Charakterisierung von potenziellen Markerpeptiden für die
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Charakterisierung von potenziellen Markerpeptiden für die Rheumatoide Arthritis Diplomarbeit im Studiengang Biotechnologie der Technischen Fachhochschule Berlin zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplomingenieurs (FH) vorgelegt von Vedat Durmaz Berlin, Oktober 2005 Diese Arbeit wurde am Universitätsklinikum Charité Berlin, Schwerpunkt Rheumatologie und klinische Immunologie, in der Arbeitsgruppe und unter der Leitung von Dr. Karl Skriner angefertigt. 1. Gutachter: Prof. Dr. Wörner 2. Gutachter: Prof. Dr. Fischer DANKSAGUNG An dieser Stelle möchte ich mich bei all jenen bedanken, die mich mit ihrem Verständnis und ihrer Freundschaft durch das Studium und die Diplomarbeit begleitet haben. Ohne diese Unterstützung wäre mir in so manch einem Moment die Disziplin und der rechte Wille abhanden gekommen. Im Besonderen gilt mein Dank meinen Eltern, die mich immer vorbehaltlos unterstützt und mir das Studium erst ermöglicht haben. Auch den Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe, Alexandra, Kerstin und Nicole, allen anderen Mitarbeitern der diagnostischen Rheumatologie und gewiss nicht zuletzt Dr. Hausdorf und der Arbeitsgruppe um Dr. Zoltán Konthur vom MPI sowie meinem Betreuer von Seiten der TFH Berlin, die mir alle mit Rat und Tat zur Seite standen, bin ich zu Dank verpflichtet. Für den wohl wichtigsten Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit gerade in der besonders schwierigen Schlussphase durch meine Freundin Marie werde ich ihr – so Gott will – auf ewig verbunden sein. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 2.AKh Gegen humane Antikörper gerichteter Zweitantikörper 2.AKr Gegen Kaninchenantikörper gerichteter Zweitantikörper ACR American College of Rheumatology AFA Antifilaggrin – Antikörper AK Antikörper AKA Antikeratin – Antikörper ANA Antinukleäre Antikörper APF Anti – Perinukleärer Faktor - Antikörper APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure BiP Binding protein BSA Rinderserumalbumin CII Collagen-Typ II CP Citrulliniertes Peptid CCP Cyclisches citrulliniertes Peptid DMEM Dulbecco's Modified Eagles Medium DRFZ Deutsches Rheumaforschungszentrum DTT Dithiothreitol EBNA EBV – codiertes nukleäres Antigen EBV Epstein-Barr-Virus EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EQ Extinktionsquotient ER Endoplasmatisches Reticulum Fa. Firma FKS Fötales Kälberserum HLA Human Leukocyte Antigen hnRNP Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein HRP Horseraddish Peroxidase Hsp Heatshock Protein IDDM Insulinabhängiger Diabetes mellitus Ig Immunglobuline IP Immunpräzipitation MCTD Mixed Connective Tissue Disease MP Milchpulver MPI Max Planck Institut MS Multiple Sklerose MTP Mikrotiterplatte mt Mycobakterium tuberkulosis NC Negativkontrolle des Serums (Serumkontrolle) beim Blotten und ELISA OA Osteoarthritis PA Polyarthritis PAD Peptidyl-Arginin-Deiminase PAGE Polyacrylamid – Gelelektrophorese PBS Phosphatgepufferte Saline Pen Penicillin RA Rheumatoide Arthritis RF Rheumafaktor/-en S-ARA Adulte RA – Seren S-KRA Kinder – RA – Seren S-MS MS – Seren S-OA OA – Seren S-SLE SLE – Seren SDS Natriumdodecylsulfat SLE Systematischer Lupus Erythematosus Ssc Sytemische Sklerose Strep Streptomycin TCE Trichloressigsäure TCR T – Zellrezeptor TEMED N, N, N', N' – Tetramethylethylendiamin TMB Tetramethylbenzidin TNF Tumornekrosefaktor INHALTSVERZEICHNIS 1 EINFÜHRUNG 1.1 Autoimmunität 1.2 Rheumatoide Arthritis (RA) 1.3 Autoantigenitäten bei der RA ........................................................ 4 ................................................................ 4 Gewebsspezifische Antigene 1.3.3 Ubiquitäre Antigene 1.3.4 Sonderfall Citrullinierung .................................................... 5 ............................................................... 7 ........................................................ 10 ............................................................. 10 .............................................................. 12 ................................................................................ 12 Zielsetzung dieser Arbeit MATERIAL UND METHODEN 2.1.1 Chemikalien 2.1.2 Puffer und Lösungen 2.1.3 Verbrauchsgegenstände und Geräteliste 2.1.4 Antigene Peptide und Proteine 2.1.5 Seren 2.1.6 Zelllinien und histologische Gewebsschnitte 2.2 ......................................................................... .............................................................. 12 13 ................................... 15 ................................................ 15 .................................................................................. 16 Zellkulturarbeiten .............................. 17 ....................................................................... 18 ..................................................................... 18 2.2.1 Zellkultivierung 2.2.2 Kryokonservierung 2.2.3 Passagieren 2.2.4 Zellzahlbestimmung 2.2.5 Zellaufschluss und Proteinextraktion 2.3 1 3 1.3.2 Materialien 1 .......................................................... Xenogene Antigene 2.1 3 ........................................................................... 1.3.1 1.4 2 .................................................................................. ................................................................ 18 ......................................................................... 18 .............................................................. ........................................ Proteinbiochemische und Immunologische Methoden 19 19 ...................... 20 2.3.1 SDS – PAGE ......................................................................... 20 2.3.2 Westernblot ......................................................................... 21 2.3.3 Immunoblot ......................................................................... 21 2.3.4 Streptavidin – ELISA 2.3.5 Citrullinierung von Peptiden 2.3.6 Immunaffinitätschromatographie 2.3.7 Immunhistochemische Inkubation 2.3.8 ............................................................. ................................................... 21 23 ............................................ 24 ........................................... 25 Immunpräzipitation in ProteinG - Mikrotiterplatten ..................... 25 ERGEBNISSE .................................................................................. 3.1 Native und denaturierende Proteinextraktion aus HeLa S3 3.2 Untersuchung des citrullinierten Peptids P12 26 ............... 26 .................................. 27 3.2.1 Einfluss der Citrullinierung auf die Antigenität von P12 3.2.2 Sensitivität und Spezifität von P12 für die RA 3.3 Untersuchung des Peptids P32 ............... 27 ............................ 29 ..................................................... 29 3.3.1 Sensitivität und Spezifität von P32 für die RA 3.3.2 Einfluss der Citrullinierung auf die Sensitivität von P32 3.3.3 Isolierung von anti-P32 – AK mittels Streptavidin – ELISA 3.3.4 Isolierung von anti-P32 – AK mit Streptavidinbeads 3.3.5 Immunoblot von anti-P32 – AK gegen HeLa S3 – Linie 3.3.6 Fluoreszenzmikroskopische Detektion des zu P32 homologen humanen Autoantigens 3.3.7 Nachweis eines immunpräzipitierten Antigens 31 ................... 32 ............... ........................... 3.5 Epitopmapping an hnRNP A1 und A2 32 33 34 35 ...................... 35 ............................................. 37 Häufigkeit einer B-Zellantwort gegen A1/A2 – Peptide differenziert nach Krankheitsgruppen ........................................................ 38 Sensitivitäten aller untersuchten A1 – / A2 – Peptide für unterschiedliche Krankheitsgruppen 4 30 .......... .................................................. Magnetic Streptavidinbeads vs. Streptavidin – ELISA 3.5.2 29 Präzipitation eines humanen Autoantigens aus einem HeLa S3 – 3.4 3.5.1 ............... .......................................................... Extrakt mittels anti-P32 - AK 3.3.8 ............................ DISKUSSION ................................................ 36 .................................................................................. 42 4.1 P12 ..................................................................................... 42 4.2 P32 ..................................................................................... 43 4.3 ELISA mit und ohne Beads 4.4 Epitopmapping an hnRNP A1 und A2 ..................................................... 45 ........................................ 45 ....................................................................... 47 ..................................................................................... 48 5 ZUSAMMENFASSUNG 6 LITERATUR Einführung 1 1 EINFÜHRUNG 1.1 Autoimmunität Eine gegen körpereigene Antigene gerichtete Immunantwort des Abwehrsystems bezeichnet man im Allgemeinen als Autoimmunität. Die zu Grunde liegenden biochemischen Mechanismen sind keine anderen als die bei Menschen mit gesundem adaptiven Immunsystem vorliegenden, verursachen aber gravierende direkte und indirekte gesundheitliche Schäden. Verantwortlich dafür ist die zelluläre Abwehr durch Makrophagen und cytotoxische T-Zellen in Verbindung mit einer humoralen Antwort, vermittelt von autoreaktiven T- und B-Zellen [1]. Erschwerend kommt für das unter diesen Umständen bereits geschädigte Abwehrsystem hinzu, dass das vom eigenen Organismus exprimierte Antigen ständig nachgeliefert wird, wodurch es häufig zu chronisch entzündlichen Gewebsschädigungen kommt. Andererseits kann ein einzelnes Antigen bildendes Organ vollständig zerstört werden. Als sinnvoll erscheint eine erste Einteilung nach der Gewebsspezifität der autoimmunen Antwort. Sie liefert zwei Gruppen von Autoimmunerkrankungen: organspezifische, die nur bestimmte Organe oder Gewebe schädigen wie bespielsweise IDDM und MS [2, 3] und systemische Autoimmunerkrankungen wie die RA und SLE, bei denen ubiquitäre, in fast allen Körperzellen vorkommende Antigene dem Immunsystem als Zielscheibe dienen [4]. Solche Fehlfunktionen sind zudem oft durch zahlreiche unterschiedliche und gemeinsam auftretende Autoreaktivitäten innerhalb eines Individuums geprägt. Ursachen der Autoimmunität Die genauen Ursachen für das Auftreten von Autoimmunerkrankungen konnten bisher nicht geklärt werden. Man geht heute davon aus, dass sowohl genetische Prädispositionen [5, 6] als auch Umweltfaktoren [7, 8] eine Verschiebung des Immunsystems zu einem ungesunden Gleichgewicht bewirken, was durch zahlreiche Versuche und insbesondere durch vergleichende empirische Untersuchungen an ein- und zweieiigen Zwillingen belegt werden konnte. Die genetisch bedingte Vielfalt an T-Zellrezeptoren (TCR) [9] ermöglicht die Erkennung vieler verschiedener, auch körpereigener Antigene. Im Normalfall sollte sich ein gesunder Organismus im Verlaufe einer natürlichen negativen Selektion im Thymus unter Anderem autoreaktiver T-Zellen apoptotisch entledigt und deren Migration in die Peripherie verhindert haben, was allerdings nicht in allen Fällen funktioniert [10]. Diese und andere Störungen in der komplexen Regulation des Immunsystems kön- Einführung 2 nen zu entsprechenden Erkrankungen führen. Zur Aktivierung und Proliferation muss die T-Zelle des weiteren mit einem an ein MHC – Molekül gebundenen Antigen konfrontiert werden, um weitere Schritte zu dessen Bekämpfung einleiten zu können. Dabei ist zu beachten, dass auch die Struktur der MHC – Moleküle, insbesondere in der Peptidbindungsgrube, aufgrund der genetischen Polymorphie und Polygenie innerhalb eines Organismus sehr stark variiert [11, 12]. Ein immunrelevanter Kontakt (sog. Immunologische Synapse) zwischen TCR und MHC-Peptid – Komplex kommt erst dann zustande, wenn sowohl Peptid als auch der MHC eine ausreichende Avidität zum TCR aufweisen [13]. Die verschiedenen allelischen Haplotypen des MHC – Genotyps (HLA - Serotypen) begünstigen die Entstehung einer Autoimmunerkrankung in unterschiedlich starkem Maße [6, 14]. Andererseits belegen zahlreiche Untersuchungen den Einfluss von Umweltfaktoren wie molekulare Mimikrys auf die Entstehung von Autoimmunerkrankungen, wobei ganz unterschiedliche Mechanismen zum Tragen kommen. So führen beispielsweise Kreuzreaktivitäten immunogener viraler oder mikrobieller Komponenten mit körpereigenen antigenen Strukturen zur Ausbildung spezifischer Effektorzellen die zusätzlich autoreaktives Potenzial besitzen [15, 16]. Aus weiteren Untersuchungen geht hervor, dass erst durch das Einwirken eines zusätzlicher Schadstoffes wie Zigarettenrauch räumliche Barrieren zwischen bereits vorliegendem AK und Antigen beseitigt und entsprechende immunrelevante Kontakte ermöglicht werden [17]. Über die Entstehung und die Mechanismen von Autoimmunerkrankungen ist oftmals nur sehr wenig bekannt. Ein komplexes System vieler verschiedener externer (Umwelt) sowie interner (genetischer) Faktoren versetzt das Immunsystem in ein Ungleichgewicht, das oft erst anhand der Symptomatik eindeutig identifiziert werden kann. Daher ist die Wissenschaft im Allgemeinen daran interessiert, schnellere und eindeutigere Diagnosemöglichkeiten zu entwickeln. Frühzeitigere und treffendere Therapien könnten Leben retten, erträglicher machen oder auch nur verlängern. Am Beispiel der RA sollen im Folgenden die Vielfältigkeit der zu Grunde liegenden Autoreaktivitäten und die damit einher gehenden Schwierigkeiten bei der Erstellung einer möglichst signifikanten Diagnose erörtert werden. Gerade die RA bietet sich aufgrund ihrer zahlreichen Autoantigenitäten für diese Betrachtungen an. Einführung 3 1.2 Die Rheumatoide Arthritis Rheumatische Erkrankungen sind die häufigsten chronischen Erkrankungen, die mit dem Auftreten autoreaktiver T- und B-Zellen verbunden sind. Bei der RA im Besonderen handelt es sich um eine systemische Autoimmunerkrankung, von der fast 1% der Weltbevölkerung betroffen ist, wobei die Wahrscheinlichkeit des Auftretens mit zunehmendem Alter steigt, und insbesondere bei Frauen in Erscheinung tritt. Letztere Tatsache kann zu der Vermutung verleiten, dass Geschlechtshormone an der Entstehung beteiligt sind [18]. Sie führt aufgrund auftretender spezifischer T- und BLymphozyten und inflammatorischer Zytokine bereits im Frühstadium zu einer systemischen, chronisch entzündlichen Erkrankung der Gelenke und ist zudem durch zahlreiche Autoreaktivitäten geprägt [18-20]. Man geht weiterhin von einer genetischen Prädisposition auf dem HLA-DR – Locus aus, wobei Ätiologie und Pathogenese noch weitergehend ungeklärt sind [18]. Alleine die RA wirft viele Fragen über die Ursachen von Autoimmunerkrankungen und die beteiligten zellulären Komponenten, die als Autoantigene fungieren, auf. Diagnose der RA Die Diagnose der Erkrankung erfolgt primär anhand klinischer Symptome, wodurch meist Monate und Jahre ohne sinnvolle Therapierung verstreichen. In der Regel setzt zunächst eine Entzündung der Synovialmembran verschiedener Gelenke der Gliedmassen ein, gefolgt von Schmerzen und Schwellungen an Fuß – und Handgelenken, die sich im weiteren Verlauf der Pathogenese auf größere Gelenke wie Knie, Ellbogen und Fußgelenke ausweiten. Aufgrund chronischer Entzündungen entstehen dauerhafte Schädigungen, die in den meisten Fällen zur Zerstörung der betroffenen Knochen und des Knorpels führen. Um das zu vermeiden, ist man an einer frühzeitigeren Diagnose interessiert, da eine Behandlung im frühen Stadium den Krankheitsverlauf signifikant zu Gunsten des Patienten beeinflussen kann [21, 22]. Viel Nutzen erhofft man sich insbesondere von der Erforschung der zahlreichen Autoreaktivitäten und Antigene, auf derer einige im Verlaufe dieser Arbeit näher eingegangen wird. So soll in ihr ein Schritt in Richtung frühzeitiger Diagnose der RA gemacht werden, nicht ohne Hoffnung, hier vielleicht auch einen Einblick in die Mechanismen der Erkrankung gewinnen zu können. Ein erster Erfolg versprechender Schritt zu einer schnelleren, serologischen Diagnose wurde mit der Beschreibung der sog. Rheumafaktoren (RF) in den Zwanzigern des letzten Jahrhunderts geleistet. Seither wurden zahlreiche Untersuchungen zur Herkunft und Spezifität der RA durchgeführt [23]. Einführung 4 Therapiekonzepte für die RA Die heute angewandten Therapien gegen die RA basieren im Allgemeinen auf der Verabreichung unspezifisch wirkender, oft nicht ausreichend im Wirkmechanismus charakterisierter Präparate, die weitgehend ungezielt bestimmte Funktionen des Organismus (z.B Zellteilung) beeinflussen. Medikation und Dosierung wurden klinisch – empirisch ermittelt und werden an den auftretenden Nebenwirkungen gemessen. Bei der T-Zell – Vakzinierung beispielsweise erfordert die Vielzahl an Autoreaktivitäten innerhalb eines einzelnen Patienten eine auf diesen abgestimmte, spezifische Behandlung mit T-Zellen. Sie sollen das Immunsystem zur Bildung regulatorischer TZellen anregen, wodurch ihm wieder die Kontrolle über autoraktive T-Zellen zuteil wird. Eine andere wäre die Inhibition entzündungsfördernder Zytokine wie den TNFoder die Verabreichung hemmender Zytokine. Den lebensbedrohenden, schweren systemischen Verlaufsformen der RA und SLE vorbehalten bleibt die autologe Stammzell – Therapie, quasi ein Reset des Immunsystems. Hierbei werden dem Patienten seine eigenen entnommenen Stammzellen reappliziert, nachdem zuvor alle immunkompetenten Zellen des Immunsystems chemisch und radiologisch zerstört wurden [24]. 1.3 Autoantigenitäten bei der RA Aufgrund der sehr zahlreichen Autoreaktivitäten bei der RA sollen hier nur einige Autoantigene beschrieben werden. Viele treten nur bei einem geringen Teil aller RA – Patienten auf und / oder auch bei zahlreichen anderen Autoimmunerkrankungen mit ähnlicher Pathogenese oder gar Gesunden. Gefragt sind insbesondere Kenntnisse über solche Antigene, die möglichst spezifisch für eine bestimmte Erkrankung sind, also bei anderen Patienten keine Immunantwort auslösen oder bei einem möglichst großen Teil der an einer bestimmten Erkrankung leidenden Menschen auftreten. Im Folgenden sollen nur einige der viel versprechendsten Autoantigene werden und in der Sensitivität und Spezifität beurteilt werden. 1.3.1 Xenogene Antigene Heatshock Proteine Heatshock Proteine sind an der Faltung natürlicher Proteine beteiligt, erzeugen also Tertiär- und Quartärstrukturen. Im Tiermodell konnte nachgewiesen werden, dass beispielsweise Mycobakterium tuberculosis bzw. eins seiner Proteine mt-Hsp65 oder Einführung 5 gegen diesen gerichtete AK in der Lage sind, die sog. Adjuvans – Arthritis auszulösen, eine Erkrankung, die der menschlichen RA in gewissen Aspekten ähnelt [25]. Gegen mt-HSP65 gerichtete Antiköper und T-Zellen, die in der Synovialflüssigkeit von RA – Patienten nachgewiesen werden konnten, legten die Vermutung nahe, dass eine Kreuzreaktivität mit dem homologen Säuger – HSP60 eine Autoreaktivität gegen das Säuger – Protein auslöst. Allerdings sind die AK nicht RA – spezifisch, sondern treten auch bei Erkrankungen wie SLE, Reiter – Syndrom, Tuberkulose aber auch bei gesunden Menschen auf [26]. Shared Epitope Das bakterielle Stressprotein Dna J mit Homologie zum Säuger – Hsp70 enthält die für die RA prädisponierende Sequenz QKRAA (Shared Epitope) [27]. Das Epitop ist zudem Bestandteil des EBV (Epstein-Barr-Virus) – codierten Proteins gp110. Dna J ist das Ziel autoreaktiver T-Zellen von RA – Patienten, nicht aber bei Gesunden [28]. EBNA-1 Das EBV – codierte nukleäre Antigen (EBNA-1) konnte erst spät in der Synovialflüssigkeit von RA – Patienten nachgewiesen werden [29, 30]. Es wurde schon lange zuvor mit der Entstehung von RA in Verbindung gebracht. Ein gegen EBNA-1 gerichteter AK konnte zeigt Reaktivität bei p62, einem Protein der synovialen Deckzellen bei RA – Patienten [31]. Eine in EBNA-1 enthaltene Glycin-Alaninreiche Repeatsequenz (IR-3) ist das Ziel von Autoantikörpern von Patienten, die an RA, SLE, Ssc oder infektiöser Mononucleose erkrankt sind, aber auch von Gesunden [32]. EBNA-1 zeigt über die IR-3 Kreuzreaktionen mit zahlreichen humanen Proteinen, wie beispielsweise p62 und p542. Letzteres reagiert vornehmlich mit Seren von Patienten mit infektiöser Mononucleose und RA [15]. Man vermutet aufgrund der hohen Sequenzhomologie mit Maus - hnRNP, dass es sich bei p542 um eine 71kDa - Komponente von hnRNPs handelt [16]. Die hnRNPs, derer Untersuchung diese Arbeit einen Großteil ihres Umfangs widmet, werden unter 1.3.3 (Ubiquitäre Autoantigene) detailierter abgehandelt. 1.3.2 Gewebsspezifische Antigene Sa - Protein Das 50 kDa große Sa – Protein konnte in der humanen Milz, der Placenta und im RA – Pannusgewebe, aber nicht in kultuvierten Zellen nachgewiesen werden [33]. Die Krankheitsspezifität für RA liegt mit 78 – 99 % sehr hoch [34]. Man vermutet, bei dem Sa – Protein handle es sich um die citrullinierte Form von Vimentin [35]. Aus Einführung 6 anderen Untersuchungen wiederum geht hervor, dass die Sa – Aktivität mit der der humanen - Enolase identisch ist [36]. Filaggrin Das Filaggrin (Filament Aggregating Protein), ein 42k – Protein des Endothels, ist an der Organisation des Zytoskeletts in Epithelzellen beteiligt. Es vernetzt intermediäre Filamente, insbesondere Cytokeratin und wird aus der stark phosphorylierten Proteinvorstufe Profillagrin gebildet. Die gegen Filaggrin gerichteten Antikörper (AFA) sind anscheinend dieselben wie die gegen Keratin (AKA) und den Perinukleären Faktor (APF) gerichteten [37]. Als Haupdeterminante des Epitops/der Epitope besitzt der AFA Citrullin, posttranslational modifiziertes Arginin [38, 39], wobei etwa 20 % des Arginins, deiminiert von der Peptidylarginin – Deiminase (PAD), als Citrullin vorliegt [40]. Die Sensitivität des Filaggrins für AFA aus RA – Seren liegt zwischen 36 % und 91 % bei einer Spezifität von 66 % bis 100 %. Citrullin konnte in Synovialzellen nachgewiesen werden, obwohl Filaggrin nur extraartikulär vorliegt [41]. Collagen-Typ II Collagen-Typ II (CII) ist ein wesentlicher Bestandteil der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpels und beteiligt an der Bildung von Tripelhelices aus Tropocollagen - Unteinheiten. B-Zellen gegen CII wurden vermehrt in entzündeten Gelenken von RA Patienten nachgewiesen [42]. Maus – T-Zellen, die mit bovinem CII reagieren, sind spezifisch für ein Epitop, das auch in humanem CII vorkommt und überlappen zudem mit einem T-Zellepitop von Mäusen mit induzierter Arthritis [43]. CII – spezifische TZellen konnten sowohl bei Gesunden als auch bei RA – Patienten nachgewiesen werden [44]. Bei einer serologischen Gesamtspezifität von 30 % unter RA – Patienten scheinen derer HLA-DR4 – positive zudem genetisch prädisponiert [45]. Im Vergleich hierzu enthält das Synovialgewebe der Mehrheit von RA – Patienten Anti-CII produzierende BZellen und entsprechende AK [45, 46]. Allerdings lässt die Spezifität für RA zu wünschen übrig, da auch Patienten mit z.B. SLE (20 %), Ssc (15 %) und infektiösen Erkrankungen wie Lepra (50 %) anti-CII – AK aufweisen. Dessen Titer im Serum und in der Synovialflüssigkeit scheint direkt mit dem Vorkommen von Zytokinen wie TNFund IL-6 zu korrelieren [47]. CH65 Das knorpelspezifische CH65 aus Chondrozytenmembranen, das bei RA – und Arthrosepatienten als Autoantigen beschrieben wurde [48], während T-Zellen Gesunder keine Reaktivität zeigten, besitzt eine Sensitivität für AK aus RA – Seren von 70 %. Einführung 7 Obwohl CH65 insbesondere aufgrund seines hohen Glycinanteils eine Sequenzähnlichkeit mit mt-Hsp65 und einigen Cytokeratinen aufweist, konnten keine Kreuzreaktivitäten zwischen den gegen diese gerichteten monoklonalen AK festgestellt werden [49]. Fibronectin Das Fibronectin ist ein dimeres Glykoprotein, das in der Bindegewebsmatrix, auf Oberflächen von Epithelzellen aber auch im Plasma und anderen Körperflüssigkeiten vorkommt. Es interagiert mit Collagen, Fibrin(ogen), Heparin und verschiedenen Zelloberflächen – Proteinen. In 14 % der untersuchten RA – Patienten konnten gegen ihn gerichtete AK nachgewiesen werden, was allerdings auch bei Patienten mit anderen Erkrankungen (z.B. SLE: 34 %) zutrifft [50]. Human Cartilage Glycoprotein (HC gp39) HC gp39 wird von artikulären Chondrozyten, Synovialzellen, Makrophagen und Neutrophilen sezerniert. Es ist am Umbau von Gewebe und an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt. Der gp39 – Spiegel im Serum und in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit degenerativen Gelenkserkrankungen ist signifikant höher als der gesunder Menschen [51, 52]. Gegen gp39 gerichtete T-Zellen tauchen bei 44 % der untersuchten RA – Patienten und 27 % der Gesunden auf [53]. 1.3.3 Ubiquitäre Antigene Calpastatin Das zytoplasmatische 72 kDa Protein Calpastatin besitzt vier inhibitorische Domänen für Calpaine, eine Familie von Cysteinproteasen. Die Regulierung der Calpaine erfolgt über Calpastatin (inhibierend) und Calciumionen (aktivierend). Nach einer Zellaktivierung tritt Calpastatin auch extrazellulär auf, wodurch es für AK zugänglich wird [54]. Gegen ein rekombinant gewonnenes Calpastatin reagieren 45 % der untersuchten RA – Seren positiv. Allerdings wird es auch bei Krankheiten wie SLE, MCTD, Ssc, aktivierter Arthrose und Anderen als Antigen [55, 56] und sogar bei Gesunden [57] mit vergleichbaren Häufigkeiten erkannt. Es wird angenommen, dass durch die Eliminierung des Calpastatins und die damit einher gehende Steigerung der Calpainaktivität schwere Gelenksschädigungen gefördert werden [54]. IgG - Fc Der Rheumafaktor (RF) ist der bislang am besten untersuchte Antikörper, der bei Rheumapatienten in Erscheinung tritt. Er wurde kurz nach dem 1. Weltkrieg entdeckt Einführung 8 und wird als bislang einziges serologisches Nachweiskriterium vom American College of Rheumatology (ACR) anerkannt [58]. Nachgewiesen werden kann er bei 75% aller RA – Patienten aber – auf Kosten der Spezifität – auch bei anderen rheumatischen Autoimmun – (wie SLE oder Sjögren – Syndrom) und Infektionserkrankungen (z. B. Hepatitis, Tuberkulose). Selbst 5 % – 15 % der gesunden Bevölkerung weisen den RF auf, wobei die Prävalenz mit zunehmendem Alter steigt. Zudem korreliert der RF – Titer nicht streng mit der klinischen oder serologischen Aktivität der RA oder der Gelenkszerstörung [24]. Aufgrund der Anerkennung durch das ACR findet sein Nachweis in nahezu allen klinischen Laboren Verwendung. Um eine gute diagnostische Spezifität und Sensitivität, zu erreichen, die auch gewisse Prognosen erlauben, wird eine kombinierte Untersuchung des Vorkommens von IgM –, IgA – und IgG – RF empfohlen [59, 60]. Der RF ist gegen die Fc - Region von IgG – Molekülen gerichtet und taucht in allen Antikörper - Subklassen (IgE, IgM, IgA, IgG) auf. Zudem besitzt er die Fähigkeit, sich selbst zu binden und dadurch größere Immunkomplexe zu bilden, die imstande sind, das Immunsystem zu aktivieren [61]. hnRNP's Bei den hnRNP's (heterogeneous nuclear Ribonucleoproteinen), derer einige (A1, A2, A3) im Verlauf der vorliegenden Arbeit auf Peptidebene untersucht werden sollen, handelt es sich um Kernproteine, die als Komponente des Spliceosoms [62] an der posttranskriptionalen Modifikation von prämRNA beteiligt sind und nach gewebsspezifischen Isotypen differenziert exprimiert werden [63]. Die hoch konservierten Proteine sind in der Lage, RNA / DNA zu binden [64]. Abb. 1: Funktion der hnRNPs bei der Transkription. (Foto: Nobelprize.org) Das hnRNP A2 beispielsweise, das ursprünglich gegen Ende der Achtziger als ein für die RA spezifisches Antigen RA33 beschrieben wurde [65], besitzt zwei RNA – Bindungsdomänen und ein Export- /Importsignal, wobei A2 – spezifische ANA (Antinucleäre AK) gegen den zwischen den RNA – Bindungsdomänen gelegen Bereich gerichtet sind [63]. Spätere Untersuchung zeigten, dass es sich bei RA33 vermutlich um hnRNP A2 – Protein handelt [66]. Zudem wurden die Angaben über die Spezifität des Antigens für die RA nachträglich relativiert, da auch Patienten mit anderen Erkrankungen wie MCTD und SLE dagegen gerichtete AK ausbilden [67]. Makeyev et al. legte die Vermutung nahe, das A2 – Protein könne als molekularer Adapter zwischen Einführung 10 einsträngigen Telomer – Repeatsequenzen oder Telolerase – RNA und anderen ssDNAs fungieren und an der Erhaltung der Telomere beteiligt sein [68]. Auch die A1 – Komponente der hnRNP's besitzt zwei Bindungsdomänen, die gewisse Homologien mit den Consensussequenzen der 3' – und 5' – Splicesites von Vertebraten aufweisen [69]. Anderen Untersuchungen zu Folge reagiert A1 auf posttranskriptionaler Ebene mit der 3'-UTR (3' untranslated region) von Collagen Typ 1 und 3 – mRNA. Er gilt als positiver Effektor der Collagenexpression durch Stabilisierung der RNA, wobei ein erhöhter Titer bei Patienten mit cardiovaskulären Erkrankungen nachgewiesen werden konnte [70]. 1.3.4 Sonderfall Citrullinierung Citrullinierte Proteine (CP) bilden eine ganz neue Gruppe von Antigenen mit sehr hoher Spezifität für die RA. Zudem liegt die Sensitivität im Bereich derer der RFen bei teilweise weit über 80 %. Die Autoren der Publikation empfehlen eine Ersetzung des offiziellen serologischen Markers RF durch auserwählte und gut untersuchte CP [71]. Katalysiert wird die Deiminierung des Pepid – Arginins durch das Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD), das in verschiedenen Isotypen vorliegt und Ca2+ als Cofaktor benötigt. Ihre Expression wird durch verschiedene molekularbiologische Vorgänge /Faktoren wie Transkription, Translation auch der Lokalisierung innerhalb der Zelle und der Expression notwendiger Proteine reguliert [72]. Zwar wurden ctrullinierte Peptide auch bei Menschen beobachtet, die nicht unter RA leiden [73, 74], doch werden AK gegen CP nach dem Stand bisheriger Untersuchungen ausschließlich von Patienten mit RA gebildet. Das citrullinierte humane Collagen I (CI) beispielsweise stellt ein sehr spezifisches Ziel autoreaktiver Vorgänge im Menschen dar. Zudem korreliert der AK – Titer mit dem der gegen cyclische citrullinierte Peptide (CCP) gerichteten AK [75]. Auch die Deiminierung der - und !-Kette des Fi- brins im Synovialgewebe lässt sich nicht nur bei RA – Patienten nachweisen [76], entsprechende AK allerdings wurden nur bei dieser Gruppe und bereits in frühen Stadien der Pathogenese gefunden [76]. Als Hauptdeterminante des Filaggrinepitops konnte ebenfalls Citrullin nachgewiesen werden [38, 39]. Bei dem bereits erwähnten RA – Antigen Sa soll es sich, so vermutet man, um eine citrullinierte Form von Vimentin handeln [35]. 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit Im Rahmen dieser Arbeit sollen an Peptiden unterschiedlicher Herkunft Untersuchungen durchgeführt werden, die der schnelleren Diagnose und einem vielleicht besse- Einführung 11 ren Verständnis für die Ursächlichkeiten der RA förderlich sein sollen. Dabei wird der Fokus der Betrachtungen auf die Eignung der eingesetzten Peptide als serologische Marker in Diagnostik der RA gesetzt. Für das citrullinierte Peptid P12 (15 AS), dessen unmodifizierte Sequenz einem Bereich der M9-Region des hnRNP A3 entspricht, und das Peptid P32 (15AS), das im Rahmen einer im Jahre 2002 und innerhalb der Arbeitsgruppe angefertigten Diplomarbeit bei einem Phagedisplay humaner cDNA nachgewiesen wurde, sollen bei vergleichenden Untersuchungen an unterschiedlichen Erkrankungen wie SLE, OA und natürlich RA die Spezifität und die Sensitivität für die RA ermittelt werden. Insbesondere der Einfluss der Citrullinierung beider Peptide auf die Sensitivität für die genannten Patientengruppen soll geklärt werden. Mit Hilfe des erst genannten Peptids P12 soll weiterhin die Frage erörtert werden, ob denn der Befund des derzeit einzigen kommerziell erhältlichen Markerpeptids für CP (Fa. Eurodiagnostics) allgemein verlässlich ist und bei entsprechenden Ergebnissen mit P12 eine Alternative oder Ergänzung zu den aktuellen serologischen Markern geboten werden. Durch voran gegangene serologische Tests an der P32 – Vorstufe (41 AS), die bei oben genanntem Phagedisplay in Erscheinung war, konnte eine Sensitivität des Peptids für RA – Seren nachgewiesen werden. Um der Frage nach dem Ursprung des unbekannten Peptids und der Auslösung der B-Zellwort nachzugehen, sollen P32 - spezifische AK aus entsprechend positiven Seren affinitätschromatographisch isoliert werden und zur Immunpräzipitation des passenden Antigens aus dem nativ gewonnenen Proteinextrakt einer HeLa S3 – Linie eingesetzt werden. Mittels Massenspektroskopie und Immunhistologischer Untersuchungen soll eine Sequenzierung und Lokalisierung des möglicherweise gewonnenen und neuen Antigens erfolgen. In einer letzten Versuchsreihe soll bei den bislang bekannten Vertretern der hnRNP A – Reihe A1 bis A3 ein Epitopmapping durchgeführt werden. Die Betrachtung erfolgt dabei serologisch differenziert nach unterschiedlichen Erkrankungen und Altersgruppen innerhalb der RA. Auch die Seren gesunder Menschen sollen bei den Untersuchungen der Peptide zum Tragen kommen. Nachdem bereits bekannt ist, dass gegen hnRNPs gerichtete AK auch in anderen als RA – Seren nachgewiesen werden konnten [67], stellt sich die Frage, ob die Epitope bei den unterschiedlichen Erkrankungen die Selben sind. Material und Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Materialien 2.1.1 Chemikalien Acrylamid (Rotiphorese Gel 30), Fa. Carl Roth GmbH APS, Fa. Carl Roth GmbH Bromphenolblau, Fa. Sigma Chemical Co BSA, Fa. Servas Electrophoresis GmbH CaCl2, Fa. Merck KGaA Coomassie R 250, Fa. Merck KGaA DTT, Fa. Carl Roth GmbH EDTA, Fa. Sigma Chemical Co Essigsäure (99%ig), Fa. Merck KGaA Glycerol, Fa. Fa. Carl Roth GmbH Glycin, Fa. Carl Roth GmbH Harnstoff, Fa. Carl Roth GmbH HCl, Fa. Merck KGaA H2SO4, Fa. Merck KGaA KCl, Fa. Merck KGaA KH2PO4, Fa. Merck KGaA Methanol, Fa. Merck KGaA Milchpulver, Fa. Carl Roth GmbH Na2HPO4, Fa. Merck KGaA NaCl, Fa. Merck KGaA NaOH, Fa. Merck KGaA Ponceau, Fa. Merck KGaA SDS-Na, Fa. Servas Electrophoresis GmbH Sulfosalicylsäure, Fa. Sigma Chemical Co TCE, Fa. Merck KGaA TEMED, Fa. Carl Roth GmbH Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, Fa. Carl Roth GmbH Triton X100, Fa. Roche Diagnostics GmbH Trypsin, Fa. Sigma Chemical Co Tween 20, Fa. Servas Electrophoresis GmbH 12 Material und Methoden 13 2.1.2 Puffer und Lösungen PAD, Fa. Sigma Chemical Co AK – Elutionspuffer: ImmunoPure Elution Buffer, Fa. Pierce Proteinmarker für SDS – PAGE, Fa. BioRad Zellkulturmedium: DMEM, Fa. Biochrom FKS, Fa. Hyclone Pen/Strep – Mischung 100fach, Fa. Cambrex Bio Science Trispuffer: PBS: 25 mM Tris.HCl, pH 7,4 0,2 g KCl + 0,2 g KH2PO4 + 80 g NaCl + 14,4 g Na2HPO4 pH 7,4 mit 1 M HCl ad 1 l mit H2Obidest 6x Ladepuffer: 0,35 M Tris.HCl (pH 6,8) 0,35 M SDS 30 % (v/v) Glycerol 0,6 M DTT 0,18 M Bromphenolblau Elektrodenpuffer: 25 mM Tris 0,2 M Glycin 0,1 % SDS Sammelgel (4 %): (für ca. 5 Gele) 0,67 ml Acrylamid 1,25 ml Tris.Cl (0,5 M, pH 6,8) 0,05 ml SDS (10 %) 3,00 ml H2Obidest 25 µl APS (10 %) 2,5 µl TEMED Trenngel (10 %): (für ca. 6 Gele) 10 ml Acrylamid 7,5 ml Tris.HCl (1,5 M, pH 8,8) 0,3 ml SDS (10 %) 12,1 ml H2Obidest 150 µl APS (10 %) 15 µl TEMED Tankblotpuffer: 15 mM Tris 0,1 mM Glycin Material und Methoden Coomassie – Lösung: 14 5 g Coomassie (für 0,25 %ige Lösung) 800 ml Methanol 140 ml Eisessigsäure ad 2 l mit H2Obidest Ponceau S – Lösung: 0,2 g Ponceau S + 3 g TCE + 3 g Sulfosalicylsäure ad 100 ml mit H2Obidest ELISA-Puffer: Blockpuffer: 5 % MP in PBS Waschpuffer: 0,1 % Tween20 in PBS Peptidverdünnung: 0,1 % BSA in PBS Serum-/AK- Verdünnung: 2 % MP in PBS Immunoblot-Puffer: Blockpuffer: 3 % MP in PBS Waschpuffer: 0,05 % Triton X100 in PBS Serum-/AK- Verdünnung: 2 % MP / 0,05 % Triton X100 in PBS PAD – Puffer A: 10 mM CaCl2 5 mM DTT 0,1 M Tris.Cl PAD – Puffer B: (Kontrolle zu A) 10 mM EDTA 5 mM DTT 0,1 M Tris.Cl IP – Puffer: pH 7,5 pH 7,5 0,05 % Triton X100 in PBS Wurde sowohl für die Verdünnung (von Antikörper und Zellextrakt) als auch als Waschpuffer verwendet. Zweitantikörper, Fa. Dako Cytomation: 2.AKr: Polyclonal swine anti rabbit Ig – HRP (1,3 g/l), für ELISA 2.AKh: Polyclonal rabbit anti human IgG – HRP (1,3 g/l), für Blot und ELISA Zweitantikörper für Immunhistochemische Detektion, Fa. The Binding Site: Polyclonal rabbit anti human IgGAM – AFF – FITC, gebrauchsfertig HRP – Substrat (TMB), Fa. Seramun Diagnostics GmbH: Für Immunoblot: SeramunBlauFast (Membran Peroxidase Substrate) Für ELISA: SeramunBlauFast (Microwell Peroxidase Substrate) 2.1.3 Verbrauchsgegenstände und Geräteliste Amicon Ultra-4 (10 000 MW CO), Fa. Millipore Analysenwaage, Fa. SatoriusResearch Brutschrank Functionline, Fa. Heraeus Material und Methoden 15 Dynabeads m-280-Streptavidin, Fa. Dynal Electrophoresis Power Supply EPS 600, Fa. Pharmacia Biotec Elektrophorese-Temperiergerät Multitemp3, Fa. Pharmacia Biotec ELISA-Platten, ProteinG-bechichtet, Fa. Pierce ELISA-Platten, Streptavidin-beschichtet, Fa. Biotez ELISA-Reader SLT Spectra & Software Magellan, Fa. Tecan ELISA-Reader (am MPI) Spectramax 250, Fa. Molecular Devices ELISA-Schüttler Titramax, Fa. Heidolph Flaschenhandpumpsystem, Fa. Walu Genius Gelkammer Mighty Small II, Fa. Amersham Pharmacia Biotech International GS 6R Zentrifuge, Fa. Beckmann King Fisher Prototyp, Fa. Thermolab Systems Magnet MPC-S, Fa. Dynal Mechan. Zellaufschluss mittels Miccra-D1, Fa. Art Microskop DM IL, Fa. Leica Nitrocellulosetransfermembran Protran, Fa. Schleicher & Schuell BioScience Photo-/ Spektrometer UV-160A, Fa. Shimadzu Pipettierhilfe Pipetus-Aktiv, Fa. Hirschmann Proteinextraktionskit NucBuster, Fa. Novagen Schuettler Promax 1040, Fa. Heidolph Streptavidin-Kit µMacs, Fa. Miltenyi Biotec Tischzentrifuge Biofuge 22R, Fa. Heraeus Sepatec Vortex-Genie 2, Fa. Scientific Industries Wasserbad, Fa. GFL Workbench AntairBSK, Fa. Heraeus Zellkulturflasche, 250 ml, Fa. Falcon 2.1.4 Antigene Peptide und Proteine Die Synthese sowie eine N-terminale Erweiterung mit einem Spacer (Aminohexan) und die Biotinylierung aller verwendeten Peptide bis hin zur Lyophilisierung erfolgte durch die Fa. Peptides & Elephants. Das Biotin gewährleistet eine starke Bindung zu der mit Streptavidin beschichteten Oberfläche der ELISA – Platten. Die Peptide wurden in 8 M Harnstoff aufgelöst (1 mg Peptid / ml) und bis zum Einsatz im ELISA bei -80 °C gelagert. Die Veröffentlichung der Sequenzen im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mir von meinem Projektleiter aus patentrechtlichen Gründen nicht gestattet. Material und Methoden 16 hnRNP – Peptide Die Peptide der einem Epitopmapping zu unterziehenden hnRNPs (-A1, -A2) wurden so hergestellt, dass ihre Sequenzen über einen konstanten Bereich mit denen benachbarter Peptide überlappten. Untersuchung der Eignung potenzieller Markerpeptide für die RA Das zu untersuchende, citrullinierte Peptid P12, und das entsprechende nicht citrullinierte Kontrollpeptid P16, das stattdessen methyliertes Arginin besitzt, sind Bestandteil des hnRNP-A3 und wurden bei vorangegangenen Untersuchungen der selben Arbeitsgruppe als Ziel autoreaktiver AK aus RA – Seren in Erscheinung getreten. Abb. 1 zeigt die Strukturformeln beider Aminosäuren. Abb. 1: Strukturformeln von Citrullin (rechts) und methyliertem Arginin der internen Kontrolle (links) bei den Untersuchungen des potenziellen Markerpeptids P12. Das zweite potenzielle Markerpeptid P32, bestehend aus 15 AS, bzw. das 41 AS langes Vorläuferpeptid war bei einem Phagedisplay humaner cDNA innerhalb der Arbeitsgruppe im Rahmen einer Diplomarbeit entdeckt worden (Alexander Sternjak, Universität Wien 2002) und konnte bisher nicht klar identifiziert werden. weiteren Untersuchungen hatte man festgestellt, dass es eine Bindestelle für AK aus RA – Seren besitzt. Das vermutlich lineare Epitop liegt im Bereich der synthetisierten 15 AS des Peptids P32. Positivkontrolle Das Peptid P27-11, ein Fragment des Proteins hnRNP-A3 wurde in Verbindung mit dem Serum eines gegen hnRNP A3 immunisierten Kaninchens als Positivkontrolle beim ELISA eingesetzt. 2.1.5 Seren Die verwendeten Seren entstammten Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen und aus verschiedenen Instituten. Aber auch Seren Gesunder kamen bei vergleichenden Untersuchungen zum Einsatz. Material und Methoden 17 SLE – Seren Es wurden zwölf SLE – Seren eingesetzt. Sie waren vom University Medical Centre Ljubliana (Slowenien) zur Verfügung gestellt worden. OA – Seren Auch von den OA – Seren wurden für diese Arbeit zwölf verwendet. Sie stammten aus dem Institut für Physiologie (Charité). MS – Seren Von Dr. Wandinger vom Physiologieinstitut der Charité waren unserer Arbeitsgruppe MS – Seren zur Verfügung gestellt worden. Von denjenigen, die bei voran gegangenen Untersuchungen positiv auf rekombinantes hnRNP A1, -A2 oder -A3 reagiert hatten, kamen 17 Seren zum Einsatz. Adulte RA – Seren Es wurden bei den Untersuchungen mit erwachsenen RA – Patienten Seren unterschiedlicher Herkunft eingesetzt. 24 Patientenseren stammten aus dem Institut für Rheumatologie der Charité, weitere 38 Seren waren von der Rheumaklinik Eisenmoorbad in Bad Liebenwerda zur Verfügung gestellt worden. Kinder – RA – Seren Die Seren von Kindern mit einer sehr früh auftretenden Form der RA wurden von einer Klinik in den Niederlanden (eine genauere Angabe war leider nicht möglich). Positivkontrolle Das A3 – Kaninchenserum der Fa. Seramun Diagnostics GmbH fand als Positivkontrolle im ELISA Verwendung. Es stammte von Kaninchen, die gegen hnRNP-A3 immunisiert worden waren. 2.1.6 Zelllinien und histologische Gewebsschnitte Die Zelllinien HeLa S3 und Lungencarcinom H 2170 stammten vom Institut für Rheumatologie, Charité. Die histologischen Gewebsschnitte von HEp2 – Zellen für die Lokalisierung eines Antigens im humanen Gewebe wurden uns zur Verfügung gestellt von Mitarbeitern der Rheumadiagnostischen Labors der Charité. Sie trugen auch dafür Sorge, dass die Schnitte unter Verwendung eines Einbettmittels auf Objektträger fixiert wurden. Material und Methoden 18 2.2 Zellkulturarbeiten 2.2.1 Zellkultivierung Für die immunologischen Untersuchungen mit Rheumaseren und hieraus affinitätschromatographisch isolierten, gegen humane Proteine gerichtete Antikörper wurden Krebszelllinien gezüchtet (HeLa S3, Lungencarcinom 2170). Sie lagen zu Beginn meiner Diplomarbeit in flüssigem Stickstoff vor (siehe auch unter 2.2.2 Kryokonservierung). Die Kultivierung der adhärenten Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37 °C und einem CO2 – Partialdruck von 5 %. Das Nährmedium (DMEM) enthielt zusätzlich 5 % hitzeinaktiviertes (30 min bei 56 °C) und sterilfiltriertes FKS sowie die Antibiotikakonzentrationen [Pen] = 100 U/ml und [Strep] = 100 µg/ml. Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. 2.2.2 Kryokonservierung Für eine Lagerung über sehr lange Zeiträume eignet sich die Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff bei ca. -196 °C. Ein Einfrieren der kultivierten Zellen war für die Durchführung dieser Arbeiten nicht notwendig, jedoch das Auftauen der Zellen zur Anzucht. Die Kryoröhrchen wurden aus dem flüssigen Stickstoff direkt in ein auf 37 °C temperiertes Wasserbad gegeben und vollständig aufgetaut. Es folgte die Aufnahme der Zellen in etwa 10 ml des ebenfalls auf 37 °C temperierten Kulturmediums. Nach einer Pelletierung der Zellen bei 100 x g wurden diese erneut in 10 ml Medium aufgenommen und einer Kulturflasche ausgesät. Es erfolgte nach 24 Stunden eine Versorgung der Zellen mit frischem Nährmedium, indem das alte Medium abgesaugt wurde, und nach einer Waschung mit 10 ml PBS und dessen Entfernung 10 ml frisches Medium zugegeben wurde. 2.2.3 Passagieren Eine Passagierung oder die Ernte der adhärenten Zellen zwecks Gewinnung eines Proteinextraktes (2.2.5) wurde dann durchgeführt, wenn eine annähernd 100 %ige Konfluenz in der Kulturflasche erreicht war. Nach dem Entfernen des Mediums erfolgte zunächst ein Waschschritt mit 10 ml PBS. Anschließend wurde 1ml Trypsin (1 M) zugegeben und auf dem Zell – Monolayer durch Schwenken der Kulturflasche verteilt, um die Verbindung der Zellen von der Oberfläche und von einander zu lösen. Ein endgültiges Lösen kam erst durch ein kräftiges Schlagen mit der flachen Hand Material und Methoden 19 gegen die Flaschenseite zustande. Unmittelbar danach wurden 9 ml frisches Medium zugegeben. Für eine Proteinextraktion wurden die Zellen (nach der Entnahme von etwa 30µl für die Zellzahlbestimmung) für 10 Minuten bei 100 x g pelletiert, in ca. 10 ml PBS resuspendiert und gewaschen um erneut wie oben beschrieben pelletiert zu werden. Nach dem Abdekantieren der Waschlösung wurden die Zellen bis zur Proteinextraktion bei -20 °C eingefroren. Ansonsten wurden die in 10 ml Nährmedium aufgenommenen Zellen auf mit einem entsprechenden Volumen frischen Mediums versetzte Flaschen so verteilt, dass sich je nach Bedarf Verdünnungen zwischen 1:2 bis 1:5 ergaben. Alle verwendeten Lösungen (Trypsin, PBS, Nährmdium) wurden vor der Verwendung auf 37 °C temperiert. 2.2.4 Zellzahlbestimmung Zur Bestimmung der Gesamtzellzahl wurde die Neubauer – Zählkammer (neu) verwendet. Anhand der Zellenzahl pro Großquadrat (1mm²) kann der Zelltiter mit Hilfe folgender Formel errechnet werden: Zellzahl Zellzahl ! 104 ml Grossquadrat Durch Multiplikation mit dem Volumen, in dem die Zellen aufgenommen worden waren, ergibt sich wiederum die Gesamtzellzahl. 2.2.5 Zellaufschluss und Proteinextraktion Denaturierende Proteinextraktion Die für einen Western und die anschließende Detektion mit aufgereinigten AK vorgesehene Proteinextraktion wurde mit dem chaotrophen Reagenz Harnstoff durchgeführt, wobei die pelletierten und unter Umständen aufgetauten Zellen in einer möglichst gesättigten Harnstofflösung (8M) aufgenommen wurden. In einem Reaktionsgefäß wurden pro 106 Zellen 100 µl eingesetzt. Bei diesem Verfahren wird durch Einlagerung des Reagenzes die Struktur der Zellmembran und der meisten Proteine zerstört. Die Zellfragmente wurden anschließend 10 min bei 1000 x g und abzentrifugiert, der Überstand für eine SDS-PAGE vorbereitet. Native Proteinextraktion Material und Methoden 20 Bei der nativen Extraktion der Proteine kam ein erworbener Kit der Fa. Novagen (NucBuster) zum Einsatz. Er ermöglicht die getrennte Extraktion von Plasma – und Kernproteinen für die Weiterverarbeitung in nativer Form. Die Durchführung entsprach im Grunde der Anleitung des Kitherstellers und erfolgte durchweg auf Eis: 100 µl Zellpellet (entspricht etwa 2*107 Zellen) wurden in 300 µl Reagenz 1 aufgenommen, 15 s bei maximaler Geschwindigkeit gevortext, 5 min auf Eis gestellt, erneut 15 s gevortext und 5 min lang bei 4 °C und 16 000 Upm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand (Zytoplasmafraktion) wurde in ein frisches 1,5 ml – Eppendorfgefäß überführt. Das Pellet mit 2 µl Proteaseinhibitorcocktail, 2 µl DTT und 150 µl Reagenz 2 versetzt und resuspendiert. Es folgten 15 s Vortexen, eine Inkubation auf Eis für 5 min und ein erneutes Vortexen für 15 s. Abweichend vom Protokoll des Herstellers wurde an dieser Stelle eine zusätzlicher mechanischer Aufschluss mit MiccraD1 der Fa. Art durchgeführt (2 x 10 s bei maximaler Umdrehungszahl), um den Aufschluss zu intensivieren und die DNA zu zerstückeln. Es folgte erneut eine Zentrifugation wie oben beschrieben. Der Überstand, der Kernextrakt, wurde mit dem Plasmaextrakt zusammen geführt und bei -4 °C bis zum Einsatz bei der Immunpräzipitation gelagert. 2.3 Proteinbiochemische und Immunologische Methoden 2.3.1 SDS – PAGE SDS – PAGE mit Proteinextrakt Für den Gellauf wurden pro Slot je 15 µl des Proteinextraktes mit 3 µl des 6x Ladepuffers versetzt, 5 min bei 95 °C inkubiert und auf neun der zehn Slots aufgetragen. Ein Slot wurde mit 5 µl des BioRad – Markers bestückt. Anschließend erfolgte der Gellauf in der wassergekühlten Gelkammer bei 25 mA pro Gel bis die Lauffront das Gel verlassen hatte. Nach dem Gellauf wurde das Gel je nach Bedarf entweder eine halbe Stunde in Coomassie gefärbt und über Nacht in Leitungswasser auf dem Schüttler Promax 1040 entfärbt oder western geblottet. Material und Methoden 21 SDS – PAGE mit Immunpräzipitat Mit dem Immunpräzipitat (2.3.8 Immunpräzipitation) wurde beim Gellauf im Grunde ebenso verfahren wie mit dem Proteinextrakt, abgesehen von der Tatsache, dass das Präzipitat nach Abschluss der Präzipitation bereits im Ladepuffer vorlag und gleich aufgetragen werden konnte 2.3.2 Westernblot Das Gel wurde nach abgeschlossener SDS – PAGE wie in Abb. 1 dargestellt in die mit Tankblotpuffer befüllte Blotkammer eingelegt. Der Lauf dauerte 1 h bei 400 mA, wobei die Kammer wassergekühlt und gerührt wurde. Abb. 1: Westernblot. Aufbau des Westernblots innerhalb der Blotkammer und im angelegten elektrischen Feld (+ und -). Im Anschluss erfolgte eine ca. 5 minütige Ponceau S – Behandlung der Blotmembran, die dann so lange mit Leitungswasser gewaschen wurde, bis sich Proteinbanden abzeichneten. Zum Trocknen und zur Lagerung bei 4 °C wurden die Blots zwischen Filterpapier gepackt, wo sie bis zur Verwendung im Immunoblot aufbewahrt wurden. 2.3.3 Immunoblot Der in dünne Streifen geschnittene Westernblot mit dem elektrophoretisch aufgetrennten Proteinextrakt, gewonnen nach der denaturierenden Methode mit Harnstoff und dem mitgeführten Roth – Marker wurde zunächst für 1 h geblockt, 2x 5 min in Waschpuffer gewaschen, anschließend entweder in einem 1:25 verdünnten Serum 2 h oder einer affinitätsgereinigten (ohne Beads), 1:2 verdünnten AK – Lösung inkubiert, 4x gewaschen, 45 min lang mit 1:1000 verdünntem 2.AKh bedeckt. Nach 5x Waschen erfolgte die Substratbehandlung (500 µl), die unter Beobachtung der sich ausbildenden Banden und durch Abgießen der Substratlösung mit anschließender Inkubation im Waschpuffer abgebrochen wurde. Aufbewahrt wurden alle immunologisch behandelten Blots zwischen Filterpapierlagen und bei 4 °C. Material und Methoden 2.3.4 22 Streptavidin – ELISA In Mikrotiterplatten Nach einem halbstündigen Blocken und Waschen der mit Streptavidin beschichteten Wells erfolgte 1 h lang die Beladung mit 1:1000 verdünnten, biotinylierten Peptiden und eine erneute Waschung. Die anschließende Inkubation in 1:200 verdünntem Serum dauerte ebenfalls 1 h. Nach dem Waschen und der Beladung mit 1:5000 verdünntem 2AKh (bzw. 2AKr bei mitgeführten Kontrollen) für 1 h gefolgt von einem weiteren Waschschritt wurde das Substrat aufgetragen und nach ausreichender Blaufärbung (Beobachtung der Positivkontrolle, etwa 3-5 min) durch Zugabe einer 0,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte der auftretenden Gelbfärbung wurde am ELISA – Reader photometrisch bei einer Messwellenlänge von 450 nm und gegen eine Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen und mit Hilfe Software Magellan dargestellt. Von allen Lösungen wurden pro Well 100 µl aufgetragen. Zur anschließenden Waschung wurden nach jedem ELISA – Schritt (abgesehen von der Substratzugabe) 4x 300 µl Waschpuffer pro Well aufgewendet. Kontrollen Tab. 1: ELISA-Kontrollen. Beladungsreihenfolge der beim ELISA mitgeführten Kontrollen: I: Nullabgleich der photometrischen Messung, II: Prüfung auf unspezifische Anlagerung des 2.AKh an die Welloberfläche, III: Prüfung auf unspezifische Bindungen des 2.AKh an in dieser Kombination nicht-antigenes Peptid P27-11, IV: Positivkontrolle, V: Prüfung auf unspezifische Anlagerung des 2.AKr an die Welloberfläche, VI: Prüfung auf unspezifische Bindungen des 2.AKr an in dieser Kombination nicht-antigenes Peptid P27-11, VII: Negativkontrolle der verwendeten Seren; Prüfung auf unspezifische Bindung des SerumAntikörpers an Welloberfläche. Kontroll - Ansatz I blank II 2.Akh - Kontrolle III IV Positivkontrolle V 2.Akr - Kontrolle VI VII Serumkontrolle NC Antigen Kontrollpeptid P 27-11 + + + - Antikörper (Serum) + (rabbit) + (humane Probe) 2.AK h + + + r + + + - An magnetischen Microbeads Der Immunoassay an Microbeads verlief im Grunde analog zum ELISA, jedoch wurde er automatisiert und mit Hilfe eines eigens entwickelten computerunterstützten Prototyps (Fa. Thermolab Systems) des MPI für Molekulare Genetik und unter Betreuung durch die Arbeitsgruppe Dr. Zoltan Konthur durchgeführt. Material und Methoden 23 Es wurden ELISA - Platten mit den entsprechenden Puffern (Waschpuffer, Seren, 2.AK, Substrat) vorgelegt und in den Automaten gesetzt. 2 x 10 µl Beads (Fa. Dynal) pro eingesetztes Serum (Probe + NC) sowie je 10 µl für die Standardkontrollen (Tab. 1, I – IV) wurden zunächst in einem Ansatz 1 h geblockt, gewaschen und 1 h lang mit biotinyliertem Peptid (1:1000) beladen. Nach der Waschung wurden die Beads entsprechend der Anzahl an verwendeten Seren und Kontrollen auf die Wells einer ebenfalls zuvor in 5% Milchpulver – PBS geblockten ELISA – Platte aufgeteilt. Beim Austausch der Puffer kam ein Magnet (MPC-S, Fa. Dynal) zum Einsatz, der die Beads in Eppendorf Reaktionsgefäßen fixierte. Mit dem Einsetzen der mit Peptid beladenen Platte in den Automaten und dem Start des an die Bedürfnisse angepassten Programms (Tab. 2) setzte der Automatismus ein. Tab. 2: Protokoll des Immunoassays an magnetischen Streptavidinbeads. Die automatisierte Durchführung übernahm ein computergestütztes System, das vom MPI selbst entwickelt worden war. Es übertrug die Beads nach den vorgegebenen Zeiten von MTP zu MTP. Schritt Verdünnung Volumen Dauer Serum 1:400 200 µl 1h 4x Waschen - 200 µl 4x 5 min 2. AK 1:12000 200 µl 1h 4x Waschen - 200 µl 4x 5 min Substrat - 200 µl 5 min Nach Abschluss der Programms wurden per Hand in jedes Well 100 µl Stopplösung (0,5 M Schwefelsäure) gegeben und die Bestimmung der optischen Dichte bei 450 nm am ELISA – Reader der Arbeitsgruppe Konthur (MPI) durchgeführt. Da der Automat Volumen von mindestens 200 µl pro Well benötigt, wurden der Verdünnungsfaktor der AK und 2.AK im Vergleich zum Strepdavidin – ELISA verdoppelt, andererseits jedoch das doppelte Volumen aufgetragen, um die gleiche AK – Menge pro Well zu erhalten. 2.3.5 Citrullinierung von Peptiden Die Citrullinierung (Deiminierung der Peptidylarginine) eines (biotinylierten) Peptids fand im Zuge eines ELISA – Durchgangs (2.3.4) statt. Nach der Beladung eines Wells mit Peptid und der anschließenden Waschung wurde es über Nacht und auf einem Schüttler bei 37 °C in 100 µl PAD – haltigem PAD – Puffer A (0,5 µg PAD pro ml) inkubiert und ebenfalls vier mal mit Waschpuffer gewaschen um dann mit verdünntem Serum bedeckt zu werden. Die weitere Behandlung wich nicht vom ELISA – Protokoll ab. Parallel wurde unter Verwendung von PAD – Puffer B mit derselben PAD - Kon- Material und Methoden 24 zentration zu jedem Assay eine Kontrolle geführt, wobei das darin enthaltene EDTA die für die Enzymaktivität notwendigen Ca2+ - Ionen abfing und die Reaktion somit unterband. 2.3.6 Immunaffinitätschromatographie Als ELISA Die Affinitätsreinigung des AK erfolgte an einem biotinylierten Peptid, das an eine Streptavidin – beschichtete ELISA – Platte gebunden wurde. Der Ablauf entspricht im Allgemeinen der Durchführung des Streptavidin – ELISA's unter Punkt 2.3.4. Allerdings wurden die Seren nur 1:50 verdünnt und die anschließende Elution mit 100 µl Elutionbuffer pro Well durchgeführt. Nach einer halbstündigen Inkubation wurde der Puffer in Ultrafiltrationstubes (50 ml) überführt, mit Trispuffer auf 20 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und bei 3000 Upm 45 min zentrifugiert, sodass eine Konzentration des AK auf etwa 250 µl zustande kam. Nach einer weiteren Zugabe von ca. 20 ml Trispuffer und einer erneuten Zentrifugation wie oben beschrieben lag der Antikörper erneut in 250 µl Puffer vor. Er wurde bis zur Verwendung bei der Immunpräzipitation in ProteinG – MTP bei 4 °C gelagert. An magnetischen Microbeads Alternativ zur erst genannten chromatographischen Reinigungsmethode und zwecks Detektion eines präzipitierten Proteins / Antigens wurde die Isolierung gegen P32 gerichteter AK auch mit Hilfe von magnetischen Streptavidinbeads der Fa. Miltenyi Biotec durchgeführt, allerdings ohne den Einsatz des Automaten, der beim ELISA an Streptavidinbeads der Fa. Dynal Verwendung fand. Stattdessen wurde hier jeder Pufferaustausch manuell mit Hilfe eines Magneten erreicht. Alle Pufferkonzentrationen, und Inkubationszeiten entsprachen denen der Aufreinigung durch den ELISA an der Mikrotiterplattenoberfläche, abgesehen vom Serum, das in einer 1:3,3 – Verdünnung vorlag und über Nacht inkubiert wurde, um möglichst viel AK zu gewinnen. Für die Isolierung Selbiger aus 300 µl Serum wurden 300 µl der beadhaltigen Suspension eingesetzt. Alle übrigen eingesetzten Volumina betrugen 1 ml. Der letzte Pufferaustausch nach der Elution mit 150 µl Elutionbuffer erfolgte hier mittels Dialyse in einer Dialysemembran (cut off bei 10000 kDa) über Nacht und bei 4 °C gegen 800 ml des Trispuffers (20 mM, pH 7,4). Für die Aufbewahrung des isolierten AK genügte die Lagerung bei 4 °C. Material und Methoden 25 Die Beads wurden zweimal für die Aufreinigung von AK verwendet. Nach der Elution erfolgte zu diesem Zwecke eine Waschung in Wasser und in PBS, bevor eine erneute Beladung mit Serum – AK stattfinden konnte. 2.3.7 Immunhistochemische Inkubation Die zur Lokalisierung des Zielantigens eingesetzten Gewebsschnitte von HEp2 - Zellen (gelagert bei -20 °C) wurden nach dem Auftauen zunächst mit ca. 100 µl des ohne zu Hilfe nahme der Beads aufgereinigten und 1:3 in PBS verdünnten AK bedeckt und 0,5 h in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach drei Waschschritten à 5 min mit PBS erfolgte eine 30 minütige Beladung mit dem FITC – konjugierten sekundären AK, ebenfalls in der feuchten Kammer. Nach einer erneuten Waschung konnte der Schnitte mit einem Tropfen Einbettmittel (Glycerol – PBS, 1:1) und einem Deckglas bedeckt werden. Parallel wurden eine Positiv- (Einsatz des 1:20 verdünnten Serums, das zur Isolierung der AK gedient hatte, an Stelle der AK - Lösung) und eine Negativkontrolle (PBS statt AK) geführt. Die Detektion erfolgte am Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von 1:60. 2.3.8 Immunpräzipitation Die Wells der ProteinG – Platten wurden zunächst für wenige Sekunden mit je 200 µl IP – Puffer gewaschen/ äquilibriert. Es wurden anschließend je 200µl einer AKhaltigen Lösung (Serum, 1:5 verdünnt, Produkt der Affinitätschromatographie (2.3.5), 1:2 verdünnt) bzw. einer Kontrolle aufgetragen und über Nacht inkubiert. Nach vier mal waschen erfolgte für 2 h eine Inkubation mit einer 1:2 – Verdünnung des aus der nativen Proteingewinnung (2.2.5 Zellaufschluss und Proteinextraktion) hervor gegangenen Extrakts. Nach weiteren 4 Waschschritten wurde das Antigen durch Denaturierung mittels 40 µl 6x Ladepuffer (auf 95°C erhitzt) und zusätzlichem zehn minütigen Schütteln (Titramax, Stufe 6) eluiert und fand entweder direkt bei der SDS – PAGE Verwendung oder wurde bei 4 °C gelagert. 26 Ergebnisse 3 ERGEBNISSE 3.1 Native und denaturierende Proteinextraktion aus HeLa S3 Das Protein aus HeLa S3 – Zellen war nach zwei Verfahren gewonnen worden. Das chaotrophe Reagenz Harnstoff wurde dann eingesetzt, wenn der Extrakt geblottet und mit affinitätschromatographisch isolierten P32 – spezifischen AK inkubiert werden sollte (3.3.5). Für die Immunpräzipitation eines humanen Autoantigens (mit Hilfe der isolierten P32 – spezifischen AK) aus einem HeLa S3 – Extrakt (3.3.7) war dieser nativ mittels eines Kits der Fa. Novagen gewonnen worden. Abb. 3: mit PonceauS gefärbter Blot eines HeLa - Gesamtproteinextraktes, gewonnen mit 8 M Harnstoff. 1: Roth – Marker, 2/3: Zellextrakt Abb. 4: PonceauS-gefärbter Westernblot eines nativen HeLa - Proteinextraktes, gewonnen mit dem NucBuster-Kit von Novagen. 1: Roth – Marker, 2: Kernextrakt, 3: Zytoplasmafraktion Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die Blots der nach beiden Methoden gewonnenen HeLa S3 – Extrakte und damit das Gelingen der Aufreinigungen Ergebnisse 27 3.2 Untersuchungen des citrullinierten Peptids P12 Das ursprünglich aus der M9-Region des hnRNP A3 stammende citrullinierte Peptid P12 sollte auf die Eignung als Markerpeptid, vielleicht in Verbindung mit anderen Antigenen, für die RA untersucht werden. Wichtige zu bestimmende Kriterien sind die Sensitivität und insbesondere die Spezifität für die RA. Zu diesem Zweck kamen Seren unterschiedlicher Krankheitsbilder (RA, SLE, OA) zum Einsatz. Parallel zu P12 und gegen dieselben Seren wurde die interne Kontrolle P12-nc geführt, deren Sequenz bis auf zwei Arginine, die nicht citrulliniert sondern methyliert (verhindert Deiminierung des Peptidylarginins) vorlagen, nicht von der des Peptids P12 abwich. Diese interne Kontrolle für ein citrulliniertes Antigen ist nicht zu verwechseln mit der konventionellen Negativkontrolle (NC) des Serums, die zur Messung unspezifischer Bindungen von Serumproteinen und damit zur Berechnung einer Prüfgrösse (Extinktionsquotient EQ) heran gezogen wird, welche über den Befund entscheidet. Diese wurde nach der Formel EQ ! x a y a errechnet, wobei a die Extinktion der Zweitantikörperkontrolle (S. 22, Tab. 1, III), x die der Probe (Serum) und y deren Negativkontrolle (NC) darstellt. Die Untersuchungen sollten zudem zur Klärung der Frage beitragen, ob die in der gängigen Praxis für Citrullin-negativ befundenen Seren von RA – Patienten auch bei anderen citrullinierten Peptiden wie P12 tatsächlich dasselbe Ergebnis liefern. 3.2.1 Einfluss der Citrullinierung auf die Sensitivität von P12 Zur Beurteilung des Einflusses der Citrullinierung auf die Sensitivität von P12 wurden Seren von 34 RA – Patienten eingesetzt. Ein Befund fiel dann positiv aus, wenn EQ die festgelegte Schwelle von 2,1 überschritt (Abb. 4). 28 Ergebnisse 5 Extinktionsquotient P12 P12-nc 3 Schwelle 2,1 1 1 6 11 16 21 26 31 RA - Seren Abb. 4. Untersuchung der Sensitivität der Peptide P12 und P12-nc für AK aus Seren von RA – Patienten. Als positiv wurden jene Proben bewertet, deren Nettoextinktion (von unspezifischen Bindungen des Zweitantikörpers bereinigt) ins Verhältnis gesetzt zur Negativkontrolle (ebenfalls bereinigt) die rote Markierung (bei 2,1) überschritten. Schon bei visueller Betrachtung der Sensitivität in Form von Abb. 4 erkennt man, dass der EQ bei P12 bei mehreren Patienten überschritten wird, doch kein einziges Mal bei P12-nc. Tabelle 3 gibt dasselbe Ergebnis in Zahlen wieder. Zusätzlich wurde hier nach dem Befund des z. Z. einzigen serologischen Markers für citrullinierte Peptide (Fa. Eurodiagnostics) differenziert. Tab. 3 zeigt die Sensitivität der Peptide P12 und P12-nc für AK aus RA – Seren. Es wurden sowohl citrullinpositive als auch –negative Seren (diagnostiziert mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Tests auf B-Zellreaktivität gegen citrullinierte Peptide der Fa. Eurodiagnostics) eingesetzt. Peptid P12 P12-nc Zahl der getesteten Zahl der positiven Sensitivität Seren Seren % gesamt 34 10 29 + 19 5 26 - bei cp 15 5 33 gesamt 34 0 0 bei cp Fast 30 % der eingesetzten Seren enthielten AK gegen das citrullinierte Peptid P12, wohingegen keins davon mit der nicht citrullinierten Variante (P12-nc) des ansonsten homologen Peptids reagierte. Interessanterweise zeigt Tab. 3 ähnliche P12 – Sensitivitäten bei Patienten, deren Seren von den entsprechenden Instituten für cp- oder cp+ befunden worden waren. Sie weichen beide um etwa 10 % von der Gesamtsensitivität (29 % +/- 3 %) ab und bestätigen diese im Schnitt. 29 Ergebnisse 3.2.2 Sensitivität und Spezifität von P12 für die RA Für die Bestimmung der Spezifität des Peptids P12 für die RA wurden zusätzlich Seren von Patienten mit anderen Gelenks- oder Autoimmunerkrankungen (SLE, OA) getestet. Die entsprechenden Sensitivitäten zeigt Tab. 4. Tab. 4: Sensitivität des Peptids P12 für RA, SLE und OA. Krankheitsbild Zahl der positiven Zahl der getesteten Sensitivität Proben Seren % RA 34 10 29 SLE 11 0 0 OA 11 0 0 Es wurden unterschiedliche Sensitivitäten für die verschiedenen Erkrankungen ermittelt (Tab. 4). Errechnet man die Spezifität von P12 für die RA anhand der Sensitivitäten für die untersuchten Krankheitsbilder, so ergibt sich nach der Formel Spezifität ! RA Sensitivität "100% Summe _ aller _ ermittelten _ Sensitivitäten für die RA ein Wert von 100 %. Das bedeutet, dass alle P12 – positiven Seren von RA – Patienten und keins von denen der anderen untersuchten Krankheitsgruppen stammten. 3.3 Untersuchung des Peptids P32 Das Peptid P32 wurde ebenso wie P12 mit Seren verschiedener Krankheitsgruppen getestet. Auch hier sollten Sensitivität und Spezifität für die RA bestimmt werden. Anhand P32 – negativer Seren sollte zudem untersucht werden, ob eine Citrullinierung von P32 dieses antigen werden lässt. Bei weiteren Untersuchungen sollten eventuell vorliegende Homologien /molekulares Mimikri zu humanem Protein, das es in diesem Kontext zu lokalisieren sowie zu isolieren und sequenzieren galt, ermittelt werden. 3.3.1 Sensitivität und Spezifität von P32 für die RA Bei der Bestimmung der Sensitivitäten für unterschiedliche Krankheiten kamen Seren der bereits unter 3.1 untersuchten Krankheiten zum Einsatz. Das Ergebnis gibt Tab. 5 wieder. 30 Ergebnisse Tab. 5: Ermittlung der Sensitivitäten des Peptids P32 für AK aus Seren von Patienten mit RA, SLE und OA. Krankheitsbild RA SLE OA Zahl der getesteten Seren 24 12 12 Zahl der positiven Seren 8 2 3 Sensitivität % 33 17 8 Bei allen untersuchten Krankheiten treten P32 – spezifische AK auf, wobei die Sensitivität für die RA am höchsten ist. Die Spezifität für die RA beträgt unter Verwendung der unter 3.2.2 genannten Formel fast 60 %. 3.3.2 Einfluss der Citrullinierung auf die Sensitivität von P32 Zur Untersuchung der immunologischen Relevanz der Citrullinierung von P32 wurden 29 P32 – negative Seren von adulten Patienten aus Bad Liebenwerda und 15 Seren vom Institut für Rheumatologie der Charité eingesetzt. Es wurden auch hier die Quotienten nach dem oben beschriebenen Verfahren errechnet und als Diagramm in Abb. 5 dargestellt. 4 Extinktionsquotient P32 citrulliniertes P32 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 P32 - negative RA - Seren Abb. 5 zeigt den Extinktionsquotienten von 44 P32-negativen Seren vor und nach der Citrullinierung durch das Enzym PAD. Es wurde mit HRP-konjugierten und gegen humanes IgG gerichteten sekundären AK sowie TMB als Substrat gearbeitet und die Extinktion bei 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen. Man erkennt einen deutlichen Anstieg der Extinktion bei zumindest drei der verwendeten Seren adulter RA – Patienten nach der Deiminierung des Peptids P32. Es lässt sich unter diesen Umständen eine Sensitivität des citrullinierten P32 von 8 % für die RA errechnen, nachdem dieselben Seren vor der Citrullinierung P32 – negativ bewertet worden waren. 31 Ergebnisse 3.3.3 Isolierung von anti-P32 – AK mittels Streptavidin – ELISA Die affinitätschromatographische Isolierung der gegen P32 gerichteten AK aus P32 – positiven Seren erfolgte unter Verwendung der mit Streptavidin beschichteten ELISA – Platten und wie unter 2.3.7 beschrieben. Die einmal mit P32 beschichteten Platten wurden mehrmals mit denselben Seren beladen und eluiert. Dabei entstanden keine nennenswerten Verluste am ohnehin schon knappen Ziel – AK, wie durch Abb. 6 ersichtlich wird. Zumindest konnte anhand der Messungen nach den ersten fünf Zyklen gezeigt werden, dass die mit P32 beladenene Platte nach einer Elution eine geringere Extinktion lieferte, die AK also tatsächlich entfernt worden waren, und bei den folgenden Durchgängen immer wieder neue gebunden werden konnten. Extinktionen 2 vor Elution nach Elution 1 0 1 2 3 Anzahl Zyklen 4 5 Abb. 5: Extinktionen vor und nach der Elution eines jeden der fünf zu Beurteilung der Frage, ob eine Mikrotiterplatte zu mehr als nur einer affinitätschromatographischen Antikörperisolierung in der Lage ist, heran gezogenen Zyklen. Es muss ergänzt werden, dass die Messung der Extinktion nach jedem Durchgang anhand zweier (Probe + nc) neuer Wells erfolgte, da diese nach der Beladung mit 2.AK für weitere Isolierungen nicht mehr brauchbar waren. Immerhin blieb das Verhältnis von gebundenem zu eluiertem AK relativ konstant, bis auf die Messung nach dem dritten Zyklus (Abb. 6). Dass tatsächlich aktive AK isoliert werden konnten, zeigten anschliessende Untersuchungen mittels ELISA. Hier wurde der gereinigte AK in verschiedenen Verdünnungen auf eine MTP gegeben, die zuvor mit P32 beladen worden war. Ansonsten verlief der ELISA nach dem beschriebenen Protokoll. Das Ergebnis des Nachweises gibt Tab. 6 wieder. 32 Ergebnisse Tab 6: Gemessene Extinktionen nach der Inkubation von P32 mit verschiedenen Volumina des gegen P32 gerichteten aufgereinigten AK, isoliert im gewöhnlichen MTP – ELISA, ohne die Verwendung von Beads. Volumen des AK (µl) E MTP 10 (NC) 1 5 20 0,181 0,178 0,31 1,139 Man erkennt eine gewisse Korrelation zwischen der Extinktion und der eingesetzten Menge an AK. Die Aufreinigung hat offensichtlich funktioniert. 3.3.4 Isolierung von anti-P32 – AK mit Streptavidinbeads Der Nachweis der Isolierung von AK mittels magnetischer Beads erfolgte analog zu dem unter 3.3.3 beschriebenen Verfahren ohne Beads. Es wurden dieselben Volumina des isolierten AK auf die Wells einer mit P32 beladenen MTP aufgetragen (Tab. 7). Tab 7: Gemessene Extinktionen nach der Inkubation von P32 mit gegen Selbiges gerichteten aufgereinigten AK, isoliert aus dem Serum eines erwachsenen RA – Patienten und mit Hilfe von magnetischen Streptavidinbeads. Volumen des AK (µl) E MTP E Beads 10 (NC) 1 5 20 0,181 0,178 0,31 1,139 0,269 1,006 1,598 1,684 Der AK lag bei diesem Aufreinigungsverfahren in viel konzentrierterer Form vor (Tab. 7), als es die Isolierung auf einer MTP mit anschliessender Konzentrierung mittels Zentrifugal – Ultrafiltration ermöglichte. 3.3.5 Immunoblot der isolierten AK gegen HeLa S3 – Linie Die nach der Methode ohne Beads aufgereinigten AK wurden im Blot gegen das unter denaturierenden Umständen aus HeLa – Zellen gewonnene Protein eingesetzt. Abb. 7 zeigt den Blot vor (Slot 1, 2) und nach der Inkubation mit P32 – spezifischen AK, wobei dieser nur auf den letzten Streifen aufgetragen worden war. Zu erkennen sind Banden bei etwa 90 kDa, 80 kDa und 55 kDa sowie eine vierte Bande im unteren Drittel, deren Grösse nicht bestimmt werden kann. Bei dem Streifen links davon (3) handelt es sich um die 2.AKh – Kontrolle, die keine Bande aufweist. 33 Ergebnisse Abb. 7: Western eines HeLa - Gesamtproteinextraktes, gewonnen mit 8 M Harnstoff. 1: Roth – Marker, 2: Zellextrakt (1 + 2 gefärbt mit Ponceau S), 3: 2.AK-Kontrolle, 4: P32spezifischer AK, aufgereinigt mittels Streptavidin-MTP aus dem Serum eines RA-Patienten. 3 + 4: Detektion mit anti human IgG (pAK ausKaninchen, HRP-konjugiert). Die Isolierung P32 – spezifischer AK mit Hilfe von MTP scheint funktioniert zu haben. Allerdings findet er sein Epitop innerhalb des geblotteten und denaturierten Proteinextrakts mehrmals (Banden bei etwa 90, 80, 55 und weit unter 45 kDa). Doch geben die folgenden Untersuchungen der rechts markierten Bande bei ca. 55 % eine besondere Bedeutung. 3.3.6 Fluoreszenzmikroskopie Die Fluoreszenzmikroskopie nach einer immunhistochemischen Färbung ermöglicht die Lokalisierung des Zielantigens im Gewebe. Beim Einsatz des aufgereinigten P32 spezifischen AKs und des Serums, aus welchem sie isoliert worden waren, auf HEp2 – Zellen mit anschliessender Detektion durch FITC – konjugierte sekundäre AK entstanden fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (Abb. 8), die auf eine Lokalisierung des Zielantigens hauptsächlich in der Kernmembran hinweisen. Abb. 8 zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von HEp2-Zellen, die mit affinitätsgereinigten P32 - spezifischen AK einerseits (B und C, 20- bzw. 60-fache Vergrösserung) und mit dem Serum (D, 20-fach), das zur AK-Isolierung gedient hatte, inkubiert worden waren. A (20-fach)diente als Negativkontrolle. Hier wurde nur der FITC-markierte, gegen humanes IgG, -A, -M gerichtete polyklonale Zweitantikörper aus Kaninchen aufgetragen. 1: Kernmembran, 2: Zytoplasma, 3: Zellkern, 4: Nucleolus. Ergebnisse 34 Beim Vergleich der affinitätsgereinigten AK (mittlere Bilder) mit dem Serum eines RA – Patienten (Bild D) werden klare Unterschiede hinsichtlich der Lage antigener Strukturen deutlich. Während bei Verwendung des P32 – spezifischen AK hauptsächlich eine ringförmige Struktur, die Kernmembran (1), angefärbt wird, legt das rechte Bild die Annahme weiterer Antigene wie nucleoläre (4, kleine helle Punkte innerhalb des Kerns) und ansatzweise auch zytoplasmatische Strukturen (2) nahe, was auf das Vorkommen weiterer AK – Spezifitäten als nur die gegen P32 Gerichtete im Serum des Patienten deutet. Die Negativkontrolle hingegen (linkes Bild, nur 2.AK – FITC) lieferte nur ganz schwache Hintergrundsignale, was das Gelingen der Affinitätsreinigung zusätzlich zu Abb. 7 bestätigt. 3.3.7 Präzipitation eines humanen Autoantigens aus einem HeLa S3 – Extrakt mittels anti-P32 - AK Bei der Immunpräzipitation eines P32 – homologen humanen Autoantigens in ProteinG – Platten wurden RA – Seren mit einer besonders starken Avidität zu P32 (ermittelt im ELISA) sowie die aus diesen Seren mittels beider angewandter affinitätschromatographischer Methoden (3.3.3, 3.3.4) isolierten AK eingesetzt. Im nächsten Schritt wurden die nativ gewonnen HeLa – Proteine (3.1) aufgetragen. Die Untersuchung des Eluats der Immunpräzipitation erfolgte mittels SDS-PAGE mit anschliessender Coomassiefärbung. Abb. 9 zeigt das Ergebnis der Immunpräzipitation. Abb. 9: SDS-PAGE + Coomassie von den Eluaten der Immunpräzipitation (Immunaffinitätschromatographie in ProteinG-MTP). Aufgetragen wurden 1: Roth-Marker und die Eluate von: 2: Zellextraktkontrolle (Zellextrakt ohne AK bzw Serum; stattdessen IPPuffer), 3-5: P32-positive RA-Seren mit Proteinextrakt, 6: mittels Streptavidin-MTP und 7: mittels magnetischer Streptavidinbeads gewonnene AK mit Proteinextrakt, 8-10: Serenkontrollen (Serum mit IP-Puffer statt Zellextrakt). Die markierte Bande zeigt ein potenzielles Autoantigen bei RA-Patienten. Der Proteinextrakt war mittels NucBuster Kit der Fa. Novagen aus HeLa S3-Zellen gewonnen worden. Das Abbild des Gels zeigt eine schwache Bande (rechteckige Markierung im Gel) bei etwa 55 kDa in der siebten Spur, auf die das Präzipitat /Eluat der mit Hilfe von mag- 35 Ergebnisse netischen Beads gewonnen AK mit HeLa - Protein aufgetragen worden war. Die anderen Banden kamen für weitere Untersuchungen nicht in Betracht, da sie auch in mindestens einer der Kontrollspuren (2, 8-10) auftauchen. 3.3.8 Nachweis eines immunpräzipitierten Antigens Ein weiteres Gel, das analog und parallel zu dem in Abb. 10 dargestellten mit Immunpräzipitat beladen worden war, wurde geblottet und mit P32-spezifischen AK, die unter zu Hilfe nahme magnetischer Microbeads isoliert worden waren, inkubiert (Spur 3). Abb. 10: Western eines immunpräzipitierten Proteins aus nativ isolierten HeLaS3-Proteinen, gewonnen mit einem Kit der Fa. Novagen (NucBuster) und gegen P32 gerichteter AK, die affinitätschromatographisch aus dem Serum eines RA-Patienten isoliert worden war. 1: Roth – Marker (gefärbt mit Ponceau S), 2: dient als zusätzliche 2.AK-kontrolle, 3: detektiertes immunpräzipitiertes Protein. 4: 2.AK-Kontrolle, 2 - 4: Detektion mit anti human IgG (pAK aus Kaninchen, HRP-konjugiert) Der Streifen, der mit dem präzipitierten Protein beladen worden war (Spur 3) zeigt eine Bande bei einer Grösse zwischen 55 und 60 kDa. Das bestätigt zunächst das Ergebnis des Gellaufs nach der Immunpräzipitation, der ebenfalls eine Bande bei etwa 55 kDa hervorgebracht hatte (Abb. 9). Durch den Immunoblot (Abb. 10) konnte zudem gezeigt werden, dass es sich bei dem Präzipitierten um ein humanes Protein handelt, das eine gewisse Homologie zur Sequenz des Peptids P32 besitzen muss. Spur 2 zeigt einen Streifen, der mit AK inkubiert wurde, welche nicht mit Hilfe von Beads gewonnen worden waren. Hierbei konnte kein Protein detektiert werden. 3.4 Magnetic Streptavidin Beads vs. Streptavidin – MTP Die zur Klärung der Frage, ob denn signifikante Unterschiede in den Sensitivitäten der beiden angewandten ELISA – Methoden vorliegen, wurden ebenfalls die Antigene P12 und P32 gegen 44 Seren unterschiedlicher Krankheitsgruppen (RA, SLE, OA) eingesetzt. Der Versuch an magnetischen Beads war am MPI unter der Leitung von Dr. Zoltan Kothur erfolgt. Die gemessenen Extinktionen (Probe und NC) wurden auch dieses Mal bereinigt (Substraktion der Extinktion der 2.AK – Kontrolle) und ins Ver- 36 Ergebnisse hältnis gesetzt. Abb. 11 und 12 zeigen die berechneten Quotienten beider Verfahren für je ein Peptid. 10 P12 Extinktionsquotient 8 MTP Beads 6 4 2 0 1 6 11 16 21 26 Patientenseren 31 36 41 Abb. 11 stellt den Quotienten aus Probenwert und NC in Abhängigkeit von der angewandten Methode (ELISA in MTP oder an magnetischen Beads) und den eingesetzten Patientenseren (der Krankheitsgruppen RA, 22 Seren, sowie SLE und OA mit je elf Seren) dar. Als Antigen wurde hier das Peptid P12 eingesetzt. Die rote Markierung gibt auch hier den Schwellenwert für den Extinktionsquotienten bei 2,1 wieder. Wird er von einem Serum überschritten, gilt es als positiv. 25 P32 Extinktionsquotient 20 MTP Beads 15 10 5 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 Patientenseren Abb. 12: wie Abb. 11, jedoch erfolgten die Untersuchungen am Antigen P32. Die Verläufe beider Verfahren zeigen zunächst bei rein visueller Betrachtung für beide zu Grunde gelegten Antigene starke Korrelationen /Parallelen. Stark positive Seren lieferten fast immer bei beiden Verfahren starke Signale. Um festzustellen, ob denn anhand der unterschiedlichen Methoden auch die selben Sensitivitäten ermittelt werden können, wurden diese für beide Verfahren und anhand beider für die Untersuchung verwendeten Peptide ermittelt. Tabelle 8 zeigt 37 Ergebnisse die errechneten Sensitivitäten für die Gesamtheit aller heran gezogenen Krankheitsgruppen (RA, SLE, OA), ohne nach diesen zu differenzieren, und gibt den Anteil der gleichen Befunde bei beiden Verfahren wieder, wobei auch hier für einen positiven Befund der Schwellenwert von 2,1 für den bereinigten Extinktionsquotienten zu überschreiten galt. Tab. 8: Übersicht über die Sensitivitäten der Antigene P12 und P32 für alle Seren, also ungeachtet der diagnostizierten Erkrankungen, beider ELISAMethoden und über den Anteil der gleichen Befunde bei beiden Verfahren. Peptid P12 P32 Methode % Positive ohne Beads 11 mit Beads 9 ohne Beads 25 mit Beads 23 % gleiche Befunde 93 89 Die Sensitivitäten variieren in nur sehr geringem Masse über die angewandten ELISA – Methoden. Bei beiden Peptiden liegt die Zahl der übereinstimmenden Diagnosen bei etwa 90 %. 3.5 Epitopmapping an hnRNP A1 und hnRNP A2 Die A1/A2 – Peptide, die zur Verfügung standen, deckten nicht die gesamte A1/A2 – Sequenz ab, da bei voran gegangenen Untersuchungen in der Arbeitsgruppe die AK – Bindestellen bei RA – Patienten bereits grob zugeordnet werden konnten. Von den ursprünglich 371 (A1) und 353 AS (A2) lagen nur 195 bzw. 105 AS vor. Es handelte sich um Peptide von 15 AS Länge, wobei jedes mit seinen direkten Nachbarn über einen Bereich von fünf AS überlappte. Es wurde mit den Seren der Krankheitsgruppen RA, MS und SLE sowie von gesunden Mitarbeitern der Rheumatologie gearbeitet, wobei die RA zusätzlich in die Altersgruppen Erwachsene (Adulte) und Kinder eingeteilt wurde. Zudem handelte es sich bei den RA – Seren um solche, die bei voran gegangenen ELISA – Untersuchungen als positiv gegen hnRNP A3 beurteilt worden waren. Der Extinktionsquotient, den es für einen positiven Befund zu überschreiten galt, wurde bei diesen Untersuchungen auf 2,5 gesetzt, wodurch klarere Ergebnisse erzielt werden konnten. 38 Ergebnisse 3.5.1 Häufigkeit einer B-Zellantwort gegen A1/A2 – Peptide differenziert nach Krankheitsgruppen Tabelle 9 zeigt die Zahl aller positiven Reaktionen auf die untersuchten Peptide sowie die durchschnittliche Anzahl positiver Befunde pro Person, wobei nicht nach der Reaktivität der Seren innerhalb einer Krankheitsgruppe differenziert wurde. Der Mittelwert gestattet eine Aussage über das Maß der AK – Aktivität gegenüber der Gesamtheit der untersuchten Peptide in Abhängigkeit von den Patientengruppen. Tab. 9: Gesamtzahl und über die Testpersonen gemittelte Häufigkeit (fett gedruckt) positiver Befunde in der Summe aller untersuchten Peptide von A1 und A2. Es wurden mehrere Krankheitsgruppen sowie gesunde Testpersonen betrachtet. Peptide Zahl der positiven Reaktionen innerhalb einer Krankheitsgruppe gegen alle Peptide der insgesamt und im Schnitt pro Person Adulte RA 24 Seren Kinder-RA 18 Seren MS 17 Seren SLE 9 Seren Gesunde 9 Seren gesamt 20 16 24 8 5 pro Patient 0,8 0,9 1,4 0,9 0,6 gesamt 17 8 20 8 1 pro Patient 0,7 0,4 1,2 0,9 0,1 Proteine A1 A2 Zu erkennen sind an Hand der fett gedruckten Zeilen Unterschiede in der Zahl der positiven Befunde innerhalb jeder Patientengruppe und insbesondere im Vergleich zur Gruppe der gesunden Testpersonen. Diese schlagen zwar auch bei Peptiden beider hnRNP an, allerdings in geringerem Maße. Besonders hoch liegt die Zahl der Positivitäten bei Patienten mit MS. 3.5.2 Sensitivitäten aller A1/A2 – Peptide für unterschiedliche Krankheitsgruppen Für eine genauere Lokalisierung der Peptidepitope wurden die Sensitivitäten aller vorliegenden Peptide für verschiedene Erkrankungen ermittelt und in Tabelle 9 abgebildet. Zu erkennen sind sehr deutliche Unterschiede in den Sensitivitäten der Peptide. Einzelne Peptidepitope, die besonders hohe Sensitivitäten innerhalb einer Krankheitsgruppe aufweisen, wurden fett gedruckt. 39 Ergebnisse Tab. 10: Die Sensitivitäten aller untersuchten A1- (Zeile 1-19) und A2-Peptide (Zeile 2028) für die Krankheitsgruppen RA (unterteilt in Erwachsene und Kinder), MS, SLE sowie für gesunde Kontrollpersonen. Alle Werte, die den festgelegten Schwellenwert von 13 % überschritten (fett gedruckt), wurden zur Ermittlung der Häufigkeit gemeinsamer Reaktivitäten innerhalb derselben Patientengruppe heran gezogen. A1- % Sensitivität für [Krankheitsgruppe] von insgesamt [Anzahl getesteter Seren] A2 - Adulte RA Kinder-RA MS SLE Gesunde Peptide 24 Seren 18 Seren 17 Seren 9 Seren 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 8 4 0 4 4 8 0 4 4 4 0 13 0 0 25 0 4 0 0 8 17 0 38 0 8 0 0 0 0 6 0 0 6 33 0 0 6 0 0 0 6 0 11 0 0 11 11 0 11 0 33 6 6 0 0 0 12 0 0 12 0 47 0 0 0 0 0 29 6 0 24 0 0 6 6 6 41 0 29 0 35 6 0 0 0 0 0 0 0 44 0 0 0 0 0 11 0 0 22 0 0 11 0 0 33 0 33 0 22 0 0 0 0 0 0 20 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 Abb. 13 zeigt die Lage der sensitivsten Peptide innerhalb der untersuchten Bereiche (violette Markierung) von hnRNP A1 und –A2. Es handelt sich dabei um die RNA-Bindedomä nen (RRM1/ RRM2). Bei voran gegangenen Untersuchungen konnte die Lage der Epitope bei RAPatienten auf diesen Bereich eingegrenzt werden. Rot gekennzeichnet sind die Submotive der RNA-Bindedomänen. 40 Ergebnisse Die prozentuale Verteilung der Häufigkeiten über der Anzahl (n) positiver Befunde des einzelnen Patienten einer jeden Krankheitsgruppe zeigen Tabelle 11 für A1 – bzw. Tabelle 12 für die A2 - Peptide. Die fett gedruckte Zeile gibt den Anteil derjenigen Patienten wieder, die gegen keines der untersuchten Peptide AK gebildet hatten. Die zweite Zeile (n = 1) zeigt den Anteil derjenigen Patienten, die nur auf ein einziges A1 – bzw. A2 – Peptid positiv reagierten usw. Tab. 11: Übersicht über die Verteilung prozentualer Häufigkeiten in Abhängigkeit von der Anzahl positiver Befunde innerhalb jeder Krankheitsgruppe. Die fett gedruckte Zeile zeigt den Anteil derjenigen Patienten, die gegen keines der untersuchten A1-Peptide Antikörper besassen. Anzahl n %uale Häufigkeit des Eintretens von n positiven Befunden bei den Krankheitsgruppen positiver Adulte RA Kinder-RA MS SLE Gesunde Befunde 24 Seren 18 Seren 17 Seren 9 Seren 9 Seren 0 54 56 41 44 56 1 25 22 18 33 33 2 8 6 12 11 11 3 8 11 18 11 4 4 6 12 60 Adulte RA Kinder-RA % Häufigkeit MS SLE 40 Gesunde 20 0 0 1 2 3 4 Zahl der Positivitäten Abb. 14: Histogramm der Anzahl positiver Befunde bei der Untersuchung von A1Peptiden innerhalb jeder Krankheitsgruppe, basierend auf den Daten aus Tabelle 11. Die Ergebnisse aus Tabelle 11 wurden in Abbildung 13 veranschaulicht. Unter den Gesunden treten weniger mehrfache Reaktivitäten auf als bei allen anderen Gruppen. Drei von neun gesunden Testpersonen hatten AK gegen ein einzelnes und nur eine Person gegen zwei Peptide. Die meisten multifaktoriellen Immunreaktivitäten und gleichzeitig den geringsten Anteil an Solchen Patienten, die auf keines der Antigene 41 Ergebnisse ansprangen, zeigte die MS – Gruppe, gefolgt von der SLE – und beiden RA – Gruppen (Tabelle 11, Abbildung 14). Tab. 12: Wie Tab 11, jedoch auf der Grundlage der A2-Peptide. Anzahl n %uale Häufigkeit des Eintretens von n positiven Befunden bei den Krankheitsgruppen positiver Adulte RA Kinder-RA MS SLE Gesunde Befunde 24 Seren 18 Seren 17 Seren 9 Seren 9 Seren 0 50 67 59 56 89 1 38 22 0 11 11 2 4 11 3 8 4 18 22 12 11 12 100 Adulte RA Kinder-RA MS 80 % Häufigkeit SLE Gesunde 60 40 20 0 0 1 2 3 4 Zahl der Positivitäten Abb. 15: Histogramm der Anzahl positiver Befunde bei der Untersuchung von A2Peptiden innerhalb jeder Krankheitsgruppe, basierend auf den Daten aus Tabelle 12. Noch deutlicher werden die Unterschiede bei der Betrachtung der A2 – Peptide (Tabelle 12). AK gegen eines der untersuchten Peptide konnten nur bei einer gesunden Person nachgewiesen werden. Auch hier treten die meisten multifaktoriellen Reaktivitäten bei MS – Patienten auf. Zudem werden hier Unterschiede zwischen den Reaktivitäten beider RA – Gruppen deutlich. Nur ein Drittel der jungen RA – Patienten reagierte positiv und keiner der Betroffenen auf mehr als zwei A2 – Peptide. Diskussion 42 4 DISKUSSION 4.1 P12 An Hand des RA – Antigens P12 konnte in der Tat die gegenwärtige Ansicht hinsichtlich der immunologischen Bedeutung des Peptidylcitrullins für die RA bestätigt werden. Untersuchungen mit 34 RA – Seren an P12 und P12-NC zeigten ganz klar, dass allein durch das Vorhandensein zweier Peptidylcitrulline an Stelle zweier Arginine innerhalb der P12 – Sequenz dessen RA – Sensitivität von 0 % auf immerhin 29 % anstieg. Bei einer Erniedrigung des von uns fest gesetzten Grenzwertes für den Extinktionsquotienten hätten durchaus höhere Sensitivitäten erzielt werden können, ohne dass die Seren als positiv gegen die interne Negativkontrolle P12-nc befunden worden wären. Allerdings hatten wir uns für einen gemeinsamen Schwellenwert von 2,1 für alle durchgeführten Untersuchungen entschieden. Dagegen konnten in keinem der je elf SLE – und OA – Seren AK gegen P12 nachgewiesen werden. Die Betrachtung aller bislang untersuchten Sensitivitäten gestattet die vorläufige Annahme einer 100 %igen Spezifität von P12 für die RA. Nach den bisherigen Ergebnissen zu urteilen, wäre es durchaus in der Lage, als Markerantigen, alleine oder in Verbindung mit anderen Peptiden, sinnvolle Verwendung zu finden. Vorstellbar wäre beispielsweise ein Diagnosechip, der eine sinnreiche Kombination einer frei wählbaren Anzahl unterschiedlicher Markerantigene trägt und via Schnittselle binär ausgelesen werden kann. Die Entwicklung solcher Proteinmicroarrays wird unter Anderem auch von verschiedenen Arbeitsgruppen der Charité vorangetrieben. Die Frage, ob denn das Ergebnis des kommerziellen anti-CP – Tests, der das Serum nach AK gegen citrullinierte Peptide screent, generelle Gültigkeit hat, musste mit einem klaren nein beantwortet werden. Die Zahl der P12 – positiven unter den je fünf eingesetzten und laut Testergebnis als CP - negativ (33 %) oder - positiv (26 %) eingestuften Seren hält sich durchaus die Waage. Im Schnitt ergeben beide Anteile sogar die Gesamtsensitivität, die an Hand von 34 RA – Seren ermittelt worden war (29 %). Der Test trifft also nur eine Aussage darüber, ob der untersuchte Patient AK gegen das eingesetzte Peptid produziert oder nicht. Hier besteht Bedarf an der Erweiterung der Diagnose um das ein oder andere hoch RA – spezifische Markerpeptid, so dass Gesamtspezifitäten von annäherend 100 % und eine entsprechend hohe Treffsicherheit bei der Diagnose von RA erreicht werden können. Die besondere Bedeutung der Peptidylcitrulline für die RA konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit noch mal bestätigt werden. Weitere und umfangreichere Untersu- Diskussion 43 chungen an CP sollten mit der RA – Forschung einhergehen, um dem Geheimnis dieses besonderen Zusammenhangs näher zu kommen. 4.2 P32 Die Untersuchungen am Antigen P32 ergaben bei 24 verwendeten Seren zwar mit 33 % eine mindestens ebenso hohe Sensitivität für die RA wie P12 (29 %), doch enthalten auch Seren anderer Krankheitsgruppen P32 – spezifische AK. Von den jeweils eingesetzten zwölf Seren waren bei SLE 17 % und bei der OA 8 % P32 – positiv. Dadurch lässt sich eine Spezifität von höchstens 60 % ermitteln. Verglichen mit P12 oder anderen CP eignet es sich daher nicht für den Einsatz als diagnostisches Instrument. Durch den Einsatz von 44 P32 – negativen Seren konnte allerdings erneut die immunologische Bedeutung von CP für die RA gezeigt werden. 8 % der eingesetzten Seren besassen AK gegen die citrullinierte Variante von P32. Auch hier kam die Immunreaktivität einzig durch die Deiminierung der beiden in der Sequenz enthaltenen Peptidylarginine zu Stande. Eine Bestimmung der Spezifität dieses citrullinierten Peptids wäre in diesem Zusammenhang interessant gewesen, konnte aber angesichts mangelnder Zeit nicht mehr realisiert werden. Der Ursprung des Peptids, bzw. seines 41 kDa – Vorläufers, der beim Phagedisplay einer humanen cDNA – Bank aufgetreten war, wurde bis heute nicht geklärt. Die Untersuchungen hatten im Rahmen einer Diplomarbeit im Jahre 2002 unter der Betreuung der Arbeitsgruppe Skriner stattgefunden. Das Interesse an der weiteren Erforschung des Proteins kam aufgrund seines antigenen Charakters bei der RA und des Misslingens jeglicher Vergleiche mit humanen Sequenzen zu Stande. Auf der Suche nach einem (linearen) Epitop hatte die Arbeitsgruppe Skriner die Länge auf 15 AS (Peptid P32) reduziert. Es galt nun, das humane Antigen ausfindig zu machen, das die P32 – spezifische Immunantwort auslöst. Hierzu hatten wir zunächst unter zu Hilfe nahme von Streptavidin – MTP eine Immunaffinitätschromatographie durchgeführt. Dabei durchlief die Platte mehrere Beladungs- und Elutionszyklen, ohne dass eine offensichtlich dadurch bedingte Beeinträchtigung der Effizienz stattgefunden hätte (Abb.5). Allerdings war die allgemeine Ausbeute bei dieser Methode nicht ausreichend. Angesichts der kleinen Volumina der andererseits zahlreich vorhandenen Seren mussten immer wieder neue P32 – positive Seren ermittelt und hieraus AK isoliert werden. Während der ELISA in der Lage war, ein Gelingen der Affinitätschromatographie zu bestätigen (Tab. 6), reichten die Sensitivitäten anderer immunologischer Methoden wie Western oder Diskussion 44 Immunopräzipitation für das Arbeiten mit den geringen Mengen an anti-P32 kaum aus. Schliesslich gelang es uns an einem HeLa S3 – Blot (Abb. 7) und unter Verwendung des isolierten AK, der über Nacht den Streifen bedeckt hatte, drei schwache Banden im Bereich von 55 bis 90 kDa zu detektieren, womit ein erster Nachweis für das Vorhandensein eines P32 – homologen humanen Antigens gelungen wäre. Der für diesen Blot verwendete Proteinextrakt war unter Verwendung denaturierender Reagenzien (Harnstoff) gewonnen worden, da beim SDS-PAGE ohnehin eine Proteindenaturierung statt gefunden hätte. Auch die fluoreszenzmikroskopische Lokalisierung des Antigens in Hep2 – Zelle konnte mit Hilfe des AK durchgeführt werden. Abb. 8 zeigt eine deutliche Färbung der Kernhülle. Für die weiteren geplanten Untersuchungen (Immunpräzipitation, Immunoblot, Sequenzierung) war die Konzentration des isolierten AK nicht mehr ausreichend. Es ist anzunehmen, dass der ohnehin schon in geringen Konzentrationen vorliegende Ziel – AK im Verlaufe der Vielzahl von Behandlungen und angesichts der vielen mit ihm in Kontakt getretenen Oberflächen (Pipettenspitzen!, MTP, Falcon Tube, Eppendorf RKKGefäß ...) zu einem großen Teil verloren gegangen ist. Aufgrund der zudem knapp bemessenen Ressourcen (Volumina der einzelnen Patientenseren) beschlossen wir den Einsatz von Microbeads, die eine wesentlich größere Oberfläche bei gleichzeitig kleinen Arbeitsvolumina bieten. Was zuvor die Wells einer ganzen MTP benötigte, spielte sich beim neuen Verfahren mit Beads innerhalb eines Volumens von 200 µl ab. Mit Hilfe der Beads gelang es uns nun, AK eines einzelnen Serums in einer Konzentration zu gewinnen, die uns deren Einsatz bei der Immunpräzipitation Hierfür benötigten wir ein Zellextrakt mit nativen Proteinen. Wir verwendeten einen Kit, der Zytoplasma- und Kernfraktion getrennt liefert, und die wir wieder für den Einsatz bei der Immunpräzipitation zusammenführten, um die geringe Menge an isoliertem antiP32 nicht aufteilen zu müssen. Das mit dem Eluat des Präzipitats beladene SDS-Gel zeigt nach der Coomassiefärbung eine schwache Bande bei etwa 55 kDa (Abb. 9). Sie taucht in keiner anderen Spur auf und besitzt dasselbe Molekulargewicht wie eine der Banden die von isolierten AK auf einem HeLa S3 – Blot (Abb. 7) detektiert worden waren. Sie taucht bei keiner Negativkontrolle, allerdings auch nicht im Präzipitat der eingesetzten Seren, die zur Isolierung der P32 – spezifischen AK dienten, auf. Dies könnte daran liegen, dass das Serum in einer geringeren Konzentration aufgetragen wurde. Zudem beinhaltet es eine Vielzahl von AK unterschiedlicher Spezifitäten, die mit dem Ziel – AK um die mit ProteinG beschichteten Wells in Konkurrenz Diskussion 45 treten. Auch der an Hand des gewöhnlichen ELISAs ohne zu Hilfe nahme der Beads isolierte AK war nicht in der Lage, ein Antigen zu präzipitieren. Dieselben Eluate wurden zusätzlich geblottet, um eine Detektion mit Hilfe der isolierten AK durchzuführen. Es konnte nachgewiesen werden, dass das präzipitierte Protein tatsächlich eine Homologie zu P32 besitzen muss. Der affinitätschromatographisch gereinigte AK war in der Lage, eine schwache Bande bei etwa 55 kDa (Abb. 9) zu detektieren. Sie wurde zwecks Massenspektrometrie an die Arbeitsgruppe Dr. Jungblut (Institut für Biochemie, Charité) übergeben. Das Ergebnis konnte leider nicht mehr in die Auswertung der vorliegenden Arbeit eingegliedert werden. 4.3 ELISA mit und ohne Beads Es war im Verlaufe meiner Beschäftigung als Diplomand in der Arbeitsgruppe Skriner die Frage aufgekommen, ob sich denn unter Verwendung magnetischer Streptavidinbeads in gewöhnlichen MTP vergleichbare Ergebnisse, also ähnliche Sensitivitäten der Antigene, erzielen lassen. Und in der Tat zeigen bereits Abb. 11 und 12 eine große Korrelation der Ergebnisse beider Methoden. Die Abweichung der Sensitivitäten von Methode zu Methode variiert um etwa 10 % (P32) bis 20 % (P12). Bei beiden Peptiden wurde durch das Verfahren ohne Beads die geringere Sensitivität ermittelt. Allerdings ließe sich eine solche Beeinflussung des Ergebnisses durch Angleichen des Schwellenwertes relativieren. Wichtig in diesem Zusammenhang ist insbesondere die Frage nach dem Anteil der übereinstimmenden Befunde im Vergleich der Methoden (Tab. 8). Bei 89 % der Seren lieferten beide dieselbe Diagnose. Das gilt sowohl für P12 als auch für P32. Durch geringfügiges Ändern des Schwellenwertes, der bei den vorliegenden Untersuchungen stets 2,1 betrug, könnte die Zahl der gleichen Befunde nach oben korrigiert werden. Die Relationen der Extinktionsquotienten innerhalb einer Methode würde damit nicht beeinflusst und das Ergebnis folglich nicht verfälscht werden. 4.4 Epitopmapping an hnRNP A1 und A2 Bereits bei einer Gesamtbetrachtung der Reaktivitäten unabhängig von der Frage, welches der eingesetzten Seren eine positive Reaktion lieferte (Tabelle 9), konnte nachgewiesen werden, dass innerhalb der Kontrollgruppe der Gesunden die wenigsten Positivitäten (gemittelt über die Zahl der untersuchten Person) auftraten, während die Seren von MS – Patienten die höchste Zahl an Reaktionen pro Patient zeigten. Diskussion 46 Etwa die Hälfte der Patienten (zwischen 41 % und 56 %, Tabelle 11) reagierte auf keins der A1 – Peptide positiv. Bei den A2 – Peptiden lag dieser Anteil mit Werten zwischen 50 % und 67 % sogar deutlich höher. Hier wurde auch deutlich, wieso gerade MS – Patienten durchschnittlich die meisten Reaktivitäten pro Person lieferten. Der Anteil derjenigen, bei denen keine AK gegen die untersuchten Peptide nachgewiesen werden konnten (41 % bei A1, 59 % bei A2), wich von denen der anderen Krankheitsgruppen nicht allzu sehr ab. Vielmehr lag die Erscheinung in der Tatsache begründet, dass die Zahl der Mehrfachpositivitäten bei dieser Gruppe am größten war, was mit Hilfe der Tabellen 11 und 12 und den entsprechenden Abbildungen 14 und 15 gezeigt werden konnte. Unterschiede in der Verteilung der Anzahl an Reaktivitäten zwischen der frühen Form der RA bei Kindern und der adulten RA traten bei den Untersuchungen an A1 – Peptiden (Tabelle 11, Abbildung 14) kaum auf, dafür aber bei den A2 – Peptiden (Tabelle 12, Abbildung 15). Hier zeigten zwei Drittel der Kinder keine Reaktivitäten, während die übrigen Patienten derselben Gruppe Reaktivitäten gegen höchstens zwei Peptide pro Person aufwiesen. Bei differenzierter Betrachtung der Sensitivitäten aller Peptide (Tabelle 10) werden ebenfalls Unterschiede deutlich. Als Hauptepitop konnte für die Gruppe der jungen RA - Patienten das Peptid 6 des A1 – und Peptid 23 des A2 – Proteins bestimmt werden. Für die Zuordnung der Epitope der anderen Patientengruppen wurde das Augenmerk auf solche Peptide gerichtet, die bei Patienten eine Sensitivität größer als und bei den gesunden Personen eine kleinere als 13 % lieferten. Da auch zuletzt genannte auf bestimmte Peptide anzuschlagen schienen (20 % bei den Peptiden 4 und 15 des A1 – Proteins), kamen diese als Epitop für die Patientengruppen nicht in Frage. Abbildung 13 zeigt für die untersuchten Gruppen die wahrscheinlichste Lage der Epitope. Innerhalb des A1 – Proteins lagen die Epitope für AK aus der MS – und SLE – Gruppe an derselben Stelle wie bei der Gruppe der Kinder – RA und im Bereich der ersten RNA – Bindedomäne (Peptid 6), während das A1 – Epitop für Seren adulter RA – Patienten in den Bereich der zweiten Bindedomäne fiel (Peptid 12). Peptid 6 überlappt vollständig mit dem ersten Submotiv der ersten RNA – Bindedomäne des A1. Peptid 12 um zwei AS mit dem zweiten Submotiv der zweiten RNA – Bindedomäne (Abbildung 13, Schema des Aufbaus der hnRNP’s entnommen aus [78]). Auch innerhalb des A2 – Proteins deuteten Untersuchungen mit den Seren beider RA – Gruppen auf ein gemeinsames Epitop hin (Peptid 23), das genau zwischen den beiden Submotiven der ersten RNA-Bindedomäne des A2. Die stärksten Reaktionen mit Seren von MS – Patienten wurden von Peptid 21 erzielt, welches wiederum um fünf AS mit dem zweiten Submotiv der ersten RNA – Bindedomäne überlappt. Beide genannten Epitope des A2 – Proteins waren zudem in gleichen Anteilen das Ziel autoreaktiver SLE – Seren. Zusammenfassung 47 4 ZUSAMMENFASSUNG Mit dem Peptid P12 konnte ein geeigneter Marker für die Rheumatoide Arthritis vorgestellt werden. Es stammte ursprünglich aus der M9 – Region des hnRNP A3 und wurde sowohl in citrullinierter als auch in der ursprünglichen Form serologischen Untersuchungen unterzogen. Dabei konnte eine Sensitivität für die Rheumatoide Arthritis von etwa 30 % gemessen werden, während die Seren der Patientengruppen SLE und OA kein einziges Mal anschlugen. Daraus ergab sich eine vorläufige Spezifität für die RA von 100 %. Zudem zeigte keins der eingesetzten Seren Reaktivitäten gegen die nicht citrullinierte Variante des Peptids, wodurch die besondere Rolle der Citrullinierung bei der Autoimmunität von RA - Patienten hervorgehoben werden konnte. Die Untersuchungen am Peptid P32, dessen natürlicher Ursprung bislang nicht geklärt war, konnten die daran gestellten Erwartungen als spezifisches Markerpeptid für die Rheumatoide Arthritis nicht erfüllen. Einer Sensitivität von 33 % für die RA stehen solche von 17 % bzw. 8 % für SLE und OA gegenüber. Mit Hilfe von P32 – spezifischen Antikörpern, die affinitätschromatographisch aus P32 – positiven Seren isoliert worden waren, konnte ein Autoantigen auf einem HeLa S3 – Blot und Fluoreszenzmikroskopisch in der Kernmembran von HEp2 – Zellen detektiert werden. Zudem war es mit Hilfe derselben Antikörper gelungen, aus einem nativ gewonnen Proteinextrakt das entsprechende humane Autoantigen zu isolieren. Ob es sich um ein bereits bekanntes oder neu entdecktes Autoantigen handelt, soll eine Massenspektrometrische Analyse des Proteins zeigen. Allerdings konnte das Resultat aus zeitlichen Gründen in der vorliegenden Arbeit nicht mehr präsentiert werden. Durch das Epitopmapping konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in den Bindestelle für AK aus adulten RA – Seren und Kinder – RA – Seren existieren, zumindest beim A1 Protein der hnRNP’s. Sie überlappen mit verschiedenen Untereinheiten der Consensussequenzen der hnRNP’s. MS – und SLE – Seren binden dasselbe Epitop wie die Seren der jungen RA – Patienten. Beide RA – Gruppen binden dasselbe Epitop des A2, das zwischen dem ersten und zweiten Submotiv der ersten Bindedomäne für RNA sitzt, während AK aus SLE – und MS – Seren genau das zweite Submotiv binden. !"# $ % & ' ( )* $"#$ +&,)% &-! ). ("! & / 0 1 /&2 3 %- /' %-204 5$! ("* * 6-/& . $### ! "! ( 78101220(" )* " ! 122 0 % & ' ) .& * ("(* &-4 9-4 6: , ;&, 6 ( # $ *$ $"* && / )8 0&"6-4 3 6 0 9<& 3 ) 6- +9 ! %&'&(30= ,8 #"# # 2 %6 >& 4 /) $##$ ) ,8$ !" 64 %?3 < 3/ 92 >: 9 3 / 9 34&-4 % &, 0' $##$ * +,- 1& &,(# #!"( $ 9 0 /8 / : ' 6-/& . ! - ! -2&, = 4 &-28=%-&- ($"($ :&2 % & 0 $## 12&)9&,8# **!"*(* ? + 0/ 6 & 6? +& & 9& ) 6 4& / ! 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