Band 16 Zivilschutz-Forschung Neue Folge (2MB, PDF
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ZivilschutzForschung Schriftenreihe der Schutzkommission beim Bundesminister des Innern Herausgegeben vom Bundesamt für Zivilschutz Neue Folge Band 16 Friedrich Edward Müller, Wolfgang König, Manfred Köller Einfluß von Lipidmediatoren auf die Pathophysiologie der Verbrennungskrankheit ISSN 0343-5164 Herausgeber: Bundesamt für Zivilschutz, Deutschherrenstraße 93-95, 53177 Bonn Schriftleitung und Redaktion: Carl Maier Die Arbeit gibt die Meinung der Autoren wieder. Sie stellt keine Äußerung des Herausgebers dar und ist auch nicht als solche auszulegen. © 1993 by Bundesamt für Zivilschutz, Bonn Gesamtherstellung: Max Schick GmbH, Druckerei und Verlag, München Inhalt Einleitung Aufgabenstellung Planung und Ablauf des Vorhabens Wissenschaftlicher und technischer Stand Zusammenarbeit mit anderen Stellen Voraussichtlicher Nutzen. Verwertbarkeit des Ergebnisses und der Erfahrung Ergebnisse Allgemeines Die Infektion der Brandwunden Septisches Syndrom und Sepsis Überschießende Cytokin-Synthese: Als Beispiel IL-6 Die Granulozytendysfunktion Die Suppression der spezifischen Immunantwort Streß-Proteine Mögliche therapeutische Ansätze aus der Sicht der erhobenen Daten 7 7 8 8 8 8 9 9 9 11 15 17 22 25 26 Kurzfassung 29 Literatur 31 Die Autoren 35 Einleitung Aufgabenstellung Die Aufgabenstellung war, Prädiktivmarker beim Brandverletztentrauma aufzustellen, die für den Verlauf der „Burn Wound Sepsis“ entscheidend sind. Um diese Aufgabe sachgerecht zu erfüllen, mußte eine strikte Koordination zwischen angewandter Forschung und klinischem Fallverlauf durchgeführt werden. In der Zusammenarbeit mit der Abteilung für Plastische Chirurgie und Brandverletzte*) war eine ideale Voraussetzung geschaffen, um hier ein Verbundprojekt aufzubauen, das Grundlagenerkenntnisse der Mikrobiologie, Infektiologie wie der Infektabwehr mit der klinischen Aufgabenstellung verknüpft. Im wesentlichen wurden folgende Arbeitsbereiche erschlossen: Es wurde dargelegt, daß der Nachweis der mikrobiellen Invasion am frühesten durch biooptische Methoden hergestellt werden konnte und daß der Nachweis der Kolonisierung für den weiteren Verlauf nur von relativem Wert ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es vor dem Auftreten der mikrobiellen Invasion zu einem Abknicken, d. h. zu einem Einfrieren der Phagozytenfunktion kommt. Dieser frühe Prädiktivmarker geht mit der Unfähigkeit des Granulozyten einher, sein eigenes Chemotaxin, nämlich das Leukotrien B4 zu bilden; und geht ferner mit einer massiven Reduktion des LTB4 Rezeptors einher. Weitere Arbeiten wurden zur Pathogenität der kolonisierenden wie auch der eindringenden Mikroorganismen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß das Pathogenitätspotential von Pseudomonas aeruginosa und Staphylokokkus aureus – Keimen, die aus bioptischem Material gewonnen wurden – sehr viel stärker ausgeprägt war als dasjenige, das von Wundabstrichen isoliert wurde. Die Paralyse der unspezifischen Effektorleistung betrifft nicht nur den Granulozyten, sondern auch Basophile und Mastzellen. Aus diesen Befunden wird klar, daß Mediatoren der Entzündung eine duale Funktion beinhalten, so daß ein Abknicken der Mediatorsekretion für die mikrobielle Invasion mitverantwortlich ist. Weiterführende Untersuchungen wurden an Parametern der spezifischen Infektabwehr durchgeführt. Signifikante Veränderungen wurden sowohl hinsichtlich der Typisierung wie auch der Funktion von B- und TLymphozyten erhoben. Ein weiterer Prädiktivmarker der mikrobiellen *) Früherer Leiter: Prof. Dr. Dr. F. E. Müller; jetziger Leiter: Prof. Dr. U. Steinau. Invasion und letztendlich der „Burn-Wound-Sepsis“ ist der irreversible Anstieg von IL-6 im Plasma. Diese Befunde zusammen haben neben den Beobachtungen zum klinischen Verlauf tiefreichende Erkenntnisse und Erfahrungen zur Pathophysiologie des „Burn-Wound-Traumas“ gegeben. Planung und Ablauf des Vorhabens Insgesamt konnten wir uns an den vorgegebenen Zeitabschnitte sehr gut orientieren. Die Zusammenarbeit mit der Klinik verlief hervorragend, so daß weiterführende Arbeiten sich aus den bisherigen Grundlagen ergeben sollten. Wissenschaftlicher und technischer Stand Unsere Untersuchungen basieren auf den modernen Erkenntnissen der Grundlagenforschung. Zellbiologische, mikrobiologische und molekularbiologische Erkenntnisse wie auch klinische Fragestellungen sind in idealer Weise verknüpft worden. Zusammenarbeit mit anderen Stellen Das Projekt war als Kooperationsprogramm mit der Abteilung für Plastische Chirurgie und Brandverletzte, Universitätsklinik „BERGMANNSHEIL“ geplant und wurde in hervorragender Weise koordiniert und realisiert. Weiterführende Arbeiten hinsichtlich der Etablierung von Grundlagenerkenntnissen konnten mit auswärtigen Institutionen verwirklicht werden; hier ist insbesondere die Einbindung molekularbiologischer Techniken und die Verfügbarkeit entsprechender molekularbiologischer Sonden zu nennen. Voraussichtlicher Nutzen. Verwertbarkeit des Ergebnisses und der Erfahrung Die Bearbeitung des Projektes hat in idealer Weise gezeigt, daß die Kombination von Grundlagenforschung und klinischer Forschung notwendig ist, um zu weiterführenden pathophysiologischen Erkenntnissen zu kommen. Durch die intensive Zusammenarbeit zweier Institutionen gelang diese ideale Lösung. Die o.a. Ergebnisse und Erkenntnisse sind sicherlich wegweisend für die moderne Forschung auf dem Gebiet des Verbrennungstraumas. Eine Vielzahl von internationalen Publikationen dokumentiert die internationale Wertigkeit der hier in Bochum durchgeführten Studien. Wir glauben aufgrund der hier erstellten Parameter auch dem klinisch tätigen Arzt bald frühzeitige Parameter an die Hand geben zu können, die für die praktische Umsetzung seiner täglichen Arbeit von herausragender Bedeutung sind. 8 Ergebnisse Allgemeines Die Wiederherstellung und Aufrechterhaltung der kardiovaskulären und respiratorischen Funktionen, spezielle Volumenersatztherapie, das frühzeitige Abtragen tief verbrannter Hautareale, neue Transplantationstechniken und die hochkalorische Ernährung haben die Überlebensrate schwerbrandverletzten Patienten in der frühen posttraumatischen Phase erheblich verbessert. In der späteren posttraumatischen Phase ist gerade diese Patientengruppe aber durch Infektion und Sepsis vital gefährdet. Das septische Syndrom mit fortschreitendem Multiorganversagen stellt heute das Hauptrisiko für den schwerbrandverletzten Patienten dar. Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß 6080 % aller spät auftretenden posttraumatischen Todesfälle auf Sepsis und damit verbundenem konsekutiven Multiorganversagen zurückgeführt werden können. Die Infektion der Brandwunden Das Spektrum der Keimbesiedlung von Verbrennungswunden hat sich in den letzten Jahrzehnten auch aufgrund des Selektionsdrucks durch die antibiotische Therapie deutlich verändert. Eine grundlegende Veränderung der mikrobiell-induzierten Morbiditäts- und Mortalitätsrate ist damit aber nicht einhergegangen. Oft entwickelt sich unter dem permanenten Selektionsdruck durch die jeweilige kliniktypische Antibiotikatherapie auf Intensiv-Stationen ein epidemisches Ansteigen von antibiotikaresistenten Stämmen. So berichteten wir für die Brandverletzten-Intensivstation der Bochumer Universitätsklinik „BERGMANNSHEIL“ über das präferentielle Auftreten von Staphylokokkus aureus und Pseudomonas aeruginosa in den Brandwunden (s. Abb. 1). Durch die systematische Auswertung von Antibiogrammen wurde auch der hohe Anteil von multiresistenten Stämmen mit Mehrfachresistenzen gegen bis zu 16 verschiedenen Antibiotika dokumentiert. Die Eintrittspforten der Mikroorganismen sind beim Brandverletzten primär die großflächigen offenen Wunden, aber natürlich auch die chirurgischen Maßnahmen und die invasive Patientenversorgung und -Überwachung. Die Anflutung bakterieller Pathogenitätsfaktoren von Endotoxinen z.B. führt zu signifikanten Reaktionen der körpereigenen Abwehr. Abb. 1: Epidemiologische Untersuchung zum Auftreten von Mikroorganismen auf Wundabstrichen bzw. in Wundbiopsien einer Verbrennungsstation (nach Winkler et al. 1987). Eigene Untersuchungen haben gezeigt, daß viele bakterielle Toxine in der Lage sind, die Bildung von Entzündungsmediatoren zu induzieren und zu modulieren. Wir konnten anhand klinischer Isolate von Verbrennungspatienten zeigen, daß unterschiedliche zellgebundene und lösliche Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen (z. B. hitzelabile und hitzestabile Hämolysine) die Generierung von Entzündungsmediatoren wie Histamin oder Leukotrienen in definierter Weise beeinflussen. Taxonomisch identische Stämme können diesbezüglich in ihrer Pathogenität deutlich variieren. So wiesen wir nach, daß die in vitro-Virulenz wundinfizierender Staphylokokken-Isolate von Schwerbrandverletzten sich in der Phase der Kolonisierung anders verhält als in der Phase der Invasion (Tab. 1). Im Vergleich zu den die Wundoberfläche besiedelnden Stämmen exprimieren invasive Staphylokokken vermehrt zellgebundene Pathogenitätsfaktoren (Toxine). Gleichzeitig ist jedoch ihre Freisetzung in löslicher Form vermindert. Invasive Stämme können offensichtlich durch Unterlaufen der lokalen Infektabwehr einen Selektionsvorteil entwickeln. Die Charakteristika der ausgedehnten thermischen Verletzung mit den großflächigen Wunden, die hohe Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit innerhalb der Intensivstation, das Auftreten von multiresistenten Bakterienstämmen, der Pathogenitätserwerb invasiver Mikroorganismen und auch die intensive Behandlung und Betreuung der Patienten durch das Klinikpersonal (Gefahr der Kreuzinfektion) sind Faktoren, die die mikrobielle Kolonisierung und Invasion fördern. Zusätzlich ist 10 Tabelle 1: Vergleich der Hämolyseaktivität und Induktion der Histaminfreisetzung von Staphylokokken aus unterschiedlichen Wundebenen. RPMC: Ratten-Peritoneal-Mastzellen. Histaminwerte in ng. die körpereigene Infektabwehr der Verbrennungspatienten durch eine trauma-induzierte Immunsuppression geschwächt. Mikrobielle Kolonisation und Immunsuppression sind typische Elemente der entstehenden sogenannten „Verbrennungskrankheit“, die sich gegenseitig bedingen und verstärken können. Unsere heutigen Vorstellungen über die pathogenetischen Zusammenhänge zwischen gestörter Infektabwehr und dem septischen Syndrom mit fortschreitendem Multiorganversagen konzentrieren sich auf ein „fehlgesteuertes“ Immunsystem. Dabei spielen die hochpotenten löslichen Effektor-Elemente der spezifischen und unspezifischen Infektabwehr wie z. B. TNF-α oder Interleukin 6 eine entscheidende Rolle. Septisches Syndrom und Sepsis Das Kriterium einer Brandwundensepsis ist die Invasion der Mikroorganismen in tiefere Gewebsschichten der Haut, das Eindringen in perivaskuläre Strukturen, die Penetration der Gefäßwände und die Ausbreitung im Systemkreislauf mit den entsprechenden Folgen bis hin zum progressiven Multiorganversagen. Der Nachweis von Keimen in der Blutkultur, trotz systemischer Ausbreitung, bleibt oft negativ, so daß die Bewertung der Blutkultur nur im positiven Fall diagnostische Aussagen erlaubt. Wie wir anhand umfangreicher Untersuchungen nachweisen konnten (Tab. 2, Abb. 2) sind histologische Untersuchung und die quantitative Keimzahlbestimmung von Biopsieproben verläßlichere Parameter einer mikrobiellen Invasion. Das septische Syndrom ist durch kli11 Tabelle 2: Log. Ergebnisse der quantitativen Keimzahlbestimmungen methodisch unterschiedlicher gewonnener Bakterien, (nach Winkler et nische Symptome gegeben: u.a. Fieber, Kreislaufversagen, Hypermetabolismus, Verwirrungszustände oder eine Leukozytose, an die sich prämortal oftmals eine Leukopenie anschließt. Die Synthese und Exkretion mikrobieller Toxine ist offensichtlich für die Kolonisierung, Invasion und Überwindung der körpereigenen Infektabwehr durch Mikroorganismen eine wesentliche Voraussetzung. 12 Keimzahlbestimmungen mittels Gaze-Auflage-Technik an 8 Lokalisationen einer Verbrennungswunde. Abb. 2: Vergleich zweier Methoden zur quantitativen Keimzahlbestimmung. 13 Andererseits aktivieren z.B. die Lipopolysaccharide (Endotoxine) gram-negativer Bakterien auch das Immunsystem. Kennzeichen dafür ist die Induktion von Cytokinen (u. a. IL-1, IL-6 oder TNF-α) oder Entzündungsmediatoren wie Leukotriene. Das Endotoxin gram-negativer Bakterien ist prinzipiell nicht alleiniger Induktor der klinischen Sepsis-Symptome, die ja ebenfalls bei der Sepsis, hervorgerufen durch gram-positive Bakterien (z. B. beta-hämolysierende Streptokokken oder Staphylokokken), auftreten. Offensichtlich spielen neben den bisher gut untersuchten Endotoxinen eine Vielzahl anderer bakterieller Toxine und Pathogenitätsfaktoren bei der Ausprägung des septischen Syndroms eine Rolle. Während die „Infektion“ ein mikrobiell zugeordnetes Charakteristikum ist, reflektiert das „septische Syndrom“ und die „Sepsis“ eher die Antwort der körpereigenen Infektabwehr auf das Trauma und die mikrobielle Kolonisierung. Typischerweise kann das septische Syndrom experimentell auch ohne mikrobielle Pathogenitätsfaktoren z. B. durch Injektion von IL-1 oder TNF-α induziert werden. Träger des septischen Syndroms sind damit Cytokine und Entzündungsmediatoren. Dennoch ist die physiologische Aufgabe dieser Mediatoren, das Immunsystem zu aktivieren und zu kontrollieren. Für die Ausprägung der pathophysiologischen Symptomatik spielt dann das Zusammentreffen vieler Faktoren eine Rolle (s. Tab.3), zu denen u.a. die Überproduktion von Cytokinen über einen längeren Zeitraum gehört. Tabelle 3: Faktoren die eine Cytokin-Wirkung bestimmen. 1. Cytokine können überschneidende Wirkprofile haben (z.B. IL-1 und TNF-α) 2. Cytokine können auf verschiedene Zellen wirken 3. Cytokine (z. B. TNF-α) induzieren Cytokine, d. h. eine Cytokinwirkung beruht evtl. nicht auf einem einzelnen Cytokin 4. Gleichzeitig anwesende Cytokine wirken synergistisch oder inhibitorisch 5. Cytokin-Rezeptoren auf den Zielzellen sind auf- oder abreguliert 6. Cytokine werden durch lösliche Cytokin-Rezeptoren neutralisiert (z.B.IL-2 oder TNF) 7. Cytokine interagieren mit anderen Mediatoren (z. B. Eicosanoiden oder Neuropeptiden) 14 Überschießende Cytokin-Synthese: Als Beispiel IL-6 Wir haben insbesondere die Induktion von IL-6 im Rahmen der Verbrennungskrankheit untersucht. Die pleiotropen Wirkungen des IL-6 erstrecken sich auf die Differenzierung von B-Zellen in antikörpersezernierende Plasmazellen. Die Steigerung von T-Zellfunktionen (Proliferation, Cytotoxizität) und die Stimulation der Hämatopoese in Synergismus mit IL-3. IL-6 ist ein wichtiger Induktor der AkutphasenproteinSynthese in der Leber und wirkt als endogenes Pyrogen. Es wird von einer Vielzahl von Zellen (z. B. Monozyten, Makrophagen, Endothelzellen Fibroblasten, Lymphozyten) gebildet. Klinische Untersuchungen zeigten eine Erhöhung der IL-6-Plasmakonzentrationen bei akuten bakteriellen Infektionen, in der Akutphase nach einem Verbrennungstrauma, bei Transplantationsabstoßungsreaktionen sowie bei entzündlichen Gelenkserkrankungen. Wir konnten zeigen, daß auf der Regulationsebene der Cytokine das Interleukin 6 dramatisch im Plasma der Brandverletzten ansteigt (Abb. 3). Insbesondere bei dem Vergleich von Patienten mit unterschiedlichem klinischem Verlauf wurde das sehr deutlich. Bei überlebenden Patienten fällt der Plasma-IL-6-Spiegel nach initialem Anstieg. Im Gegensatz dazu stand der massive Anstieg von IL-6 besonders in der Spätphase bei 15 verstorbenen Patienten, die zu diesen Zeitpunkten eine dokumentierte Sepsis durchliefen. Zusätzlich konnten wir auch die vermehrte in-vitro IL-6-Bildung von isolierten mononukleären Zellen Brandverletzter sowie den erhöhten Messenger-RNA-Gehalt dieser Zellen nachweisen (Abb. 4 und 5). Abb. 4: IL-6 Konzentrationen im Überstand von Monozyten/Lymphozyten-Fraktionen bzw. im Serum zweier Verbrennungspatienten. Oben: Überlebender; unten: Verstorbener. Balken: Zellüberstände (weiß, unstimuliert; grau stimuliert). Punkt-Linie: Serum Werte. 16 Abb. 5: Il-6-mRNA in Monozyten/Lymphozyten-Fraktionen eines Brandverletzten (RNAse-Verdauungs-Schutzanalyse). 1: Zellen eines gesunden Spenders. 2-4: Zellen des Patienten (zeitlich unterschiedliche Blutentnahmen). Selbstverständlich spielen neben dem IL-6 eine Vielzahl von anderen Cytokinen (IL-1, IL-8, TNF-α oder TGF-β) und Entzündungsmediatoren (Leukotriene, Phospholipid-Derivate, Prostaglandine, biogene Amine) eine Rolle. Für die posttraumatischen pathophysiologischen Auswirkungen müssen offensichtlich mehrere Faktoren aufeinander treffen. Dementsprechend muß man die trauma-induzierte Immunsuppression als Netto-Resultat einer der komplexen veränderten Signalgebung sehen, deren Auswirkungen sich dann auch an einzelnen ZeilPopulationen zeigen lassen. Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben zentrale Elemente dieser Immunsuppression bei der spezifischen (Lymphozyten-System) und unspezifischen Infektabwehr (Granulozyten-System) aufzeigen und biochemisch charakterisieren können. Die Granulozytendysfunktion Wir wiesen nach, daß der typische chemotaktische Funktionsverlust der Granulozyten multifaktoriell bedingt ist. So ist die Freisetzung chemotaktisch aktiver Faktoren nach Stimulation von Patientengranulozyten vermindert. Für das neben IL-8 potenteste körpereigene Chemotaxin Leukotrien B4 (LTB4) wurde eine reduzierte Bildung nachgewiesen (Abb. 6). Zudem ist die Metabolisierung des freigesetzten LTB4 zu inaktiven Produkten erhöht (Abb. 7). Zusätzlich ist auch die LTB4-Rezeptorexpression auf Patienten-Granulozyten vermindert (Abb. 8). Die auf diese Weise herabgesetzte Fähigkeit der Phagozyten, ein chemotaktisches Potential aufzubauen, geht einer invasiven bakteriellen Infektion voraus oder stellt eine begleitende Funktionsstörung dar (Tab. 4). Selbstverständlich wird die komplexe Symptomatik der Verbrennungskrankheit auch durch die Vielfalt anderer biologisch aktiver Mediatoren geprägt. Außer dem Leukotrien B4 sind auch die spasmogenen und vasoaktiven Cysteinyl-Leukotriene (LTC4, LTD4, LTE4) von Bedeu17 Abb. 6: Leukotrien B4-Freisetzung aus Granulozyten brandverletzter Patienten. A, B, E: Überlebende. C, D: Verstorbene. Punkt-Strich-Linie: Normalwert. tung. Die enzymatische Inaktivierung der Cysteinyl-Leukotriene im Plasma ist in der Frühphase nach Verbrennung vermindert. Der Thrombozyten-aktivierende Faktor (PAF), zu dessen biologischen Wirkqualitäten u. a. die eosinophile Chemotaxis, die Bronchokonstriktion, die Induktion einer bronchialen Hyperreagibilität sowie die Modulation lymphozytärer Funktionen zählen, wird von neutrophilen Granulozy18 19 LTB4-Rezeptorexpression Abb. 8: Vergleich von Chemotaxin-Rezeptorexpressionen auf Granulozyten von Normalspendern und Brandverletzten. Die Bindung des radioaktiv markierten LTB4 ist als Zählrate im β-Counter angegeben. ten schwerverbrannter Patienten in vermindertem Maße synthetisiert und metabolisiert (Abb. 9). Somit werden Lipidmediatoren wie LTB4 oder PAF im Rahmen des Verbrennungstraumas unterschiedlich metabolisiert. Die verminderte zelluläre Reaktivität ließ sich auch an basophilen Granulozyten schwerverbrannter Patienten zeigen. So führten Zellstimulationen mit anti-IgE oder dem Ca-Ionophor A23187 zu einer verminderten Freisetzung von Histamin bei unverändertem Histamingehalt der Zellen (Abb. 10). Diese Daten belegen, daß auch das Fehlen von Mediatoren, wie z. B. von Lipidmediatoren oder von biogene Aminen, den geordneten Ablauf der Infektabwehr beeinträchtigen kann. Neuen Untersuchungen ist zu entnehmen, daß bestimmte Cytokine wie IL-6 oder TNF-α im Verlauf der posttraumatischen Phase im peripheren Blut ansteigen. 20 Metabolisierung von lyso-PAF nach Stimulation mit Ca-Ionophor 21 Die Suppression der spezifischen Immunantwort Die Zellen des Phagozytose-Systems und die Zellen der spezifischen Immunantwort (Antigenerkennung, Antikörper-Bildung, cytotoxische Funktionen) stehen über Entzündungsmediatoren wie PGE2, LTB4 oder PAF bzw. über Cytokine wie IL-1, IL-6, TNF- oder IL-8 in Verbindung und beeinflussen sich so gegenseitig. Wir haben das nach Verbrennungs-Trauma veränderte spezifische Immunsystem u. a. anhand von Lymphozytenfunktionen analysiert. Dabei ergab sich, daß beim Brandverletzten keine Verschiebung im Verhältnis zirkulierender T-, B- und Null-Zellen gegenüber Normalspendern zu finden ist. Demgegenüber ist allerdings eine Abnahme von HeIfer/Inducer-T-Zellen (also CD4-Zellen) gegenüber den Suppressor/ Cytotoxischen T-Zellen (also CD8-Zellen) typisch. Diese Verschiebung des CD4/CD8-Verhältnisses dokumentiert zwar den immun-supprimierten Status des Brandverletzten, gibt uns aber keine Informationen zu funktionellen Zelleistungen. Daher untersuchten wir die Proliferationsleistung von T- und B-Lymphozyten nach Stimulation mit PHA, einem T-zellspezifischen Mitogen, oder SAC, einem polyklonalen B-Zellaktivator. Bei schwerverbrannten Patienten kommt es zwischen der zweiten und fünften Woche nach Trauma zu einer ausgeprägten T-Zellsuppression, während die B-Zellproliferation in geringerem Maße betroffen ist. Die polyklonale Immunglobulinsynthese Schwerverbrannter nach Stimulation mit PWM (Pokeweed Mitogen) oder SAC (Staphylokokkus aureus Cowan I) ist ebenfalls zwischen der zweiten und fünften Woche nach Trauma supprimiert (Abb. 11). Antikörper der Frühphase einer humoralen Immunantwort – IgM – wie auch der Spätphase – IgG – sind dabei in gleicherweise betroffen. Die Befunde zur Lymphozytenproliferation und zur Antikörpersynthese deuten darauf hin, daß bei Schwerbrandverletzten die Aktivierung von T- und B-Zellen gestört ist. Deshalb untersuchten wir die Expression und Regulation der Lymphozytenaktivierungsmarker CD25 und CD23. CD25 ist vornehmlich ein Marker für aktivierte T-Zellen und Bestandteil des Rezeptors für Interleukin 2. CD23 ist ein B-Zellaktivierungsmarker und fungiert u. a. als Rezeptor für B-Zellwachstumsfaktoren. Bei Schwerbrandverletzten kommt es in der zweiten bis fünften Woche nach Trauma zu einer Verringerung der Interleukin-4-stimulierten CD23-Expression. Gleichzeitig ist die spontane und Interleukin-2-stimulierte CD25-Expression deutlich gesteigert (Abb. 12). 22 Abb. 11: IgM-Synthese von B-Zellen unterschiedlicher Verbrennungspatienten. Oben: Überlebender. Unten: Verstorbener. Die Zellen wurden mit Staphylokokken (S. aureus Stamm Cowan I, SAC) bzw. mit einem Mitogen (pokeweed mitogen, PWM) kultiviert. Werte von Normalspender-Zellen: rechter Abbildungsrand. 23 Abb. 12: B-Zell-Proliferation nach Stimulation von Monozyten/Lymphozyten von Verbrennungspatienten. Oben: Stimulation der Zellen mit Staphylokokken (S. aureus Stamm Cowan I, SAC). Unten: Stimulation der Zellen mit einem Mitogen (pokeweed mitogen, PWM). Diese Befunde sprechen für eine intrinsische B-Zell-Funktionsstörung und ebenfalls für eine gestörte Regulation über das T-Zell-System. Wir wissen inzwischen, daß es sich bei vermehrt exprimierten CD25-Komponenten um nicht-funktionelle IL-2-Rezeptoren handelt. Hier liegen offensichtlich Entkopplungen im Signaltransduktionssystem vor. 24 Nicht nur die verminderte Bildung von regulatorischen Faktoren im Immunsystem kann zur Fehlregulation beitragen, sondern auch vermehrt gebildete Komponenten. Streß-Proteine Es ist offensichtlich, daß der schwerverletzte Patient einer Vielzahl psychischer und biochemischer Streßfaktoren ausgesetzt ist. Eine intrazelluläre Streßantwort ist u. a. die Bildung sogenannter Streßproteine (heat-shock proteins, hsp). Streßproteine werden z. B. durch Hypoxie oder Infektionen induziert. Experimentell kann man die Bildung von Streßproteinen durch die hypertherme Behandlung der Zellen hervorrufen. Die genaue physiologische Rolle von Streßproteinen ist noch nicht vollständig geklärt. Durch ihreBeteiligung an essentiellen intrazellulären Prozessen wie z.B. Proteintransport oder Proteinfaltung haben sie offensichtlich protektive Funktionen. So sind bestimmte Streß-Proteine in der Lage, bereits denaturierte Enzyme wieder zu reaktivieren. Unsere Untersuchungen haben ergeben, daß sowohl bakterielle Toxine als auch Cytokine (IL-6, TNFa) und Lipidmediatoren (12-HETE) in der Lage sind, in peripheren Leukozyten Streßproteine zu induzieren (Abb. 13). Diese Befunde lassen einen Zusammenhang Abb. 13: Westen-Blot-Analyse von Heat-Shock-Protein (hsp72) in Leukozyten eines Normalspenders nach unterschiedlicher Behandlung. X: Molekulargewichts-Marker, y: Coomassie-Blau-Färbung. 25 zwischen der intrazellulären Streßreaktion und der veränderten zellulären Reaktivität vermuten. Möglicherweise reflektiert die Induktion von Streßproteinen einen intrazellulären Schutzmechanismus gegen bakterielle Toxine oder einer überschießenden Cytokinexposition. Wie aus Abb. 14 ersichtlich, konnten wir die Induktion von Streßproteinen (hsp72) in den peripheren Leukozyten eines Patienten mit manifester Sepsis nachweisen. Abb. 14: 1, 2: Granulozyten von Normalspendern. 3-7: Granulozyten eines Verbrennungspatienten (zeitlich unterschiedliche Blutentnahmen). Mögliche therapeutische Ansätze aus der Sicht der erhobenen Daten Die Pathophysiologie des septischen Syndroms wird von mindestens drei Parametern mitbestimmt: Der Virulenz der Mikroorganismen, der Bildung mikrobieller Toxine sowie der Bildung von Cytokinen und Entzündungsmediatoren. Damit ergeben sich auf unterschiedlichen Ebenen therapeutische Ansatzpunkte (Tab. 5). Die Elimination der Mikroorganismen gelingt trotz moderner topischer und systemischer Antibiotikatherapie nicht vollständig. Die immunologische Neutralisierung bakterieller Toxine erfordert spezifische Antikörper. Vielversprechend scheint die Entwicklung humaner monoklonaler Antikörper gegen 26 Tabelle 5: Mögliche therapeutische Ansätze Zukünftige Therapiekonzepte Toxin-Neutralisierung mittels monoklonaler Antikörper (z.B. antiEndotoxin-Antikörper) Cytokin-Neutralisierung mittels monoklonaler Antikörper (z.B. antiIL-6 oder anti-TNF-a) oder lösliche Cytokin-Rezeptoren Cytokin-Rezeptor-Blockade mittels monoklonaler Antikörper oder Rezeptor-Antagonisten (z. Β. IL-lra) Cytokin-Kombinations-Therapie bzw. Cytokin-Peptid-Therapie zur Induktion erwünschter Cytokineffekte (z. B. Immunstimulation) Reaktivierung „paralysierter“ Zellfunktionen durch hämatopoetische Wachstumsfaktoren (z. B. G-CSF, GM-CSF), Interleukinen (z. B. IL-8) oder stabilen Eicosanoiden (z. B. LTB4-Agonisten) Endotoxin oder gegen die Adhäsionsstrukturen von Pseudomonas aeruginosa zu sein. Die rechtzeitig angewandte Antikörper-Therapie bietet in der Frühphase der Entwicklung und Verselbständigung des septischen Syndroms die Möglichkeit einer frühen Maßnahme. Wesentlich komplexer stellt sich die therapeutische Regulation der cytokin- und mediator-induzierten Symptomatik dar. Hier ist es z.B. das Ziel, selektiv überschießende Cytokin-Produktionen zu drosseln und gleichzeitig physiologische Cytokinspiegel zu erhalten, die eine geordnete Infektabwehr erst ermöglichen. Damit ist die pharmakologische Gesamt-Blockade einer Mediator-Synthese z.B. über Glucocoticoide oder Cyclosporin wenig sinnvoll, da eine bestehende Immunsuppression weiter verstärkt wird. Eher bieten sich Faktoren an, mit denen das Immunsystem selbst die Cytokin-Wirkungen steuert wie z. B. die natürlich vorkommenden Inhibitoren von IL-1, nämlich der IL-1-RezeptorAntagonist (IL-lra) oder von TNF-α, nämlich das TNF-Bindeprotein (TNF-INH). IL-lra ist dem IL-1 strukturverwandt, bindet an den IL-1Rezeptor, führt aber nicht zum Auslösen einer biologischen Antwort. TNF-Inh ist ein lösliches Fragment des TNF-Rezeptors, bindet TNF-α und blockiert damit die Bindung von TNF-α an seinen Rezeptor. Mögliche zukünftige Therapiestrategien sind in Tab. 5 zusammengefaßt. Solche Therapiekonzepte lassen sich nur in der engen Zusammenarbeit zwischen Klinik und Grundlagenforschung verwirklichen. 27 Kurzfassung Ziel der Untersuchungen war es, die immunpathophysiologischen Zusammenhänge zwischen supprimierter Infektabwehr und mikrobieller Kolonisierung bzw. Invasion beim ausgedehnten Verbrennungstrauma zu untersuchen. Dabei konnte der Beginn einer bakteriellen Invasion mit distikten Störungen wesentlicher Elemente der spezifischen und unspezifischen Infektabwehr korreliert werden (u.a. Granulozytenfunktionen, Mediatorfreisetzung, Lymphozytenproliferation, Antikörpersynthese). Diese Ergebnisse haben dazu beigetragen, die biochemischen Mechanismen der posttraumatischen Immunsuppression aufzuhellen und bilden die Grundlage für zukünftige therapeutische Konzepte. 29 Literatur Bergmann, U., Scheffer J., Koller M., Schönfeld W., Erbs G., Müller F.E., König W.: (1989) Induction of inflammatory mediators (histamine and leukotrienes) from rat peritoneal mast cells and human granulocytes by Pseudomonas aeruginosa strains from burn patients. Infect Immun 57: 2187-2195 Bermann U., Gross-Weege W., Koller M., Schlüter B., Erbs G., Müller E E., König W.: (1990) Basophil histamine releasability in burned patients. J. Trauma 30: 1372-1379 Brom J., König W., Koller M., Gross-Weege W., Erbs G., Müller F. E.: (1987) Metabolism of leukotriene B4 by polymorphonuclear granulocytes of severely burned patients. Prostaglandins Leukotrienes Med. 27: 209-225 Brom J., Koller M., Schönfeld W., KnöUer J., Erbs G., Müller F. 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Leiter der Abteilung Infektabwehrmechanismen des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Ruhr-Universität 44780 Bochum Manfred Köller Dr. rer. nat. Projektleiter in der Abteilung Infektabwehrmechanismen des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Ruhr-Universität 44780 Bochum 35
