04-Elektrophysiologie - Max-Planck-Institut für Kognitions
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Methoden der kognitiven Neurowissenschaften Elektrophysiologie Christopher Gundlach christopher.gundlach@uni -leipzig.de 2 Themenfeld „Elektrophysiologie“ Electrophysiology is the study of the electrical behavior and underlying mechanisms of cells and tissues. Biological information is processed and communicated by various physical modalities, but electrical signals, e.g. action potentials, synaptic and intrinsic membrane currents, are the most prominent in the nervous system. • Klassischerweise werden eine oder mehrere Elektroden in verschiedene Gewebe-Präparationen eingeführt („invasiv“): • lebendes Gewebe, z.B. ins lebende Gehirn • entnommenes Gewebe (akut oder als „Kultur“) • einzelne Zellen des entnommenen Gewebes 3 Verhalten …hat biologische Grundlagen Descartes, 1664 Churchland et al., 1988 4 Verhalten – ist messbar Auf unterschiedlichen Skalen mit unterschiedlichen Methoden Grinvald & Hildesheim., 2004 5 Grundrisse der Zellphysiologie 6 Nervenzellen präsynaptisch postsynaptisch Kandel, 2013 7 Zellmembran ! Vout = 0 mV Vin = -65 mV Doppelschichtige Zellmembran aus Fett-Molekülen (Lipiden): • unpassierbar für wasserlösliche Ionen, Proteine und andere Moleküle, die in der intra- und extrazellulären Flüssigkeit gelöst sind • Austausch zwischen intra- und extrazellulären Stoffen durch spezifische Strukturen in der Zellmembran (Ionen-Kanäle und „Pumpen“). Membranpotential Vm = Vin – Vout Dendriten Axon Zellkörper Myelinscheide 8 Kandel, 2013 ! Zellmembran - Ionen • Ionen sind elektrisch geladene Atome: • Natrium (Na+) • Kalium (K+) • Chlorid (Cl-) • Organische Anionen (A -) • Positiv geladene Ionen: Kationen • Negativ geladene Ionen: Anionen • Außerhalb der Zelle: Höhere Konzentration von Na + und Cl• Innerhalb der Zelle: Höhere Konzentration von K+ und A- Ionen • Man unterscheidet passive Ionenkanäle und aktive Ionenkanäle (Pumpen) • Ionenkanäle sind in der Regel Ionen-spezifisch Kandel, 2013 9 ! Zellmembran - Ruhemembran Equilibrium! Durch Ausgleich des chemischen und elektrischen Gradientens Potential wäre bei -75 mV Ruhemembranpotential: -65 mV [-60 mV bis -70 mV] 10 Kandel, 2013 Zellmembran - Ruhemembran Na+ –K+ Pumpe (aktiv) • Moleküle, die Adenosintriphosphat spalten (ATP) und die daraus gewonnene Energie dazu verwenden 3 Na + aus der Zelle heraus und 2 K + in die Zelle hineinzupumpen. • Höhere Na+ Konzentration im extrazellulären Raum • Höhere K+ Konzentration im intrazellulären Raum • die Na+ –K+ Pumpe erreicht stabilen Zustand der Ionenkonzentrationen und –flüsse über die Zellmembran. • Na+ Wanderung nach außen und K+ Wanderung nach innen ausgeglichen • Ruhepotential (VR) ~ -60 bis -70 mV Kandel, 2013 11 ! Neurone als Signalüberträger Morphologisch definierte Regionen: • Dendriten – hauptsächlich Signalempfang • Zellkörper (Soma) • Axon hillock (oder initial segment, Axonhügel) – Initiierung von Aktionspotentialen • Axon – Hauptsächlich Signalweiterleitung • Präsynaptisches Terminal (Signalübertragung) Neurone sind getrennt durch synaptischen Spalt Hillock – Niedrigste Schwelle, weil hier höchste Dichte von Na + sensitiven Kanälen Kandel, 2013 12 ! Neurone als Signalüberträger Signalübertragung (im Regelfall) ist unidirektional: • von den empfangenden Regionen (meist Dendriten oder Zellkörper) • zur Trigger-Region am Axon • Weiterleitung des Aktionspotentials entlang des Axons • zum synaptischen Terminal Kandel, 2013 13 ! Neurone als Signalüberträger • An Dendriten: zeitliche und räumliche Summation von synaptischen Signalen • Unterschiede je nach Synapse/Transmitter/Verschaltung • EPSP (excitatory postsynaptic potential) • Depolarisierend Reduktion des Membranpotentials (z.B. von –65 mV zu –55 mV) • erhöht Wahrscheinlichkeit für Aktionspotential • IPSP (inhibitory postsynaptic potential) • hyperpolarisierend Vergrößerung des Membranpotentials (z.B. von –65 mV zu –75 mV) • verringert Wahrscheinlichkeit für Aktionspotential Kandel, 2013 14 ! Neurone als Signalüberträger • Auslösung des Aktionspotentials (Spike) an Axonhügel, wenn Depolarisierung Schwelle überschreitet • Führt zu massivem Einfluss von Na + der Ausfluss von K + übersteigt schnelle Steigerung der Depolarisierung Charakteristika des Aktionspotentials • Läuft nach Auslösung mit konstanten Zeit- und Amplitudenverlauf ab, unabhängig von Ausgangsdepolarisierung (Alles-oder-nichtsPrinzip) • Starke Depolarisiering (bis 30 mV) • Rückbildung zu Ruhepotential durch K + Ausfluss • Refraktärzeiten nach Aktionspotential • Absolute Refraktärzeit: 1-2 ms nach Beginn eines Aktionspotentials ist es nicht möglich ein weiteres Aktionspotential auszulösen. • Relative Refraktärzeit: über weitere 5-10 ms ist die Erregungsschwelle für die Auslösung eines Aktionspotentials höher als normal Kandel, 2013 15 Neurone als Signalüberträger Saltatorische Weiterleitung der Aktionspotentiale • Aktionspotentiale “springen” von Ranvierschen Schnürring zu Schnürring • Effektivere Weiterleitung der Signale Kandel, 2013 16 Methoden der Elektrophysiologie 17 Überblick Scanziani & Häusser, 2009 Uni Freiburg BMI, 2015 18 Überblick Ableitung der elektrischen Aktivität Mikroelektroden • Glaspipetten-Elektroden • Metallmikroelektroden: aus Wolfram, Stahl, Platin. • Kohlefaserelektrode: haben keine toxische Wirkung bei Langzeitableitungen. • Mehrkanalelektroden: Bündel verschiedener Kapillaren, erlauben zusätzliche Interventionen wie die Injektion von Transmittern etc. • Büschelelektroden: Breit gestreutes Bündel von Kapillaren um die Aktivität vieler Neuronen abzuleiten. • Unterschiedliche Elektroden messen nicht exakt das gleiche • Größe der Elektroden hat einen Einfluss auf die Sensitivität der Ableitung, aber auch der Lokalisationsgenauigkeit Leica, 2011 19 ! Überblick Formen der Einzelzellableitung • in vitro (außerhalb lebender Organismen / künstliche Umgebung): • an Gewebeschnitten (häufig: Hippocampus) • an vereinzelten Zellen (z.B. das Riesenaxon von Tintenfischen) • in vivo (im lebendigen Organismus): • am wachen Versuchstier: Implantate (“chronisch”) • am anästhetisierten Versuchstier (“akut” oder “chronisch”) • beim Mensch vor Tumor- oder Epilepsieoperationen The Williams Hippocampal Rhythm Laboratory, 2015 • ex vivo (entnommenes lebendes biologisches Material): • Lebendes Gewebe wird entnommen und kann eine begrenzte Zeit kultiviert werden 20 Überblick Chronisch vs. Akut chronisch • Chronische Elektrodenimplantierung • geeignet für Aufzeichnungen von sich bewegenden Tieren akut: • Elektroden nicht fest implantiert • Vor der Messung wird die Elektrode ins Gewebe eingeführt • Nachteile etwa durch Kompression des Gewebes oder Nachwirkungen der akuten Operation Albany Medical College, 2011 21 ! Intrazelluläre Ableitungen • Zwei Elektroden verbunden über Verstärker und Oszilloskop (misst die Spannung zwischen beiden Elektroden) • Eine Elektrode wird in Zelle injiziert • Eine Elektrode positioniert in extrazellulärem Raum Ramón y Cajal, 1899 22 + Hohe Spezifität: Aktivität einzelner Zelle wird gemessen + Messung von Ruhepotentialen möglich invasiv Zelle wird verletzt, begrenzte Lebensdauer Umsetzung in vivo schwierig Nur Messung des Zellkörpers möglich (Messung des Informationstransfers über Axone, Dendriten kaum messbar) Intrazelluläre Ableitungen klassisch Positiv innerhalb Negativ innerhalb Kandel, 2013 23 Intrazelluläre Ableitungen klassisch -Beispiel https://www.youtube.com/watch?v=9qg9-nBjUTc http://ruccs.rutgers.edu/; Hubel & Wiesel, 1959 24 Intrazelluläre Ableitungen klassisch -Beispiel https://www.youtube.com/watch?v=B-H06H86XiM http://ruccs.rutgers.edu/; Hubel & Wiesel, 1959 25 Intrazelluläre Ableitungen Voltage clamp Kandel, 2013 26 Intrazelluläre Ableitungen Voltage clamp 2.) Voltage Clamp Verstärker vergleicht Membranpotential mit Zielpotential 1.) Eine Elektrode misst das Ruhemembranpotential 3.) Wenn das Membranpotential vom Zielpotential abweicht, wird ein Stromfluss ins Axon über eine zweite Elektrode injiziert. Über die Nutzung des Feedbackaufbaus wird das Membranpotential dem Zielpotential angeglichen. 4.) Der Stromfluss der ins Axon fließt, wird gemessen. Die Logik ist, dass die Ströme, die zugeführt werden proportional (und umgekehrt) zu den Strömen sind, die über die Membran abfließen. Kandel, 2013 27 Intrazelluläre Ableitungen Current clamp 28 Intrazelluläre Ableitungen Patch clamp Charité, 2010 del Corsso, 2006 29 Intrazelluläre Ableitungen Patch clamp • Mikropipetten wird auf der Zellmembran aufgesetzt und ein leichter Unterdruck erzeugt • Unterschiedliche Konfigurationen sind möglich: Kandel, 2013 Messung eines einzelnen Ionenkanals 30 • Messung einzelner Ionenkanäle • durch Öffnung des Patch “whole cell” Messung • Perforation erlaubt ebenso die Messung der ganzen Zelle Ashcroft, 2013 ! Extrazelluläre Ableitungen • Zwei Elektroden verbunden über Verstärker und Oszilloskop (misst die Spannung zwischen beiden Elektroden) • Eine Elektrode wird nahe der Zellen positioniert • Eine Elektrode (Referenz) positioniert mit Abstand in extrazellulärem Raum Ramón y Cajal, 1899 31 + Längere Messung einzelner isolierter Neuronen möglich + kein Schaden an zu messender Zelle + Messung bei wachen, lebenden Tieren möglich invasiv Selektive Aufzeichnung bestimmter Zellen • Große Zellen (größeres Aktionspotential) • Sehr aktive Zellen keine Messung des Ruhemembranpotentials Extrazelluläre Ableitungen Was kann gemessen werden? ! Single-Unit Aktivität: • Messung entweder mit Glaspipetten oder Metallelektroden nahe an einer Zelle, Durchmesser der Messspitze 1Micrometer • Ein einzelnes entladendes Neuron, dessen Aktionspotential (Spike) klar isoliert werden kann • Abstand von der zu beobachteten Zelle sollte < 50 μm sein, da sich kurze Aktionspotentiale (0.5-2 ms) über die Zeit nicht aufsummieren, deren Potential mit Entfernung stark abnimmt und deshalb nur lokal beobachtbar sind (im Gegensatz zu LFPs, siehe unten) Multi-Unit Aktivität: • Die Gesamtheit der Aktivität einer unbekannten Anzahl von Neuronen in der Nähe der aufzeichnenden Elektrode • Bei größeren Elektroden wird die Aktivität von mehreren Neuronen aufgezeichnet • Enthält sowohl Aktionspotentiale einzelner Neurone als auch langsamere extrazelluläre Veränderungen ausgelöst durch die Aktivität vieler Neurone 32 Extrazelluläre Ableitungen Was wird gemessen? ! • Das Gehirn besteht aus unterschiedlich gut leitenden Gewebearten • Gleichzeitig laufen elektrochemische Prozesse in den 100 Milliarden (1011) Neuronen und deren 1014 bis 1015 Verbindungen ab • In jedem Areal im Gehirn spiegelt die elektrische Aktivität die Überlagerung aller elektrochemischen Prozesse wieder (der Einfluss nimmt jedoch mit der Entfernung zur Messelektrode ab) • Summenaktivität von Neuronen im Umkreis von mm bis cm • an jeder Elektrode wird das Local Field Potential (LFP) gemessen • Das LFP stellt die Summe der elektrische Ströme dar, die durch neuronale Aktivität und daraus resultierende Wanderung von Ionen entstehen • es enthält neben den Aktionspotentialen einzelner Neurone auch extrazelluläre Feldveränderungen die aus weiteren Quellen resultieren: • Synaptische Ströme (Neurotransmitter getriggerter lokaler Einstrom von Na+, Ca+) • Somatodendritische Ströme vieler gleichzeitig aktiver Neurone 33 Extrazelluläre Ableitungen Was wird gemessen? • Das LFP stellt die Summe der elektrische Ströme dar, die durch neuronale Aktivität und daraus resultierende Wanderung von Ionen entstehen Zschocke, 2000 Birbaumer & Schmidt, 2003 34 Extrazelluläre Ableitungen Quain Quiroga & Panzeri, 2009 35 Extrazelluläre Ableitungen Trennung der Komponenten im Signal • Bestandteile haben unterschiedliche zeitliche Dynamiken: ! • Spikes haben schnelle Dynamiken hohe Frequenzanteile high pass filter (300– 5000 Hz) • LFPs haben langsame Dynamiken niedrige Frequenzanteile low pass filter (0.1–300 Hz) • Spikes lassen sich (idealerweise) aufgrund von bestimmten Parametern einzelnen Neuronen zuweisen (spike sorting) Quain Quiroga & Panzeri, 2009 36 Extrazelluläre Ableitungen Trennung der Komponenten im Signal Schwierigkeiten – Spike sorting ! • Individuale Spikes werden nicht direkt in neurophysiologischen Experimenten aufgezeichnet • Die an einer Elektrode aufgezeichneten extrazellulären Potentiale repräsentieren die simultane elektrische Aktivität einer unbekannten Anzahl von Neuronen • Von diesen Aufzeichnungen muss folgendes identifiziert werden: • Spike-Events oder Aktionspotentiale • Die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen • und jeder Spike muss dem Neuron zugeordnet werden, welches es produzierte Brown et al., 2004 37 Extrazelluläre Ableitungen Trennung der Komponenten im Signal Schwierigkeiten – Spike sorting ! gut isoliertes Neuron schlecht isoliertes Neuron 2 1 Lewicki., 1998 38 Extrazelluläre Ableitungen Trennung der Komponenten im Signal Verbesserung durch spezielle Multielektroden • Tetrode: Elektrode mit mehreren (hier: vier) electrode tips • Aufgrund der räumlichen Anordnung der tips zu den umliegenden Neuronen, bildet sich jedes Neuron leicht anders auf den vier tips ab • erlaubt u.U. die bessere Trennung von Neuronen (spike-sorting) Buzsáki, 2004 39 Extrazelluläre Ableitungen Trennung der Komponenten im Signal Modernes Spike Sorting Einevoll et al., 2012 40 Extrazelluläre Ableitungen Trennung der Komponenten im Signal Darstellung der Aktivität ! Bsp.: Aktivität eines Inferior colliculus Neuron (Teil der Hörbahn) einer Ratte bei auditiver Stimulation (Ton alle 3 s) • Rasterplot • x-Achse = Zeit, y-Achse = einzelne Stimuli • Punkte repräsentieren spike • Peri-stimulus time histogram (PSTH) • Peri-stimulus = alle Trials/Zeitepochen werden auf ein bestimmtes Event/Stimulus zentriert: hier die Präsentation eines Tons • Time histogram = Teile die Zeitepoche in eine Serie von bins (kleinere Zeitabschnitte) und zähle wie viele Spikes in jedes bin fallen 41 ! Extrazelluläre Ableitungen • Lineares Elektroden Array (Multielektroden) • Eine Elektrode wird in Gewebe platziert, in unterschiedlichen Schichten • Eine Elektrode (Referenz) positioniert mit Abstand in extrazellulärem Raum + Elektrode hat mehrere Messpunkte entlang der Elektrode erlaubt Aufzeichnung der Aktivität in unterschiedlichen Schichten single unit Aktivität bedingt messbar Ramón y Cajal, 1899 42 Extrazelluläre Ableitungen Charakterisierung der Aktivität in unterschiedlichen Schichten • LFP-Aktivität (niedrigfrequente Signale: beeinflusst durch synaptische Transmembran- und Rückflusströme) • Multiunit-Aktivität (hauptsächlich Aktionspotentiale) • Current Source Density (Maß für räumliches Muster der LFPs) Bollimunta et al., 2011 43 Extrazelluläre Ableitungen ! Elektrokortikographie • Elektroden Array, Multielektrodenraster unterschiedlicher Größe positioniert unter dem Schädel, auf Hirngewebe + Mehre Messpunkte räumlich verteilt + Direkte Messung ohne störenden Einfluss des Schädels höheres Signal-Rausch-Verhältnis, höhere räumliche Präzision + Stimulation und Messung gleichzeitig möglich - Messung nur über begrenzte Zeit - Eingeschränktes Messfeld (Planung der Elektrodenpositionierung) - Risikobehaftete Operation notwendig Albany Medical College, 2011 Stanford School of Medicine, 2015 44 Extrazelluläre Ableitungen Elektrokortikographie • im Menschen häufiger Einsatz bei der Operationsplanung bei schwerer Epilepsie Identifizierung epileptogener Zonen Identifizierung motorischer und sensorischer Areale durch Stimulation Alexander et al., 2013 45 Ethik Bei jedem Tierversuch fordert das Tierschutzgesetz: „Es muss immer die sinnesphysiologisch am niedrigsten entwickelte Tierart eingesetzt werden, die erlaubt, die entsprechende Frage zu beantworten“ … (ff.) “Rhesusaffen werden deshalb so oft für Versuche genommen, da sie ein äußerst differenziertes Sozialverhalten aufweisen und viele kognitive Leistungen erbringen, die denen des Menschen sehr ähnlich sind. Außerdem besteht aufgrund ihrer jahrelangen Erforschung ein breit umfassendes Detailwissen über Aufbau und Funktion ihres Gehirns. Für die Versuche am Max-Planck-Institut werden in der Regel erwachsene Affen im Alter zwischen 5 und 15 Jahren eingesetzt. Die meisten Experimente bestehen aus recht komplexen kognitiven Aufgaben. Damit sie die Aufgaben lösen können, müssen die Tiere bereit sein, konzentriert mitzuarbeiten. Dies gelingt nur, wenn sie gesund sind und sich in ihrer Umgebung wohl fühlen.” http://hirnforschung.kyb.mpg.de/tiere.html 46 Ethik • Forschung mit Tieren ist durch die Forschungsinstitution und durch staatliche Institutionen stark reglementiert. • Jede Studie muss vorab geprüft und genehmigt werden. • Auch bei Experimenten mit bspw. Mäusen muss die Verwendung jedesTieres vorab gerechtfertigt werden Wichtiger aber: “Nur Tiere, die richtig gehalten werden, eignen sich für die Forschung. Die richtige Haltung und Pflege von Versuchstieren ist daher nicht einfach nur ein Ausdruck einer humanen Einstellung zivilisierter Leute – sie liegen auch im gesunden Eigeninteresse des Wissenschaftlers. • Die Entscheidung darüber, ob Experimente am Tier und an welchen Tieren ethisch vertretbar ist, ist eine gesamtgesellschaftliche Entscheidung und keine von einem einzelnen Individuum • Sie folgt also aus staatlichen sowie demokratischen Praktiken und Diskursen; Regeln für Experimente am Tier werden dort bestätigt oder geändert, und können dort eingefordert werden • Einzelne Individuen können sich aber entscheiden, ob Sie als Forscher Experimente am Tier durchführen wollen oder nicht http://hirnforschung.kyb.mpg.de/tiere.html 47 ! • Verhalten hat biologische Grundlage, die sich in elektrochemischen Prozessen im Körper niederschlägt: viele Prozesse zum Austausch von Informationen im Körper sind elektrochemisch • Die Elektrophysiologie möchte über die Messung elektrochemischer Prozesse auf unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Skalen, diese Prozesse und deren Mechanismen beschreiben. Grinvald & Hildesheim., 2004; Uni Freiburg BMI, 2015; Kandel, 2013 48 Zusammenfassung ! • Für die Messung der elektrochemischen Aktivität stehen viele Methoden zur Verfügung 1. Intrazelluläre Messungen • mit scharfen Elektroden • mit stumpfen Elektroden (Patch Clamp) 2. Extrazelluläre Messungen • zellnah mit kleinen Elektroden • mit größeren Elektroden/Multielektroden • Lineares Elektrodenarray • Elektrodenraster und Elektrokortikogramm 49 Zusammenfassung ! Zusammenfassung Messung von unterschiedlichen Signalen mit unterschiedlicher Bedeutung • Stromfluss einzelner Ionenkanäle • Ruhemembran einzelner Neurone • Aktionspotentiale/Spikes einzelner Zellen (single unit activity) • Aktionspotentiale/Spikes mehrer Zellen (multi unit activity) • Local Field Potential • … Buzsáki, 2004 50 Fragen? Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit! 51
