Protein zur chemoenzymatischen Herstellung von L-threo - H-IP-O

Protein zur chemoenzymatischen
Herstellung von
L-threo-Hydroxyaspartat
Kristallstruktur der natürlichen Asparaginoxygenase AsnO mit gebundenem L-threo-β-Hydroxyasparagin und Succinat.
Konzept:
Die vorliegende Erfindung liefert ein neuartiges Protein, mit dem L-threoHydroxyaspartat chemoenzymatisch und enantiomerenrein aus L-Aspartat
hergestellt werden kann.
*Deutsche Patentanmeldung
Unser Zeichen:
TM218
Das natürliche Protein AsnO (Asparaginoxygenase) ist Teil des CDA-BiosyntheseGenclusters in Streptomyces coelicor. AsnO ist eine Fe2+- und α-Ketoglutaratabhängige Hydroxylase. Diese Hydroxylase dient in vivo als Baustein für nicht
ribosomal hergestelltes CDA („Calcium-dependent antibiotic“). Während des
Katalysezyklus verbindet diese Klasse von Enzymen den oxidativen Abbau von
α-Ketoglutarat zu Succinat und CO2 mit der Hydroxylierung des Substrates (LAsparagin).
Im Wildtyp des AsnO bindet dabei die Seitenkette des Aminosäurerestes Asp-241 an
die NH2-Gruppe der Carboxamidgruppe von L-Asn.
Überraschend wurde gefunden, dass eine gerichtete Mutagenese von Asp-241 zu
Asn-241 (D241N) zu einer Bindungsstelle für die Carboxylgruppe einer AspartatSeitenkette führt. Durch diese gerichtete Mutagenese ändert sich die
Substratspezifität von Asparagin zu Aspartat, und das mutierte Protein überführt
Aspartat in Gegenwart von Fe2+ und α-Ketoglutarat chemoenzymatisch in L-threoHydroxyaspartat. Die Umsetzung erfolgt quantitativ und enantioselektiv nach
folgendem Schema:
NH2
O
NH2
AsnO D241N
Fe2+
HO
O
HO
OH
OH
O
O
α -Ketoglutarat
O2
OH
Succinat
CO2
Dabei ist AsnO D241N die erfindungsgemäße Mutante des Wildtyps AsnO.
Vorteile / Besondere Eigenschaften:
Das erfindungsgemäße Protein AsnO D241N kann zur Herstellung von L-threoHydroxyaspartat verwendet werden. Hierfür wird L-Aspartat in Gegenwart von AsnO
D241N und dem Cofaktor Fe2+- sowie mit dem Cosubstrat α-Ketoglutarat inkubiert.
Dabei wird eine nicht aktivierte β-Methylengruppe (hier: die β-CH2-Gruppe von
Aspartat) enzymatisch hydroxyliert. Diese enzymatische Hydroxylierung ist
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besonders vorteilhaft, da nicht aktivierte β-CH2-Gruppen auf klassisch chemischem
Wege im Allgemeinen nur schwer zugänglich sind. „Rein chemische“, nicht
enzymkatalysierte Reaktionen an β-CH2-Gruppen von Aminosäuren führen
außerdem in aller Regel zu Enantiomeren- bzw. Diastereomerengemischen. Die
chemoenzymatische Herstellung von L-threo-Hydroxyaspartat mit Hilfe des
erfindungsgemäßen
Proteins
verläuft
dagegen
enantioselektiv
und
substratspezifisch, da AsnO D241N ausschließlich L-Aspartat hydroxyliert und
ausschließlich L-threo-Hydroxyaspartat gebildet wird.
Es wurde gezeigt, dass die Umsetzung von L-Aspartat zu L-threo-Hydroxyaspartat
quantitativ verläuft und dass das erfindungsgemäße Protein keine andere
Aminosäure hydroxyliert. Aus L-threo-Hydroxyaspartat lässt sich anschließend sehr
leicht das korrespondierende benzylierte Derivat L-TBOA herstellen.
Das erfindungsgemäße mutierte Protein AsnO D241N ist im Labormaßstab
vorhanden und lässt sich leicht hochskalieren.
Hintergrund:
L-threo-Hydroxyaspartat hemmt die Funktion der Glutamattransporter.
Im ZNS von Säugern nimmt L-Glutamat eine zentrale Rolle ein, indem es als
primärer exzitatorischer Neurotransmitter agiert.
Eine Regulierung des exzitatorischen L-Glutamats ist entscheidend, da ein Mangel
an L-Glutamat zu einer verminderten Signalübertragung führt, während ein
Überschuss die exzytotoxischen Signalwege hemmt. Ein Überschuss an L-Glutamat
tritt beispielsweise bei Ischämie, Hypoglykämie, Chorea Huntington, Morbus
Alzheimer, amyotroper Lateralsklerose, tardiven Dyskinesien, Angststörungen,
Depressionen, Schizophrenie, Epilepsie, Astrozytomen und bei manchen
Lebererkrankungen auf.
Der Hauptanteil des Glutamattransports im ZNS wird durch hoch affine, Natriumabhängige EAA-Transporter („excitatory amino acid transporters“) vermittelt. Es
konnte gezeigt werden, dass das EAA-Analogon L-threo-Hydroxyaspartat (L-THA)
und sein benzyliertes Derivat L-TBOA die Funktion des Glutamattransporters
hemmen. L-TBOA ist der wirksamste derzeit bekannte Inhibitor der
Glutamattransporter.
Die bislang bekannten Verfahren zur Herstellung von L-threo-Hydroxyaspartat sind
zeitaufwändig, kostenintensiv und liefern kein enantiomerenreines Produkt.
*Deutsche Patentanmeldung
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TM218
Patentstatus:
Deutsche
Patentanmeldung
im
Patentanmeldung in Vorbereitung.
April
2007
eingereicht,
internationale
Kooperationsmöglichkeit / Wunsch:
Die TransMIT GmbH sucht F&E-Partner und Lizenznehmer, die Aminosäuren wie
herstellen und vertreiben. Gesucht werden Partner aus Deutschland, Europa,
Nordamerika und Asien.
TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer
Geschäftsbereich Patente und Innovationen
Dr. Peter Stumpf
Kerkrader Str. 3
D-35394 Gießen
Tel.:
+49-(0)641-94364-0
Fax:
+49-(0)641-94364-55
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