Aktivitätstest der Aminoacylase - Institut für Organische Chemie

Chemisch-organisches Praktikum II
Ferienkurs
WS 2006/2007
Gruppenpräparat zu 10.2.3
Aktivitätstest der Aminoacylase
zur enzymatischen Racematspaltung von D/L-Methionin
Apfel, Katharina
Hefner, Timo
Renz, Manuel
Schlag, Vanessa
Schütz, Max
Werner, Katharina
1
Inhalt
1.
EINLEITUNG........................................................................................................3
1.1.
Bedeutung der Aminoacylase................................................................................................. 3
1.2.
Aktivitätstest ............................................................................................................................. 3
2.
MOTIVATION UND ZIEL .....................................................................................4
3.
LITERATURRECHERCHE ..................................................................................5
4.
VORGEHENSWEISE UND PLANUNG DES AKTIVITÄTSTESTS......................6
4.1.
Schnelltest ................................................................................................................................ 6
4.2.
Quantitativer Aktivitätstest...................................................................................................... 7
5.
EXPERIMENTALTEIL .........................................................................................7
5.1.
Darstellung von N-acyl-D/L-Methionin ................................................................................... 7
5.2.
Markierung des freien L-Methionin durch Dansylchlorid .................................................... 8
5.3.
Ninhydrin-Test .......................................................................................................................... 8
6.
ERGEBNISSE DES AKTIVITÄTSTEST DER ACYLASE..................................11
7.
DISKUSSION UND AUSBLICK.........................................................................17
8.
ANHANG............................................................................................................18
2
Einleitung
1.1 Bedeutung der Aminoacylase
Es besteht offenkundig ein großes Interesse an enantiomerenreinen α-, wie auch βAminosäuren in Bezug auf ihre pharmazeutische und lebensmittelchemische
Nutzung. [1] Zur Racematspaltung von D/L-Aminosäuren verwendet man heute noch
oft „klassisch“ chemische Reaktionen, bei denen chirale Auxiliare stöchiometrische
eingesetzt werden müssen. [2] Auf der Suche nach einfacheren, katalytischen
Methoden stellten enzymatische Racematspaltungen eine viel versprechende und
wie sich herausstellte effektive Möglichkeit dar.
So bietet die Spaltung von N-acylierten D/L-Aminosäuregemischen durch
Aminoacylasen einen Zugang zu enantiomerenreinen L-Aminosäuren, während die
D-Isomere nicht gespalten werden. Diese Acylasen werden beispielsweise von
Schimmelpilzen wie Aspergillus mellus sezerniert und besitzen die Fähigkeit, nur das
L-Isomer zur freien Aminosäure zu hydrolysieren. [3] Voraussetzung für diese
Selektivität ist eine grundlegende Eigenschaft von Enzymen, ihre Spezifität für ein
Substrat. In diesem Fall passt lediglich das acylierte L-Isomere in das aktive Zentrum
des Enzyms und nur so kann es hydrolysiert werden. Die Aminoacylase aus
Aspergillus mellus eignet sich für die Racematspaltung einer Vielzahl von N-acyl-D/LAminosäuren, wie beispielsweise hier in diesem Versuch eingesetztes D/L-Methionin.
1.2 Aktivitätstest
Definition Aktivität:
Die Aktivität eines Enzyms ist ein Maß dafür, wie schnell ein Substrat zu einem
Produkt umgesetzt wird. Sie hängt von der Menge des Enzyms und von seiner
Effizienz ab, so dass mit Vorteil normierte Größen verwendet werden.
Die Anwendbarkeit ist nicht auf Enzyme beschränkt, sondern kann sinngemäß auch
für andere Katalysatoren verwendet werden.
Die Enzymaktivität kann über eine geeignete Umsetzungsreaktion bestimmt werden
(Enzymkinetik). Dafür ist die Kenntnis folgender Daten notwendig:
•
•
•
•
•
•
die Stöchiometrie des Umsatzes
die Gleichgewichtslage der Reaktion
die Erfordernis von Kofaktoren (Metallionen, Coenzyme)
die Michaeliskonstanten, d.h. Km-Werte (Affinitätsparameter) für Substrat und
Kofaktoren
das pH-Optimum
die Stabilität des Enzyms unter den Bedingungen des Tests
Generell werden diese Daten bei optimalen pH-Wert und bei 25 °C gemessen.
Unter diesen Bedingungen ist die Reaktionsanfangsgeschwindigkeit ein Maß der
Enzymkonzentration.
3
Einheiten der Enzymaktivität :
Für die Enzymaktivität gibt es zwei verschiedene Einheiten, die verwendet werden
können:
•
•
enzyme unit: diese Einheit ist definiert als diejenige Enzymmenge, die unter
Standardbedingungen (pH = 8, 37 °C) pro Minute ein μmol Substrat umsetzt
katal: diese SI-Einheit (Symbol kat) ist die Enzymaktivität ausgedrückt als mol
umgesetztes Substrat pro Sekunde.
Die beiden Systeme sind folgendermaßen miteinander gekoppelt:
•
•
1 kat = 6 . 107 enzyme units
1 enzyme unit = 16,67 x 10-9 kat = 16,67 nkat
Zur Feststellung der Enzymaktivität wird zuerst die Volumenaktivität einer
bestimmten Menge der zu untersuchenden Lösung bestimmt und hieraus dann die
spezifische Aktivität berechnet.
2. Motivation und Ziel
Enzyme eignen sich zwar hervorragend zur Racematspaltung, doch stellt ihre
Handhabung immer wieder ein Problem in Labor und Technik dar. Es gilt zum einen
ihre optimalen Arbeitsbedingungen auszutesten, zum anderen müssen sie richtig
gelagert werden, um ihre Aktivität zu erhalten.
Im Praktikumsversuch 10.2.3 gilt es eine Racematspaltung von D/L-Methionin mit
Hilfe der Aminoacylase aus Aspergillus mellus von Fluka durchzuführen. Der erste
Schritt besteht aus der N-Acylierung des racemischen Gemisches. Anschließend soll
nur das L-Isomer enzymatisch hydrolysiert werden.
O
HH2
Ac2O, HOAc
S
3 h, RT
COOH
HN
O
S
HN
S
pH 7-9, RT, 1h
Acylase, CoCl2,
NaOH, H2O
HH2
COOH
S
COOH
COOH
Laut Hersteller Fluka soll das Enzym bei 4°C gelagert werden. Darüber hinaus ist
darauf zu achten, das Enzym vor Verunreinigungen zu schützen, da diese die
Aktivität hemmen. Da im Praktikumsbetrieb nicht immer sorgfältig mit dem Material
umgegangen wird, ist es von Interesse, das Enzym vor dem Einsatz im
Praktikumsversuch auf dessen noch vorhandene Aktivität, laut Hersteller 1-2U/mg,
zu testen.
4
Ziel sollte es sein, einen möglichst einfachen und schnellen Aktivitätstest zu
entwickeln, der es ermöglicht vor der eigentlichen Racematspaltung die
Aminoacylase auf deren Aktivität hin zu testen. Dieser Test sollte dabei ohne großen
Material- und Zeitaufwand im Rahmen des Praktikums durchführbar sein.
3. Literaturrecherche
Wichtige Literatur zu dieser Aufgabe wurden in den Datenbanksystemen SciFinder
Scholar und Beilstein Crossfire gefunden. Ebenso ergab die weitere
Internetrecherche einige verwertbare
Informationen
zu Enzymen
und
Enzymaktivitätstests. Das direkte Anschreiben der Enzymhersteller- Firmen lieferte
noch abschließend Erkenntnisse über die Versuche zu Enzymaktivität.
Nachstehend ist eine kurze Zusammenfassung der Quellen aufgeführt:
[1] L-Methionine related L-amino acids by acylase cleavage of their corresponding Nacetyl-DL-derivates, Andreas S. Bommarius, Karlheinz Drauz, Kurt Günther,
Günter Knaup, Michael Schwärm, Tetrahedron: Asymmetry, 1997, Vol.8, Nr. 19,
pp. 3197-3200
Dieser Artikel geht kurz und knapp auf die Synthese und Isolierung von N- Acetyl-DLAminosäuren ein, sowie auf den Grund, warum man die reinen D- oder L- Aminosäuren zu
synthetisieren versucht. Der Schwerpunkt liegt aber eher auf den kinetischen Messungen der
enzymatischen Racematspaltung.
[2] The first aminoacylase-catalyzed anantioselective synthesis of aromatic β-amino
acids, Harald Gröger, Harald Thrathwein, Stefan Buchholz, Karlheinz Drauz,
Christiane Sacherer, Sylvie Godfrin, Helge Werner, Org. Biomol. Chem. 2004, 2,
1977-1978
In diesem Artikel geht es hauptsächlich um die enantioselektive Synthese von β-Aminosäuren,
aber es gibt auch Auskunft über die Spezifität der Aminoacylase I.
[3] Verfahren zur optischen Spaltung von racemischen Aminosäuren, Tanabe,
SEIYAKU Co., LTD, Osaka, Japan, Offenlegungsschrift: 2105009,
16.September.1931
Dieses Verfahren geht auf die Gewinnung und die Verbesserung der Aktivität der Acylase ein.
Daneben geht die Offenlegungsschrift auf die Eigenschaften und die Handhabung des Enzyms
ein.
[4] Acylase „Amano“ (Datenplatt), Amano Enzyme
enzyme.co.jp/pdf/synthe_e/cat_synthe_AC-S_e.pdf
Inc.,
http://www.amano-
Dies ist eine Auflistung der Parameter (Temperatur, Puffer, pH,..) bei welche die Acylase optimal
arbeitet. Weiterhin ist es eine Vorschrift für einen standardisierten Aktivitätstest zur Prüfung der
genauen Aktivität.
The Resolution of Amion Acids: III Methionine, Glynn P. Wheeler, A.W. Ingersoll
J. Chem. Soc. 1951, 73, 4604-4606
In diesem Paper ist die Synthesevorschrift für N-Acyl-DL-Methionin beschrieben. Diese Vorschrift
wurde aber nicht verwendet, da eine Gruppe im OPII WS 2005/2006
eine
verbesserte Versuchsvorschrift entwickelt hat, nach welcher dann auch die Synthese erfolgte.
5
Enzymatic Assay of ACYLASE I (EC 3.5.1.14) von Fluka (SSACET01-Revised
11/11/95)
Dies ist eine ausführliche Versuchsvorschrift für einen Aktivitätstest, der industriell verwendet
wird, um die genaue Aktivität eines Enzyms zu ermitteln.
Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, Degussa AG 40474 Düsseldorf, DE,
Prof. Andreas Bommarius, Dr. Stefan Verseck, Prof. Karlheinz Drauz,
Offenlegungsschrift: DE 100 50 123 A1, 25.4.2002
Wie das Unternehmen sagt, geht es hier um ein Verfahren zur Herstellung optisch angereicherten
Aminosäuren und deren Verwendung. Insbesondere richtet sich das Verfahren zum einen auf die
Racemisierung, zum anderen auf das Entschützen von speziellen N-geschützten Aminosäuren.
Dabei findet man in diesem Paper auch einen Nachweisverfahren der Racemaseaktivität der
rekombinanten N-acetylaminosäureracemaseaktivität aufweisenden Enzymen.
H. Naumer, W. Heller (Hrsg.) (1990) Untersuchungsmethoden in der ChemieEinführung in die moderne Analytik. Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York
In diesem Buch werden einige Analysetechniken in der Chemie ausführlich erklärt.
H.-P. Kleber, D. Schlee, W. Schöpp (1997) Biochemisches Praktikum. Gustav
Fischer Verlag Jena, Stuttgart, Lübeck, Ulm
Versuchsvorschriften zu Aktivitätstests und Synthesen mit Enzymen sind in diesem Buch
beschrieben.
F. Horn, Biochemie des Menschen, Das Lehrbuch für das Medizinstudium. Georg
Thieme Verlag Stuttgart, New York. ISBN 3-8274-1303-6
L. Stryer (2003) Biochemie, spektrum Akademischer Verlag Heidelberg- Berlin
Hier findet man allgemeines zu Aminosäuren und Enzymen.
F. Zorbas Lottseich (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag HeidelbergBerlin
4. Vorgehensweise und Planung des Aktivitätstests
4.1 Schnelltest
Für den Einsatz von Enzymen im Praktikumsversuch ist es wünschenswert, kurz vor
dem Gebrauch des Enzyms dessen prinzipielle Aktivität ohne großen Aufwand zu
testen. Bei der Entwicklung eines Schnelltest für die Aminoacylase bot sich die
Markierung des freien L-Methionins als aussichtsreiche Möglichkeit an.
Bei der Analyse der N-terminalen Aminosäure von Peptidsequenzen kann man diese
gezielt durch fluoreszierende Reagenzien wie Dabsylchlorid, Dansylchlorid etc.
markieren und identifizieren. Dieses Prinzip, die freie Aminogruppe des deacylierten
L-Methionins als Indikator für die Aktivität der Aminoacylase zu markieren, bot sich
als gute Möglichkeit für einen Schnelltest an, da sich die derivatisierte Aminosäure
mittels Dünnschichtchromatographie analysieren lässt. Das N-acyl-D/L-MethioninRacemat kann dabei keine Reaktion mit dem Markierungsreagenz eingehen, da es
keine freie Aminogruppe besitzt.
6
4.2 Quantitativer Aktivitätstest
Da eine quantitative Aussage über die Aktivität von Enzymen für deren Einsatz in
Bezug auf Menge und Reaktionszeit von großem Interesse ist, gilt es neben dem
Schnelltest auch noch einen Test zu entwickeln, der ein quantitatives Ergebnis liefert.
Die Literaturrecherche lieferte drei von Enzymherstellern angebotenen Aktivitätstest
für die Aminoacylase aus Aspergillus mellus, von denen im Rahmen des Praktikums
einer als ohne Probleme durchführbar erachtet wurde. Bei allen drei Tests nutzt man
die Absorption eines aus zwei Ninhydrineinheiten über in situ hergestellten
Ammoniak aus L-Methionin verbrückten, blauvioletten Farbstoffes bei 570 nm aus,
um auf die Aktivität zu schließen (siehe Schema 2).
5. Experimentalteil
5.1 Darstellung von N-acyl-D/L-Methionin
10.4 g (69.8 mmol) D-/L- Methionin (racemisch) wurden in 102.2 g (97.6 mL, 698
mmol) reiner Essigsäure (da leider kein Eisessig vorhanden war, wurde 96%ige
Essigsäure ausgefroren) gelöst. Zu der so hergestellten klaren Lösung wurden unter
der Annahme, dass immer noch ein Restwassergehalt von 2% in der Essigsäure
vorhanden war, 29.6 g (27.6 mL, 291 mmol) Essigsäureanhydrid gegeben. Bei
Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch für 2.5 h gerührt. Anschließend wurde
die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und das erhaltene gelbe Öl im
Hochvakuum getrocknet. Danach wurde es mit 15 ml Wasser versetzt und zur
Kristallisation im Kühlschrank stehen gelassen. Die Kristalle wurden über einer Fritte
abgesaugt, mit 10 mL kaltem Wasser, mit 5 mL kaltem Diethylether gewaschen und
im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet.
7
Charakterisierung
IR-Spektrum: (siehe Anhang, mit Vergleichsspektrum)
ν% = 3340 cm −1(N − H − Valenzschwingung )
ν% = 2970 und 2920 cm −1(C − H − Valenzschwingungen gesättigt )
ν% = 1690, 1620 und 1570 cm −1(C = O − Valenzschwingungen )
5.2 Markierung des
(Schnelltest)
freien
L-Methionin
durch
Dansylchlorid
Die folgenden Lösungen werden benötigt:
1. Substrat-Lösung (0.1M N-acyl-D/L-Methionin)
i) Lösen von 0.48g N-acyl-D/L-Methionin in 10ml Wasser und 2ml 1M NaOH
ii) Der pH-Wert wird mit 1/10N NaOH auf pH=8 eingestellt.
iii) Mit Wasser auf 25 ml verdünnen
2. 0.1M Phosphat-Puffer, pH=8
i) 14.2 g di-Natriumhydrogenphosphat in 1000 ml Wasser lösen
ii) mit NaOH auf pH=8 einstellen
3. 0.5 mM Cobalt-(II)-Chlorid
i) 118 mg CoCl2·6H2O zu 1 ml Lösung mit Wasser auffüllen
4. Enzym-Lösung
i) 0.50 g Enzym in wenig Wasser lösen
ii) Auf 500ml Wasser auffüllen
iii) 5 ml dieser Lösung nochmals auf 100 ml Lösung verdünnen
5. 0.2 M NaHCO3
i) 1.68 g Natriumhydrogencarbonat auf 100 ml Wasser
Für den Schnelltest der Reaktivität der Aminoacylase kann, wie oben beschrieben,
die freie Aminogruppe des deacylierten L-Methionins zur Markierung mit
Dansylchlorid und somit zum Nachweis der Reaktion genutzt werden.
Hierzu wurde wie folgt vorgegangen:
1. Im Reagenzglas wurden 2 ml Phosphat-Puffer (pH=8), 1 ml Cobaltchlorid-Lösung
und 1 ml Enzymlösung gegeben.
2. Anschließend wurde für 5 min bei 37°C gerührt, mit 1 ml Substratlösung versetzt
und nach weiterem Rühren bei 37°C nach 15 bzw. 30 min jeweils eine Probe
entnommen.
3. Die entnommenen Proben wurden jeweils 3 min in kochendem Wasser erhitzt
(zur Denaturierung des Enzyms).
4. Nach der Denaturierung wurden die Proben mit jeweils 0,1 ml einer 0,2 M
NaHCO3-Lösung und 0,05 ml Dansylchlorid-Lösung in Aceton versetzt und 30
min bei 40 °C gerührt.
8
Die Proben wurden nun zusammen mit einer Referenzlösung des N-acyl-D/LMethionin-Racemats auf eine DC-Platte aufgebracht.
Laufmittel: n-Butanol/Eisessig/Wasser 4/1/1.
5.3 Ninhydrin-Test (Quantitativer Aktivitätstest)
Der quantitative Aktivitätstest nach Amano wurde wie in Literatur [4] beschrieben
durchgeführt.
Hierzu werden die folgenden Lösungen benötigt:
1. Substrat-Lösung (0.1M N-acyl-D/L-Methionin)
i) Lösen von 0.48g N-acyl-D/L-Methionin in 10ml Wasser und 2ml 1M NaOH
ii) Der pH-Wert wird mit 1/10N NaOH auf pH=8 eingestellt.
iii) Mit Wasser auf 25 ml verdünnen
2. Ninhydrin-Lösung
i) Lösen von 1.00 g Ninhydrin in 25ml Ethylenglycolmonoethylether
ii) 25 ml der Puffer-Lösung (3) zugeben
iii) In einer dunklen Flasche aufbewahren
3. Puffer-Lösung, pH=5
i) 21.0 g Zitronensäure in 200 ml 1N NaOH-Lösung
ii) Verdünnen mit Wasser auf 500 ml
4. Zinn-(II)-Chlorid-Lösung
i) 0.20 g SnCl2·2H2O in 12.4 ml Puffer-Lösung (3) geben.
ii) Wichtig: Erst kurz vor Gebrauch herstellen
5. 50% n-Propanol-Lösung
i) Lösung aus 50% n-Propanol und 50% Wasser herstellen
6. 0.1M Phosphat-Puffer, pH=8
i) 14.2 g di-Natriumhydrogenphosphat in 1000 ml Wasser lösen
ii) mit NaOH auf pH=8 einstellen
7. 0.5 mM Cobalt-(II)-Chlorid
i) 118 mg CoCl2·6H2O zu 1 ml Lösung mit Wasser auffüllen
8. Enzym-Lösung
i) 0.50 g Enzym in wenig Wasser lösen
ii) auf 500ml Wasser auffüllen
iii) 5 ml dieser Lösung nochmals auf 100 ml Lösung verdünnen
Durchführung des Aktivitätstests:
1. In elf Reagenzgläsern wurden jeweils 2 ml Phosphat-Puffer (pH=8), 1 ml
Cobaltchlorid-Lösung und 1 ml Enzymlösung gegeben
2. Zehn Reagenzgläser (1-10) wurden für 5 min bei 37°C gerührt und anschließend
mit 1 ml Substratlösung versetzt und für weitere 15 (RG 1-5) bzw. 30 min (RG 610) bei 37°C gerührt
9
3. Es wurden 0.5 ml (RG 1-3 sowie 6-8) bzw. 0.25 ml (RG 4,5 sowie 9,10) in ein
weiteres Reagenzglas überführt und 3 min in kochendem Wasser erhitzt (zur
Denaturierung des Enzyms)
4. Die Lösung wurde anschließend auf Raumtemperatur gekühlt und mit 1 ml
Ninhydrin-Lösung und 0.1 ml Zinnchlorid-Lösung versetzt.
5. Um die Farbe zu entwickeln wurde das Reaktionsgemisch für 20 min in
kochendem Wasser erhitzt
6. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung mit 20 ml 50% n-Propanol verdünnt.
7. Für die Referenzlösung wurden aus dem verbliebenen Reagenzglas (Ref) sofort
nach den Versetzen mit 1 ml Substrat-Lösung 0.5 ml in ein anderes Reagenzglas
überführt und mit Punkt 3 fortgefahren
8. Es wurde jeweils ein Absorptionsspektrum der Lösungen (1-10) gegen die
Referenzlösung (Ref) gemessen (Maximum bei 570 nm).
Abb. 1: Reagenzgläser nach Entwicklung der Farbe
10
6. Ergebnisse des Aktivitätstest der Acylase
6.1 Markierung des
(Schnelltest)
freien
L-Methionin
durch
Dansylchlorid
Auf der DC Platte ist ersichtlich, dass in 15 bzw. 30 Minuten schon das N-acyl-D/LMethionin durch die Acylase deacyliert wurde. Das Enzym muss folglich noch aktiv
sein, wobei über dessen quantitative Aktivität keine Aussage gemacht werden kann.
6.2 Ninhydrin-Test (Quantitativer Aktivitätstest)
Abb. 1: Absorptionsspektrum Reagenzglas 1: Reaktionszeit 15 min, 0.5 ml der Lösung denaturiert.
11
Abb. 2: Absorptionsspektrum Reagenzglas 2: Reaktionszeit 15 min, 0.5 ml der Lösung denaturiert.
Abb. 3: Absorptionsspektrum Reagenzglas 3: Reaktionszeit 15 min, 0.5 ml der Lösung denaturiert.
12
Abb. 4: Absorptionsspektrum Reagenzglas 4: Reaktionszeit 15 min, 250 µl der Lösung denaturiert.
Abb. 5: Absorptionsspektrum Reagenzglas 5: Reaktionszeit 15 min, 250 µl der Lösung denaturiert.
13
Abb. 6: Absorptionsspektrum Reagenzglas 6: Reaktionszeit 30 min, 0.5 ml der Lösung denaturiert.
Abb. 7: Absorptionsspektrum Reagenzglas 7: Reaktionszeit 30 min, 0.5 ml der Lösung denaturiert.
14
Abb. 8: Absorptionsspektrum Reagenzglas 8: Reaktionszeit 30 min, 0.5 ml der Lösung denaturiert.
Abb. 9: Absorptionsspektrum Reagenzglas 9: Reaktionszeit 30 min, 250 µl der Lösung denaturiert.
15
Abb. 10: Absorptionsspektrum Reagenzglas 10: Reaktionszeit 30 min, 250 µl der Lösung denaturiert.
Mittelwerte der Absorption
Reagenzgläser 1-3:
Reagenzgläser 4-5:
Reagenzgläser 6-8:
Reagenzgläser 9-10:
0.623
0.350
0.943
0.525
Berechung der Enzymaktivität
Eine unit ist definiert als die Menge an Enzym, die in 30 Minuten ein µmol LMethionin unter den oben genannten Bedingungen produziert.
30
Acylaseaktivität [units/g]=6.02 ⋅ 10-2 ⋅ E ⋅ a ⋅
t
E
Absorption bei 570 nm
a
Verhältnis von hergestellter Lösung (Punkt 1 und 2) zu entnommener Lösung
(Punkt 3).
In unserem Fall ist a entweder 10 (RG 1-3, 6-8) oder 20 (RG 4-5, 9-10).
t
Enzymreaktionszeit (15 oder 30 Minuten)
Der Vorfaktor beruht auf experimentell bestimmten Daten der Firma Amano Enzyme
Inc. Jp.
Damit ergeben sich folgende Aktivitäten [units/g]:
Reagenzgläser 1-3:
Reagenzgläser 4-5:
0.751
0.844
16
Reagenzgläser 6-8:
Reagenzgläser 9-10:
0.568
0.633
Mittelwert
0.699
Dieser Wert scheint ganz realistisch zu sein, da auf der Verpackung des Enzyms
eine Aktivität von mindestens 1.6 unit/g angegeben wurde, wobei diese Verpackung
nicht frisch geöffnet wurde sondern schon über einen längeren Zeitraum offen stand.
7. Diskussion und Ausblick
Im Rahmen der Möglichkeiten des organisch-chemischen Praktikums konnte sowohl
mit dem Schnelltest mit Dansylchlorid aber vor allem mit dem quantitativen
Aktivitätstest der Enzymaktivität der Aminoacylase nach der Anleitung von Amano
ein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt werden. Dabei ist allerdings zu
berücksichtigen, dass die Voraussetzungen im Labor nicht optimal waren: Beim
Einwiegen der Substanzen standen keine justierten Feinwagen zur Verfügung.
Darüber hinaus mussten alle Lösungen mittels Spritzen und nicht mit Pipetten oder in
Messkolben der Güteklasse B abgemessen werden. Diese Messfehler sind bei der
Interpretation der berechneten Enzymaktivität zu berücksichtigen. Davon abgesehen
war es möglich innerhalb eine Tages das Enzym auf seine Aktivität hin zu testen.
Zur Darstellung des acylierten D-/L-Methionin bleibt noch zu sagen, dass sich die
Kristallisation als schwierig herausstellt und das Produkt auch nicht komplett Edukt
frei war. Die lies sich allerdings der Reaktionskontrolle (DC angefärbt mit Ninhydrin)
nicht entnehmen und das IR sah sauber aus, doch die Färbung mit Dansylchlorid
zeigt dass auch dort noch leicht Spuren an D-/L-Methionin vorhanden waren. Es
wäre vielleicht sinnvoller in Zukunft die Reaktionskontrolle mit Dansylchlorid
anzufärben, insofern dies die Möglichkeiten des Praktikums zu lassen.
Es wäre interessant mit dem oben beschriebenen Aktivitätstest auch noch den
Einfluss der Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Pufferzusammensetzung und
pH-Wert zu optimieren, um die maximale Aktivität der Aminoacylase bei der
Racematspaltung von D-/L-Methionin zu erzielen.
Da das getestete Enzym schon seit längerem geöffnet im Kühlschrank aufbewahrt
wurde, stellt sich die Frage, wieviel seiner Aktivität verloren gegangen ist. Auch wenn
die Aminoacylase laut Hersteller bei 4°C aufbewahrt werden kann, legen die
Bedingungen im Labor, d.h. mehrmaliges Öffnen des Kühlschranks täglich und
Entnahme des Enzym durch verschieden Personen, nahe, dass es zum einen zu
warm geworden und zum anderen verschmutzt worden ist. Man könnte nun mit einer
neuen Packung Aminoacylase die Aktivität des neuen und alten Enzyms vergleichen
und so eine Aussage über den Aktivitätsverlust mit der Zeit nach der Öffnung
gewinnen.
Es wäre auch interessant die Aktivität des Enzyms noch auf weitere Varianten zu
testen: Im Praktikum gäbe es noch die Möglichkeit mittels HPLC einfach und schnell
die Aktivität des Enzyms zu testen. Ein Problem bei dieser Variante könnte allerdings
die Aufbereitung der Lösungen für die HPLC darstellen.
17
8. Anhang
IR-Spektren
18