B. burgdorferi - Infectolab Vet
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Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] T-Zell-Diagnostik in der Veterinärmedizin 22. Oktober 2014 Infectolab-Vet Dr. N. Ettischer AID GmbH, Germany [email protected] [email protected] www.aid-diagnostika.com Das Immunsystem Quelle: wikipedia [email protected] www.aid-diagnostika.com Lymphozyten [email protected] www.aid-diagnostika.com T-Helferzellen [email protected] www.aid-diagnostika.com T-Helferzellen [email protected] www.aid-diagnostika.com PBMC Isolierung Untersuchungsmaterial: Vollblut bzw PBMCs: Peripheral blood mononuclear cells Heparinblut CPT Röhrchen BD Leucosep (Greiner) CPDA- Röhrchen (Sarstadt) Zu beachten: Röhrchen sollten immer ganz gefüllt sein! Blut sollte nicht älter als 48 Std. sein! Blutproben bei RT lagern Nicht stark schütteln/ zentrifugieren [email protected] www.aid-diagnostika.com Elispot Enzyme Linked Immuno Spot technique Der Elispot detektiert die Anzahl der antigenspezifischen T- Zellen aufgrund ihrer Zytokinausschüttung: 1 Spot = 1 Cytokinproduzierende T-Zelle Material : PBMCs [email protected] EliSpot-Platte beschichtet mit monoklonalen Antikörpern (IFN-y, etc.) www.aid-diagnostika.com EliSpot – Methodik [email protected] www.aid-diagnostika.com EliSpot – Methodik [email protected] www.aid-diagnostika.com EliSpot – Methodik [email protected] www.aid-diagnostika.com EliSpot – Auswertung Beispiel Canine Lymespot (IFNy) LW [email protected] Positiv Kontrolle Pos. Kontr. 1:5 OspC www.aid-diagnostika.com Interpretation Zur Interpretation der Ergebnisse kann ein Stimulationsindex gebildet werden: Spotanzahl Antigen Mix ______________________ = Stimulationsindex (SI) Spotanzahl Leerwert Beispiel Canine Lymespot (IFNy) SI ist größer oder gleich 3 Probe ist reaktiv SI zwischen 2 und 3 Probe ist grenzwertig SI kleiner 2 Probe ist negativ [email protected] www.aid-diagnostika.com Diagnostik Wo wird die Elispot Diagnostik eingesetzt? Autoimmunologie Transplantation Allergie Infektionskrankheiten Impfstoff Monitoring [email protected] www.aid-diagnostika.com Borrelia burgdorferi sensu lato Pathogene Erreger: B. burgdorferi sensu stricto B. afzelii B. garinii B. spielmanii (Lyme-Arthritis) (Hautmanifestationen) (ZNS-Infektionen) • Übertragung durch den gemeinen „Holzbock“ Ixodes ricinus • sehr selten auch durch fliegende Insekten (Pferdebremsen, Stechmücken) [email protected] www.aid-diagnostika.com Serologische Diagnostik Antikörper-Anstieg tritt in den meisten Fällen 2- 4 Wochen nach dem Zeckenbiss auf, aber auch längere Latenzphasen möglich Ak können auch bei eindeutiger Klinischer Symptomatik fehlen! Frühzeitige Therapie kann eine Antikörpersynthese oder z. B. die Ausbildung von IgM oder IgG Antikörpern partiell oder vollständig unterdrücken Auch unter Therapie sind signifikante Titer-Anstiege möglich Spezifische IgG AK können auch nach effektiver Therapie z. T. über Jahre nachweisbar bleiben Grundsätzlich ist ein positiver Borrelien AK-Befund allein keine Indikation zur Therapie [email protected] www.aid-diagnostika.com LymeSpot Möglichkeiten des EliSpots in der Diagnostik der Lyme-Borreliose Alternativmethode zu ELISA / WB bei unklaren Fällen Frühere Diagnose Höhere Sensitivität und Spezifität Therapieüberwachung / Prognose möglich Seronegative “chronische Borreliosen” IFN-y Elispot (equine) Antigen: VLSE [email protected] www.aid-diagnostika.com Therapiemonitoring Antibiotikatiter Borrelien - spezifische T-Zellen 3 6 9 12 Monate nach Beginn der antibiotischen Therapie [email protected] www.aid-diagnostika.com LymeSpot Borrelien Vollantigen : Aufgereinigtes Bakterien Lysat (Borrelia burgdorferi B31) Borrelien Osp Peptidmix: Peptide von OspA: Borrelia burgdorferi, B. afzelii, B. garinii Natives OspC: B. afzelii Rekominates DbpA VLSE DbpB IFN-y Elispot (equine) Antigen: Lysat IFN-y Elispot (equine) Positivkontrolle [email protected] IFN-y Elispot (equine) Antigen: OspC www.aid-diagnostika.com LymeSpot (equine) Negativkontrolle (5 spots) Borrelien Vollantigen (40 spots) Spotanzahl Antigen Mix ______________________ = Stimulationsindex (SI) Spotanzahl Leerwert SI ist größer oder gleich 4 Probe ist reaktiv Stimulationsindex: 40/5= 8 [email protected] reaktiv www.aid-diagnostika.com Borrelien- Immunoarray Dot 1: Dot 2: Dot 3: Dot 4: Dot 5: Dot 6: Dot 7: Dot 8: Dot 9: Dot 10: Dot 11: Dot 12: [email protected] IgG und IgM IgG IgM OspC (B. burgdorferi) OspC (B. spielmanii) OspC (B. afzelii) p18 (B. burgdorferi) BmpA (B. burgdorferi) p41 (B. burgdorferi und B. afzelii) p58 (B. burgdorferi) p100 (B. burgdorferi) VlsE (B. burgdorferi) www.aid-diagnostika.com Borrelien- Immunoarray [email protected] www.aid-diagnostika.com Herpesviren Humanpathogene Typen: Herpes simplex-Virus (HSV-1) Typ1 Herpes simplex-Virus (HSV-2) Typ2 Varizellen Zoster-Virus VZV Epstein-Barr-Virus (EBV) Humanes Cytomegalievirus (HCMV) Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6) A und B Humanes Herpesvirus 7 (HHV-7) Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) Lynn Enquist lab (molbio.princeton.edu) Canines Herpesvirus Typ 1 Equine Herpesviren Typ 1,2,3,4,5 [email protected] www.aid-diagnostika.com Herpesviren Equine Herpesviren EHV1 Alpha HV EHV2 EHV3 Alpha HV EHV4 Alpha HV EHV5 Gamma HV Gamma HV VZV? EBV, HSV „equines CMV“ VZV? VZV? EBV, HSV Virusaborte Respiratorische Erkrankungen Neurologische Erkrankungen (Myeloenzephalopathie) Hohe Durchseuchung, meist asymptomatisch, Bindehautentzündung Koitalexanthem (Bläschenausschlag) Anzeigenpflichtige Tierseuche, Zuchtausschluss Virusaborte Respiratorische Erkrankungen Neurologische Erkrankungen (Myeloenzephalopathie) Hohe Durchseuchung, meist asymptomatisch Canines Herpesvirus CHV1 Genus Alpha HV Related to HSV 1&2 40-93% Durchseuchung Ältere Tiere asymptomatisch bis leichte Atemwegsinfekte (Zwingerhustenkomplex) Primärinfektion während Trächtigkeit kann Totgeburten auslösen Infektion in den ertsen 3 Wochen kann Welpensterben verursachen [email protected] www.aid-diagnostika.com Elispot- Herpesviren Negativkontrolle 25 Spots EBV Lysat (EHV2) 187 Spots Stimulationsindex 7,48: Reaktiv Vorteile: EHV pos/neg Status VOR einer Erkrankung (Gerade bei Zuchttieren sinnvoll) [email protected] www.aid-diagnostika.com AID MultiSpot Multifunktionale Plattform für Zellzählung, EliSpot und FluoroSpot assays in unterschiedlichen Formaten (96-well plates, Glas-Objektträger und Terasaki trays) • Enzymatischer und Fluoreszenz-EliSpot • Zellzählung und Zellvitalitätstests • IF-basierte Gewebeassays • HLA screening assays (z.B. CDC assay) • Maßgeschneiderte Lösungen auf 96well Platten, Glas-Objektträgern und Terasaki trays 2-color assays [email protected] 2-color assays iSpot AID EliSpot Reader System Enzymatic assays 3-color assays www.aid-diagnostika.com AID - Firmenprofil 1989 von Dr. Schoellhorn in Straßberg (Süd-West Deutschland) gegründetes Unternehmen in Privatbesitz Der Fokus liegt auf der Entwicklung und Herstellung von in-vitro Diagnostika und Readersystemen für deren Auswertung als auch auf dem weltweiten Vertrieb der Produkte [email protected] www.aid-diagnostika.com AID - Produktpalette • Immunoblots / Microarrays für den Nachweis verschiedenster Infektionskrankheiten Bsp. HPV MicroArray • Molekularbiologische Testsysteme für den Nachweis von Infektionskrankheiten, Genetischer Mutationen und Antibiotika Resistenzen • T- und B- Zell basierte Plattformen für die Verlaufskontrolle und die Bestimmung von Immunreaktionen bspw. nach Transplantationen, Impfungen und Infektionskrankheiten • Zertifiziert nach DIN ISO 13485 und DIN ISO 9001 [email protected] www.aid-diagnostika.com Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit [email protected] www.aid-diagnostika.com
