5 DIAGNOSE
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Seite 2 Diagnose, B. Schweiger 5 DIAGNOSE 5.1 Einleitung 5.2 Probengewinnung 5.3 5.3.1 5.3.1.1 5.3.1.2 5.3.1.3 Generelle Nachweisverfahren für Influenzaviren Nachweis des viralen Genoms (PCR) Konventionelle (klassische) PCR Real-time-PCR Real-time-PCR zum Nachweis der neuen Influenza A/H1N1 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 Antigennachweis Immunfluoreszenz Enzymimmunoassays Schnellteste 5.5 Virusanzucht 5.6 Antikörpernachweis 5.7 5.7.1 5.7.2 5.7.3 Diagnostik resistenter Influenzaviren Phänotypische und genotypische Resistenzanalyse Resistenzen bei neuen Influenza A/H1N1v-Viren gegenüber antiviralen Substanzen Charakterisierung von Influenzaviren 5.8 Literatur Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger 5.1 Einleitung Bei Personen mit klinischem Verdacht auf eine Infektion durch Influenza A/H1N1i insbesondere bei schwerer Erkrankung, Schwangeren, Säuglingen bis 6 Monate, Personen ab dem 65. Lebensjahr und chronisch Kranken sollte eine labordiagnostische Sicherung erfolgen. Goldstandard für die Diagnose ist der Nachweis von viraler RNA durch die PCR-Analyse (Polymerasekettenreaktion). Schnelltests, für die ohnehin keine Anwendungsempfehlung zur Fallklärung einer neuen Influenza A/H1N1 besteht, sind dafür nicht ausreichend. Labordiagnostische Nachweisverfahren sind insbesondere dann erforderlich, wenn hieraus therapeutische Schlussfolgerungen für die Betroffenen oder Schutzmaßnahmen für die öffentliche Gesundheit (z. B. häusliche Quarantäne von Kontaktpersonen) abgeleitet werden können. Die Probenentnahme erfolgt nach Absprache mit dem zuständigen Gesundheitsamt und möglichst früh nach Symptomenbeginn mit einem Tupfer, der für die Virusdiagnostik geeignet ist (Watte oder Bürstchen, befeuchtet). Grundsätzlich ungeeignet sind die Tupfer für bakteriologische Untersuchungen. Der Versand der respiratorischen Proben erfolgt in einem flüssigkeitsdichten Probengefäß (Schraubröhrchen mit Tupfer + NaCl-Lösung oder Transportpuffer = Primärverpackung), welches von einem mit saugfähigem Material gefüllten, flüssigkeitsdichten Schutzgefäß umgeben ist (verschraubtes Umröhrchen = Sekundärverpackung). Die Außenverpackung besteht aus einer bauartgeprüften, kistenförmigen Verpackung, die mit "Biologischer Stoff, Kategorie B" und "Biological Substance, Category B" sowie einer Raute mit der Inschrift "UN3373" und Name und Telefonnummer einer verantwortlichen Person gekennzeichnet ist. Das Probenmaterial wird an ein Vertragslabor versendet, das eine PCR-Diagnostik für das neue Influenza A(H1N1)v-Virus anbietet. Bis zur Untersuchung sollte die Lagerung der Probe bei 4°C erfolgen. Auskünfte über entsprechende Labore geben die örtlichen Gesundheitsämter. Unklare Befunde oder Viren zur weiteren Charakterisierung werden vom durchführenden Labor an das Nationale Referenzzentrum für Influenza weitergeleitet. 5.2 Probengewinnung Für den direkten Nachweis einer Influenzavirusinfektion werden klinische Materialien des oberen Respirationstraktes wie Nasenabstrich, Nasenspülwasser, Rachenabstrich, Rachenspülwasser oder Absaugsekrete aus dem Nasen/Rachenraum eingesetzt. Besteht der Verdacht auf eine Ausbreitung der Infektion auf den unteren Atemwegstrakt, kann eine Bronchiallavage vorgenommen werden. Werden Proben aus dem Nasen- und Rachenraum entnommen, so können diese im Labor vereinigt werden, um sowohl die Sensitivität als auch die Effizienz zu erhöhen. Bei der Probenentnahme sollte bedacht werden, dass die Virusreplikation etwa am dritten Tag nach Infektion ihren Höhepunkt erreicht hat. Die Wahrscheinlichkeit eines positiven Nachweises ist daher am höchsten. Für die Labordiagnostik bei Todesfällen sind Gewebeproben von Luftröhre, Lunge und Herz von Bedeutung. Sie sollten keinesfalls in Formalin aufbewahrt werden, da Nachweisverfahren wie die PCR gehemmt werden und eine Virusanzucht ausschließen. Die Untersuchung von Blut könnte Auskunft über eine Virämie geben, wie sie bei Infektionen mit dem hochpathogenen H5N1-Virus auftritt. Um Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 3 Seite 4 Diagnose, B. Schweiger auch die Möglichkeit einer Virusanzucht bieten zu können, sollten die Proben entweder bis zum Versand an das Labor bei 4°C oder bei einer längeren Lagerung bei –70°C aufbewahrt werden. Eine kurzfristige Lagerung kann auch bei –20°C erfolgen. 5.3 Generelle Nachweisverfahren für Influenzaviren Die Anzucht der Influenzaviren stellt das älteste Verfahren für den Nachweis einer Influenzavirusinfektion dar. Später wurden schnellere Methoden wie die Immunfluoreszenz (IF) und Enzymimmunoassays (EIA) entwickelt. In den vergangenen Jahren hat die Polymerasekettenreaktion (PCR) auch in nicht spezialisierten Laboren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Probenqualität, Zeitpunkt der Probenentnahme und Transportbedingungen sind weniger kritisch als für die Virusanzucht oder den Antigennachweis, da lebensfähige Viren und intakte Zellen keine Voraussetzung für die PCR darstellen. Serologische Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen humane Influenzaviren stehen schon seit vielen Jahren zur Verfügung, haben aber zum Nachweis einer akuten Infektion an Bedeutung verloren. 5.3.1 Nachweis des viralen Genoms (PCR) Die PCR ist eine sehr sensitive und spezifische Methode. Bei Influenzaviren trägt die virale RNA (Ribonukleinsäure) die Erbinformation. Daher werden hier definierte Bereiche der RNA ausgewählt, um einen spezifischen Nachweis der Influenzaviren zu ermöglichen. Dazu muss in einem ersten Schritt die RNA in eine komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden. Mithilfe spezifischer Startermoleküle (Primer) werden dann die gewünschten Genomsequenzen vervielfältigt. Der DNA-Einzelstrang wird verdoppelt, dieser Doppelstrang anschließend wieder getrennt, und in einem weiteren Schritt werden beide Stränge erneut verdoppelt. So können nach 20 Schritten (PCR-Zyklen) theoretisch etwa 1 Million Kopien vorliegen. Diese PCR-Produkte werden mit verschiedenen Techniken nachgewiesen. 5.3.1.1 Konventionelle (klassische) PCR Frühere Assays beschränkten sich auf den Einsatz von Primern und die Analyse des PCR-Produktes im Agarosegel [46]. Eine höhere Spezifität der PCR kann jedoch durch den Einsatz spezifischer Sonden mittels Hybridisierungsblot oder PCR-EIA erzielt werden. Die Sonden bestehen aus 20–30 Basen und binden an eine ausgewählte Sequenz zwischen beiden Primern. Der Nachweis der viralen RNA erfolgt über diese Sonde, die dazu entsprechend markiert werden muss [36]. Eine höhere Spezifität und Sensitivität des Nachweises kann auch durch eine "nested-PCR" erfolgen. Ein Aliquot des ersten PCR-Produktes wird in einer zweiten PCR mit einem Primerpaar, das innerhalb des ersten PCR-Produktes bindet, vervielfältigt [47]. 5.3.1.2 Real-time-PCR Der Einsatz der PCR und der sich anschließenden Methoden zur Produktanalyse in diagnostischen Laboratorien erfordert, dass diese Techniken einfach, schnell und reproduzierbar durchzuführen sind. Diesen Ansprüchen werden neuere fluoreszenzbasierte "Real-time-Verfahren" gerecht. Dazu zählt die PCR (TaqManPCR), die die 5'-3'-Nukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase ausnutzt. Zusätzlich zu den Primern befindet sich eine mit unterschiedlichen Reporter- und QuencherBesonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger Farbstoffen markierte Sonde im PCR-Ansatz. Diese Sonde enthält ganz spezifische Genomsequenzen, die zwischen den beiden Primern an die cDNA binden. Während der Amplifikation wird die Sonde abgebaut, sodass sich Reporter und Quencher nicht mehr in räumlicher Nähe befinden. Dadurch beginnt der Reporterfarbstoff zu fluoreszieren. Diese Daten werden durch das PCR-Gerät ermittelt. Das spezifische PCR-Produkt kann mithilfe der fluoreszenzmarkierten Sonde bereits während der PCR durch Online-Messung detektiert werden, sodass eine anschließende Produktanalyse entfällt. Spezifische Primer/Sonden-Sets ermöglichen einen schnellen und sensitiven Nachweis von Influenzaviren im Patientenmaterial. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Vermeidung von Kontaminationen, da jeglicher Umgang mit PCR-Produkten entfällt. Verwendet werden je nach Fragestellung Primer/Sonden, die an konservierte Genombereiche interner Gene wie das Matrixprotein(M)-Gen binden und so den generellen Nachweis von Influenza-A-Viren ermöglichen. Influenza-A- und -B-Viren sind jedoch aufgrund ihrer Divergenz nicht mit einer universellen PCR zu erfassen. Daher müssen sowohl Typ-A- als auch Typ-B-spezifische Primer und Sonden eingesetzt werden. Um eine Differenzierung der Influenza-A-Viren in die verschiedenen Subtypen vornehmen zu können, werden PCR-Assays für spezifische Sequenzabschnitte auf den HA- und NA-Genen herangezogen [37]. 5.3.1.3 Real-time-PCR zum Nachweis der neuen Influenza A/H1N1 Während der ersten Wochen der Ausbrüche der neuen Influenza wurde von vielen Laboren ein ganzes Set von Testverfahren eingesetzt. Dazu zählten direkte Antigennachweise wie Immunfluoreszenz und Schnellteste, die Virusanzucht, die PCR zum generellen Nachweis von Influenza-A-Viren, PCRs zum spezifischen Nachweis der saisonalen A/H1N1- und A/H3N2-Viren, eine Influenza-B-PCR sowie die Sequenzanalyse [19]. Die PCR ist bisher die einzige breit einsetzbare Methode, die einen spezifischen Nachweis der pandemischen A/H1N1-Viren ermöglicht. Die ersten Sequenzen dieser Viren, die im April 2009 in Mexiko und den USA identifiziert wurden, waren am 25./26. April über internationale Datenbanken verfügbar. Diese zeitnahe Publikation der Sequenzdaten war die Voraussetzung, um eine spezifische Diagnostik für die pandemischen A/H1N1-Viren aufzubauen. Ausgewählt wurde dazu das Hämagglutinin- (HA-)Gen, das für eines der beiden Oberflächenproteine, das HA, kodiert. Die vom Nationalen Referenzzentrum (NRZ) für Influenza entwickelte PCR wurde Ende April auf den Internetseiten des Robert Koch-Instituts publiziert, um einen schnellen Methodentransfer zu ermöglichen. Diese PCR erlaubt eine eindeutige Abgrenzung von saisonalen Influenza A/H1N1- und porcinen A/H1N1-Viren und zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität aus, was an vielen hundert Patientenproben bestätigt wurde [35]. Komplettiert wurde die Methodik durch die Entwicklung einer weiteren PCR, die spezifisch das Neuraminidase- (NA-)Gen der pandemischen A/H1N1-Viren nachweisen kann. Real-time-PCRs zum spezifischen Nachweis der pandemischen A/H1N1-Viren wurden auch auf den WHO-Internetseiten publiziert [45] und von einer Reihe weiterer Arbeitsgruppen entwickelt [5, 30, 32, 43]. Da jedoch seit dem Auftreten der pandemischen A/H1N1-Viren auch saisonale Influenzaviren zirkulieren, ist es wichtig, ein breites Methodenspektrum einzusetzen, um auch diese zu erfassen. Das NRZ Influenza hat parallel eine PCR zum universellen Nachweis von Influenza-A-Viren und eine weitere PCR zum Nachweis von Influenza-B-Viren eingesetzt. Ist die Influenza-A-PCR positiv, aber der spezifische Nachweis für pandemische A/H1N1-Viren negativ, wurde eine weitere Subtypisierung angeschlossen. Dies betraf den spezifischen Nachweis für die HA-Gene der humanen Subtypen H1 und H3 sowie die NA-Gene der humanen Subtypen N1 und N2. Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 5 Seite 6 Diagnose, B. Schweiger Ein positives Ergebnis und somit der Nachweis von Influenzavirus-RNA in der Patientenprobe wird in der Real-time-PCR durch eine ansteigende Fluoreszenzintensität angezeigt. Der Schwellenwert (CT-Wert) für den Anstieg der Intensität korreliert mit der Viruskonzentration und variiert somit von Patient zu Patient. Typische Real-time-Ergebnisse für den Nachweis von pandemischen A/H1N1-Viren und den seit vielen Jahren zirkulierenden saisonalen A/H1N1-Viren sind in Abbildung 1 dargestellt. Niedrige CT-Werte um 20 sind eher selten. In der Regel liegen die CT-Werte für einen positiven Nachweis zwischen 25 und 35. Eine Analyse von über 1000 PCR-Daten zeigt, dass die CT-Werte für den Nachweis der pandemischen A/H1N1- und der saisonalen A/H1N1-Viren vergleichbar sind. Die Real-time-PCR ermöglicht auch eine quantitative Analyse der Viruslast in der Patientenprobe. Grundlage dafür sind in der PCR mitgeführte definierte Standards und die Ermittlung deren CT-Werte. Eine Gegenüberstellung von CT-Werten im Patientenmaterial zeigt Tabelle 1. CT-Wert A/H1N1Variante <20 (%) 20-24 (%) 25-30 (%) >30 (%) Saisonale A/H1N1-Viren 1,8 4,5 40,4 53,3 Pandemische A/H1N1-Viren 2,3 5,1 37,2 55,4 Tabelle 1 CT-Werte in der Real-time PCR als Indikator für die Viruslast in der Probe: Vergleich von saisonalen A/H1N1- und pandemischen A/H1N1-Viren. Für diese Zusammenstellung wurden 600 saisonale A/H1N1- positive und 550 für pandemische A/H1N1-positive Patientenproben analysiert. Angegeben ist die Prozentzahl der Proben, für die CT-Werte in den aufgeführten Bereichen ermittelt wurden. Der CT-Wert entspricht dem PCR-Zyklus, der eine ansteigende Fluoreszenz und somit eine positive Probe anzeigt. Die Viruslast (Genomkopien) in den Patientenproben variierte zwischen 2x10 8 Kopien/ml und 400 Kopien/ml. Viruslast in der Probe und CT-Wert stehen in engem Zusammenhang. 5.4 Antigennachweis Antigennachweise können innerhalb weniger Stunden ein Ergebnis liefern. Sie sind daher schneller als die Virusanzucht und aufgrund von Standardmethodik in jedem Labor durchzuführen. Für den Nachweis einer saisonalen Influenza stehen kommerzielle Teste als Immunfluoreszenz- (IFT-) und ELISA-Teste zur Verfügung. Diese Verfahren geben recht gute Resultate, wenn ausreichend Virusantigene in der Patientenprobe vorhanden sind. Die Spezifität dieser Teste ist meist sehr gut, aber die Sensitivität ist geringer als die der PCR. Dies gilt auch für Schnellteste, die auf der Basis eines Enzymimmunoassays fungieren. 5.4.1 Immunfluoreszenz Die indirekte Immunfluoreszenz (IFT) ist eine einfache und schnelle Technik zum Nachweis von Influenzaviren [25]. Positive Zellen können durch die Morphologie des fluoreszierenden Bereichs und die typische apfelgrüne Fluoreszenz identifiziert werden. Monoklonale Antikörper in kommerziellen Tests ermöglichen eine strenge intranukleare Partikelfluoreszenz. Die Sensitivität dieser Teste wird, verglichen mit der Virusanzucht, im Durchschnitt mit 70 % angegeben. Für dieses Verfahren Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger werden Zellen des Respirationstraktes auf einem Objektträger fixiert. Influenzavirus-infizierte Zellen werden durch spezifische Antikörper nachgewiesen, die direkt an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind. Bei der indirekten Immunfluoreszenz bindet der spezifische Antikörper ebenfalls an das Antigen in den Zellen. Die Detektion erfolgt jedoch über einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen den Anti-Influenza-Antikörper. Die indirekte Immunfluoreszenz verfügt über eine etwas höhere Sensitivität, ist aber zeitaufwendiger. Der besondere Vorteil der IFT besteht darin, dass diese Methode generell breit eingesetzt wird und somit auch für kleinere Laboratorien mit geringerem Probendurchgang geeignet ist. Ein wesentlicher Nachteil jedoch ist, dass bei diesem Verfahren besonders hohe Anforderungen an das Probenmaterial zu stellen sind. Grundlegende Voraussetzungen für eine sichere Diagnostik sind ausreichend vorhandene Epithelzellen in der Probe sowie ein sehr kurzer Zeitraum zwischen Gewinnung der Probe und Durchführung des Tests. Hervorzuheben ist außerdem, dass die Auswertung im Fluoreszenzmikroskop sehr erfahrenes Personal erfordert. Kommerzielle IFT ermöglichen in der Regel nur eine Differenzierung zwischen Influenza-A- und -B-Viren. Daher steht derzeit kein IFT zur Verfügung, der spezifisch pandemische A/H1N1-Viren nachweisen kann. Über die Eignung des IFT als Screeningtest für die neue Influenza sind bisher wenige Daten verfügbar. Eine Fallstudie aus den USA berichtet über Patienten mit schwerer respiratorischer Symptomatik, die ursprünglich IFT-negativ für Influenza A und B getestet wurden. Aufgrund des klinischen Verdachts wurde noch eine PCR-Untersuchung angefordert, die zeigte, dass diese Patienten an neuer Influenza erkrankt waren [26]. Im Rahmen eines breiten Methodenvergleichs und der Analyse von über 6000 Patienten aus New York wurde dem IFT eine vergleichsweise geringe Sensitivität für den Nachweis der neuen Influenza bescheinigt. Nur etwa die Hälfte der Patienten wurde im Vergleich zur Virusanzucht (47,2 %) und im Vergleich zur PCR (46,7 %) IFT-positiv getestet [19]. 5.4.2 Enzymimmunoassays Die Sensitivität des Enzymimmunoassays (EIA) ist derjenigen der Immunfluoreszenz vergleichbar, der EIA kann aber auch freies Virus nachweisen und ist nicht auf frisch gewonnenes Material angewiesen [20]. Ein solcher Test ist leicht zu implementieren, da die EIA-Technik in den Laboratorien zu den Standardmethoden zählt. Verfügbare Teste basieren auf einer FestphasenSandwich-Kolorimetrie-Technik. Monoklonale Antikörper sind an die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte gebunden und erlauben so die Bindung der in der Patientenprobe vorhandenen Influenzaviren. Anti-Influenza-Antikörper sind mit einem Nachweisreagens (Enzym) gekoppelt, das durch eine Farbreaktion das Vorhandensein von Influenzavirus-Antigen in der Probe anzeigt. Von Vorteil im Vergleich zum IFT ist die leichte und sichere Auswertung, die mittels Spektrometer und einem festgelegten Schwellenwert (cut-off) erfolgt [38]. Derzeit liegen keine publizierten Daten vor, die Auskunft zur Sensitivität des Nachweises der pandemischen A/H1N1-Viren geben. Zu betonen ist auch hier, dass die verfügbaren kommerziellen ELISA-Teste keine spezifische Diagnostik der neuen Influenza ermöglichen, da das Testprinzip auf monoklonalen Antikörpern gegen das Nukleoprotein (NP) beruht und somit nur einen generellen Nachweis von Influenza-A-Viren ermöglicht. 5.4.3 Schnellteste Antigenteste, die einen Nachweis von Influenzaviren ohne Laborausrüstung innerhalb von 10–20 Minuten ermöglichen, werden als Schnellteste bezeichnet. Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 7 Seite 8 Diagnose, B. Schweiger Eine schnelle und akkurate Influenzadiagnostik ist vor allem für das Patientenmanagement von großer Bedeutung. Dies betrifft aber auch die Surveillance und somit die Identifizierung von neuen Virusvarianten oder anderen als den saisonalen Influenzaviren. Diese Anforderungen an die Diagnostik gelten auch für die antivirale Therapie und die Isolierung von Patienten in Krankenhäusern zur Vermeidung nosokomialer Infektionen. Derzeit verfügbare Schnellteste sind Enzym-Immunoassays, die sich sowohl in ihrem Format als auch in der Testdurchführung etwas unterscheiden. Einheitlich jedoch ist das Testprinzip: Monoklonale Antikörper gegen das NP-Protein von Influenza-A- und -B-Viren sind an eine Membran gekoppelt. Liegen Influenzaviren im Probenmaterial vor, so zeigt eine enzymvermittelte Farbreaktion das positive Ergebnis an. Diese Teste können in der Regel zwischen Influenza-A- und -B-Viren differenzieren. Alle Teste zeichnet eine hohe Spezifität aus. Die Angaben über die Sensitivität zum Nachweis saisonaler Influenzaviren schwanken zwischen 60 und 100 % [41, 2, 14, 33, 1, 3]. Überwiegend wurden Virusanzucht und/oder IFT als Referenzmethode eingesetzt. Die Sensitivität dieser Schnellteste ist vergleichbar der von IFT und EIA [34]. Daten im Rahmen der Influenzasurveillance in Deutschland ergaben, dass Schnellteste sehr effizient die virologische Surveillance unterstützen können. Die Sensitivität lag im Vergleich zur PCR zwischen 65 und 70 %. Im Rahmen der Überwachung von importierten Influenzavirusinfektionen wurde über eine ähnliche Sensitivität berichtet [42]. Nicht nur für die saisonale Influenza, sondern vor allem auch im Hinblick auf die pandemische Influenza besteht dringender Bedarf, die Sensitivität der Schnellteste zu erhöhen. Wie bei der IFT oder auch dem ELISA können im Schnelltest nur die Antigenkonzentrationen nachgewiesen werden, die vorliegen. Daher ist verständlich, dass die Virusanzucht, in der die vorliegenden Viren vermehrt werden, und die PCR, in der die vorliegenden Genomkopien vervielfältigt werden, eine höhere Sensitivität aufweisen. Derzeit stehen den Klinikern und Epidemiologen jedoch keine Schnellteste einer neuen Generation zur Verfügung. Zur Ermittlung erster Daten zur Sensitivität der auf dem Markt befindlichen Schnellteste zum Nachweis der neuen Influenza wurden Virusisolate in seriellen Verdünnungen eingesetzt. Die Evaluierung von drei Testen zeigte, dass die Nachweisgrenze in Abhängigkeit vom Virusisolat zwischen 105 TCID50/ml und 104 TCID50/ml schwankte [23]. Eine vergleichbare Nachweisgrenze für die pandemischen A/H1N1-Viren wurde auch durch eine andere Gruppe beschrieben. Sie lag bei fünf Schnelltesten für ein Isolat aus Hongkong zwischen 103,3 TCID50/ml und 104 TCID50/ml und für ein Isolat aus den USA zwischen 103,9 TCID50/ml und 104,7 TCID50/ml. Interessant war auch die Analyse einer seriellen Verdünnung des Nasopharynxaspirates (NPA) eines Patienten, dessen Viruskonzentration zuvor bestimmt wurde. Hier variierte die Sensitivität zwischen 102,8 TCID50/ml und 103,5 TCID50/ml beim Vergleich von fünf Schnelltesten [11]. Beide Studien gaben eine etwa 5- bis 10-fach höhere Sensitivität für saisonale Influenzaviren an. Von größerer Bedeutung sind jedoch umfassendere Daten zur direkten Analyse einer Vielzahl von Patientenproben im Vergleich zur PCR. Die bisher verfügbaren Daten beruhen noch auf einer sehr geringen Anzahl von getesteten Patientenproben. Die von den amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) publizierte Studie berichtet über die Analyse von 45 Patienten, bei denen pandemische A/H1N1-Viren mittels PCR nachgewiesen wurden. Schnelltestergebnisse dreier Hersteller wurden mit den CT-Werten in der PCR verglichen und somit indirekt in Korrelation zur Viruslast in der Probe gesetzt. Eine sehr hohe Viruslast (CT <20) resultierte darin, dass 89 bis 100 % der Schnellteste positiv waren. Bei CT-Werten ab 25 und somit weniger Virusmaterial in der Probe ergaben die Schnellteste nur noch für 16 % der Patienten ein positives Ergebnis (Abb. 1). Im Durchschnitt schwankte die Nachweisgrenze zwischen 40 und 69 % im Vergleich zur PCR (Tab. 2). Die Nachweisgrenze für saisonale Influenzaviren Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger Seite 9 lag zwischen 60 und 83 % [6]. Zwei dieser Schnellteste wurden in einer anderen Studie mit vergleichbaren Sensitivitäten beschrieben [40]. Bei einem anderen Test wurden 53 % im Vergleich zu 69 % der CDC-Daten angegeben (Tab. 2) Die im Rahmen eines Schulausbruchs für einen weiteren Schnelltest evaluierte Sensitivität lag bei 47 % [7]. Es liegen auch Berichte über weitaus niedrigere Sensitivitäten vor, die je nach Schnelltest zwischen 10 und 40 % schwankten [18]. Die publizierten Schnelltestergebnisse waren Grundlage sowohl der Empfehlung der CDCs als auch der Fachgesellschaften in Deutschland, Schnellteste derzeit nicht für therapie- oder epidemiologierelevante Fragestellungen heranzuziehen. Abbildung 1 Abhängigkeit der Schnelltest-Sensitivität von den CT-Werten in der PCR und somit der Viruslast. Der CT-Wert stellt den Schwellenwert für den Anstieg der Fluoreszenzintensität in der Real-time PCR dar. Dieser Wert korreliert mit der Viruslast und variiert von Patient zu Patient. (siehe 5.2.1.3). Publikation Test Sensitivität (%) Details Vasoo et al. Directigen 47 60 Patienten CID, 49, 2009 Binax Now 38 Quick Vue 53 CDC Directigen 49 MMWR, 58, 2009 Binax Now 40 Quick Vue 69 45 Patienten Tabelle 2 Evaluierung von Schnelltesten zum Nachweis von pandemischen A/H1N1-Viren. Referenzmethode zur Ermittlung der Sensitivität der Schnellteste war die vom Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA (CDC) publizierte PCR zum spezifischen Nachweis von pandemischen A/H1N1-Viren. Sowohl in der Studie von [40] Vasoo et al. (Clin Infect Dis, 49, 1090-3, 2009) als auch in der des [6] CDC (MMWR, 58(30):826-29, 2009) wurden Nasopharynx-Abstriche als respiratorische Proben eingesetzt. Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 10 Diagnose, B. Schweiger 5.5 Virusanzucht Eine Isolierung von Influenzaviren erfolgt für saisonale Influenzaviren aufgrund der technischen Voraussetzungen nur in spezialisierten Laboratorien unter Bedingungen der Sicherheitsstufe 2. Die über Jahrzehnte verwendeten embryonierten Hühnereier werden in der Routinediagnostik nur noch selten eingesetzt. Dieses Verfahren ist jedoch für die Kultivierung von Referenzstämmen und für die Viruscharakterisierung unerlässlich. Die Primäranzucht aus Patientenmaterial findet fast ausschließlich in Zellkulturen statt. Besonders bewährt haben sich Hundenierenzellen (Madin Darby Canine Kidney- [MDCK-]Zellen). Die Anzucht kann wenige Tage bis zu zwei Wochen erfordern. Zur Beschleunigung des Verfahrens ist es möglich, virusspezifische Antigene mittels Immunfluoreszenz (Shell-vial-Methode) nachzuweisen [28]. Diese Schnellkultivierungen können nach ein bis zwei Tagen ein Ergebnis liefern, sind aber weniger sensitiv. Aufgrund des aufwendigen Verfahrens als auch des Zeitfaktors spielt die Virusanzucht daher zum Nachweis einer Influenza weder im ambulanten noch im klinischen Bereich eine Rolle. Neu beim Menschen identifizierte Influenzaviren wie die pandemischen A/H1N1Viren oder hochpathogene aviäre Influenzaviren von Subtyp H5 oder H7 dürfen nur unter Sicherheitsbedingungen der Stufe 3 angezüchtet werden. Diese Restriktionen betreffen nicht die Patientendiagnostik, denn dafür wird in der Regel die PCR eingesetzt. Virusisolate sind jedoch Voraussetzung für die Viruscharakterisierung und somit für die nationale und globale Influenzavirusüberwachung. Aufgrund der weiten Verbreitung der pandemischen A/H1N1-Viren ist die Virusanzucht seit dem 1.09.2009 wieder unter S2Bedingungen möglich. In einer Reihe von Speziallaboren wurde auch die Virusanzucht zur Diagnostik der neuen Influenza eingesetzt. Da dieses Verfahren von verschiedenen Faktoren wie Zeitpunkt und Qualität der Probenentnahme, Transportbedingungen und dem Vorhandensein lebensfähiger Viren im Patientenmaterial abhängig ist, liegt die Sensitivität der PCR für saisonale Influenzaviren um bis zu 20 % höher als die der Virusanzucht [17, 37]. Vergleichbare Daten wurden auch für die pandemischen A/H1N1-Viren beschrieben [19]. 5.6 Antikörpernachweis Influenzaspezifische Antikörper im Serum können entweder als Gesamtantikörper nachgewiesen oder auch in einzelne Antikörpersubklassen (IgA, IgM, IgG) differenziert werden. Zu den in Routinelaboren am breitesten eingesetzten Methoden zählen Komplementbindungsreaktion (KBR), Enzymimmunoassay und Immunfluoreszenz. Eine Influenzavirusinfektion resultiert in einem lang anhaltenden IgG-Titer, aber auch ein KBR-Titer kann über längere Zeit erhöht sein. Daher sollte für den Nachweis einer akuten Infektion ein Serumpaar (im akuten Stadium und etwa 20 Tage nach Beginn der Erkrankung) untersucht werden. Als positiver Nachweis wird ein vierfacher Titeranstieg gewertet. Verfahren wie Hämagglutinationshemmtest (HHT) und Neutralisationstest erfordern neben Spezialreagenzien auch sehr erfahrenes Personal und werden daher nur in wenigen Laboratorien durchgeführt. Diese Teste zeichnen sich dadurch aus, dass sie Auskunft darüber geben können, welche Virusvariante für die Infektion verantwortlich war. Antikörpernachweise spielen jedoch weder für Therapieentscheidungen noch für das Patientenmanagement eine Rolle, da sie viel zu spät vorliegen. Serologische Verfahren zum Nachweis einer Infektion durch Antikörper sind daher vor allem im Rahmen epidemiologischer Studien, bei Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger Untersuchungen zur Effizienz der Impfung oder bei der Aufklärung von Ausbrüchen von Bedeutung. Die Erfahrungen und Methodik zum serologischen Nachweis einer saisonalen Influenza sind keinesfalls einfach auf Infektionen des Menschen mit anderen als saisonalen Typ-A-Viren zu übertragen. Das zeigte sich bei Infektionen mit dem hochpathogenen Vogelgrippevirus A/H5N1. Hier gilt der Mikroneutralisationstest (MNT) als Goldstandard, da andere Verfahren weder die erforderliche Sensitivität noch Spezifität aufweisen. Derzeit stehen hinsichtlich der Sensitivität verschiedener serologischer Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen die pandemischen A/H1N1-Viren kaum Daten zur Verfügung. Erste vergleichende Analysen liegen für den MNT und den HHT vor. Eingesetzt wurden Serumpaare von Kleinkindern, Erwachsenen und älteren Menschen, bei denen die neue Influenza mittels PCR diagnostiziert wurde. Im Gegensatz zu A/H5N1-Infektionen erwies sich auch der HHT mit Truthahn- oder Meerschweinchenerythrozyten als geeignet, um Antikörper gegen die pandemischen A/H1N1-Viren nachzuweisen. Generell war die Korrelation zwischen HHT und MNT recht gut. Mit dem MNT konnten mehr Serokonversionen nachgewiesen werden als mit dem HHT. Es ist zu betonen, dass die Probandenanzahl mit 28 Kleinkindern, 30 Erwachsenen und 43 älteren Menschen über 60 Jahre sehr niedrig war (CDC 2009). Erste vom NRZ Influenza durchgeführte serologische Untersuchungen erbrachten ähnliche Resultate. Eine Analyse von Referenzstämmen und Patientenseren ist in Tabelle 3 dargestellt. Der obere Bereich zeigt, dass die Referenzstämme nur mit dem homologen Immunserum reagieren. Im unteren Teil der Tabelle sind serologische Ergebnisse für einige Patienten dargestellt, in deren respiratorischen Proben pandemische A/H1N1-Viren nachgewiesen wurden. Analysiert wurden Serumpaare, bestehend aus einem Akut- und einem Rekonvaleszenzserum. Ein vierfacher Titeranstieg wird als positiver Antikörpernachweis gewertet. Bei einigen Seren konnten auch Antikörper gegen saisonale Influenzaviren detektiert werden. Diese Befunde waren zu erwarten, da die Patienten durchaus in den letzten Jahren auch an einer saisonalen Influenza erkrankt sein konnten. Derzeit gibt es noch keine kommerziellen serologischen Verfahren, die Antikörper gegen pandemische A/H1N1-Viren spezifisch nachweisen können. Die Beantwortung der Frage, ob in bestimmten Bevölkerungsgruppen kreuzreaktive Antikörper gegen pandemische A/H1N1-Viren nachweisbar sind, ist ebenfalls von Bedeutung. Dies war im Wesentlichen nur bei Personen der Fall (34 %), die vor 1950 geboren wurden [21]. Abbildung 2 Elektronenmikroskopische Darstellung von pandemischen A/H1N1Influenzaviren (Stamm A/Berlin/84/2009. Aufnahme L. Moeller, Dr. N. Banner, Robert KochInstitut, Berlin, mit frdl. Genehmigung). Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 11 Seite 12 Diagnose, B. Schweiger Serum Referenzstämme Immunserum A/Cal/7 A/H1N1v A/Bri/59 A/H1N1 A/Bri/10 A/H3N2 B/Bri/60 B/VicLinie B/Flo/4 B/YamLinie A/Cal/7/09 320 <10 <10 <10 <10 A/Bri/59/07 <10 320 <10 <10 <10 A/Bri/10/07 <10 <10 1280 <10 <10 B/Bri/60/08 <10 <10 <10 640 <10 B/Flo/4/06 <10 <10 <10 <10 320 A-S1 <10 <10 <10 <10 20 A-S2 160 <10 <10 <10 20 B-S1 <10 40 640 40 20 B-S2 40 40 640 40 20 C-S1 <10 <10 <10 <10 <10 C-S2 80 <10 <10 <10 <10 D-S1 <10 160 20 40 20 D-S2 <10 160 20 40 20 Patientenserum Tabelle 3 Nachweis von Antikörpern gegen pandemische Influenza A/H1N1-Viren mittels Hämagglutinationshemmtest (HHT). Die Analysen wurden am NRZ Influenza durchgeführt. Die HHT-Ergebnisse sind als reziproke Titer angegeben. Der obere Teil der Tabelle zeigt die spezifische Reaktion der Frettchenimmunseren mit dem homologen Stamm. Folgende Referenzstämme und entsprechende Immunseren wurden eingesetzt: A/Cal/7/09: A/California/7/2009 (H1N1v), A/Bris/59/07: A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Bris/10/07: A/Brisbane/10/2007 (H3N2), B/Bris/60/08: B/Brisbane/60/2008 (Victoria-Linie), B/Flo/4/06: B/Florida/4/2006. Patientenseren sind durch die Buchstaben A-D gekennzeichnet. Serum 1 (S1) wurde in der Akutphase entnommen und Serum 2 (S2) etwa 2-3 Wochen nach Symptombeginn. Bei den Patienten A-C wurden Antikörper gegen pandemische Influenza A/H1N1-Viren nachgewiesen. Das Serum von Patient D stammt aus der Saison 2007/08, in der noch keine pandemischen Influenzaviren zirkulierten. Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger 5.7 Diagnostik resistenter Influenzaviren Zur Therapie und Prophylaxe der Influenza sind derzeit Medikamente zweier Wirkstoffklassen verfügbar: die Neuraminidaseinhibitoren Oseltamivir und Zanamivir und aus der Gruppe der Adamantane die M2-Channel-Inhibitoren Amantadin sowie das in Deutschland nicht zugelassene Rimantadin [22]. Eine Resistenz gegenüber M2-Inhibitoren ist mit Aminosäuresubstitutionen im M2Protein assoziiert. Amantadin-resistente saisonale A/H3N2-Viren zirkulieren seit einigen Jahren weltweit, während eine Amantadin-Resistenz gegen saisonale A/H1N1- und aviäre A/H5N1-Viren seltener beobachtet wurde [13]. Influenzaviren, die gegen Neuraminidaseinhibitoren (NAI) resistent sind, weisen charakteristische Mutationen in den Neuraminidasegenen auf, die typ- und subtypspezifisch sind. NAI-resistente Influenzaviren wurden bis zum Winter 2007 seltener beobachtet. Daher war das Auftreten und die schnelle Verbreitung Oseltamivir-resistenter saisonaler A/H1N1-Viren ein unerwartetes Ereignis [15, 29]. 5.7.1 Phänotypische und genotypische Resistenzanalyse Eine phänotypische Resistenzanalyse gibt Informationen darüber, ob und wie sich das Virus in Anwesenheit antiviraler Substanzen vermehrt. Hierbei wird mithilfe eines Replikations-Assays die Inhibitorkonzentration bestimmt, bei der die Virusvermehrung zu 50 % gehemmt ist (IC50). Da diese Methode sehr aufwendig ist, hat sich schon seit Längerem die Bestimmung der Neuraminidaseaktivität mit einem fluorometrischen Enzymassay (MUNANA-Test) als Goldstandard etabliert. Voraussetzung ist jedoch auch für diese Methode das Vorliegen eines isolierten Influenzavirus. Im Gegensatz zum Replikations-Assay kann mit dem MUNANATest nur die phänotypische Auswirkung auf die Neuraminidase untersucht werden, nicht aber die Wirkungen möglicher Mutationen im Hämagglutinin. Für die genotypische Resistenzanalyse steht schon seit vielen Jahren die Methode der DNA-Sequenzierung zur Verfügung. Die Länge des zu sequenzierenden PCRProduktes hängt davon ab, ob nur bereits bekannte resistenzassoziierte Mutationen oder das gesamte Neuraminidase-Gen analysiert werden sollen. Die Untersuchung eines größeren Probenaufkommens wird durch neue Methoden wie die Pyrosequenzierung (PSQ) erleichtert. Ein PSQ-Assay zur Analyse der resistenzassoziierten Mutationen im M2-Gen wurde schon vor einiger Zeit beschrieben [4]. Das NRZ Influenza hat verschiedene PSQ-Assays entwickelt, um die Neuraminidase auf Resistenzmutationen bei Influenza-A- (H1N1-, H5N1-, H3N2-) und Influenza-B-Viren zu untersuchen [16]. Im NRZ Influenza wurde jetzt auch ein PSQ-Assay zur genotypischen Resistenzanalyse der pandemischen A/H1N1-Viren entwickelt. 5.7.2 Resistenzen bei neuen Influenza A/H1N1v-Viren gegenüber antiviralen Substanzen Mit Ausnahme der seit 2007 zirkulierenden Oseltamivir-resistenten saisonalen A/H1N1-Viren wurden NAI-Resistenzen selten und überwiegend nur bei immunsupprimierten Patienten beobachtet [24]. Daher war auch der Nachweis Oseltamivir-resistenter pandemischer A/H1N1-Viren bei immunsupprimierten Personen nicht unerwartet. Dies betraf bisher zwei an Leukämie Erkrankte in den USA. Oseltamivir-resistente A/H1N1-Viren wurden am Tag fünf bzw. sieben nach Therapiebeginn nachgewiesen [9]. Ein anderer Bericht über Oseltamivir-resistente pandemische A/H1N1-Viren betrifft die Entstehung während der Prophylaxe. Es wird jedoch vermutet, dass die beiden im Zusammenhang mit einem Ausbruch stehenden Personen zum Zeitpunkt des Prophylaxebeginns schon infiziert waren. Damit hätte die Virusreplikation unter suboptimalen Oseltamivir-Konzentrationen Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 13 Seite 14 Diagnose, B. Schweiger stattgefunden und wahrscheinlich eine Resistenzentstehung begünstigt [10]. Aus Hongkong kam der erste Report über ein Oseltamivir-resistentes pandemisches A/H1N1-Virus, das nicht im Zusammenhang mit Therapie oder Prophylaxe stand. Daher geht man hier von der Übertragung eines resistenten Virus aus. Eine Übertragung dieses resistenten Virus von der infizierten Schülerin auf andere Personen war jedoch nicht nachweisbar [26]. Zusammenfassend ist hervorzuheben, dass Oseltamivir-resistente pandemische A/H1N1-Viren bisher nur vereinzelt identifiziert wurden und kontinuierliche Resistenzanalysen in den USA, Deutschland und vielen anderen Ländern keinen Hinweis auf die Zirkulation Oseltamivir-resistenter pandemischer A/H1N1-Viren geben (AGI 2009). 5.7.3 Charakterisierung von Influenzaviren Eine antigene und molekulare Charakterisierung der Influenzaviren ist für eine primäre Patientendiagnostik und Überwachung der Influenzaaktivität nicht erforderlich. Diese Daten sind jedoch von grundlegender Bedeutung zur Erforschung der Evolution sowohl der saisonalen als auch der pandemischen A/H1N1-Viren. Zuständig für eine umfassende Charakterisierung der in Deutschland zirkulierenden Influenzaviren ist das NRZ Influenza am Robert KochInstitut in Berlin. Zur Untersuchung der antigenen Eigenschaften der Influenzaviren wird eine Palette spezifischer Immunseren eingesetzt, um die Ähnlichkeit mit Referenzstämmen und Impfstämmen zu bestimmen. Dazu werden die zirkulierenden Viren mit spezifischen Immunseren im Hämagglutinationshemmtest (HHT) untersucht. Die bisher in Deutschland isolierten pandemischen A/H1N1Viren haben sich in ihrem Antigenprofil noch nicht verändert und sind dem Referenzstamm A/California/7/2009 sehr ähnlich. Eine umfassende Charakterisierung der zirkulierenden Influenzaviren erfordert neben der antigenen auch eine molekulare Analyse. Dies betrifft in erster Linie die Gene, die für die beiden Oberflächenproteine Hämagglutinin und Neuraminidase kodieren, um detaillierte Informationen über die Evolution der Influenzaviren und beginnende Driftereignisse zu erhalten. Von besonderem Interesse sind solche Mutationen, die den Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren zur Folge haben und in den bekannten Antigendomänen liegen. Eine phylogenetische Analyse des HA-Gens der pandemischen A/H1N1-Viren ist in Abbildung 4 dargestellt. Es wurden über 500 Sequenzen aus der Datenbank analysiert, um die Variabilität dieser Viren zu studieren. Trotz der hohen Sequenzhomologie ist die Kozirkulation mehrerer Subgruppen nachweisbar. Vertreter dieser Subgruppen wurden ausgewählt und in eine phylogenetische Analyse des HA-Gens von pandemischen A/H1N1-Viren eingebunden, die am NRZ Influenza isoliert wurden. Auch die in Deutschland identifizierten pandemischen A/H1N1-Viren können verschiedenen Gruppen zugeordnet werden. Mehr als die Hälfte dieser Viren sind Vertreter einer Gruppe, die durch eine Aminosäuresubstitution nahe einer Antigendomäne charakterisiert ist. Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Diagnose, B. Schweiger Abbildung 4 Phylogenetische Analyse des Hämagglutiningens von pandemischen A/H1N1Viren. Die in anderen Ländern isolierten Viren wurden als repräsentative Stellvertreter für 600 analysierte pandemische A/H1N1-Viren ausgewählt. Viele der in Deutschland isolierten pandemischen A/H1N1-Viren sind durch eine Aminosäuresubstitution and Position 203 charakterisiert (Substitution von Serin durch Threonin). Diese Analyse zeigt auch die Variabilität der in Deutschland detektierten Viren auf, denn sie lassen sich verschiedenen „Gruppen“ zuordnen. Besonders wichtige Arbeiten sind im Text und im Literaturverzeichnis fett gedruckt. Seite 15 Seite 16 Diagnose, B. Schweiger 5.8 Literatur AGI (2009). Wochenberichte. www.influenza.rki.de. 1. Alexander R, Hurt AC et al. (2005) A comparison of a rapid test for influenza with laboratory-based diagnosis in a paediatric population. Commun Dis Intell 29(3):272–276 2. Bellei N, Benfica D et al. 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