2. Sample Preparation - Schweizer Jugend forscht

Isolierung von Bakterien aus der Umwelt
Verfasserin: Anja Lieberherr
Betreuerinnen: Dr. Lisa Christina Metzger & Prof. Melanie Blockesch
1. Zusammenfassung
Bakterien befinden sich überall in der Natur. Obwohl sie von Auge nicht erkennbar sind,
findet man sie im Wasser, in der Erde, in der Luft, auf der Haut und auf
Pflanzenoberflächen. Viele von diesen Bakterien können im Labor kultiviert werden. Das
Ziel vom Projekt bestand darin, einige dieser Mikroorganismen zu isolieren und deren
Spezies zu identifizieren. Nachdem eine Wasserprobe vom Genfersee sowie eine Erdund Pflanzenblätterprobe genommen wurde, präparierten wir die Proben so, damit wir
sie auf Agar Platten plattieren konnten. Aus einer Vielfalt von Bakterien wählten wir
sieben aus, die wir isolierten, um sie genauer untersuchen zu können. Anschliessend
reinigten wir von 2-3 Isolaten die genomische DNA auf, um eine PolymeraseKettenreaktion (PCR) zu machen. Dabei amplifizierten wir das
Gen der 16S rRNA, welches bestimmt ist, die Bakterienspezies zu ermitteln. Im letzten
Schritt wurde das PCR Produkt aufgereinigt und zur Sequenzierung geschickt.
2. Entnahme der Proben
Unweit von der EPFL, am Seeufer des Genfersees, haben wir
unsere Proben genommen (Abb. 1):
1) klares Seewasser, ohne Partikel
2) trübes Seewasser, mit Partikel
3) feuchte Erde
4) kleinerer Pflanzenblätter
Abb. 1
3. Aufbereitung der Proben
Abb.2
Abb.3
Abb.4
Im Labor nutzen wir verschiedene Agar Platten, um die Bakterien unserer Proben zu
kultivieren.
Medien Beschreibung:
Luria-Miller Broth (LB) universelles, nährstoffreiches Medium, welches das Wachstum
von einem breiten Spektrum von Bakterien fördert (Abb.2)
Sample Preparation
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2.
Thiosulfate-Citrate-Bile(salts)-Sucrose (TCBS) selektives Medium, vor allem für
Vibrio spp., enthält pH-Indikator, welcher die Säurebildung beim Zuckerabbau sichtbar
macht (blau - alkalisch pH; gelb – sauer pH) (Abb.3)
MacConkey (MC) selektives Medium, isoliert Gram-negative Bakterien, wie
Escherichia coli, enthält einen pH-Indikator, um zu bestimmten, ob Bakterien fähig sind,
Laktose zu fermentieren (Abb.4)
Minimal Medium Methanol (MMM) enthält die minimale Menge an Methanol um
bestimmte Bakterien zu selektieren
KingB (KB) dient der Isolierung von fluoreszierenden Bakterien, wird häufig für die
Isolation von Pseudomonas spp. verwendet
Die Wasserproben wurden direkt auf LB, MC und TCBS plattiert, während wir aus der
Erde eine Suspension aus Erde und Puffer herstellten. Diese Suspension wurde
einerseits bei Raumtemperatur gehalten und andererseits auf 80 Grad Celsius während
15 min erhitzt, bevor wir sie auf LB und MC plattierten. Zuletzt machten wir
Pflanzenplätterabdrücke auf MMM und KingB agar Platten.
4. Bakterien von den Proben
A) Eine Collage von verschiedenen Agar Platten zeigt die Vielfalt von Bakterien aus
der Umwelt.
B) Die Erdproben wurden entweder bei Raumtemperatur gehalten oder erhitzt, um
Sporenbildende Bakterien zu selektieren. Gram-positive Bakterien bilden Sporen
aus. Wie aus den Fotos zu entnehmen ist, sind Gram-positive Mikroorganismen in
der Erde reichlich vorhanden.
C) Eine Auswahl von Planzenblätterabdrücken auf MMM und KingB Agar Platten
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5. Analyse von sechs Isolaten
Abb.5
Abb.6
Abb.7
Aus unserer Sammlung von verschiedenen Bakterien wählten wir sieben aus, um sie
weiter zu isolieren. Zuerst wurden diese auf LB Agar Platten ausgestrichen, um einzelne
Kolonien zu erhalten. (Abb.5)
Mithilfe des Mikroskops analysierten wir deren Formen. (Abb.6)
Um herauszufinden, ob es sich um Gram-positive oder Gram-negative Bakterien handelt,
wurde ein Gram-stain durchgeführt. Um sicher zu sein, dass es sich um Gram-positive
oder Gram-negative Bakterien handelt, strichen wir die sechs Isolaten zusätzlich auf MC
Agar Platten aus. (Abb.7)
6. Bestimmung der Spezies
Wir wählten wiederum drei von unseren sieben Isolaten aus, um deren Spezies zu
bestimmen. (Nr. 2,6,7) Dazu sequenzierten wir das Gen der 16S rRNA.
Zu allererst extrahierten wir die genomische DNA (gDNA) und analysierten sie mithilfe
der Agarose-Gel Elektrophorese. (A, nr. 2,6,7). Das Gen der 16S rRNA wurde durch die
PCR amplifiziert und ebenso durch die Agarose-Gel Elektophorese überprüft (B, nr.
2,6,7). Schliesslich wurde das aufgereinigte PCR Produkt zum Sequenzieren verschickt.
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Mittels der erhaltenen Sequenzen und dem Ribosomal Database Project (RDP) konnte
die Gattung unserer Isolaten identifiziert werden. Ebenso konnte die Spezies von nahen
verwandten Bakterien ermittelt werden. (C)
B
Abb.7
C
7. Fazit
Bakterien sind in unserer Umwelt überall vorhanden. Während dieser Woche nutzen
wir die Möglichkeit, dass viele Bakterien unter Laborbedingungen kultivierbar sind.
Nach dem Isolieren von Bakterien nutzen wir grundlegende Techniken, wie Mikroskopie
und Gram-stain, um eine Auswahl von ihnen zu charakterisieren. Die Sequenzierung des
16S rRNA Gens ist eine üblich genutzte Methode, Bakterienspezies zu erkennen. Auf
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diesem Weg wurde es uns ermöglicht, die Gattung und die nächst verwandte Spezies zu
bestimmen.
8. Dank
Ein grosses Dankeschön möchte ich meinen Betreuerinnen Dr. Lisa Christina Metzger
und Prof. Melanie Blockesch aussprechen. Während einer Woche standen sie mir mit
ihrer stets kompetenten, freundlichen und sympathischen Art zur Seite. In einem
professionellen Labor selbständig einige Arbeiten durchzuführen, empfand ich als sehr
spannend und interessant.
Ebenso will ich Schweizer Jungend forscht und der EPFL für das Ermöglichen der
Studienwoche danken.
Datum: 22.03.15
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