n=16 - Sarkomkonferenz
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Probleme bei der Referenzpathologie und bei Ringversuchen Prof. Dr. med. Eva Wardelmann Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Köln Berlin, den 19. März 2011 The efficacy of treatment of sarcomas depends on the correct histopathological diagnosis! Fragestellungen in der Referenzpathologie mesenchymaler Tumoren • Ausschluss/Nachweis eines gastrointestinalen Stromatumors, ggf. Mutationsanalyse • Festlegung der Tumorentität • Dignitätsbestimmung • Grading Einsendungen mesenchymaler Tumoren im Bonner SarkomRegister (Einsendungen von 1990 bis 2009) 700 600 500 400 300 200 100 0 19902002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 GISTs (n=2958) 138 173 174 180 247 385 449 608 604 Non-GISTs (n=1776) 31 33 46 85 119 271 345 380 466 Cases per year GISTs (n=2958) Non-GISTs (n=1776) Limitationen I • häufig Übersendung von nur einem Block: repräsentativ? alle Tumorkomponenten erfasst? Heterogenität immunhistochemischer Marker Ausdehnung der Nekrosen nicht beurteilbar Limitationen II • mangelhafte klinische Angaben (Primärtumor oder Rezidiv; Vorbehandlung…) • Keine Bildgebung • Keine interdisziplinäre Diskussion möglich Anforderungen an die Referenzpathologie bei Weichgewebstumoren • Valide reproduzierbare Immunhistochemie • Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums • Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden (FISH, rt-PCR, CGH) Anforderungen an die Referenzpathologie bei Weichgewebstumoren • Valide reproduzierbare Immunhistochemie • Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums • Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden (FISH, rt-PCR, CGH) Relevanz des immunhistochemischen KIT-Rezeptor-Nachweises Wichtigster diagnostischer Marker KIT Therapietarget Masterblock Auswerteschema HE-Schnitt Start Ende GIST des Magens 604-RV CD117 604-RV CD117-3 KIT Bewertungskriterien • Qualität der Färbung • Qualität der Auswertung Ergebnismitteilung 1 = für die Diagnostik unzureichend 2 = für die Diagnostik brauchbar, aber technisch verbesserungswürdig 3 = gut/sehr gut • Teilnahme (Wiederholung empfohlen) • Teilnahme mit Erfolg Bemerkungen/Anregungen.... Ergebnisse des Ringversuchs CD 117 (Stand 02/2008) Anmeldungen seit 2006: 34 Institute Rückläufe seit 10/2006: 23 Teilnehmer Universitäre Institute: Bisher keine Rücksendung: 2 11 Institute Antikörper Angaben zur Technik Verdünnung Vorbehandlung Färbetechnik DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:200 Mikrowelle Automat DAKO 1:500 Dampf Manuell DAKO 1:200 Dampf Manuell DAKO 1:100 Dampf Automat DAKO 1:200 Dampf Automat DAKO 1:300 Mikrowelle Automat DAKO ? Mikrowelle Automat DAKO 1:500 Dampf Automat DAKO 1:200 Dampf Automat DAKO 1:1000 Dampf Manuell DAKO 1:200 Mikrowelle Automat DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:400 Dampf Manuell DAKO 1:200 Mikrowelle Automat Dianova 1:30 Dampf Automat DAKO 1:50 Dampf Manuell DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:150 Dampf Automat DAKO 1:100 Hitze Automat Antikörper Angaben zur Technik Verdünnung Vorbehandlung Färbetechnik DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:200 Mikrowelle Automat DAKO 1:500 Dampf Manuell DAKO 1:200 Dampf Manuell DAKO 1:100 Dampf Automat DAKO 1:200 Dampf Automat DAKO 1:300 Mikrowelle Automat DAKO ? Mikrowelle Automat DAKO 1:500 Dampf Automat DAKO 1:200 Dampf Automat DAKO 1:1000 Dampf Manuell DAKO 1:200 Mikrowelle Automat DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:400 Dampf Manuell DAKO 1:200 Mikrowelle Automat Dianova 1:30 Dampf Automat DAKO 1:50 Dampf Manuell DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:50 Dampf Automat DAKO 1:150 Dampf Automat DAKO 1:100 Hitze Automat Ergebnisse des Ringversuchs CD 117 (Stand 02/2008) 1 = für die Diagnostik unzureichend n=2 2 = für die Diagnostik brauchbar, aber technisch verbesserungswürdig n=5 3 = gut/sehr gut n=16 Teilnahme (Wiederholung empfohlen) n=7 Teilnahme mit Erfolg n=16 German Interlaboratory Sequence Testing Group Teilnehmende Zentren: Bonn Göttingen Hamburg Heidelberg Magdeburg Regensburg Pitfalls: • Kontamination • Schwierigkeiten bei der DNA-Extraktion, insbesondere bei älteren Paraffinblöcken oder zu langer Fixation von Nassmaterial • Unterschiedliche Primersets • Falsche Interpretation der Sequenz Merkelbach-Bruse S. et al. BMC Medical Genetics 2010; 11:106. Lösungen: • Consensus-Primer • Verhinderung von Kontamination • Verwendung von high quality DNA/keine Reamplifikation • Maximale Zyklenzahl: 40 • Schwierige Fälle an ein zweites Labor senden German Interlaboratory Sequence Testing Group Teilnehmende Zentren: Bonn Göttingen Hamburg Heidelberg Magdeburg Regensburg erfolgreiche Teilnehmer http://www.dgp-berlin.de/index.php/ringversuche/institute-mit-erfolgreicher-teilnahme/gist Anforderungen an die Referenzpathologie bei Weichgewebstumoren • Valide reproduzierbare Immunhistochemie • Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums • Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden (FISH, rt-PCR, CGH) Value of the antibody DOG1 to exclude the diagnosis „gastrointestinal stromal tumor (GIST)“ GIST other sarcomas AllredScore positive (8-4) DOG1 positive** negative (below 4) 1.99% 98.01% **clone SP31, monoclonal rabbit, Spring Bioscience subgroup WDLS/DDLS (n=150) 8.39% MLS (n=31) 9.68% PLS (n=11) 0% LMS (n=70) 5.17% ASA (n=27) 7.41% SS (n=16) 6.25% MPNST (n=21) 9.25% MFH (n=35) SS = synovial sarcoma, LMS = leiomyosarcoma, WDLS = well differentiated liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma, MLS = myxoid liposarcoma, ASA = angiosarcoma, PLS = pleomorphic liposarcoma, MPNST = malignant peripheral nerve sheath tumor, MFH = pleomorphic high grade sarcoma DOG1 positive* 0% *strong intensity in 1 DDLS, 1 MLS, 1 ASA and 1 MPNST, all others weak Anforderungen an die Referenzpathologie bei Weichgewebstumoren • Valide reproduzierbare Immunhistochemie • Vorhalten auch selten verwendeter Antikörper und kontinuierliche Erweiterung des Markerspektrums • Etablierung der wesentlichen relevanten molekularen Methoden (FISH, rt-PCR, CGH) Methoden der Molekularpathologie bei Sarkomen Multicolor FISH-Analyse zum Nachweis von Translokationen und Genamplifikationen rt-PCR zum Nachweis bestimmter Fusionsgene T A T T GC G A A T C T A DNA-Sequenzierung einzelner Genabschnitte zum Nachweis bestimmter Mutationen Translocations in sarcomas I Tumor entity translocation fusion gene Ewing sarcoma (ES) t(11;22)(q24;q12) t(21;22)(q22;q12) t(7;22)(p22;q12) t(17;22)(q12;q12) t(2;22)(q33;q12) t(16;21)(p11;q22 EWS1R-FLI1 EWS1R-ERG EWS1R-ETV1 EWS1R-E1AF EWS1R-FEV FUS-ERG Clear cell sarcoma (CCS) t(12;22)(q13;q12) t(2;22)(q33;q12) EWS1R-ATF1 EWS1R-CREB1 Desmoplastic small round cell tumor (DSRCT) t(11;22)(p13;q12) EWS1R-WT1 Extraskelettal myxoid chondrosarcoma (EMCS) t(9;22)(q22;q12) t(9;17)(q22;q11) t(3;9)(q12;q22) t(9;17)(q22;q11) EWS1R-CHN TAF2N-CHN TFG-NR4A3 TCF12-NR4A3 Myxoid liposarcoma (MLS) t(12;16)(q13;p11) t(12;22)(q13;q12) FUS-DDIT3 EWS1R-DDIT3 Solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma (SFT) der(12)(q13-15) unknown Angiomatoid fibrous histiocytoma (AFH) t(12;16)(q13;p11) t(2;22)(q33;q12) t(12;22)(q13;q12) TLS-ATF1 EWS1R-CREB1 EWS1R-ATF 1 Alveolar rhabdomyosarcoma (ARMS) t(2;13)(q35;q14) t(1;13)(p36;q14) t(2;2)(p23;q36) t(X;2)(q13;q36) PAX3-FOXO1A PAX7-FOXO1A PAX3-NCOA1 PAX3-FOXO4 Synovial sarcoma (SS) t(X;18)(p11;q11) t(X;18)(p11;q11) t(X;18)(p11;q11) t(X;20)(p11;q13) SS18-SSX1 SS18-SSX2 SS18-SSX4 SS181-SSX1 Dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) t(17;22)(q22;q13) der(22)t(17;22) ring chromosome COL1A1-PDGFB Translocations in sarcomas II Tumor entity translocation Fusion gene Congenital fibrosarcoma (CGFS) t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 Inflammatory myofibroblastic tumor (IMFT) t(2p23) div. ALK fusion partners Alveolar soft part sarcoma (ASPS) t(X;17)(p11;q25) ASPSCR1-TFE3 Endometrial stromal sarcoma (ESS) t(7;17)(p15;q21) JAZF1-JJAZ1 Myxoinflammatory fibroblastic sarcoma (MIFS) t(1;10)(p22;q24) Ring chromosome deregulation of FGF8+NPM3 amplification of VGLL3 Well differentiated liposarcoma (WDLS)/atypical lipomatous tumor (ALT) Ring chromosome/giant marker amplification of MDM2, CDK4, HMGA2, GLI-SAS Low grade fibromyxoid sarcoma (LGFS) t(7;16)(q33-34;p11) t(11;16)(p11;p11) FUS-CREB3L2 FUS-CREB3L1 Laufende Ringversuche in der Pathologie Schlussfolgerungen Ringversuche: • dienen der Qualitätssicherung und -verbesserung • sind insbesondere bei therapeutisch relevanten Markern von großer Relevanz • sollten stärker frequentiert werden • sollten zentral organisiert werden • sind bislang freiwillig, Nichtbestehen hat keine Konsequenz
