04-Elektrophysiologie - Max-Planck-Institut für Kognitions

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Methoden der kognitiven
Neurowissenschaften
Elektrophysiologie
Christopher Gundlach
christopher.gundlach@uni -leipzig.de
2
Themenfeld
„Elektrophysiologie“
Electrophysiology is the study of the electrical behavior and underlying mechanisms of cells and tissues. Biological
information is processed and communicated by various physical modalities, but electrical signals, e.g. action
potentials, synaptic and intrinsic membrane currents, are the most prominent in the nervous system.
• Klassischerweise werden eine oder mehrere Elektroden in verschiedene Gewebe-Präparationen eingeführt
(„invasiv“):
• lebendes Gewebe, z.B. ins lebende Gehirn
• entnommenes Gewebe (akut oder als „Kultur“)
• einzelne Zellen des entnommenen Gewebes
3
Verhalten
…hat biologische Grundlagen
Descartes, 1664
Churchland et al., 1988
4
Verhalten – ist messbar
Auf unterschiedlichen Skalen mit unterschiedlichen Methoden
Grinvald & Hildesheim., 2004
5
Grundrisse der Zellphysiologie
6
Nervenzellen
präsynaptisch
postsynaptisch
Kandel, 2013
7
Zellmembran
!
Vout = 0 mV
Vin = -65 mV
Doppelschichtige Zellmembran aus Fett-Molekülen
(Lipiden):
• unpassierbar für wasserlösliche Ionen, Proteine und
andere Moleküle, die in der intra- und extrazellulären
Flüssigkeit gelöst sind
• Austausch zwischen intra- und extrazellulären Stoffen
durch spezifische Strukturen in der Zellmembran
(Ionen-Kanäle und „Pumpen“).
Membranpotential
Vm = Vin – Vout
Dendriten
Axon
Zellkörper Myelinscheide
8
Kandel, 2013
!
Zellmembran - Ionen
• Ionen sind elektrisch geladene Atome:
• Natrium (Na+)
• Kalium (K+)
• Chlorid (Cl-)
• Organische Anionen (A -)
• Positiv geladene Ionen: Kationen
• Negativ geladene Ionen: Anionen
• Außerhalb der Zelle: Höhere Konzentration von Na +
und Cl• Innerhalb der Zelle: Höhere Konzentration von K+
und A- Ionen
• Man unterscheidet passive Ionenkanäle und aktive
Ionenkanäle (Pumpen)
• Ionenkanäle sind in der Regel Ionen-spezifisch
Kandel, 2013
9
!
Zellmembran - Ruhemembran
Equilibrium!
Durch Ausgleich des chemischen und elektrischen Gradientens
Potential wäre bei -75 mV
Ruhemembranpotential: -65 mV [-60 mV bis -70 mV]
10
Kandel, 2013
Zellmembran - Ruhemembran
Na+ –K+ Pumpe (aktiv)
• Moleküle, die Adenosintriphosphat spalten (ATP) und die daraus gewonnene
Energie dazu verwenden 3 Na + aus der Zelle heraus und 2 K + in die Zelle
hineinzupumpen.
• Höhere Na+ Konzentration im extrazellulären Raum
• Höhere K+ Konzentration im intrazellulären Raum
• die Na+ –K+ Pumpe erreicht stabilen Zustand der Ionenkonzentrationen
und –flüsse über die Zellmembran.
• Na+ Wanderung nach außen und K+ Wanderung nach innen ausgeglichen
• Ruhepotential (VR) ~ -60 bis -70 mV
Kandel, 2013
11
!
Neurone als Signalüberträger
Morphologisch definierte Regionen:
• Dendriten – hauptsächlich Signalempfang
• Zellkörper (Soma)
• Axon hillock (oder initial segment, Axonhügel) – Initiierung von
Aktionspotentialen
• Axon – Hauptsächlich Signalweiterleitung
• Präsynaptisches Terminal (Signalübertragung)
Neurone sind getrennt durch synaptischen Spalt
Hillock – Niedrigste Schwelle, weil hier höchste Dichte von Na +
sensitiven Kanälen
Kandel, 2013
12
!
Neurone als Signalüberträger
Signalübertragung (im Regelfall) ist unidirektional:
• von den empfangenden Regionen (meist Dendriten oder Zellkörper)
• zur Trigger-Region am Axon
• Weiterleitung des Aktionspotentials entlang des Axons
• zum synaptischen Terminal
Kandel, 2013
13
!
Neurone als Signalüberträger
• An Dendriten: zeitliche und räumliche Summation von
synaptischen Signalen
• Unterschiede je nach Synapse/Transmitter/Verschaltung
• EPSP (excitatory postsynaptic potential)
• Depolarisierend  Reduktion des
Membranpotentials (z.B. von –65 mV zu –55 mV)
• erhöht Wahrscheinlichkeit für Aktionspotential
• IPSP (inhibitory postsynaptic potential)
• hyperpolarisierend  Vergrößerung des
Membranpotentials (z.B. von –65 mV zu –75 mV)
• verringert Wahrscheinlichkeit für Aktionspotential
Kandel, 2013
14
!
Neurone als Signalüberträger
• Auslösung des Aktionspotentials (Spike) an Axonhügel, wenn
Depolarisierung Schwelle überschreitet
• Führt zu massivem Einfluss von Na + der Ausfluss von K + übersteigt
 schnelle Steigerung der Depolarisierung
Charakteristika des Aktionspotentials
• Läuft nach Auslösung mit konstanten Zeit- und Amplitudenverlauf
ab, unabhängig von Ausgangsdepolarisierung (Alles-oder-nichtsPrinzip)
• Starke Depolarisiering (bis 30 mV)
• Rückbildung zu Ruhepotential durch K + Ausfluss
• Refraktärzeiten nach Aktionspotential
• Absolute Refraktärzeit: 1-2 ms nach Beginn eines
Aktionspotentials ist es nicht möglich ein weiteres
Aktionspotential auszulösen.
• Relative Refraktärzeit: über weitere 5-10 ms ist die
Erregungsschwelle für die Auslösung eines Aktionspotentials
höher als normal
Kandel, 2013
15
Neurone als Signalüberträger
Saltatorische Weiterleitung der Aktionspotentiale
• Aktionspotentiale “springen” von Ranvierschen
Schnürring zu Schnürring
• Effektivere Weiterleitung der Signale
Kandel, 2013
16
Methoden der Elektrophysiologie
17
Überblick
Scanziani & Häusser, 2009
Uni Freiburg BMI, 2015
18
Überblick
Ableitung der elektrischen Aktivität
Mikroelektroden
• Glaspipetten-Elektroden
• Metallmikroelektroden: aus Wolfram, Stahl, Platin.
• Kohlefaserelektrode: haben keine toxische Wirkung bei
Langzeitableitungen.
• Mehrkanalelektroden: Bündel verschiedener Kapillaren,
erlauben zusätzliche Interventionen wie die Injektion von
Transmittern etc.
• Büschelelektroden: Breit gestreutes Bündel von Kapillaren
um die Aktivität vieler Neuronen abzuleiten.
• Unterschiedliche Elektroden messen nicht exakt das gleiche
• Größe der Elektroden hat einen Einfluss auf die Sensitivität
der Ableitung, aber auch der Lokalisationsgenauigkeit
Leica, 2011
19
!
Überblick
Formen der Einzelzellableitung
• in vitro (außerhalb lebender Organismen / künstliche
Umgebung):
• an Gewebeschnitten (häufig: Hippocampus)
• an vereinzelten Zellen (z.B. das Riesenaxon von
Tintenfischen)
• in vivo (im lebendigen Organismus):
• am wachen Versuchstier: Implantate (“chronisch”)
• am anästhetisierten Versuchstier (“akut” oder
“chronisch”)
• beim Mensch vor Tumor- oder Epilepsieoperationen
The Williams Hippocampal Rhythm Laboratory, 2015
• ex vivo (entnommenes lebendes biologisches Material):
• Lebendes Gewebe wird entnommen und kann eine
begrenzte Zeit kultiviert werden
20
Überblick
Chronisch vs. Akut
chronisch
• Chronische Elektrodenimplantierung
• geeignet für Aufzeichnungen von sich
bewegenden Tieren
akut:
• Elektroden nicht fest implantiert
• Vor der Messung wird die Elektrode ins Gewebe
eingeführt
• Nachteile etwa durch Kompression des
Gewebes oder Nachwirkungen der akuten
Operation
Albany Medical College, 2011
21
!
Intrazelluläre Ableitungen
• Zwei Elektroden verbunden über Verstärker und Oszilloskop
(misst die Spannung zwischen beiden Elektroden)
• Eine Elektrode wird in Zelle injiziert
• Eine Elektrode positioniert in extrazellulärem Raum
Ramón y Cajal, 1899
22
+ Hohe Spezifität: Aktivität einzelner Zelle
wird gemessen
+ Messung von Ruhepotentialen möglich
 invasiv
 Zelle wird verletzt, begrenzte Lebensdauer
 Umsetzung in vivo schwierig
 Nur Messung des Zellkörpers möglich
(Messung des Informationstransfers über
Axone, Dendriten kaum messbar)
Intrazelluläre Ableitungen
klassisch
Positiv
innerhalb
Negativ
innerhalb
Kandel, 2013
23
Intrazelluläre Ableitungen
klassisch -Beispiel
https://www.youtube.com/watch?v=9qg9-nBjUTc
http://ruccs.rutgers.edu/; Hubel & Wiesel, 1959
24
Intrazelluläre Ableitungen
klassisch -Beispiel
https://www.youtube.com/watch?v=B-H06H86XiM
http://ruccs.rutgers.edu/; Hubel & Wiesel, 1959
25
Intrazelluläre Ableitungen
Voltage clamp
Kandel, 2013
26
Intrazelluläre Ableitungen
Voltage clamp
2.) Voltage Clamp Verstärker
vergleicht Membranpotential
mit Zielpotential
1.) Eine Elektrode misst das
Ruhemembranpotential
3.) Wenn das Membranpotential vom
Zielpotential abweicht, wird ein
Stromfluss ins Axon über eine zweite
Elektrode injiziert. Über die Nutzung
des Feedbackaufbaus wird das
Membranpotential dem Zielpotential
angeglichen.
4.) Der Stromfluss der ins
Axon fließt, wird
gemessen.
Die Logik ist, dass die
Ströme, die zugeführt
werden proportional (und
umgekehrt) zu den
Strömen sind, die über
die Membran abfließen.
Kandel, 2013
27
Intrazelluläre Ableitungen
Current clamp
28
Intrazelluläre Ableitungen
Patch clamp
Charité, 2010
del Corsso, 2006
29
Intrazelluläre Ableitungen
Patch clamp
• Mikropipetten wird auf
der Zellmembran
aufgesetzt und ein
leichter Unterdruck
erzeugt
• Unterschiedliche
Konfigurationen sind
möglich:
Kandel, 2013
Messung eines einzelnen Ionenkanals
30
• Messung einzelner
Ionenkanäle
• durch Öffnung des Patch
“whole cell” Messung
• Perforation erlaubt
ebenso die Messung der
ganzen Zelle
Ashcroft, 2013
!
Extrazelluläre Ableitungen
• Zwei Elektroden verbunden über Verstärker und Oszilloskop
(misst die Spannung zwischen beiden Elektroden)
• Eine Elektrode wird nahe der Zellen positioniert
• Eine Elektrode (Referenz) positioniert mit Abstand in
extrazellulärem Raum
Ramón y Cajal, 1899
31
+ Längere Messung einzelner isolierter Neuronen
möglich
+ kein Schaden an zu messender Zelle
+ Messung bei wachen, lebenden Tieren möglich
 invasiv
 Selektive Aufzeichnung bestimmter Zellen
• Große Zellen (größeres Aktionspotential)
• Sehr aktive Zellen
 keine Messung des Ruhemembranpotentials
Extrazelluläre Ableitungen
Was kann gemessen werden?
!
Single-Unit Aktivität:
• Messung entweder mit Glaspipetten oder Metallelektroden nahe an einer Zelle, Durchmesser der
Messspitze 1Micrometer
• Ein einzelnes entladendes Neuron, dessen Aktionspotential (Spike) klar isoliert werden kann
• Abstand von der zu beobachteten Zelle sollte < 50 μm sein, da sich kurze Aktionspotentiale (0.5-2
ms) über die Zeit nicht aufsummieren, deren Potential mit Entfernung stark abnimmt und deshalb
nur lokal beobachtbar sind (im Gegensatz zu LFPs, siehe unten)
Multi-Unit Aktivität:
• Die Gesamtheit der Aktivität einer unbekannten Anzahl von Neuronen in der Nähe der
aufzeichnenden Elektrode
• Bei größeren Elektroden wird die Aktivität von mehreren Neuronen aufgezeichnet
• Enthält sowohl Aktionspotentiale einzelner Neurone als auch langsamere extrazelluläre
Veränderungen ausgelöst durch die Aktivität vieler Neurone
32
Extrazelluläre Ableitungen
Was wird gemessen?
!
• Das Gehirn besteht aus unterschiedlich gut leitenden Gewebearten
• Gleichzeitig laufen elektrochemische Prozesse in den 100 Milliarden (1011) Neuronen und deren 1014
bis 1015 Verbindungen ab
• In jedem Areal im Gehirn spiegelt die elektrische Aktivität die Überlagerung aller elektrochemischen
Prozesse wieder (der Einfluss nimmt jedoch mit der Entfernung zur Messelektrode ab)
• Summenaktivität von Neuronen im Umkreis von mm bis cm
• an jeder Elektrode wird das Local Field Potential (LFP) gemessen
• Das LFP stellt die Summe der elektrische Ströme dar, die durch neuronale Aktivität und daraus
resultierende Wanderung von Ionen entstehen
• es enthält neben den Aktionspotentialen einzelner Neurone auch extrazelluläre Feldveränderungen
die aus weiteren Quellen resultieren:
• Synaptische Ströme (Neurotransmitter getriggerter lokaler Einstrom von Na+, Ca+)
• Somatodendritische Ströme vieler gleichzeitig aktiver Neurone
33
Extrazelluläre Ableitungen
Was wird gemessen?
• Das LFP stellt die Summe der elektrische Ströme dar, die
durch neuronale Aktivität und daraus resultierende
Wanderung von Ionen entstehen
Zschocke, 2000
Birbaumer & Schmidt, 2003
34
Extrazelluläre Ableitungen
Quain Quiroga & Panzeri, 2009
35
Extrazelluläre Ableitungen
Trennung der Komponenten im Signal
• Bestandteile haben unterschiedliche
zeitliche Dynamiken:
!
• Spikes haben schnelle Dynamiken
 hohe Frequenzanteile  high
pass filter (300– 5000 Hz)
• LFPs haben langsame Dynamiken 
niedrige Frequenzanteile  low
pass filter (0.1–300 Hz)
• Spikes lassen sich (idealerweise)
aufgrund von bestimmten
Parametern einzelnen Neuronen
zuweisen (spike sorting)
Quain Quiroga & Panzeri, 2009
36
Extrazelluläre Ableitungen
Trennung der Komponenten im Signal
Schwierigkeiten – Spike sorting
!
• Individuale Spikes werden nicht direkt in neurophysiologischen
Experimenten aufgezeichnet
• Die an einer Elektrode aufgezeichneten extrazellulären
Potentiale repräsentieren die simultane elektrische Aktivität
einer unbekannten Anzahl von Neuronen
• Von diesen Aufzeichnungen muss folgendes identifiziert werden:
• Spike-Events oder Aktionspotentiale
• Die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen
• und jeder Spike muss dem Neuron zugeordnet werden,
welches es produzierte
Brown et al., 2004
37
Extrazelluläre Ableitungen
Trennung der Komponenten im Signal
Schwierigkeiten – Spike sorting
!
gut isoliertes Neuron
schlecht isoliertes Neuron
2
1
Lewicki., 1998
38
Extrazelluläre Ableitungen
Trennung der Komponenten im Signal
Verbesserung durch spezielle Multielektroden
• Tetrode: Elektrode mit mehreren (hier: vier)
electrode tips
• Aufgrund der räumlichen Anordnung der tips zu
den umliegenden Neuronen, bildet sich jedes
Neuron leicht anders auf den vier tips ab
• erlaubt u.U. die bessere Trennung von Neuronen
(spike-sorting)
Buzsáki, 2004
39
Extrazelluläre Ableitungen
Trennung der Komponenten im Signal
Modernes Spike Sorting
Einevoll et al., 2012
40
Extrazelluläre Ableitungen
Trennung der Komponenten im Signal
Darstellung der Aktivität
!
Bsp.: Aktivität eines Inferior colliculus Neuron (Teil der
Hörbahn) einer Ratte bei auditiver Stimulation (Ton
alle 3 s)
• Rasterplot
• x-Achse = Zeit, y-Achse = einzelne Stimuli
• Punkte repräsentieren spike
• Peri-stimulus time histogram (PSTH)
• Peri-stimulus = alle Trials/Zeitepochen werden
auf ein bestimmtes Event/Stimulus zentriert:
hier die Präsentation eines Tons
• Time histogram = Teile die Zeitepoche in eine
Serie von bins (kleinere Zeitabschnitte) und
zähle wie viele Spikes in jedes bin fallen
41
!
Extrazelluläre Ableitungen
• Lineares Elektroden Array (Multielektroden)
• Eine Elektrode wird in Gewebe platziert, in unterschiedlichen
Schichten
• Eine Elektrode (Referenz) positioniert mit Abstand in
extrazellulärem Raum
+ Elektrode hat mehrere Messpunkte entlang
der Elektrode  erlaubt Aufzeichnung der
Aktivität in unterschiedlichen Schichten
 single unit Aktivität bedingt messbar
Ramón y Cajal, 1899
42
Extrazelluläre Ableitungen
Charakterisierung der Aktivität
in unterschiedlichen Schichten
• LFP-Aktivität (niedrigfrequente Signale:
beeinflusst durch synaptische
Transmembran- und
Rückflusströme)
• Multiunit-Aktivität
(hauptsächlich
Aktionspotentiale)
• Current Source Density (Maß
für räumliches Muster der
LFPs)
Bollimunta et al., 2011
43
Extrazelluläre Ableitungen
!
Elektrokortikographie
• Elektroden Array, Multielektrodenraster unterschiedlicher Größe
positioniert unter dem Schädel, auf Hirngewebe
+ Mehre Messpunkte räumlich verteilt
+ Direkte Messung ohne störenden Einfluss des Schädels  höheres
Signal-Rausch-Verhältnis, höhere räumliche Präzision
+ Stimulation und Messung gleichzeitig möglich
- Messung nur über begrenzte Zeit
- Eingeschränktes Messfeld (Planung der Elektrodenpositionierung)
- Risikobehaftete Operation notwendig
Albany Medical College, 2011
Stanford School of Medicine, 2015
44
Extrazelluläre Ableitungen
Elektrokortikographie
• im Menschen häufiger Einsatz bei der Operationsplanung bei schwerer Epilepsie  Identifizierung
epileptogener Zonen
Identifizierung
motorischer
und
sensorischer
Areale durch
Stimulation
Alexander et al., 2013
45
Ethik
Bei jedem Tierversuch fordert das Tierschutzgesetz:
„Es muss immer die sinnesphysiologisch am niedrigsten entwickelte Tierart eingesetzt werden, die erlaubt, die
entsprechende Frage zu beantworten“ …
(ff.) “Rhesusaffen werden deshalb so oft für Versuche genommen, da sie ein äußerst differenziertes Sozialverhalten
aufweisen und viele kognitive Leistungen erbringen, die denen des Menschen sehr ähnlich sind. Außerdem besteht
aufgrund ihrer jahrelangen Erforschung ein breit umfassendes Detailwissen über Aufbau und Funktion ihres Gehirns.
Für die Versuche am Max-Planck-Institut werden in der Regel erwachsene Affen im Alter zwischen 5 und 15 Jahren
eingesetzt. Die meisten Experimente bestehen aus recht komplexen kognitiven Aufgaben. Damit sie die Aufgaben
lösen können, müssen die Tiere bereit sein, konzentriert mitzuarbeiten. Dies gelingt nur, wenn sie gesund sind und
sich in ihrer Umgebung wohl fühlen.”
http://hirnforschung.kyb.mpg.de/tiere.html
46
Ethik
• Forschung mit Tieren ist durch die Forschungsinstitution und durch staatliche Institutionen stark reglementiert.
• Jede Studie muss vorab geprüft und genehmigt werden.
• Auch bei Experimenten mit bspw. Mäusen muss die Verwendung jedesTieres vorab gerechtfertigt werden
Wichtiger aber: “Nur Tiere, die richtig gehalten werden, eignen sich für die Forschung. Die richtige Haltung und Pflege
von Versuchstieren ist daher nicht einfach nur ein Ausdruck einer humanen Einstellung zivilisierter Leute – sie liegen
auch im gesunden Eigeninteresse des Wissenschaftlers.
• Die Entscheidung darüber, ob Experimente am Tier und an welchen Tieren ethisch vertretbar ist, ist eine
gesamtgesellschaftliche Entscheidung und keine von einem einzelnen Individuum
• Sie folgt also aus staatlichen sowie demokratischen Praktiken und Diskursen; Regeln für Experimente am Tier
werden dort bestätigt oder geändert, und können dort eingefordert werden
• Einzelne Individuen können sich aber entscheiden, ob Sie als Forscher Experimente am Tier durchführen wollen
oder nicht
http://hirnforschung.kyb.mpg.de/tiere.html
47
!
• Verhalten hat biologische Grundlage, die
sich in elektrochemischen Prozessen im
Körper niederschlägt: viele Prozesse zum
Austausch von Informationen im Körper
sind elektrochemisch
• Die Elektrophysiologie möchte über die
Messung elektrochemischer Prozesse auf
unterschiedlichen zeitlichen und
räumlichen Skalen, diese Prozesse und
deren Mechanismen beschreiben.
Grinvald & Hildesheim., 2004; Uni Freiburg BMI, 2015; Kandel, 2013
48
Zusammenfassung
!
• Für die Messung der elektrochemischen
Aktivität stehen viele Methoden zur
Verfügung
1. Intrazelluläre Messungen
• mit scharfen Elektroden
• mit stumpfen Elektroden (Patch
Clamp)
2. Extrazelluläre Messungen
• zellnah mit kleinen Elektroden
• mit größeren
Elektroden/Multielektroden
• Lineares Elektrodenarray
• Elektrodenraster und
Elektrokortikogramm
49
Zusammenfassung
!
Zusammenfassung
Messung von unterschiedlichen Signalen mit
unterschiedlicher Bedeutung
• Stromfluss einzelner Ionenkanäle
• Ruhemembran einzelner Neurone
• Aktionspotentiale/Spikes einzelner Zellen
(single unit activity)
• Aktionspotentiale/Spikes mehrer Zellen
(multi unit activity)
• Local Field Potential
• …
Buzsáki, 2004
50
Fragen?
Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit!
51
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