahme mit Erfolg
Bemerkungen/Anregungen....
Ergebnisse des Ringversuchs CD 117
(Stand 02/2008)
Anmeldungen seit 2006:
34 Institute
Rückläufe seit 10/2006:
23 Teilnehmer
Universitäre Institute:
Bisher keine Rücksendung:
2
11 Institute
Antikörper
Angaben zur
Technik
Verdünnung
Vorbehandlung
Färbetechnik
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:200
Mikrowelle
Automat
DAKO
1:500
Dampf
Manuell
DAKO
1:200
Dampf
Manuell
DAKO
1:100
Dampf
Automat
DAKO
1:200
Dampf
Automat
DAKO
1:300
Mikrowelle
Automat
DAKO
?
Mikrowelle
Automat
DAKO
1:500
Dampf
Automat
DAKO
1:200
Dampf
Automat
DAKO
1:1000
Dampf
Manuell
DAKO
1:200
Mikrowelle
Automat
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:400
Dampf
Manuell
DAKO
1:200
Mikrowelle
Automat
Dianova
1:30
Dampf
Automat
DAKO
1:50
Dampf
Manuell
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:150
Dampf
Automat
DAKO
1:100
Hitze
Automat
Antikörper
Angaben zur
Technik
Verdünnung
Vorbehandlung
Färbetechnik
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:200
Mikrowelle
Automat
DAKO
1:500
Dampf
Manuell
DAKO
1:200
Dampf
Manuell
DAKO
1:100
Dampf
Automat
DAKO
1:200
Dampf
Automat
DAKO
1:300
Mikrowelle
Automat
DAKO
?
Mikrowelle
Automat
DAKO
1:500
Dampf
Automat
DAKO
1:200
Dampf
Automat
DAKO
1:1000
Dampf
Manuell
DAKO
1:200
Mikrowelle
Automat
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:400
Dampf
Manuell
DAKO
1:200
Mikrowelle
Automat
Dianova
1:30
Dampf
Automat
DAKO
1:50
Dampf
Manuell
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:50
Dampf
Automat
DAKO
1:150
Dampf
Automat
DAKO
1:100
Hitze
Automat
Ergebnisse des Ringversuchs CD 117
(Stand 02/2008)
1 = für die Diagnostik unzureichend
n=2
2 = für die Diagnostik brauchbar, aber
technisch verbesserungswürdig
n=5
3 = gut/sehr gut
n=16
Teilnahme (Wiederholung empfohlen)
n=7
Teilnahme mit Erfolg
n=16
German
Interlaboratory
Sequence
Testing
Group
Teilnehmende
Zentren:
Bonn
Göttingen
Hamburg
Heidelberg
Magdeburg
Regensburg
Pitfalls:
• Kontamination
• Schwierigkeiten bei der DNA-Extraktion,
insbesondere bei älteren Paraffinblöcken
oder zu langer Fixation von Nassmaterial
• Unterschiedliche Primersets
• Falsche Interpretation der Sequenz
Merkelbach-Bruse S. et al. BMC Medical Genetics 2010; 11:106.
Lösungen:
• Consensus-Primer
• Verhinderung von Kontamination
• Verwendung von high quality DNA/keine
Reamplifikation
• Maximale Zyklenzahl: 40
• Schwierige Fälle an ein zweites Labor
senden
German
Interlaboratory
Sequence
Testing
Group
Teilnehmende
Zentren:
Bonn
Göttingen
Hamburg
Heidelberg
Magdeburg
Regensburg
erfolgreiche
Teilnehmer
http://www.dgp-berlin.de/index.php/ringversuche/institute-mit-erfolgreicher-teilnahme/gist
Anforderungen an die Referenzpathologie
bei Weichgewebstumoren
• Valide reproduzierbare Immunhistochemie
• Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und
kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums
• Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden
(FISH, rt-PCR, CGH)
Value of the antibody DOG1 to exclude the diagnosis
„gastrointestinal stromal tumor (GIST)“
GIST
other sarcomas
AllredScore
positive
(8-4)
DOG1
positive**
negative
(below 4)
1.99%
98.01%
**clone SP31, monoclonal rabbit, Spring Bioscience
subgroup
WDLS/DDLS
(n=150)
8.39%
MLS (n=31)
9.68%
PLS (n=11)
0%
LMS (n=70)
5.17%
ASA (n=27)
7.41%
SS (n=16)
6.25%
MPNST (n=21)
9.25%
MFH (n=35)
SS = synovial sarcoma, LMS = leiomyosarcoma, WDLS =
well differentiated liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma, MLS =
myxoid liposarcoma, ASA = angiosarcoma, PLS = pleomorphic
liposarcoma, MPNST = malignant peripheral nerve sheath tumor, MFH =
pleomorphic high grade sarcoma
DOG1
positive*
0%
*strong intensity in 1 DDLS, 1 MLS, 1 ASA and
1 MPNST, all others weak
Anforderungen an die Referenzpathologie
bei Weichgewebstumoren
• Valide reproduzierbare Immunhistochemie
• Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und
kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums
• Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden
(FISH, rt-PCR, CGH)
Methoden der Molekularpathologie bei Sarkomen
Multicolor FISH-Analyse zum Nachweis
von Translokationen und Genamplifikationen
rt-PCR zum Nachweis bestimmter Fusionsgene
T
A T T GC G A A T C T A
DNA-Sequenzierung einzelner Genabschnitte
zum Nachweis bestimmter Mutationen
Translocations in sarcomas I
Tumor entity
translocation
fusion gene
Ewing sarcoma (ES)
t(11;22)(q24;q12)
t(21;22)(q22;q12)
t(7;22)(p22;q12)
t(17;22)(q12;q12)
t(2;22)(q33;q12)
t(16;21)(p11;q22
EWS1R-FLI1
EWS1R-ERG
EWS1R-ETV1
EWS1R-E1AF
EWS1R-FEV
FUS-ERG
Clear cell sarcoma (CCS)
t(12;22)(q13;q12)
t(2;22)(q33;q12)
EWS1R-ATF1
EWS1R-CREB1
Desmoplastic small round cell tumor (DSRCT)
t(11;22)(p13;q12)
EWS1R-WT1
Extraskelettal myxoid chondrosarcoma (EMCS)
t(9;22)(q22;q12)
t(9;17)(q22;q11)
t(3;9)(q12;q22)
t(9;17)(q22;q11)
EWS1R-CHN
TAF2N-CHN
TFG-NR4A3
TCF12-NR4A3
Myxoid liposarcoma (MLS)
t(12;16)(q13;p11)
t(12;22)(q13;q12)
FUS-DDIT3
EWS1R-DDIT3
Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma (SFT)
der(12)(q13-15)
unknown
Angiomatoid fibrous histiocytoma (AFH)
t(12;16)(q13;p11)
t(2;22)(q33;q12)
t(12;22)(q13;q12)
TLS-ATF1
EWS1R-CREB1
EWS1R-ATF 1
Alveolar rhabdomyosarcoma (ARMS)
t(2;13)(q35;q14)
t(1;13)(p36;q14)
t(2;2)(p23;q36)
t(X;2)(q13;q36)
PAX3-FOXO1A
PAX7-FOXO1A
PAX3-NCOA1
PAX3-FOXO4
Synovial sarcoma (SS)
t(X;18)(p11;q11)
t(X;18)(p11;q11)
t(X;18)(p11;q11)
t(X;20)(p11;q13)
SS18-SSX1
SS18-SSX2
SS18-SSX4
SS181-SSX1
Dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP)
t(17;22)(q22;q13)
der(22)t(17;22)
ring chromosome
COL1A1-PDGFB
Translocations in sarcomas II
Tumor entity
translocation
Fusion gene
Congenital fibrosarcoma (CGFS)
t(12;15)(p13;q25)
ETV6-NTRK3
Inflammatory myofibroblastic tumor (IMFT)
t(2p23)
div. ALK fusion partners
Alveolar soft part sarcoma (ASPS)
t(X;17)(p11;q25)
ASPSCR1-TFE3
Endometrial stromal sarcoma (ESS)
t(7;17)(p15;q21)
JAZF1-JJAZ1
Myxoinflammatory fibroblastic sarcoma (MIFS)
t(1;10)(p22;q24)
Ring chromosome
deregulation of
FGF8+NPM3
amplification of
VGLL3
Well differentiated liposarcoma (WDLS)/atypical
lipomatous tumor (ALT)
Ring chromosome/giant
marker
amplification of
MDM2, CDK4, HMGA2,
GLI-SAS
Low grade fibromyxoid sarcoma (LGFS)
t(7;16)(q33-34;p11)
t(11;16)(p11;p11)
FUS-CREB3L2
FUS-CREB3L1
Laufende Ringversuche in der Pathologie
Schlussfolgerungen
Ringversuche:
• dienen der Qualitätssicherung und -verbesserung
• sind insbesondere bei therapeutisch relevanten Markern von großer
Relevanz
• sollten stärker frequentiert werden
• sollten zentral organisiert werden
• sind bislang freiwillig, Nichtbestehen hat keine Konsequenz