Pharma-Kurs Script SS13

Medizinische Mikrobiologie
Pharmazie Kurs
K. Zimmermann
FLI f. Medizin. Mikrobiologie
Methoden zum Nachweis von Mikroorganismen
• Mikroskopie
– Lichtmikroskopie
• Nativpräparate
• Färbungen
– Übersichtsfärbungen
– Differentialfärbungen
•
•
•
•
•
Methylenblau
Gram
Ziehl-Neelsen
– Elektronenmikroskopie
Kultur
Serologische Methoden
Molekularbiologische Methoden
Zellkultur
Tierversuch
Mikroskopischer Nachweis von Mikroorganismen
Lichtmikroskopie
- Nativpräparate: ungefärbt
- Übersichtsfärbungen (ein Farbstoff)
Darstellung von Strukturen
- Differentialfärbungen
(Färbung/Gegenfärbung)
Zellwand: Gram-F., Ziehl-Neelsen-F.
Kapsel / Sporen / Geißeln
Elektronenmikroskopie
Ablauf Gramfärbung
1. Lufttrocknen u.
Fixieren (Hitze, Ethanol)
2. Färben mit Gentianaviolett
Gentianaviolett-PhenolAmmoniumoxalatlösung
anschließend spülen (H2O)
3. Beizen (Lugolsche Lösung)
Jod-Kaliumjodid-Lösung
anschließend spülen (H2O)
4. Entfärben mit 96%igem Alkohol
anschließend spülen (H2O)
5. Gegenfärbung mit Fuchsin
Fuchsin-Phenolrot-Lösung
anschließend spülen (H2O)
Vermehrung von Mikroorganismen
(Mikroorganismenkultur)
Nährmedien / Kulturmedien:
zur Kultivierung von Mikroorganismen dienende Substrate, die alle
zum Wachstum erforderlichen Nährstoffe enthalten
- synthetische Medien ↔ komplexe Medien
- feste Medien ↔ flüssige Medien
- Universalmedien (Komplett-, Vollmedien) ↔ Spezialmedien
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen
Nährmedium
Charakterisierung
Komplexe Medien
bestehen aus Nährstoffen deren Inhalte nicht
chemisch bestimmt sind, wie zum Beispiel
Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt
(z.B. Blutagar)
Synthetische Medien
(def. Medien)
beinhalten eine genau bestimmte Anzahl und Menge
an Inhaltsstoffen, die chemisch gereinigt werden, um
Spuren von anderen Stoffen auszuschließen (z.B.
Amies-Medium)
Minimalmedien
Sonderform der definierten Medien, beinhalten nur
die minimal nötigen Stoffe für das Wachstum der zu
kultivierenden Mikroorganismen
Flüssige Medien
Nährbouillon, Nährbrühe
(z.B. Fleischwasser)
Feste Medien
Nährboden (Nährbouillon mit zugesetzten
Verfestigungsmitteln, z.B. Gelatine, Agar)
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen
Agar (Agar-Agar):
● gelierfähiges Polysaccharid, vorwiegend Polygalaktane. Gewinnung hauptsächlich in
Ostasien aus verschiedenen Meeres-Rotalgen (Gelidium, Gracilaria).
● Nähragar wird beim Erhitzen ab 95°C flüssig und erst arrt ab 45°C.
● Agar wird von Bakterien nicht abgebaut.
Vorteil gegenüber Nährbouillon:
auf festen (Agar-)Nährböden können Reinkulturen
von Bakterien isoliert werden.
Blutagar:
zu 100 ml verflüssigtem Nähragar
(auf 50°C abgekühlt)
5-10 ml defibriniertes Blut geben,
mischen und in Petrischalen
ausgiessen.
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen
Nährmedium
Charakterisierung
Universalmedien
(Komplettmedien)
komplexe oder synthetische Nährmedien, auf der eine
Vielzahl verschiedener Mikroorganismen wachsen
(z.B. Blutagar)
Spezialmedien
Elektivmedien
Medien, die das Wachstum bestimmter Bakterien fördern
(z.B Mannit-Kochsalz-Agar zur Anzucht von
Staphylococcus aureus)
Selektivmedien
Spezialmedien, enthalten Hemmstoffe, die nur das
Wachstum bestimmter Mikroorganismen zulassen
(z.B. Tinsdale-Agar zur Anzucht von Korynebakterien)
Differentialmedien
(Indikatormedien)
Spezialmedien, die eine Unterscheidung verschiedener
Mikroorganismen ermöglicht. Sie zeigen bestimmte
Stoffwechselleistungen an
(z.B. MacConkey-Agar)
Nährböden
• Grundbestandteile
Agar-Agar
Seealgen, getrocknete Kolloidsubstanz
fester Nährboden = 1-2%
Peptone
eiweißhaltiges Material, Fleisch, Casein,
Sojabohnen, enzymat. Hydrolyse
(Polypeptid, Dipeptid, Aminosäure)
völlig löslich in H2O pH 5-7
Fleischextrakt
Hefeextrakt
mageres Rindfleisch
autolysierte Hefe (Vit. B-Komplex)
• Spezielle Nährsubstrate
Serum 10%
Blut 5-10% Schaf defibriniert
Kochblut (hohe Ansprüche) 5-10 min 75-80°C
MacConkey-Agar = Selektivnährboden (kein Blut)
Eiernährboden ( Malachitgrün + Ei-emulsion)
Differenzierung grampositiver Kokken
Katalase
positiv
Staphylokokken
negativ
Streptokokken
Koagulase
positiv
St. aureus
Hämolyse
negativ
α
KNS
VS
β
(γ)
anhämol.Str.
(ß)HS
Katalase-Reaktion
Das eisenporphyrinhaltige Enzym Katalase wird von
den meisten oxidasepositiven
aeroben und fakutativ anaeroben Spezies
- mit der wichtigsten Ausnahme STREPTOKOKKEN gebildet.
Es wandelt im Energiestoffwechsel gebildetes
Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff um.
Koagulase-Reaktion
Freie Koagulase (extrazelluläres Enzym) bindet an Prothrombin und
aktiviert die Entstehung von Fibrin aus Fibrinogen.
Clumping Faktor
(zellwandgebundenes Protein)
= Fibrinogenrezeptor
Differenzierung von Staphylococus aureus
und Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS)
durch die Koagulase-Reaktion gebildetes
Fibringerinnsel in einem Reagenzglas
Koagulase-Reaktion
Latexpartikel sind mit Fibrinogen und IgG beladen Fibrinausfällung durch
Koagulase und Clumping factor
Protein A von Staph. aureus bindet an den Fc Teil von Immunglobulinen,
welche dann nicht mehr an den Fc-Rezeptor von Phagozyten binden
Ausserdem sind die Latexpartikel mit spezifischen Antikörpern gegen die Kapselpolysaccharide von Staph. aureus beladen.
Durch diese Mehrfachbeladung besteht die Möglichkeit, alle Stämme zu erfassen.
Oxidase-Reaktion
•
Nachweis von Cytochromen aus
der Atmungskette, die Sauerstoff
als terminalen Elektronenakzeptor
im Energiestoffwechsel verwenden
•
Cytochrome ermöglichen den
Eintritt von atmosphärischen
Sauerstoff in den Zellstoffwechsel,
indem sie durch molekularen
Sauerstoff oxydiert werden
•
in der Zelle erfolgt die enzymatische Reduktion der Cytochrome
•
künstliche Substrate (N,N-Dimethyl-1,4-diaminobenzol) bewirken die
Reduktion des Cytochromoxidase-Systems (d.h. sie werden oxydiert)
•
Substrate in Abhängigkeit vom Reduktions-/Oxidationszustand farblos
bzw. gefärbt
Gramnegative Stäbchen: Bsp Enterobakterien: biochemische Reaktionen
Kohlenhydratspaltung
Abbau von Kohlenhydraten (Glucose, Lactose, Rhamnose) Säure (18 – 24 h)
Indikator: Bromthymolblau Farbumschlag blaugrün (negativ) zu gelb/orange (positiv)
Citrat-Abbau
C-Quelle: Citrat, N-Quelle: Ammoniumsalz (Grundlage für Energie- + Baustoffwechsel)
Alkalisierung
Indikator: Bromthymolblau Farbumschlag grün (negativ) zu blau (positiv)
H2S-Bildung
- aus Eiweißkörpern bzw. S-haltigen Aminosäuren (insbes. Cystein)
- aus S-haltigen, (an)organischen Zusätzen [(Thio-)Sulfaten, Sulfiten, Cystein]
Indikator: Metallsalz (insbes. Ferrochlorid + Bleiacetat) Sulfid (schwarzer Niederschlag)
Urease-Nachweis / Indol-Bildung
Indikator: Phenolrot (durch Säurebildung aus Glucose-Abbau gelb = negativ)
- Urease: Harnstoff Ammoniak + CO2 positiv (rotviolett)
- Indol: Eiweißabbau (Tryptophan) Indol (Nachweis mit Kovacs Reagenz, roter Ring)
- Beweglichkeit: Wachstum außerhalb des Impfstichs (wolkenartige Trübung) im Agar
Ornithin-Dekarboxylierung
L-Ornithin (L-Lysin u.a) [pH niedrig] Amine + CO2 (pH-Anstieg)
Indikator: Bromkresolpurpur Farbumschlag von farblos/gelblich (negativ) zu violett (positiv)
Mikroflora im Menschen
Standort
Keimzahl
(pro ml o. g)
anaerobe
Bakterien
aerobe
Bakterien
Sproßpilze
Zungenoberfläche
108 – 109
(Speichel)
108
107
102
Zahnoberfläche
1010 - 1011
1011
108
102
(Plaquesubstanz)
Zahnfleischtasche
1012 - 1013
1012
108
102
Magen
104 – 105
104
104
103
oberer
Dünndarm
104 – 105
104
103
102
unterer
Dünndarm
107 – 108
107
105
103
Dickdarm
1011 – 1012
1011
108
103
Mikroflora im Menschen
Standort
Aerobier
Anaerobier
grampositiv
gramnegativ
grampositiv
gramnegativ
Zungenoberfläche
Str. salivarius
Str. mitis
Str. sanguis
Micrococcus,
Staphylococcus
Corynebacterium
Neisseria
Vibrio
Haemophilus
Enterobacteriaceae
Candida u.a.
Peptococcus
Peptostreptococcus
Propionibacterium
Actinomyces
Veillonella
Prev. melaninogenica
Prev. oralis
Wangenschleimhaut
Str. sanguis
Str. salivarius
Str. mitis
Zahnoberfläche
Str. mutans
Str. sanguis
Neisseria
Hämophilus
Mycoplasma
Protozoa
(Entamoeba gingivalis
Trichomonas tenax)
Peptostreptococcus
Actinomyces
Nocardia
Lactobacillus
Veillonella
Fusobacterium
Leptotrichia
Prev. oralis
Bact. corrodens
Propionibacterium
Sulcus
gingivalis
Str. sanguis
Str. mitis
S. epidermidis
Micrococcus
Mycoplasma
Entamoeba gingivalis
Trichomonas tenax
Desinfektion
heißt, einen Gegenstand in den Zustand versetzen, in dem er nicht mehr infizieren
kann
Wirksamkeit abhängig von:
• Temperatur
• Einwirkungszeit
• Konzentration und Art des Wirkstoffes
• weitere Faktoren: inkorporierte MO (Ausscheidungen, Blut) schlecht o. nicht erreichbar
Desinfektionsverfahren
Physikalisch
UV-Strahlen
Filtration
Heißwasser
75 - 95°C
10 - 30 min
thermische Methoden
strömender Dampf
100°C
10 - 30 min
Niederdruckdampf
105°C, Unterdruck
1 - 15 min
Chemisch
Alkohole / Aldehyde / Phenole und Derivate / Metalle / Halogene /
Oberflächenaktive Substanzen / Oxidantien
Chemothermisch
Kombination von feuchter Hitze (60°C) und chemischen
Desinfektionsmitteln bei thermolabilen Werkstoffen
Wirksamkeit von Dekontaminationsmaßnahmen
Reinigung:
mechanische Entfernung
Reduktion der Keimzahl (2-3 log-Stufen = 99 – 99,9 %)
Antiseptik:
Inaktivierung von MO auf lebendem Gewebe
Desinfektion:
Reduktion der Keimzahl (5 log-Stufen = 99,999 %)
Inaktivierung krankheitserrregender MO
Entkeimungsfiltration:
Abtrennung lebender und toter MO, nicht aller Viren
Sterilisation:
Inaktivierung aller MO inklusive aller Sporen und Viren
Keimzahlreduktion mind. 6 log-Stufen
Sporenbildende Bakterien
grampositive Stäbchen
aerob:
anaerob:
Bacillus
Clostridium
Bakteriensporen stoffwechselinaktive Dauerformen
hohe Umweltresistenz
Artspezifische Sporenform und –lokalisation
Sporenbildung (Sporogenese) durch Nährstoff-Mangel
induziert
Sporenkeimung: Aktivierung, Keimung, Auswachsen
Bacillus: aerobe sporenbildende Stäbchen
Bedeutung: Toxinbildner (Lebensmittel, Bioterrorismus), Antibiotikaproduzent,
Bioindikator (Phenylketonurienachweis, Sterilisatoren), Proteasebildner (Waschmittel)
Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Clostridium: anaerobe sporenbildende Stäbchen
verschiedene Spezies verursachen Krankheiten durch die Produktion von
potenten Protein-Ektotoxinen
Wichtige Humanpathogene Spezies:
A) Clostridium botulinum
B) Clostridium tetani
C) Clostridium perfringens
D) Clostridium difficile
Auswertung Sporenbildner
Spezies
Wachstum
Makromorphologie (Blutagar)
Mikromorphologie
flache trockene Kolonien,
unregelmäßiger Rand
ovale zentrale bis
subterminale Spore
terminale runde
Spore
(Trommelschläger)
aerob anaerob
Bacillus
subtilis
+
Clostridium
tetani
+
durchsichtig, flach, stumpfe Oberfläche, unregelmäßiger Rand mit
Ausläufern
Clostridium
perfringens
+
flach, matt glänzend, unregelmäßiger große grampositive
Rand, Doppelzonenhämolyse
Stäbchen mit
abgerundeten Enden
Clostridium
difficile
+
Weißlich, flache Kolonien mit
unregelmäßigem Rand
(Geruch nach Stalldung)
Clostridium
botulinum
+
schlanke Stäbchen
z.T. mit ovaler
subterminaler Spore
subterminale ovale
Spore
(Tennisschläger)
Wichtige Erreger von Humanmykosen
(Auswahl)
Erreger
Reservoir
Dermatophyten
Mykose/häufige Lokalisation
Dermatophytose
Haut, Haare, Nägel
Trichophyton spp.
Microsporum spp.
Epidermophyton
Mensch, Tier,
Erdboden
Hefen
Candida
Mensch, Tier,
Nahrungsmittel
Candidose
Haut, Schleimhaut, andere Organe
Cryptococcus
Vogelkot
Cryptococcose/ZNS
Schimmelpilze
ubiquitär
Aspergillose
Lunge und andere Organe
Mucormykose
Verletzungsmykosen
Pflanzen,
Erdboden
Primäre Systemmykosen
Aspergillus spp.
Zygomyceten (Mucor u.a.)
Dematiaceae
Dimorphe Pilze
(außereuropäische Mykosen
zB. Histoplasma
Dermatophyten
Keratinophile Pilze, Einteilung ungeschlechtliche FortpflanzungsOrgane (Mikro-und Makrokonidien)
geophil
zoophil
anthropophil
Erde Mensch, Kontamination selten Infektion
Tier Mensch, intensiver Fellkontakt
Mensch Mensch oder indirekt
Pathogenese: Sporen Keratinozyten Auskeimen zu Hyphen
fungistatische Lipide und Proteine können
Eindringen verhindern
Infektion gesteigerte Desquamation (Schuppung)
Hyperkeratose
Klinik
Tinea = Sammelbegriff für oberflächliche Dermatomykose
unabhängig von Spezies
T.pedis (Fuß)
T.capitis (Kopf)
T.inguinalis (in der Leistenbeuge)
T.corporis (Körper)
T.barbae (Bart)
Therapie:
lokale Applikation (Salben) Azole
ausgedehnte Dermatosen (Haut, Nagel, Haare)
systemische Therapie Griseofulvin, Itraconazol
6 Monate (Finger) 12 Monate (Fuß)
Labordiagnostik Virus-assoziierter Erkrankungen
direkter Virusnachweis
mit Virusvermehrung
Zellkultur
Brutei
Versuchstier
ohne Virusvermehrung
Mikroskopie (Einschluß-K.)
Elektronenmikroskopie
Antigen
virale Nukleinsäure
indirekter Virusnachweis
Immunantwort des Wirtes
virus-spezifische Antikörper
Methoden zum Virusnachweis
HA
HHT
ELISA
IBL
FAT
CPE
NAT
Hämagglutination
Hämagglutinationshemmung
Enzymimmunoassay
Immunoblot
Fluoreszenzantikörpertechnik
zytopath.Effekt in der Zellkultur
Nukleinsäurenachweis
RT-PCR, n-PCR
Real-time PCR
Sequenzierung
Nukleotid-alignment
direkt indirekt
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Polymerasekettenreaktion
Nukleinsäureextraktion aus Probe
Cave: RNA-Viren Reverse Transcription in c-DNA
Amplifikation DNA, Primer, dNTP,Taq-Polymerase
Denaturing der Ziel-DNA Einzelstränge
Temperatursenkung Anlagerung der Primer = Start der Neusynthese
Temperaturanstieg Sythese-Stop
erneute Denaturierung
X-Zyklen (25 – 50 Kettenreaktion)
Cave: Störfaktoren Heparin, Proteinasen, Harnstoff, Phenol, Paraffin, Salze
Detection der Amplifikate
a) Längenscreening im Gel
Ethidiumbromid
klassische PCR
b) Fluoreszenzsignale messen
markierte Oligonukleotide
Real-time PCR
Real-time PCR nach TaqManTM Prinzip
Amplifikation
in einem Reaktionsgefäß
Detektion
Basis: 5‘Exonuklease-Aktivität der AmpliTaqDNA-Polymerase
spezielle fluorogene Sonde = Oligonukleotid
markiert mit Reporter-Farbstoff (5‘Ende)
Quencher-Farbstoff (3‘Ende)
Zellbiologische Verfahren
Virusisolierung
Versuchstier
embryoniertes Hühnerei
Zellkultur (monolayer)
a) primär (aus Organen angezüchtet, diploid)
b) diploid = Zell-Stamm (2.-50. Passage,
begrenzte Lebensdauer)
c) Zell-Linie = permanent
(unbegrenzte Passagenzahl,
tri-, tetra-, polyploid, oft tumorbildend)
Antikörper-Nachweise
Neutralisationstest
Hämagglutinations-Hemmtest
Komplementbindungs-Reaktion
Immunfluoreszenztest
ELISA
Immunoblot
Quantitativ
Serumtitration
Titer
Einpunktverfahren(ELISA)
ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)
Detektions-Antikörper
(Enzym-markiert)
Enzym
setzt farbloses Substrat um
nachzuweisende Komponente
aus Patientenmaterial
(AK / Ag)
adsorbierter
Nachweisparameter (Ag / AK)
es entsteht ein lösliches
farbiges Produkt
OD-Messung
Beurteilung von Antikörperbestimmung
Akute Infektion
Cave:
IgM Antikörper Nachweis in einer Probe
persistierende Virusinfektionen
bei Aktivierung erneut IgM-Bildung möglich
Intrauterine Infektion IgM im Serum des Embryo
ab 19.SSW selbständige IgM Bildung
keine Placentapassage
NT und HHT
Differenzierung:
Antikörperanstieg 4-fach in zwei
Proben, Abstand 14 Tage
akute Phase,
postakute Phase
Western-Blot = Immunoblot
Auftrennung der Virusproteine
Molekulargewicht
Nitrozellulose
Patientenantikörper
enzymgekoppelter Anti-Human IgG Antikörper
farbloses Substrat
Umwandlung in unlöslichen farbigen Niederschlag