Magnetanrcicherung, lasenscanning

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Zellkonzentration
fUmorzell-Analyse
mit kombinierter
Magnetanrcicherung,
lasenscanningZybmeüieunduisuellerKonüolle
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Solide Tumoren, wie Bronchial- und Kolonkarzinome und bei Frauen das Mammakarzinom, sind nach Herz-Kreislauferkrankungen die häufigste Todesursachein den Ländern der westlichen Welt. Initialtherar:ie
der Wahl ist die chirurgische Entfernung
des Primärtumors, um möglichst viele Tumorzellen aus dem Körper zu entfernen. In
der Praxis kann damit iedoch nur selten
eine Heilung erzielt weiden. Letztlich lebensbedrohlich sind hämatogene Absiedelungen in verschiedene Organe, die schließ-
MAINTRAC-Analyse
zum lrlachweis
minF
malerZahlenzirkulierender
Tumorzellen
außerhalb des Magneten gebundene
Zell6n eluieren
Eluat auf Adhäsionsobiektträ9er
Laser Scanning Cytometer mes3en
Fenster aiborpositive fl üoreszierendeEreignisss
vasuelleKontrolle
Abb. 1: Flußdiagramm zur Anreicherung und
Analyse zirkulierender Epithelantigen-positiver Zellen
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lich zum Versagen dieser Organe und zum
Tod führen. Ausgang für diese Metastasen
sind disseminierte Tumorzellery die aus dem
Tumor ausgeschwemmt worden sind.
Deswegenwurde- inersterLiniebeimMammakarzinom - die adjuvante Chemotherapie
etabliert. Ziel dieser Chemotherapie ist es,
bereitszirkulierende Tumorzellen zu eliminierery bevor sie sich als Metastasen absiedeln können. Jedoch gab es bislang kein Verfahrery um das Ansprechen der zirkulierenden Tumorzellen auf diese Therapie direkt
zu überprüfen.Nur eineverri ngertäRezidivrate, die beim Mammakarzinom erst nach
mehreren ]ahren objektivierbar ist, konnte
bisher als statistisches Maß für den Therar:ieerfolg herangezogenwerclen.Für die einlelne Patientin gibt es keine Möglichkeit zeitnahns kontrollieren, ob bei ihr die entsprechende Therapie erfolgreich eingesetzt wird.
Über die Zahl und die Eigenschaften zirkulierender Tumorzellen ist bisher sehr wenig
bekannt. Schonvor über 100jahren ging man
davon aus, daß solcheZellen vorhanden sein
müßtery durch ihre geringe Zahl entzogen
sie sich aber einem sicheren Nachweis.
Fortschritte wurden durch den Einsatz immunologischer Nachweisverfahren erzieltl.
So konnte in den letzten Jahren vor allem
gezeigt werdery daß eine Korrelation besteht
zwischen den im Knochenmark nachgewiesenen Zellen mit epithelialen Oberflächenmarkern und der Metastasierungsrate2.Diese Methoden sind aber sehr zeitaufwendig,
da große Zahlen normaler Blut- oder Knochenmarkszellen gescreentwerden müssery
um einzelne nicht dem Blutkompartiment
zugehörige Zel len au fzufinden. Ei n wei terer
Ansatz, zirkulierende Tumorzellen nachzuweisery ist die Anwendung der Durchflußzytophotometrie. Diese Methode erlaubt es,
in kürzester Zeit zehntausende von Zellen
durchzumessen. Die Sensitivität der Durchflußzytometrie liegt aber ohne zusätzliche
Sortierschritte im Bereich von einer Tumorzelle pro 1.000normalen Blutzellen.
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Abb. 2: SchematischeDarstellungder
magnetischenAnreicherung
Itranstri[tTABoRWELT
Durch den Einsatz von immunmagnetischen
Anreicherungsverfahren und Immunmikrofluorimetrie konnte die Nachweisempfindlichkeit für im Blut zirkulierende epitÄeliale
Zellen erhöht und dahingehend weiterentwickelt werdery daß ein qualitativer und
Tabelle
1:Vorteile
derMethode
Anreicherung
der gewünschten
Zellen
bis zur Nachweisbarkeil
Minimaler
Zellverlust
nur lebendeZellengehenin die
Analyseein
g automatisch
Auswertun
(beobachterunabhängig)
quantitativ(Zahlund Intensität
werdenbestimmt)
Relokalisation:
Visualisierung,
Reanalyse
quantitativer Nachweis tumorverdächtiger
Zellen möglich wird3.
Die tumorverdächtigen Zellen werden automatisch und vom Untersuchenden unabhängig erfaßt. Sie können einzeln wiederaufgesucht, visuell verifiziert und, falls erforderlich" mit weiteren Analyseverfahren bearbeitet werden.
Anreicherung der
tumorverdächtigen Zellen
Die Anreicherung der disseminierten Tumorzellen - bei soliden Tumoren meist Zellen epithelialen Ursprungs - erfolgte über
funktionalisierte Magnet-Partikel (Labsoft
Diagnostics AG Halle) mit Hilfe von Antikörpern, die gegen epitheliale Antigene (vor
allem gegen ein Epitop des EpCAM-Moleküls auf der Zelloberfläche) gerichtet sind.
Für die Untersuchung werden 20 ml antikoaguliertes Blut benötigt (Abb. 1), bei der Untersuchung des Knochenmarkes etwa 5 ml
AspiratinRinger-Lösungverdünnt. Alle Proben sollten spätestens 36 Stunden nach Entnahme analysiert werden. Die Erythrozyten
wurden lysiert und die weißen Blutzellen
einschließlich der Tumorzellen durch Zentrifugieren sedimentiert. Die Viabilität der Zellen zu diesem Zeifpunkt lag zwischen 95 und
700%.Die Zellsuspension wurde mit den entsprechenden Magnetpartikeln und einem
spezifischenfl uorochrommarkierten Antikörper inkubiert. Danach wurden die Zellery an
die sich die Magnetpartikel gebunden hattery
mit einem Magneten an die Wand des Röhrchens gezogen, so daß die übrige von epithelialen Zellen depletierte Zellsuspension entweder abgegossen oder abpipettiert werden
kann (Abb. 2). Um möglichst wenige spezifisch markierte Zellen zu verlierery wurde
der Anreicherungsschritt nur einmal durchgeführt. EinewiederholteAnreicherungwürde zwar zu einer höheren Reinheit, zugleich
aber auch zu Zellverlust fuhren.
Nachweis der
tumorverdächti gen Zellen
Der Nachweis der Zellen erfolgte über den
fluorochrommarkierten Antikörper an
Nr.lY/2OOt 23
FITC Fluor Md Pixel
Coet
Rgn. #
1
18340
2
99
Totäl
18340
Pct.
Mem
l0o.Oolo 116
?90
0.5%
116
Abb. 3: A. Veileilungder Zellen nach Anreicherungund Aufbringen,links: mit den x- und
y-Koordinaten auf einem Objektträger, rechts:
deren maximale Fluoreszenzintensitätin der
Grünfluoreszenz.Das blaue Fenster umfaßt
alle Zellen(Region1),das rote FensterZellen
mit intermediärerFluoreszenz,die nicht sichtbar ist, und das grüne Fensterdie eindeutig
positivenZellen(Region2).
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FITC Fluor M* Pixel
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Rgn. #
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2
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FI|C
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156
O.4o/o
115
Abb. 3 B. RelokalisierungeinzelnerZellen.Der
Scanningtischfährt nacheinanderdie einzelnen Ereignisseim gewähltenFensteran. Die
Positionjeder Zelle auf der x- und y-Achse
wird im linken Diagrammangezeigt,die Intensität jeder Zelle in der Punktwolkewird durch
einen Kreis angegeben.
nichtfixiertery lebenden Zellen. Dies vermindert unspezifische Bindungery wie sie beim
Nachweis intrazellulärer Antigene nicht selten sind, und stellt gleichzeitig sicher, daß
nur die relevantery lebenden Zellen in die
Analyse einbezogen werden. Die spezifisch
gesuchten Zellen sind nun zwar höher konzentriert, iedoch immer noch in nur in einem
Anteil von f bis 0,1% vorhanden. Bei diesen
niedrigen Zahlen ist es wichtig, daß jede einzelne Zelle verifiziert wird. Dies geschieht
durch automatisierte Auswertung im LaserScanning-Cytometer (LSC@)(CompuCyte,
Cambridge, Mass.).Die Vorteile diesesVor-
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Abb.4: Morphologie (links) und im Fluoreszenzbild (rechts) die kappenförmige
Oberflächenmarkierung der in der Abbildung
3 angefahrenen Zelle
24
Nr. lVl2001
gehens sind in Tabelle 1 aufgelistet. Ein Laserstrahl tastet das Präparat ab und erkennt
über Vorwärtsstreulicht die Zellen.Ürberjede
Zelle wird punktförmig über Areale von
0,5pm die Intensität gemessen und als Pixel
gespeichert (ca. 200 Messungen pro Zelle).
Beispielhaft sind die Ergebnisse einer solchen Auswertung in Abbildung 3a dargestellt. Jederweiße Punktim x-y-Koordinatensystem repräsentiert eine Zelle. Die Intensitätsverteilung ist in der rechten Punktwolke
dargestellt. Die Intensitätswerte können als
maximale Intensität oder als Integral der über
die Zelle gemessenen Intensität aufgelistet
werden. Dies ermöglicht eine vom lJntersucher unabhängige objektive Auswertung. Jede
Zelle mit einem bestimmten Intensitätswert
(beispielsweise die Zellen im grünen Fenster)
kann nun wiederaufgesucht werdery so daß
die Spezifität der Markierung und die Morphologie der Zelle beurteilt werden können.
In Abbildung 3b ist gezeigt, wie der Scanningtisch des LSC@bis zu der Stelle vorrückt,
an der die eingekreiste Zelle im Präparat
liegt. Die in Abbildung 3b eingekreiste Zelle
ist in Abbildung 4 rechts einmal in der Fluoreszenzfärbttng mit der typischen kappenförmigen Markierung abgebildet. Das Präparat kann anschließend mit einer panoptischen
Färbung nachgefärbt werden und dieselbe
Zelle wiederaufgesucht werden (Abb. 4links).
vor dem kompletten Absterben und Abräumen der tumorverdächtigen Zellen der
Erfolg der Ther apiein aiao frihzeitig festgestellt werden.
3. Die körpereigene Immunantwort auf die
Tumorzellen kann in zweierlei Hinsicht
analysiert werden. Einerseits kann über
die Immunglobulinbeladung der Tumorzellen die Effektivität und Stärke der BZellantwort getestet werden. Des weiteren
sind bei den Patienten nicht selten Tumorzellen mit rosettenförmig adhärierenden
T -Zellen zu flinden.Inwieweit dies prognostisch von Bedeufung is! muß in weiteren
Untersuchungen geklärt werden.
4. Für die Planung des therapeutischen Vorgehens ist der Nachweis der Her2/neut)berexpression in den Tumorzellen von
zunehmender Bedeutung. Diese wird bisher noch am ursprünglichen Tumorgewebe untersucht . Zielzellen der Therapie mit
dem Antikörper Herceptin werden aber
vor allem die zirkulierenden Tumorzellen
sein.Eskannbereitsroutinemäßig die Am-
Tab.2: Feanalyseder lokalisiertenzellen
von:
Untersuchung
Morphologie
Kernfärbung
undZellzyklusanalysen
Apoptose
Her2lneu-FISH
Klinischer Einsatz der Methode
Längsschnittanalysen der Zahlen zirkulierender Epithelantigen-positiver Zellen bei Brustkrebspatientinnen haben gezeigt, daß damit
unter adjuvanter Chemotherapie sehr gut
nachvollzogen werden kann, wie diese ZellenmiteinerReduktionumzumTeilmehrere
Dekaden auf die Chemotherapie ansprechen
(Abb. 5). Bei einem nachgewiesenen soliden
Tumor ist davon auszugehen, daß die Mehrzahl der zirkulierenden Epithelantigen-positiven Zellen vom Tumor herrühren. Damit
scheint sich dieses Vorgehen für eine zeitnaheKontrolle desTherapieansprechenszueig-
:
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'100000
10000
1000- '
0
2
4
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Zyklen
Anahl chemotheEpie
Die Anreicherung und Reanalyse tumorverdächtiger Zellen eröffnet neben der morphologischen Begutachtung weitere Möglichkeiten zur Charakterisierung dieser Zellery von
denen die bei den Autorenbereits etablierten
in Tabelle 2 aufgelistet sind:
1. So können nach Färbung der Kerne mit
einem fl uoreszierenden Kern iarb stoff (2.8.
Propidiurniodid)Zellzykhrcanalysenselektiv an den Epithelantigen-positiven Zellen
durchgeführt werden und damit das
Wachstumsverhalten dieser Zellen analysiert werden.
2. Durch die Chemotherapie kommt es zur
Induktion von Apoptosewegen in den Zellen. Es kann der Anteil der in Apoptose
befindlichen Zellen an den zirkulierenden
Zellenbestimmtwerden und damitbereits
Abb. 5: Reduktionder Zahl zirkulierendertumorverdächtiger Zellen bei sieben Patientinnen unter adjuvanter Ghemotherapiezum Teil
um mehr als zwei Dekaden.
plifikation des Her2/neu-Gens, das verantwortlich für die llberexpression ist, an
den angereicherten Epithelantigen-positiven Zellen durch FISH-Analyse (Fluoreszenz-in si t u -Hybridisierun g) nachgewie sen
werden. Ein Beispiel fi.ir eine solche Analyse ist in Abbildung 6 dargestellt. Links ist
mit Grünfilter die kappenförmige Grünfltoreszenz fur das Epithelantigen darge-
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Abb. 6: EineGruppevon Epithelantigen-positiven
Zellenmit sehr starker kappenförmigerFluoreszenzmarkierung.
DieselbeZellgruppenach
Hybridisierungmit einer rotfluoreszierenden
Sondefür das HerZneuGenzeigt pro Zellezwischen3 und über 20 Signaleals Zeicheneiner
Amplifikationdes Her2lneu-Gens.
stellt, dieselben Zellen zeigen
mit Rotfilter (rechts) zwischen
drei und mehr als zwanzig
FISH-Signafe für das Her2/
neu-Gen und damit eine Überexpression in fast allen diesen
Zellen.
Ausblick
Erst mit einer Anreicherung seltener Zellen in den Nachweisbereich hinein und einem anschließenden quantitativen Nachweisverfahren kann die biologische
Relevanzunterschiedlicher Mengen zirkulierender Tumorzellen
differenziert analysiert werden.
Die quantitative Analyse erlaubt
es, festzustellen, ob sich die Zahl
zirkulierender Tumorzellen unter dem Einsatz von Zytostatika
ändertund ermöglicht damit erstmals eine zeitnahe Erfolgskontrolle der Chemotherapie in der
adjuvanten Situatiory in der es
sonst keine andere Möglichkeit
gibt, das Therapieansprechen zu
kontrollieren. Im Rahmen der
neoadjuvanten Chemotherapie
kann überprüft werdery ob die
zirkulierenden Zellen im gleichen
Umfang wie der Primärtumor
ansprechen. Damit bietet sich
diese Methode als Werkzeug für
dle Ürberwachungbei adjuvanten und neoadiuvanten Chemotherapiestudien an. In Zukunlt
soll diese Analyse dem Patienten unnötige oder in-effektive
Chemotherapien ersparen helfen.
Zttsätzlich können die zirkulierenden Tumorzellen selektiv auf
ihr Wachstumsverhalten mit Hille v on Zellzyklus analy senuntersucht werdery ihre Absterberate
26 | Nr. \V/2OO1,
ist mit Apoptoseanalysen und
ihre llberexpression von Wachsfumsgenen mit Hilfe von Fluoreszenz-i n sifu-Hybridisierung
analysierbar. Dies erlaubt es,
Tumorzellsubpopulationen zu
analysieren, die unterschiedlich
auf die Cytostase ansprechen,
und damit frühzeitig eine klonale Selektion resistenter Zellen zu
erkennen und dieser therapeutisch gegenzusteuern.
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Danksagung
Für die kompetente technische
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Scanning
Cytometer
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LabMed2001:39:811-7
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Prof, Dr. med.KatharinaPachmann
Ab t eilung für experimentelle
Hämatologie und Onkologie
Klinik für lnnere Medizin II
Fr i edri ch-Schiller- Unioersität Jena
ErlangerAllee 101,07747lena
eMail: katharina.p
achmann@me
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