Der Einfluss des antimikrobiellen Peptides LL
Werbung
Der Einfluss des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf Candida albicans und den Infektionsprozess in vitro Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolina-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Daniela Evers aus Berlin 1. Referentin: Professorin Dr. Ursula M. Bilitewski 2. Referent: Professor Dr. Michael Steinert eingereicht am: 02.10.2012 mündliche Prüfung (Disputation) am: 05.12.2012 Druckjahr 2012 Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissenschaften, vertreten durch die Mentorin der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Tagungsbeiträge: • Evers, D., Gremmer, K. & Bilitewski, U.: The double life of Candida albicans (Poster). 3rd International PhD Symposium, Braunschweig (2009) • Hofmann, B., Mangin, S., Müller, D., Suárez-Diez, M., Puchalka, J., Evers, D., Bilitewski, U. & Martins dos Santos, V.: Turning Dr. Jekyll into Mr. Hyde – A Genome-Scale Model For Predicting C.albicans Metabolic Changes During Host Infection (Poster). Conference for Systems Biology of Microorganisms, Paris, Frankreich (2010) • Evers, D., Gremmer, K., Sokolis, D. & Bilitewski, U.: The double life of Candida albicans (Poster). 3. Gemeinsame Tagung der VAAM und DGHM, Hannover (2010) • Mangin, S., Suárez-Diez, M., Hofmann, B., Mueller, D., Sandoval, R., May, S., Evers, D., Puchalka, J., Bilitewski, U. & Martins dos Santos, V.: Turning Dr. Jekyll into Mr. Hyde - A Genome-Scale Model To Analyse C. albicans and Host Interactions During Host Infection (Poster). 25th German Conference on Bioinformatics, Braunschweig (2010) • Evers, D., Gremmer, K. & Bilitewski, U.: Dr. Jekyll and Mr. Hyde: A commensal organism switches to a deadly pathogen - Candida albicans (Poster). 4th International PhD Symposium, Braunschweig (2010) • Evers, D., Mangin, S. & Bilitewski, U.: Dr. Jekyll and Mr. Hyde: A commensal organism switches to a deadly pathogen - Candida albicans (Poster). 5th European Conference on Prokaryotic and Fungal Genomics, Göttingen (2011) • Mangin, S., Hofmann, B., Müller, D., Suárez-Diez, M., May, S., Puchalka, J., Evers, D., Rupp, S., Sohn, K., Grumaz, C., Schaller, M., Schröppel, K., Wagener, J., Bilitewski, U. & Martins dos Santos, V.: Turning Dr. Jekyll into Mr. Hyde – A Genome-Scale Model to Analyze Candida albicans and Host Interactions During Host Infection (Poster), 12th International Conference on Systems Biology, Heidelberg (2011) • Evers, D., Mangin, S. & Bilitewski, U.: Dr. Jekyll and Mr. Hyde: A commensal organism switches to a deadly pathogen - Candida albicans (Poster). 5th International PhD Symposium, Braunschweig (2011) • Evers, D & Bilitewski, U.: The influence of the antimicrobial peptide LL-37 on Candida albicans and the infection process in vitro (Poster). 11th ASM Conference on Candida and Candidiasis, San Francisco, CA, USA (2012) Abstract Candida albicans is a fungal opportunistic pathogen leading to superficial or systemic infections. The physical barrier of the skin, cellular components, such as phagocytes and killer cells, but also molecular components, e.g. antimicrobial peptides (AMPs), protect the healthy host against pathogens. However, the underlying molecular mechanisms are only partly understood. The thesis work focused on the AMP LL-37, which was reported to be of high relevance for the protection against invasion of epithelial cell layers by C. albicans. Thus, LL37 was added to C. albicans (SC5314) and to vaginal epithelial cells (A431) separately and the respective co-culture system was established. LL-37 inhibited growth of C. albicans when concentrations exceeded inflammation-like ranges of 30 µg/mL. Gene expression analysis showed that LL-37 treatment led to the upregulation of transcription factors, which are involved in stress response, of genes which are related to glucose uptake and carbon metabolism and of genes which are involved in cell wall regulating functions. Genes which are related to ncRNA- or rRNA-metabolism were downregulated, which is a general response to stress. In nutrient-turnover a slightly decreased rate of glucose consumption and reduced biomass yields was observed. Correlating to putative effects on the cell wall of C. albicans a decreased adhesion to plain plastic surfaces in the presence of LL-37 was observed, but, surprisingly, adhesion to epithelial cells was increased. FACS analysis of the epithelial cells revealed a higher surface abundance of the Pattern Recognition Receptors TLR2, Dectin-1 and the receptor CXCR4, when the A431 cells were treated with LL-37. This was confirmed by gene expression analysis via qRT-PCR. This could point to an active contribution of the epithelial cells to the interaction with C. albicans. On the other hand treatment of epithelial cells with LL-37 reduced the viability of the cells, in particular under serum-free conditions. Zusammenfassung Candida albicans ist ein pathogener Pilz, der oberflächliche oder systemische Infektionen auslöst. Die physikalische Barriere der Haut, zelluläre Komponenten, wie Phagozyten und NK-Zellen, aber auch molekulare Komponenten, wie z. B. antimikrobielle Peptide (AMPs), schützen den gesunden Wirt vor dem Pathogen. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind nur teilweise verstanden. Der Fokus dieser Arbeit richtete sich auf das AMP LL-37. Das als wichtige epitheliale Schutzkomponente vor C. albicans-Invasionen geltende LL-37 wurde zu C. albicans (SC5314) bzw. zu vaginalen Epithelzellen (A431) sowie zum etablierten Co-Kultivierungssystems gegeben. LL-37 inhibierte das Wachstum von C. albicans, wenn Konzentrationen entzündungsähnliche Bereiche von 30µg/ml erreichten. Genexpressionsanalysen zeigten, dass die LL-37-Behandlung zu einer Hochregulation von Stressanwort-assoziierten Transkriptionsfaktoren und von Genen, die mit Glucose-Aufnahme und KohlenstoffMetabolismus verbunden sind sowie in Zellwand-regulierende Funktionen involviert sind, führte. Gene, die mit ncRNA- oder rRNA-Metabolismus assoziiert sind, wurden einer generellen Stressantwort entsprechend herunterreguliert. Die Betrachtung des Nährstoffumsatzes zeigte eine reduzierte Glucoseverbrauchsrate und eine geringere Biomasseproduktion. Korrelierend mit putativen Zellwand-Effekten wurde eine reduzierte Adhäsion an Plastikoberflächen in Anwesenheit von LL-37 detektiert. Die Adhäsion an Epithelzellen hingegen war verstärkt. FACS-Analysen zeigten eine höhere Abundanz der Pattern Recognition Rezeptoren TLR2, Dectin-1 und des Rezeptors CXCR4 an A431-Zellen, die mit LL-37 behandelt wurden. Diese Ergebnisse konnten durch Genexpressionanalysen via qRT-PCR bestätigt werden und sprechen für eine aktive Beteiligung der Epithelzellen an der Interaktion mit C. albicans. Andererseits bewirkte die Behandlung der Epithelzellen mit LL-37 eine reduzierte Viabilität der Zellen, insbesondere unter Serum-freien Bedingungen. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 1.2 1.3 1.4 1 Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.1 Historische Aspekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.2 Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.3 Klinische Relevanz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.1.4 Virulenzfaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Die Interaktion Candida albicans - Wirt . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.2.1 Adhärenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.2.2 Erkennung von C. albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.2.3 Zytokine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2.4 Phagozytierende Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.2.5 Evasionsstrategien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Antimikrobielle Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.3.1 Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.3.2 Wirkungsweisen von AMPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.3.3 Selektivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.3.4 AMPs als Regulatoren der Immunantwort . . . . . . . . . . . 24 1.3.5 Resistenzentwicklungen von Pathogenen . . . . . . . . . . . . 25 1.3.6 AMPs als Therapeutikum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1.3.7 Defensine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.3.8 Cathelicidin LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2 Material und Methoden 39 2.1 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 2.2 Lösungen und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 2.3 Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.4 Kit-Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 vii 2.5 Stämme und Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.5.1 Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.5.2 Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 2.6 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.7 Zellzahlbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.8 Arbeiten mit Candida albicans 2.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2.8.1 Stammhaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2.8.2 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2.8.3 Hitzeinaktivierung von C. albicans 2.8.4 Wachstumstests in Mikrotiterplatten . . . . . . . . . . . . . . 47 2.8.5 Wachstumstests in Erlenmeyerkolben . . . . . . . . . . . . . . 48 2.8.6 Bestimmung der Trockenmasse . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 2.8.7 CFU-Bestimmung von C. albicans-Kulturen . . . . . . . . . . 49 2.8.8 Extraktion der intrazellulären Metabolite . . . . . . . . . . . . 49 2.8.9 Analyse der Metabolite per HPLC . . . . . . . . . . . . . . . 47 . . . . . . . . . . . . . . . 50 Arbeiten mit humanen Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 2.9.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 2.9.2 Toxizitätstests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 2.9.3 Infektion der Epithelzellen mit Candida albicans . . . . . . . . 56 2.9.4 Adhärenzassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2.9.5 Lebend/Tot-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2.9.6 Annexin-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 2.9.7 Färbung des Aktin-Zytoskeletts und des Zellkerns . . . . . . . 59 2.9.8 Analyse der Oberflächenrezeptoren der Epithelzellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.9.9 Nachweis des Zytokins IL8 mittels ELISA . . . . . . . . . . . 61 2.10 Genexpressionsanalysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 2.10.1 Isolation von RNA aus humanen Zellen . . . . . . . . . . . . . 62 2.10.2 Isolation von RNA aus Candida albicans . . . . . . . . . . . . 62 2.10.3 Konzentrationsbestimmung und Qualitätskontrolle der RNA . 63 2.10.4 Genexpressionsanalyse von Candida albicans . . . . . . . . . 64 2.10.5 cDNA-Synthese und RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 3 Ergebnisse 3.1 67 Methodenetablierung an der HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.1.1 Analytik organischer Säuren und Kohlenhydrate . . . . . . . . 67 viii 3.1.2 3.2 Aminosäureanalytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Untersuchungen zum Wachstum und Metabolismus von Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 3.2.1 Wachstum und Metabolismus von C. albicans in verschiedenen Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 3.2.2 Einfluss von LL-37 auf Wachstum und Metabolismus von Candida albicans 3.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Wachstum von Candida albicans unter Zugabe von LL-37 in Mikrotiterplatten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.3.1 Bestimmung der optischen Dichte . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.3.2 CFU-Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 3.4 Einfluss von LL-37 auf die Hyphenbildung . . . . . . . . . . . . . . . 86 3.5 Veränderung der Genexpression von C. albicans bei Wachstum in LL37-haltigem Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.6 Beeinflussung der Adhärenz von Candida albicans durch LL-37 . . . . 99 3.6.1 Adhärenz von C. albicans an Glasoberflächen . . . . . . . . . . 99 3.6.2 Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen . . . . . . . . . . . 100 3.6.3 Untersuchung der Infektion im Adhärenzassay unter dem Rasterelektronenmikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 3.6.4 F-Aktinfärbung an infizierten Epithelzellen . . . . . . . . . . . 105 3.6.5 Lebend/Tot-Färbung im Adhärenzassay . . . . . . . . . . . . 105 3.6.6 Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen nach vorheriger Behandlung mit LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 3.7 Adhärenz von Candida albicans Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . 109 3.8 Wirkung des AMP LL-37 auf Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . 111 3.8.1 Toxizität von LL-37 auf Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . 111 3.8.2 Einfluss von LL-37 auf die Pattern Recognition-Rezeptoren der Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 3.8.3 LL-37-induzierte Bildung von IL8 . . . . . . . . . . . . . . . . 113 3.8.4 Einfluss von LL-37 auf die Expression der PRR und des Zytokins IL8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 4 Diskussion 117 4.1 Metabolische Analysen liefern molekulare Ziele . . . . . . . . . . . . . 118 4.2 Wirkung von LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 4.2.1 Wirkung von LL-37 auf C. albicans . . . . . . . . . . . . . . . 120 ix 4.3 4.2.2 Wirkung von LL-37 auf Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . 123 4.2.3 Wirkung von LL-37 auf die Infektion . . . . . . . . . . . . . . 125 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Literaturverzeichnis 133 A Abkürzungsverzeichnis 155 B verwendete Geräte 161 C Verbrauchsmaterialien 164 D Chemikalien 167 E Inhaltsverzeichnis des digitalen Anhangs 170 Danksagung 171 x Abbildungsverzeichnis 1.1 Zentraler Metabolismus in der Abwesenheit von Glucose . . . . . . . 4 1.2 Citronensäure- und Glyoxylat-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.3 Parasexueller Zyklus von Candida albicans 7 1.4 Morphologische Wachstumsformen von C. albicans 1.5 Signaltransduktionswege, die zu der Expression hyphenspezifischer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Gene führen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.6 Übersicht der wichtigsten PRRs (Pattern Recognition Receptors) bei der Erkennung von C. albicans 1.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Schematische Darstellung der Interaktion zwischen C. albicans und angeborenem Immunsystem des Wirts an mukosalen Oberflächen . . . 20 1.8 Modelle, die die Membranzerstörung durch antimikrobielle Peptide beschreiben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.9 Bindungsverhalten antimikrobieller Peptide an Membranen eukaryotischer und prokaryotischer Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 1.10 Übersicht der Funktionen antimikrobieller Peptide in der Verteidigung des Wirts gegenüber Pathogenen . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.11 Schematische Darstellung der Prozessierung von Cathelicidin hCAP18 30 2.1 Zählgitter einer Neubauer improved Zählkammer . . . . . . . . . . . . 46 2.2 Schematischer Aufbau der verwendeten HPLC-Anlage . . . . . . . . . 50 2.3 OPA-Derivatisierung von primären Aminosäuren . . . . . . . . . . . . 51 2.4 Reduktion von CFDA-SE zu CFSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.5 Reduktion von Resazurin zu Resorufin . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 2.6 Umwandlung des membrangängigen Calcein AM zu dem fluoreszierenden Calcein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 2.7 Elektropherogramm einer RNA-Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . 63 3.1 Chromatogramme der getesteten Standards in der Analyse der organischen Säuren und Kohlenhydraten mittels HPLC . . . . . . . . . . 69 xi 3.2 Chromatogramm der Analyse eines Aminosäurestandardgemisches mittels HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 3.3 Überprüfung der Stabilität des OPA-Derivates . . . . . . . . . . . . . 70 3.4 Wachstumskurven von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C . . 72 3.5 Konzentrationen der extrazellulären organischen Säuren und Glucose bei Wachstum von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C . . . . . 74 3.6 Konzentrationen der extrazellulären Aminosäuren bei Wachstum von SC5314 in RPMI-MOPS pH 7,4 bei 37◦ C . . . . . . . . . . . . . . . . 75 3.7 Glucosekonzentrationen und gebildete Biomasse bei der Kultivierung von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C . . . . . . . . . . . . . 76 3.8 Konzentrationen der intrazellulären Aminosäuren bei Wachstum von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C . . . . . . . . . . . . . . . 77 3.9 Wachstumskurve nach OD-Messung und Trockenmasse in RPMIMOPS pH 7,4 mit und ohne LL-37 bei 37◦ C . . . . . . . . . . . . . . 78 3.10 Konzentrationen der extrazellulären organischen Säuren und Glucose bei Wachstum von C. albicans SC5314 in RPMI-MOPS pH 7,4 ohne und mit LL-37 bei 37◦ C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.11 Glucosekonzentrationen bei der Kultivierung von SC5314 in RPMIMOPS pH 7,4 mit und ohne LL-37-Behandlung bei 37◦ C . . . . . . . 80 3.12 Zusammensetzung der extrazellulären Aminosäuren bei Wachstum von C. albicans SC5314 in RPMI-MOPS pH 7,4 ohne und mit LL37 bei 37◦ C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 3.13 Wachstum von C. albicans SC5314 bei 30◦ C unter LL-37-Behandlung in YPD-Medium und YNB pH 5,6-Medium . . . . . . . . . . . . . . . 83 3.14 Veränderung der Zellgröße von C. albicans bei Kultivierung in YNB pH 5,6 nach 1 h und 6 h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.15 Wachstum von C. albicans SC5314 bei 37◦ C unter LL-37-Behandlung in YNB pH 5,6-Medium und RPMI-MOPS pH 7,4 . . . . . . . . . . . . 84 3.16 Einfluss von LL-37 auf das Wachstum von C. albicans SC5314 in YNB pH 5,6 und in RPMI-MOPS pH 7,4 bei 37◦ C . . . . . . . . . . . 85 3.17 Einfluss von LL-37 auf die Hypheninduktion (Reporterassay) . . . . . 86 3.18 Einfluss von LL-37 auf das Hyphenwachstum (Hyphenlängenmessung) 87 3.19 Principal Component Analyse der Datensets 1-3 der GanzgenomUntersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 3.20 Heatmap mit 73 Genen, die in C. albicans SC5314 bei Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 differenziell exprimiert wurden . . . . . . . . . . 89 xii 3.21 Venn-Diagramm der differentiell exprimierten Gene LL-37- behandelter C. albicans SC5314 im Vergleich zu unbehandelten Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 3.22 Zuordnung der signifikant regulierten Gene (Datenset 1-3, lfc1, pValue <0,05) zu zellulären Prozessen mit Hilfe des CGD Gene Ontology Slim Mapper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 3.23 Molekulare Ziele von LL-37 im Metabolismus von C. albicans . . . . 94 3.24 Einfluss von LL-37 auf die Adhärenz von SC5314 an Glasoberflächen und Epithelzellen A431 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 3.25 LL-37 verstärkt die Adhärenz von SC5314 an Caco2- und A549-Zellen 101 3.26 LL-37 verstärkt die Adhärenz von verschiedenen C. albicans-Stämmen an A431 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 3.27 LL-37 erhöht die Anzahl adhärenter lebender C. albicans an Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 3.28 LL-37 erhöht die Anzahl adhärenter C. albicans an Epithelzellen unter serumhaltigen Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 3.29 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Infektion von A431 mit SC5314 unter Zugabe von LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 3.30 Aktinfärbung an C. albicans SC5314-infizierten Epithelzellen . . . . . 105 3.31 Lebend/Tot-Färbung an infizierten A431- und Caco2-Zellen nach LL37-Behandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 3.32 Lebend/Tot-Färbung an infizierten A431-Zellen nach LL-37- Behandlung in serumhaltigem Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 3.33 Einfluss einer Vorbehandlung der Epithelzellen A431 mit LL-37 auf die Adhärenz von C. albicans SC5314 und die Vitalität der Epithelzellen109 3.34 Einfluss von LL-37 auf die Adhärenz verschiedener C. albicans Mutanten an A431 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 3.35 Toxizitätstests an A431, Behandlung mit LL-37 und Methanol als Kontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 3.36 Annexin-Färbung an A431-Zellen nach LL-37-Behandlung . . . . . . 112 3.37 Detektion der PRRs an der Zelloberfläche der Epithelzellen A431 nach Behandlung mit LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 3.38 Histogramme der Durchflusszytometrie PRR-gefärbter Epithelzellen A431 nach Behandlung mit LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 3.39 IL8-Konzentration in den Überständen LL-37-behandelter Epithelzellen A431 und A549 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 xiii 3.40 Expression der Gene CLEC7A, CXCR4, IL8, TLR2, TLR4 und des Housekeepers GAPDH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 xiv Tabellenverzeichnis 1.1 Humane antimikrobielle Peptide: Defensine und Cathelicidin . . . . . 34 1.2 Veränderte Expression von LL-37 in immunvermittelten inflammatorischen Krankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.4 verwendete Candida albicans-Stämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.5 Übersicht der angewendeten HPLC-Methoden . . . . . . . . . . . . . 52 2.6 Verwendete Kulturgefäße und Mediumvolumina in der Zellkultur . . . 54 2.7 Verwendete Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.8 Übersicht der in der RT-PCR verwendeten Primer . . . . . . . . . . . 66 3.1 Detektionslimits der Analyse der organischen Säuren und Kohlenhydrate mittels der Rezex-ROA-Säule in der HPLC . . . . . . . . . . . 68 3.2 Detektionslimits der Analyse OPA-markierter primärer Aminosäuren mittels der Zorbax EclipseC18plus-Säule in der HPLC . . . . . . . . . 70 3.3 Glucoseaufnahmeraten der C. albicans-Kulturen in verschiedenen Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 3.4 Glucoseaufnahmeraten der C. albicans-Kulturen mit oder ohne LL37-Behandlung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 3.5 Liste der positiv regulierten Gene in C. albicans SC5314 bei Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 3.6 Liste der negativ regulierten Gene in C. albicans SC5314 bei Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 xv xvi Kapitel 1 Einleitung 1.1 1.1.1 Candida albicans Historische Aspekte Die ersten beschriebenen Krankheitsbilder, die auf eine Infektion mit Candida albicans schließen lassen, führen zu Hippokrates ins vierte Jahrhundert v. Ch. zurück. Die heute als Soor bezeichnete Krankheit galt damals und noch bis ins frühe 20. Jahrhundert hinein als Defekt des Erkrankten und wurde beispielsweise 1920 von Aldo Castellani als krankhafte „Sekretion der Mundschleimhaut“ bezeichnet. Im Jahr 1839 konnte der Erreger C. albicans von Langenbeck erstmalig isoliert werden und 8 Jahre später wurde er von Charles-Philippe Robin als Oidium albicans bezeichnet. 1923 wurde der Erreger aufgrund neuer taxonomischer Erkenntnisse von Christine M. Berkhout der Gattung Candida zugeordnet. 21 Jahre später erfolgte die offizielle Festlegung des taxonomischen Namens Candida albicans [1]. Somit gehört der Pilz zur Ordnung der Saccharomycetales im Stamm der Schlauchpilze (Ascomycota), dem das Reich der Pilze übergeordnet ist. Die Gruppe der Pilze umfasst 1,5 Millionen Arten mit einer nahezu ubiquitinären Verbreitung. Nur 150 bis 200 Arten können den Menschen infizieren. Zu diesen gehören neben Candida albicans auch Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidiis und Cryptococcus neoformans [2]. 1.1.2 Eigenschaften Die eukaryotische Hefe C. albicans ist diploid und verfügt über 8 Chromosomen. Die Genomgröße umfasst ca. 13,4 Mb, die 6200 Gene kodieren [3]. Eine Besonderheit, 1 2 Einleitung die C. albicans mit den Spezies C. paropsilosis und C. tropicalis gemeinsam hat, liegt in der Kodierung der Aminosäuren. Das Triplet CUG wird seltener in Leucin als in Serin translatiert [4]. Die Zellwand von C. albicans ist in zwei Hauptschichten gegliedert. Das Skelett der inneren Schicht wird aus β-1,3-Glucanen gebildet, die kovalent an β-1,6Glucanen und Chitin gebunden sind. Durch Wasserstoffbrückenbindungen zu benachbarten Polysaccharidketten kommt es zu der Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerks von Mikrofibrillen. Die äußere Schicht der Zellwand besteht hauptsächlich aus Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker-abhängigen Zellwandproteinen (GPI-CWPs). Diese Proteine sind mit Mannose-enthaltenden Polysacchariden, den sogenannten Mannanen, stark glycolysiert. Eine Verbindung der äußeren Schicht mit der inneren Schicht erfolgt für die GPI-CWPs über GPI-Reste, die an β-1,6-Glucane binden. Die Mannoproteine (Pir-CWP), die interne Repeat-Domänen aufweisen, gehen eine Bindung mit β-1,3-Glucanen oder Chitin ein [5]. 1.1.3 Klinische Relevanz C. albicans ist ein opportunistisches Pathogen der menschlichen Mikroflora. Er besiedelt meist asymptomatisch den Gastrointestinal- und Vaginaltrakt sowie die Schleimhäute der Mundhöhle bei 30 - 60 % der Menschen [6]. Eine leichte Beeinträchtigung des Immunsystems oder eine Veränderung der Zusammensetzung der Mikroflora können jedoch ausreichend für einen Übergang in die pathogene Form sein. Oberflächliche Infektionen der Haut und der Schleimhäute sind sehr weit verbreitet. So durchleben 75 % der Frauen mindestens einmal in ihrem Leben eine vulvovaginale Kandidose [2]. C. albicans-Infektionen können aber auch invasiv (systemisch) sein. Aufgrund einer Verletzung der Haut oder der Schleimhäute kann C. albicans in die Blutbahn eindringen und dort Infektionen, sogenannte Kandidämien, auslösen. Eine weitere Verbreitung zu inneren Organen wie Niere, Milz, Leber, Herz sowie Lunge und eine Besiedlung dieser ist dann möglich. Im gesunden Menschen treten diese schwerwiegenden Formen von Candida-Infektionen nicht auf. Eine Reihe prädisponierender Faktoren unterschiedlichen Ursprungs spielen hierbei eine Rolle. Dazu zählen physiologische (Alter, Schwangerschaft) oder traumatische (Verletzung, Verbrennung) Faktoren. Ebenso haben Personen mit Vorerkrankungen wie Diabetes mellitus, AIDS, Leukämie und anderen Krebserkrankungen, aber auch organtransplantierte Menschen und Patienten auf Intensivstationen ein erhöhtes Risiko, an Einleitung 3 einer invasiven Kandidose zu erkranken. Die mit diesen Erkrankungen verbundenen Therapien, wie Chemotherapie oder die Gabe von Breitbandantibiotika, künstlicher Ernährung und Dauerkatheter, begünstigen die Entwicklung von Kandidosen [7]. Bei der Betrachtung der Sterberaten wird die Schwere dieser Erkrankung deutlich. Je nach Fall und Risikofaktoren liegt diese bei 50 - 75 % [8]. Die Symptome einer systemischen Kandidose ähneln denen einer bakteriellen Sepsis. Eine Behandlung nach erfolgter Diagnose führt meist nicht zur Heilung, da die Infektion schon zu weit fortgeschritten ist. Daher erfolgt in den oben genannten Indikationsfällen eine prophylaktische Behandlung mit antifungischen Präparaten. Trotz aller medizinischer Fortschritte haben in den letzten 10 Jahren die Fälle invasiver Kandidosen um das 10-fache zugenommen. Candida ssp., darunter C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis und C. tropicalis, sind derzeit die dritthäufigste Ursache nosokomialer Blutbahninfektionen und die zweithäufigste Todesursache von Infektionen dieser Art in den USA [8]. Eine wichtige Ursache hierfür ist die Entwicklung von Resistenzen. 1.1.4 Virulenzfaktoren Als Pathogenität bezeichnet man die Fähigkeit eines Organismus ein anderes Lebewesen zu schädigen. Das Ausmaß der Pathogenität, die Virulenz, und somit das Potential im Wirt eine Krankheit auszulösen, wird durch Virulenzfaktoren bestimmt. Die große Flexibilität und Anpassungsfähigkeit, die C. albicans dazu befähigt, verschiedenste Bereiche des Wirts zu infizieren und verschiedene Formen der Infektion auszulösen, spricht für eine starke genomische Spezialisierung. Im Folgenden werden einzelne Virulenzfaktoren des weit gefächerten Spektrums von Candida albicans näher erläutert. 1.1.4.1 Metabolische Flexibilität Ein Organismus kann nur wachsen, wenn er Nährstoffe assimilieren kann. Da C. albicans ein breites Spektrum unterschiedlicher Nischen im menschlichen Körper besiedelt (siehe Kapitel 1.1.3), muss der Mikroorganismus ein hohes Maß metabolischer Flexibiliät besitzen, Nährstoffe aufnehmen und verwerten zu können. Zu den wichtigsten und am besten untersuchten Substanzen im Bezug auf den Metabolismus von C. albicans sind Kohlenstoff, Stickstoff und Eisen [9]. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle von Candida albicans sind Zucker, insbesondere Glucose. Des weiteren kann C. albicans auch sogenannte alternative Kohlenstoffquellen verwerten. Zu diesen gehören neben Ethanol und Acetat auch Aminosäuren, 4 Einleitung Abbildung 1.1: Zentraler Metabolismus in der Abwesenheit von Glucose. Biochemische Wege sind in Boxen dargestellt. Schlüsselgene, die infolge von limitierenden Bedingungen induziert werden, sind im grau hinterlegten Teil der Boxen beschrieben. Die ovalen Elemente stellen Zwischenprodukte dar. Alternative Kohlenstoffquellen sind links (weiße Pfeile), katabolische Produkte sind rechts genannt (graue Pfeile). CSZ - Citroenensäurezyklus, nach [10] Glycerin und Fettsäuren. Diese Substanzen werden, wie in Abbildung 1.1 gezeigt, über die drei Hauptwege β-Oxidation von Fettsäuren, Glyoxylatzyklus und Gluconeogenese metabolisiert [10]. Wird das Pathogen beispielsweise während des Infektionsprozesses durch Makrophagen phagozytiert, zeigt der Metabolismus einen Wechsel in einen Zustand, der kohlenstofflimitierenden Bedingungen gleicht. Es werden glycolytische Gene herunterreguliert, während Gene des Glyoxylatzyklusses (Isocitratlyase - ICL1, Malatsynthase - MLS1, Malatdehydrogenase - MDH1) und der Gluconeogenese (Phosphoenolpyruvatkinase - PCK1, Fructose-1,6-bisphosphatase - FBP1) aktiviert werden [11]. Dass dieser metabolische Wechsel für den eigentlichen Infektionsprozess von Bedeutung ist, zeigen Untersuchungen von Deletionsmutanten. So konnte gezeigt werden, dass Deletionen der Gene ICL1, MDH1 und PCK1 eine geringere Virulenz im Mausmodell bewirken [12, 13]. Die primäre Funktion des Glyoxylatzyklusses ist es, ein Wachstum nur auf der Basis verfügbarer C2-Komponenten, wie z.B. Ethanol und Acetat, zu vermitteln. Der Zitronensäurezyklus (siehe Abbildung 1.2), der ebenso über C2-Komponenten gespeist wird, ermöglicht dem Organismus aufgrund von zwei Decarboxylierungs- Einleitung 5 Abbildung 1.2: Citronensäure- und Glyoxylat-Zyklus: Das Schema zeigt die grundlegenden enzymatischen Schritte des Citronensäure-Zyklus (schwarze Linien), der in allen Organismen vorkommt. Der für Mikroorganismen und Pflanzen spezifische Glyoxylat-Zyklus ist in gestrichelten Linie dargestellt. Schritte, die von beiden Wegen genutzt werden, sind durch dicke Linien gekennzeichnet. PEP - Phosphoenolpyruvat, nach [14] schritten keine Kohlenstoffassimilierung. Der als Bypass zu sehende Glyoxylatweg arbeitet ohne Decarboxylierung. Somit können die C2-Komponenten als Kohlenstoffquellen in die Gluconeogenese eingespeist werden (siehe Abbildung 1.2). In diesem Weg erfolgt die Synthese von Glucose, die dann für die Herstellung von Aminosäuren, DNA und RNA verwendet werden kann [14]. Ebenso essentiell für das Wachstum ist Stickstoff. Mögliche wirtseigene Stickstoffquellen für C. albicans sind Aminosäuren, Peptide und Proteine. Das Candida-Genom kodiert 20 Aminosäure-Permeasen, die die aktive Aminosäureaufnahme vermitteln. Des weiteren können zwei Ammonium-Permeasen gebildet werden, die durch die Gene MEP2 und MEP3 kodiert werden. Die Familie der sekretierten Aspartyl-Proteinasen (SAPs, siehe Kapitel 1.1.4.4 ) ermöglichen den Aufschluss extrazellulärer Wirtsproteine. Die dadurch entstehenden Oligopeptide, werden durch Oligopeptid-Transporter (OPT1-OPT8) in die Zelle transportiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine induziert werden, wenn C. albicans mit Neutrophilen co- 6 Einleitung kultiviert oder durch Makrophagen phagozytiert wird [15, 13, 16]. Nahezu alle Mikroorganismen benötigen Eisen (Fe3+ ) für ihr Wachstum. Ebenso ist Eisen für verschiedene wirtseigene metabolische Prozesse unverzichtbar. Um dieses limitierte Ion zu sichern, hat der Wirt Verteidigungsstrategien entwickelt. So liegt Eisen nicht frei vor, sondern wird an Eisenspeicherproteinen gebunden. Man spricht hier von Nahrungsmittel-Immunität (Nutritional Immunity). Zu diesen Speicherproteinen zählen Hämoglobin, Transferrin, Lactoferrin, Ferritin. Mikroorganismen haben wirksame Gegenmechanismen entwickelt. C. albicans nutzt beispielsweise drei hochaffine Aufnahmesysteme. Das erste System umfasst ein ReduktasePermease-System, das sich aus den Eisenpermeasen Ftr1 und Fet3 sowie dem Kupfertransporter Ccc2 zusammensetzt. Das Siderophor-Aufnahmesystem besteht aus dem Transportern Arn1/Sit1 und das Hämoglobin-Aufnahmesystem aus dem Hämoglobinrezeptor Rbt5 und der Hämoxygenase Hmx1 [17, 18, 9]. C. albicans besitzt nicht nur die Fähigkeit, sich an einzelne sich ändernde Nährstoffbedingungen anzupassen, sondern auch schnell auf sogenannte Stressbedingungen zu reagieren. Zu den Stressoren zählen hierbei unter anderem Temperatur- oder pH-Wert-Wechsel der Umgebung, aber auch hohe Mengen an Sauerstoff oder CO2 sowie die Größe des osmotischen Drucks. Eine Kombination aus mehreren Stressoren ist möglich. Im folgenden sollen zwei Beispiele näher erläutert werden: C. albicans kann im Magen bei pH 2, aber auch im leicht alkalischen Blut (pH 47,6) überleben. Ebenso kann Candida im aziden Milieu der Vagina (pH 4,4) die Schleimhäute besiedeln. Die Detektion des pH-Wertes erfolgt über Oberflächensensoren (z.B. DFG16), die Regulation über das Rim101-Signalsystem [19, 20, 9]. Im Laufe des Infektionsprozesses ist C. albicans unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen ausgesetzt und muss demzufolge den Metabolismus diesen Bedingungen anpassen. Auf der Haut und in der Mundhöhle beispielsweise liegen aerobe und semiaerobe Bedingungen vor, im Darm anaerobe Bedingungen. So hat C. albicans Wege, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) über die Atmungskette zu entgiften [21] und durch Fermentation gebildete Säuren und Ethanol metabolisch zu nutzen (siehe Abbildung 1.1). 1.1.4.2 White-Opaque Switching Trotz fehlendem oder noch nicht vollständig gezeigtem Sexualzyklus zeigt das Genom von C. albicans eine sehr starke Anpassungsfähigkeit an seine Umwelt. Nahezu jedes Gewebe kann in Anhängigkeit vom Immunstatus des Wirts angegriffen wer- Einleitung 7 den. Mit Hilfe des Multi-Locus Sequence Typing (MLST) konnten C. albicans-Isolate in 17 Gruppen unterteilt werden. Diese Untergruppen korrelieren mit dem geographischen Gebiet ihrer Isolation und zeigen Unterschiede hinsichtlich der Resistenz gegenüber antifungischen Substanzen und der Struktur von Adhäsionsproteinen in der Zellwand [22]. Der komplizierte Mechanismus des Matings ist ein Grund für diese Diversität. Ein wesentlicher Teil des Matings ist das sogenannte „White-OpaqueSwitching“ [23]. Hierbei handelt es sich um einen spontanen und reversiblen Wechsel (Frequenz 1:1000) zwischen zwei Erscheinungsformen von Candida albicans auf festem Medium: der „weißen“ und der „opaken“ Form. Während die weißen Kolonien eine rund, hemisphärische Form aufweisen und aus runden bis ovalen Zellen bestehen, sind die Kolonien der opaken Form flach und grau und ihre Zellen langgezogen bis bohnenförmig. Nur opake Zellen können den Prozess des Matings vollziehen. Kontrolliert wird dieser Mechanismus durch den Mating-Typ Locus (MTL). Dieser besteht aus zwei Allelen (siehe Abb. 1.3). Weiße Zellen sind normalerweise heterozygot im MTL (Mat a/α). Ein Wechsel zu der opaken Form ist nur möglich, wenn die Zellen homozygot im MTL sind (Mat a/a bzw. Mat α/α). Das Mating ist wiederum nur unter den beiden verschiedenen homozygoten opaken Formen möglich. Reguliert wird dieser Wechsel durch den Transkriptionsfaktor Wor1, der die Abbildung 1.3: Parasexueller Zyklus von Candida albicans . (A) Die diploide Hefeform, die homozygot (a/a oder α/α) im MTL ist, kann einen phenotypischen Wechsel von dem weißen in den Mating-kompetenten opaken Zustand vollziehen. Ein Mating opaker Zellen des gegensätzlichen Mating-Typs führt zur Bildung einer tetraploiden aa/αα Zygote, die durch Chromosomenverlust in den diploiden Zustand zurückkehrt. (B) Der Transkriptionsfaktor Wor1 verstärkt seine eigene Transkription und die der Gene der opaken Phase. In Zellen, die heterozygot im Matingtyp sind, wird die Expression von Wor1 durch den heterodimeren Genregulator a1/α2 reprimiert, so dass die Zellen in der weißen Form verbleiben und somit kein Mating vollziehen können nach [24]. 8 Einleitung Transkription von Genen der opaken Form initiiert und sich selbst positiv reguliert. Der im heterozygoten Zustand des MTL gebildete heterodimere Repressor a1/α2 inhibiert Wor1. Somit wird der weiße Zustand stabilisiert. Unter seltenen Umständen können die Konzentrationen des Transkriptionsfaktors jedoch ansteigen. Die Selbstverstärkung und somit die Transkription der opaken Gene beginnt. Alle Voraussetzungen für den Wechsel zur opaken Wachstumsform und somit zum Mating sind gegeben. Nach dem Entstehen der tetraploiden Zygote kommt es jedoch nicht zur Meiose. Hierfür fehlen C. albicans essentielle Regulatoren. Der diploide Status wird durch Chromosomenverlust wiederhergestellt, so dass man bei dieser Art genetischer Rekombination eher von einem parasexuellen als von einem sexuellen Weg sprechen kann [25, 24]. 1.1.4.3 Dimorphismus Dass C. albicans ein großes Spektrum morphologischer Veränderungen als Anpassung an die verschiedenen Begebenheiten im Wirt besitzt, soll auch das folgende Charakteristikum zeigen, das sich C. albicans in der Gruppe der Candida-Spezies nur mit C. dubliniensis teilt. C. albicans kann zwischen vier verschiedenen Wachstumsmorphologien wechseln (siehe Abbildung 1.4). Man spricht von Dimorphismus und unterscheidet hauptsächlich zwischen Hefeform (Blastoconidien) und echten Hyphen und den Wachstumsformen der Pseudohyphen und Clamydosporen [26]. Die letztere Form der Clamydosporen ist bisher am wenigsten in ihrer Funktion aufgeklärt. Es handelt sich hierbei um große, runde Zellen, die eine auffällige dicke Zellwand aufweisen. Gebildet werden sie in bestimmten nährstoffarmen Medien [27]. Das Wachstum in der runden bis ovalen Hefeform erfolgt hauptsächlich bei 30◦ C und azidem pHWert durch Zellteilung. Die echten Hyphen werden bei einer Umgebungstemperatur von 37◦ C und neutralem pH-Wert sowie Anwesenheit von Serum und hohem CO2 Gehalt gebildet. Sie erscheinen 30 - 60 min nach Induktion als langgestreckte, polarisierte Ausläufer ohne Septum an der Knospungsstelle. Innerhalb der langgestreckten Hyphe, jedoch nicht an der Knospungsstelle, können durch Zellteilung entstandene Septen erkennbar sein. Ein Wachstum in dieser Morphologie erscheint nach 24 h als Myzel. Die in ihrer Länge sehr variablen Pseudohyphen entstehen durch Teilung. Es kommt hierbei aber nicht zu einer vollständigen Trennung von der Mutterzelle. Die in die Länge wachsenden Knospen behalten eine Einschnürungen an der Knospungsstelle. Die äußeren Bedingungen, die die Ausbildung von Pseudohyphen induzieren, Einleitung 9 Abbildung 1.4: Morphologische Wachstumsformen von C albicans. Hefe und Hyphenform treten während der Infektion hauptsächlich auf. Tochterzellen und ihr Entstehungsort sind durch gepunktete Linien dargestellt. nach [28] nehmen eine Zwischenstellung zwischen denen der Hefen- und Hyphenbildung ein. Es wird vermutet, dass auch die Morphologie einem Zwischenstatus entspricht. C. albicans kann, wie in Abbildung 1.4 gezeigt, zwischen den Wachstumsformen wechseln. Diesem Wechsel liegt ein verzweigtes regulatorisches Netzwerk zugrunde. Infolge verschiedener äußerer Signale wie z.B. Temperatur, CO2 -Gehalt, pH-Wert, Verfügbarkeit von Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen werden unterschiedliche Signalkaskaden angeschaltet (für eine genaue Beschreibung der Signalwege siehe Abbildungstext zu Abbildung 1.5). Als Beispiel für ein wachstumsformregulierendes Signal sei hier das Quorum-Sensing Molekül Farnesol genannt. Quorum-Sensing ist ein Prozess, der der Kommunikation zwischen Zellen dient. Extrazelluläre Signalmoleküle ermöglichen die Interaktion zwischen Mikroorganismen. Unter Prokaryonten ist dies lang bekannt und gut untersucht, für Candida ssp. ein sehr neu beschriebenes Phänomen. In Kulturen mit hoher Zelldichte setzt C. albicans unter anderem Farnesol frei, das das Hyphenwachstum inhibiert und das Wachstum in der Hefeform induziert [29]. Bisher konnte nicht gezeigt werden, dass eine bestimmte Wachstumsform im direkten Zusammenhang mit der Entwicklung von Krankheiten steht oder bestimmend 10 Einleitung Abbildung 1.5: Signaltransduktionswege, die zu der Expression hyphenspezifischer Gene führen. Umgebungsparameter aktivieren verschiedene Signalwege, die zu der Aktivierung unterschiedlicher Transkriptionsfaktoren (TF) führen. Der cAMP-abhängige Signalweg zielt auf einen der Schlüsselfunktions-tragenden TF Efg1 (enhanced filamentous growth protein 1 ). Hier vereinen Adenylylzyklasen verschiedene Signale in Ras-abhängige und Ras-unabhängige Wege. Durch den TF Tup1, dessen Ziel Promotoren hyphenspezifischer Gene sind, wird durch die DNA-bindenden Proteine Nrg1 und Rfg1 (Rox1p-like regulator of filamentous growth) eine negative Regulation hergestellt. Die Eigenschaften der Proteine ist wie folgt farblich kodiert: MAPK(mitogen-activated protein kinase)-Wege (grün), cAMP-Weg (türkis), TF (orange), negative Regulatoren (gelb), Matrix-einschließender Weg (hellblau), pH-regulierter Weg (braun), weitere involvierte Faktoren (lila). [30] für das Ausmaß der Infektion ist. Vielmehr scheint das Zusammenspiel beider Formen, also der mögliche Wechsel zwischen den Morphologien, wichtig zu sein [31]. So wird vermutet, dass die Hefeform für die Verbreitung von C. albicans in der Blutbahn notwendig ist, wohingegen die filamentöse Wachstumsform für das Durch- Einleitung 11 brechen von Barrieren unverzichtbar ist. Deutlich wird auch, dass die Expression von Zellwandproteinen, wie z.B. von Adhäsinen und extrazellulären Proteasen (siehe Kapitel 1.1.4.4), zwischen den Wachstumsformen sehr stark variiert [32]. 1.1.4.4 Adhärenzproteine Der erste wichtige und initiale Schritt in der kommensalen Beziehung und im Infektionsprozess ist die Adhärenz des Pathogens an den Wirt. Dies wird durch biomolekulare Adhäsine vermittelt, die eine Bindung zwischen C. albicans und Wirtszellen oder Wirtszellliganden herstellen [31]. Eine Auswahl dieser Adhäsine soll im Folgenden näher beschrieben werden. Eine Vielzahl weiterer interessanter Proteine ist an der Adhärenz von C. albicans an Wirtszellen beteiligt, wie z.B. Mannan-, Lectinund Fimbrien-Adhäsine. Jedoch konnten für diese die kodierenden Gene noch nicht isoliert werden. Als-Proteine (agglutinin-like sequence proteins) sind eine Proteinfamilie, die acht Glycoproteine, Als1-7 und Als9, umfasst. Diese binden eine Reihe von Wirtszellen und Proteinen der Extrazellulären Matrix (ECM). Sie weisen typische Merkmale sekretierter Proteine auf. Ihr hydrophober Carboxyl-Terminus ähnelt einem Glycosylphophatidylinositol(GPI)-Anker. Die Als-Proteine gehen eine Bindung mit den Aminotermini von Wirtsproteinen ein. Insbesondere Als1p und Als5p(Ala1p) scheinen adhäsive Funktionen zu erfüllen. So ist das Protein Als1p für die Infektion im Mausmodell essentiell. Die Expression der Als-Proteine erfolgt nicht simultan sondern abhängig von äußeren Bedingungen und der Morphologie von C. albicans [33]. Hwp1p (hyphae wall protein) ist ein Hyphen- und Keimschlauch-spezifisches Mannoprotein, das an der Oberfläche lokalisiert ist. Der Carboxyterminus ist kovalent in der Zellwand an β-Glucane gebunden. Die exponierte aminoterminale Domäne weist eine aminoterminale Sequenz auf, die als Substrat für Transglutaminasen (TGasen) fungiert. Daher können kovalente stabile Bindungen zu Wirtszellen entstehen. C. albicans imitiert auf diese Weise Wirtsproteine. Man spricht hierbei von molekularem Mimikry. Mutanten, die für das Gen hwp1 deletiert sind, zeigen eine reduzierte Virulenz im Mausmodell [34]. Eap1p (enhanced adherence to polystyrene protein 1 ) ähnelt in seiner Struktur dem Adhäsin Als3. So weist es am Aminoterminus eine Substratbindungsdomäne 12 Einleitung und am Carboxyterminus einen GPI-Anker auf. Es konnte gezeigt werden, dass Eap1 die Adhärenz an Plastikoberflächen (Polysteren) verstärkt und wichtige Funktionen in der Adhärenz von C. albicans an die Nierenepithelzelllinie HEK293 sowie in der Bildung von Biofilmen hat [35]. Iff4p ist ein oberflächenexprimiertes Protein, dass wie 11 weiter Proteine zur IffFamilie gezählt wird. Auch dieses Protein besitzt eine GPI-Ankersequenz. Überexpressionsanalysen mit Iff4 zeigten eine verstärkte Adhärenz von C. albicans an orale Epithelzellen und eine erhöhte Virulenz im Mausmodell, aber auch eine stärkere Empfindlichkeit gegenüber der Tötung durch Neutrophile [36]. Int1p ist ein putativ Integrin-ähnliches Protein. Es zeigt Ähnlichkeit zu humanen Integrin-Domänen und zum Fibrinogen-bindenden Protein ClfAp von Staphylococcus aureus. Deletionsmutanten weisen reduzierte Adhärenz und Virulenz an Epithelzellen auf und einen Defekt in der Hyphenbildung [37]. Mnt1p, eine α-1, 2-Mannosyltransferase, ist essentiell für die Synthese von Mannoproteinen. Deletionsmutanten zeigen eine gestörte Bindung untereinander und zu verschiedenen Epithelzellen. sowie eine reduzierte Virulenz im Mausmodell. Dies läst vermuten, dass die Mnt1p-vermittelte Mannosylierung für die Adhäsion und Virulenz von C. albicans wichtig ist [38]. 1.1.4.5 Invasion-vermittelnde Enzyme Die erfolgreiche Invasion von Wirtszellen setzt die Penetration und die Zerstörung der Zellhülle voraus. Dieser als Transmigration bezeichnete Prozess wird hauptsächlich durch physikalische und/oder enzymatische Mittel bewirkt. Die häufigsten chemischen Bestandteile der Oberfläche von Wirtszellen sind Phospholipide und Proteine. C. albicans hat ein reiches Spektrum an Enzymen entwickelt, die eine Zerstörung der Zellmembranbestandteile und somit eine Invasion ermöglichen [39]. Zu diesen Enzymen zählen Phospholipasen und Proteinasen, die im Folgenden näher beschrieben werden: SAP Bei der Familie der sekretierten Aspartyl-Proteinasen (SAP) handelt es sich um eine Gruppe von 10 Proteinasen, die es C. albicans ermöglichen, Proteine als alleinige Stickstoff-Quelle zu nutzen [40]. Die Proteinasen Sap1-8 werden sekretiert, Einleitung 13 Sap9 und 10 sind membranverankerte GPI-Proteine [41]. Die Expression der SAPProteine ist abhängig von der Wachstumsphase und den umgebenden Bedingungen. Ihre genaueren Funktionen sind noch unklar [42]. Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, dass im Vergleich zur oberflächenzerstörenden Funktion der SAP-Proteine die Proteolyse intrazellulärer Verbindungen eine größere Rolle spielt [43]. Extrazelluläre Phospholipasen sind eine heterogene Gruppe von Enzymen, die alle die Fähigkeit besitzen, Esterverbindungen in Glycerolphospholipiden zu hydrolysieren. Bisher wurden 4 Phopholipasen-kodierende Gene in C. albicans identifiziert: PLA, PLB, PLC, PLCD [31]. Die Funktionen sind im einzelnen nicht bekannt. Versuche zeigen jedoch, dass sie wichtig sind für die Penetration von Wirtszellen und die Adhäsion an Epithelzellen [41]. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass die Deletionsmutante ∆PLB1 eine geringere Virulenz im Tiermodell aufweist [39]. Extrazelluläre Lipasen ermöglichen es C. albicans durch die Spaltung von Esterbindungen Lipide als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Bisher wurden 10 Lipasenkodierende Gene (LIP1-10) identifiziert, die eine Homologie von bis zu 80 % in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen. Die genaue Funktion der Lipasen ist im einzelnen noch nicht geklärt [41]. 1.2 Die Interaktion Candida albicans - Wirt Allein die Tatsache, dass Candida albicans als kommensaler Mikroorganismus bei vielen Menschen Teil der normalen Mikroflora in verschiedensten Bereichen des Körpers ist, wie zum Beispiel der Haut, der Schleimhäute oder des Gastrointestinaltraktes [2], lässt vermuten, dass bereits die „gesunde Interaktion“ zwischen Wirt und C. albicans einen äußerst komplexen Gleichgewichtszustand darstellt. Die vielfältigen Möglichkeiten die einen Wechsel in eine pathogene Besiedlung des Wirts herbeiführen, vergrößern die Komplexität des Interaktionssystems und sind das Ergebnis einer langen Co-Evolution des Pilzes und des Menschen. Dabei kam es nicht nur zu einer Anpassung des menschlichen Immunsystems in Bezug auf Mechanismen der Erkennung und der Wachstumskontrolle des Pilzes. Ebenso entwickelte C. albicans Mechanismen, Veränderungen der Wirtsumgebung zu detektieren und darauf zu reagieren [44]. Im Folgenden sollen die Systeme, die diese Interaktion vermitteln, näher erläutert werden. Dabei spielen die beschriebenen spezifischen Virulenzfaktoren, die 14 Einleitung ebenso variieren wie die Antwort der Wirtszellen, eine Rolle und bestimmen über das Ausmaß der Infektion. 1.2.1 Adhärenz Unabhängig davon, ob C. albicans einen Wirt als Kommensale besiedelt oder als Pathogen schwerwiegende Krankheiten hervorruft, initial ist die Adhärenz des Mikroorganismus an Epithelzellen. Dabei korreliert die Virulenz des Pathogens direkt mit seiner Fähigkeit an den Wirtszellen zu adhärieren [45]. Zu den hierfür wichtigsten molekularen Elementen zählen die in Kapitel 1.1.4.4 beschriebenen Adhäsine von Candida albicans. Diese vermitteln zum Teil eine kovalente Bindung des Pathogens an die humanen Zellen. Außerdem spielt die Hydrophobizität von C. albicans eine Rolle. Diese ist durch physikalische Eigenschaften der Pilzzellwand bestimmt und wird durch die Morphologie und Kultivierungsmethode von C. albicans beeinflusst. Hydrophobe Zellen adhärieren einfacher an Wirtszellen und sind resistenter gegenüber der Tötung durch Phagozytose als hydrophile Zellen, da sie weniger Phosphomannanketten besitzen, die als Erkennungsmotiv für die Immunzellen dienen [46, 47]. 1.2.2 Erkennung von C. albicans Die wichtigste Eigenschaft des angeborenen Immunsystem eines Lebewesens ist die Fähigkeit „eigen“ und „fremd“ unterscheiden zu können. Dies erfolgt durch Keimbahn-kodierte, oberflächenexprimierte Rezeptoren, die aufgrund ihrer Fähigkeit fremdartige Strukturen zu erkennen, pattern recognition receptors (PRRs) genannt werden [48]. Sie werden auf verschiedensten humanen Zellen exprimiert, wie z.B. Zellen der oralen Schleimhaut, primären neutrophilen Granulozyten (PMNs), Dendritischen Zellen, Monozyten, Makrophagen, B-Zellen und Epithelzellen. Zu den PRRs zählen unter anderem die membrangebundenen Toll-like Rezeptoren (TLRs), C-Typ Lectin Rezeptoren (CLRs), die zytoplasmatischen NOD-like Rezeptoren (NLRs) und RIG-I-like Rezeptoren (RLRs). Nicht alle PRRs werden in jedem Zelltypen und in allen Regionen des Wirtes gleich exprimiert. Jedes Ligand-Rezeptor System aktiviert spezifische intrazelluläre Signalwege. Durch diese kommt es wiederum zur Aktivierung verschiedener Komponenten der Immunantwort des Wirts. So werden antimikrobielle Peptide, Zytokine, Chemokine und co-stimulierende Moleküle verstärkt exprimiert, die ihrerseits ein breites Wirkungsspektrum haben. Somit vermitteln PRRs zwischen angeborener und adaptiver Einleitung 15 Immunantwort. Die PRRs erkennen typische oberflächenexprimierte, mikrobielle Strukturen, die zusamengefasst werden als PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) [49]. Im Fall von C. albicans zählen zu der Gruppe der PAMPs die Zellwandbestandteile Chitine, Mannane, Phospholipomannane und Glucane [50]. Im Folgenden sollen einzelne Vertreter der PRRs, die in der Erkennung von Candida albicans eine bedeutende Rolle spielen, näher beschrieben werden. Die Abbildung 1.6 zeigt eine Übersicht der genannten Rezeptoren. 1.2.2.1 Toll-like Rezeptoren Die TLRs sind die bisher am ausführlichsten analysierten Rezeptoren in der Gruppe der PRRs. Sie sind evolutionär konserviert und reagieren auf bakterielle, virale und fungische Antigene oder endogene Faktoren, die infolge von Zellverletzung freigesetzt werden. Bisher wurden dreizehn TLRs identifiziert, wovon zehn funktionell im Menschen sind. Die Rezeptoren TLR1, TLR2 und TLR4-6 sind plasmamembranassoziiert, TLR3 bzw. TLR7-9 sind an den Lysosomen oder den Endosomen lokalisiert [52]. TLRs besitzen N-terminale Leucin-reiche Repeats (LRRs), die für die Erkennung der mikrobiellen Strukturen verantwortlich sind. Sie haben außerdem eine transmembrane Region, sowie eine zytoplasmatische TIR-Domäne (Toll-/Interleukin-1(IL-1)Rezeptor). Durch Ligandenbindung erfolgt die Bindung von Adaptermolekülen und somit die Anregung der Signalwege, die zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führen. Es kommt zu der verstärkten Transkription von antimikrobiellen Peptiden, Zytokinen und Chemokinen. Somit beeinflusst die Anregung der TLRs die Aktivität anderer Zellen des Immunsystems [49, 52]. Bei der Erkennung von C. albicans spielen vor allem TLR2 und TLR4 eine Rolle. Phospholipomannane und β-Glucane sind die Liganden des TLR2 und Overbundene Mannane die des TLR4. Diese Rezeptoren werden vor allem in myeloiden Zellen exprimiert. Aber auch Epithelzellen weisen, wenn auch für TLR4 nur in sehr geringen Mengen, diese beiden Rezeptoren an ihrer Oberfläche auf. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass TLR9 C. albicans-DNA erkennt und die Zytokinproduktion in Dendritischen Zellen induziert [51, 53, 50, 54] 1.2.2.2 CLRs Bei den C-Typ Lectin-Rezeptoren handelt es sich hauptsächlich um membranassoziierte Rezeptoren, die mindestens eine Kohlenhydraterkennungsdomäne (carbo- 16 Einleitung Abbildung 1.6: Übersicht der wichtigsten PRRs (Pattern Recognition Receptors) bei der Erkennung von Candida albicans. Der lösliche Lectinrezeptor (Mannose-binding lectin MBL) bindet Mannose-reiche Strukturen von C. albicans. Der membranassoziierte C-Typ Lectin Rezeptor (macrophage mannose receptor 1 - MMR), der für Dendritische Zellen spezifische DC-SIGN (ICAM3-grabbing non-integrin) und der Makrophagen-induzierbare Rezeptor MINCLE erkennen ebenso Mannose-reiche Strukturen. Dectin-1 bindet β-Glucane und Dectin-2 erkennt in Kombination mit dem Fcγ-Rezeptor (FcγR) Mannane (Mannosepolymere). Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) kann O-linked Mannane, TLR2 kann Phospholipomannane oder zusammen mit Galectin-3 β-Mannoside erkennen. TLR9 ist im Zytosol lokalisiert und bindet fungische DNA. Der NOD-like Rezeptor NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing 3 ) bildet zusammen mit Apoptose-assoziierten Speck-like Proteinen einen Inflammasom-Komplex, der eine Caspase-rekrutierende Domäne (ASC) und das Enzyme Caspase 1 einschließt. Die Liganden, die das NLRP3-Inflammasome aktivieren sind bisher unbekannt. CARD9 - caspase recruitment domain-containing protein 9 ; IFNs Interferone; IL-1β - Interleukin-1β; NF-κB - nuclear factor-κ B (nach [51]) hydrate recognition domain - CRD) besitzen und Kohlenhydrate Calcium-abhängig binden. Sie können somit Polysaccharidstrukturen von Mikroorganismen detektieren [52]. Es handelt sich hierbei um eine sehr große Gruppe von Rezeptoren, die eine wichtige Rolle in der Erkennung von Pilzen spielt. Diese Rezeptoren induzieren die Produktion von Zytokinen und beeinflussen somit die angeborene und adapti- Einleitung 17 ve Immunantwort. Darüber hinaus vermitteln sie die Aufnahme von C. albicans in die Zellen z. B. durch Phagozytose. Einige der CLRs werden im Folgenden näher beschrieben: Die Rezeptoren Dectin-1 (CLEC7A) und Dectin-2 (CLEC6A) sind auf der Oberfläche von Dendritischen Zellen, Makrophagen und Neutrophilen zu finden. Dectin-1 konnte auch auf Ephitelzellen nachgewiesen werde [54]. Dieser Rezeptor detektiert β-1,3-Glucane, Dectin-2 erkennt α-Mannose [55, 56]. Der Mannose-Rezeptor (MR) (auch Macrophage Mannose Receptor 1 - MMR) bindet verzweigte N -gebundene Mannane und wird hauptsächlich von Makrophagen und Dendritischen Zellen exprimiert [57]. DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM-3-grab-bing non-integrin) wird wie der MR von Makrophagen und Dendritischen Zellen exprimiert und erkennt αverknüpfte Mannanosestrukturen [58]. Der hauptsächlich auf Makrophagen exprimierte Rezeptor Galectin-3 bindet β-1,2 Mannoside [59]. Ebenso soll das lösliche MBL (mannose-binding lectin) erwähnt werden, dass die Bindung der Mannane sowie die Opsonisierung und Aufnahme von C. albicans vermittelt [60]. Weitere CLRs sind Mincle und SCARF/CD36 (scavenger receptor class F protein), deren Liganden jedoch noch nicht identifiziert werden konnten [61, 62]. 1.2.2.3 NLRs Die zytoplasmatischen NOD-like Rezeptoren (NLRs) erkennen intrazelluläre Pathogene. Charakteristisch für sie sind eine Nukleotidbindungsdomäne und Leucin-reiche Repeats. Für die Erkennung von C. albicans als wichtig erachtet wird NLR3P, welches sich innerhalb eines Proteinkomplexes, der Inflammasom genannt wird, befindet. Das durch intrazelluläre mikrobielle Stimuli aktivierte Inflammasom induziert Caspase 1, die wiederum die Freisetzung von Zytokinen der Interleukin 1(IL-1)Familie bewirkt [63]. 1.2.3 Zytokine Zytokine sind Signalmoleküle, die Differenzierung, Proliferation und Funktion von Säugerzellen regulieren. Das bei einer Infektion vorliegende Zytokinprofil ist bezeichnend und spezifisch für den Abwehrprozess eines pathogenen Organismus. Proinflammatorische Zytokine regulieren Leukozytentransport sowie -proliferation und aktivieren oxidative und nicht-oxidative metabolische Antworten der Zellen auf die 18 Einleitung Infektion [64]. Aufgrund der Tatsache, dass Epithelzellen am häufigsten mit C. albicans in Kontakt treten und in dieser Arbeit insbesondere auf die Interaktion von C. albicans mit Epithelzellen eingegangen wird, soll hier nur die Zytokinantwort dieser Zellen beschrieben werden. Epithelzellen schütten eine Vielzahl proinflammatorischer Zytokine als Antwort auf den Kontakt mit C. albicans aus, jedoch zeigen diese keinen direkten antifungischen Effekt [65]. Verschiedene Studien an oralen Epithelzellen, die an primären Zellen und an etablierten Zelllinien durchgeführt wurden, zeigten die Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β, IL-8, IL-18, TNFα und GM-CSF bei Interaktion mit C. albicans [64, 65, 66, 67, 68]. Multizelluläre Systeme aus Epithelzellen und Fibroblasten, die artifizielle Gewebekultursysteme darstellen, zeigten ähnliche Zytokinprofile mit Ausnahme von IL-6, das nur in diesen Versuchen nachgewiesen werden konnte [69, 70, 71, 72] Die Gruppe um Martin Schaller beschrieb ein Infektionsmodell basierend auf einem kommerziell erhältlichem rekonstruierten humanen oralen Epithelium (reconstituted human oral epithelium - RHE). Dieses dreidimensionale Mukosasystem zeigte bei der Infektion mit C. albicans ein ähnliches Zytokinprofil: IFNγ, TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-6 und IL-8. Bei Anwesenheit von PMNs stiegen die Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β, IL-6, GM-CSF und IL-8 an. Dies wurde von einer Migration der Neutrophilen in das mukosale Epithelium begleitet [73]. Infolge der Expression der oben beschriebenen Zytokine erfolgt der Wechsel vom anti-inflammatorischen zum pro-inflammatorischen Zustand. Es kommt zur Freisetzung von antimikrobiellen Peptiden (AMPs), wie Defensinen, Cathelicidin und Histatinen durch die Epithelzellen [74]. Diese AMPs kontrollieren das Wachstum von C. albicans und somit die Infektion, worauf in Kapitel 1.3 näher eingegangen wird. 1.2.4 Phagozytierende Zellen Phagozyten spielen im Prozess der Kontrolle von Candida-Infektionen eine entscheidende Rolle. Insbesondere PMNs sind unverzichtbar bei der Bekämpfung von oberflächlichen aber auch invasiven Kandidosen [75]. Die Rekrutierung der Neutrophilen zum Infektionsherd wird durch die Ausschüttung einer Reihe von Zytokinen stimuliert. Monozyten und Makrophagen stellen eine weitere Gruppe der phagozytieren- Einleitung 19 den Zellen dar. Die Wichtigkeit ihrer Funktionen in der Bekämpfung von CandidaInfektionen wird kontrovers diskutiert [50]. Die sich in der Haut und in Schleimhäuten befindenden und dort patrouillierenden Dendritische Zellen (DCs) nehmen eingedrungene C. albicans über die Rezeptoren MR und DC-SIGN auf [76, 58]. Dies führt zur Prozessierung und Präsentation von Candida-spezifischen Antigenen über die Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II (MHCII)-Moleküle. Hefe- und Hypheform von C. albicans lösen in den DC unterschiedliche Reaktionen aus. Während die Hefeform eine T-Helferzellen Typ1(Th1)-Antwort induziert, aktiviert die Hyphenform eher eine Th2-Antwort. Somit bilden die DCs die Brücke zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort. Phagozyten töten C. albicans sowohl intrazellulär als auch extrazellulär. Nach der Phagozytose des Pathogens und der Fusion der Lysosomen mit den Phagosomen zu Phagolysosomen erfolgt die Inaktivierung des Pathogens durch hydrolytische Enzyme, antimikrobielle Peptide und reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species - ROS) [77]. 1.2.5 Evasionsstrategien Candida albicans wäre kein so erfolgreiches Pathogen, wenn es nicht im Laufe der Evolution Mechanismen herausgebildet hätte, um die beschriebenen Verteidigungsmechanismen des Wirts zu umgehen. Zu diesen zählt unter anderem der Morphologiewechsel zwischen der Hefe- und der Hypheform (siehe Kap. 1.1.4.3). Dieser gilt als der Hauptvirulenzfaktor. Deletionsmutanten in den Genen efg1 und cph1 sind avirulent bzw. weniger virulent im Mausmodell [78]. Des weiteren zeigen Mutanten, die entweder zum Wachstum in der Hyphen- oder der Hefenform befähigt sind, eine deutlich geringere Virulenz als Wildtystämme [32, 79]. Die Fähigkeit der Hyphenbildung ermöglicht es C. albicans außerdem nach erfolgter Phagozytose aus den Makrophagen herauszuwachsen und diese damit zu töten. Untersuchungen zeigten auch, dass die Hyphenform die Expression von β-Defensinen inhibiert [80]. Im Allgemeinen gilt die Hyphe als invasive Wachstumsform, die Hefeform ermöglicht die freie Verteilung bei systemischen Infektionen. C. albicans kann über zwei Wege in Epithelschichten eindringen. Zum einen ermöglichen die Candida-Adhäsine (siehe Kapitel 1.1.4.4), die bei Kontakt mit den Epithelzellen verstärkt exprimiert werden, eine aktive Penetration. Des weiteren ist es C. albicans auch möglich, Endozytose zu induzieren. Dies erfolgt unter an- 20 Einleitung Abbildung 1.7: Schematische Darstellung der Interaktion zwischen C. albicans und angeborenem Immunsystem des Wirts an mukosalen Oberflächen. Schwarze Linien markieren Wirtsabwehrmechanismen. Rote Linien zeigen Candida Invasions- bzw. Fluchtmechanismen. [50] derem durch das bereits beschriebene Phänomen des Mimikry. So ist das Adhäsin Als3 wirtseigenen Cadherinen sehr ähnlich. Es wurde gezeigt, dass Als3 an ZellZellkontakt-vermittelnden E-Cadherinen bindet und dies die Endozytose des Pilzes induziert [81]. Durch die Beeinflussung der Expression der oberflächenassoziierten PRRs ändert sich die Empfindlichkeit von Epithelzellen gegenüber der Candida-Infektion. So konnte gezeigt werden, dass infolge einer C. albicans-Infektion im oralen RHE-Modell die Expression des TLR4 herunterreguliert wird [82]. Ebenso wird die Produktion von Zytokinen von C. albicans beeinflusst. So wird neben der in Kapitel 1.2.3 genannten, durch Epithelzellen freigesetzten Zytokine auch das Hauptzytokin der Th17-Zellen, IL-17, bei einer Infektion mir C. albicans sekretiert [83]. Dieses Zytokin vermittelt eine Vielzahl proinflammatorischer Funktionen wie Neutrophilenrekrutierung, Aktivierung von Phagozytose und Induktion von AMP-Freisetzung. Einleitung 21 Phagozytierte C. albicans inhibieren die Bildung der Phagolysosomen unterbinden und zudem werden Katalasen und Superoxiddismutasen exprimiert, um die ROS zu inaktivieren [50]. Abbildung 1.7 zeigt eine Übersicht über die genannten Mechanismen, die es C. albicans ermöglichen, das Gleichgewicht der Interaktion zu den Epithelzellen zu beeinflussen. 1.3 Antimikrobielle Peptide Antimikrobielle Peptide (AMP) zählen evolutionär gesehen zu den frühesten Verteidigungsmechanismen von Organismen. Als Teil des angeborenen Immunsystems finden sie eine weite Verbreitung im Reich der Pflanzen und Tiere. Die große Diversität dieser Klasse spiegelt sich in den folgenden Zahlen wider: 2015 antimikrobielle Peptide sind bisher identifiziert und in der Datenbank „The Antimicrobial Peptide Database“ aufgeführt. Ein Drittel davon zeigt antifungische Aktivität (http://aps.unmc.edu/AP/main.php, Stand Juli 2012). Alexander Fläming entdeckte 1922 die erste humane lösliche Substanz, die bakterizide und bakteriostatische Aktivität besitzt. Es handelte sich hierbei um Lysozym, das er erstmals aus dem Nasensekret eines Patienten mit akuter Rhinitis, später auch aus humanen physiologischen Flüssigkeiten und Geweben sowie Hühnereiweiß isolieren konnte [84]. Der außergewöhnlich große Vertreter der AMP ist bekannt durch seine membranzerstörende Aktivität aber auch durch seine nichtenzymatische Tötung von Bakterien [85]. 1963 konnte durch Zeya und Spitznagel gezeigt werden, dass PMNs ein wichtiger Speicher für antibakterielle Proteine sind. Sie untersuchten die Granula der PMN von Kaninchen und Meerschweinchen und konnten zeigen, dass die antibakterielle Wirkung auf lysosomale Proteine zurückzuführen ist, die während der Phagozytose und Degranulierung zu den aufgenommenen Bakterien transferiert werden [86, 87]. 1.3.1 Eigenschaften Die meisten AMP zeigen ähnliche Eigenschaften. Sie sind kleine Peptide (10-50 Aminosäuren), tragen eine kationische Ladung und sind von amphipathischer Struktur [88]. Je nach Aminosäurezusammensetzung, Größe und Konformation werden sie in verschiedene Kategorien unterteilt. So gibt es AMPs mit einer α-helikalen Struktur, Peptide mit einer durch Disulfidbrücken stabilisierten β-Faltblattstruktur und Peptide mit einer langgestreckten oder ringähnlichen Struktur [89]. Ähnlichkeiten 22 Einleitung zwischen den einzelnen AMPs zeigen sich auch bei den Aminosäuresequenzen. So treten die Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure sehr selten auf, wohingegen die kationische Aminosäuren Lysin und Arginin sehr häufig eingebaut werden. Die Aminosäuren Cystein und Tryptophan spielen eine Rolle in der Ausbildung stabilisierender Disulfidbrücken und hydrophober Interaktionen. An den C- und Nterminalen Positionen der Peptide ist Glycin häufig zu finden, da es stabilisierend auf die Helixstrukturen und schützend vor Amino- und Carboxypeptidasen wirkt [90]. Die amphipatische Struktur ermöglicht es den AMPs, mit den negativ geladenen Phopholipidgruppen und hydrophoben Fettsäureketten mikrobieller Membranen zu interagieren. Dies führt zur Porenformation und der Zerstörung der Zellen innerhalb von Minuten [91]. Einige Vertreter der AMPs können auch ohne Membranzerstörung in die Zellen gelangen. Ihre intrazellulären Ziele sind z.B. Störung der Bildung von Nukleinsäuren oder Inhibierung der Proteinsynthese. In Pilzen sind auch die Mitochondrien Angriffspunkte der AMPs [92]. Bereits durch die Einlagerung von AMPs in die Zellmembran des Pathogens kann eine Störung wichtiger Systeme, wie selektive Permeabilität, Aufrechterhaltung von Gradienten, zelluläre Energetik sowie Motilität, erfolgen und damit ein Zelltod ausgelöst werde. Es existieren drei verschiedene Modelle, die die Membranzerstörung durch antimikrobielle Peptide beschreiben. Diese sind in Abb. 1.8 graphisch dargestellt und werden im folgenden Kapitel näher erläutert. 1.3.2 Wirkungsweisen von AMPs 1.3.2.1 Barrel-Stave Model Das erste Modell ist das „Barrel-Stave Model “ (Tonne-Planken-Modell). Dieses Modell beruht auf der Annahme, dass sich die hydrophoben Regionen der Peptide entlang der Acylketten der Membranlipide anordnen und die hydrophilen Regionen der Peptide die innere Oberfläche der Pore bilden. Nach der Bindung der Peptide an der Membranoberfläche, kommt es zu einer Verdünnung der Membran durch das Eindringen der hydrophoben Teile der AMPs und ein damit verbundenes Verschieben der Phospholipidköpfe in der Membran. Die in ihrer Anzahl variierenden kanalbildenden Peptide formieren sich in einem Ring (barrel ) um die entstehende Pore (siehe Abb. 1.8 links). Ist eine bestimmte Schwellenkonzentration des Peptides erreicht, aggregieren Peptid-Monomere und dringen tiefer in den hydrophoben Membrankern ein. Die transmembranen Peptide und Peptidkomplexe bilden die Planken (stave) der Pore. Durch die Einlagerung weiterer Peptide vergrößert sich die Pore, bis ein Einleitung 23 vollständiger Kanal ausgebildet wird, durch den die Zellflüssigkeit entweichen kann und das Pathogen getötet wird [93, 94, 90, 85]. 1.3.2.2 Toroidal-Model Ein weiteres Modell beschreibt die als „Toroidal- “ oder „Wormhole Model “ (Ringloch-Modell) bezeichnete Theorie. Die an der Membran adhärierten Peptide bewirken ab einer bestimmten lokalen Konzentration durch das Eindringen ihrer hydrophoben Teile eine Krümmung der Membranoberfläche, was zu der Ausbildung einer Pore führt. Die Peptide assoziieren hierbei über die gesamte transmembrane Strecke mit den Lipidkopfgruppen, so dass sie erst senkrecht zu der Membran angeordnet sind und schließlich mit dem inneren Teil des Phospholipidbilayers fusionieren. Es kommt zu der Ausbildung eines gekrümmten, aus AMPs und Lipidkopfgruppen bestehenden Monolayer, der die gesamte Pore wie ein Rundloch (toroidal hole) auskleidet (siehe Abb. 1.8 mitte). Wie im Barrel-Stave Model beschrieben kommt es auch hier zu einer Kanalbildung durch die die zytoplasmatische Flüssigkeit des Pa- Abbildung 1.8: Modelle, die die Membranzerstörung durch antimikrobielle Peptide beschreiben. Die Peptide liegen unstrukturiert in Lösung vor. Nach der Bindung an Membranoberflächen und erfolgter Umstrukturierung dringen sie in den Phopholipidbilayer ein. In Abhängigkeit der biophysikalischen Eigenschaften der Peptide erfolgt die Membranzerstörung nach dem Barrel-Stave Model, dem Toroidal-Model oder dem Carpet-Model [90]. 24 Einleitung thogens entweichen kann. Diese Art der Poren wird durch eine Vielzahl mikrobieller Peptide gebildet [85, 90, 94]. 1.3.2.3 Carpet-Model Einige Peptide zeigen eine eher diffuse Wirkung auf die Membranoberfläche und zerstören diese auf eine Art und Weise, die sich mit dem „Carpet-Model “ (TeppichModell) beschreiben läßt. Die AMPs binden in paralleler Orientierung an der Membran und bedecken diese wie ein Teppich (carpet). Auch hier kommt es zu Phospholipidverschiebung und Änderung der Membranfluidität. Ab einer kritischen Schwellenkonzentration kommt es zu der peptidvermittelten Zerstörung der Membran, und somit der Zelle. Dies erfolgt durch die Bildung von Mizellen (siehe Abb. 1.8 rechts), ähnlich dem Prozess der Membranzerstörung durch Detergenzien [94, 85]. 1.3.3 Selektivität Aufgrund der Unterschiede im Aufbau bakterieller und eukaryotischer Membranen haben AMPs eine gewisse Selektivität (siehe Abbildung 1.9). Bakterielle Membranen weisen sowohl an der inneren als auch an der äußeren Seite der Phospholipiddoppelschicht durch den Einbau von Phosphatidylglycerol und Cardiolipin eine stark negative Ladung auf. Zusätzlich ist die äußere Schicht mit negativ geladenen Molekülen (wie LPS bei gram-negativen Bakterien) oder mit Molekülen mit aziden Eigenschaften (Teichonsäure bei gram-positiven Bakterien) versehen, die die negative Ladung der Membran verstärken [94]. Eukaryotische Membranen zeigen diese stark negativ geladenen Phospholipide nur im zytosolischen Teil der Membran. Durch den Einbau zwitterionischer Phospholipide wie Phosphatidylcholin, Sphingomyelin oder Phosphatidylethanolamin, deren nach außen gerichteter Teil ungeladen ist, weist die außere Hälfte der Membran eine neutrale Ladung auf [90]. Zusätzliche Cholesterineinlagerungen verstärken diesen Effekt und bewirken eine höhere Fluidität der Lipiddoppelschicht [95]. 1.3.4 AMPs als Regulatoren der Immunantwort AMPs werden im Menschen konstitutiv in nahezu allen Geweben und Zellen exprimiert und durch Entzündung oder Verletzung induziert. Sie werden als „Cocktail“ produziert, wobei jedes Gewebe sein eigenes Profil an AMPs aufweist [85]. Neben der aktiven Bekämpfung von Pathogenen haben sie auch immunregulatorische Funktio- Einleitung 25 Abbildung 1.9: Bindungsverhalten antimikrobieller Peptide an Membranen eukaryotischer und prokaryotischer Zellen. Aufgrund der stärkeren elektrostatischen und hydrophoben Interaktionen binden AMPs überwiegend an den Membranen von Prokaryonten. Durch den heterogenen Aufbau der eukaryotischen Membranen und dem Einbau von Cholesterin basiert die Interaktionen zu AMPs nur auf hydrophoben Wechselwirkungen. [96] nen. Sie wirken als Chemokine bzw. induzieren die Chemokinproduktion und spielen eine Rolle in der chemischen Anlockung von Lymphozyten oder Dendritischen Zellen sowie T-Zellen. Außerdem haben AMPs Einfluss auf die Regulation des Zellwachstums und der Wundheilung. Somit können antimikrobielle Peptide als Verbindungselement zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem gesehen werden. Eine schematische Übersicht über die Funktionen der AMPs ist in Abb. 1.10 dargestellt. Als wichtigste Vertreter wird im Folgenden auf die Defensine und das Cathelicidin, die hauptsächlich von Neutrophilen und Ephithelzellen produziert werden, näher eingegangen. Nennenswert sind außerdem die AMPs, die zur chemischen Hautbarriere gehören: Dermcidin, Psoriasin und RNase 7, sowie das in Speichelsekreten vorkommende Histatin. Für detaillierte Informationen zu diesen AMPs sei auf das sehr ausführliche Review von Wiesner und Vilcinskas verwiesen [85]. 1.3.5 Resistenzentwicklungen von Pathogenen Pathogene entwickeln fortwährend Mechanismen, Abwehrreaktionen des Wirtes zu umgehen. In Bezug auf die antimikrobiellen Peptide und deren Wirkungsweise ist dies jedoch nicht trivial. Ihre Angriffsziele sind grundlegende Strukturen, die nur 26 Einleitung Abbildung 1.10: Übersicht der Funktionen antimikrobieller Peptide in der Verteidigung des Wirts gegenüber Pathogenen. AMPs induzieren verschiedenste Antworten in wirtseigenen Immunzellen wie Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Epithelzellen. Sie verändern die Genexpression der Wirtszellen, induzieren die Produktion von Chemokinen und Zytokinen, vermitteln Leukozytentransport zum Infektionsherd, beeinflussen Zelldifferenzierung und aktivieren bzw. blockieren TLR-Signalwege. Dies führt zum Schutz vor Infektionen, zur Kontrolle von Entzündungen, vermittelt die Wundheilung und aktiviert die adaptive Immunantwort. Dendritische Zellen - DC; Lipopolysaccharid - LPS, plasmazytoide dendritische Zellen - pDC [89] schwer verändert werden können. Die Interaktionen beruhen auf elektrostatischen und hydrophoben Wechselwirkungen mit Membranen und nicht auf spezifischen Proteinbindungsstellen, die durch Mutationen modifiziert werden könnten. Erschwerend kommt hinzu, dass Pathogene im Wirt einer Vielzahl von AMPs gleichzeitig ausgesetzt sind. Dennoch ist es einigen Mikroorganismen gelungen, die Anwesenheit von AMPs zu detektieren und auf diese zu reagieren. Man kann zwei Entwicklungstrategien für die Ausbildung von Resistenzen unterscheiden. Zum einen gibt es konstitutive (passive) Eigenschaften, die zu einer reduzierten Empfindlichkeit führen, aber unabhängig von der Anwesenheit des AMPs exprimiert werden. Im Gegensatz dazu werden die induzierbaren (adaptiven) Resistenzmechanismen nur bei Anwesenheit der AMPs induziert [92]. Einleitung 27 So kann eine Veränderung der angeborenen Charakteristik mikrobieller Phospholipidmembranen zu Resistenzen gegenüber AMPs führen. Einige Staphylococcus aureus-Stämme beispielsweise enthalten in ihrer Membran mehr Lysyl-Phosphatidylglycerol. Dies ist ein weniger negativ geladenes Derivat des Phosphatidylglycerols. Somit wird die Ladung der Membranoberfläche im Vergleich zu anderen Staphylokokken reduziert [97, 98]. AMPs können leichter in mikrobielle Membranen eindringen, wenn das energetische Membranpotential hoch ist. Die Verringerung des Membranpotentials führt bei einigen Mikroorganismen, wie z.B. S. aureus, zur Resistenz gegenüber AMPs [92]. Ebenso ist für C. albicans gezeigt worden, dass Mutanten mit einem Defekt der Respiration als Folge von Mutationen in der mitochondrialen DNA eine Resistenz gegenüber Histatin-5 aufweisen. Dies hat zwei Gründe: Zum einen kann das AMP nicht in den Zellen akkumulieren und zum anderen benötigt es für seine volle Aktivität ein Minimum an zellulärer Energie, die durch die mitochondriale ATP-Synthese gestellt wird [99]. Dies könnte auch erklären, warum Pilze, die sich im Dormanzzustand befinden, Resistenzen gegenüber antimikrobiellen Peptiden zeigen. Ein weiterer konstitutiver Schutzmechanismus ist der Aufbau einer Kapsel oder Glycokalyx. Diese negativ geladenen Schutzschilde, die beispielsweise bei Gramnegativen Kokken aus Teichonsäure und Teichuronsäure aufgebaut sind, fangen kationische AMPs ab [92]. Ebenso kann das von Pseudomonas aeroginosa produzierte stark anionische Exopolysaccharid Alginsäure die positiv geladenen AMPs abfangen [100]. P. aeroginosa liefert ein weiteres Beispiel passiver Resistenzmechanismen. Das Pathogen ist in der Lage, Gewebe zu infizieren, die hohe Salzkonzentrationen aufweisen. Aufgrund der Tatsachen, dass viele kationische AMPs bei Anwesenheit großer Mengen mono- und divalenter Kationen nicht ihre volle Wirkung entfalten können, hat P. aeruginosa als salzresistenter Organismus hier eine Nische gefunden, in der er die Wirkung der AMPs umgehen kann [92]. Ein weiteres Beispiel der Nischenbildung stellt die Bildung von Biofilmen dar. Diese Wachstumsform, zu der auch Candida albicans befähigt ist, bewirkt eine Ausgrenzung des Immunsystems des Wirts und bietet demzufolge auch Schutz vor antimikrobiellen Peptiden. Antimikrobielle Peptide sind potentiell tödliche Stressoren, die in einigen Mikroorganismen die Herausbildung ausgeklügelter Antwortsysteme induzierten. So bewirkt in diversen Gram-negativen Stämmen das PhoP/PhoQ Regulon eine umfassende Veränderungen von Proteinen, Phospholipiden und Lipopolysacchariden und induziert die Transkription sekretorischer und oberflächenassoziierter Proteine, 28 Einleitung Enzyme und Peptidasen, die einen Schutz gegen AMPs vermitteln [101, 102, 103]. Die Degradation von AMPs durch Endopeptidasen wurde unter anderem für Salmonella und Escherichia coli beschrieben [104, 105]. Ebenso sekretieren P. aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis and Streptococcus pyogenes Proteasen, die das AMP LL-37 degradieren [106]. Des weiteren wurden von Pathogenen Transportsysteme entwickelt, die den Abtransport eingedrungener AMPs regeln. So wurde für Neisseria gonorrhoeae das energieabhängige Transportsystem mtr [107] und für Yersinia das Transportersystem RosA/RosB beschrieben [108]. 1.3.6 AMPs als Therapeutikum In Zeiten des starken Anstiegs von Resistenzen gegenüber Antibiotika und Antimykotika ist das Interesse an neuen Wirkstoffen groß. Für den medizinischen Einsatz antimikrobieller Peptide spricht ihr breites Aktivitätsspektrum. So haben sie eine schädigende Wirkung auf viele Gram-negative und Gram-positive Bakterien sowie Pilze, darunter auch Arzneimittel-resistente Stämme [109]. Das wissenschaftliche Feld, das sich mit dem Einsatz antimikrobieller Peptide als Therapeutikum befasst, ist groß und neben den natürlich vorkommenden AMPs werden auch synthetische Derivate getestet. Viele Substanzen befinden sich in frühen Phasen prae-klinischer Untersuchungen, andere sind bereits in der Phase III klinischer Studien angelangt. Die Kosten der Herstellung solcher Peptide und die Durchführung notwendiger Studien sind hoch. Es stellt sich die Frage, ob in Hinblick auf die oben beschriebenen Resistenzmechansismen (siehe Abschnitt 1.3.5) der Nutzen den Kostenfaktor aufwiegt. Boman [91] liefert für die Verwendung antimikrobieller Peptide in der Medizin prägnante Gründe: 1. Kämen in der Therapie nicht-modifizierte Peptidstrukturen zum Einsatz, die ebenso in Mensch oder Tier gebildet werden, stelle dies keinen neuen Selektionsdruck dar. Mögliche Resistenzmechanismen hätten sich im Verlauf der Evolution längst entwickeln können. 2. Meist sind mikrobielle Membranen das Angriffsziel natürlicher aber auch modifizierter antimikrobieller Peptide. Experimente zeigten, dass es schwierig ist, Mutanten zu isolieren, die eine geänderte Membranstruktur besitzen. Zwar konnten solche Mutanten hergestellt werden, aber nach Bomans Meinung beeinflussen die eingefügten Veränderungen die Vitalität der Mutanten in einem Einleitung 29 Maße, das ein Überleben in der Natur erheblich einschränkt. 3. Sollen die therapeutischen Maßnahmen natürliche Prozesse nachahmen, sollte stets mit einer Kombination antimikrobieller Peptide gearbeitet werden. Resistente Mutanten müssten dann so verändert sein, dass die Inhibierung der Wirkung verschiedener Peptide simultan erfolgt. Dies erscheint sehr unwahrscheinlich. 1.3.7 Defensine Die wohl bekannteste Gruppe humaner antimikrobieller Peptide sind die Defensine. Sie sind charakterisiert durch sechs hochkonservierte Cysteinreste, die drei Disulfidbrücken ausbilden. Aufgrund von Homologie und Lage der Disulfidbrücken unterscheidet man α- und β- sowie ringförmige θ-Defensine. Im Menschen wurden sechs α-Defensine (human neutrophil peptide(HNP) 1-4, HD-5 und HD-6), die konstitutiv exprimiert werden, und vier induzierbare βDefensine (hBD1-4) identifiziert. Die Defensine HNP1 - 3 und in geringeren Mengen auch HNP4 werden, wie in Tabelle 1.1 dargestellt, in Neutrophilen exprimiert und in ihren Granula gespeichert. HD-5 und HD-6 werden hauptsächlich von den Paneth-Zellen im Dünndarm sekretiert. Die β-Defensine hBD1-4 werden in Leukozyten sowie in mukosalen und epithelialen Zellen produziert [85, 91]. Die Defensine werden aus größeren Vorläuferproteinen gebildet und haben umfassende immulatorische Aktivität. Sie modifizieren Zellmigration und -reifung, induzieren Zytokine und regeln Histamin- und Prostaglandin D2-Ausschüttung von Mastzellen. β-Defensine sind zudem chemoattraktiv für unreife DC- und Gedächtnis-T-Zellen [85, 110]. Die sehr kleine Gruppe der θ-Defensine wird in Altweltaffen und Orang-Utans exprimiert jedoch nicht im Menschen. Diese zyklischen AMPs sind aktiv bei hohen Salzkonzentrationen und verhindern die Fusion von HIV-1 mit Wirtszellen. Im Menschen existieren sechs Pseudogene der θ-Defensine, deren Translation durch ein vorzeitiges Stoppcodon in der Signalpeptid-Region der mRNA verhindert wird. Eine Reaktivierung dieser Defensine wird als potentielle neue Therapie für HIV-Infektionen diskutiert [85]. 30 1.3.8 Einleitung Cathelicidin LL-37 Cathelicidine werden von vielen Spezies exprimiert. Im Menschen ist jedoch nur ein einziges Cathelicidin-Gen (CAMP ) bekannt, welches das inaktive Precursor-Protein hCAP18 mit einer molekularen Masse von 18 kDa kodiert [89]. Dieser Precursor besitzt, wie in Abbildung 1.11 dargestellt, eine N -terminale Cathelin-Domäne und eine C -terminale Domäne, die durch eine Serinproteasen-katalysierte Prozessierung als aktives antimikrobielles Peptid LL-37 (4,5 kDa) abgespalten wird. Eine weitere Prozessierung in verschiedene LL-37-Derivate, die ebenso antimikrobielle Aktivität aufweisen und die Fähigkeit besitzen, immunstimulatorischen Effekte auszuüben, ist möglich [111, 112]. Ebenso zeigt die bei der Prozessierung freigesetzte CathelinDomäne antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, S. aureus und S. epidermidis [113]. Abbildung 1.11: Schematische Darstellung der Prozessierung von Cathelicidin hCAP18. Die proteolytische Spaltung des inaktiven Precursor-Proteins durch die Serinproteinasen Kallikrein 5 (KLK5) und Proteinase 3, die durch Serinproteinasen inhibiert werden können, setzt das aktive antimikrobielle Peptid LL-37 frei. Durch die Proteinasen KLK 5 und KLK 7 kann eine weitere Spaltung von LL-37 in die ebenso antimikrobiell aktiven und immunstimulatorischen Peptide KS-30, KS-22, LL-29, RK-31 und KR-30 erfolgen. (modifiziert nach [111]) Einleitung 1.3.8.1 31 Expression und Regulation LL-37 bildet in wässrigen Lösungen eine stabile α-Helix. Es zeigt antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien sowie gegen Pilze, unter anderem auch gegen Candida albicans [114]. Es wird konstitutiv in Neutrophilen, Monozyten und Mastzellen sowie NK-, B- und T-Zellen exprimiert. Des weiteren wird LL-37 auch in den Epithelien des repiratorischen Traktes, des Verdauungsund Fortpflanzungstrakts, sowie in den merokrinen Drüsen und Speicheldrüsen des gesunden Menschen gebildet (siehe auch Tabelle 1.1). Eine induzierte Expression von LL-37, infolge von Entzündung, Verletzung oder Infektion, wurde für Keratinozyten und für intestinale epitheliale Zellen beschrieben [112]. Im gesunden Menschen wurden in Körperflüssigkeiten LL-37-Konzentrationen von 2 bis 5 µg/ml nachgewiesen. Bei Infektionen, Verletzungen oder Entzündungen können die Konzentrationen auf 30 µg/ml ansteigen [115]. Induziert werden kann die Bildung von LL-37 neben den genannten Faktoren wie Verletzung, Infektion oder Entzündung auch durch die Gabe von Vitamin D und durch die Stimulation der Zellen mit Wachstumsfaktoren (insulin-like growth factor I und TGF-α) [116, 117]. 1.3.8.2 Wirkung AMPs wirken durch Interaktion mit mikrobiellen Membranen letal auf viele Organismen. Für das Peptid LL-37 wird ein Wirkmechanismus nach dem Toroidal-Modell beschrieben [118]. Neben der antimikrobiellen Wirkung erfüllt das Peptid weitere wichtige Funktionen. LL-37 erhöht die Zytokin- und Chemokin-Ausschüttung sowohl in umliegenden Zellen und Leukozyten, als auch in Mastzellen und Keratinozyten. Es hat chemotaktische Effekte auf viele Immunzellen und verstärkt die Proliferation von Endothelzellen und Monozyten sowie die Wundheilung. Dies geschieht unter anderem durch die LL-37-vermittelte Induktion der Expression von IL-8 und MCP-1 und oberflächenassoziierter Chemokinrezeptoren wie IL-8RB, CXCR-4 und CCR2 [119]. Ebenso beeinflusst es die Angiogenese und inhibiert die Apoptose in Neutrophilen, verlängert somit deren Lebensspanne [120]. Neben den genannten pro-inflammatorischen Funktionen wurden auch antiinflammatorische Wirkungen von LL-37 beschrieben [119]. Scott et al. konnten zeigen, dass LL-37 die LPS- und LTA-abhängige Aktivierung von Makrophagen neutralisiert und die LPS-induzierte Produktion von TNF-α reduziert. Somit fungiert LL37 in einer Doppelrolle. Einerseits aktiviert es Entzündungsprozesse und rekrutiert Phagozyten zum Infektionsherd. Andererseits zeigt LL-37 anti-inflammatorische 32 Einleitung Wirkung nach Inkubation mit Mikroorganismen oder deren Produkten. Dies reduziert die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Sepsen. Es wird beschrieben, dass in die Aktivierung von LL-37 Toll-like Rezeptoren (insbesondere TLR2, 4 und 9) involviert sind [121] aber auch, dass LL-37 Signalwege der Toll-like Rezeptoren und des Rezeptors P2X7 beeinflusst [122, 123, 124]. Da die Toll-like Rezeptoren, die einer der Hauptauslöser der angeborenen Immunantwort sind (siehe Kapitel 1.2.2), nicht wirklich zwischen konservierten Oberflächenmolekülen von pathogenen bzw. kommensalen Organismen unterscheiden können, bleibt zu klären, in welchem Maße antimikrobielle Peptide an der Balance zwischen Symbiose und Pathogenese eine Rolle spielen [125]. 1.3.8.3 Wirkung von LL-37 auf C. albicans Bisher gibt es nur wenige Untersuchungen zu der Wirkung von LL-37 auf C. albicans und ihre Ergebnisse sind nicht immer vergleichbar, da sich die Versuchsbedingungen drastisch unterscheiden. So zeigt LL-37 bei einer Behandlung von C. albicans über zwei Tage eine MIC (minimale Konzentration, die eine Wachstumshemmung verursacht) von 15–20 µM (in 20 % Dixon Medium bei 37◦ C). Diese Aktivität ist abhängig vom pH-Wert. So ist die MIC bei aziden pH-Werten (pH 4–5) kleiner als bei neutralem pH-Wert [126]. Andere Untersuchungen betrachteten nur eine 30-minütige Behandlung von C. albicans mit LL-37 bei 30◦ C. Hier trat eine leichte wachstumshemmende Wirkung von 30 % erst bei einer Konzentration von 50 µM auf, die sich bei einer Konzentration von 100 µM auf 80 % erhöhte [127]. Es wurde gezeigt, dass LL-37 an der Oberfläche von C. albicans bindet und nicht wie Histatin 5 in die Zellen eindringt [128]. Diese Assoziation erfolgt über die Kohlenhydrate der Zellwand von Candida albicans und wird durch die Exo-1,3-β-Glucanase Xog1p vermittelt [129]. LL-37 beeinflusst die Membranmorphologie, so dass es zu einer Zerstörung des Membranbilayers und zu der Ausbildung einzelner Bläschen führt. Es wurde beobachtet, dass die LL-37-Behandlung einen Ausstrom kleiner Peptide verursacht [128]. In Adhärenzuntersuchungen wurde gezeigt, dass LL-37 die Bindung von C. albicans an nicht-biologische Oberflächen wie Polystyrol aber auch an biologischen Oberflächen, wie humanen oralen Epidermiszellen (OECM-1) und der murinen Harnblase, reduziert [127]. Diese Untersuchungen wurden bei 4◦ C durchgeführt und C. albicans wurde mit LL-37 vorbehandelt. Im RHE-Modell (siehe Kapitel 1.2.3) wurde nach Infektion mit C. albicans unter Einleitung 33 Anwesenheit von PMNs neben der Hochregulation der epithelialen TLR4-Expression auch eine erhöhte Freisetzung von LL-37 beobachtet. Die Menge freigesetzten LL-37 korrelierte mit dem Schutz der Epithelzellen, der auch durch exogene Zugabe von LL-37 ohne Anwesenheit von Neutrophilen erreicht werden konnte (unpublizierte Ergebnisse aus [130]). Pilze sind generell vor Angriffen auf die Zellwand gut geschützt, da sie ein schnell reagierendes Signalsystem besitzen, das Defekte erkennt und Reparaturmechanismen einleitet [131]. Eine Komponente dieses Signalsystems ist das Sensorprotein Msb2, welches das Kopfglied des Cek1-MAP-Kinase Signalweges bildet. Dieser sorgt für Zellwandintegrität und ermöglicht Hyphenwachstum. Das Transmembranprotein Msb2 besitzt eine kleine zytoplasmatische und eine große extrazelluläre Domäne, die durch Abspaltung ins Medium sekretiert werden kann. Für C. albicans scheint diese sekretierte Komponente von Msb2 von großem Vorteil in der Kolonisierung von Wirtsepithelien zu sein, denn sie schützt das Pathogen vor der zellschädigenden Wirkung von LL-37. Mutanten, die eine Deletion im MSB2-Gen aufweisen, sind sensitiver gegenüber der LL-37-Behandlung [132]. Übereinstimmend sind die Ergebnisse, dass C. albicans die Expression von LL-37 induziert und die Produkte der weiteren Prozessierung von LL-37 (siehe Abbildung 1.11) eine höhere Toxizität aufweisen als LL-37 selbst [126, 130, 133]. 1.3.8.4 LL-37 und Autoimmunerkrankungen LL-37 scheint eine zentrale Rolle in der angeborenen Immunität, insbesondere in der Immunantwort von Epithelien, zu spielen. Dies verdeutlichen die folgenden Beispiele an chronischen Krankheiten, die mit Störungen in der Regulierung der LL37-Expression korrelieren [134]. Eine Übersicht dieser Autoimmunerkrankungen und die zugehörige Beeinflussung der LL-37-Regulation ist in Tabelle 1.2 gegeben. Atopische Dermatitis ist eine relativ weit verbreitete inflammatorische Krankheit mit chronischem Verlauf. Patienten, die an dieser Krankheit leiden, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber viralen, bakteriellen und mykotischen Infektionen. Die Transkription der Cathelicidin-mRNA als Antwort auf Verwundung der Haut ist im Vergleich zu gesunden Menschen supprimiert. Es wird vermutet, dass die Expression weiterer AMPs reduziert ist, was die Entwicklung von Superinfektionen begünstigt. Die klassisch angewendetet Therapie verstärkt vermutlich den Effekt, denn die Gabe von Corticosteroiden bewirkt eine zusätzliche Reduzierung der Expression antimikrobieller Peptide [136, 137]. 34 Einleitung Tabelle 1.1: Humane antimikrobielle Peptide: Defensine und Cathelicidin. nach [135] Klasse Name Lokalisation α-Defensin HNP1 Neutrophile HNP2 HNP3 HNP4 HD5 Paneth-Zellen HD6 β-Defensin Cathelicidin HBD-1 Epithelzellen: HBD-2 respiratorischer Trakt, HBD-3 Gastrointestinaltrakt, HBD-4 Kornea, Haut, Niere etc. LL-37 Neutrophile, Epithelien der Haut, Darm, Lunge, Monozyten, natürliche Killer-T-Zellen, Mastzellen Rosacea ist eine chronische inflammatorische Hautkrankheit, die hauptsächlich bei hellhäutigen Erwachsenen auftreten kann. Sie äußert sich durch Rötungen, Pusteln, Knötchen sowie erweiterten Kapillargefäßen in der Gesichtspartie. Diese chronischen Entzündungen lassen sich unter anderem auf eine erhöhte Bildung von Cathelicidin zurückführen. Die in Kapitel 1.3.8 beschriebenen, für die Prozessierung des Precursorproteins notwendigen Serinproteasen, werden in Patienten ebenfalls in erhöhtem Maße exprimiert. Diese induzieren eine permanente inflammatorische Umgebung [138]. Psoriasis ist eine Autoimmunerkrankung, deren Entstehung bisher nicht vollständig geklärt ist. Ein wichtiger Faktor scheint eine stark induzierte Expression von LL-37 zu sein, das mit humaner DNA Komplexe bildet. Diese Komplexe werden durch den Rezeptor TLR9 in plasmazytoiden Dendritischen Zellen als fremdartig erkannt, und es kommt zur Auslösung einer Interferon-abhängigen Immunantwort [139, 140, 141]. Weitere inflammatorische Autoimmunerkrankungen wie Rheumatische Arthritis und Osteoarthritis, systemische Lupus erythematodes sowie das Bronchiolitis obliterans Syndrom gehen mit einer Induktion der Expression von LL-37 und einer damit verbundenen chronischen Entzündung einher. Die an Morbus Crohn leiden- Einleitung 35 den Patienten hingegen weisen reduzierte Mengen des antimikrobiellen Peptides auf. Alle genannten Krankheiten sind neben der gestörten LL-37-Bildung mit einer Störung der Expression weiterer AMPs und einer Dysregulation der Chemokin- und Zytokin-Ausschüttung verbunden [114]. Tabelle 1.2: Veränderte Expression von LL-37 in immunvermittelten inflammatorischen Krankheiten. nach [134] Inflammatorische Krankheit Induktion Suppression Atopische Dermatitis - X Rosacea X - Psoriases X - Rheumatische Arthritis und Osteoarthritis X - systemische Lupus erythematodes X - Bronchiolitis obliterans Syndrom X - Morbus Crohn - X Die Behandlung dieser Autoimmunerkrankungen erfolgt aufgrund nicht ausreichender Kenntnisse ihrer Ursachen symptomatisch und nicht kausal. Es werden Immunsystem-hemmende Medikamente eingesetzt. Dies ist aber insbesondere bei Krankheiten, die mit einer reduzierten AMP-Expression verbunden sind, problematisch, da Corticosteroide generell die Produktion von AMPs reduzieren [134]. Insbesondere Autoimmunerkrankungen verdeutlichen sehr eindrucksvoll, wie kompliziert und empfindlich das menschliche Immunsystem aufgebaut ist und wie wichtig die Balance der einzelnen Elemente untereinander ist. Der Mensch trägt 2 kg Mikroorganismen in seinem Verdauungssystem und ca. 200 g auf der Haut [91]. Zur Kontrolle dieser mikrobiellen Flora ist diese Balance unerläßlich. Störungen des Gleichgewichts, können schwere Infektionen nach sich ziehen, da das rasche Wachstum adaptierter Kommensale ermöglicht wird. Genauere Kenntnisse bezüglich dieser Faktoren und ihrer Wirkungsweisen würden gezieltere Therapien der Autoimmunerkrankungen ermöglichen. Antimikrobielle Peptide sind hierbei ein sehr wichtiger Aspekt. 36 Einleitung 1.4 Zielsetzung der Arbeit Candida albicans ist ein fakultativ pathogener Organismus, der in immunsupprimierten Menschen lebensbedrohende Krankheiten verursachen kann. C. albicans ist der häufigste Erreger systemischer Pilzinfektionen. Die jährlichen Kosten für die Behandlung von Pilzinfektionen belaufen sich auf 2,6 Milliarden US-Dollar. Der Anteil für die Behandlung Candida-bedingter Infektionen macht dabei mehr als zwei Drittel aus [142]. Ein ähnliches Bild liefern Zahlen aus der Europäischen Union. Somit ist C. albicans nicht nur ein Krankheitserreger, sondern die Therapiekosten stellen auch eine hohe Belastung für das Gesundheitswesen dar. Langfristig gesehen, wird die Zahl der zur Risikogruppe zählenden Personen sogar noch steigen, da die Fortschritte in der Medizin zu einer steigenden Lebenserwartung führen und wirkungsvollere Therapien gegen Krankheiten wie AIDS und Krebs ermöglichen. Daher besteht ein Interesse daran, Therapien zu verbessern, um die finanzielle Belastung durch die kostenintensive Behandlung von Patienten zu minimieren. Da C. albicans als kommensaler Organismus mukosale Oberflächen kolonisiert, beginnen invasive Infektionen, die bei einer Störung des Gleichgewichts zwischen der Immunabwehr des Wirts und einem opportunistischen Pathogen entstehen können, mit Veränderungen der Wechselwirkungen zwischen Hefe und Epithelzellen. Antimikrobielle Peptide sind wesentliche Elemente der angeborenen Immunabwehr und erfüllen insbesondere in Epithelien, der ersten physikalischen Barriere, die infektiöse Organismen überwinden müssen, eine Schutzfunktion. Die Arzneimittelforschung zeigt, dass AMPs das Potential besitzen, als Therapeutika eingesetzt zu werden. Gleichzeitig sind bislang nur wenige Details über ihre Wirkung auf Pilze und Epithelzellen bekannt. Einer der wichtigsten Vertreter der epidermal exprimierten AMPs ist das Cathelicidin LL-37. Es stand im Mittelpunkt der hier vorgestellten Arbeit, die Teil des BMBF-geförderten Projektes „Dr. Jeykll & Mr. Hyde: Ein systembiologischer Ansatz zur Behandlung nosokomialer Infektionen durch Candida albicans“ war. LL-37 ist ein potentes antimikrobielles Peptid mit breitem Wirkungsspektrum. Eine Candida-spezifische Aktivität ist umstritten. In dieser Arbeit sollten molekulare Details zur Reaktion von Candida albicans auf dieses Peptid durch Analyse der exprimierten Gene und der Aktivität von Stoffwechselwegen gewonnen werden. Ebenso sollten Informationen zu der Beeinflussungen des Wachstums sowie des Adhäsions- und Infektionsverhaltens von C. albicans an Epithelzellen geliefert werden. Zur umfassenden Genexpressionsanalyse wurden Ganzgenom-Mikroarrays einge- Einleitung 37 setzt. Metabolite konnten über HPLC-Methoden quantifiziert werden. Die ermittelten molekularen Daten sollten in mathematische Modelle einfließen, die von Projektpartnern entwickelt wurden und nicht Thema dieser Arbeit waren. Um die Modellierung zu ermöglichen, wurden die Organismen, so weit möglich, in Medien mit definierter Zusammensatzung kultiviert. Anhand dieser Modelle sollte die Identifikation wichtiger Schlüsselfaktoren im Infektionsprozess erfolgen, die den dramatischen Wechsel vom kommensalen („Dr. Jekyll“) zum pathogenen („Mr. Hyde“) Organismus erklären können. Kapitel 2 Material und Methoden 2.1 Software Name, Version und Her- Anwendung steller Bioanalyzer Software Aufzeichnung von Elektropherogrammen zur Qualitätsanalyse von RNA BZ8000 Analyser, Keyence Bearbeitung mikroskopischer Bilder am Keyence Mikroskop BZ8000 Viewer, Keyence Steuerung des Keyence Mikroskops und Aufnahme von Bildern CellA 3.0, Olympus Aufnahme mikroskopischer Bilder am Olympus Mikroskop ChemStation, Agilent Techno- Aufzeichnung von HPLC Chromatogrammen logies und Quantifizierung Excel 2007, Microsoft numerische Datenanalyse Feature Extraction 10.7.3.1, Extraktion und Zuordnung der Signale auf Agilent Technologies DNA-Arrays und Qualitätskontrolle FlowJo Version 7.6.3, TreeStar Auswertung der Daten der Durchflusszytometrie Gen5, Version 1.06, BioTek In- Absorptions- und Fluoreszenzmessung struments GIMP 2.6 Graphikgestaltung LightCycler480 Steuersoftware Aufnahme von Fluoreszenzdaten aus dem LightCycler480 und Bestimmung der Cp-Werte 39 40 Material und Methoden PowerPoint 2007 Graphikgestaltung R/Bioconductor numerische Datenanalyse der Mikroarrays Scan Control, Agilent Einlesen der Fluoreszenzwerte auf DNA-Arrays (Agilent) Texmaker Textbearbeitung Word 2007, Microsoft Textverarbeitung 2.2 Lösungen und Puffer 10x Bindungspuffer 0,1 M HEPES/KOH, pH 7,4 1,4 M NaCl 25 mM CaCl2 sterilfiltriert Einfriermedium 1 ml RPMI 1640 10 % FBS 5% DMSO ELISA Waschpuffer 1x PBS 0,05 % Tween 20 FACS Waschpuffer 2% FBS in 1 x PBS Fixierlösung 2% Formalin in 1 x PBS Injektionslösung zur Probenverdünnung für Aminosäureanalyse 100 ml LM-AA A 0,4 ml konz H3 PO4 Material und Methoden Laufmittel A für Aminosäureanalyse (LM-AA A) 10mM Na2 HPO4 10mM Na2 B4 O7 5mM NaN3 pH 8,2 filtriert Laufmittel B für Aminosäureanalyse (LM-AA B) 45 % Methanol 45 % Acetonitril 10 % MilliQ Wasser filtriert LL-37-Stocklösung 1 mg LL-37 1 ml dH2 O 10x PBS 80 g/l NaCl 2 g/l KCl 14,4 g/l Na2 HPO4 2 g/l KH2 PO4 pH 7,3 TE-Puffer 1,21 g/l Tris 0,37 g/l EDTA 7AAD-Stocklösung 1 mg 7AAD 50 µl Methanol 950 µl 1x PBS 41 42 2.3 Material und Methoden Medien Medien und Lösungen für die Zellkultur Firma Artikelnummer RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) Lonza BE12-702F FBS (fetal bovine serum) Lonza DE14-801F R Trypsin-Versene (EDTA) (1x) Lonza BE17-161E Medien für die Kultivierung von C. albicans RPMI-MOPS pH 7,4 8,4 g/l RPMI-1640 (Sigma, R1383) 34,5 g/l MOPS 2 g/l Glucose pH 7,4 YNB pH 5,6 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 2 g/l Glucose pH 5,6 YNB-MOPS pH 5,6 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 34,5 g/l MOPS 2 g/l Glucose pH 5,6 YNB-MOPS pH 7,4 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 34,5 g/l MOPS 2 g/l Glucose pH 7,4 YPD 50 g/l YPD Einige der verwendeten C. albicans-Stämme benötigten den Zusatz essentieller Aminosäuren. Diese wurden in folgenden Konzentrationen ergänzt: 20 mg/l L-Histidin bzw. 20 mg/l L-Arginin Material und Methoden 2.4 43 Kit-Systeme Bezeichnung Bestellnummer, Hersteller TM Human IL8 ELISA MAX Deluxe 431505 , BioLegend R LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit L-3224, Invitrogen Low Input Quick Amp Labeling Kit, one- 5190-2305, Agilent Technologies color RNeasy mini Kit 2.5 74106, Qiagen Stämme und Zelllinien 2.5.1 Candida albicans Die in dieser Arbeit verwendeten C. albicans-Stämme wurden in der Tabelle 2.4 aufgelistet. Tabelle 2.4: verwendete Candida albicans-Stämme Stamm Eigenschaften Quelle und Referenz SC5314 Wildtyp, sequenziert K. Sohn* [143] DSM1386 Wildtyp DSMZ DSM1577 Wildtyp DSMZ ura3-iro1 ∆::λimm434 /ura3- FGSC [144] DAY286 BWP17 iro1 ∆::λimm434 arg4 ::hisG/arg4 ::hisG his1 ::hisG/his1 ::hisG ∆cdc35 ura3-iro1 ∆::λimm434 /ura3- M. Whiteway** SC5314 iro1 ∆::λimm434 (CAI4) cdc35 ∆::hisG-URA3- [145] hisG/cdc35 ∆::hisG ∆cek1 SC5314 iro1 ∆::λimm434 ura3-iro1 ∆::λimm434 /ura3- M. Whiteway** (CAI4) cek1 ∆::hisG-URA3- [146] hisG/cek1 ∆::hisG ∆efg1 SC5314; ura3-iro1 ∆::λimm434 ::URA3- IRO1 /ura3-iro1 ∆::λimm434 arg4 ∆::hisG/arg4 ∆::hisG his1 ∆::hisG/his1 ∆::hisG, leu2 ∆::hisG/leu2 ∆::hisG efg1 ∆::CmLEU2 /efg1 ∆::CdHIS1 (SN152) FGSC [147] 44 Material und Methoden Tabelle 2.4 - Fortsetzung Stamm Eigenschaften Quelle und Referenz ∆hog1 ura3-iro1 ∆::imm434 /ura3- J. Pla*** [148] SC5314; iro1 ∆::imm434 his1 ∆::hisG/his1 ∆::hisG (RM1000) hog1 ∆::hisG-URA3-hisG/hog1 ∆::hisG ∆iff4 SC5314; ura3-iro1 ::λimm434 /ura3- FGSC [144] iro1 ::λimm434 arg4 ::hisG/arg4 ::hisG his1 ::hisG/his1 ::hisG (BWP17) iff4 ∆::ARG4 /iff4 ∆::URA3 ∆mkc1 ura3-iro1 ∆::λimm434 /ura3- FGSC [144] SC5314; iro1 ∆:: λimm434 arg4 ::hisG/arg4 ::hisG his1 ::hisG/his1 ::hisG (BWP17) mkc1 ∆::ARG4 /mkc1 ∆::URA3 ∆msb2 ura3-iro1 ::λimm434 /ura3- FGSC [144] SC5314; iro1 ::λimm434 arg4 ::hisG/arg4 ::hisG his1 ::hisG/his1 ::hisG (BWP17) msb2 ∆::ARG4 /msb2 ∆::URA3 ∆pho100 SC5314; ura3-iro1 ∆::λimm434 ::URA3- FGSC [149] IRO1 /ura3-iro1 ∆::λimm434 arg4 ∆::hisG/arg4 ∆::hisG his1 ∆::hisG/his1 ∆::hisG, leu2 ∆::hisG/leu2 ∆::hisG (SN152) pho100 ∆::CmLEU2 /pho100 ∆::CdHIS1 * Frauenhofer IGB, Stuttgart, ** Biotechnology Research Institute, Montreal, *** Universität Madrid, Spanien 2.5.2 Epithelzellen Die im Projekt „Dr. Jeykll & Mr. Hyde: Ein systembiologischer Ansatz zur Behandlung nosokomialer Infektionen durch Candida albicans“ und hauptsächlich in dieser Arbeit verwendete Zelllinie waren die Epithelzellen A431. Hierbei handelt es sich um humane Vaginalzellen, die aus einem Epidermoidkarzinom der Vulva einer 85-jährigen Frau entnommen wurden [150]. Die Zellen wurden von dem Projektpartner Dr. Kai Sohn vom Institut für Molekulare Biotechnologie des Frauenhofer IGB (Stuttgart) zur Verfügung gestellt. Material und Methoden 45 Zur Validierung von Ergebnissen wurden weitere Zelllinien herangezogen. Zum einen wurden die Caco-2 Zellen verwendet, die von Bettina Hinkelmann (Arbeitsgruppe CBIO, HZI) zur Verfügung gestellt wurden. Die Caco-2 Zellen sind eine stabile humane Zelllinie heterogener, epithelialer, kolorektaler Zellen eines Adenokarzinoms [151]. Bei Kultivierung unter bestimmten Bedingungen können die Caco-2 Zellen differenzieren und polarisieren, so dass sie in ihrem Phenotyp, der Morphologie und der Funktion den Enterozyten ähneln, die den Dünndarm auskleiden [152, 153]. Des weiteren wurde die A549-Zellen verwendet. Hierbei handelt es sich um immortalisierte humane Lungenepithelzellen, die aus einem Lungenkarzinom etabliert wurden [150]. Bezogen wurden die A549-Zellen von der „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen “ (DSMZ)(ACC 107) und dem Protokoll entsprechend in Kultur genommen. 2.6 Steriles Arbeiten Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden mit Candida albicans und humanen Zelllinien wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilwerkbank durchgeführt. Gebrauchsfertige Zellkulturmedien und Materialien wurden steril vom Hersteller bezogen. Weitere verwendete Puffer und Medien wurden bei 121◦ C für 20 min dampfsterilisiert bzw. mit Hilfe von Sterilfiltern mit einer Porengröße von 0,2 µm (Millipore) sterilfiltriert. Verwendete Kunststoffmaterialien wie Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße wurden dampfsterilisiert. Glasmaterialien wie Erlenmeyerkolben und Glaspipetten wurden für mindestens 4 h bei 180◦ C sterilisiert. 2.7 Zellzahlbestimmung Für eine Standardisierung der Experimente war es erforderlich, die humanen Zellen bzw. die Hefezellen mit definierter Zellzahl in den Versuchen einzusetzen. Hierfür wurde die Dichte einer Zellsuspension mit Hilfe einer Neubauer improved Zählkammer bestimmt (siehe Abbildung 2.1). Für die Bestimmung der Dichte einer humanen Zellsuspension wurden die Zellen in den vier grau hinterlegten Eckquadrate (Fläche 1 mm2 ) gezählt und der Mittelwert (MWZellzahl ) gebildet. Aufgrund einer Kammertiefe von 0,1 mm ergibt sich ein Kammervolumen von 0,1 µl über einem Großquadrat, so dass zur Bestimmung der Zelldichte folgende Formel verwendet wurde: 46 Material und Methoden Abbildung 2.1: Zählgitter einer Neubauer improved Zählkammer, nach Alcibiades [http://de.academic.ru/dic.nsf/dewiki/1556822] Zellzahl/ml = M WZellzahl ∗ 1 · 104 . Die Zelldichte einer Hefekultur wurde durch Zählung der Zellen (SummeZellzahl ) in fünf Kleinquadraten im zentralen Großquadrat ermittelt. Da die Fläche eines Kleinquadrates 0,2 mm beträgt, ergibt sich für die Bestimmung der Zelldichte folgende Formel: Zellzahl/ml = SummeZellzahl ∗ 5 · 104 . Lag eine zu hohe Zelldichte vor, wurde die Zellsuspension mit PBS verdünnt und der entsprechende Verdünnungsfaktor in die Berechnung der Zellzahl mit einbezogen. 2.8 2.8.1 Arbeiten mit Candida albicans Stammhaltung Die in der Arbeit verwendeten Stämme wurden in Kryokonserven gelagert. Zur Reaktivierung wurde die gesamte Zellsuspension einer Kryokonserve in einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml YPD-Medium gegeben und bei 30◦ C und 160 rpm schüttelnd inkubiert. Zur Herstellung von neuen Kryokonserven wurden Kulturen der Stämme verwendet, die über Nacht in YPD-Medium schüttelnd bei 30◦ C und 160 rpm gewachsen waren. In die Kryoröhrchen wurden 250 µl Glycerin vorgelegt und anschließend 750 µl der entsprechenden Kultur dazugegeben. Die Lagerung der Stämme erfolgte bei −80◦ C. Material und Methoden 2.8.2 47 Kultivierung Für jeden durchgeführten Versuch wurde stets eine neue Kryokultur reaktiviert. Eine Langzeitkultivierung (länger als 3 Tage) der Stämme wurde vermieden, da Candida albicans stark zur Veränderung des genetischen Materials neigt. Die Reaktivierung der Kryokulturen erfolgte wie in Absatz 2.8.1 beschrieben. Ausgehend aus dieser Kultur wurde eine Vorkultur in YNB pH 5,6 angeimpft. Für einige verwendete Mutanten war die Zugabe von essentiellen Aminosäuren notwendig. Die benötigte Menge Kultur wurde aus der YPD-Kultur entnommen, zentrifugiert und das Pellet in 20 ml YNB pH 5,6 resuspendiert. Diese Kultur wurde in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen bis zur exponentiellen Wachstumphase bei 37◦ C und 160 rpm schüttelnd inkubiert. Anschließend konnten ausgehend aus dieser Kultur die eigentlichen Arbeitskulturen hergestellt werden. Je nach Bedarf erfolgte dies in 100 oder 250 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 20 oder 50 ml entsprechenden Mediums. Handelte es sich hierbei um ein anderes Medium als YNB pH 5,6 wurde ein zweimaliges Waschen der Zellen mit dem entsprechenden Medium durchgeführt. Dafür wurden die Kulturen durch Zentrifugation bei 8000 x g pelletiert und im gewünschten Medium resuspendiert. Die Arbeitskulturen wurden bei 37◦ C und 160 rpm dem Versuch entsprechend inkubiert. Alle eingesetzten Medien wurden vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt. Die für die Hauptkulturen verwendeten Medien wurden auf die Versuchstemperatur vorgewärmt. Die Messungen der optischen Dichten jeder Kultur erfolgten durch eine Absorptionsmessung am Mikrotiterplattenmessgerät µQuant bei einer Wellenlänge von 620 nm in einem Volumen von 180 µl. 2.8.3 Hitzeinaktivierung von C. albicans C. albicans SC5314 wurde wie in Kapitel 2.8.2 angezogen. Durch Bestimmung der Zellzahl (siehe Kapitel 2.7) wurde eine Hefesuspension mit einer Zellkonzentration 2 · 106 Zellen/ml in serumfreiem RPMI hergestellt. Diese Hefezellen wurden durch eine zweistündige Inkubation bei 65◦ C unter Schütteln abgetötet und im Adhärenzassay verwendet (siehe Kapitel 2.9.4). 2.8.4 Wachstumstests in Mikrotiterplatten Um die Wirkung einer Substanz auf das Wachstum von Candida albicans zu untersuchen, wurden die gewünschten Stämme mit der zu analysierenden Substanz in Mikrotiterplatten (96-Well) kultiviert. Hierbei wurde in einem Gesamtvolumen von 48 Material und Methoden 180 µl gearbeitet. Die Wells einer Mikrotiterplatte wurden mit 60 µl Medium befüllt. In die erste Spalte der Platte wurden 30 µl der zu untersuchenden Substanz gegeben. Im Fall der eingesetzten Substanz LL-37 wurden 15 µl Medium und 15 µl der LL-37Stammlösung (1 mg/ml) zugegeben. Der Inhalt der Wells der ersten Spalte wurden gemischt und 30 µl der Suspension in die Wells der folgenden Spalte überführt. Nach Mischen des Inhalts des zweiten Wells wurden ebenfalls 30 µl der Lösung in die folgende Spalte transferiert. Dieser Vorgang wurde bis zur 10. Spalte wiederholt und die hier übrigen 30 µl wurden verworfen. Die 11. Spalte diente als unbehandelte Mediumkontrolle und in die 12. Spalte wurde die dem ersten Well entsprechende Menge Lösungsmittel als Kontrolle gegeben. Alle Untersuchungen wurden in Zweioder Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Arbeitskulturen (siehe Absatz 2.8.2) wurden im exponentiellen Wachstum verwendet, durch Zentrifugation bei 8000 x g für 5 min pelletiert, im gewünschten Medium resuspendiert und gewaschen. Nach Bestimmung der optischen Dichte der Kultur erfolgte das Einstellen der Hefesuspension auf eine optische Dichte von 0,1. 120 µl dieser Zellsuspension wurden in die vorbereiteten Wells gegeben. Zu den je nach Versuch geplanten Messzeitpunkten erfolgten die photometrischen Messungen bei geöffnetem Deckel. Zwischen den Messzeitpunkten wurde die Platte mit Parafilm verschlossen, um die Verdunstung so gering wie möglich zu halten, und schüttelnd bei 600 rpm bei 30◦ C oder 37◦ C inkubiert. 2.8.5 Wachstumstests in Erlenmeyerkolben Für die Untersuchung des Effektes von LL-37 auf C. albicans war es notwendig, das Wachstum auch in größerem Kulturvolumen zu testen. Es wurde mit 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen gearbeitet. Hierbei kam das Medien RPMI-MOPS pH 7,4 zum Einsatz, dem LL-37 in einer Endkonzentration von 30 µg/ml bzw. die entsprechende Menge Wasser zugegeben wurde. Die Kulturen wurden mit einer optischen Dichte bei 620 nm von 0,02 angeimpft und bei 37◦ C und 160 rpm schüttelnd inkubiert. Zu den gewünschten Zeitpunkten erfolgte die Probenentnahme für die Messung der optischen Dichte (siehe Kapitel 2.8.2), die Bestimmung der Zellzahl mit der Zählkammer (siehe Kapitel 2.7), die Trockenmassebestimmung (siehe Kapitel 2.8.6) und die Analyse der Metabolite in den Kulturüberständen (siehe Kapitel 2.8.9). Material und Methoden 2.8.6 49 Bestimmung der Trockenmasse Für die Bestimmung der Trockenmasse wurden Reaktionsgefäße über Nacht bei 70◦ C offen inkubiert. Anschließend wurden sie geschlossen und nach Aklimatisierung gewogen (Masse0 ). Zu den entsprechenden Zeitwerten wurde je zweimal (Doppelbestimmung) 1 ml der Kultur in die vorbereiteten Reaktionsgefäße gegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (16000 x g, 10 min, RT) und der Überstand abgenommen. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht bei 70◦ C offen getrocknet. Die Reaktionsgefäße wurden verschlossen und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur gewogen (Massex ). Anschließend wurden die Massen der Proben durch Berechnung der Differenzen aus Massex und Masse0 bestimmt. 2.8.7 CFU-Bestimmung von C. albicans-Kulturen In einigen Fällen war es erforderlich die Anzahl der teilungsfähigen Zellen in einer Kultur (CFU - colony forming units) zu bestimmen. Hierfür wurden 50 µl der C. albicans - Kultur in 450 µl 1x PBS überführt. Die Suspension wurde nach gründlichem Vortexen in weiteren Stufen 1:10 verdünnt. Je 20 µl der erhaltenen Verdünnungsstufen 102 bis 106 wurden zweimal auf eine YPD-Agar-Platte getropft. Nach dem Eintrocknen der Zellsuspension wurden die Platten über Nacht bei 37◦ C inkubiert und anschließend die gewachsenen Kolonien gezählt. Aus den erhaltenen Werten wurden die Zellzahl pro Milliliter zum Zeitpunkt der Ausplattierung ermittelt. 2.8.8 Extraktion der intrazellulären Metabolite Wie im Kapitel 2.8.2 beschrieben wurde Candida albicans SC5314 im gewünschten Medium kultiviert. Zu den gewählten Zeitpunkten wurde zweimal 1 ml Kultur abgenommen und pelletiert (16000 x g, 5 min, RT ). Der Überstand wurde verworfen und das erhaltene Pellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zum Aufschluss der Proben wurden diese bei −80◦ C gelagert. Zu Beginn des eigentlichen Aufschlusses erfolgte das Auftauen der Proben auf Eis. Um eine Verfälschung der Messdaten durch Restmedium aus der Kultivierung zu verhindern, wurden die Zellen in 150 µl 1x YNB resuspendiert und zentrifugiert (16000 x g, 4◦ C , 3 min). Der Überstand wurde vollständig entfernt und die Pellets mit 500 µl 95◦ C heißem 75 %-igem Ethanol überschichtet. Nach kurzem Vortexen wurden die Proben sofort für 3 min geöffnet in das heiße Wasserbad (95◦ C) gegeben. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Proben 50 Material und Methoden schnell verschlossen und für mindestens 5 min auf Eis gelagert. Durch Zentrifugation (16000 x g, 4◦ C , 3 min) erfolgte die Trennung der Zelltrümmer von den intrazellulären Bestandteilen. Der erhaltene Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Das zum Aufschluss benötigte Ethanol wurde in der SpeedVac bei 43◦ C vollständig entfernt. Die so erhaltenen intrazellulären Metabolite wurden in 100 µl MilliQ Wasser durch starkes Vortexen gelöst und bis zur weiteren Analyse bei −20◦ C gelagert. 2.8.9 Analyse der Metabolite per HPLC Der Einfluss des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf den Metabolismus von C. albicans SC5314 wurde untersucht. Die extrazellulären und intrazellulären Metabolite in Kulturüberständen bzw. Zellextrakten wurden mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC - High-performance Liquid Chromatography) quantifiziert. Der Aufbau des verwendeten HPLC-Systems ist in Abbildung 2.2 gezeigt. Abfall Detektor Säulenofen mit Säule Prozesseinheit mit Monitor A B Lösungsmittelreservoir Probengeber Entgaser Kühleinheit Pumpe Abbildung 2.2: Schematischer Aufbau der verwendeten HPLC-Anlage Bei dieser analytischen Methode werden die zu untersuchenden Substanzen in einen Laufmittelstrom, der sogenannten mobilen Phase, injiziert und unter hohem Druck durch eine Trennsäule geleitet. Die Säule enthält die als stationäre Phase bezeichnete Matrix. Entsprechend der zu analysierenden Substanz werden stationäre Phasen mit unterschiedlichen Trenneigenschaften verwendet. Eine Vorsäule, die aus dem gleichen Material wie die Säule besteht, dient dem Schutz vor Verunreinigung der eigentlichen Trennsäule. In Abhängigkeit vom Säulenmaterial und der Lösungsmittel werden verschiedene Trennmethoden unterschieden. In dieser Arbeit wurde mit der Ionenaustauschchromatographie und der Umkehrphasenchromatographie ge- Material und Methoden 51 arbeitet. Das für die Ionenaustauschchromatographie verwendete Material der Rezex ROASäule besteht aus dem organischen Polymersubstrat Resin, an das sulfonierte StyrolDivinylbenzole (SDVB) gekoppelt sind. Diese haben eine negative Ladung, so dass positiv geladene Analyten gebunden werden. Die von der Ladung der Substrate abhängige Interaktion ist bei dieser Methode die wesentliche Ursache für die Trennleistung der Säule. Adsorption und Größe der Analyten spielen eine untergeordnete Rolle. Bei der Analyse der Aminosäuren wurde die Methode der Umkehrphasenchromatographie verwendet. Dies erfolgte mit der Zorbax Eclipse C18plus-Säule, die aus einer unpolaren stationären Phase besteht. Die Matrix der Säule basiert auf ultrareinem Dimethyl-n-Octadecylsilan. Je nach der Hydrophobizität der Analyte interagieren diese mehr oder weniger stark mit dem Säulenmaterial. Durch die Verwendung eines Gradienten-gesteuerten Laufmittelgemisches wird die Verweildauer der Analyte beeinflusst. So werden die Proben in die polare mobile Phase (98 % LM-AA A, 2 %LM-AA B) injiziert. Stark polare Substanzen interagierten nicht mit dem Säulenmaterial und werden schnell eluiert, unpolare binden an das Säulenmaterial. Durch die zeitliche Änderung der Laufmittelzusammensetzung durch Erhöhung des prozentualen Anteils des unpolaren LM-AA B werden die unpolaren Analyte eluiert. Somit haben hydrophile Substanzen eine kürzere Verweildauer in der Säule als hydrophobe. Direkt nach der Säule gelangen die Substanzen in Detektoren. In dieser Arbeit wurden ein Dioden-Array-Detektor (DAD) und ein Brechungsindexdetektor (refractive index detector - RID) verwendet, wobei der RI-Detektor vor allem bei der Quantifizierung der Kohlenhydrate und organischen Säuren zum Einsatz kam. Die durch eine Vorsäulenderivatisierung OPA-markierten Aminosäuren wurden mit dem DAD detektiert. Diese Derivatisierung bewirkt eine Signalverstärkung. Die zugrundeliegende Reaktion wurde in Abbildung 2.3 dargestellt. Abbildung 2.3: OPA-Derivatisierung von primären Aminosäuren, OPA - O-Phthalaldehyd; R’SH - 3-Mercaptopropionische Säure 52 Material und Methoden Die Zeit von Injektion der Probe in den Strom der mobilen Phase bis zur Detektion der Substanz wird als Retentionszeit bezeichnet. Diese ist charakteristisch für den Analyten und wird ebenso wie die sich im Chromatogramm ergebende konzentrationsabhängige Peakfläche für die Kalibrierung des Systems mit den zu bestimmenden Substanzen genutzt. Für die Kalibrierung des Systems wurden pro Analyt fünf verschiedene Konzentrationen eingesetzt. Diese Daten ermöglichen es, mit der verwendeten Software ChemStation die verschiedenen Metabolite in den Proben zu quantifizieren. Durch die Anwendung von zwei verschiedenen Methoden (siehe Tabelle 2.5), konnten sowohl Zucker und organische Säuren als auch die primären Aminosäuren detektiert werden. C. albicans wurde wie in 2.8.2 beschrieben kultiviert. Zu den gewünschten Zeitpunkten wurde je 1 ml der Kultur entnommen. Der zu analysierende Kulturüberstand wurde durch Zentrifugation von den Zellen getrennt und bis zur weiteren Analyse bei −20◦ C gelagert. Vor der Probeninjektion in die HPLC wurden die Proben mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 µl partikelfrei filtriert. In die Wells Tabelle 2.5: Übersicht der angewendeten HPLC-Methoden Analyte organische Säuren, primäre Aminosäuren Zucker Methode REZEXROAORGACID.M AS ECLIPSE PLUSC18.M Säule RezexRoA Zorbax EclipseC18plus Laufmittel 2,5 mM H2 SO4 LM-AA A, LM-AA B Gradient - 0-0,5 min 2 % LM-AA B 20 min 57 % LM-AA B 20,1 min 100 % LM-AA B 23,5 min 100 % LM-AA B 23,6 min 2 % LM-AA B Temperatur 60◦ C 40◦ C Fluss 0,04 ml/min 0,42 ml/min Vorsäulen- - OPA Derivatisierung Injektionsvolumen 10 µl 5 µl Detektion DAD (Sig 210(40) nm Ref DAD (Sig 338(10) nm, Ref 360(100) nm), RID 390(20) nm) Material und Methoden 53 einer 96-Well-Platte wurden je 100 µl der Filtrate pipettiert. Die Platte wurde mit einer Abdeckmatte verschlossen und bis zur Injektion bei 4◦ C im Autosampler der HPLC inkubiert. 2.9 2.9.1 Arbeiten mit humanen Zelllinien Kultivierung Die humanen Epithelzellen wurden aus 1 ml-Kryokonserven reaktiviert. Die Konserven wurden bei 37◦ C aufgetaut, in ein Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgewärmten Zellkulturmedium RPMI + 10 % FBS überführt und 3 min bei 250 x g zentrifugiert. Das erhaltene Zellpellet wurde in 10 ml Medium resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt. Bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90 % wurden die Zellen bei 37◦ C in einem nassbegastem Brutschrank bei 5 % CO2 kultiviert. Das Passagieren der Zellen erfolgte nach zweimaligem Waschen mit PBS durch enzymatisches Ablösen vom Kulturgefäßboden mit Trypsin-EDTA Lösung (5 % des Kulturvolumens). Die Zellen wurden für 5 min mit Trypsin-EDTA Lösung im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion mit der dem Kulturgefäß entsprechenden Menge Kulturmedium gestoppt. Sollten die Zellen für einen Versuch genutzt werden, wurde die Zellzahl der Suspension wie in Kapitel 2.7 beschrieben bestimmt und die Zellen in der gewünschten Dichte in den entsprechenden Kulturgefäßen ausgesät. Für die weitere Kultivierung wurden die A431- und Caco2-Zellen in einer Verdünnung von 1:5, die A549-Zellen in einer Verdünnung von 1:50 in einem neuen Kulturgefäß ausgesät. Eine Zusammenstellung der verwendeten Kulturgefäße und zugehörigen Mediumvolumina sind in Tabelle 2.6 dargestellt. Alle Medien wurden vor ihrer Verwendung auf 37◦ C vorgewärmt. Die Zellen wurden bis zur 50. Passage verwendet. Die Zeit zwischen zwei Passagen betrug 3-7 Tage. Zur Langzeitlagerung wurden in den frühen Passagen konfluente Zellen wie oben beschrieben trypsinisiert und in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert. Die Zellen wurden 3 min bei 250 x g pelletiert, in 1 ml Einfriermedium (RPMI + 10 % FBS + 5 % DMSO) resuspendiert und in ein Kryoröhrchen überführt. Um eine optimale Zellausbeute beim Einfrieren zu erzielen, wurden die Kryoröhrchen in einem mit Isopropanol befüllten Kryo-Einfriergerät für mindestens 24 h bei −80◦ C gelagert, bevor sie dauerhaft in flüssigem Stickstoff bei −196◦ C gelagert wurden. 54 Material und Methoden Tabelle 2.6: Verwendete Kulturgefäße und Mediumvolumina in der Zellkultur Kulturgefäß Mediumvolumen Mediumvolumen bei Kultivierung bei Infektion 25 cm2 -Flaschen 10 ml - 75 cm2 -Flaschen 30 ml - 175 cm -Flaschen 50 ml - 4-Kompartiment-Schalen 700 µl/well 500 µl/well 6-Well-Platten 5 ml 3 ml 24-Well-Platten 700 µl/well 500 µl/well 2 mit Glasboden 2.9.2 Toxizitätstests Zur Bestimmung der Toxizität von Substanzen auf die Epithelzellen wurden zwei Testsysteme herangezogen, die im Folgenden näher erläutert werden. Die Vorbehandlung der Zellen erfolgte für alle drei Methoden gleich. Wie in Absatz 2.9.1 beschrieben wurden 0,5 · 105 Zellen in einem Volumen von 120 µl RPMI + 10 % FBS in den Wells einer 96-Well-Platte ausgesät und für 2 bis 3 Stunden im Brutschrank inkubiert. In einer weiteren 96-Well-Platte wurden die Verdünnungen der Substanzen vorbereitet. Hierfür wurden in die Wells der Spalten 2 bis 12 je 100 µl RPMI + 10 % FBS vorgelegt. In die erste Spalte der Platte wurden die zu testenden Substanzen und die erforderlichen Lösungsmittelkontrollen in einem Gesamtvolumen von 150 µl gegeben. Das Erstellen der Verdünnungsreihe erfolgte durch Transferieren von 50µl Flüssigkeit aus den Wells der ersten Spalte in die entsprechenden Wells der zweiten Spalte. Nach Durchmischung wurden erneut 50µl aus den Wells der zweiten Spalte in die Wells der dritten Spalte transferiert. Diese Prozedur wurde bis zum 10. Well wiederholt. Die übrigen 50 µl wurden verworfen. Die 11. Spalte diente der unbehandelten Kontrolle, die 12. Spalte wurde für die Lösungsmittelkontrolle verwendet. Nach Ablauf der zweistündigen Inkubation der nun angehefteten Zellen wurden je 60 µl der Substanzverdünnung zu den entsprechenden Wells der vorbereiteten Zellplatte gegeben. Je nach Testsystem wurden die Zellen 24 oder 48 Stunden kultiviert. Alle Untersuchungen wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt. Material und Methoden 2.9.2.1 55 CFSE-Test Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFDA-SE) ist ein membrangängiges Molekül, das innerhalb der Zelle von intrazellulären Esterasen durch Abspaltung zweier Acetatgruppe in das fluoreszente Carboxyfluorescein-Succinimidyl Ester (CFSE) umgewandelt wird (siehe Abbildung 2.4). Die Succinimidylestergruppe des CFSE reagiert mit primären Aminen und verbindet sie so mit intrazellulären Proteinen [154]. Abbildung 2.4: Reduktion von CFDA-SE zu CFSE, das colorimetrisch detektiert werden kann Nach einer 48-stündigen Inkubation der behandelten Zellen mit der Testsubstanz wurde das Medium aus der 96-Well-Platte entfernt. Es erfolgte die Zugabe von 100µl CFSE-Lösung, die zuvor durch eine 1:500 Verdünnung in PBS aus der Stammlösung (1 mg/ml) hergestellt wurde. Die Platte wurde für 10 min bei Raumtemperatur dunkel inkubiert und anschließend erfolgte die Messung der entstehenden Fluoreszenz am Synergy4 bei einer Anregungswellenlänge von 485/20 nm und einer Emissionswellenlänge von 528/20 nm. 2.9.2.2 R AlamarBlue -Test R Der AlamarBlue -Test beruht auf der irreversiblen Reduktion des wasserlöslichen, blauen Redox-Farbstoffes Resazurin (synonym: Alamarblau) zu dem rosafarbenen, R fluoreszierenden Resorufin. Der aktive Bestandteil von AlamarBlue Resazurin ist eine nicht toxische, membrangängige Substanz, die von lebenden Zellen in Resorufin umgewandelt wird. Die sich ergebenden Fluoreszenzintensitäten korrelieren mit der Aktivität der Zellen. Somit ist eine quantitative Bestimmung der Zellvitalität möglich [155, 156]. R Zu den wie oben beschrieben behandelten Zellen wurden 18 µl AlamarBlue - Lösung gegeben. Es erfolgte eine Inkubation bei 37◦ C im Brutschrank. Die Messungen wurden nach 3 und 5 Stunden am Synergy4 bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm und einer Emissionswellenlänge von 490 nm durchgeführt. 56 Material und Methoden Abbildung 2.5: Reduktion von Resazurin zu Resorufin, das colorimetrisch detektiert werden kann 2.9.3 Infektion der Epithelzellen mit Candida albicans Für die in dieser Arbeit durchgeführten Infektionen wurden humane Epithelzellen verwendet, die nach Protokoll 2.9.1 ausgesät und für 48 (in seltenen Ausnahmen 72) Stunden kultiviert wurden. Die eingesetzten Zellzahlen variierten hierbei von den verwendeten Zellkulturgefäßen. So wurden pro Kompartiment einer 4-Kompartimentschale mit Glasboden (Greiner) und pro Well einer 24-Well-Platten 1 · 105 Zellen eingesetzt. In die Wells einer 6-Well-Platte wurden 0,5 · 106 gegeben. Vor der Infektion wurden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem, serumfreiem RPMI gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe von serumfreiem RPMI in den in Tabelle 2.6 angegebenen Medienvolumina bei Infektion. Bis zur Zugabe von C. albicans wurden die Zellen im Brutschrank gelagert (maximal 1 h). Sollten dem Infektionsansatz weitere Mediumszusätze zugegeben werden, so erfolgte dies vor der Infektion. LL-37 wurde 30 min, Inhibitoren 15 min vor Infektion zugegeben. Die C. albicansStämme wurden wie in Kapitel 2.8.2 beschrieben kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase verwendet. 2 bis 4 ml der Kulturen wurden zentrifugiert (16000 x g, 3 min, RT). Das erhaltene Pellet wurde in vorgewärmtem serumfreien RPMI resuspendiert und mit selbigem Medium zweimal gewaschen. Nach erneutem Resuspendieren wurden die Hefen in RPMI aufgenommen und die Zellzahl der Suspension ermittelt (siehe Absatz 2.7). Die Infektionen erfolgten abhängig vom Experiment stets mit einer definierten Anzahl C. albicans und für eine definierte Zeit bei 37◦ C im CO2 -begasten Brutschrank. Material und Methoden 2.9.4 57 Adhärenzassay Um den Einfluss verschiedener Substanzen auf die Adhärenz von Candida albicans an Epithelzellen zu untersuchen, wurden die Epithelzellen wie in Kapitel 2.9.1 erläutert, in 4-Kompartimentschalen mit Glasboden (Greiner) ausgesät. Die Kultivierung der C. albicans-Stämme und die Infektion erfolgten wie in den Abschnitten 2.8.2 und 2.9.3 beschrieben mit 1 · 105 Candida-Zellen. Nach einer Infektionszeit von 90 min wurden bei Bedarf die Überstände für weitere Untersuchungen abgenommen und bei −20◦ C gelagert. Die Zellen wurden durch dreimaliges Waschen mit 1x PBS von den nicht adhärenten C. albicans befreit und anschließend mit 500 µl Formalin-Lösung (2 % in 1x PBS) fixiert. Bei Bedarf wurden C. albicans in den Infektionspräparaten mit Calcoflour white gefärbt. Hierbei handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der Cellulose- und Chitin-haltige Strukturen bindet. Die fixierten Präparate wurden dreimal mit 1x PBS gewaschen und anschließend erfolgte eine Inkubation der Zellen mit 300 µl Calcoflour white-Lösung (1:2 Verdünnung in 1x PBS) für 1 min im Dunkeln. Nach 5-maligem Waschen mit 1x PBS wurden 500 µl 1x PBS auf die Präparate gegeben. Die Betrachtung der so bearbeiten Präparate erfolgte unter dem digitalen Mikroskop (Objektiv 20 x 0,75) im Hellfeld. Es wurden mindestens sieben mikroskopische Aufnahmen pro Behandlung erstellt. Bei durchgeführter Calcofluor white-Färbung der Präparate, wurde auch die entsprechende Aufnahme im Fluoreszenzkanal gemacht. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software „BZ-Analyser“ konnten die zusammengehörenden Aufnahmen übereinandergelegt werden (Overlay). Die Anzahl der adhärenten C. albicans wurde durch Auszählung mit der Zählfunktion des Programms „BZ-Analyser“ bestimmt. 2.9.5 Lebend/Tot-Färbung R Das LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) ermöglicht durch die si- multane Färbung mit zwei Farbstoffen eine schnelle und einfache Unterscheidung zwischen toten und lebenden Zellen innerhalb einer Epithelzellpopulation. In lebenden Zellen kann das membrangängige Calcein AM durch intrazelluläre Esterasen zu dem grün fluoresziernden Calcein umgewandelt werden (siehe Abbildung 2.6). Der zweite Farbstoff, das rot-fluoreszierende Ethidium Homodimers-1 (EthD1), kann nur in geschädigte/tote Zellen eindringen und bindet an Nukleinsäuren, was eine 40-fache Verstärkung der Fluoreszenz bewirkt. Somit kann in den gefärbten Präparaten zwischen lebenden und toten Zellen unterschieden werden. Die toten Zellen emittieren 58 Material und Methoden eine rote Fluoreszenz, die lebenden eine grüne. Die Epithelzellen wurden wie in Kapitel 2.9.1 in 4-Kompartimentschalen mit Glasboden (Greiner) angezogen und nach der gewünschten Behandlung gefärbt. Hierfür wurden die Überstände verworfen und die Zellen mit 200 µl der Färbelösung (0,5 µl Calcein AM und 1 µl EthD1 auf 1 ml 1x PBS) pro Kompartiment beschichtet. Nach einer 30-minütigen Inkubation im CO2 -begasten Brutschrank erfolgte ein dreimaliges Waschen der Zellen mit 1x PBS und die Fixierung mit 500 µl Formalin-Lösung (2 % in 1x PBS). Mit Hilfe des digitalen Mikroskops wurden mindestens sieben Aufnahmen pro Behandlung jeweils im Hellfeld und in den Fluoreszenzkanälen „Rot“ und „Grün“ erstellt. Die Bildanalyse-Software „BZ-Analyser“ ermöglichte eine Auswertung der Histogramme der Fluoreszenzaufnahmen. Die ermittelten Werte der durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten im Bild wurden für die Auswertung verwendet. Abbildung 2.6: Umwandlung des membrangängigen Calcein AM zu dem fluoreszierenden Calcein durch intrazelluläre Esterasen 2.9.6 Annexin-Färbung In speziellen Fällen ist es wünschenswert, die zellschädigenden Eigenschaften von Substanzen näher zu charakterisieren. Entscheidend ist hierbei die Art des Ablaufs des Zelltods. Man unterscheidet zwischen dem programmierten Zelltod, der Apoptose, und dem willkürlichen Zelltod, der Nekrose. Bei eintretender Apoptose werden in der asymmetrisch aufgebauten Membran der Epithelzellen normalerweise membraninnenständige Phospholipide (Phosphatidylserin - PS) an die Außenseite transferiert. Auf diese Weise werden die apoptotischen Zellen von Makrophagen erkannt und können durch Phagozytose eliminiert werden, ohne dass es zu einer unkontrol- Material und Methoden 59 lierten Freisetzung von Zellbestandteilen kommt. PS kann durch FITC-gekoppeltes Annexin V, das an PS bindet, nachgewiesen werden. Da Annexin V auch in geschädigte Zellen eindringen kann, ist die Doppelfärbung mit einem zweiten Farbstoff erforderlich. Hierfür wurde das rot-fluoreszierende 7-Aminoactinomycin D (7AAD) verwendet. Diese Substanz kann nur in geschädigte Zellen eintreten und interkaliert mit doppelsträngiger DNA. Somit weisen apoptotische Zellen eine Grünfluoreszenz auf und nekrotische Zellen sowohl eine Grün- als auch eine Rotfluoreszenz, die im Overlay gelb erscheint. Lebende Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Die Kultivierung der Epithelzellen erfolgte wie in Abschnitt 2.9.1 beschrieben in 4-Kompartimentschalen mit Glasboden (Greiner). Nach der Behandlung wurden die Zellen dreimal mit 1x PBS gewaschen und anschließend mit der 150 µl Färbelösung pro Kompartiment überschichtet und für 15 min im CO2 -begasten Brutschrank bei 37◦ C inkubiert. Die Färbelösung wurde aus 20 µl Annexin V und 10 µl 7AAD (Stocklösung 1 mg/ml) in 1 ml 1x Bindungspuffer hergestellt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 1x PBS gewaschen und mit 500 µl Formalin-Lösung (2 % in 1x PBS) fixiert. Die mikroskopische Auswertung der Präparate erfolgte wie für die Lebend/Tot-Färbung in Abschnitt 2.9.5 beschrieben. 2.9.7 Färbung des Aktin-Zytoskeletts und des Zellkerns Das filamentöse Aktin (F-Aktin) ist ein wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts. Es stabilisiert die äußere Zellform und vermittelt intrazellulären Transport. Die Färbung des F-Aktins in den Epithelzellen A431 erfolgte durch Phalloidin, das an den R Farbstoff Alexa Fluor 488-Phalloidin gekoppelt ist. Phalloidin ist ein bizyklisches, toxisches Peptid, das aus dem Knollenblätterpilz isoliert wird. Es bindet spezifisch an filamentöses F-Aktin. Die wie in Kapitel 2.9.1 und 2.9.3 kultivierten und infizierten Zellen wurden mit 500 µl Formalin-Lösung (2 % in 1x PBS) für 15 min bei RT fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit 1x PBS wurden die Zellen mit 100 µl 0,05 % Triton X 100 in 1x PBS für 5 min inkubiert und somit permeabilisiert. Es folgte ein dreimaliges Waschen mit R 1x PBS und die Färbung mit 100 µl Alexa Fluor 488-Phalloidin (2 U/ml in 1x PBS mit 2 % FBS) für eine Stunde dunkel bei 37◦ C. Die Zellen wurden dreimal mit R Gold Antifade Reagent 1x PBS gewaschen und anschließend mit 10 µl ProLong with DAPI für 1 min inkubiert. DAPI ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der DNA bindet und somit eine Färbung des Zellkerns ermöglicht. Um ein Austrocknen der Präparate zu verhindern, wurden 400 µl 1x PBS zugegeben. Die Untersuchung der Zellen 60 Material und Methoden erfolgte am Fluoreszenzmikroskop. 2.9.8 Analyse der Oberflächenrezeptoren der Epithelzellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie Die Untersuchung der Oberflächenrezeptoren der humanen Epithelzellen wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie durchgeführt. Dies ist ein Verfahren, das die quantitative Vermessung und molekulare Charakterisierung intakter Zellen erlaubt. Hierbei fließen Zellen einzeln unter hoher Geschwindigkeit durch eine Flusszelle und passieren den Messbereich eines Laserstrahls. Aufgrund der Form, Struktur und Farbe der Zellen werden unterschiedliche Effekte erzeugt. Die dabei entstehenden Signale wie Streulicht oder Fluoreszenz werden von einem Detektor ausgewertet und ermöglichen eine Aussage über die Zelleigenschaften. So gibt das Vorwärtsstreulicht (forward scatter - FSC) Auskunft über die Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht (sidewards scatter - SSC) über die Granularität. Wurden die Zellen außerdem mit einem fluoreszenzgekoppeltem Antikörper oder einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, können auch diese Merkmale detektiert werden. Die humanen Epithelzellen wurden wie in Kapitel 2.9.1 beschrieben zu je 0,5 · 106 Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte in RPMI + 10 % FBS ausgesät. Die Zellen wurden vor der weiteren Behandlung zweimal mit vorgewärmtem serumfreiem RPMI gewaschen. Anschließend wurden 3 ml des Mediums auf die Zellen gegeben. Da der Einfluss des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf die Zusammensetzung der Oberflächenzezeptoren untersucht werden sollte, wurde die Substanz dem Medium beigefügt und die Zellen für 90 min inkubiert. Die Ernte und Färbung der Zellen für die Durchflusszytometrie wurde wie folgt durchgeführt. Die Zellen wurden nach der gewünschten Behandlung zweimal mit PBS gewaschen und durch die Zugabe von 300 µl Trypsin-EDTA Lösung trypsinisiert. Nach der Zugabe von 3 ml kaltem FACS-Waschpuffer wurden die Zellen vorsichtig mit einem Schaber vollständig von der Oberfläche gelöst und anschließend in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Je zwei Wells einer 6-Well-Platte mit identischer Behandlung wurden hier vereinigt. Es erfolgte eine Zentrifugation bei 250 x g und 4◦ C für 5 min und eine Aufnahme des Pellets in FACS-Waschpuffer. Dieser Waschschritt wurde einmal wiederholt. Die Zellsuspension wurde auf Reaktionsgefäße verteilt, in denen die Antikörpermarkierung der Zellen erfolgte. Nach erneuter Zentrifugation und Aufnahme der Zellen in 200 µl FACS-Waschpuffer wurden die Zellen mit dem primären Antikörper für 1 h schüttelnd auf Eis inkubiert. Der Tabelle 2.7 sind die ver- Material und Methoden 61 wendeten Antikörper zu entnehmen. Anschließend erfolgte ein dreimaliges Waschen der Zellen mit 500 µl FACS-Waschpuffer wie oben beschrieben und die Färbung mit R dem sekundären Antikörper AlexaFlour 488 (siehe Tabelle 2.7) für 45 min schüt- telnd auf Eis. Der nichtgebundene sekundäre Antikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit 500 µl FACS-Waschpuffer entfernt. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen durch die Zugabe von kalter 500 µl Formalin-Lösung (2 % in 1x PBS) fixiert und in FACS-Röhrchen überführt. Die Zellen wurden sofort am FACS Calicur bzw. FACS Canto vermessen. Für eine eindeutige Auswertung der gemessenen Daten wurden als Kontrolle ungefärbte Zellen und nur mit dem sekundären Antikörper markierte Zellen jeder Behandlung vermessen. Nach der Messung der Proben wurden die Daten des FSC, SCC und der FITC-Kanal zur Quantifizierung betrachtet. Es wurde die Software FlowJo Version 7.6.3 verwendet. Tabelle 2.7: Verwendete Antikörper Name Hersteller Artikelnummer TLR2 Biomol IMG-416E TLR4 Biomol IMG-417E Dectin1 R&D MAB1859 R&D MAB172 Biomol BLD-511412 CXCR4 AlexaFlour 2.9.9 R 488 Nachweis des Zytokins IL8 mittels ELISA Der Nachweis des inflammatorischen Zytokines IL8 in den Infektionsüberständen oder im Kulturmedium der mit LL-37 behandelten Epithelzellen erfolgte mit dem enzymatischen Immunadsorptionsverfahren (kurz ELISA - enzyme linked immunosorbent assay). In dieser Arbeit wurde ein kommerziell erhältliches Kit-System (BioLegend) verwendet, das nach dem Prinzip des „Sandwich-ELISA“ aufgebaut ist. Hierbei wird das gewünschte Antigen mit Hilfe eines oberflächenfixierten Antikörpers (capture antibody) spezifisch gebunden und durch einen Biotin-gekoppelten Detektionsantikörper (detection antibody) nachgewiesen. Als Reporterenzym dient hierbei die an Avidin gekoppelte Meerrettichperoxidase (kurz HRP - horseradish peroxidase), welche die Umsetzung des Substrates Tetramethylbenzidin (TMB) katalysiert. Es kommt zu einer Farbreaktion, die mit 2 N Schwefelsäure gestoppt und durch Absorptionsmessung quantifiziert werden kann. Die Intensität der Farbe korreliert dabei mit der Konzentration des gebildeten Nitrophenols und somit auch mit 62 Material und Methoden der Konzentration des analysierten Antigens. Zur Berechnung der tatsächlichen Antigenkonzentrationen in den Proben ist der Vergleich mit einer Verdünnungsreihe eines Standards definierter Konzentration erforderlich. Wie oben erwähnt wurde zum Nachweis des Zytokins IL8 mit dem Kit-System der Firma BioLegend gearbeitet. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerprotokoll. Die Analysen wurden in volumenreduzierten 96-Well-Platten durchgeführt und alle Volumenangaben halbiert. Die zu untersuchenden Proben wurden unverdünnt verwendet. Mit dem im Kit enthaltenen IL8-Standard wurde eine Kalibrierreihe erstellt, die zur Berechnung der Zytokinkonzentrationen in den Kultur- und Infektionsüberständen genutzt wurde. 2.10 2.10.1 Genexpressionsanalysen Isolation von RNA aus humanen Zellen Es wurden 1 · 105 Zellen pro Well einer 24-Well-Platte in RPMI + 10 % FBS ausgesät und für 72 h kultiviert (siehe Kapitel 2.9.1). Die Behandlung der Zellen erfolgte wie in Absatz 2.9.3 beschrieben. Nach dem Ablauf der gewünschten Inkubationszeit wurden die Überstände der Zellen entfernt und für weitere Analysen bei −20◦ C gelagert. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und es erfolgte die Lyse der Zellen durch die sofortige Zugabe von 350 µl RLT-Puffer (RNeasy Kit, Qiagen). Nach dem Abschaben wurde das Lysat zur Homogenisierung durch die QIAShredder-Säulen gegeben. Aus der erhaltenen Suspension wurde die RNA mit Hilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert. Der im Protokoll aufgeführte optionale DNase-Verdau wurde durchgeführt. Die RNA wurde mit 30 µl nukleasefreiem Wasser eluiert und bis zum weiteren Gebrauch bei −80◦ C gelagert. 2.10.2 Isolation von RNA aus Candida albicans Der C. albicans-Stamm SC5314 wurde wie in Kapitel 2.8.2 beschrieben kultiviert und die Arbeitskultur im exponentiellen Wachstum verwendet. Die Zellen dieser Kultur wurden durch Zentrifugation bei 8000 x g für 5 min pelletiert und zweimal mit RPMI-MOPS gewaschen. Ausgehend aus dieser Zellsuspension wurde eine Arbeitskultur mit einer optischen Dichte von 0,1 eingestellt. Je 2 ml dieser Kultur wurden in 2 ml Reaktionsgefäße gegeben und wie gewünscht behandelt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Proben zentrifugiert (16000 x g, 5 min, RT), der Material und Methoden 63 Überstand abgenommen und für weitere Analysen bei −20◦ C gelagert. Das Zellpellet wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Bearbeitung bei −80◦ C gelagert. Für die RNA-Extraktion wurden die Proben auf Eis aufgetaut und in 600 µl RLT-Puffer (RNeasy Kit, Qiagen) resuspendiert. Das Gemisch wurde in ein 2 ml-Reaktionsgefäß mit 0,5 g Glasperlen gegeben. Der Zellaufschluss erfolgte durch siebenmaliges Vortexen für 30 sec. Zwischen den einzelnen Vortexschritten wurden die Proben für 30 sec auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Proben für 2 min bei 16000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und mit 600 µl 70 % Ethanol gemischt. Die Durchführung aller weiteren Schritte erfolgte nach dem Protokoll des RNeasy Kits (Qiagen). Ein DNase-Verdau wurde durchgeführt. Die RNA wurde in 30 µl nukleasefreiem Wasser eluiert und bis zum weiteren Gebrauch bei −80◦ C gelagert. 2.10.3 Konzentrationsbestimmung und Qualitätskontrolle der RNA Die Konzentrationsbestimmung der isolierte RNA erfolgte am spektrophotometrisch NanoDrop1000. Es wurden hierfür stets 2 µl eingesetzt. Die Qualitätskontrolle erfolgte am HZI im Labor der „Array Facility“ durch Sabrina Kaser und Petra Hagendorff. Verwendet wurde ein RNA 6000 NanoChip (Agilent). Das Elektropherogramm wurde mit Hilfe eines Agilent 2100 Bioanalyzers aufgenommen, ein Beispiel wurde in Abbildung 2.7 gezeigt. RNA von reiner Qualität zeigt zwei Maxima im Graphen des Elektropherogramms, die denen der 18S- bzw. 28S-RNA entsprechen und keine weiteren Degradationsprodukte. Alle Proben, die in der RT-PCR oder im Mikroarray analysiert werden sollten, wurden kontrolliert. Abbildung 2.7: Elektropherogramm einer RNA-Qualitätskontrolle. Eine deutliche Trennung der scharfen Peaks, ist zu erkennen. Der rechte Peak, der die 28S-rRNA detektiert, sollte die doppelte Höhe des linken Peaks (18S-rRNA) aufweisen. 64 Material und Methoden 2.10.4 Genexpressionsanalyse von Candida albicans Zur Genexpressionsanalyse von LL-37 behandelter Candida albicans wurden 8 x 15k Custom Gene Expression Arrays für Candida albicans der Firma Agilent Technologies verwendet. Diese Mikroarrays beinhalten je zwei oder vier Sonden für 6203 Gene, sowie je 20 Sonden für 10 Spike-In-Kontrollen, 336 Sonden für Hybridisierungs- und Rasterkontrollen. Die in der Hybridisierung mit dem Mikroarray eingesetzten Proben wurden mit Hilfe des Low-Input QuickAmp Labeling Kits von Agilent wie folgt vorbereitet. Es wurden je Reaktionsanstz 100 ng RNA und eine Spike-in-Kontrollmischung (OneColor RNA Spike-In Kit, Agilent) eingesetzt. Die Reaktionen wurden in 200 µl Reaktionsgefäßen im Thermocycler durchgeführt. Die Reaktionen gliederten sich in mehrere Schritte. Zunächst wurde die cDNA synthetisiert, die anschließend in cRNA transkribiert wurde. In diesem Schritt erfolgte der Einbau von Cy3gekoppelten CTPs. Die synthetisierte cRNA wurde durch RNeasy-Säulen (Qiagen) aufgereinigt und ihre Konzentration und die Cy3-Einbaueffizienz mit Hilfe des NanoDrop1000 spektophotometrisch bestimmt. Die Fragmentierung erfolgte mit 600 ng der Cy3-markierten cRNA. Die cRNA wurde mit nukleasefreiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 24 µl aufgefüllt und mit 1 µl 25x Fragmentierungspuffer und 5 µl 10x Blockierungsagenz gemischt. Das Gemisch wurde für 30 min bei 60◦ C inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 27 µl Hybridisierungspuffer und eine einminütige Zentrifugation. Für die Hybridisierung wurden 40 µl der hergestellten Suspension auf einen speziellen Objektträger, den sogenannten Gasket Slide, pipettiert und mit dem eigentlichen Mikroarrayträger verschlossen. Der Array wurde in einer Hybridisierungskammer (Hybridization Chamber Kit, Agilent) eingeklemmt, fest verschlossen und im Hybridisierungsofen für 17 h bei 65◦ C und 10 rpm inkubiert. Anschließend wurde der Mikroarray in einer Waschlösung (Gene Expression Wash Buffer 1, Agilent) untergetaucht, geöffnet, in frische Waschlösung 1 (RT) transferiert und unter leichtem Schwenken 1 min gewaschen. Es folgte ein zweiter Waschschritt in 37◦ C warmen Waschpuffer 2 (Gene Expression Wash Buffer 2, Agilent) für 2 min. Anschließend wurden die Mikroarrays für 1 min durch Zentrifugation in der Microarray High Speed Centrifuge getrocknet. In einer speziellen Fassung (Slide Holder, Agilent) wurden die Mikroarrays im Mikroarrayscanner mit den Standardeinstellungen für einfarbig markierte 8 x 15k-Arrays gescannt. Material und Methoden 2.10.5 65 cDNA-Synthese und RT-PCR Für die Validierung von Daten auf Proteinebene wurde die Methode der qRT-PCR (quantitative real-time PCR) genutzt, die die Messung der relativen Genexpression erlaubt. Während der PCR (Polymerase Chain Reaction) werden Farbstoffe (in dieR ser Arbeit der Cyanin-Farbstoff SYBR Green) in die neu gebildeten doppelsträn- gige DNA eingebaut. Die detektierbare Fluoreszenz des eingebauten Farbstoffes ist dabei proportional zu der Menge synthetisierter DNA. Somit ermöglicht diese Methode die Abschätzung der Anzahl gebildeter PCR-Produkte nach jedem Zyklus der Reaktion, man spricht daher auch von quantitativer Echtzeit-PCR. Ausgehend von der isolierten RNA (siehe Kapitel 2.10.1) erfolgte in einem reversen Transkriptionsschritt die Synthese der cDNA im Thermocycler. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von 12 µl je 1 µg RNA mit 250 ng Oligo-dT Primer und 1,5 µg Random Primer bei 70◦ C denaturiert. Nach der Zugabe von 4 µl 5 x FirstStrand Puffer, 2 µl DTT (Endkonzentration 10 mM), 1 µl dNTPs (Endkonzentration R je 500 µM) und 1 µl Reverse Transkriptase (Superscript II, 10 U/Ansatz) erfolgte die Transkription für 1 h bei 42◦ C. Die Proben wurden stets auf Eis gelagert. Es wurde mit Chemikalien von InvitrogenTM gearbeitet. Nach der Zugabe von 8 µl/1µg RNA TE erfolgte die eigentliche RT-PCR. Hierfür wurden für das Zielgen spezifische Primerpaare verwendet (siehe Tabelle 2.8), die mit Hilfe der Universal ProbeLibrary Assay Design Center von Roche von Katja Gremmer (Arbeitsgruppe BISA, HZI) ausgewählt wurden. Aus den jeweiligen Primerpaaren wurden mit nukleasefreiem Wasser Primerverdünnungen mit einer Konzentration von 2 pmol/µl je Primer hergestellt. Ebenso wurde die cDNA 1:2,5 verdünnt. Je 2,5 µl Primerverdünnung und 2,5 µl cDNA-Verdünnung wurden in die Wells einer 384-Well-Platte (Roche) gegeben. Neben den Proben, die die zu untersuchenden cDNA enthielten, wurden auch Kontrollproben ohne cDNA hergestellt. Die Untersuchung aller Proben erfolgte in R Doppelbestimmungen. Nach der Zugabe von 5 µl SYBR Green (Roche) wurde die R RT-PCR im LightCycler 480 nach Standardprotokoll (Roche) in der Array Facility, HZI durchgeführt. Das Programm war wie folgt aufgebaut: 95◦ C 5 min Denaturierung 95◦ C 10 sec Hybridisierung 60◦ C 10 sec Elongation 72◦ C 10 sec ◦ - 97◦ C Denaturierung 45 Zyklen Schmelzkurve 65 C 66 Material und Methoden Tabelle 2.8: Übersicht der in der RT-PCR verwendeten Primer Genname Gen ID Primer links Primer rechts CLEC7A NM_197947 ctttctcggccccagact ttgggtagctgtggttctga CXCR4 NM_001008540 attgggatcagcatcgactc caaactcacacccttgcttg IL8 NM_000584 agacagcagagcacacaagc aggaaggctgccaagagag TLR2 NM_003264 tgtcattctttcttcctgctaaga ctaggtaggacagagaatgccttt TLR4 NM_138554 ccatggccttcctctcct HPRT1 NM_000194 tgaccttgatttattttgcatacc cgagcaagacgttcagtcct RPL13A NM_012423 tgaccaataggaagagcaacc agatgccccactcacaagat GAPDH NM_002046 agccacatcgctcagacac gcccaatacgaccaaatcc ctgtgtggtttagggccaag R Die oben beschriebene fluorimetrische Bestimmung des eingebauten SYBR Green erfolgte in jedem Zyklus nach der Elongationsphase. Mit Hilfe der ProgramR moption „Abs Quant/2nd Derivative Max method“ der LightCyclers 480 Software Relative Quantification wurde die Zykluszahl ermittelt, bei der die detektierte Fluoreszenz erstmalig signifikant über der Hintergrund-Fluoreszenz lag. Dieser Schwellenwert wird auch Cp-Wert (crossing point) genannt. Da diese Werte stark von der Menge der eingesetzten cDNA Menge abhängig sind, war es erforderlich, mit sogenannten Haushaltsgenen (Housekeeper) eine Normalisierung vorzunehmen. Dies erfolgte nach der Formel: ∆Cp = Cp (Gen) − Cp (Housekeeper) . Unter der Annahme einer Verdopplung des Fluoreszenzsignals pro Zyklus, wurde die logarithmische relative Genexpressionsänderung (log2 Fold Change) wie folgte berechnet: log2 F C = −(∆Cp (P robe) − ∆Cp (Kontrollprobe) F C = 2log2 F C Kapitel 3 Ergebnisse 3.1 3.1.1 Methodenetablierung an der HPLC Analytik organischer Säuren und Kohlenhydrate Die Analyse der organischen Säuren und Zucker mittels HPLC wurde mit der RezexROA-Säule und dem Laufmittel H2 SO4 duchgeführt (Kap. 2.8.9). Die Kalibrierung lieferte die in Tabelle 3.1 aufgeführten Retentionszeiten und unteren Detektionslimits für die einzelnen getesteten Standards. In der Abbildung 3.1 sind beispielhaft die Chromatogramme von vier verschiedenen Standardgemischen dargestellt. Alle analysierten Substanzen zeigen klar voneinander abgegrenzte Peaks. Die Substanznamen sind im Chromatogramm angegeben. Die Standards konnten reproduzierbar quantifiziert werden. Die Schwankungen der Peakflächen und somit die berechneten Konzentrationen lagen bei maximal 8 %. Somit wurde die Methode der Analytik der organischen Säuren und Kohlenhydrate erfolgreich etabliert. 3.1.2 Aminosäureanalytik Die Auftrennung der Aminosäuren erfolgte nach einer Vorsäulenderivatisierung mit OPA über die Zorbax EclipseC18plus-Säule (Kap. 2.8.9). Tabelle 3.2 zeigt die für die Kalibrierung verwendeten Standards, ihre Retentionszeiten und die ermittelten unteren Detektionslimits. In Abbildung 3.2 ist ein typisches Chromatogramm mit der Auftrennung eines Standardgemisches gezeigt. Alle 19 analysierten Aminosäuren erscheinen in separaten Peaks, die mit dem Substanznamen markiert sind. Die Messungen waren gut reproduzierbar. Es traten bei der Berechnung der Peakflächen Abweichungen von maximal 11 % auf. Die Aminosäure Prolin war jedoch mit 67 68 Ergebnisse Tabelle 3.1: Detektionslimits der Analyse der organischen Säuren und Kohlenhydrate mittels der Rezex-ROA Säule in der HPLC. Angegeben sind die minimal verläßlich quantifizierbaren Konzentrationen (als Peak von der Software detektiert) und die Retentionszeiten bei Detektion im RI-Detektor. Die Detektion erfolgte im DAD aufgrund des Geräteaufbaus 0,9 min früher. nd - nicht detektiert Standard Retentionszeit [min] Konzentration [mM] RI RI DAD Ammoniumsulfat 11,08 5 nd α-Ketoglutarat 13,79 1 1 Citrat 14,11 1 1 Isocitrat 14,39 1 10 Pyruvat 15,20 1 1 Glucose 15,81 1 2,5 Inositol 16,39 1 5 Malat 16,47 1 10 Succinat 19,92 2,5 1 Lactat 21,07 2,5 10 Glycerin 22,11 1 2,5 Fumarat 22,47 1 1 Formiat 22,50 2,5 1 Acetat 24,59 2,5 10 MOPS 30,53 1 nd Ethanol 33,75 1 nd dieser Methode nur bedingt analysierbar, da hier ein relativ hohes Detektionslimit vorlag. Des weiteren wurde die Stabilität des OPA-Derivates über die Zeitspanne, die für mehrere Probenläufe benötigt wurde, getestet. In Abbildung 3.3 sind die berechneten Konzentrationen der einzelnen Aminosäuren, wie sie sich aus den Signalen aufeinanderfolgender HPLC-Läufe ergaben, aufgetragen. Es wird deutlich, dass die Stabilität des OPA-Derivates über die Messung von 12 Proben (entspricht ca. 7 Stunden) erhalten blieb. Bei späteren Messungen erfolgte die Markierung der einzelnen Aminosäuren nicht mehr gleichmäßig und es entstanden Messungenauigkeiten. Insbesondere die Aminosäuren Prolin, Cystein und Lysin waren davon betroffen. Aus diesem Grund wurde es vermieden, mehr als 15 Proben in einer Sequenz zu analysieren. Ergebnisse 69 Abbildung 3.1: Chromatogramme der getesteten Standards in der Analyse der organischen Säuren und Kohlenhydraten mittels HPLC. Die einzelnen Substanzen wurden in einer Konzentration von 0,1 M vermessen. Abbildung 3.2: Chromatogramm der Analyse eines Aminosäurestandardgemisches mittels HPLC. Die Konzentration der Analyte betrug 1 mM. 70 Ergebnisse Tabelle 3.2: Detektionslimits der Analyse OPA-markierter primärer Aminosäuren mittels der Zorbax EclipseC18plus-Säule in der HPLC. Angegeben wurden die minimal verläßlich quantifizierbaren Konzentrationen (als Peak von der Software detektiert) und die Retentioszeiten bei Detektion im DAD-Detektor. Standard Retentionszeit [min] Konzentration [mM] Asparaginsäure 1,96 0,031 Glutaminsäure 3,17 0,063 Asparagin 6,12 0,125 Serin 6,82 0,016 Glutamin 7,45 0,125 Histidin 8,08 0,031 Glycin 8,44 0,031 Threonin 8,67 0,016 Arginin 9,81 0,016 Alanin 10,17 0,016 Tyrosin 11,65 0,016 Cystein 13,19 0,031 Valin 13,72 0,016 Methionin 14,00 0,1 Phenylalanin 15,39 0,031 Isoleucin 15,61 0,1 Leucin 16,36 0,031 Lysin 16,93 0,031 1.10 1.00 Menge [mM] 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0 5 10 15 Lauf 20 Asparaginsäure Glutaminsäure Serin Histidin Glycin Threonin Arginin Alanin Tyrosin Cystein Valin Methionin Phenylalanin Isoleucin Leucin Lysin Prolin Abbildung 3.3: Überprüfung der Stabilität des OPA-Derivates über 22 Messungen. Ergebnisse 3.2 71 Untersuchungen zum Wachstum und Metabolismus von Candida albicans Diese Arbeit ist Teil des BMBF-geförderten Projektes „Dr. Jeykll & Mr. Hyde: Ein systembiologischer Ansatz zur Behandlung nosokomialer Infektionen durch Candida albicans“ . Ein Ziel dieses Projektes war es, ein mathematisches Infektionsmodell „Candida albicans - Wirt“ aufzustellen, das eine Identifikation von wichtigen Schlüsselfaktoren im Infektionsprozess erlaubt. Für die Berechnung von Parametern in dem durch Projektpartner erstellten metabolische Teilmodell der Hefe wurden metabolische Untersuchungen an C. albicans in definierten Medien durchgeführt. Die Verwendung definierter Medien war hierbei erforderlich, da für die mathematischen Berechnungen genaue Konzentrationsangaben der einzelnen Medienbestandteile notwendig sind. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in diesem Kapitel aufgeführt. 3.2.1 Wachstum und Metabolismus von C. albicans in verschiedenen Medien 3.2.1.1 Wachstumsuntersuchung Der Metabolismus von Candida albicans wurde in den definierten Medien RPMI und YNB analysiert. Um Veränderungen des pH-Wertes während des Wachstums von C. albicans auszuschließen, wurden die Medien mit MOPS auf pH 7,4 (RPMIMOPS pH 7,4; YNB-MOPS pH 7,4) bzw. pH 5,6 (YNB-MOPS pH 5,6) gepuffert. Die Kulturen wurden wie in Kapitel 2.8.5 beschrieben angezogen. Stündlich wurden Proben genommen und Parameter wie optische Dichte der Kultur, Zellzahl und Trockenmasse bestimmt (Kap. 2.7 und 2.8.5). Des weiteren wurden Proben für die Bestimmung der extrazellulären und intrazellulären Metabolite genommen (Kapitel 2.8.5). Die Untersuchungen wurden in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Beispielhaft sind die Daten eines Versuches im Folgenden dargestellt. Abbildung 3.4 zeigt die Wachstumskurven. Die Messdaten der Bestimmung der optischen Dichte (in Abbildung 3.4 A dargestellt) lieferten in den verschiedenen Medien nahezu identisch verlaufende Wachstumskurven. Nach einer kurzen lag-Phase von 2 Stunden ging das Wachstum der Kulturen in die exponentielle Phase über. Nach ca. 7 Stunden trat bei den YNBKulturen das Wachstum in die stationäre Wachstumsphase ein. Für die RPMIKultur ist ein stationäres Wachstum erst nach 9 Stunden zu beobachten. Bei Be- 72 Ergebnisse 0.8 7.E+07 0.7 6.E+07 5.E+07 0.5 Zellzahl/ml OD 620nm 0.6 0.4 0.3 4.E+07 3.E+07 0.2 2.E+07 0.1 1.E+07 0 0 10 20 A 0.E+00 30 Zeit [h] B 0 5 10 15 Zeit [h] 6 Trockenmasse [mg/ml] 5 4 3 2 1 0 -1 0 C 10 20 Zeit [h] 30 YNB-MOPS pH5.6 YNB-MOPS pH7.4 RPMI-MOPS pH7.4 Abbildung 3.4: Wachstumskurven von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C: YNBMOPS pH 5,6, YNB-MOPS pH 7,4 und RPMI-MOPS pH 7,4. Es sind die sich aus der ODMessung (A), der Zellzahl (B) und der Trockenmasse (C) ermittelten Wachstumskurven dargestellt. trachtung der Zellzahlen (siehe Abb. 3.4B) zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede zwischen den Kulturen. Die stärkste Zunahme der Zellzahl war bei der Kultur im YNB-MOPS pH 5,6 zu verzeichnen. Hier korrelierte der Kurvenverlauf mit der Wachstumskurve, die sich aus der OD-Messung ergab. Die YNB-MOPS pH 7,4Kultur zeigte eine um 40 % geringere maximale Zellzahl, die RPMI-MOPS pH 7,4Kultur zeigte keine Zellteilung. Dies lag daran, dass in den neutralen Medien, die Hefezellen Hyphen ausbildeten und insbesondere im RPMI-Medium ausschließlich in dieser Form wuchsen. Im YNB-MOPS pH 7,4 kam es auch zu der Ausbildung von Pseudohyphen. Einzelne Zellen wuchsen weiter in der Hefeform und teilten sich. Im azideren YNB-MOPS pH 5,6 lag dagegen ausschließlich die Hefeform vor. Dies bestätigte sich bei Betrachtung der Trockenmasse (siehe Abb. 3.4C). Es wird deutlich, dass auch die Kulturen in den neutralen Medien einen Biomassezuwachs aufwiesen. Ergebnisse 73 Bis zu einer Kultivierung von 5 Stunden verliefen die Biomasseproduktionen nahezu identisch. Bei der weiteren Kultivierung zeigten die YNB-Kulturen den gleichen Verlauf. Die in RPMI-MOPS pH 7,4 gewachsene Kultur wies eine etwa doppelt so hohe Zunahme der Trockenmasse auf. Die Erklärung hierfür liegt vermutlich darin, dass dem RPMI-Medium Aminosäuren beigesetzt sind, die ein besseres Wachstum ermöglichten. 3.2.1.2 Analyse der extrazellulären Metabolite Die Untersuchung der extrazellulären Metabolite erfolgte mittels HPLC wie in Kapitel 2.8.9 beschrieben. In allen drei Medien konnten die Konzentrationen der organischen Säuren und der Glucose bestimmt werden. Wie in Abbildung 3.5 dargestellt, zeigte sich in allen drei Medien ein ähnlich hoher Verbrauch der Glucose (s. u. weitere Details). Die Bildung von Acetat konnte vor allem in der aziden Kultur nach 7 Stunden detektiert werden. Eine eindeutige Aussage über weitere organische Säuren, wie Lactat und Formiat, die in den Proben der YNB-Medien gemessen wurden, und Malat, das im RPMI-Medium detektiert wurde, ist nicht möglich, da die Konzentrationen hier unter dem Detektionslimit lagen. Die Bildung von Glycerin wurde nur bei Wachstum in den pH-neutralen Medien, vor allem im RPMI-Medium, beobachtet. Jedoch lagen die detektierten Mengen nah am Detektionslimit (siehe Tabelle 3.1). Ethanol wurde ebenso wie α-Ketoglutarat in allen Medien zu jeder Zeit in ähnlichen Mengen detektiert. Da beide Substanzen auch in den reinen Medien gemessen wurden, laut Herstellerangaben jedoch nicht enthalten sind, kann vermutet werden, dass es sich hierbei um weitere Substanzen handelt, die nicht in die Kalibrierung der HPLC aufgenommen worden waren. Bei der Analyse der primären Aminosäuren in den Überständen der Kulturen, die im aminosäurefreien YNB-Medium gewachsen waren, konnte kein Ausschleusen gebildeter Aminosäuren detektiert werden. Die Proben der in RPMI-MOPS pH 7,4 angezogenen Kultur zeigten eine deutliche Abnahme von 12 Aminosäuren im Überstand, wie z.B. von Serin, Glutamin, Glutaminsäure und Lysin (siehe Abb. 3.6A). Die Aminosäuren Valin, Tyrosin und Asparaginsäure wurden, wie in Abb. 3.6B verdeutlicht ist, sehr viel langsamer verbraucht. Cystein, Glycin und Methionin wurden nur in sehr geringem Maße aufgenommen. Alanin hingegen ist im Medium nicht enthalten, wurde aber nach einer zweistündigen Kultivierung im Überstand detektiert. Wachstumslimitierender Faktor war in allen drei Kulturen die Glucoseverfügbarkeit. Aufgrund der Tatsache, dass zwischen der Aufnahme der Glucose aus dem Ergebnisse 14 14 12 12 10 10 Konzentration [mM] Konzentration [mM] 74 8 6 4 2 6 4 2 0 0 2 4 A Konzentration [mM] 8 6 8 Zeit [h] 10 0 12 0 2 4 B 6 8 Zeit [h] 10 12 14 Abbildung 3.5: 12 zentrationen der zellulären organischen 10 α-Ketoglutarat Glucose Malat Lactat Glycerin Fumarat Formiat Acetat Ethanol 8 6 4 2 0 0 2 4 C 6 8 Zeit [h] 10 12 Konextra- Säuren und Glucose bei Wachstum von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C, YNB-MOPS pH 5,6 (A), YNB-MOPS pH 7,4 (B) und RPMI-MOPS pH 7,4 (C) Medium und der vollständigen intrazellulären Verwertung der Kohlenstoffquelle eine gewisse Zeit benötigt wird, tritt der Übergang in die stationäre Phase zeitlich verzögert auf. Der Verbrauch der Glucose in den Medien wurde eingehender betrachtet. Hierfür wurden in den Bereichen der linearen Abnahme der detektierten Glucosekonzentrationen (siehe Abb. 3.7) die Steigung der Geraden ermittelt. Dieser Wert stellt die Glucoseaufnahmeraten, also die Abnahme der Glucosekonzentration im Medium pro Zeiteinheit, dar. Des weiteren wurden die ermittelten Trockenmassen und die Glucosekonzentrationen der entsprechenden Zeitpunkte gegeneinander aufgetragen. Hier wurde ebenfalls in den linearen Bereichen des Kurvenverlaufs die Steigung bestimmt, welche die Biomasseausbeute der einzelnen Kulturen (Masse der gebildeten Biomasse pro verbrauchtem Gramm Glucose) angibt. Eine graphische Auftragung der detektierten Glucosekonzentrationen gegen die gemessene Trockenmasse (siehe Abb. 3.7) zeigt die Effizienz der Glucoseverwertung (verbrauchte Masse Glucose für die Bildung von einem Gramm Biomasse). Es ergaben sich die in Tabelle 3.3 aufgelisteten Werte. Es wird deutlich, dass der Glucoseverbrauch im YNB-MOPS pH 5,6- Ergebnisse 75 2.50 0.35 2.00 Menge [mM] 0.30 0.25 1.50 0.20 1.00 0.15 0.10 0.50 Menge Glutamin, Arginin [mM] 0.40 0.05 0.00 0.00 0 2 4 A 6 Zeit [h] 8 10 Asparaginsäure Glutaminsäure Asparagin Serin Histidine Threonin Phenylalanin Isoleucin Leucin Lysin Glutamin Arginin 12 Abbildung 3.6: Kon- zentrationen 0.25 der extrazellulären Amino- Menge [mM] 0.20 säuren bei Wachstum Asparagin Glycin Alanin Tyrosin Cystein Valin Methionin 0.15 0.10 0.05 von SC5314 in RPMIMOPS pH 7,4 bei 37◦ C. A: schnell verbrauchte Aminosäuren; B: gering verbrauchte 0.00 0 B 2 4 6 Zeit [h] 8 10 12 Amino- säuren bzw. gebildete Aminosäure Alanin Medium um 40 % höher war als in den Medien mit neutralem pH-Wert, für die die berechneten Werte ähnlich waren. Jedoch war die Effizienz der Glucoseverwertung im aziden Medium am geringsten. Es kam hier pro verbrauchtem Gramm Glucose zu einer Bildung von nur 0,5 g Trockenmasse, wohingegen dieser Wert für die Medien YNB-MOPS pH 7,4 und RPMI-MOPS pH 7,4 um ein Drittel erhöht bzw. mehr als verdoppelt war. Das starke Wachstum bei gleichem Glucoseverbrauch im RPMI-Medium ist vermutlich auf das Vorhandenseins von zusätzlichen wachstumsfördernden Komponenten (wie Aminosäuren und Vitamine) zurückzuführen. 3.2.1.3 Analyse der intrazellulären Metabolite Die Präparation der Proben zur Bestimmung der intrazellulären Metabolite erfolgte wie in Abschnitt 2.8.8 beschrieben. Die Untersuchung der erhaltenen Proben mittels HPLC (siehe Kapitel 2.8.9) lieferte für die Analyse der organischen Säuren und Kohlenhydrate keine aussagekräftigen Daten, da die detektierten Konzentrationen unter den ermittelten Detektionslimits lagen. Die Analyse der Aminosäuren ergab unterschiedliche Verläufe der detektierten 76 Ergebnisse 2.5 Glucose [mg/ml] 2 1.5 YNB-MOPS pH 5,6 YNB-MOPS pH 7,4 1 RPMI-MOPS pH 7,4 Abbildung 3.7: 0.5 Glucosekonzentra- tionen und gebildete Biomasse bei 0 0 1 2 Trockenmasse [mg/ml] 3 der Kultivierung von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C Tabelle 3.3: Glucoseaufnahmeraten der C. albicans-Kulturen in verschiedenen Medien YNB- YNB- RPMI- MOPS MOPS MOPS pH 5,6 pH 7,4 pH 7,4 Glucoseaufnahmerate [mM/h] 2,87 2,05 2,04 Glucoseaufnahmerate [mg/ml · h] 0,5166 0,368 0,367 Biomasseausbeute [mg TM/mg Glu] 0,710 0,948 1,598 Effizienz der Glucoseverwertung [mg Glu/mg TM] 1,319 0,941 0,623 intrazellulären Konzentrationen. So können Aminosäuren aufgrund ihres in Abbildung 3.8 dargestellten zeitlichen Konzentrationsverlaufs zu Gruppen zusammengefasst werden. So waren beispielsweise Glutamin und Alanin in allen drei Medien Vertreter der „frühen“ Aminosäuren, da ihre Konzentrationen gleich zu Beginn der Kultivierung anstiegen. Für die in RPMI-Medium gewachsene Kultur wurde der Gruppe zusätzlich Arginin zugeordnet (siehe Abb. 3.8C). Weitere Aminosäuren konnten erst nach 4 bis 5 Stunden in den Extrakten detektiert werden. Hierbei erfolgte eine weitere Unterteilung in Aminosäuren, die nach 6 bis 7 Stunden eine maximale Konzentration erreichten und im weiteren Verlauf der Kultivierung abnehmende Konzentrationen aufwiesen, sowie in Aminosäuren, die nach 6 bis 7 Stunden konstante Konzentrationen aufwiesen. Zur ersten Gruppe der „späten“ Aminosäuren zählte in allen drei verwendeten Medien Asparaginsäure. Bei der Kultivierung in RPMI-Medium zählten zu dieser Gruppe außerdem Serin, Glutamin, Histidin, Glycin, Threonin und Lysin. Serin war im Fall von YNB-MOPS pH 7,4 eine „späte“ Aminosäure mit konstanter Konzentrationen ab einer Kultivierung von 7 Stunden. Im Fall des Mediums RPMI-MOPS pH 7,4 zählten hierzu Tyrosin, Valin, Isoleucin Ergebnisse 77 und Leucin. In den YNB-Medien wurden weitere „späte“ Aminosäuren (wie z.B. Valin und Threonin) gemessen, die jedoch in ihrer Konzentration nahe am Detektionslimit lagen und nur in einer geringen Anzahl von Proben detektiert wurden, so dass eine genauere Aussagen zum Konzentrationverlauf nicht gemacht werden kann. 0.25 0.18 0.16 0.16 0.20 0.1 0.08 0.10 0.06 0.04 0.00 5 10 0.08 0.06 0 15 B 0.70 0.60 Konzentration [mM] 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.20 0.20 0.10 0.10 0.00 5 02468 10 10 12 Zeit Zeit [h] [h] 0 Zeit [h] A 0.60 0.00 0.18 0.18 0.16 0.16 0.14 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 2 4 6 8 Zeit [h] 10 12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.02 0.00 0 D 0.12 0.04 0.00 0 Asparaginsäure Glutamin Serin Glutamin Histidin Glycin Threonin Arginin Alanin Tyrosin Valin Isoleucin Leucin Lysin 15 Konzentration [mM] 0 Konzentration [mM] 0.1 0.02 0 0.60 0.04 0.05 0.02 C 0.12 Menge [mM] 0.15 0.70 0.14 Konzentration [mM] 0.12 Glutamin [mM] Konzentration [mM] 0.14 0.70 Glutamin [mM] 0.18 2 4 6 8 Zeit [h] 10 12 0 E 2 4 6 8 Zeit [h] 10 12 Abbildung 3.8: Konzentrationen der intrazellulären Aminosäuren bei Wachstum von SC5314 in verschiedenen Medien bei 37◦ C. YNB-MOPS pH 5,6 (A), YNB-MOPS pH 7,4 (B), und RPMI-MOPS pH 7,4 (C-E), C: „frühe“ Aminosäuren mit maximaler Konzentration bei 6 und 7 Stunden (Glutamin, Arginin, Alanin), D: „späte“ Aminosäuren mit maximaler Konzentration bei 6 und 7 Stunden (Asparaginsäure, Serin, Glutamin, Histidin, Glycin, Threonin und Lysin), E: „späte“ Aminosäuren, deren Konzentrationen nach 7 Stunden konstant bleiben (Tyrosin, Valin, Isoleucin und Leucin). 78 Ergebnisse 3.2.2 Einfluss von LL-37 auf Wachstum und Metabolismus von Candida albicans 3.2.2.1 Wachstumsuntersuchung Die Wirkung des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf das Wachstum von C. albicans sollte untersucht werden. Hierfür wurde der Stamm SC5314 wie in Abschnitt 2.8.5 beschrieben in RPMI-MOPS pH 7,4 kultiviert. Es wurde mit einer LL-37behandelten (30 µg/ml) und einer unbehandelten Kultur gearbeitet. Es wurden sowohl das Wachstum als auch der Metabolismus in den Proben analysiert. Diese Untersuchungen wurden in fünf unabhängigen Experimenten durchgeführt. Da sie alle vergleichbare Ergebnisse lieferten, wurde beispielhaft ein Versuch herausgegriffen. Wie in Abbildung 3.9 deutlich wird, zeigten die Wachstumskurven, die sich aus den Messdaten der Bestimmung der optischen Dichte und der Trockenmasse ergaben, keinen deutlichen Einfluss der LL-37-Behandlung. In der exponentiellen Phase (3 bis 6 h) des Wachstums wies der graphische Verlauf der OD-Messdaten der unbehandelten Kultur eine stärkere Steigung auf, was für ein leicht beschleunigtes Wachstum spricht. Des weiteren wurden in dieser Kultur 10 % höhere OD-Werte gemessen als in der LL-37-behandelten Kultur. Ebenso zeigte sich im graphischen Verlauf der Daten aus der Trockenmassenbestimmung eine schnellere Zunahme der Biomasse im Bereich des exponentiellen Wachstums. Die Biomassen am Ende der Untersuchung zeigten keine Abweichungen. Dies läßt Unterschiede in der Hyphen- 0.5 2 0.45 1.8 0.4 1.6 0.35 1.4 Masse [mg/ml] OD 620nm bildung vermuten, worauf in Kapitel 3.4 näher eingegangen wird. 0.3 0.25 0.2 1 unbehandelt LL-37 (30µg/ml) 0.8 0.15 0.6 0.1 0.4 0.05 0.2 0 0 0 A 1.2 2 4 6 Zeit [h] 8 10 0 B 2 4 6 8 10 Zeit [h] Abbildung 3.9: Wachstumskurve nach OD-Messung (A) und Trockenmasse (B) in RPMIMOPS pH 7,4 mit und ohne LL-37 bei 37◦ C Ergebnisse 3.2.2.2 79 Analyse der extrazellulären Metabolite Wie in Abschnitt 2.8.9 beschrieben, wurden die Überstände der Kulturen mittels HPLC auf ihre Zusammensetzung untersucht. In den Abbildungen 3.10 und 3.12 sind die ermittelten Daten der Untersuchungen von organischen Säuren, Glucose und Aminosäuren dargestellt. Die Analyse der Glucosekonzentration zeigte, dass diese in den unbehandelten Proben schneller verbraucht wurde. Nach 6 Stunden war im Überstand keine Glucose mehr detektierbar, in der LL-37-behandelten Probe war 14 14 12 12 10 10 Konzentration [mM] Konzentration [mM] dies erst nach 8 Stunden der Fall. 8 6 4 2 α-Ketoglutarat Glucose Malat Glycerin Acetat 8 6 4 2 0 0 0 A 2 4 6 Zeit [h] 8 10 0 B 2 4 6 8 10 Zeit [h] Abbildung 3.10: Konzentrationen der extrazellulären organischen Säuren und Glucose bei Wachstum von C. albicans SC5314 in RPMI-MOPS pH 7,4 ohne (A) und mit (B) LL-37 bei 37◦ C Anhand der graphischen Auftragung der gemessenen Glucosekonzentrationen zu den entsprechenden Zeitpunkten (siehe Abb. 3.11) wurde die Steigung der Geraden ermittelt. Diese gibt an, wieviel Glucose pro Stunde von der Kultur aufgenommen wurde. Ebenso wurde, wie in Kapitel 3.2.1.3 beschrieben, die Biomasseausbeute und die Effizienz der Glucoseverwertung berechnet. Diese Werte sind in Tabelle 3.4 aufgeführt und zeigen, dass die Glucose in der unbehandelten Kultur um 30 % schneller verbraucht und fast 40 % effektiver in Biomasse umgesetzt wurde. Wie in Abbildung 3.10 dargestellt, zeigte die Analyse der organischen Säuren Acetat ab 4 Stunden in beiden Kulturüberständen, wobei die detektierten Konzentrationen für die unbehandelte Probe etwas höher waren. Des weiteren wurde nach 6 Stunden im Überstand der unbehandelten Probe und nach 8 Stunden im Überstand der LL-37-behandelten Kultur Malat bestimmt. Glycerin wurde in beiden Kulturen detektiert. Jedoch lagen die ermittelten Konzentrationen nah am Detektionslimit. 80 Ergebnisse 14 12 Glucose [mM] 10 8 unbehandelt LL-37 [µg/ml] 6 4 Abbildung 3.11: Glucosekonzentrationen bei der Kultivierung 2 von SC5314 in RPMI-MOPS 0 0 2 4 6 8 10 Zeit [h] pH 7,4 mit und ohne LL-37Behandlung bei 37◦ C Tabelle 3.4: Glucoseaufnahmeraten der C. albicans-Kulturen mit oder ohne LL-37Behandlung. unbehandelt LL-37 Glucoseaufnahmerate [mM/h] 3,066 2,280 Glucoseaufnahmerate [mg/ml · h] 0,552 0,410 Biomasseausbeute [mg TM/mg Glu] 0,678 0,423 Effizienz der Glucoseverwertung [mg Glu/mg TM] 1,396 2,295 Die Aminosäureanalytik lieferte die in Abbildung 3.12 dargestellten zeitlichen Verläufe der Konzentrationen der einzelnen Aminosäuren. Die detektierten Aminosäuren wurden in zwei Gruppen unterteilt. Die Abbildungen 3.12A und C zeigen die Aminosäuren aus den Überständen der unbehandelten bzw. der LL-37-behandelten Kultur, deren Konzentration während der Kultivierung stark abnahm. Beide Kulturen wiesen in dieser Gruppe die gleichen Aminosäuren auf: Phenylanalin, Leucin, Serin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. Die Abbildungen 3.12C und D zeigen die Aminosäuren, deren Konzentrationen in den Kulturüberständen in deutlich geringerem Maße abnahmen. Auch hier zeigten beide Kulturen die gleichen Aminosäuren in sehr ähnlichen Konzentrationen: Arginin, Cystein, Valin, Glutamin, Tyrosin und Methionin. LL-37-abhängige Unterschiede in den Aminosäurekonzentrationen konnten nur für Methionin nachgewiesen werden. Da die detektierten Konzentrationen für Methionin aber nah am Detektionslimit lagen (0,1mM), ist der Verbrauch der Aminosäure nach 5 Stunden in der LL-37-behandelten Probe nicht gesichert (Abb. 3.12). Ein Vergleich mit den hier nicht gezeigten identischen Kultivierungen zeigte, dass es sich hier um einen einmaligen Effekt handelte. Ein Vergleich der Ergebnisse dieses Versuches (VII) mit den Daten des Wachs- 81 0.70 0.30 1.40 0.60 0.25 1.20 0.30 0.20 0.60 0.10 0.40 0.05 0.10 0.00 0.20 0.00 0 5 Zeit [h] A 10 0.00 0 B 5 Zeit [h] 10 0.30 1.40 0.60 0.25 1.20 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0 0.10 5 Zeit [h] Alanin [mM] 0.500.70 0.60 0.400.50 0.40 0.300.30 0.20 0.10 0.20 0.00 Konzentration [mM] 0.70 Konzentration [mM] Konzentration [mM] 0.80 0.15 10 1.00 0.20 0.80 0.15 0.60 0.10 0.40 0.05 0.00 0.20 0.00 0 C 5 Zeit [h] 10 Alanin [mM] 0.40 1.00 0.20 Alanin [mM] 0.50 Konzentration [mM] Konzentration [mM] Ergebnisse 0.00 0 D 5 Zeit [h] 10 Asparaginsäure Glutaminsäure Serin Glutamin Tyrosin Cystein Valin Methionin Phenylalanin Leucin Lysin Arginin Abbildung 3.12: Zusammensetzung der extrazellulären Aminosäuren bei Wachstum von C. albicans SC5314 in RPMI-MOPS pH 7,4 ohne (A und B) und mit LL-37 (C und D) bei 37◦ C; A und C: Aminosäuren, deren Konzentrationen während der Kultivierung abnehmen, B und D: Aminosäuren, deren Konzentration während der Kultivierung nur in geringem Maße abnehmen. tums von C. albicans in RPMI-MOPS pH 7,4 (VI) in Kapitel 3.2.1.3 zeigt, dass die Kulturen in der Untersuchung VII eine erhöhte Glucoseaufnahmerate und eine höhere Produktion von Säuren aufwiesen. Die Aminosäuren, die über die gesamte Kultivierung (VII) aufgenommen wurden, waren alle in der Gruppen der „frühen“ Aminosäuren des in Kapitel 3.2.1.3 beschriebenen Versuches VI vertreten (siehe auch Abb. 3.6). Die nur in geringen Mengen aufgenommenen Aminosäuren Cystein, Valin, Tyrosin und Methionion waren in der Gruppe der „späten“ Aminosäuren in Kapitel 3.2.1.3 (VI) enthalten. Alanin wurde hingegen in der hier beschriebenen 82 Ergebnisse Kultivierung nicht gebildet. Ein sehr deutlicher Unterschied zwischen den beiden Versuchen zeigte sich für Glutamin, welches in dem in Kapitel 3.2.1.3 beschriebenen Versuch VI sehr schnell aufgenommen wurde, in dem in diesem Kapitel dargestellten Versuch VII jedoch kaum verbraucht wurde. Die Unterschiede zwischen den Kultivierungen, bei denen in beiden Fällen C. albicans in RPMI-MOPS pH 7,4 angezogen wurden, lassen sich durch die Versuchsbedingungen erklären. Die Untersuchungen VII wurden in 100 ml-Kolben in einem Mediumvolumen von 25 ml durchgeführt. Für den ersten Versuch VI hingegen wurden 250 ml-Kolben mit einem Mediumvolumen von 100 ml verwendet. Es zeigte sich in VII eine erhöhte Bildung von Acetat, welches bei anaeroben Bedingungen aus Glucose gebildet wird. Aufgrund dieser Daten kann angenommen werden, dass in den Kulturen der Untersuchung VII sauerstofflimitierende Bedingungen vorlagen, somit Produkte des Gärungsprozesses detektiert wurden. Die Nährstoffe konnten aufgrund der Sauerstofflimitierung weniger effizient aufgenommen werden, was sich in einer reduzierten Glucose- und Aminosäureaufnahmerate und einer geringeren Biomasseproduktion widerspiegelt. 3.3 Wachstum von Candida albicans unter Zugabe von LL-37 in Mikrotiterplatten 3.3.1 Bestimmung der optischen Dichte Es sollte getestet werden, welche Wirkung das antimikrobielle Peptid LL-37 auf das Wachstum von Candida albicans SC5314 hat. Dies erfolgte wie in Kapitel 2.8.4 beschrieben in Mikrotiterplatten. Es kamen verschiedene Medien zum Einsatz und es wurde bei unterschiedlichen Temperaturen kultiviert. Candida albicans SC5314 wurde im reichhaltigen YPD-Medium unter Zugabe verschiedener LL-37-Konzentrationen bei 30◦ C kultiviert. Abbildung 3.13A zeigt die Ergebnisse. Es wird deutlich, dass nur für die höchste Konzentration an LL-37 (55,6 µg/ml) eine signifikante Wachstumsinhibierung auftrat. Die gemessenen ODWerte dieser Probe waren zum Ende der Kultivierung 50 % geringer als die der unbehandelten Proben. Das Wachstum im Minimalmedium YNB pH 5,6 zeigte eine deutlichere konzentrationsabhängige, wachstumsinhibierende Wirkung von LL-37 im Gegensatz zu der Kultivierung im reichhaltigen YPD-Medium. Abbildung 3.13B zeigt die ermittelten Ergebnisse 83 1.8 1.6 LL-37 [µg/ml] 55.55 18.52 6.17 2.06 0.69 M H2O 1.4 OD 600nm 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 A 4 Zeit [h] 6 Abbildung 3.13: 8 von bei OD 620nm 1.2 1 LL-37 [µg/ml] 0.8 133.33 44.44 14.81 4.94 1.65 0.18 M H2O 0.6 0.4 0.2 0 0 B 2 4 Zeit [h] 6 8 Wachstum C. albicans 30◦ C SC5314 unter LL-37- Behandlung in YPD-Medium (A) und YNB pH 5,6-Medium (B). A: Es zeigte sich eine LL-37-bedingte tumsinhibierung Wachsbei einer Konzentration von 55 µg/ml. B: LL-37 inhibierte das Wachstum ab einer Konzentration von 5 µg/ml. Wachstumskurven. Es trat eine nahezu vollständige Inhibierung des Wachstums ab einer Konzentration von ca 5 µg/ml auf. Um die Wirkung von LL-37 auf das Wachstum von Candida albicans unter wirtspezifischen Bedingungen zu analysieren, wurden die Untersuchungen auch bei 37◦ C durchgeführt. Abbildung 3.15A zeigt die sich ergebenden Wachstumskurven in YNB pH 5,6. Auch hier wurde eine inhibierende Wirkung von LL-37 deutlich. Die Hemmung des Wachstums trat ab einer Konzentration von 2 µg/ml auf. Bei der Kultivierung in diesem Medium war sehr häufig ein Absinken der OD-Werte in der stationären Wachstumsphase zu beobachten. Dieser Effekt ging mit einer Verringerung der Zellgröße einher, die bei mikroskopischer Betrachtung deutlich wurde (siehe Abb. 3.14). Der Effekt der Zellschrumpfung unter limitierenden Wachstumsbedingungen und Alterung der Kultur wird in der Literatur beschrieben [157]. Da die Infektionsversuche dieser Arbeit in RPMI-MOPS pH 7,4 durchgeführt wurden, erfolgten die Wachstumsuntersuchungen auch in diesem Medium. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Inhibierung von C. albicans SC5314 (siehe Abb. 3.15B). Ab einer Konzentration von 6 µg/ml wurden in der stationären Phase 40 % 84 Ergebnisse Abbildung 3.14: Veränderung der Zellgröße von C. albicans bei Kultivierung in YNB pH 5,6 nach 1 h A (A) und 6 h (B). B geringere OD-Werte als in den unbehandelten Proben gemessen. Ein Vergleich der wachstumshemmenden Eigenschaften von LL-37 bei 30◦ C bzw. 37◦ C zeigt, dass die Effekte bei 30◦ C sehr viel schneller eintraten und zu einer fast vollständigen Wachstumsinhibierung führten. Bei 37◦ C traten inhibierende Effekte erst nach einer Kultivierung von einer Stunde auf und bewirkten einen früheren Übergang in die Phase des stationären Wachstums. Außerdem traten insbesondere in den Proben, die eine hohe Konzentration an LL-37 aufwiesen starke Abweichungen zwischen den Messwerte der Doppelbestimmungen auf. 1 OD 620nm 0.6 0.5 LL-37 [µg/ml] 0.4 55.55 18.52 6.17 2.06 0.69 0.23 M H2O 0.3 0.2 0.1 0 0 2 A 4 Zeit [h] 6 von 8 bei 0.7 LL-37 [µg/ml] OD 620nm 0.6 55.55 18.52 6.17 2.06 0.69 0.23 M H2O 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 Wachstum C. albicans 37◦ C unter SC5314 LL-37- Behandlung in YNB pH 5,6- 0.8 B Abbildung 3.15: 2 4 Zeit [h] 6 8 Medium (A) MOPS pH 7,4 und RPMI- (B). A: Es zeigt sich eine wachstumsinhibierende Wirkung von LL-37 ab einer Konzentration von 2 µg/ml. B: LL-37 hat ab einer Konzentration von 6 µg/ml einen hemmenden Einfluss auf das Wachstum. Dies wird in dem dargestellten Beispiel für die Kultivierung in RPMI-MOPS pH 7,4 nicht deut- lich, trat aber in anderen Versuchen sehr stark auf. Ergebnisse 85 Dies läßt sich durch die Ausbildung von Pseudohyphen und Hyphen aufgrund der Kultivierung bei 37◦ C erklären. Die besonders stark auftretenden Schwankungen in den LL-37-behandelten Proben bestärkten die Vermutung eines anormalen Verlaufs der Ausbildung der Hyphen und Pseudohyphen, die in Kapitel 3.4 näher betrachtet werden soll. 3.3.2 CFU-Bestimmung Da bei 37◦ C ein früherer Übergang in die stationäre Phase beobachtet wurde, jedoch nicht eine komplette Inhibierung des Wachstums durch LL-37, wie es für die Untersuchung bei 30◦ C der Fall war, sollte die Lebensfähigkeit der behandelten C. albicans durch CFU-Bestimmung (siehe Kapitel 2.8.7) untersucht werden. In YNB pH 5,6 wurden bei einer 6 stündigen Behandlung mit 60 und 30 µg/ml LL-37 50 % weniger Kolonien als in der unbehandelten Probe gezählt (Abb. 3.16A). Die Kultivierung in RPMI-MOPS pH 7,4 unter LL-37-Behandlung hat eine stärkere Reduktion der Kolonieanzahl zur Folge. So wurden bei der Zugabe von 55,6 µg/ml LL-37 80 % weniger lebensfähige Zellen detektiert als in der unbehandelten Kontrolle (Abb. 3.16B). 140 140 ** 120 * 120 * 100 CFU [%] CFU [%] 100 80 60 60 40 40 20 20 0 0 60 A 80 30 5 LL-37 [µg/ml] 0 55.55 M B 18.52 LL-37 [µg/ml] 6.17 Abbildung 3.16: Einfluss von LL-37 auf das Wachstum von C. albicans SC5314 in YNB pH 5,6 (A) und in RPMI-MOPS pH 7,4 (B) bei 37◦ C. Dargestellt wurde die prozentuale Anzahl gezählter Kolonien in der CFU-Bestimmung. Die unbehandelte Kontrolle (Medium - M) wurde auf 100 % gesetzt. Es zeigt sich eine konzentrationsabhängige Reduktion der Anzahl überlebender Zellen. Die Kultur mit 0 µg/ml LL-37 diente der Lösungsmittelkontrolle. (* - p-Wert <0,05, ** - p-Wert <0,005) 86 3.4 Ergebnisse Einfluss von LL-37 auf die Hyphenbildung Da aufgrund der oben erläuterten Versuchsergebnisse ein Einfluss von LL-37 auf die Hyphenbildung vermutet wurde, sollte dies näher analysiert werden. Hierfür wurde ein Hypheninduktionstest von Anna Buschart (Arbeitsgruppe BISA, HZI) mit dem Reporterstamm C. albicans HWP1-lacZ durchgeführt. Dieser Reporterstamm exprimiert bei Wachstum in der Hyphenform β-Galactosidase. Durch photometrische Messung der enzymatischen Umsetzung von o-Nitrophenly-β-D-Galactopyranosid (ONPG) in o-Nitrophenol kann die Aktivität der bei Hyphenwachstum exprimierten β-Galactosidase bestimmt werden. Die Kultivierung erfolgte in einem Hypheninduktionsmedium in 96-Well-Platten bei 37◦ C. Dieses Medium ist ein MOPS-gepuffertes, Stickstoff-limitiertes Medium auf YNB-Basis ohne Aminosäuren und mit den Kohlenstoffquellen Glucose (2 g/l) und Maltose (1 g/l) (siehe [158]). Nach einer dreistündigen Kultivierung erfolgte die Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität. Die Daten sind in Abbildung 3.17 dargestellt und zeigten keine signifikante Veränderung der β-Galactosidase-Aktivität. In den höchsten LL-37-Konzentrationen war eine schwache Reduktion von 20 % ersichtlich, die jedoch mit hohen Fehlerbalken einher ging. Demnach wurde die Hyphenbildung durch LL-37 nicht vollständig inhibiert. Eine Hemmung war jedoch nicht auszuschließen. Aus diesem Grund wurde eine Vermessung der sich bildenden Hyphen unter LL-37-Behandlung durchgeführt. 160 140 β-Galactosidaseaktivität [%] 120 100 80 LL-37 85G05 60 40 20 0 -20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 Konzentration [µg/ml] 100.00 1000.00 Abbildung 3.17: Einfluss von LL-37 auf die Hypheninduktion. C. albicans HWP1-lacZ wurde unter hypheninduzierenden Bedingungen für 3 Stunden inkubiert. Anschließend wurde der Reporterassay von Anna Buschart (Arbeitsgruppe BISA, HZI) durchgeführt. 85G05 ist eine Substanz, deren hyphenwachstumshemmende Eigenschaft bekannt ist und die als Kontrollsubstanz eingesetzt wurde. Ergebnisse 87 C. albicans SC5314 wurde in serumfreiem RMPI-Medium bei 37◦ C für 90 min auf Glasoberflächen im CO2 -begasten Brutschrank kultiviert. Die Fixierung der Präparate erfolgte wie in Kapitel 2.9.4 beschrieben. Anhand mikroskopischer Aufnahmen der LL-37-behandelten Kulturen wurde die Länge der gebildeten Hyphen mit der Bildanalyse-Software „BZ-Analyser“ bestimmt. Die Ausmessung der Hyphenlänge lieferte die in Abbildung 3.18 dargestellte Grafik. Es wurde deutlich, dass die mit Hyphenlänge [%] 30 µg/ml LL-37-behandelten Zellen um bis zu 30 % kürzere Hyphen ausbildeten. 140 Abbildung 3.18: Ein- 120 fluss von 100 das Hyphenwachstum. LL-37 auf C. albicans SC5314 zeig- 80 te bei Kultivierung in 60 RPMI unter 5 % CO2 bei 40 37◦ C eine signifikante (p- 20 Wert <0,005) Reduktion der Hyphenbildung um 0 0 5 15 LL-37 [µg/ml] 3.5 Veränderung der 30 30 %. Genexpression von C. albicans bei Wachstum in LL-37-haltigem Medium Die Wirkung des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf die Genexpression in C. albicans SC5314 sollte untersucht werden. Hierfür wurde der Stamm, wie in 2.10.2 beschrieben, in RPMI-MOPS pH 7,4 kultiviert. Nach der Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 für 30, 60 und 90 min wurde die RNA aus behandelten und unbehandelten Zellen isoliert. Die Genexpressionsanalyse erfolgte mit Hilfe der Mikroarraytechnik wie in den Kapiteln 2.10.3 und 2.10.4 erläutert. Die Untersuchungen wurden an drei biologisch unabhängigen Replikaten durchgeführt aus denen sich die drei Array-Datensets 1-3 ergaben. Diese wurden in einer Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis - PCA) auf ihre Ähnlichkeit untersucht (Abbildung 3.19). Hierbei zeigte sich, dass die Daten der Sets 2 (grün) und 3 (gelb) zu allen Zeiten und in allen Behandlungen clusterten, also eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen. Die Daten des Set 1 (rot) zeigten jedoch sowohl für 88 Ergebnisse die behandelten (LL37_x) als auch die unbehandelten Proben (untr_x) eine leichte Verschiebung zu den Daten von Set 2 und Set 3. Die Daten der Zeitpunkte 30 min (untr_30 bzw. LL37_30) und 60 min (untr_60 bzw. LL37_60) des Datensets 1 clusterten mit den Daten der Zeitpunkte 60 min bzw. 90 min (untr_90 bzw. LL37_90) aus den Sets 2 und 3. In den Proben des ersten Replikats kam es scheinbar zu einer Reaktionsbeschleunigung um etwa 30 Minuten. Abbildung 3.19: Princi- 30 untr_30 pal Component Analyse 20 untr_60 untr_60 untr_30 −10 Die gelb dargestellt. Es erfolgte eine Behandlung LL37_60 untr_90 mit LL37_30 −20 Ganzgenom- sind in rot, grün und LL37_30 LL37_60 LL37_60 LL37_90 30 µg/ml (LL37_x) LL37_90 −30 der Datensets 1, 2 und 3 untr_90 untr_90 LL37_30 LL37_90 −20 Datensets 1-3 Untersuchung. untr_60 0 PC2 10 untr_30 der oder LL-37 ohne LL-37 (untr_x) für eine Zeit von 30 min (x_30), 0 20 PC1 40 60 min (x_60) bzw. 90 min (x_90). Die LL-37-abhängige Änderung der Genexpression wurde durch den Vergleich der Expressionsdaten LL-37-behandelter Candida albicans zu den Daten des unbehandelten Referenzzustands ermittelt. Die in Abbildung 3.20 dargestellte Heatmap zeigt die signifikant regulierten Gene (bei der Betrachtung aller drei Datensets). Als signifikant reguliert galten Gene, deren Genexpressionsänderungen einen Faktor von mindestens 2 aufwiesen bei einem p-Wert von <0,005. Es wurden hier sehr stringente Bedingungen gewählt, um relativ schnell eine grobe Übersicht über die Wirkung von LL-37 auf C. albicans zu erhalten. Es ergaben sich die in der Heatmap dargestellten 73 regulierten Gene von denen 46 signifikant herunterreguliert und 27 signifikant hochreguliert worden waren. Nur 37 % dieser Gene sind in ihrer Funktion beschrieben. Die Gruppe der signifikant herunterregulierten Gene umfasste hauptsächlich solche, die dem Prozess der Ribosomenbiogenese (ca. 30 %) und RNA-metabolischen Prozessen (22 %) zugeordnet Ergebnisse 89 Color Key −2 0 1 2 Value orf19.2723 HIT1 orf19.3978 orf19.6777 orf19.4106 orf19.4793 orf19.1735 orf19.4191 RLP24 orf19.5067 orf19.5500 MAK16 orf19.444 orf19.5066 orf19.4063 GPT1 orf19.6342 orf19.3220 orf19.7050 NOP15 orf19.6828 orf19.5299 ECM1 orf19.6510 GRX1 orf19.7013 orf19.4691 orf19.5905 orf19.172 RPC19 orf19.5049 orf19.28 orf19.7504 orf19.4125 orf19.3970 orf19.6230 orf19.5232 CSI2 orf19.2000 orf19.661 KRR1 orf19.2564 orf19.7166 orf19.4814 orf19.5025 MET3 orf19.4819 orf19.5918 orf19.6138 orf19.377 PHR3 orf19.4861.1 orf19.6840 orf19.3631 STN1 orf19.158 orf19.3828 orf19.6824 TRY6 orf19.1473 orf19.5334 orf19.3669 SHA3 orf19.7314 CDG1 orf19.3448 orf19.2496 ATO2 orf19.2398 orf19.1314 orf19.6173 STD1 orf19.5338 GAL4 orf19.6983 orf19.5304 orf19.5255 PXA2 orf19.2024 orf19.791 RIM11 orf19.4918 orf19.4318 MIG1 orf19.203 STB3 orf19.3315 CTA9 orf19.6638 PTC4 orf19.508 QDR1 orf19.5326 orf19.846 orf19.5337 UBC15 orf19.5339 orf19.6600 orf19.732 LL37_90min LL37_60min LL37_30min orf19.3931.2 Abbildung 3.20: Heatmap mit 46 Genen, die in C. albicans SC5314 bei Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 differenziell exprimiert wurden. Dargestellt sind die logarithmierten Verhältnisse der Genexpression in LL-37-behandelter Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kulturen zu den jeweiligen Zeitpunkten. (Datensätze 1-3, log2 FC = |1|, angepasster p-Wert <0,005) werden konnten (Genome Database GO Slim Mapper ). Die hochregulierten Gene konnten in auffällig hohem Maße Prozessen wie allgemeiner Stressantwort (27 %) und Transport (15 %) zugeordnet werden. Zur letzteren Gruppe zählen auch die Gene STD1 und SHA3, die als Transkriptionsfaktoren Glucose-abhängiger Gene bzw. putative Serin/Threonin Kinase (Glucosetransport) in die Regulation der Glucose- 90 Ergebnisse aufnahme involviert sind. Diese beiden Gene wurden mit dem Gen CTA9 außerdem dem filamentösen Wachstums zugeordnet. Die Liste der Gene umfasst des weiteren eine Reihe von Genen, die durch den Trankriptionsfaktor Hap43- bzw. durch die MAP-Kinase Hog1 reguliert werden. Ein Vergleich der differentiell exprimierten Gene (Datensets 1-3) und ihrer zeitlichen Regulierung zeigte (siehe Abb. 3.21A), dass die Expression einer großen Zahl an Genen bereits nach 30 min reguliert wurde. So wurden zu dieser Zeit 25 Gene induziert (rot) und 41 Gene reprimiert (blau). Nur drei der hochregulierten und vier der herunterregulierten Gene waren auch nach 60 min noch signifikant reguliert. Ein verhältnismäßig kleines Set an Genen wurde erst nach 60 min differentiell exprimiert (2 Gene hochreguliert, 5 Gene herunterreguliert). Nach 90 min erfolgte keine weitere Regulation anderer Gene. Um umfassende Kenntnisse von der Wirkung von LL-37 auf C. albicans SC5314 zu erhalten, wurden die Daten mit weniger stringenten Parametern neu analysiert. Während weiterhin Gene betrachtet wurden, die eine Expressionsveränderung um mindestens den Faktor 2 aufwiesen, wurde der Signifikanzwert auf Werte p <0,05 beschränkt. Es ergab sich unter diesen Parametern eine Anzahl von insgesamt 330 signifikant regulierten Genen, von denen 123 heraufreguliert und 207 herunterreguliert wurden. Eine Betrachtung der Verteilung dieser Gene zu den Testzeiten ergab ebenfalls (siehe Abb. 3.21B), dass der Großteil der Gene bereits nach 30 min reguliert worden war. Die Gruppe der Gene, die bis zu einer Zeit von 60 min bzw. ab 60 min reguliert wurden, war unter diesen Parametern deutlich größer. 30 min 60 min 22 37 2 4 3 2 0 0 0 2 30 min 60 min 72 150 0 1 0 3 0 0 A 90 min 14 19 34 19 2 8 0 3 1 5 B 90 min Abbildung 3.21: Venn-Diagramm der differentiell exprimierten Gene LL-37-behandelter C. albicans SC5314 im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Hochregulierte Gene wurden in Rot, herunterregulierte Gene in Blau dargestellt. A: Datensets 1-3 (log2 FC |1|, p-Wert <0,005), B: Datensets 1-3 (log2 FC |1|, p-Wert <0,05) Ergebnisse 91 carbohy drate metaboli biologica c l_proces process s min 0 20 Anzahl der Gene 40 60 80 100 30 biologische Prozesse 60 lipid cellular protein RNA ribosom respo respons regulatio organell meta metaboli e e to n of e respons nse bolic filament modificat ion transl c biogene e to to chemical biologica organiza proce ous cell sis transport ation process stress drug stimulus l process tion ss growth process cycle Kohlenhydratmetabolismus Zellzyklus zelluläre Proteinmodifikation filamentöses Wachstum Lipidmetabolismus Organellenorganisation Regulation biologischer Prozesse Antwort auf chemischen Stimulus Antwort auf Arzneimittel Stressanwort Ribosomenbiogenese RNAMetabolismus Translation Transport 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 30 60 90 down herunterreguliert up hochreguliert Abbildung 3.22: Zuordnung der signifikant regulierten Gene (Datenset 1-3, lfc1, p-Value <0,05) zu zellulären Prozessen mit Hilfe des CGD Gene Ontology Slim Mapper. Dargestellt wurden die Prozesse, die mehr als 5 Gene zu mindestens einem Zeitwert aufwiesen. 92 Ergebnisse Anhand von Funktionsbeschreibungen der regulierten Gene wurde eine Zuordnung zu biologischen Prozessen vorgenommen (Candida Genome Database Gene Ontology Slim Mapper ). Allerdings war von 60 % der Gene keine genaue Funktion bekannt. Ähnlich wie bei der vorherigen Betrachtung wurde deutlich (siehe Abb. 3.22), dass insbesondere in den frühen Zeiten eine negative Regulation von Genen des RNA-Metabolismus und der Ribosomenbiogenese erfolgte. Zu diesen Genen gehörten z.B. MAK16, orf19.2362 (30 min), orf19.6234 (60 min) und orf19.5220 (30 und 60 min). Nur dem Prozess des RNA-Metabolismus wurden bei einer LL37-Behandlung von 30 min unter anderem die Gene orf19.1296, orf19.6356, DIM1, NSA2 und RCL1 zugeordnet. Negativ regulierte Gene der Ribosomen-Biogenese bei einer 30-minütigen LL-37-Behandlung waren orf19.6236, orf19.6886, orf19.773, DBP2, und weniger stark RLP24, NSA1 und ECM1. Unter den Genen, die zum Prozess „Transport“ gehören, waren einige herauf-, andere herunterreguliert. Zu den negativ regulierten Transportern nach 30 min zählten die putativen Glycerophosphoinositol-Permeasen GIT4 (30 min) und GIT1 (60 min) und die putativen Phosphat-Permeasen FGR2, PHO89 (beide 30 und 60 min) sowie PHO84 (30 min). Negativ regulierte Transporter waren außerdem ein Vertreter der Drug-Proton-Antiporter(DHA1)-Familie (orf19.6992) und die MultidrugeffluxPumpe MDR1 (30 min). Zu den signifikant hochregulierten Transportern nach 30 min LL-37-Behandlung zählten der Ammoniumtransporter FRP3, der in Gegenwart von Neutrophilen hochreguliert wird, sowie QDR1, ein Transporter, der vermutlich antibiotische Resistenzen vermittelt. Ein Vertreter der Fucose-Proton-Symporter(FHS)-Familie (orf19.4090) zeigte eine signifikant positive Regulation bis zu einer Zeit von 60 min. In der Liste der positiv regulierten Transporter erschienen außerdem eine Reihe von Kohlenhydrattransportern. So wurden nach einer LL-37-Behandlung von 30 min der putative Maltosetransporter MAL31 und bis zu einer Behandlung von 60 min die putative Serin/Threonin-Kinase SHA3, die in den Transport von Glucose involviert ist, stärker exprimiert. Nach einer 60-minütigen jedoch nicht nach 30-minütigen LL37-Behandlung wurde der Glucosetransporter HGT2, der Inositoltransporter ITR1 und der transkriptionelle Repressor RGT1, der in die Regulation von Glucosetransportergenen involviert ist, im Vergleich zu den unbehandelten Proben signifikant hochreguliert. Ebenso war eine eher positive Regulation für den Kohlenhydratmetabolismus insbesondere für die Gene, die mit der Kontrolle der Glycolyse assoziiert sind, ersichtlich. Hierzu zählten das α-Glucosidase-Expressions-regulierende SUC1 (30 min), die Ergebnisse 93 Transkriptionsfaktoren GAL4, TYE7 sowie STD1 (alle 30 und 60 min). Des weiteren wurde die putative Galactose-1-Phosphat Uridyl-Transferase GAL7 (30 und 60 min) und die putative Glucoamylase SGA1 (60 min) signifikant hochreguliert. Als Adhäsin-kodierendes Gen sei IFF4 erwähnt, das bis zu einer 60-minütigen LL-37-Behandlung im Vergleich zu den unbehandelten Proben stärker exprimiert wurde. Hochreguliert wurde außerdem die Expression von Genen, die der allgemeinen Stressantwort zugeordnet werden können, wie z.B. QDR1, SHA3, und der putative Ammoniumtransporter FPR3, der auch bei Anwesenheit humaner Neutrophile hochreguliert wird. Bei Betrachtung der Regulatoren der differentiell exprimierten Genen wurde deutlich, dass eine Vielzahl von Genen vom gleichen Transkriptionsfaktor beeinflusst wird. Der am häufigsten auftretende Regulator war der Transkriptionsfaktor Hap43. Unter den positiv regulierten Genen traten eine Reihe Hap43-reprimierter Gene, unter den negativ regulierten Genen eine Reihe Hap43p-induzierter Gene auf. Dies lässt vermuten, dass dieser Transkriptionsfaktor nicht oder nur in geringem Maße aktiv ist. Eine weitere Gengruppe (ECM1, RIM9, PHO89, GIT1 und PHO112) wird durch den Transkriptionsfaktor (TF) Rim101 beeinflusst. Dieser TF ist in die Antwort auf alkalischen pH-Wert-Änderungen involviert. Des weiteren standen Gene unter der Kontrolle von Hog1p, wie z.B. TYE7 und MET3. Der Transkriptionsfaktor Tup1, der filamentöses Wachstum reprimiert und durch Behandlung mit chemischen Substanzen aktiviert wird, beeinflusst die Expression der Gene MIG1, QDR1 und RBT7. Die Einpflegung der Array-Daten in das metabolische Netzwerk von C. albicans (Insilico, Stuttgart) verdeutlichte die vorher beschriebenen Genfunktionen (siehe Abb. 3.23) Auch hier zeigte sich eine Vielzahl hochregulierter Gene (orange markiert) im Embden–Meyerhof-Weg (EMP) der Glycolyse, Zitronensäurezyklus und Polysaccharidmetabolismus sowie der Lipidsynthese. Ein großes Cluster negativ regulierter Gene (grün markiert) trat vor allem in Nukleotidrecycling und -synthese sowie für die sekretierten Phospholipasen auf. Ein Faktor, der die umfassende Auswertung der Datensätze erschwert, ist die Tatsache, dass nur 40 % der differentiell exprimierten Gene in ihrer Funktion beschrieben sind. In den Tabellen 3.5 und 3.6 wurden die Gene aufgeführt, die bei der Analyse der Datensets 1-3 (p-Wert <0,05) signifikant reguliert wurden und deren Funktion näher charakterisiert wurde. Die entsprechenden Informationen sind der Datenbank Candida Genome Database entnommen worden. 94 Ergebnisse Abbildung 3.23: Molekulare Ziele von LL-37 im Metabolismus von C. albicans. Die ermittelten Daten der Ganzgenom-Expressionsanalyse wurden in das metabolische Modell eingepflegt (Insilico, Stuttgart). Die Änderung der Expression im Vergleich zur unbehandelten Probe (log2 FC) wurde für positiv regulierte Gene in orangenen Boxen, für negativ regulierte Gene in grünen Boxen dargestellt. Ergebnisse 95 Tabelle 3.5: Liste der positiv regulierten Gene in C. albicans SC5314 bei Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 (Datensets 1-3, p-Wert <0,05) Angegeben sind die durchschnittlichen Änderungen der Expressionen (log2 FC) im Vergleich zur unbehandelten Probe. Gen Genname orf19.1354 UCF1 orf19.3981 MAL31 Beschreibung Regulation nach 30 min 60 min Hap43p-reprimiert, Ras1p-reguliert; Morphologie-assoziiert 2.01 2.39 putativer hoch-affiner Maltose-Transporter; im basischen Mil- 1.66 90 min lieu hochreguliert orf19.2496 ATO2 putatives pilzspezifisches Transmembran-Protein; Hap43p- 1.65 1.11 TF mit Zink-Cluster DNA-Bindungsmotiv, involviert in Kon- 1.65 1.10 1.62 1.82 reprimiert orf19.5338 GAL4 trolle der Glycolyse orf19.7472 IFF4 Adhäsin-ähnliches Zelloberflächenprotein; involviert in Adhärenzmechanismen; Hap43p-reprimiert orf19.7319 SUC1 Zinkfinger TF; reguliert alpha-Glucosidase-Expression; invol- 1.62 viert in Adhärenzmechanismen orf19.3669 SHA3 putative Serin/Threonin-Kinase, involviert in Glucose- 1.60 (vermutlich 1.56 1.43 1.02 1.14 1.28 Transport; induziert durch Antimykotika orf19.4887 ECM21 Protein ähnlich dem S. cerevisiae Ecm21p Zellwand-assoziiert); bei alkalischem pH-Wert durch Rim101p hochreguliert orf19.7314 CDG1 putative Cystein-Dioxygenases; Morphologie-assoziiert 1.52 orf19.2046 POT1-2 putative peroxisomale 3-Ketoacyl-CoA Thiolase; Hap43p- 1.51 orf19.7317 UGA33 Zinkfinger TF; ähnlich dem S. cerevisiae Uga3p, der die Ex- reprimiert 1.44 pression von Genen des gamma-Aminobutyrat- Metabolismus reguliert; involviert in Adhärenzmechanismen orf19.5911 CMK1 putative Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II; 1.44 ESCRT-II Komplexprotein, involviert in Multi-Vesicular Body 1.40 1.24 Morphologie-assoziiert; Hap43p-reprimiert orf19.6296 VPS22 (MVB) Bewegung; Hap43p-reprimiert orf19.2173 MAF1 putativer negativer Regulator der RNA Polymerase III; 1.39 Morphologie-assoziiert orf19.6173 STD1 putativer TF, involviert in die Kontrolle der Glucose- 1.38 Nrg1p- 1.33 1.06 regulierten Genexpression; Rgt1p-reprimiert orf19.508 QDR1 putativer Transporter antibiotischer Resistenzen; und Tup1p-reguliert; Hap43p-reprimiertes Gen; Morphologieassoziiert orf19.101 RIM9 Protein der RIM101-regulierten Antwort auf alkalischen pH- 1.31 Wert orf19.4941 TYE7 bHLH TF, involviert in die Kontrolle der Glycolyse; Hog1p- 1.28 1.10 induziert; Morphologie-assoziiert orf19.347 RSN1 Hap43p-reprimiertes Gen; Morphologie-assoziiert 1.27 1.39 orf19.3675 GAL7 putative Galactose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase 1.25 1.40 orf19.5640 PEX5 notwendig für PTS1-vermittelten peroxisomalen Proteinim- 1.22 orf19.4318 MIG1 transkriptioneller Repressor; reguliert Gene zur Nutzung port und Fettsäure-β-Oxidation; Hap43p-reprimiert 1.21 1.11 von Kohlenstoffquellen; Tup1p-abhängig; Hap43p-reprimiert; Morphologie-assoziiert orf19.391 UPC2 Zn2-Cys6 transkriptioneller Regulator der Ergosterol- 1.21 postulierte Typ 2C Protein-Phosphatase, Serin/Threonin- 1.19 biosynthetischen Gene und der Sterol-Aufnahme orf19.4698 PTC8 spezifisch; notwendig für Hyphenwachstum; Stress-induziert orf19.203 STB3 putatives SIN3-Bindungsprotein 3 Homolog 1.17 1.21 orf19.3369 MOH1 Protein mit Ähnlichkeit zu S. cerevisiae Moh1p 1.17 1.16 orf19.6638 PTC4 Typ PP2C Serin/Threonin Phosphatase; wichtig für Resistenz 1.17 orf19.1224 FRP3 gegenüber Chemikalien; Morphologie-assoziiert putativer Ammonium-Transporter; hochreguliert in der Anwe- 1.15 senheit von PMNs orf19.2397.3 putative Aminotransferase; Hap43p-reprimiert 1.15 reguliert glycolytische Gene 1.15 orf19.2876 CBF1 orf19.5337 UBC15 putatives E2 Ubiquitin-konjugiertes Enzym 1.14 orf19.3315 CTA9 Morphologie-assoziiertes Gen 1.12 orf19.489 DAP1 Ähnlichkeit zu membranassoziiertem Progesteron-Rezeptor 1.08 von Säugetieren, involviert in die Antwort auf DNA Zerstörung; Stress-induziert; Hog1p reguliert; Hap43p-reprimiert orf19.4450 ZCF23 postuliertes Zinkfinger-Protein 1.08 orf19.6191 TLO8 zugehörig zur Familie der telomer-proximalen Gene mit unbe- 1.08 orf19.2655 BUB3 putative kannter Funktion assoziiert Kinetochore-Kontrollkomponente; Morphologie- 1.06 96 Ergebnisse Tabelle 3.5 - Fortsetzung Gen Genname Beschreibung Regulation nach 30 min orf19.6881 YTH1 putativer mRNA-Spaltungs- und Polyadenylierungsspezifi- 60 min 90 min 1.05 scher Faktor; durch chemischen Stress induziert; Morphologieassoziiert orf19.791 RIM11 Ähnlichkeit zu S. cerevisiae Rim11p, eine Proteinkinase, die 1.05 1.08 in Meiose und Sporulation involviert ist orf19.1331 HSM3 Ortholog(e) involviert in Reparatur von Basenfehlpaarung 1.03 orf19.1352 TIM22 mitochondriales Innenmembran-Protein mit postulierter Rolle 1.01 orf19.1067 GPM2 in Proteinimport; Hap43p-reprimiertes Gen putative Phosphoglycerat-Mutase; durch chemischem Stress 1.01 induziert; Morphologie-assoziiert orf19.1719 SGA1 putative Glucoamylase; induziert in oralpharyngealer Kandi- 1.01 dose orf19.2747 RGT1 transkriptioneller Repressor, involviert in die Regulation 1.10 von Glucose-Transportergenen; Ähnlichkeit zu S. cerevisiae Rgt1p, wichtig in Mausinfektion orf19.3526 ITR1 Inositol-Transporter, notwendig für die Aufnahme von exoge- 1.05 nem Inositol orf19.3668 HGT2 putativer Glucose-Transporter 1.43 orf19.3674 GAL102 UDP-Glucose 4,6-Dehydratase, involviert in Mannosylierung 1.21 von Zellwandproteinen; wichtig für Resistenz gegenüber Antimykotika orf19.5255 PXA2 putatives peroxisomales, Adrenoleukodystrophy Protein (ALD 1.13 oder ALDp), ABC-Transporter; Gcn4p-reguliert orf19.7500 PXA1 putatives peroxisomales Adrenoleukodystrophy-Protein (ALD 1.08 or ALDp), ABC-Transporter Tabelle 3.6: Liste der negativ regulierten Gene in C. albicans SC5314 bei Behandlung mit 30 µg/ml LL-37 (Datensets 1-3, p-Wert <0,05) Angegeben sind die durchschnittlichen Änderungen der Expressionen (log2 FC) im Vergleich zur unbehandelten Probe. Gen Genname Beschreibung ähnlich Regulation nach zu Phosphat-Transportern; 30 min 60 min 90 min orf19.7071 FGR2 Protein Morphologie- -2.80 -2.91 orf19.6824 TRY6 transkriptioneller Regulator der Hefeform-Adhärenz; Biofilm- -2.59 -2.31 -2.21 -1.81 -1.14 -1.44 -1.81 -1.52 assoziiert induziert orf19.1980 GIT4 putative Glycerophosphoinositol-Permease; pilzspezifisch; -2.55 sekretierte Lipase, differentiell exprimiert als Antwort auf Koh- -1.93 Hap43p-reprimiert orf19.5172 LIP9 lenstoffquelle und während Infektion; postulierte Rolle in Ernährung oder in der Herstellung einer aziden Mikroumgebung orf19.4673 BMT9 β-Mannosyltransferase, involviert in β-1,2-Mannosylierung von Zellwall-Phosphopeptidomannan; Sef1p-, Sfu1p-, -1.82 and Hap43p-reguliert orf19.5025 MET3 ATP-Sulfurlyase der Sulfat-Assimilation; stark induziert bei Biofilmformation; Hog1p-induziert orf19.4599 PHO89 putative Phosphatpermease; Morphologie-assoziiert; bei alkalischem pH-Wert durch Rim101p hochreguliert; Adhärenzinduziert orf19.700 SEO1 Protein mit Ähnlichkeit zu Permeasen; negativ reguliert durch -1.62 Sfu1p orf19.2723 HIT1 S. cerevisiae Ortholog HIT1 ist im Zytoplasma und Nukleus -1.55 -1.17 -1.50 -2.48 putatives ER-Protein -1.49 -1.24 putative Phosphatidyl-Glycerol-Phospholipase C -1.46 putatives Glutaredoxin; Expression höher bei geringem Eisen- -1.46 -1.04 putative RNA-Exonuklease -1.43 -1.31 putative Komponente des 66S pre-ribosomalen Partikels; -1.41 lokalisiert orf19.2681 RBT7 Protein mit Ähnlichkeit zu Rnase T2 Enzymen; Tup1p- -2.17 reprimiert orf19.2199 PHO86 orf19.3483 orf19.6510 GRX1 angebot orf19.5220 orf19.5500 MAK16 orf19.6402 CYS3 Hap43p-induziert Cystathionin-γ-Lyase; hochreguliert bei alkalischem pH, Bio- -1.35 film und chemischen Stressoren; Adhärenz-induziertes Gen; Hog1p-reguliert orf19.171 DBP2 putative ATP-abhängige RNA-Helikase (DEAD-Box Familie); herunterreguliert bei Stressantwort im Kern -1.33 -1.05 Ergebnisse 97 Tabelle 3.5 - Fortsetzung Gen Genname Beschreibung Regulation nach orf19.4266 SPR28 Septin; ähnlich dem S. cerevisiae meiotischen/Sporulations- orf19.97 CAN1 elementare Aminosäure-Permease orf19.7411 OAC1 putativer 30 min 60 min -1.33 -1.15 90 min Septin; mitochondrialer -1.29 Innenmembran-Transporter; -1.28 Morphologie-assoziiert orf19.5977 CEM1 Protein ähnlich dem S. cerevisiae Cem1p, ein Acyl- -1.28 Carrierprotein, das in die Fettsäurebiosynthese involviert ist orf19.4270 orf19.5242 CDC6 orf19.3760 DLH1 putative Mannosyltransferase; Hap43p-reguliert -1.27 putatives ATP-Bindungsprotein mit postulierter Rolle in -1.27 DNA-Replikation funktionelles Homolog zu S. cerevisiae Dmc1p, ein Meiose- -1.26 spezifisches Protein orf19.7197 putativer intranukleärer Transport- und DNA-Replikations- -1.26 Mediator orf19.4063 GPT1 GABA/Polyamin-Transporter -1.24 orf19.4191 RLP24 putatives ribosomales Protein; Hap43p-induziert -1.24 orf19.7424 NSA2 putative Proteinkomponente des 66S pre-Ribosomalpartikels; -1.24 -1.04 Hap43p-induziert orf19.5299 ECM1 putativer pre-ribosomaler Faktor; Hog1p-reguliert -1.22 orf19.123 RCN1 Protein involviert in Calcineurin-abhängiger Signalleitung, die -1.21 orf19.76 SPB1 -1.11 Stressantwort und Virulenz reguliert putative AdoMet-abhängige Methyltransferase; Hap43p- -1.21 putative Adenylylsulfat-Kinase; postulierte Rolle in Schwefel- -1.20 induziert orf19.946 MET14 Metabolismus; Biofilm-, Adhärenz-induziert orf19.2735 SEN2 putative tRNA-Splicing Endonuklease Untereinheit; Hap43p- -1.19 induziert orf19.661 KRR1 putatives Nukleolar-Protein; induziert bei Biofilmformation -1.18 orf19.5010 DIM1 putative 18S rRNA Dimethylase mit einer postulierten Rolle -1.18 orf19.2185 NSA1 in rRNA Modifikation und Prozessierung;Hap43p-induziert putative 66S pre-ribosomale Partikelkomponente; Hap43p- -1.17 induziert orf19.5604 MDR1 Plasmamembran-Multidrug-Efflux Pumpe -1.17 orf19.1566 UTP21 putatives U3 snoRNP-assoziiertes Protein; Hap43p-induziert -1.16 orf19.1902 NOC4 putatives nukleolares Protein; Hap43p-induziert; Mutation -1.16 vermittelt Resistenz gegenüber Chemikalien orf19.3727 PHO112 putative konstitutive Acidphosphatase; Transkription durch -1.15 -1.23 Rim101p negativ reguliert; Hap43p-induziert orf19.6686 ENP2 putatives Nukleolarprotein; Hap43p-induziert -1.14 orf19.6652 DBP8 Protein ähnlich dem S. cerevisiae Dbp8p, eine ATP-abhängige -1.13 Helikase, die in rRNA Prozessierung involviert ist orf19.7050 NOP15 Nukleolar-Ribosom Biogenese-Faktor; Hyphen- und Hap43p- -1.12 induziert orf19.4268 UTP13 putatives U3 snoRNA-assoziiertes Protein; Hap43p-induziert; -1.12 herunterreguliert bei Stressantwort im Kern orf19.5066 putative pre-60S pre-ribosomale Partikel-Untereinheit; -1.10 putativer Xanthine-Harnsäure/H+ Symporter (NAT/NCS2 -1.10 Hap43p-induziert orf19.2882 XUT1 (Nucleobase-Ascorbate Transporter/Nucleobase-Cation Symporter) -Family) orf19.172 RPC19 putative RNA-Polymerase I und III Untereinheit AC19; -1.08 Hap43p-induziert; Morphologie-assoziiert orf19.5232 CSI2 putative 66S pre-ribosomale Partikelkomponente; Hap43p- -1.08 induziert; involviert in filamentöses Wachstum orf19.5049 putative U3-enthaltende 90S pre-ribosomale Prozessom- -1.08 Protein ähnlich dem S. cerevisiae Ytm1p, das in Biogenese -1.06 Komplex-Untereinheit; Hap43p-induziert orf19.4815 YTM1 der großen ribosomalen Untereinheit involviert ist; Hap43pinduziert orf19.7635 DRS1 putatives Nukleolar DEAD-Box Protein; Hap43p-induziert; -1.06 positiv reguliert durch Tbf1p; herunterreguliert bei Stressantwort im Kern orf19.2712 HCA4 putative Rolle in der Regulation der Zellwandbiogenese; -1.06 Hap43p-induziert orf19.6902 DBP7 putative ATP-abhängige DEAD-Box RNA-Helikase; Hap43p- -1.06 induziert; Morphologie-assoziiert orf19.1886 RCL1 putative U3-enthaltende 90S Preribosom-Prozessom-Komplex Untereinheit; Hap43p-induziert; Stressantwort im Kern herunterreguliert bei -1.05 -1.02 98 Ergebnisse Tabelle 3.5 - Fortsetzung Gen Genname Beschreibung Regulation nach 30 min orf19.2717 SAS10 putative Prozessomkomplex-Untereinheit; Hap43p-induziert; 60 min 90 min -1.05 Mutation vermittelt Resistenz gegenüber Chemikalien, Stressreprimiert orf19.3630 RRP8 ribosomales Protein; Hap43p-induziert; Morphologie-assoziiert -1.05 orf19.5732 NOG2 putative Nukleolar-GTPase; Hap43p-induziert -1.05 Ortholog(e) haben RNA-Helikase-Aktivität -1.03 ALP1 Cystin-Transporter; in pathogenen Hefen (kein menschliches -1.03 orf19.107 orf19.2337 Homolog) orf19.2830 RRP9 ribosomales Protein; Hap43p-induziert; Mutation vermittelt -1.03 Resistenz gegenüber Chemikalien orf19.5106 DIP2 putativer kleiner Ribonukleoproteinkomplex; Einfluss auf fila- -1.03 mentöses Wachstum; Hap43p-induziert orf19.2619 PHO113 putative konstitutive Acidphosphatase; Transkription ist -1.03 Ortholog(e) involviert in ribosomaler großen Untereinheit- -1.03 durch Rim101p negativ reguliert orf19.1091 Biogenese orf19.655 PHO84 hoch-affiner Phosphate-Transporter; Morphologie-assoziiert; -1.03 Hog1p- oder durch alkalischen pH induziert; Stress-reprimiert; hochreguliert im RHE Modell; Biofilm-, Hap43p-induziert orf19.6992 postulierter Membran-Transporter (DHA1-Familie) -1.03 orf19.1791 putatives Protein mit postulierter Rolle in 60S ribosomaler -1.02 Untereinheit-Biogenese; Hap43p-induziert orf19.1633 UTP4 putatives U3 snoRNA-assoziiertes Protein; Hap43p-induziert orf19.3631 STN1 Protein involviert in Telomer-Erhaltung -1.02 orf19.3676 ABP140 Protein ähnlich dem S. cerevisiae -1.02 orf19.2998 TSR2 Aktin-Bindungsprotein -1.02 Abp140p; Hap43p-induziert; Morphologie-assoziiert putatives Protein mit postulierter Rolle in pre-rRNA Prozes- -1.02 sierung orf19.6175 putative 35S rRNA Prozessierungsprotein; Hap43p-induziert -1.02 orf19.2320 putative Serin/Threonine-Proteinkinase -1.01 Ortholog(e) haben Exoribonuklease II Aktivität, involviert in -1.01 orf19.3624 mitochondriale, RNA-katabolische Prozesse orf19.2319 putatives Nukleolar-Protein mit postulierter Rolle in pre- -1.01 rRNA-Prozessierung; Hap43p-induziert; herunterreguliert in Stressantwort im Kern orf19.5850 NOC2 putatives Nukleolarkomplex-Protein; Hap43p-induziert; involviert in filamentöses Wachstum; herunterreguliert -1.01 bei Stressantwort im Kern orf19.59 REI1 putativer zytoplasmatischer pre-60S-Faktor; Hap43p-induziert -1.00 orf19.4933 FAD3 Omega-3 Fettsäuren-Desaturase, involviert in Produktion von -1.00 -1.05 α-Linolensäure, die eine der Hauptkomponenten von Membranen ist; Plc1p-reguliert orf19.1362 SMM1 putative Dihydrouridin-Synthase; Hap43p-induziert; -1.09 Ähnlichkeit zu S. cerevisiae Aah1p, eine Adenin-Deaminase, -1.05 Morphologie-assoziiert orf19.2251 AAH1 die in Purin-Verwertung and Nitrogenkatabolismus involviert ist; Hog1p-induziert; Morphologie-assoziiert orf19.2668 RHD2 -1.13 postulierte ORF in Retrotransposon Tca4 mit Ähnlichkeit zur Gag Region, die Nukleokapsid-ähnliches Protein enkodiert; Morphologie-assoziiert orf19.34 GIT1 Glycerophosphoinositol-Permease, involviert in Nutzung von -3.34 Glycerophosphoinositol als Phosphatquelle; pilzspezifisch (kein menschliches Homolog); Transkription durch Rim101p negativ reguliert orf19.377 PHR3 putative β-1,3-Glucanosyltransferase mit Ähnlichkeit zur -1.30 A. fumigatus GEL Familie; pilz-spezifisch (keine humanen Homologe) orf19.6140 FRE30 Protein mit Ähnlichkeit zu Eisen(III)-Reduktasen; herunterre- -1.22 guliert bei der Antwort auf Chemikalien orf19.7503 CDA2 putative Chitindeacetylase; positiv reguliert durch Tbf1p -1.87 -1.75 Da wie oben erwähnt, das Datenset 1 sich in seinen Expressionsmustern von den Sets 2 und 3 unterschied, wurden in einer weiteren Analyse der Daten nur die Gene betrachtet, die bei der Berechnung basierend auf den Sets 2 und 3 signifikant reguliert waren. Es gab keine großen Unterschiede in der Prozessverteilung der Gene nach Ergebnisse 99 der GO-Term Untersuchung. Die Listen der differentiell exprimierten Gene wurden jedoch länger. Gene, die unter diesen Bedingungen neu als signifikant hochreguliert auftraten, waren nach 30 min LL-37-Behandlung SEC20, das für ein essentielles Protein kodiert, dessen Fehlen Membranakkumulation und Arzneimittelsensitivität verursacht, und WSC4, das Gen eines putativen Precursors, der Zellwandintegrität und Stressantwort vermittelte. Nach 60 min galt das Gen RBT1 als signifikant hochreguliert, das für ein HWP1-ähnliches Zellwandprotein kodiert. Neben diesen Genen, deren Produkte Membran und Zellwand regulieren, wurden außerdem nach 30-minütiger LL-37-Behandlung die Isocitratdehydrogenase IDP2 sowie nach 60-minütiger LL-37-Behandlung die putative Alkoholdehydrogenase IFE2, die putative Pyruvatdehydrogenase-Kinase PDK2, der Zuckertransporter HXT5 und die Malat-Dehydrogenase MDH1-3 hochreguliert. Die Expression des Citratsynthase-Gens CIT1 war zu allen getesteten Zeiten signifikant hochreguliert im Vergleich zu den unbehandelten Proben. Eine reduzierte Genexpression konnte für das Gen der putativen induzierbaren Acid-Phophatase PHO100 nachgewiesen werden, die im murinen Infektionsmodell virulenz-relevant war. Auffällig war unter diesen Analysebedingungen, dass eine Vielzahl Efg1p-regulierter Gene auftrat und die Anzahl Hog1p-regulierter Gene erhöht war. 3.6 Beeinflussung der Adhärenz von Candida albicans durch LL-37 3.6.1 Adhärenz von C. albicans an Glasoberflächen Da die Adhärenz von Pathogenen an die Wirtszellen der erste wichtige Schritt im Infektionsprozess ist, wurde der Einfluss des antimikrobiellen Peptides LL-37 getestet. Zunächst wurde untersucht, ob LL-37 eine Änderung der Adhärenz von C. albicans an Glasoberflächen bewirkt. C. albicans SC5314 wurde wie im Kapitel 2.8.2 und 2.9.4 beschrieben angezogen und auf Kulturschalen mit Glasboden kultiviert. Wie Abbildung 3.24A zeigt, tritt durch die Zugabe von LL-37 eine konzentrationsabhängige Inhibierung der Adhärenz auf. Bei einer Zugabe von 30 µg/ml LL-37 ist die Anzahl adhärenter C. albicans um 50 % reduziert. 100 Ergebnisse 120 ** 700 ** 100 ** 600 * * 80 Adhärenz [%] Adhärenz [%] 500 60 40 300 ** 200 20 100 0 0 0 A * 400 5 LL37 [µg/ml] 30 0 B 5 15 LL-37 [µg/ml] 30 Abbildung 3.24: Einfluss von LL-37 auf die Adhärenz von SC5314 an Glasoberflächen (A) und Epithelzellen A431 (B). Nach einer 90-minütigen Inkubation wurden die adhärenten Zellen gezählt. Die Kontrollprobe ohne LL-37-Zugabe wurde auf 100 % gesetzt. (* - p-Wert <0,05; ** - p-Wert <0,005) A: Durch LL-37-Zugabe reduzierte sich die Anzahl adhärenter Candida auf Glas um 25 % (5 µg/ml) bzw. 50 % (30 µg/ml). (100 % entsprechen ca. 230 Zellen). B: LL-37 bewirkte eine konzentrationsabhängige Verstärkung der Adhärenz von SC5314 an A431. Eine Zugabe von 30 µg/ml führte zu einer Verfünffachung der Anzahl adhärenter Candida. (100 % entsprachen ca. 20 Zellen) 3.6.2 Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen Zur Bestimmung der Adhärenz an Epithelzellen wurde die Epithelzellen A431 wie beschrieben kultiviert (siehe Abschnitt 2.9.1) und mit C. albicans SC5314 infiziert (siehe Abschnitt 2.9.4). Hier zeigte sich, wie in Abbildung 3.24B dargestellt, eine konzentrationsabhängige Verstärkung durch Zugabe von LL-37. Bei einer LL-37Konzentration von 5 µg/ml trat eine Verdopplung, bei 15 µg/ml eine Verdreifachung und bei 30 µg/ml LL-37 eine Verfünffachung der Anzahl adhärenter C. albicans ein. Da überprüft werden muësst, ob es sich bei diesem Effekt um einen von der Zelllinie abhängigen Prozess handelte, wurden die Zelllinien Cache und A549 ebenfalls im Adhärenzassay getestet. Auch für diese Zelllinien zeigte sich, dass der Stamm C. albicans SC5314 deutlich stärker an den Epithelzellen adhärierte, wenn dem Medium LL-37 zugegeben wurde (siehe Abbildung 3.25). Die Verstärkung der Adhärenz für diese beiden Zelllinien war um ca. 15 % geringer als bei der Zelllinie A431. Um auszuschließen, dass dieser durch LL-37 ausgelöste Adhärenzeffekt nur für den C. albicans -Stamm SC5314 auftritt, wurden auch die Stämme C. albicans DSM1386 und DSM1577 im Adhärenzassay eingesetzt. Hier zeigte sich ebenfalls eine Verstärkung der Adhärenz bei Zugabe von LL-37 (siehe 3.26A). Die im Vergleich zu den Ergebnisse 101 500 800 450 700 400 600 300 250 A431 Caco2 200 Adhärenz [%] Adhärenz [%] 350 500 400 A431 A549 300 150 200 100 100 50 0 0 0 15 LL-37 [µg/ml] 0 15 LL-37 [µg/ml] B Abbildung 3.25: LL-37 verstärkt die Adhärenz von SC5314 an Caco2- (A) und A549Zellen (B). Nach 90-minütiger Inkubation mit den Epithelzellen wurden die adhärenten Hefezellen gezählt. Die Kontrollproben ohne LL-37-Zugabe wurde gleich 100 % gesetzt. Für alle verwendeten Zelllinien ist die Erhöhung der Anzahl adhärenter C. albicans mit einem p-Wert <0,005 signifikant. (100 % entsprachen ca. 50 (A) bzw. 20 (B) Zellen) oben dargestellten Versuchsergebnissen höheren prozentualen Werte unter LL-37Behandlung sind bedingt durch geringere absolute Zahlen in den unbehandelten Proben. Abbildung 3.26B zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Adhärenz des Stam- 1400 600 1200 500 800 SC5314 DMSZ1386 DMS1577 600 Adhärenz [%] Adhärenz [%] 1000 400 300 SC5431 DAY286 200 100 200 0 0 0 A 400 15 LL-37 [µg/ml] 0 B 15 LL-37 [µg/ml] Abbildung 3.26: LL-37 verstärkt die Adhärenz von verschiedenen C. albicans-Stämmen an A431 Zellen. Nach 90-minütiger Inkubation mit den Epithelzellen A431 wurden die adhärenten Hefezellen gezählt. Die Kontrollprobe ohne LL-37-Zugabe wurde gleich 100 % gesetzt. Für alle drei Stämme ist die Erhöhung der Anzahl adhärenter Zellen mit einem p-Wert <0,005 signifikant. (100 % entsprachen ca. 4 (A) bzw. 20 (B) Zellen) 102 Ergebnisse mes DAY286 an den Epithelzellen unter Zugabe von LL-37. Auch hier zeigte sich ein deutlicher Anstieg der Anzahl adhärierter Hefen. Des weiteren wurden der C. albicans-Stamm SC5314 in abgetöteter Form und Latex-Beads im Adhärenzassay eingesetzt (siehe Kapitel 2.8.3). Hiermit sollte eine unspezifische Veränderung der Adhärenzeigenschaften der Epithelzellen ausgeschlossen werden. Die Auszählung der mikroskopischen Aufnahmen zeigte, dass sowohl für die abgetöteten C. albicans SC5314 als auch die Latex-Beads keine Erhöhung der Adhärenz bei der Zugabe von LL-37 detektierbar war (siehe Abbildung 3.27). 800 700 Adhärenz [%] 600 500 SC5314 SC5314 † Latex 400 300 200 100 0 5 15 LL-37 [µg/ml] 30 Abbildung 3.27: LL-37 erhöht die Anzahl adhärenter lebender C. albicans an Epithelzellen. LL-37 hat keinen Einfluss auf die Adhärenz abgetöteter C. albicans SC5314 und Latex Beads an A431-Zellen. Nach 90-minütiger Inkubation mit den Epithelzellen A431 wurden die toten adhärenten Hefezellen bzw. die Latex Beads gezählt. Die Kontrollprobe ohne LL-37-Zugabe wurde gleich 100 % gesetzt. (100 % entspricht ca. 20 Zellen bzw. 70 LatexBeads) Die beschriebenen Infektionsversuche wurden ausschließlich in serumfreien Medien durchgeführt. Da aber eine Veränderung der Wirkung antimikrobieller Peptide bei Anwesenheit von Serum in der Literatur beschrieben ist [159, 160], wurde der Einfluss von Serum auf die Adhärenz von C. albicans unter Zugabe von LL-37 untersucht. Die Infektion wurde wie in Kapitel 2.9.4 erläutert durchgeführt, jedoch wurde statt des serumfreien RPMI das Medium RPMI + 10 % FBS verwendet. Die Auszählung der nach 90-minütiger Inkubation adhärierten C. albicans zeigte, dass auch in serumhaltigen Medium eine vergleichbar starke LL-37-bedingte Verstärkung der Adhärenz auftrat (Abb. 3.28). Ergebnisse 103 600 ** 500 Adhärenz [%] Abbildung 3.28: LL-37 erhöht die Anzahl adhä400 renter C. albicans an Epithelzellen unter serum- ** 300 haltigen Bedingungen. Nach 90-minütiger Inku- * 200 bation mit den Epithelzellen A431 wurden die adhärenten C. albicans gezählt. Die Kontrollprobe 100 ohne LL-37-Zugabe wurde gleich 100 % gesetzt. 0 0 3.6.3 5 15 LL-37 [µg/ml] 30 (100 % entspricht ca. 20 Zellen bzw. 70 LatexBeads; * - p-Wert <0,05, **- p-Wert <0,005) Untersuchung der Infektion im Adhärenzassay unter dem Rasterelektronenmikroskop Zur genaueren Analyse wurden nach Kapitel 2.9.3 hergestellte Infektionspräparate elektronenmikroskopisch untersucht (Manfred Rhode, Arbeitsgruppe MMIK, HZI). Auch hier zeigte sich eine Verstärkung der Adhärenz. Während in den unbehandelten Proben nur eine sehr geringe Anzahl adhärenter C. albicans detektiert werden konnten, war die Anzahl in den LL-37-behandelten Proben stark erhöht. Auffällig war außerdem, dass in den unbehandelten Präparaten nur sehr kurze Hyphen zu finden waren, die ohne ausgeprägte Kontakte auf den Epithelzellen lagen (3.29A). Es muß angenommen werden, dass durch weniger starke Zell-Zellkontakte in den unbehandelten Proben die Hefe während der stringenteren Waschschritte der Probenaufbereitung für die Elektronenmikroskopie abgewaschen wurden. Die Hyphen in den LL-37-behandelten Präparaten waren in die Epithelzellen eingedrungen (3.29B und D). In den Abbildungen 3.29C und E zeigten sich enge Zell-Zellkontakte zwischen C. albicans und Epithelzellen. Ob diese für eine aktive Aufnahme des Pathogens durch die Wirtszellen oder ein aktives Penetrieren durch Candida sprechen, ließ sich aus den mikroskopischen Aufnahmen nicht ableiten. Abbildung 3.29G zeigt jedoch sehr eindrucksvoll, dass die eingedrungenen Hyphen lebensfähig sind und die Wirtszellen durchwachsen können. 104 Ergebnisse A B C D E F G Abbildung 3.29: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Infektion von A431 mit SC5314 unter Zugabe von LL-37; A: Nach einer Infektionsdauer von 6 h ohne Zugabe von LL-37 befinden sich nur vereinzelt C. albicans auf den Wirtszellen. B, C: Bei Behandlung mit 5 µg/ml bzw. 30 µg/ml LL-37 und einer Infektionsdauer von 3 h dringt C. albicans in die Zellen ein. D, E: Ein Eindringen des Pathogens tritt ebenso bei 6-stündiger Infektion unter der Zugabe von 5 µg/ml bzw. 30 µg/ml auf. F: unbehandelte A431-Zellen; G: Nach 3-stündiger Infektion unter Zugabe von 5 µg/ml LL-37 hat die Hyphe die Epithelzelle komplett durchwachsen. Ergebnisse 3.6.4 105 F-Aktinfärbung an infizierten Epithelzellen Eine aktive Aufnahme von C. albicans durch Endothel- und Epithelzellen mit Hilfe Clathrin-abhängiger Mechanismen wurde in der Literatur beschrieben [161, 162]. Dieser Prozess ist verbunden mit einer Akkumulation von F-Aktin um die eindringenden Hyphen. Wie in Kapitel 3.6.3 gezeigt, drangen die C. albicans-Hyphen unter LL-37-Zugabe in die Epithelzellen ein. Um eine Aussage darüber treffen zu können, ob die Epithelzellen hierbei eine aktive Rolle ausüben, wurde das Aktinzytoskelett R wie in Kapitel 2.9.7 beschrieben mit Alexa Fluor 488-Phalloidin gefärbt. Abbildung 3.30 zeigt ein Beispiel einer mikroskopischen Aufnahme. Die Hyphen dringen in die Zellen ein und verlaufen hierbei zwischen Filamentschichten. Eine Akkumulation R von Alexa Fluor 488-Phalloidin-markiertem F-Aktin um eindringende Candida- Zelle konnte jedoch nicht unter diesen Bedingungen beobachtet werden. Abbildung 3.30: Aktinfärbung an C. albicans SC5314-infizierten Epithelzellen A431. Die Infektion erfolgte für 90 min unter Zugabe von 15 µg/ml LL-37. Die Aktinfilamente wurden mit R Alexa Fluor 488-Phalloidin ge- färbt. Eine Aktinakkumulation an C. albicans-Hyphen konnte nicht beobachtet werden. 3.6.5 Lebend/Tot-Färbung im Adhärenzassay Aufgrund der Ergebnisse aus den beschriebenen Adhärenzversuchen sollte getestet werden, inwieweit C. albicans die Epithelzellen schädigt. Aufgrund des Durchwachsens der Zellen (siehe Abb. 3.29) wurde vermutet, dass C. albicans die Zellen tötet. Eine Lebend/Tot-Färbung, die wie in Abschnitt 2.9.5 beschrieben durchgeführt wurde, sollte darüber Aufschluss geben. Die Epithelzellen A431 wurden wie in Kapitel 2.9.1 und 2.9.3 beschrieben kultiviert und infiziert. Die LL-37-Zugabe erfolgte 30 min vor der Infektion mit C. albicans SC5314, die Infektion für 90 min. Wie Abbildung 3.31A zeigt, wird eine Erhöhung der Anzahl toter (roter) Zellen bei Infektion mit C. albicans und LL-37 deutlich. 106 Ergebnisse - SC5314 + SC5314 LL-37 [µg/ml] 0 15 Overlay 1 A Overlay 2 - SC5314 + SC5314 LL-37 [µg/ml] 0 15 Overlay 1 B Overlay 2 C 40 50 40 30 - SC5314 + SC5314 20 10 0 0 15 LL-37 [µg/ml] Fluoreszenzintensität [rfu] Fluoreszenzintensität [rfu] 60 D 35 30 25 20 - SC5314 + SC5314 15 10 5 0 0 LL-37 [µg/ml] 15 Abbildung 3.31: Lebend/Tot-Färbung an infizierten A431- (A, C) und Caco2-Zellen (B, D) nach LL-37-Behandlung: Es zeigt sich eine signifikante Zunahme der Fluoreszenzintensität toter Epithelzellen allein durch die Behandlung mit LL-37 (p-Wert <0,005). A und B: mikroskopische Aufnahmen der Präparate, Overlay 1 stellt die Überlagerung der Aufnahmen im Grün- (lebend) und Rot- (tot) Filter dar. Overlay 2 setzt sich aus den Aufnahmen im Hellfeld und der Tot-Färbung zusammen. C und D: Die aus den Histogrammen der Aufnahmen im Rotfilter ermittelten durchschnittlichen Fluoreszenzintentsitäten wurden graphisch aufgetragen. Ergebnisse 107 Jedoch tritt diese ebenso bei den nichtinfizierten aber mit LL-37-behandelten Zellen auf. Die Histogramme der mikroskopischen Aufnahmen der Tot-Färbung wurden erstellt und lieferten die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten. Diese Daten wurden in Abbildung 3.31C dargestellt. Es zeigte sich eine vierfach verstärkte Rotfärbung der Zellen nach LL-37-Behandlung. Die Infektion mit C. albicans hatte hier keinen weiteren zellschädigenden Einfluss. Die Untersuchungen wurden ebenso an Caco2-Zellen durchgeführt. Wie die Abbildung 3.31B zeigt, trat auch hier eine verstärkte Rotfärbung bei LL-37-Zugabe auf. Die graphische Darstellung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten (siehe Abb. 3.31D) zeigt eine Verdopplung der Anzahl rot-markierter Zellen nach LL37-Behandlung. Auch auf diese Zelllinie hatte LL-37 eine zellschädigende Wirkung, die unabhängig von der Infektion mit C. albicans SC5314 war. Durch Auszählung der Gesamtzahl lebender und toter Zellen pro mikroskopischer Aufnahme wurde ein Anteil von maximal 10 % toter Zellen nach LL-37-Behandlung ermittelt. Es wird in der Literatur beschrieben, dass eine zytotoxische Wirkung der AMPs nur in serumfreiem Medium auftritt [159, 160]. Aus diesem Grund wurde die Lebend/Tot-Färbung auch nach LL-37-Behandlung im serumhaltigen Medium RPMI + 10 % FBS durchgeführt. Es zeigte sich, dass hier eine nur schwache aber signifikante Erhöhung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der gefärbten toten Zellen von ca. 10 % auftrat, während unter serumfreien Bedingungen eine Vervierfachung detektiert werden konnte (siehe Abb. 3.32). Im Gegensatz zu den Untersuchungen unter serumfreien Bedingungen zeigte sich hier bei Infektion mit C. albicans eine Zunahme der Fluoreszenzintensität toter Zellen im Vergleich zu den uninfizierten Proben. Unter serumhaltigen Bedingungen wurde also eine zellschädigende Wirkung von C. albicans detektiert. Bei einer Behandlung der Proben mit 30 µg/ml LL-37 war dies jedoch nicht mehr der Fall. Hier wurde im Vergleich zu den Proben, die mit 0, 5 bzw. 15 µg/ml LL-37 behandelt wurden, eine geringere Menge toter Zellen bei gleichzeitiger Infektion detektiert. 3.6.6 Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen nach vorheriger Behandlung mit LL-37 Da gezeigt werden konnte, dass LL-37 einen zellschädigenden Effekt auf die Epithelzellen hatte, wurde getestet, wie C. albicans an mit LL-37 vorbehandelten Zellen bindet. Hierfür wurden die Zellen wie in Kapitel 2.9.1 beschrieben kultiviert. Es 108 Ergebnisse - SC5314 + SC5314 LL-37 [µg/ml] 0 30 A Overlay 1 Overlay 2 9 Fluoreszenzintensität [rfu] 8 ** ** 7 ** * 6 ** 5 - SC5314 4 + SC5314 3 2 1 0 0 B 5 15 30 LL-37 [µg/ml] Abbildung 3.32: Lebend/Tot-Färbung an infizierten A431-Zellen in serumhaltigem Medium: Es zeigt sich eine schwache aber signifikante Zunahme der Fluoreszenzintensität toter Epithelzellen durch die Behandlung mit LL-37. Die Infektion mit C. albicans SC5314 hat eine zusätzliche zellschädigende Wirkung. A: mikroskopische Aufnahmen der Präparate, Overlay 1 stellt die Überlagerung der Aufnahmen im Grün- (lebend) und Rot- (tot) Filter dar. Overlay 2 setzt sich aus den Aufnahmen im Hellfeld und der Tot-Färbung zusammen. B: Die aus den Histogrammen der Aufnahmen im Rotfilter ermittelten durchschnittlichen Fluoreszenzintentsitäten wurden graphisch aufgetragen. (* - p-Wert <0,05, ** - p-Wert <0,005) erfolgte ein 30-minütige Vorbehandlung der Zellen mit LL-37. Vor Versuchsbeginn wurden die Zellen zweimal mit serumfeiem RPMI gewaschen. Nach erneuter Zugabe des Mediums erfolgte die Infektion mit (15/15) oder ohne (15/0) erneute Zugabe von LL-37. Abbildung 3.33A zeigt die Ergebnisse der Auszählung der adhärenten Zellen in den mikroskopischen Aufnahmen. Es wird deutlich, dass allein durch die Vorbehandlung der Epithelzellen mit dem antimikrobiellen Peptid eine Verdopplung der Anzahl adhärenter C. albicans auftrat. Durch die Zugabe von LL-37 zum eigentlichen Infektionsprozess stieg die Zahl nochmals um 40 %. Die Vitalität der Epithelzellen zeigte durch die Vorbehandlung mit LL-37, wie in Abbildung 3.33B Ergebnisse 109 ersichtlich wird, nur eine geringe Beeinträchtigung. Die erneute Zugabe von LL-37 zum Infektionszeitpunkt erhöhte die Anzahl toter Zellen im gleichen Maße, wie in Abbildung 3.31C dargestellt. 700 50 45 Fuoreszenzintensität [rfu] 600 Adhärenz [%] 500 400 300 200 100 35 30 25 - SC5314 + SC5314 20 15 10 5 0 0 0/0 A 40 15/0 LL-37 [µg/ml] 15/15 0/0 B 15/0 LL-37 [µg/ml] 15/15 Abbildung 3.33: Einfluss einer Vorbehandlung der Epithelzellen A431 mit LL-37 auf die Adhärenz von C. albicans SC5314 (A) und die Vitalität der Epithelzellen (B). Die Zellen wurden nach Vorbehandlung mit LL-37 bei Infektion erneut mit LL-37 versetzt (15/15) oder die Infektion erfolgte ohne LL-37 (15/0). Die Kontrollzellen wurden nicht mit LL-37 behandelt (0/0). A: Die Anzahl adhärenter C. albicans nimmt bei einer Vorbehandlung der Epithelzellen um ca. 250 % zu, bei LL-37-Zugabe während der Infektion um 400 %. (* - p-Wert <0,05, ** - p-Wert <0,005) B: Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Aufnahmen der Tot-Färbung zeigt einen schwachen Anstieg bei Vorbehandlung mit LL-37, eine Vervierfachung bei Anwesenheit von LL-37 während der Infektion. Die durch LL-37 bedingte Änderung der Fluoreszenzintensität ist signifikant (p-Wert <0,05). 3.7 Adhärenz von Candida albicans Mutanten Aufgrund der Array-Daten (siehe Kapitel 3.5) wurden Mutanten ausgewählt, die im Adhärenzassay getestet werden sollten. Es kamen die Mutanten ∆iff4 und ∆pho100 zum Einsatz, da diese Gene als signifikant hoch- bzw. herunterreguliert ermittelt worden waren (siehe Kapitel 3.5). Des weiteren wurden Mutanten eingesetzt, in denen Gene deletiert waren, die für Proteine kodieren, die bei LL-37-Behandlung die Expression signifikant regulierter Gene beeinflussen, wie ∆hog1 und ∆efg1. Da eine durch LL-37-beeinflusste Hyphenbildung beschrieben wurde (siehe Kapitel 3.4), sollten Mutanten getestet werden, die eine Deletion der hyphenregulierenden Gene cdc35, cek1 bzw. mkc1 aufwiesen. Außerdem wurde ein Stamm verwendet, der für 110 Ergebnisse das Protein Msb2 deletiert war, da dies ein wichtiges Protein in der Entgiftung von LL-37 für C. albicans darstellt [132]. Wie in Abbildungen 3.34A und B deutlich wird, zeigten die Stämme ∆iff4, ∆pho100 und ∆msb2 keine durch LL-37 verstärkte Adhärenz, gleiches galt für die Stämme ∆hog1 und ∆efg1. Die Mutanten ∆cdc35, ∆cek1 und ∆mkc1 wiesen ein Adhärenzverhalten auf, das den Wildtypstämmen SC5314 und DAY286 entsprach. 900 800 Adhärenz [%] 700 600 500 ** 400 ** 300 SC5314 DAY286 Δiff4 Δmsb2 Δpho100 200 100 0 5 A 15 LL-37 [µg/ml] 30 1200 Adhärenz [%] 1000 800 600 ** 400 ** SC5314 Δcdc35 Δcek1 Δmkc1 Δefg1 Δhog1 200 0 5 B 15 LL-37 [µg/ml] 30 Abbildung 3.34: Einfluss von LL-37 auf die Adhärenz verschiedener C. albicans Mutanten an A431 Zellen. Nach 90-minütiger Inkubation mit den Epithelzellen A431 wurden die adhärenten Hefezellen gezählt. Die Kontrollprobe ohne LL-37-Zugabe wurde gleich 100 % gesetzt. (** - p-Wert <0,005) Ergebnisse 3.8 111 Wirkung des AMP LL-37 auf Epithelzellen 3.8.1 3.8.1.1 Toxizität von LL-37 auf Epithelzellen R CSFE- und AlamarBlue -Test Da in der Lebend/Tot-Färbung ein zellschädigender Effekt von LL-37 festgestellt wurde, erfolgte die Untersuchung der toxischen Wirkung des Peptides auf die Epithelzellen A431 nach den in Abschnitt 2.9.2 beschriebenen Toxizitätstest. Die Abbildung 3.35 zeigt die Ergebnisse. In beiden Tests konnte keine Toxizität von LL-37 festgestellt werden. Für Methanol, das als Kontrollsubstanz verwendet wurde, konnte eine toxische Wirkung gezeigt werden. Wie in Kapitel 3.6.5 beschrieben, wurde in den mikroskopischen Aufnahmen eine maximale Anzahl toter Zellen von 10 % ermittelt. Da sich die Standardabweichungen der Doppelbestimmungen in den verschiedenen Tests ebenfalls in diesen Größenordnungen belaufen, kann mit diesen 140 140 120 120 100 100 Toxizität [%] Toxizität [%] Tests eine so schwache toxische Wirkung nicht erfasst werden. 80 60 80 40 40 20 20 0 0.0001 0.01 1 LL-37 [µg/ml] 100 CFSE Alamar blue 60 0 0.00001 0.001 0.1 Methanol [%] 10 Abbildung 3.35: Toxizitätstests an A431, Behandlung mit LL-37 (A) und Methanol als Kontrolle (B) 3.8.1.2 Annexin-Färbung Eine weitere Möglichkeit der Untersuchung der toxischen Wirkung auf Zellen stellt die in Kapitel 2.9.6 beschriebene Annexin-Färbung dar. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, zwischen apoptotischen und nekrotischen Zellen zu unterscheiden. Die in Abbildung 3.36A dargestellten mikroskopischen Aufnahmen lassen erkennen, dass die Anzahl nekrotischer (gelber) Zellen in gleichem Maße zunahm wie die 112 Ergebnisse apoptotischer (grüner) Zellen. Die Auswertung der Fluoreszenzaufnahmen nach ihrer durchschnittlichen Fluoreszenzintensität zeigte ebenfalls eine Zunahme der Werte bei steigender LL-37-Konzentrationen im Medium (siehe Abb. 3.36B). Durch Annexin werden sowohl apoptotische also auch nekrotische Zellen angefärbt, während der Farbstoff 7AAD nur nekrotische Zellen eindringt. Da beide Farbstoffe in gleichem Maße bei steigender LL-37-Konzentration detektiert werden konnten, lag hauptsächlich nekrotischer Zelltod vor. 0 µg/ml 5 µg/ml Annexin 7AAD 3.0 15 µg/ml 30 µg/ml FC zu unbehandelt 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 A 5 15 LL-37 [µg/ml] 30 B Abbildung 3.36: Annexin-Färbung an A431-Zellen nach LL-37-Behandlung. A: Die mikroskopischen Aufnahmen (hier Overlays der Fluoreszenzbilder und der Aufnahmen im Hellfeld) zeigen eine Zunahme rot- und gelbfluoreszierender Zellen. Annexin-FITC - grün, 7AAD - rot, Annexin-FITC und 7AAD - gelb. B: Durchschnittliche Fluoreszenzintensität der mikroskopischen Fluoreszenzaufnahmen. Dargestellt sind die Änderungen der Fluoreszenzintensitäten der beiden Farbstoffe durch LL-37-Behandlung im Vergleich zur unbehandelten Probe. 3.8.2 Einfluss von LL-37 auf die Pattern RecognitionRezeptoren der Epithelzellen Die dargestellten Ergebnisse der Adärenzassays zeigen eine durch LL-37 verstärkte Bindung von C. albicans an Epithelzellen. Eine Interaktion zwischen Pathogen und Wirt erfolgt unter anderem über PRRs. Aus diesem Grund sollte die Wirkung des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf die Zusammensetzung der Pattern Recognition Receptors (PRR) an der Oberfläche der Epithelzellen getestet werden. Da vor allem die Rezeptoren TLR2, TLR4 und Dectin-1 für die Erkennung von Candida albicans wichtig sind, wurden sie für diese Untersuchungen ausgewählt. Zusätzlich wurde der CXCR4-Rezeptor mit in die Untersuchungen aufgenommen, da das für diesen Ergebnisse 113 800 Fluoreszenzintensität [%] 700 600 500 LL-37 [µg/ml] 400 0 5 15 300 200 100 0 Alexa488 TLR2 TLR4 Dectin1 CXCR4 Abbildung 3.37: Detektion der PRRs an der Zelloberfläche der Epithelzellen A431 nach Behandlung mit LL-37. Gezeigt wurden die gemessenen durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten (Mediane), die sich aus den Messungen in der Durchflusszytometrie ergaben. Die Werte der unbehandelten Proben wurden auf 100 % gesetzt. Rezeptor kodierende Gen in den Arbeiten von Katja Gremmer [163] als stark reguliert in der Interaktion von Epithelzellen mit C. albicans auftrat. Die Epithelzellen A431 wurden wie in Kapitel 2.9.1 beschrieben kultiviert und nach der 90-minütigen LL-37-Behandlung mit den entsprechenden Antikörpern für die FACS-Analyse aufbereitet (siehe 2.9.8). In mindestens drei unabhängigen Experimenten konnte für TLR2, Dectin-1 und CXCR4 eine deutliche, für TLR4 eine sehr schwache Erhöhung der Anwesenheit der Rezeptoren auf der Zelloberfläche nach LL-37-Behandlung gezeigt werden (Abb. 3.37). Die Erhöhung der detektierten Signale lag für TLR2 bei 50 % und 25 % bei einer Behandlung mit 5 bzw. 15 µg/ml LL-37 und für Dectin-1 bei 100 % bei einer LL-37-Konzentration von 15 µg/ml. Die detektierten Mengen des Rezeptors CXCR4 wurden durch LL-37-Zugabe verdoppelt bzw. um das 6-fache erhöht. Der TLR4 wurde bei Behandlung mit 15 µg/ml des AMPs um 20 % mehr auf der Epithelzelloberfläche nachgewiesen. In Abbildung 3.38 sind typische Histogramme dargestellt. Hier zeigt sich deutlich die Verschiebung der Peaks für die Rezeptoren TLR2 und CXCR4 infolge einer Behandlung mit 5 µg/ml LL-37. 3.8.3 LL-37-induzierte Bildung von IL8 LL-37 wird während Entzündungs- und Infektionsprozessen freigesetzt. Ein weiterer wichtiger Botenstoff, der in solchen Situationen von Zellen ausgeschüttet wird, ist das Zytokin IL8. IL8 ist als chemotaktiler Faktor für Neutrophile bekannt. Es sollte 114 Ergebnisse unbehandelt Abbildung 3.38: 5 µg/ml LL-37 Histogramme Alexa488 TLR2 TLR4 der Durch- flusszytomtrie Dectin1 PRR-gefärbter CXCR4 Epithelzellen A431 nach Behandlung mit LL-37. untersucht werden, ob die Behandlung der Epithelzellen mit LL-37 auch zur IL8Freisetzung führt. Die Epithelzellen A431 wurden wie in Kapitel 2.9.1 beschrieben kultiviert und für 120 min mit LL-37 inkubiert. Die Probenahme und der IL8-ELISA wurden wie in Abschnitt 2.9.9 beschrieben durchgeführt. Die Daten aus sechs verschiedenen Experimenten wurden zusammengefasst und in der Abbildung 3.39A dargestellt. Nach der Behandlung mit LL-37 wurde ein konzentrationsabhängiger Anstieg von IL8 im Überstand gemessen. Bei Zugabe von 30 µg/ml LL-37 war eine Erhöhung der IL8-Konzentration um das 6-fache im Überstand detektierbar. Diese Beobachtung konnte ebenso an A549 Zellen gemacht werden (Abb. 3.39B).2 280 400 ** 230 300 ** 250 IL8 [pg/ml] 180 IL8 [pg/ml] ** 350 130 80 200 150 * 100 50 30 0 -50 -20 0 A 5 15 LL-37 [µg/ml] 0 30 B 5 15 LL-37 [µg/ml] 30 Abbildung 3.39: IL8-Konzentration in den Überständen LL-37-behandelter Epithelzellen A431 (A) und A549 (B). Das Detektionslimit lag bei 15 pg/ml IL8. Die LL-37-bedingte IL8-Ausschüttung war in beiden Zelllinien signifikant. (* - p-Wert <0,05, ** - p-Wert <0,005) 2 Im Adhärenzassay wurde der Einfluss von IL8 auf das Bindungsverhalten von C. albicans SC5314 an Epithelzellen A431 getestet. Es konnte keine Veränderung der Anzahl adhärierter C. albicans detektiert werden. Ergebnisse 3.8.4 115 Einfluss von LL-37 auf die Expression der PRR und des Zytokins IL8 Wie in den Abschnitten 3.8.2 und 3.8.3 beschrieben, konnte gezeigt werden, dass LL37 Einfluss auf die Expression von PRRs in der Zellmembran hat und die Freisetzung von IL8 induziert. Es soll überprüft werden, ob dies auch auf Genexpressionsebene zu sehen ist. Hierfür wurde wie in Abschnitt 2.10.5 beschrieben vorgegangen. Die RT-PCR wurde von drei unterschiedlichen biologischen Replikaten erstellt. Abbildung 3.40 zeigt exemplarisch die Daten einer Versuchsserie. Die Expression des Dectin-1 Gens (CLEC7A) war nach dem gewählten Analysezeitpunkt um das dreifache erhöht. Die Gene der Rezeptoren CXCR4 und TLR4 sowie des Zytokins IL8 wurden infolge der LL-37-Behandlung um 50 % stärker exprimiert. Die Expression des TLR2-Gens änderte sich ebenso wie die der gewählten Housekeeper-Gene nicht durch Zugabe des AMPs. 4.0 3.5 FC zu unbehandelt 3.0 LL-37 [µg/ml] 2.5 5 15 0 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 CLEC7A CXCR4 IL8 TLR2 TLR4 GAPDH Abbildung 3.40: Expression der Gene CLEC7A, CXCR4, IL8, TLR2, TLR4 und des Housekeepers GAPDH. Die Epithelzellen A431 wurden in RPMI mit 0 (unbehandelt), 5 bzw. 15 µg/ml LL-37 für 60 min inkubiert. Dargestellt sind die vielfachen Veränderungen (fold changes - FC ) der Genexpression im Vergleich zu den unbehandelten Proben. Kapitel 4 Diskussion Candida albicans ist ein opportunistisches Pathogen, das ausgesprochen vielfältige Anpassungsmechanismen an seinen Wirt entwickelt hat. Diese verhelfen ihm zu einem Leben als kommensaler Organismus der menschlichen schleimhautassoziierten Mikroflora. Gleichzeitig ermöglichen sie ihm bei gegebenen äußeren Bedingungen einen schnellen Wechsel zu einem Pathogen. Während Menschen, die C. albicans als Kommensale der normalen Mikroflora aufweisen, keinerlei Krankheitssymptome zeigen, kann die pathogene Wachstumsform von C. albicans schwere invasive Infektionen hervorrufen. Bisherige Therapien zielen auf die Abtötung und Eliminierung des Mikroorganismus. Aufgrund genetischer und zellbiologischer Ähnlichkeiten zwischen der eukaryotischen Hefe und menschlichen Zellen sind molekulare, pathogenspezifische Angriffspunkte für Antibiotika nicht einfach zu finden. Zudem erschwert die zunehmende Entwicklung mikrobieller Arzneimittelresistenzen die Therapie. Ein Therapieansatz unter neuem Blickwinkel könnte neue Behandlungsmöglichkeiten offerieren. Denn die Tatsache, dass C. albicans im gesunden Menschen keine Krankheiten verursacht, spricht dafür, dass der Mensch wirkungsvolle Verteidigungsmechanismen gegen den Pilz besitzt. Im immunsupprimierten Patienten sind diese Mechanismen nicht mehr voll funktionsfähig, was die ausgesprochen flexible Hefe zu einem rasanten Wachstum befähigt. Eine Aufklärung der Schlüsselfaktoren, die C. albicans für eine Invasion ausnutzt oder eine Reaktivierung der menschlichen Verteidigungsmechanismen könnten die Entstehung schwerwiegender C. albicans-assoziierter Krankheiten verhindern. 117 118 4.1 Diskussion Metabolische Analysen liefern molekulare Ziele Ein Teilaspekt dieser Arbeit war es, den Metabolismus von C. albicans eingehend zu untersuchen, um Schlüsselreaktionen zu identifizieren, die als mögliche Angriffspunkte in der Therapie verwendet werden könnten. Dies erfolgte unter Verwendung verschiedener, in ihrer Zusammensetzung definierter Medien, wie RPMI-MOPS pH 7,4, YNB-MOPS pH 7,4 und YNB-MOPS pH 5,6. Es zeigte sich, dass C. albicans nur in den pH-neutralen Medien bei 37◦ C auch ohne Serum Hyphen ausbildet. Dies wird durch die Literatur bestätigt, in der beschrieben wird, dass die Anwesenheit zweier hypheninduzierender Bedingungen (hier der neutrale pH-Wert und eine Temperatur von 37◦ C) für den Übergang in das filamentöse Wachstum ausreichend ist [30]. Eine Zellzahlerhöhung war in diesen Medien, anders als im aziden Medium, nicht zu verzeichnen. Die Biomasseproduktion unterschied sich zwischen den YNB-Kulturen nicht. Im azideren Medium wurde die Biomassebildung jedoch durch Teilung erzielt, im neutralen Medium nahezu ausschließlich durch die Hyphenbildung. C. albicans ist dazu befähigt, alle Aminosäuren selbst zu synthetisieren [126]. Dies ist energetisch aufwendig, was sich in einer reduzierten Biomasseproduktion in den YNB-Medien im Vergleich zum RPMI-Medium widerspiegelt. Es kam im YNBMedium zu einer früheren Limitierung der Rohstoffe und somit zum Übergang der Kultur in die stationäre Phase. Hierbei ist zu beachten, dass diese Prozesse nicht zeitgleich auftraten. Da die aus dem Medium aufgenommenen Nährstoffe intrazellulär verstoffwechselt wurden, fand ein Wachstum statt, auch nachdem im Medium keine Kohlenstoffquellen mehr detektiert werden konnten. Einer der markantesten Unterschiede zwischen den Medien war die erhöhte Glycerinproduktion in RPMI-Medium. Glycerin ist neben Ethanol und Kohlendioxid eines der wichtigsten Nebenprodukte der alkoholischen Gärung unter anaeroben Bedingungen. 4-10 % der Kohlenstoffquelle können hierbei zu Glycerin umgewandelt werden, um das zytosolische Redoxgleichgewicht unter Sauerstoffmangel aufrechtzuerhalten. Glycerin wird in sehr viel geringerem Maße auch unter aeroben Bedingungen gebildet [164]. Es kann angenommen werden, dass es aufgrund des vielfältigeren Ressourcenangebots im RPMI-Medium (Aminosäuren und Vitamine sind enthalten) zu einer schnelleren Atmung und somit zu einer Sauerstofflimitierung kam, die eine Bildung von Glycerin nach sich zog. Das gebildete Glycerin kann von C. albicans als Kohlenstoffquelle genutzt werden [165]. Da im RPMI-Medium auch nach dem Verbrauch der Glucose eine Zunahme Diskussion 119 der Biomasse zu verzeichnen war, könnte das Glycerin als Kohlenstoffquelle genutzt worden sein. Dies korreliert mit der Beobachtung, dass nach einer Kultivierungsdauer von 4 Stunden die Glycerinkonzentrationen im Medium abnahmen. Ebenso kann C. albicans Aminosäuren als Kohlenstoffquelle nutzen [16]. Während die Glucose nach 6 Stunden verbraucht war, standen Aminosäuren noch zur Verfügung. Ein Vergleich der metabolischen Daten der RPMI-Kulturen aus der Wachstumsuntersuchungen in verschiedenen Medien (VI) und unter LL-37-Behandlung (VII) zeigte, dass im letzteren Versuch VII deutlich niedrigere OD-Werte erreicht wurden und die produzierte Biomasse um 50 % geringer war. Die Glucoseaufnahmerate war hingegen um 1 mM/h höher als in Versuch VI. Neben der Glycerinbildung wurde in Versuch VII die Bildung von Acetat nachgewiesen. Acetat tritt als Nebenprodukt der Glycerinproduktion unter Sauerstoff-limitierten Bedingungen auf, das zur Ausbalancierung der Redoxbalance genutzt wird. Die Untersuchungen VI wurden in 250 ml-Kolben mit einem Mediumvolumen von 100 ml durchgeführt. Für die Untersuchung VII wurden die kleineren 100 ml-Kolben mit 25 ml Medium verwendet. Die kleinere Oberfläche der 100 ml-Kolben scheint einen geringeren Sauerstoffeintrag bewirkt zu haben, was zu der rascheren Ausbildung anaerober Bedingungen geführt haben könnte. Diese haben Gärungsprozesse ausgelöst, die sich in einem erhöhten Glucoseverbrauch bei gleichzeitiger Glycerin- und Acetatbildung widerspiegeln. Die ermittelten Daten konnten zur Berechnung von Parametern eines im Rahmen des Verbundprojektes „Dr. Jeykll & Mr. Hyde: Ein systembiologischer Ansatz zur Behandlung nosokomialer Infektionen durch Candida albicans“ aufgestellten metabolischen Modells (Insilico, Stuttgart) genutzt werden. Auf der Grundlage dieses Modells konnten für das Wachstum von C. albicans 117 essentielle Gene ermittelt werden. Aus patentrechtlichen Gründen können die Gennamen hier nicht aufgeführt werden. Zu den bereits bekannten essentiellen Genen gehörten das ErgosterolBiosynthese-Gen 1 ERG1 [166] und die 1,3-β-Glucansynthase 1 (GSC1) [167]. Durch die Herstellung von Mutanten mit induzierbarer Deletion dieser Gene [168] könnte ihre essentielle Funktion bestätigt werden. 4.2 Wirkung von LL-37 Die menschlichen Schleimhäute sind von einer artenreichen mikrobiellen Flora besiedelt. Diese bietet dem Wirt eine Schutzbarriere, beinhaltet aber nicht nur C. albicans als potentielles Pathogen. Daher ist es äußerst wichtig für den Wirt, das Wachstum der mikrobiellen Flora zu kontrollieren. In diesem Kontrollprozess wird den anti- 120 Diskussion mikrobiellen Peptiden eine entscheidende Rolle zugeordnet. Unter diesen Peptiden zeigen β-Defensin-2 (hBD-2), hBD-3 [169], Histatin-5 [170] und das Cathelicidin LL-37 [171] potente Eigenschaften gegen C. albicans. Sowohl bei der Infektion des oralen RHE-Modells [130] als auch in der Untersuchung infizierter A431-Monolayer [163] wurde eine Schutzwirkung durch Neutrophile und eine erhöhte Expression des antimikrobiellen Peptides LL-37 durch die Epithelzellen beobachtet. LL-37 wird in großen Mengen in Neutrophilen gespeichert und an Infektionsherden freigesetzt. Es wird aber auch von den Epithelzellen selbst produziert. In dieser Arbeit wurde die Wirkung dieses Peptides auf C. albicans und den Infektionsprozess untersucht. 4.2.1 Wirkung von LL-37 auf C. albicans Bei Kultivierung in Schüttelkolben konnte keine deutliche Wachstumshemmung durch LL-37 detektiert werden. Während die Daten der Bestimmung der optischen Dichte der Kultur eine schwache Inhibition erkennen ließen, wurde dies durch die Messung der produzierten Biomasse nicht bestätigt. In Mikrotiterplatten hingegen konnte eine Wachstumsinhibierung gezeigt werden. Das Maß der Wachstumsinhibierung und die konzentrationsabhängige Wirkung von LL-37 wurde jedoch stark vom verwendeten Medium beeinflusst. Bei dem reichhaltigen Medium YPD konnte eine Wachstumshemmung nur bei LL-37-Konzentrationen von 56 µg/ml nachgewiesen werden. Im YNB-Medium (pH 5,6) hingegen konnten sowohl bei 30◦ C als auch bei 37◦ C wachstumshemmende Wirkungen ab 2 µg/ml LL-37 detektiert werden. Im Medium RPMI-MOPS pH 7,4 trat eine LL-37-bedingte Wachstumsinhibierung erst ab Konzentrationen von 6 µg/ml auf. Dies ist konform mit Untersuchungen von Lopez et al.. Sie zeigten, dass die wachstumshemmende Wirkung von LL-37 vom pH-Wert der Umgebung abhängig ist und die MIC unter aziden Bedingungen kleiner ist als unter neutralen Bedingungen [126]. Die Ergebnisse erlauben außerdem die Feststellung, dass die toxische Wirkung von LL-37 umso höher ist, je limitierender die äußeren Bedingungen sind. Dies könnte sich dadurch erklären lassen, dass C. albicans unter guten Wachstumsbedingungen in der Lage ist, vorhandene membranassoziierte Reparaturmechanismen [131] zu aktivieren und somit die Zellmembran-zerstörenden Eigenschaften von LL-37 abzuwenden. Unter stark limitierenden Bedingungen ist dies wahrscheinlich nicht oder nur in einem deutlich geringerem Maße möglich. Der Vergleich des Einflusses der Temperatur auf das Wachstums in Mikrotiter- Diskussion 121 platten zeigte, dass bei 30◦ C eine sofortige Hemmung des Wachstums durch LL-37 erfolgte. Bei einer Umgebungstemperatur von 37◦ C hingegen begann das exponentielle Wachstum scheinbar unbeeinflusst von LL-37. Die LL-37-behandelten Kulturen gingen dann jedoch schneller in die stationäre Phase über. Es wurde gezeigt, dass LL-37 durch die Bindung an Zellwandkomponenten, insbesondere durch die Bindung an Polysaccharide, seine toxische Wirkung verliert. Gleichzeitig bewirkt diese Aufhebung der toxischen Wirkung eine Reduktion der primären Immunantwort [172]. Tsai et.al. konnten zeigen, dass LL-37 an Mannane, Chitine und Glucane von C. albicans bindet [127]. Somit ist C. albicans generell gut gegen einen Angriff durch LL-37 geschützt. Bei der Zellteilung werden entlang der Teilungsnaht zeitweise Membranbereiche freigelegt. Dies könnte einen einfachen und schnellen Angriff durch LL-37 ermöglichen. Da bei 37◦ C die gesamte Biomasseproduktion von C. albicans über die Ausbildung der Hyphen erfolgte und es zu keiner Zellteilung kam, kam es auch nicht zur Freilegung der fungischen Membran. Somit hatte LL-37 keine membranassoziierten Angriffspunkte. Anhand der metabolischen Daten, die von Kulturen in Schüttelkolben gewonnen wurden, lassen sich nur geringe Rückschlüsse auf den Einfluss von LL-37 auf den Metabolismus ziehen. Gezeigt werden konnte eine reduzierte Glucoseaufnahmerate bei Behandlung mit dem antimikrobiellen Peptid. Wie oben erwähnt lagen unter diesen Bedingungen vermutlich leicht anaerobe Verhältnisse vor und es kam nur zu einer schwachen wachstumshemmenden LL-37-Wirkung. Bedingt durch den Versuchsaufbau der Wachstumsuntersuchungen in Mikrotiterplatten ist es wahrscheinlich, dass aufgrund eines geringeren Sauerstoffeintrags in den Wells der Mikrotiterplatten Sauerstoff-limitierende Bedingungen vorherrschten. Eine Verstärkung der LL-37-Wirkung unter anaeroben Bedingungen kann vermutet werden. Metabolische Untersuchungen der Überstände in den Wells der Mikrotiterplatten würde dies klären. Die Hyphenbildung von C. albicans bei 37◦ C unter dem Einfluss von LL-37 wurde untersucht. Es zeigte sich eine signifikante Reduktion der Hyphenlänge bei LL-37Behandlung. Die Wachstumsuntersuchungen in Mikrotiterplatten bei einer Umgebungstemperatur von 37◦ C zeigten reduzierte OD-Werte bei Behandlung mit LL-37. Ein Grund hierfür könnte neben der reduzierten Anzahl an Candida-Zellen, die im CFU-Test gezeigt wurde, ebenso die LL-37-bedingte reduzierte Hyphenlänge gewesen sein. Wie oben beschrieben wird vermutet, dass in den Mikrotiterplatten ein geringerer Sauerstoffeintrag vorlag. Hypoxie ist ein Faktor, der Hyphenbildung auslöst [30]. Ist die Hyphenbildung durch LL-37-Zugabe geschwächt, tritt dieser Effekt 122 Diskussion unter Sauerstoff-limitierenden Bedingungen besonders stark auf, was die konzentrationsabhängig reduzierten Werte der OD-Messungen in Mikrotiterplatten unter LL-37-Zugabe erklären würde. Die Ganzgenomanalyse LL-37-behandelter C. albicans-Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kulturen zeigte, dass Gene, die die Aufnahme von Kohlenhydraten und den Kohlenstoffmetabolismus regulieren oder vermitteln unter LL-37Behandlung hochreguliert wurden. Die metabolischen Daten zeigten eine reduzierte Glucoseaufnahmerate. Dem scheint C. albicans durch die Genregulation entgegen zu wirken. Zudem wurden Gene wie SEC20 und WSC4, deren Produkte zellwand- und membranregulierende Funktionen ausüben, und Gene der allgemeinen Stressantwort in den Versuchen hochreguliert. Somit scheint C. albicans unter LL-37-Behandlung stressregulierte Signalwege und Reparaturmechanismen anzuschalten. Da die Zellwand aus Polysacchariden besteht, werden für Reparaturen Kohlenhydrate benötigt. Es zeigte sich unter LL-37-Behandlung eine 25 % geringere Glucoseaufnahmerate. Die Glucoseumwandlung in Biomasse erfolgte hingegen bei LL-37-Zugabe weniger effektiv. Sie war um 40 % reduziert. Die Diskrepanz zwischen diesen Werten könnte sich durch Zellwandreparaturprozesse, die mit einem erhöhtem Einbau von Zuckern verbunden wären, erklären lassen. In der Untersuchung waren unter den signifikant negativ regulierten Genen die Prozessgruppen des RNA-Metabolismus und der Ribosomenbiogenese überrepräsentiert. Gleiche Beobachtungen wurden von Park et al. bei der Untersuchung der transkriptionellen Antwort von C. albicans bei der Infektion oraler Epithelzellen FaDu gemacht [173]. Eine Herunterregulierung der Proteinsynthese konnte auch bei C. albicans nachgewiesen werden, die durch Makrophagen und Neutrophile phagozytiert worden waren. [15, 13]. Diese Antwort wird als eine stressinduzierte Reaktion gedeutet. Die zum RNA-Metabolismus zählenden regulierten Gene gehörten hauptsächlich zum ncRNA und rRNA-Metabolismus, also zu Genen, die für die Synthese von Ribosomen verantwortlich sind. Über die Anzahl der Ribosomen kann die Zelle die Wachstumsrate steuern. In Saccharomyces cerevisiae zählen diese Prozesse der negativen Regulation der Ribosomenbiogenese zur allgemeinen Stressabwehr [174, 175]. In C. albicans scheinen trotz deutlich erhöhter Resistenz gegenüber Stressbedingungen und spezifischeren Stressantworten [176] ähnliche Mechanismen vorzuliegen, denn 80 % der Stress-induzierten Gene in S. cerevisiae besitzen ein Ortholog in C. albicans [177]. Die Einstellung der Produktion von Ribosomen und die daraus resultierende Reduktion der Wachstumsrate könnte für die gestressten Zellen von Vorteil sein, da so die aus Nährstoffen gewonnene Energie besser in die Diskussion 123 Stressbeseitigung bzw. Schadensbekämpfung investiert werden kann. 4.2.2 Wirkung von LL-37 auf Epithelzellen Antimikrobielle Peptide werden zum Schutz des Wirtes vor eindringenden Pathogenen und zur Kontrolle des Wachstums der mikrobiellen Flora gebildet. Wegen der auf hydrophoben Wechselwirkungen beruhenden membranzerstörenden Wirkungsweise sind auch wirtseigene Zellen vom Angriff dieser Peptide bedroht. Zwar weisen sie durch ihre asymmetrische Struktur und die Einlagerung von Cholesterin einen gewissen Schutz auf [90, 95], jedoch wurde gezeigt, dass sowohl Defensine als auch LL-37 in hohen Konzentrationen Zelltod auslösen können [178]. Für Defensine konnte eine zellschädigende Wirkung an den humanen Zelllinien MRC-5 (fetale Lungenfibroblasten), A549 (Lungenadenokarzinom mit Alveolarepithel-ähnlichen Eigenschaften) und primären Kulturen humaner Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) gezeigt werden. Diese nach 10 - 12 Stunden detektierte zytotoxische Wirkung war konzentrationsabhängig und wurde durch die Zugabe von Serum inhibiert [159]. Auch für LL-37 wurde nach einer 12-stündigen Inkubation mit dem Peptid eine zytotoxische Aktivität sowie deren Inhibierung durch Serum beschrieben [160]. In dieser Arbeit wurde die zytotoxische Wirkung von LL-37 durch den CFSEund den Alamar-Blue-Test in serumhaltigem RPMI-Medium bestimmt. Nach einer Langzeitinkubation mit dem Peptid von 48 h zeigten sich keine toxischen Effekte, was auf das Vorhandensein des Serums zurückzuführen sein könnte. Die Bestimmung der zytotoxischen Wirkung von LL-37 unter serumhaltigen Bedingungen mit Hilfe der Lebend/Tot-Färbung zeigte nach einer zweistündigen Inkubation ähnliche Ergebnisse. In einer Lebend/Tot-Färbung unter serumfreien Bedingungen konnte bereits nach 30-minütiger Behandlung mit 15 µg/ml LL-37 eine erhöhte Anzahl toter Zellen detektiert werden. Nach einer 2-stündigen Inkubation mit dem Peptid lag eine signifikante Erhöhung der Anzahl toter Zellen vor. Eine Annexin/7AADFärbung zeigte, dass es sich hierbei um nekrotische Effekte handelte, was sich mit den Untersuchungen von Aarabiou et al. deckt [178]. Die toxischen Effekte sind demzufolge teilweise auf das nicht vorhandene Serum zurückzuführen. Im Wirt kommt es außerdem am Infektionsherd zu einem Zusammenspiel mehrerer Faktoren, die sich untereinander beeinflussen. So wurde für A549Zellen beschrieben, dass Defensine die Zelllyse induzieren. Die bei einer Infektion freigesetzten Serinproteinasen, wie Elastase und Cathepsin G, bewirken das Ablösen 124 Diskussion der Zellen. Werden die Zellen hingegen mit allen genannten Substanzen gleichzeitig inkubiert, werden die Ablösung der Zellen und die Defensin-vermittelte Zelllyse verhindert. Die antimikrobielle Wirkung des Defensins wird durch Elastase und Cathepsin G dagegen nicht unterdrückt [179]. Dieses Beispiel zeigt, dass die Ergebnisse von in vitro-Experimenten nur unter Vorbehalt Relevanz für in vivo-Situationen haben. Als weitere Wirkung von LL-37 konnte sowohl eine erhöhte Expression des IL8kodierenden Gens durch die Epithelzellen als auch eine erhöhte Sekretion des Proteins IL8 im Überstand LL-37-behandelter Epithelzellen nachgewiesen werden, was eine Funktion des AMPs ist [119]. Es wird postuliert, dass dieses Zytokin ebenfalls das Potential besitzt, antimikrobielle Eigenschaften auszuüben [85]. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine solche Wirkung aber nicht bestätigt werden. Diese Daten wurden nicht gezeigt. Die Untersuchung der Expression von membranständigen PRRs zeigte, dass unter LL-37-Behandlung die Rezeptoren Dectin-1 und TLR-2 sowie der Rezeptor CXCR4 vermehrt an der Zelloberfläche zu finden waren. Auf genetischer Ebene konnte dies verläßlich für das Dectin-1-kodierende Gen CLEC7A sowie für CXCR4 bestätigt werden. Die Heraufregulierung der Expression des TLR2-Gens war minimal. Der TLR4-Rezeptor hingegen zeigte eine verdoppelte Expressionsrate im Gegensatz zu der unbehandelten Kontrolle, was auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Eventuell liegt der TLR2-Rezeptor in einer Vorform gespeichert in der Zelle vor, was eine induzierte Expression bei einer Aktivierung der Zellen nicht notwendig machen würde. Die PRRs wurden im nicht aktivierten Zustand der Zellen nur in äußerst geringem Maße auf den Zellen vorgefunden. Dies erscheint sinnvoll, da Epithelzellen im Wirt ständig der Anwesenheit von Mikroorganismen ausgesetzt sind, was durch die Literatur belegt wird [54, 180, 173]. Würden die Zellen PRRs, wie z.B. TLR2 oder TLR4, konstitutiv in hoher Dichte exprimieren, läge eine permanente Aktivierung durch die kommensale Flora vor. Die Zellen könnten auf Veränderungen dieses Zustandes nicht effektiv reagieren. Ohne PRRs befinden sie sich jedoch in einer Art Ruhezustand, aus dem sie durch Faktoren wie z.B. Neutrophile oder (wie in dieser Arbeit gezeigt) durch die Anwesenheit des durch Neutrophile ausgeschütteten antimikrobiellen Peptides LL-37 aktiviert werden können. Dies führt zu einer Rekrutierung der PRRs an die Oberfläche, um so PAMPs auf der Oberfläche der Pathogene zu binden und eine Immunantwort auszulösen bzw. zu verstärken. Diskussion 4.2.3 125 Wirkung von LL-37 auf die Infektion Der erste Faktor für die Ausbildung manifester Infektionen ist die Adhärenz des Pathogens an Epithelien, die äußere physikalische Barriere des Wirts. Da Candida albicans im Laufe des Infektionsprozess mit dem antimikrobiellen Peptid LL-37 direkt in Kontakt kommt, wurde die Wirkung des Peptides auf den Adhärenzprozess untersucht. Während die Zahl adhärenter C. albicans an Plastikoberflächen durch LL-37-Behandlung reduziert war, zeigte sich an Epithelzellen eine drastische Verstärkung der Adhärenz. Dabei kam es nicht nur zu einer Bindung an LL-37-geschädigte Epithelzellen. Der Pilz adhärierte über den gesamten Zelllayer stärker. Des weiteren kam es zu einer Invasion der Epithelzellen. Diese Effekte waren nicht nur auf die Epithelzellen A431 beschränkt sondern konnten außerdem für Lungen- (A549) und Darmepithelzellen (CaCo2) gezeigt werden. Andere C. albicans-Stämme zeigten das gleiche Verhalten. Durch Tsai et al. [127] wurde gezeigt, dass LL-37 die Adhärenz von C. albicans sowohl an Plastikoberflächen als auch an humanen Zellen inhibiert. Diese Untersuchungen wurden jedoch nach einer Vorbehandlung von C. albicans bei einer Temperatur von 4◦ C durchgeführt. Dies entspricht keineswegs physiologischen Parametern und ist aus diesem Grunde mit den Daten dieser Arbeit nicht vergleichbar. Jones et al. konnten für Neisseria meningitidis ähnliche Phänomene zeigen. Während eine LL-37-Behandlung (10 µM ≈ 2,5 µg/ml) der Bakterien in Flüssigkultur und in adhärierter Form an Plastikoberflächen toxisch wirkte, wurden Bakterien, die an Epithelzellen (humane Rachenepithelzellen FaDu, ATCC HTB-43) gebunden vorlagen, nicht getötet [181]. Eine LL-37-Behandlung der Epithelzellen vor der Infektion mit N. meningitidis bewirkte eine starke Adhärenz der Bakterien an die Epithelzellen. Als wichtige Faktoren wurden hier die bakterielle Kapsel sowie ein bakterielles Endotoxin (LOS) beschrieben. Mutanten, die keine Kapsel ausbildeten, zeigten diese Resistenz gegenüber LL-37 nicht. Des weiteren erfolgte unter LL-37-Behandlung eine Hochregulierung der Kapselgene siaC und siaD. Die bakterielle Kapsel vermittelte einen Schutz vor den membranzerstörenden Eigenschaften des Peptides. Zudem erfuhren die Bakterien durch die Zellassoziation einen Schutz vor LL-37. Auch für Gruppe A Streptokokken werden Resistenzmechanismen beschrieben. So stimulieren sublethalen Konzentrationen von LL-37 die Expression der GAS-Kapselgene und Virulenzgene. Ebenso wurde die Produktion von kapsulären Polysacchariden hochreguliert [182]. Es ist nicht auszuschließen, dass in C. albicans ähnliche Effekte auftreten. Ein Großteil der in dieser Arbeit infolge der LL-37-Behandlung als signifikant re- 126 Diskussion guliert beschriebenen Gene ist bisher in seiner Funktion noch völlig unbekannt. Es ist durchaus möglich, dass darunter Gene sind, die eine zellwandaufbauende oder -verändernde Funktion ausüben. C. albicans bildet eine äußerst dichte Zellwand, die die mikrobielle Membran ebenso effektiv vor antimikrobiellen Peptiden schützt wie eine bakterielle Kapsel. Die verstärkte Adhärenz könnte durch mehrere Prozesse erklärt werden. Mögliche Hypothesen werden genannt: LL-37 könnte eine nicht letale Veränderung an der Zellwandstruktur von C. albicans auslösen, die eine bessere Erreichbarkeit der Glucane herbeiführt. Für Caspofungin-Behandlung konnte gezeigt werden, dass solche Effekte der Demaskierung in vitro und in vivo möglich sind [183, 184]. Glucane sind die Liganden des PRR Dectin-1. Durch die Bindung der Liganden werden Signaltransduktionswege zur weiteren Aktivierung der Immunabwehr angeschaltet [51]. Da unter anderem der Dectin-1-Rezeptor nach LL-37-Behandlung an der Oberfläche der Epithelzellen verstärkt vorzufinden war, kann vermutet werden, dass durch die gegebene verstärkte Rezeptor-Liganden-Interaktion gleichzeitig eine verstärkte Bindung zwischen Wirt und Pathogen eingegangen wird. Dectin-1 vermittelt außerdem die Phagozytose von C. albicans [185], was die beobachtete Internalisierung des Pathogens zu späteren Zeitpunkten der Infektion erklären könnte. Ein weiterer Rezeptor, der die Endozytose von C. albicans durch Epithelzellen vermittelt, ist E-Cadherin. Dieser Rezeptor interagiert mit dem mikrobiellen Protein Als3 [186]. In Rahmen der Untersuchungen dieser Arbeit konnten keine Aussagen über eine durch LL-37 beeinflusste Expression des Rezeptors getroffen werden. Es ist auszuschließen, dass der beobachtete Effekt der LL-37-vermittelten Verstärkung der Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen nur auf die zellschädigende Wirkung des AMPs zurückzuführen ist. Die Untersuchung der LL-37-vermittelten Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen unter serumhaltigen Bedingungen zeigte im Vergleich zu den Untersuchungen in serumfreiem Medium ähnliche Effekte. Außerdem konnte keine besondere Bindungsaffinität der Hefe zu toten Epithelzellen nachgewiesen werden. Dass eine Schädigung der humanen Zellen in vivo in gleichem Maße stattfindet, ist nicht anzunehmen. Wie bereits erwähnt, kann die Anwesenheit von Serum oder anderer sekretierter Proteine die zytotoxische Wirkung von LL-37 aufheben [160, 179]. Ebenso wäre es möglich, dass in den Zellen stabiler Zelllinien die Einlagerung von Cholesterin, das die Membran stabilisiert und ihre Ladung neutralisiert, nicht in gleichem Maße erfolgt, wie in primären Zellen. Dies würde eine erhöhte Selektivität der stabilen Zelllinien gegenüber kationischen Peptiden bewir- Diskussion 127 ken. Die Zerstörung wirtseigener Zellen kann aber auch ein natürlicher Prozess sein, den der Wirt „in Kauf nimmt“. Die effektive Bekämpfung potentieller Pathogene könnte diesen Verlust kompensieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass LL-37 eine starke Wirkung auf die Genexpression in C. albicans hat. Die Zuordnung der signifikant regulierten Gene zu zellulären Prozessen mit Hilfe des CGD Gene Ontology Slim Mappers wies den regulierten Genen IFF4 und PHO100 den Prozess der Pathogenese zu. Mutanten, die eine Deletion dieser Gene aufwiesen, wurden auf ihre Adhärenz an Epithelzellen unter dem Einfluss von LL-37 getestet. Ebenso wurden C. albicans-Stämme für diese Untersuchung eingesetzt, die eine Deletion der Gene HOG1 und EFG1 aufwiesen, weil einige der differentiell exprimierten Gene durch diese reguliert werden. Da eine LL-37-bedingte Hemmung des Hyphenwachstums detektiert wurde, erfolgte die Untersuchung des Adhärenzverhaltens der Mutanten ∆cdc35, ∆cek1 und ∆mkc1 unter LL-37-Zugabe. Diesen Stämmen fehlen Gene, die für die Regulation des filamentösen Wachstums wichtig sind. Szafranski-Schneider et al. konnten zeigen, dass die sekretierte extrazelluläre Komponente des Protein Msb2 eine wichtige Rolle in der Entgiftung des antimikrobiellen Peptides LL-37 spielt [132]. Um zu testen, ob dieses Protein die Ursache für die Resistenz von C. albicans im Adhärenzassay ist und eine Adhärenzerhöhung vermittelt, wurde die Deletionsmutante ∆msb2 ebenfalls eingesetzt. Es zeigte sich, dass Mutanten mit einer Deletion der Gene CDC35, CEK1 und MKC1 das gleiche LL-37-beeinflusste Adhärenzverhalten an Epithelzellen aufwiesen wie der Wildtyp-Stamm. Bei Deletion der Gene IFF4, PHO100 und MSB2 wurde hingegen keine oder nur eine sehr geringe Zunahme der Anzahl adhärenter C. albicans unter LL-37-Zugabe festgestellt. Gleiche Beobachtungen konnten für die Mutanten ∆efg1 und ∆hog1 gemacht werden. Da Iff4 als Adhäsin-ähnliches Zelloberflächenprotein beschrieben und eine Beteiligung an Adhärenzmechanismen [187] gezeigt wurde, fügt sich die beobachtete ausbleibende LL-37-vermittelte Adhärenzerhöhung der Deletionsmutante in das bekannte Funktionsprofil des Proteins. Da eine Hochregulierung des Gens IFF4 durch LL-37-Behandlung von C. albicans gezeigt werden konnte, ist diesem Protein eine entscheidende Rolle in der LL-37-vermittelten Adhärenzerhöhung zuzuschreiben. Msb2 zählt ebenfalls zu den Adhäsin-ähnlichen Proteinen und wird als Sensor für Zellwanddefekte beschrieben. Die Sekretion der extrazellulären Domäne nach Aktivierung des Proteins wird als wichtiger Faktor für eine Resistenz von C. albicans gegenüber LL-37 postuliert [132]. In den Genexpressionsdaten der vorliegenden Arbeit konnte keine Regulation des Gens MSB2 nachgewiesen werden. Als konstitutiv 128 Diskussion exprimiertes Sensorprotein könnte es aber in ausreichenden Mengen an der Zelloberfläche von C. albicans vorliegen, so dass eine Regulation zu den untersuchten, relativ frühen Infektionszeitpunkten nicht notwendig war. Die Deletion des Gens MSB2 bewirkte ein durch LL-37 nur schwach verändertes Adhärenzverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Das könnte auf die fehlende Schutzwirkung von Msb2 zurückzuführen sein, die eine verstärkte Tötung der Hefe durch LL-37 bewirkt. Somit wär die Anzahl vitaler ∆Msb2-Zellen reduziert und dementsprechend auch die Anzahl adhärenter Zellen. Die Expression anderer LL-37-regulierter, Adhärenz-vermittelnder Proteine erfolgte vermutlich im gleichen Maße wie im Wildtyp. Außerdem traten auf der Seite der Epithelzellen ebenfalls Veränderungen durch die LL-37-Behandlung auf, die eine verstärkte Bindung des Pathogens an die Wirtszellen bewirken können. Dies erklärt die trotz fehlendem Msb2 beobachtete schwache Erhöhung der Anzahl adhärenter C. albicans an die Epithelzellen. Pho100 ist eine putative periplasmatische, induzierbare Acidphosphatase, die in den Genexpressionsstudien durch LL-37-Behandlung in C. albicans herunterreguliert wurde. MacCallum et al. konnten zeigen, dass die Deletion des PHO100-Gens paradoxerweise eine Mutante erzeugt, die ein erhöhte Acidphosphatase-Aktivität aufweist und im Mausmodell eine leichte Schwächung in der Virulenz zeigt. Dies korrelierte mit der Untersuchung klinischer Isolate, die bei sehr schwacher Virulenz im Mausmodell gleichzeitig hohe Acidphosphatase-Level aufwiesen [188]. Im Adhärenzassay zeigte die Mutante ∆pho100 keine Erhöhung der Anzahl adhärenter C. albicans durch die Zugabe von LL-37, was mit den in den beschriebenen Ergebnissen von MacCallum et al. konform ist. Für die in den Expressionsdaten gezeigte negative Regulation des PHO100-Gens gibt es jedoch noch keine Erklärung. Es sind detailiertere Untersuchungen zur Regulation der Phosphatase-Aktivität notwendig, um diesen Effekt verstehen zu können. Der Transkriptionsfaktor (TF) Efg1 ist mit der Regulation einer großen Anzahl wichtiger Prozesse in C. albicans assoziiert. Hierzu zählen unter anderem das Hyphenwachstum, der Metabolismus, die Zellwandintegrität sowie Adhäsion und Virulenz. Aufgrund dieser zentralen Rolle ist es nicht verwunderlich, dass die Deletionsmutante ∆efg1 ein LL-37-beeinflusstes Adhärenzverhalten an Epithelzellen aufwies, das sich von dem des Wildtyps (Wt) unterschied. Während die Anzahl Wirtszellgebundener Wt-C. albicans durch LL-37-Zugabe um das fünffache stieg, trat für die Mutante nur eine Verdopplung auf. Dies könnte durch eine infolge des Fehlen des TF ausgelösten Dysfunktion der Regulation morphogenetischer Prozesse [189, 190] oder der Induktion und Regulation von Zellwand-Genen [191] verursacht sein. Des weite- Diskussion 129 ren wurde für Efg1 auch eine regulierende Funktion in der Bindung von C. albicans an humane Zellen beschrieben [35], die durch ein Fehlen des TF ebenfalls unterbunden wäre. Die letzte getestete Mutante ∆hog1 zeigte einen im Vergleich zum Wildtyp schwachen Anstieg von maximal 250 % (vergleiche Wt: 400 %) adhärenter C. albicans bei Zugabe von LL-37. Unter den bei LL-37-Behandlung differentiell exprimierten Hog1regulierten Genen traten der pre-ribosomale Faktor ECM1, die ATP-Sulfurylase MET3 sowie TYE7, ein in die Regulation der Glycolyse involvierter TF, auf. Alle diese Gene werden als Stress-assoziiert beschrieben. Hog1 ist eine MAP-Kinase, die mit der Antwort auf osmotischen-, Schwermetall- und Kernstress [192] assoziiert ist. Eine der Konsequenzen ist die Regulation des Glycerin-Metabolismus [193]. Außerdem ist Hog1 mit den Prozessen Morphologie und Virulenz assoziiert [194]. Ebenso wie für das Gen EFG1 bietet das breitgefächerte Funktionsspektrum viele Möglichkeiten für die Erklärung des beobachteten LL-37-beeinflussten Adhärenzverhaltens der Deletionsmutante. Aufgrund der Genexpressionsdaten ergeben sich eine Reihe weiterer interessanter Gene, wie z. B. HAP43, TYE7, MET3, ECM1 und QDR1, deren entsprechende Deletionsmutanten im Adhärenzassay untersucht werden könnten. Die Ergebnisse des LL-37-beeinflussten Adhärenzverhaltens der getesteten Mutanten zeigt aber bereits, dass nicht nur eine Komponente entscheidend für die durch LL-37 verstärkte Bindung von C. albicans an Epithelzellen ist. Vielmehr scheint das Zusammenspiel mehrerer Faktoren, die in C. albicans durch das AMP beeinflusst werden, entscheidend zu sein. 4.3 Fazit Um die medizinische Relevanz infektionsbiologischer Erkenntnisse zu beurteilen, sind in vivo-Untersuchungen unverzichtbar. Im Falle von C. albicans ist dies jedoch problematisch. Die Verwendung von Mausmodellen zur Aufklärung der Prozesse humaner Candida-Infektionen ist limitiert, da große physiologische Unterschiede zwischen humanen und murinen Epithelien bestehen. Zudem sind die häufig verwendeten C. albicans-Stämme, wie z.B. SC5314, nur schwache Kolonisierer von Mausepithelien [195]. Aus diesem Grund werden für die Untersuchungen Candida-spezifischer Infektionen hauptsächlich humane, epitheliale Zelllinien eingesetzt. Bei der Verwendung von stabilen Zelllinien, die meist aus Karzinomen etabliert wurden, ist jedoch stets zu bedenken, dass ihre Reaktionen nicht immer der in vivo-Situation entsprechen. 130 Diskussion Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren Zelllinien ist daher zwingend erforderlich. Aber auch diese Daten sollten mit Vorsicht interpretiert werden, da sie nicht immer die Antworten primärer Epithelzellen repräsentieren. Die Zellen weisen meist keinen polaren Phenotyp auf, wie es in Geweben der Fall ist, haben einen schwächeren Differenzierungsgrad und eine geringere Anzahl an Zell-Zell-Kontakten, die ihre Funktion und die Antwort auf externe Stimuli beeinflussen [64]. Eine Bestätigung der beobachteten Effekte mit primären Zelllinien würde eine bessere Übertragbarkeit in wirkliche Wirt-Pathogen-Interaktionen zulassen. In dieser Arbeit wurden die beobachteten Effekte an drei verschiedenen Zelllinien bestätigt, was zumindestens für in vitro-Versuche annehmen läßt, dass die durch LL37-verstärkte Adhärenz von C. albicans an Epithelzellen ein generell gültiger Effekt ist. Eine Bestätigung dieses Effektes an primären Epithelzellen wäre der nächste wichtige Schritt. Inwieweit dieser Effekt Relevanz für die Infektion des Menschen mit C. albicans hat, ist aus den oben genannten Gründen ungewiss. Im Körper werden im Falle einer Infektion weitaus mehr Faktoren in einer regulierten zeitlichen Abfolge ausgeschüttet, die teilweise synergistische, teilweise aber auch gegenseitig limitierende Funktionen ausüben. Die Betrachtung der hier sehr vereinfachten Interaktion zwischen Epithelzellen und C. albicans unter dem Einfluss von LL-37 spiegelt nur einen kleinen Ausschnitt der in vivo-Situation wider. Als Kommensale tritt C. albicans jedoch primär mit Eptihelzellen in Kontakt, was die ausschließliche Verwendung dieser Zellen in dieser Arbeit rechtfertigt. Eines der wichtigsten antimikrobiellen Peptide in der Haut ist LL-37. Dieses wird unter anderem konstitutiv durch Epithelzellen exprimiert. Im Falle einer Verletzung oder einer Infektion wird durch geschädigte Epithelzellen vermehrt LL-37 ausgeschüttet. Des weiteren sekretieren Neutrophile, die als erste Vertreter der weißen Blutkörperchen an den Ort der Verletzung bzw. zum Infektionsherd rekrutiert werden, große Mengen LL-37. Dieser Zelltyp ist außerdem einer der bedeutendsten in der Bekämpfung von C. albicans-Infektionen. Dies spricht dafür, dass die gewählten Versuchsbedingungen, wenn sie auch vereinfacht sind, aus infektionsbiologischer Sicht Relevanz haben. Die gezeigten Effekte, die das Cathelicidin LL-37 sowohl auf die Epithelzellen als auch auf Candida albicans ausübt und die Art und Weise, wie es den Infektionsprozess beeinflusst, geben die Möglichkeit, den Wechsel vom Kommensalen zum Pathogen durch C. albicans zu erklären. In gesunden Menschen ruft C. albicans aufgrund gut funktionierender Verteidigungsmechanismen, wie einer gut ausgebildeten Mikroflora, einer intakten physikalischen Hautbarriere und einer ausbalancierten chemischen Barriere durch AMPs, keine invasive Infektionen hervor. Gerät jedoch ei- Diskussion 131 nes dieser Verteidungssysteme aus dem Gleichgewicht, kann die schnell adaptierende Hefe dies zu ihrem Vorteil nutzen. So reicht bereits eine Reduzierung der mikrobiellen Flora (z.B. durch die Gabe von Breitbandantibiotika) aus, um eine oberflächliche Hautinfektion durch C. albicans auszulösen. Auch Verletzungen der Haut, wie z.B. durch Verbrennungen oder bereits vorliegende Entzündungen, verstärken die Wahrscheinlichkeit einer Ausbildung von C. albicans-Infektionen. Insbesondere diese Tatsache ließe sich durch die in dieser Arbeit beschriebenen Phänomene erklären. Denn gerade unter diesen Umständen erfolgt eine vermehrte Freisetzung des antimikrobiellen Peptides LL-37. Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, bewirkt dies im Wirt eine Aktivierung der Epithelzellen. Durch das AMP werden die Zellen in einen Alarmzustand versetzt und reagieren mit der Ausschüttung des neutrophilenchemotaktischen Zytokins IL8 und der verstärkten Expression von PRRs, die eine Bindung von Mikroorganismen vermitteln. Auf der Seite des Pathogens bewirkt LL-37 eine starke Änderung der Genexpression. C. albicans reagiert mit Stressabwehrmechanismen, reguliert aber gleichzeitig Adhäsine und andere Faktoren, die das Adhärenzverhalten an die Epithelzellen ändern. Für die weiterführendere Aufklärung des Einflusses des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf den Infektionsprozess wäre die Betrachtung späterer Infektionszeiten sinnvoll. Dies könnte Einblicke in den zeitlichen Verlauf der Expression der humanen PRRs und der Sekretion von IL8 liefern. Durch die von LL-37 auf der Seite des Wirts als auch auf der Seite des Pathogens ausgelösten Reaktionen, wird die verstärkte Adhärenz von C. albicans an die Epithelzellen bewirkt. Da die Adhärenz des Pathogens an das Wirtsepithelium der initiale Schritt in der Ausbildung manifester Infektionen ist, wären somit alle Voraussetzungen für eine Infektion mit C. albicans gegeben. Aufgrund der schnellen Anpassungsfähigkeit und des raschen Wachstums des Pilzes, wäre eine schnelle Verbreitung in tieferliegendes Gewebe möglich. Sollte der Wirt einen Defekt in der dritten und letzten Instanz der Abwehrmechanismen, dem adaptiven Immunsystem, aufweisen, drohen invasive Kandidosen. Diese Gefahr ist für Patienten mit supprimierten Immunsystem gegeben, wie z.B. AIDS-, und Transplantations-Patienten oder Patienten, die Chemotherapien erhalten. Die durch LL-37 verstärkte Adhärenz könnte des weiteren die bei den Autoimmunerkrankungen Rosaceae und Psoriases häufiger auftretenden Candida-Infektionen [196, 197] erklären. Als Ursache für diese Krankheiten wird ein erhöhtes Expressionslevel des antimikrobiellen Peptides LL-37 beschrieben. Die erhöhte Expression des Peptides würde nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit die Adhärenz 132 Diskussion von C. albicans an die Epithelien fördern, was das kombinierte Auftreten der Autoimmunerkrankung und C. albicans-Infektionen erklären würde. Diese Ergebnisse zeigen sehr deutlich, wie wichtig ein ausbalanciertes Immunsystem für die Gesundheit ist. Des weiteren wird deutlich, dass die Verwendung antimikrobieller Peptide in der Medizin zwar vielversprechende Aussichten hat aber ihre Wirkung genauestens analysiert werden muss, da auch sie zu unerwünschten Nebeneffekte führen können. Literaturverzeichnis [1] R. A. Calderone. Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, DC, 2002. [2] D. Wilson, S. Thewes, K. Zakikhany, C. Fradin, A. Albrecht, R. Almeida, S. Brunke, K. Grosse, R. Martin, F. Mayer, I. Leonhardt, L. Schild, K. Seider, M. Skibbe, S. Slesiona, B. Waechtler, I. Jacobsen, and B. Hube. Identifying infection-associated genes of candida albicans in the postgenomic era. FEMS Yeast Research, 9(5):688–700, 2009. [3] B.R. Braun, M. van het Hoog, C. d’Enfert, M. Martchenko, J. Dungan, A. Kuo, D.O. Inglis, M.A. Uhl, H. Hogues, M. Berriman, M. Lorenz, A. Levitin, U. Oberholzer, C. Bachewich, D. Harcus, A. Marcil, D. Dignard, T. Iouk, R. Zito, L. Frangeul, F. Tekaia, K. Rutherford, E. Wang, C.A. Munro, S. Bates, N.A. Gow, L.L. Hoyer, G. Köhler, J. Morschhäuser, G. Newport, S. Znaidi, M. Raymond, B. Turcotte, G. Sherlock, M. Costanzo, J. Ihmels, J. Berman, D. Sanglard, N. Agabian, A.P. Mitchell, A.D. Johnson, M. Whiteway, and A. Nantel. A human-curated annotation of the candida albicans genome. PLoS Genetics, 1(1):0036–0057, 2005. [4] M.A.S. Santos and M.F. Tuite. The cug codon is decoded in vivo as serine and not leucine in candida albicans. Nucleic Acids Research, 23(9):1481–1486, 1995. [5] M.G. Netea, G.D. Brown, B.J. Kullberg, and N.A.R. Gow. An integrated model of the recognition of candida albicans by the innate immune system. Nature Reviews Microbiology, 6(1):67–78, 2008. [6] F.C. Odds, C.E. Webster, P. Mayuranathan, and P.D. Simmons. Candida concentrations in the vagina and their association with signs and symptoms of vaginal candidosis. Journal of Medical and Veterinary Mycology, 26(5):277– 283, 1988. 133 134 Literaturverzeichnis [7] M.A. Pfaller. Nosocomial candidiasis: Emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases, 22(SUPPL. 2):S89–S94, 1996. [8] H. Wisplinghoff, T. Bischoff, S.M. Tallent, H. Seifert, R.P. Wenzel, and M.B. Edmond. Nosocomial bloodstream infections in us hospitals: Analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases, 39(3):309–317, 2004. [9] B. Hube. Infection-associated genes of candida albicans. Future microbiology, 1:209–218, 2006. [10] M.A. Ramírez and M.C. Lorenz. Mutations in alternative carbon utilization pathways in candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell, 6(2):280–290, 2007. [11] C.J. Barelle, C.L. Priest, D.M. MacCallum, N.A.R. Gow, F.C. Odds, and A.J.P. Brown. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology, 8(6):961–971, 2006. [12] M.C. Lorenz and G.R. Fink. The glyoxylate cycle is required for fungal virulence. Nature, 412(6842):83–86, 2001. [13] M.C. Lorenz, J.A. Bender, and G.R. Fink. Transcriptional response of candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell, 3(5):1076– 1087, 2004. [14] M.C. Lorenz and G.R. Fink. Life and death in a macrophage: Role of the glyoxylate cycle in virulence. Eukaryotic Cell, 1(5):657–662, 2002. [15] C. Fradin, P. De Groot, D. MacCallum, M. Schaller, F. Klis, F.C. Odds, and B. Hube. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of candida albicans in human blood. Molecular Microbiology, 56(2):397–415, 2005. [16] I. Rubin-Bejerano, I. Fraser, P. Grisafi, and G.R. Fink. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in saccharomyces cerevisiae and candida albicans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(19):11007–11012, 2003. Literaturverzeichnis 135 [17] C. Chen, K. Pande, S.D. French, B.B. Tuch, and S.M. Noble. An iron homeostasis regulatory circuit with reciprocal roles in candida albicans commensalism and pathogenesis. Cell Host and Microbe, 10(2):118–135, 2011. [18] Z. Weissman and D. Kornitzer. A family of candida cell surface haem-binding proteins involved in haemin and haemoglobin-iron utilization. Molecular Microbiology, 53(4):1209–1220, 2004. [19] D. Davis. Adaptation to environmental ph in candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics, 44(1):1–7, 2003. [20] K.J. Barwell, J.H. Boysen, W. Xu, and A.P. Mitchell. Relationship of dfg16 to the rim101p ph response pathway in saccharomyces cerevisiae and candida albicans. Eukaryotic Cell, 4(5):890–899, 2005. [21] A. Tillmann, N.A.R. Gow, and A.J.P. Brown. Nitric oxide and nitrosative stress tolerance in yeast. Biochemical Society Transactions, 39(1):219–223, 2011. [22] F.C. Odds and M.D. Jacobsen. Multilocus sequence typing of pathogenic candida species. Eukaryotic Cell, 7(7):1075–1084, 2008. [23] B. Slutsky, M. Staebell, and J. Anderson. ’white-opaque transition’: A second high-frequency switching system in candida albicans. Journal of Bacteriology, 169(1):189–197, 1987. [24] P. Kim, J.and Sudbery. Candida albicans, a major human fungal pathogen. Journal of Microbiology, 49(2):171–177, 2011. [25] J. Morschhäuser. Regulation of white-opaque switching in candida albicans. Medical Microbiology and Immunology, 199(3):165–172, 2010. [26] P. Sudbery, N. Gow, and J. Berman. The distinct morphogenic states of candida albicans. Trends in Microbiology, 12(7):317–324, 2004. [27] P. Staib and J. Morschhäuser. Chlamydospore formation in candida albicans and candida dubliniensis - an enigmatic developmental programme. Mycoses, 50(1):1–12, 2007. [28] J.F. Enrst. Transcription factors in candida albicans-environmental control of morphogenesis. Microbiology, 146(8):1763–1774, 2000. 136 Literaturverzeichnis [29] J.M. Hornby, E.C. Jensen, A.D. Lisec, J.J. Tasto, B. Jahnke, R. Shoemaker, P. Dussault, and K.W. Nickerson. Quorum sensing in the dimorphic fungus candida albicans is mediated by farnesol. Applied and Environmental Microbiology, 67(7):2982–2992, 2001. [30] P.E. Sudbery. Growth of candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology, 9(10):737–748, 2011. [31] R.A. Calderone and W.A. Fonzi. Virulence factors of candida albicans. Trends in Microbiology, 9(7):327–335, 2001. [32] B.R. Braun, D. Kadosh, and A.D. Johnson. Nrg1, a repressor of filamentous growth in c.albicans, is down-regulated during filament induction. EMBO Journal, 20(17):4753–4761, 2001. [33] L.L. Hoyer. The als gene family of candida albicans. Trends in Microbiology, 9(4):176–180, 2001. [34] J.F. Staab, S.D. Bradway, P.L. Fidel, and P. Sundstrom. Adhesive and mammalian transglutaminase substrate properties of candida albicans hwp1. Science, 283(5407):1535–1538, 1999. [35] F. Li and S.P. Palecek. Eap1, a candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryotic Cell, 2(6):1266–1273, 2003. [36] Y. Fu, G. Luo, B.J. Spellberg, Edwards Jr. J.E., and A.S. Ibrahim. Gene overexpression/suppression analysis of candidate virulence factors of candida albicans. Eukaryotic Cell, 7(3):483–492, 2008. [37] C.A. Gale, C.M. Bendel, M. McClellan, M. Hauser, J.M. Becker, J. Berman, and M.K. Hostetter. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in candida albicans to a single gene, int1. Science, 279(5355):1355–1358, 1998. [38] E.T. Buurman, C. Westwater, B. Hube, A.J.P. Brown, F.C. Odds, and N.A.R. Gow. Molecular analysis of camnt1p, a mannosyl transferase important for adhesion and virulence of candida albicans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(13):7670–7675, 1998. [39] M.A. Ghannoum. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews, 13(1):122–143, 2000. Literaturverzeichnis 137 [40] F. Staib. Serum-proteins as nitrogen source for yeastlike fungi. Sabouraudia Journal of Medical and Veterinary Mycology, 4(3):187–193, 1965. [41] M. Schaller, C. Borelli, H.C. Korting, and B. Hube. Hydrolytic enzymes as virulence factors of candida albicans. Mycoses, 48(6):365–377, 2005. [42] A.J.P. Brown, F.C. Odds, and N.A.R. Gow. Infection-related gene expression in candida albicans. Current Opinion in Microbiology, 10(4):307–313, 2007. [43] W. Zhu and S.G. Filler. Interactions of candida albicans with epithelial cells. Cellular Microbiology, 12(3):273–282, 2010. [44] F. Cottier and N. Pavelka. Complexity and dynamics of host-fungal interactions. Immunologic Research, pages 1–9, 2012. [45] L.J. Douglas. Adhesion of candida species to epithelial surfaces. Critical reviews in microbiology, 15(1):27–43, 1987. [46] J. Masuoka and K.C. Hazen. Cell wall protein mannosylation determines candida albicans cell surface hydrophobicity. Microbiology, 143(9):3015–3021, 1997. [47] B.W. Hazen and K.C. Hazen. Dynamic expression of cell surface hydrophobicity during initial yeast cell growth and before germ tube formation of candida albicans. Infection and Immunity, 56(9):2521–2525, 1988. [48] R. Medzhitov and C.A. Janeway Jr. Innate immunity: The virtues of a nonclonal system of recognition. Cell, 91(3):295–298, 1997. [49] O. Takeuchi and S. Akira. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell, 140(6):805–820, 2010. [50] S.-C. Cheng, L.A.B. Joosten, B.-J. Kullberg, and M.G. Netea. Interplay between candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity, 80(4):1304–1313, 2012. [51] N.A.R. Gow, F.L. Van De Veerdonk, A.J.P. Brown, and M.G. Netea. Candida albicans morphogenesis and host defence: Discriminating invasion from colonization. Nature Reviews Microbiology, 10(2):112–122, 2012. 138 Literaturverzeichnis [52] G.G. Gauglitz, H. Callenberg, G. Weindl, and H.C. Korting. Host defence against candida albicans and the role of pattern-recognition receptors. Acta Dermato-Venereologica, 92(3):291–298, 2012. [53] A. Miyazato, K. Nakamura, N. Yamamoto, H.M. Mora-Montes, M. Tanaka, Y. Abe, D. Tanno, K. Inden, X. Gang, K. Ishii, K. Takeda, S. Akira, S. Saijo, Y. Iwakura, Y. Adachi, N. Ohno, K. Mitsutake, N.A.R. Gow, M. Kaku, and K. Kawakami. Toll-like receptor 9-dependent activation of myeloid dendritic cells by deoxynucleic acids from candida albicans. Infection and Immunity, 77(7):3056–3064, 2009. [54] J.R. Naglik and D.L. Moyes. Mucosal immunity and candida albicans infection. Clinical and Developmental Immunology, 2011, 2011. [55] G.D. Brown, P.R. Taylor, D.M. Reid, J.A. Willment, D.L. Williams, L. Martinez-Pomares, S.Y.C. Wong, and S. Gordon. Dectin-1 is a ma- jor β-glucan receptor on macrophages. Journal of Experimental Medicine, 196(3):407–412, 2002. [56] S. Saijo, S. Ikeda, K. Yamabe, S. Kakuta, H. Ishigame, A. Akitsu, N. Fujikado, T. Kusaka, S. Kubo, S.-H. Chung, R. Komatsu, N. Miura, Y. Adachi, N. Ohno, K. Shibuya, N. Yamamoto, K. Kawakami, S. Yamasaki, T. Saito, S. Akira, and Y. Iwakura. Dectin-2 recognition of α-mannans and induction of th17 cell differentiation is essential for host defense against candida albicans. Immunity, 32(5):681–691, 2010. [57] M.G. Netea, N.A.R. Gow, C.A. Munro, S. Bates, C. Collins, G. Ferwerda, R.P. Hobson, G. Bertram, H.B. Hughes, T. Jansen, L. Jacobs, E.T. Buurman, K. Gijzen, D.L. Williams, R. Torensma, A. McKinnon, D.M. MacCallum, F.C. Odds, J.W.M. Van Der Meer, A.J.P. Brown, and B.J. Kullberg. Immune sensing of candida albicans requires cooperative recognition of mannans and glucans by lectin and toll-like receptors. Journal of Clinical Investigation, 116(6):1642–1650, 2006. [58] A. Cambi, M.G. Netea, H.M. Mora-Montes, N.A.R. Gow, S.V. Hato, D.W. Lowman, B.-J. Kullberg, R. Torensma, D.L. Williams, and C.G. Figdor. Dendritic cell interaction with candida albicans critically depends on n-linked mannan. Journal of Biological Chemistry, 283(29):20590–20599, 2008. Literaturverzeichnis 139 [59] T. Jouault, M. El Abed-El Behi, M. Martínez-Esparza, L. Breuilh, P.-A. Trinel, M. Chamaillard, F. Trottein, and D. Poulain. Specific recognition of candida albicans by macrophages requires galectin-3 to discriminate saccharomyces cerevisiae and needs association with tlr2 for signaling. Journal of Immunology, 177(7):4679–4687, 2006. [60] N. Brouwer, K.M. Dolman, M. Van Houdt, M. Sta, D. Roos, and T.W. Kuijpers. Mannose-binding lectin (mbl) facilitates opsonophagocytosis of yeasts but not of bacteria despite mbl binding. Journal of Immunology, 180(6):4124– 4132, 2008. [61] A. Bugarcic, K. Hitchens, A.G. Beckhouse, C.A. Wells, R.B. Ashman, and H. Blanchard. Human and mouse macrophage-inducible c-type lectin (mincle) bind candida albicans. Glycobiology, 18(9):679–685, 2008. [62] T.K. Means, E. Mylonakis, E. Tampakakis, R.A. Colvin, E. Seung, L. Puckett, M.F. Tai, C.R. Stewart, R. Pukkila-Worley, S.E. Hickman, K.J. Moore, S.B. Calderwood, N. Hacohen, A.D. Luster, and J.E. Khoury. Evolutionarily conserved recognition and innate immunity to fungal pathogens by the scavenger receptors scarf1 and cd36. Journal of Experimental Medicine, 206(3):637–653, 2009. [63] A.G. Hise, J. Tomalka, S. Ganesan, K. Patel, B.A. Hall, G.D. Brown, and K.A. Fitzgerald. An essential role for the nlrp3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen candida albicans. Cell Host and Microbe, 5(5):487–497, 2009. [64] A. Dongari-Bagtzoglou and P.L. Fidel Jr. The host cytokine responses and protective immunity in oropharyngeal candidiasis. Journal of Dental Research, 84(11):966–977, 2005. [65] C. Steele and P.L. Fidel Jr. Cytokine and chemokine production by human oral and vaginal epithelial cells in response to candida albicans. Infection and Immunity, 70(2):577–583, 2002. [66] M. Rouabhia, G. Ross, N. Pagé, and J. Chakir. Interleukin-18 and gamma interferon production by oral epithelial cells in response to exposure to candida albicans or lipopolysaccharide stimulation. Infection and Immunity, 70(12):7073–7080, 2002. 140 Literaturverzeichnis [67] M. Schaller, R. Mailhammer, G. Grassl, C.A. Sander, B. Hube, and H.C. Korting. Infection of human oral epithelia with candida species induces cytokine expression correlated to the degree of virulence. Journal of Investigative Dermatology, 118(4):652–657, 2002. [68] A. Dongari-Bagtzoglou and H. Kashleva. interleukin-8 secretion by oral epithelial cells. Candida albicans triggers Microbial Pathogenesis, 34(4):169–177, 2003. [69] C. Dieterich, M. Schandar, M. Noll, F.-J. Johannes, H. Brunner, T. Graeve, and S. Rupp. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of candida albicans efg1 and cph1 to adhesion and invasion. Microbiology, 148(2):497–506, 2002. [70] Y. Mostefaoui, C. Bart, M. Frenette, and M. Rouabhia. Candida albicans and streptococcus salivarius modulate il-6, il-8, and tnf-α expression and secretion by engineered human oral mucosa cells. Cellular Microbiology, 6(11):1085– 1096, 2004. [71] Y. Mostefaoui, I. Claveau, and M. Rouabhia. In vitro analyses of tissue structure and interleukin-1β expression and production by human oral mucosa in response to candida albicans infections. Cytokine, 25(4):162–171, 2004. [72] F. Tardif, J.-P. Goulet, A. Zakrazewski, P. Chauvin, and M. Rouabhia. Involvement of interleukin-18 in the inflammatory response against oropharyngeal candidiasis. Medical Science Monitor, 10(8):BR239–BR249, 2004. [73] M. Schaller, U. Boeld, S. Oberbauer, G. Hamm, B. Hube, and H.C. Korting. Polymorphonuclear leukocytes (pmns) induce protective th1-type cytokine epithelial responses in an in vitro model of oral candidosis. Microbiology, 150(9):2807–2813, 2004. [74] J.K. Kolls, P.B. McCray Jr., and Y.R. Chan. Cytokine-mediated regulation of antimicrobial proteins. Nature Reviews Immunology, 8(11):829–835, 2008. [75] J.W. Van ’t Wout, I. Linde, P.C.J. Leijh, and R. Van Furth. Contribution of granulocytes and monocytes to resistance against experimental disseminated candida albicans infection. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 7(6):736–741, 1988. Literaturverzeichnis 141 [76] A. Cambi, K. Gijzen, I.J.M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G.J. Adema, M.G. Netea, B.-J. Kullberg, L. Romani, and C.G. Figdor. The c-type lectin dc-sign (cd209) is an antigen-uptake receptor for candida albicans on dendritic cells. European Journal of Immunology, 33(2):532–538, 2003. [77] Y. Aratani, H. Koyama, S.-I. Nyui, K. Suzuki, F. Kura, and N. Maeda. Severe impairment in early host defense against candida albicans in mice deficient in myeloperoxidase. Infection and Immunity, 67(4):1828–1836, 1999. [78] H.-J. Lo, J.R. Köhler, B. Didomenico, D. Loebenberg, A. Cacciapuoti, and G.R. Fink. Nonfilamentous c. albicans mutants are avirulent. Cell, 90(5):939– 949, 1997. [79] A.M.A. Murad, P. Leng, M. Straffon, J. Wishart, S. Macaskill, D. MacCallum, N. Schnell, D. Talibi, D. Marechal, F. Tekaia, C. D’Enfert, C. Gaillardin, F.C. Odds, and A.J.P. Brown. Nrg1 represses yeast-hypha morphogenesis and hypha-specific gene expression in candida albicans. EMBO Journal, 20(17):4742–4752, 2001. [80] Q. Lu, J.A.M.S. Jayatilake, L.P. Samaranayake, and L. Jin. Hyphal invasion of candida albicans inhibits the expression of human β-defensins in experimental oral candidiasis. Journal of Investigative Dermatology, 126(9):2049–2056, 2006. [81] Q.T. Phan, C.L. Myers, Y. Fu, D.C. Sheppard, M.R. Yeaman, W.H. Welch, A.S. Ibrahim, J.E. Edwards Jr., and S.G. Filler. Als3 is a candida albicans invasin that binds to cadherins and induces endocytosis by host cells. PLoS biology, 5(3), 2007. [82] G. Weindl, J.R. Naglik, S. Kaesler, T. Biedermann, B. Hube, H.C. Korting, and M. Schaller. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through tlr4-mediated signaling. Journal of Clinical Investigation, 117(12):3664–3672, 2007. [83] S.-C. Cheng, F. Van De Veerdonk, S. Smeekens, L.A.B. Joosten, J.W.M. Van Der Meer, B.-J. Kullberg, and M.G. Netea. Candida albicans dampens host defense by downregulating il-17 production. Journal of Immunology, 185(4):2450–2457, 2010. 142 Literaturverzeichnis [84] T. Nakatsuji and R.L. Gallo. Antimicrobial peptides: Old molecules with new ideas. Journal of Investigative Dermatology, 132(3 PART 2):887–895, 2012. [85] J. Wiesner and A. Vilcinskas. Antimicrobial peptides: The ancient arm of the human immune system. Virulence, 1(5):440–464, 2010. [86] H.I. Zeya and J.K. Spitznagel. Antibacterial and enzymic basic proteins from leukocyte lysosomes: Separation and identification. Science, 142(3595):1085– 1087, 1963. [87] H.I. Zeya and J.K. Spitznagel. Antimicrobial specificity of leukocyte lysosomal cationic proteins. Science, 154(3752):1049–1051, 1966. [88] R.E.W. Hancock and M.G. Scott. The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(16):8856–8861, 2000. [89] Y. Lai and R.L. Gallo. Amped up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends in Immunology, 30(3):131–141, 2009. [90] M. Pasupuleti, A. Schmidtchen, and M. Malmsten. Antimicrobial peptides: Key components of the innate immune system. Critical Reviews in Biotechnology, 32(2):143–171, 2012. [91] H.G. Boman. Antibacterial peptides: Basic facts and emerging concepts. Journal of Internal Medicine, 254(3):197–215, 2003. [92] N.Y. Yount and M.R. Yeaman. Immunocontinuum: Perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action and resistance. Protein and Peptide Letters, 12(1):49–67, 2005. [93] G. Ehrenstein and H. Lecar. Electrically gated ionic channels in lipid bilayers. Quarterly Reviews of Biophysics, 10(1):1–34, 1977. [94] M.R. Yeaman and N.Y. Yount. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacological Reviews, 55(1):27–55, 2003. [95] S.A. Okorochenkov, G.A. Zheltukhina, and V.E. Nebol’sin. Antimicrobial peptides: The mode of action and perspectives of practical application. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 5(2):95–102, 2011. Literaturverzeichnis 143 [96] F. Veas and G. Dubois. Il-22 induces an acute-phase response associated to a cohort of acute phase proteins and antimicrobial peptides as players of homeostasis. In Acute Phase Proteins - Regulation and Functions of Acute Phase Proteins. InTech, 2011. [97] A.S. Bayer, R. Prasad, J. Chandra, A. Koul, M. Smriti, A. Varma, R.A. Skurray, N. Firth, M.H. Brown, S.U.-P. Koo, and M.R. Yeaman. In vitro resistance of staphylococcus aureus to thrombin-induced platelet microbicidal protein is associated with alterations in cytoplasmic membrane fluidity. Infection and Immunity, 68(6):3548–3553, 2000. [98] A. Peschel, R.W. Jack, M. Otto, L.V. Collins, P. Staubitz, G. Nicholson, H. Kalbacher, W.F. Nieuwenhuizen, G. Jung, A. Tarkowski, K.P.M. Van Kessel, and J.A.G. Van Strijp. Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor mprf is based on modification of membrane lipids with l-lysine. Journal of Experimental Medicine, 193(9):1067–1076, 2001. [99] C. Gyurko, U. Lendenmann, R.F. Troxler, and F.G. Oppenheim. Candida albicans mutants deficient in respiration are resistant to the small cationic salivary antimicrobial peptide histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 44(2):348–354, 2000. [100] C. Friedrich, M.G. Scott, N. Karunaratne, H. Yan, and R.E.W. Hancock. Saltresistant alpha-helical cationic antimicrobial peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43(7):1542–1548, 1999. [101] A.M. Lippa and M. Goulian. Feedback inhibition in the phoq/phop signaling system by a membrane peptide. PLoS Genetics, 5(12), 2009. [102] M. Li, Y. Lai, A.E. Villaruz, D.J. Cha, D.E. Sturdevant, and M. Otto. Gram-positive three-component antimicrobial peptide-sensing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(22):9469–9474, 2007. [103] J.S. Gunn and S.I. Miller. Phop-phoq activates transcription of pmrab, encoding a two-component regulatory system involved in salmonella typhimurium antimicrobial peptide resistance. Journal of Bacteriology, 178(23):6857–6864, 1996. 144 Literaturverzeichnis [104] T. Guina, E.C. Yi, H. Wang, M. Hackett, and S.I. Miller. A phop-regulated outer membrane protease of salmonella enterica serovar typhimurium promotes resistance to alpha-helical antimicrobial peptides. Journal of Bacteriology, 182(14):4077–4086, 2000. [105] K. Sugimura and T. Nishihara. Purification, characterization, and primary structure of escherichia coli protease vii with specificity for paired basic residues: Identity of protease vii and ompt. Journal of Bacteriology, 170(12):5625– 5632, 1988. [106] A. Schmidtchen, I.-M. Frick, E. Andersson, H. Tapper, and L. Björck. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide ll-37. Molecular Microbiology, 46(1):157–168, 2002. [107] W.M. Shafer, X.-D. Qu, A.J. Waring, and R.I. Lehrer. Modulation of neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(4):1829–1833, 1998. [108] J.A. Bengoechea and M. Skurnik. Temperature-regulated efflux pump/potassium antiporter system mediates resistance to cationic antimicrobial peptides in yersinia. Molecular Microbiology, 37(1):67–80, 2000. [109] W.C. Wimley and K. Hristova. Antimicrobial peptides: Successes, challenges and unanswered questions. Journal of Membrane Biology, pages 1–8, 2011. [110] L.L. Jha, D. Shah, and K.S. Rajesh. Human defensin peptides with antimicrobial properties: An overview. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 13(1):82–87, 2012. [111] K. Yamasaki, J. Schauber, A. Coda, H. Lin, R.A. Dorschner, N.M. Schechter, C. Bonnart, P. Descargues, A. Hovnanian, and R.L. Gallo. Kallikrein-mediated proteolysis regulates the antimicrobial effects of cathelicidins in skin. FASEB Journal, 20(12):2068–2080, 2006. [112] M. Zanetti. The role of cathelicidins in the innate host defenses of mammals. Current Issues in Molecular Biology, 7(2):179–196, 2005. Literaturverzeichnis 145 [113] M. Zaiou, V. Nizet, and R.L. Gallo. Antimicrobial and protease inhibitory functions of the human cathelicidin (hcap18/ll-37) prosequence. Journal of Investigative Dermatology, 120(5):810–816, 2003. [114] M. Reinholz, T. Ruzicka, and J. Schauber. Cathelicidin ll-37: An antimicrobial peptide with a role in inflammatory skin disease. Annals of Dermatology, 24(2):126–135, 2012. [115] J. Overhage, A. Campisano, M. Bains, E.C.W. Torfs, B.H.A. Rehm, and R.E.W. Hancock. Human host defense peptide ll-37 prevents bacterial biofilm formation. Infection and Immunity, 76(9):4176–4182, 2008. [116] G. Weber, J.D. Heilborn, C.I.C. Jimenez, A. Hammarsjö, H. Törmä, and M. Ståhle. Vitamin d induces the antimicrobial protein hcap18 in human skin [5]. Journal of Investigative Dermatology, 124(5):1080–1082, 2005. [117] O.E. Sorensen, J.B. Cowland, K. Theilgaard-Mönch, L. Liu, T. Ganz, and N. Borregaard. Wound healing and expression of antimicrobial pepti- des/polypeptides in human keratinocytes, a consequence of common growth factors. Journal of Immunology, 170(11):5583–5589, 2003. [118] K.A. Henzler Wildman, D.-K. Lee, and A. Ramamoorthy. Mechanism of lipid bilayer disruption by the human antimicrobial peptide, ll-37. Biochemistry, 42(21):6545–6558, 2003. [119] M.G. Scott, D.J. Davidson, M.R. Gold, D. Bowdish, and R.E.W. Hancock. The human antimicrobial peptide ll-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses. Journal of Immunology, 169(7):3883–3891, 2002. [120] R. Bucki, K. Leszczyńska, A. Namiot, and W. Sokołowski. Cathelicidin ll37: A multitask antimicrobial peptide. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 58(1):15–25, 2010. [121] B. Rivas-Santiago, R. Hernandez-Pando, C. Carranza, E. Juarez, J.L. Contreras, D. Aguilar-Leon, M. Torres, and E. Sada. Expression of cathelicidin ll-37 during mycobacterium tuberculosis infection in human alveolar macrophages, monocytes, neutrophils, and epithelial cells. Infection and Immunity, 76(3):935–941, 2008. 146 Literaturverzeichnis [122] L. Tomasinsig, C. Pizzirani, B. Skerlavaj, P. Pellegatti, S. Gulinelli, A. Tossi, F. Di Virgilio, and M. Zanetti. The human cathelicidin ll-37 modulates the activities of the p2x 7 receptor in a structure-dependent manner. Journal of Biological Chemistry, 283(45):30471–30481, 2008. [123] A. Di Nardo, M.H. Braff, K.R. Taylor, C. Na, R.D. Granstein, J.E. McInturff, S. Krutzik, R.L. Modlin, and R.L. Gallo. Cathelicidin antimicrobial peptides block dendritic cell tlr4 activation and allergic contact sensitization. Journal of Immunology, 178(3):1829–1834, 2007. [124] E.M. Molhoek, A.L. Den Hertog, A.-M.B.C. De Vries, K. Nazmi, E.C.I. Veerman, F.C. Hartgers, M. Yazdanbakhsh, F.J. Bikker, and D. Van Der Kleij. Structure-function relationship of the human antimicrobial peptide ll-37 and ll-37 fragments in the modulation of tlr responses. Biological Chemistry, 390(4):295–303, 2009. [125] D.M.E. Bowdish, D.J. Davidson, and R.E.W. Hancock. Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins. Current Topics in Microbiology and Immunology, 306:27–66, 2006. [126] B. López-García, P.H.A. Lee, K. Yamasaki, and R.L. Gallo. Anti-fungal activity of cathelicidins and their potential role in candida albicans skin infection. Journal of Investigative Dermatology, 125(1):108–115, 2005. [127] P.-W. Tsai, C.-Y. Yang, H.-T. Chang, and C.-Y. Lan. Human antimicrobial peptide ll-37 inhibits adhesion of candida albicans by interacting with yeast cell-wall carbohydrates. PLoS ONE, 6(3), 2011. [128] A.L. Den Hertog, J. Van Marle, H.A. Van Veen, W. Van’t Hof, J.G.M. Bolscher, E.C.I. Veerman, and A.V. Nieuw Amerongen. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: Histatin 5 causes small membrane defects, but ll-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal, 388(2):689–695, 2005. [129] P.-W. Tsai, C.-Y. Yang, H.-T. Chang, and C.-Y. Lan. Characterizing the role of cell-wall β-1,3-exoglucanase xog1p in candida albicans adhesion by the human antimicrobial peptide ll-37. PLoS ONE, 6(6), 2011. Literaturverzeichnis 147 [130] G. Weindl, J. Wagener, and M. Schaller. Interaction of the mucosal barrier with accessory immune cells during fungal infection. International Journal of Medical Microbiology, 301(5):431–435, 2011. [131] J.F. Ernst and J. Pla. Signaling the glycoshield: Maintenance of the candida albicans cell wall. International Journal of Medical Microbiology, 301(5):378– 383, 2011. [132] E. Szafranski-Schneider, M. Swidergall, F. Cottier, D. Tielker, E. Román, J. Pla, and J.F. Ernst. Msb2 shedding protects candida albicans against antimicrobial peptides. PLoS Pathogens, 8(2), 2012. [133] M. Murakami, B. Lopez-Garcia, M. Braff, R.A. Dorschner, and R.L. Gallo. Postsecretory processing generates multiple cathelicidins for enhanced topical antimicrobial defense. Journal of Immunology, 172(5):3070–3077, 2004. [134] K.-Y. Choi, L.N.Y. Chow, and N. Mookherjee. Cationic host defence peptides: Multifaceted role in immune modulation and inflammation. Journal of Innate Immunity, 4(4):361–370, 2012. [135] A. Cederlund, G.H. Gudmundsson, and B. Agerberth. Antimicrobial peptides important in innate immunity. FEBS Journal, 278(20):3942–3951, 2011. [136] L. Mallbris, L. Carlén, T. Wei, J. Heilborn, M.F. Nilsson, F. Granath, and M. Ståhle. Injury downregulates the expression of the human cathelicidin protein hcap18/ll-37 in atopic dermatitis. Experimental Dermatology, 19(5):442– 449, 2010. [137] J.-M. Jensen, K. Ahrens, J. Meingassner, A. Scherer, M. Bräutigam, A. Stütz, T. Schwarz, R. Fölster-Holst, J. Harder, R. Gläser, and E. Proksch. Differential suppression of epidermal antimicrobial protein expression in atopic dermatitis and in efad mice by pimecrolimus compared to corticosteroids. Experimental Dermatology, 20(10):783–788, 2011. [138] K. Yamasaki, A. Di Nardo, A. Bardan, M. Murakami, T. Ohtake, A. Coda, R.A. Dorschner, C. Bonnart, P. Descargues, A. Hovnanian, V.B. Morhenn, and R.L. Gallo. Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. Nature Medicine, 13(8):975–980, 2007. 148 Literaturverzeichnis [139] E.J. Hollox, U. Huffmeier, P.L.J.M. Zeeuwen, R. Palla, J. Lascorz, D. RodijkOlthuis, P.C.M. Van De Kerkhof, H. Traupe, G. De Jongh, M.D. Heijer, A. Reis, J.A.L. Armour, and J. Schalkwijk. Psoriasis is associated with increased β-defensin genomic copy number. Nature Genetics, 40(1):23–25, 2008. [140] R. Lande, J. Gregorio, V. Facchinetti, B. Chatterjee, Y.-H. Wang, B. Homey, W. Cao, Y.-H. Wang, B. Su, F.O. Nestle, T. Zal, I. Mellman, J.-M. Schröder, Y.-J. Liu, and M. Gilliet. Plasmacytoid dendritic cells sense self-dna coupled with antimicrobial peptide. Nature, 449(7162):564–569, 2007. [141] Y. Dombrowski, M. Peric, S. Koglin, C. Kammerbauer, C. Göß, D. Anz, M. Simanski, R. Gläser, J. Harder, V. Hornung, R.L. Gallo, T. Ruzicka, R. Besch, and J. Schauber. Cytosolic dna triggers inflammasome activation in keratinocytes in psoriatic lesions. Science Translational Medicine, 3(82), 2011. [142] L.S. Wilson, C.M. Reyes, M. Stolpman, J. Speckman, K. Allen, and J. Beney. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health, 5(1):26–34, 2002. [143] A.M. Gillum, E.Y.H. Tsay, and D.R. Kirsch. Isolation of the candida albicans gene for orotidine-5’-phosphate decarboxylase by complementation of s.cerevisiae ura3 and e. coli pyrf mutations. Molecular and General Genetics, 198(1):179–182, 1984. [144] C.J. Nobile and A.P. Mitchell. Large-scale gene disruption using the uau1 cassette. Methods in Molecular Biology, 499:175–194, 2009. [145] C.R.C. Rocha, K. Schröppel, D. Harcus, A. Marcil, D. Dignard, B.N. Taylor, D.Y. Thomas, M. Whiteway, and E. Leberer. Signaling through adenylyl cyclase is essential for hyphal growth and virulence in the pathogenic fungus candida albicans. Molecular Biology of the Cell, 12(11):3631–3643, 2001. [146] C. Csank, K. Schröppel, E. Leberer, D. Harcus, O. Mohamed, S. Meloche, D.Y. Thomas, and M. Whiteway. Roles of the candida aibicans mitogenactivated protein kinase homolog, cek1p, in hyphal development and systemic candidiasis. Infection and Immunity, 66(6):2713–2721, 1998. [147] O.R. Homann, J. Dea, S.M. Noble, and A.D. Johnson. A phenotypic profile of the candida albicans regulatory network. PLoS Genetics, 5(12), 2009. Literaturverzeichnis 149 [148] C.S. José, R.A. Monge, R. Pérez-Díaz, J. Pla, and C. Nombela. The mitogenactivated protein kinase homolog hog1 gene controls glycerol accumulation in the pathogenic fungus candida albicans. Journal of Bacteriology, 178(19):5850–5852, 1996. [149] S.M. Noble, S. French, L.A. Kohn, V. Chen, and A.D. Johnson. Systematic screens of a candida albicans homozygous deletion library decouple morphogenetic switching and pathogenicity. Nature Genetics, 42(7):590–598, 2010. [150] D.J. Giard, S.A. Aaronson, and G.J. Todaro. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of the National Cancer Institute, 51(5):1417–1423, 1973. [151] L. Smetanová, V. Stětinová, Z. Svoboda, and J. Kvetina. Caco-2 cells, biopharmaceutics classification system (bcs) and biowaiver. Acta medica (Hradec Králové) / Universitas Carolina, Facultas Medica Hradec Králové, 54(1):3–8, 2011. [152] I.J. Hidalgo, T.J. Raub, and R.T. Borchardt. Characterization of the human colon carcinoma cell line (caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology, 96(3):736–749, 1989. [153] M. Pinto, S. Robine Leon, and M.D. Appay. Enterocyte-like differentiation and polarization of the human colon carcinoma cell line caco-2 in culture. Biology of the Cell, 47(3):323–330, 1983. [154] C.R. Parish. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunology and Cell Biology, 77(6):499–508, 1999. [155] M.J. Kim, S. Pal, Y.K. Tak, K.-H. Lee, T.K. Yang, S.-J. Lee, and J.M. Song. Determination of the dose-depth distribution of proton beam using resazurin assay in vitro and diode laser-induced fluorescence detection. Analytica Chimica Acta, 593(2):214–223, 2007. [156] R.S. Twigg. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature, 155(3935):401– 402, 1945. [157] X.-H. Fu, F.-L. Meng, Y. Hu, and J.-Q. Zhou. Candida albicans, a distinctive fungal model for cellular aging study. Aging Cell, 7(5):746–757, 2008. 150 Literaturverzeichnis [158] 2011 Buschart, A. Wirkstoffsuche in Candida albicans: Etablierung neuer Screenings und Untersuchung der Wirkung antimykotischer Substanzen. PhD thesis, Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, 2011. [159] D.G. Okrent, A.K. Lichtenstein, and T. Ganz. Direct cytotoxicity of polymorphonuclear leukocyte granule proteins to human lung-derived cells and endothelial cells. American Review of Respiratory Disease, 141(1):179–185, 1990. [160] J. Johansson, G.H. Gudmundsson, M.E. Rottenberg, K.D. Berndt, and B. Agerberth. Conformation-dependent antibacterial activity of the naturally occurring human peptide ll-37. Journal of Biological Chemistry, 273(6):3718– 3724, 1998. [161] Q.T. Phan, R.A. Fratti, N.V. Prasadarao, J.E. Edwards Jr., and S.G. Filler. Ncadherin mediates endocytosis of candida albicans by endothelial cells. Journal of Biological Chemistry, 280(11):10455–10461, 2005. [162] E. Moreno-Ruiz, M. Galán-Díez, W. Zhu, E. Fernández-Ruiz, C. D’Enfert, S.G. Filler, P. Cossart, and E. Veiga. Candida albicans internalization by host cells is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Cellular Microbiology, 11(8):1179–1189, 2009. [163] K. Gremmer. Dr. Jekyll und Mr. Hyde – Molekulare Antworten von humanen vaginalen Epithelzellen auf eine Infektion mit Candida albicans. PhD thesis, Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, 2012. [164] R. Costenoble, H. Valadi, L. Gustafsson, C. Niklasson, and C.J. Franzén. Microaerobic glycerol formation in saccharomyces cerevisiae. Yeast, 16(16):1483– 1495, 2000. [165] R.E. Syverson. Variable assimilation of carbon compounds by candida albicans. Journal of Clinical Microbiology, 13(1):163–166, 1981. [166] R. Pasrija, S. Krishnamurthy, T. Prasad, J.F. Ernst, and R. Prasad. Squalene epoxidase encoded by erg1 affects morphogenesis and drug susceptibilities of candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 55(6):905–913, 2005. Literaturverzeichnis 151 [167] C.M. Douglas, J.A. D’Ippolito, G.J. Shei, M. Meinz, J. Onishi, J.A. Marrinan, W. Li, G.K. Abruzzo, A. Flattery, K. Bartizal, A. Mitchell, and M.B. Kurtz. Identification of the fks1 gene of candida albicans as the essential target of 1,3-β-d-glucan synthase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 41(11):2471–2479, 1997. [168] S. Michel, S. Ushinsky, B. Klebl, E. Leberer, D. Thomas, M. Whiteway, and J. Morschhäuser. Generation of conditional lethal candida albicans mutants by inducible deletion of essential genes. Molecular Microbiology, 46(1):269–280, 2002. [169] J.J. Schneider, A. Unholzer, M. Schaller, M. Schäfer-Korting, and H.C. Korting. Human defensins. Journal of Molecular Medicine, 83(8):587–595, 2005. [170] J. Turner, Y. Cho, N.-N. Dinh, A.J. Waring, and R.I. Lehrer. Activities of ll-37, a cathelin-associated antimicrobial peptide of human neutrophils. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42(9):2206–2214, 1998. [171] F.G. Oppenheim, T. Xu, F.M. McMillian, S.M. Levitz, R.D. Diamond, G.D. Offner, and R.F. Troxler. Histatins, a novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion. isolation, characterization, primary structure, and fungistatic effects on candida albicans. Journal of Biological Chemistry, 263(16):7472–7477, 1988. [172] M. Foschiatti, P. Cescutti, A. Tossi, and R. Rizzo. Inhibition of cathelicidin activity by bacterial exopolysaccharides. Molecular Microbiology, 72(5):1137– 1146, 2009. [173] H. Park, Y. Liu, N. Solis, J. Spotkov, J. Hamaker, J.R. Blankenship, M.R. Yeaman, A.P. Mitchell, H. Liu, and S.G. Filler. Transcriptional responses of candida albicans to epithelial and endothelial cells. Eukaryotic Cell, 8(10):1498– 1510, 2009. [174] S.M. O’Rourke and I. Herskowitz. Unique and redundant roles for hog mapk pathway components as revealed by whole-genome expression analysis. Molecular Biology of the Cell, 15(2):532–542, 2004. [175] A.P. Gasch, P.T. Spellman, C.M. Kao, O. Carmel-Harel, M.B. Eisen, G. Storz, D. Botstein, and P.O. Brown. Genomic expression programs in the respon- 152 Literaturverzeichnis se of yeast cells to environmental changes. Molecular Biology of the Cell, 11(12):4241–4257, 2000. [176] B. Enjalbert, D.A. Smith, M.J. Cornell, I. Alam, S. Nicholls, A.J.P. Brown, and J. Quinn. Role of the hog1 stress-activated protein kinase in the global transcriptional response to stress in the fungal pathogen candida albicans. Molecular Biology of the Cell, 17(2):1018–1032, 2006. [177] B. Enjalbert, A. Nantel, and M. Whiteway. Stress-induced gene expression in candida albicans: Absence of a general stress response. Molecular Biology of the Cell, 14(4):1460–1467, 2003. [178] J. Aarbiou, G.S. Tjabringa, R.M. Verhoosel, D.K. Ninaber, S.R. White, L.T.C. Peltenburg, K.F. Rabe, and P.S. Hiemstra. Mechanisms of cell death induced by the neutrophil antimicrobial peptides α-defensins and ll-37. Inflammation Research, 55(3):119–127, 2006. [179] S. Van Wetering, S.P.G. Mannesse-Lazeroms, J.H. Dijkman, and P.S. Hiemstra. Effect of neutrophil serine proteinases and defensins on lung epithelial cells: Modulation of cytotoxicity and il-8 production. Journal of Leukocyte Biology, 62(2):217–226, 1997. [180] F. Bäckhed and M. Hornef. Toll-like receptor 4-mediated signaling by epithelial surfaces: Necessity or threat? Microbes and Infection, 5(11):951–959, 2003. [181] A. Jones, M. Geörg, L. Maudsdotter, and A.-B. Jonsson. Endotoxin, capsule, and bacterial attachment contribute to neisseria meningitidis resistance to the human antimicrobial peptide ll-37. Journal of Bacteriology, 191(12):3861– 3868, 2009. [182] I. Gryllos, H.J. Tran-Winkler, M.-F. Cheng, H. Chung, R. Bolcome III, W. Lu, R.I. Lehrer, and M.R. Wessels. Induction of group a streptococcus virulence by a human antimicrobial peptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(43):16755–16760, 2008. [183] R.T. Wheeler and G.R. Fink. A drug-sensitive genetic network masks fungi from the immune system. PLoS Pathogens, 2(4):328–339, 2006. [184] R.T. Wheeler, D. Kombe, S.D. Agarwala, and G.R. Fink. Dynamic, morphotype-specific candida albicans β-glucan exposure during infection and drug treatment. PLoS Pathogens, 4(12), 2008. Literaturverzeichnis 153 [185] V. Maneu, A. Yáñez, C. Murciano, A. Molina, M.L. Gil, and D. Gozalbo. Dectin-1 mediates in vitro phagocytosis of candida albicans yeast cells by retinal microglia. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 63(1):148– 150, 2011. [186] B. Wächtler, F. Citiulo, N. Jablonowski, S. Förster, F. Dalle, M. Schaller, D. Wilson, and B. Hube. Candida albicans-epithelial interactions: Dissecting the roles of active penetration, induced endocytosis and host factors on the infection process. PLoS ONE, 7(5), 2012. [187] M. Kempf, V. Apaire-Marchais, P. Saulnier, P. Licznar, C. Lefrançois, R. Robert, and J. Cottin. Disruption of candida albicans iff4 gene involves modifications of the cell electrical surface properties. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 58(2):250–255, 2007. [188] D.M. MacCallum, L. Castillo, K. Nather, C.A. Munro, A.J.P. Brown, N.A.R. Gow, and F.C. Odds. Property differences among the four major candida albicans strain clades. Eukaryotic Cell, 8(3):373–387, 2009. [189] V.R. Stoldt, A. Sonneborn, C.E. Leuker, and J.F. Ernst. Efg1p, an essential regulator of morphogenesis of the human pathogen candida albicans, is a member of a conserved class of bhlh proteins regulating morphogenetic processes in fungi. EMBO Journal, 16(8):1982–1991, 1997. [190] D.P. Bockmüh and J.F. Ernst. A potential phosphorylation site for an a-type kinase in the efgl regulator protein contributes to hyphal morphogenesis of candida albicans. Genetics, 157(4):1523–1530, 2001. [191] K. Sohn, C. Urban, H. Brunner, and S. Rupp. Efg1 is a major regulator of cell wall dynamics in candida albicans as revealed by dna microarrays. Molecular Microbiology, 47(1):89–102, 2003. [192] D.A. Smith, S. Nicholls, B.A. Morgan, A.J.P. Brown, and J. Quinn. A conserved stress-activated protein kinase regulates a core stress response in the human pathogen candida albicans. Molecular Biology of the Cell, 15(9):4179– 4190, 2004. [193] G. Kayingo and B. Wong. The map kinase hog 1p differentially regulates stress-induced production and accumulation of glycerol and d-arabitol in candida albicans. Microbiology, 151(9):2987–2999, 2005. [194] R. Alonso-Monge, F. Navarro-García, G. Molero, R. Diez-Orejas, M. Gustin, J. Pla, M. Sánchez, and C. Nombela. Role of the mitogen-activated protein kinase hog1p in morphogenesis and virulence of candida albicans. Journal of Bacteriology, 181(10):3058–3068, 1999. [195] R. Martin, B. Wächtler, M. Schaller, D. Wilson, and B. Hube. Host-pathogen interactions and virulence-associated genes during candida albicans oral infections. International Journal of Medical Microbiology, 301(5):417–422, 2011. [196] H.L. Ee, H.H. Tan, S.K. Ng, and M. Ee. Autosomal dominant familial chronic mucocutaneous candidiasis associated with acne rosacea. Annals of the Academy of Medicine Singapore, 34(9):571–574, 2005. [197] A. Waldman, A. Gilhar, L. Duek, and I. Berdicevsky. Incidence of candida in psoriasis - a study on the fungal flora of psoriatic patients. Mycoses, 44(34):77–81, 2001. Anhang A Abkürzungsverzeichnis % Prozent ◦ Grad Celsius C µ mikro-, 10-6 µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer µM Mikromol 7AAD 7-Aminoactinomycin D AA Aminosäure (engl. amino acid) Abb. Abbildung AIDS erworbenes Immundefektsyndrom (engl. acquired immunodeficiency syndrome) Als engl. agglutin-like sequence AMP antimikrobielles Peptid arg Arginin ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat B Bor BISA Biologische Systemanalyse BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung bzw. beziehungsweise C Cystidin C Kohlenstoff C. albicans Candida albicans 155 C. glabrata Candida glabrata C. parapsilosis Candida parapsilosis C. tropicalis Candida tropicalis Ca Calcium ca. circa cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat (engl. cyclic adenosine monophosphate) CBIO Chemische Biologie cDNA komplementäre DNA (engl. complementary DNA) CFDA-SE Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester CFSE Carboxyfluorescein-Succinimidyl Ester CFU engl. colony forming units Cl Chlor CLR 2 C-Typ Lectin Rezeptor cm Quadratzentimeter CO2 Kohlenstoffdioxid Cp Schwellenwert (engl. crossing point) cRNA komplementäre RNA (engl. complementary RNA) C-terminal in der Nähe des Carboxylendes des Proteins CWP Zellwandprotein (engl. cell wall protein) DAD Diodenarraydetektor DC Dentritische Zellen, (engl. dendritic cell) DC-SIGN DC-specific (ICAM)-3-grabbing non-integrin DHA engl. drug proton antiporter DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. desoxyribonucleic acid) DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay engl. englisch ER Endosomatisches Retikulum ERK1/2 engl. extracellular signal-regulated kinase et al. und andere (lat. et alii) EthD1 Ethidium Homodimer-1 FACS Fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie (engl. fluorescenceactivated cell sorting) F-Aktin filamentöses Aktin FBP1 Fructose-1,6-bisphosphatase FBS Fötales Kälberserum (engl. fetal bovine serum) FC Faktor der Genexpressionsveränderung (engl. fold change) Fe Eisen FGSC Fungal Genetic Stock Center FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC engl. forward scatter g Gramm G Guanosin, Glycin Glu Glucose GO engl. Gene Ontology GPI-Anker Glykosylphosphatidylinositol-Anker G-Protein GTP-bindendes Protein h Stunden (engl. Hour) H Histidin, Wasserstoff HBD humanes β-Defensin HD humanes Defensin HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure his Histidin HIV humaner Immundefizienz-Virus HNP engl. human neutrophil protein HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography) Hwp engl. hyphal wall protein HZI Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung ICAM engl. intercellular adhesion molecule ICL1 Isocitratlyase ID Identifikationsschlüssel IFN Interferon IGB Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IL Interleukin k kilo, 103 K Kalium, Lysin Kap Kapitel KCl Kaliumchlorid kDa kilo Dalton kg kilo Gramm KH2 PO4 Kaliumhydrogenphosphat l Liter L Leucin lfc engl. log fold change LM Lösungsmittel log Logarithmus log2 Logarithmus zur Basis 2 LPS Lipopolysaccharid LRR Leucin-reiche Repeats LTE Lipidexporter (engl. lipid translocating exporter) m Meter, milli- 10-3 M Mol pro Liter MAPK mitogenaktivierte Proteinkinase MAP-Kinase mitogenaktivierte Proteinkinase (engl. mitogen-activated protein kinase) Mbp Millionen Basenpaare MCP-1 engl. monocyte chemotactic protein-1 MDH1 Malatdehydrogenase MIC minimale inhibierende Konzentration min Minute ml Milliliter MLS1 Malatsynthase mm Millimeter mm2 Quadratmillimeter mm3 Kubikmillimeter MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure MR Mannoserezeptor mRNA Boten-RNA (engl. messenger RNA) MTL engl. Mating Type Like MW Mittelwert N Stickstoff n Nano-, 10-9 Na Natrium Na2 HPO4 Natriumdihydrogenphosphat NaCl Natriumchlorid NAD+ oxidiertes Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid NADH reduziertes Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid ncRNA engl. non-coding RNA nd nicht detektiert NF-κB nuklearer Faktor κB NLR NOD-like Rezeptoren nm Nanometer NOD Nucleotide Oligomerization Domain Receptors N-terminal in der Nähe des Aminoendes des Proteins O Sauerstoff OD optische Dichte OPA O-Phthalaldehyd OPT Oligopeptid-Transporter ORF offenes Leseraster (engl. open reading frame) P Phosphor P. aeroginosa Pseudomonas aeroginosa PAMP engl. pathogen-associated molecular patterns PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (engl. phosphate buffered saline) PCA engl. principle component analysis PCK1 Phosphoenolpyruvatkinase PCR Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction) pDC plasmazytoide dendritische Zellen PEP Phosphoenolpyruvat pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration (lat. pondus hydrogenii) PMN polymorphnukleare Leukozyten pmol Picomol PRR engl. pattern recognition receptor PS Phosphatidylserin R Arginin RHE rekonstruiertes humanes Epithelium RI Brechungindex (engl. refractive index) RIG engl. retinoic acid-inducible gene RLR RIG-I-like Rezeptoren RNA Ribonukleinsäure (engl. ribonucleic acid) ROS reaktive Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species) rpm Umdrehungen pro Minute (engl. revolutions per minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium rRNA ribosomale RNA RT Raumtemperatur RT-PCR Echtzeit-PCR (engl. real-time) S Serin S. aureus Staphylococcus aureus S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae S. epidermidis Staphylococcus epidermidis SAP sekretierte Aspartatprotease sec Sekunde SHA Salicylhydroxamsäure (engl. salicylhydroxamic acid) spp. lat. species pluralis SSC engl. sidewards scatter s. u. siehe unten Tab. Tabelle TE Tris-EDTA TF Transkriptionsfaktoren TH T-Helferzelle TIR Toll-/Interleukin-1(IL-1)-Rezeptor TLR Toll-like-Rezeptor TM Trockenmasse TNF Tumornekrosefaktor U Uridin untr unbehandelt (engl. untreated) USA Vereinigte Staaten von Amerika v. Ch. vor Christus xg x fache Erdschwerebeschleunigung: 9,81 m/s2 YNB Minimalmedium (engl. yeast nitrogen base) YPD engl. yeast extract, peptone, dextrose medium z. B. zum Beispiel Anhang B verwendete Geräte Bezeichnung Typ, Hersteller Brucheisautomat Ziegra Brutschränke CO2 -Auto-Zero, Heraeus HeraCell 150i, Thermo Scientific Bunsenbrenner Fireboy, Heraeus Dampfsterilisatoren Belimed Infection Control Sauter 464 Zirbus HST 4-5-6 Durchflusszytometer Canto, BD Bioscience Calibur, BD Bioscience HPLC LC 1200 Serie, Agilent HPLC-Detektoren Brechungsindexdetektor RID-10A, Shi- madzu HPLC-Säulen Rezex RoA-Organic Acid H+ (8 %) S-Säule und SecurityGuard-Vorsäule, Phenomenex Zorbax Eclipse C18plus-Säule und Vorsäule, Agilent Technologies RID-10A, Shimadzu Hybridisierungskammer Hybridization Chamber Kit, Agilent Technologies Hybridisierungsofen G2545A, Agilent Technologies Kapillarelektrophorese (RNA) G 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies Kolbenschüttler Multitron, Infors-HT 161 Kryo-Einfriergerät Freezing Container, Thermo Scientific Magnetrührer MR 2002, Heidolph Microarrayscanner G2565A, Agilent Technologies Mikroskope CKX41/U-RFLT50, Olympus Biozero BZ-8100, Keyence Axioplan, Zeiss Mikroskopkamera ColorView SIS FireWire Camera 3.0 Mikrotiterplattenabsorptionsleser µQuant, BioTek Mikrotiterplattenschüttler Titramax 1000, Heidolph Comfort 5355R, Eppendorf Mikrotiterplattenwascher Elx50, BioTek Multikanalpipetten R Transferpette -12 electronic: 0,5-10, 5-100, 15-300 µl, Brand R Transferpette -8 electronic: 1 - 20 µl; 5 - 100 µl, Brand R Transferpette S -8 10-100 µl Research Mehrkanal 10-100 µl, Eppendorf Pipetten Research 0,5 - 10 µl, Eppendorf Research 2- 20 µl, Eppendorf Research 20- 200 µl, Eppendorf Research 100- 1000 µl, Eppendorf Pipettierhilfen R Easypet , Eppendorf CellMate Matrix, Thermo Scientific real-time PCR System R Light Cycler 480, Roche Rotoren Ausschwingrotor A-4-44, Eppendorf Festwinkelrotor F-34-6-38, Eppendorf F45-30-11 Eppendorf Ausschwingrotor 1154, Hettich E1547, Hettich Ausschwingrotor JS-5.3, BeckmanCoulter Schütteltisch Innova 2100, New Brunswick Scientific Spektralphotometer NanoDrop1000, Peqlab Sterilwerkbänke HeraSafe KS 12, Thermo Scientific MaxiSafe 2020, Thermo Scientific HLB 2448, Heraeus Thermocycler Personal Cycler, Biometra T3, Biometra Thermmixer 5437, Eppendorf Thermostat 5320, Eppendorf Vakuumpumpe XF54 230 50, Millipore Vortexer Vortex Genie 2, Scientific Industries IKA Works Vortexer Waagen PC4400, Mettler Sartorius excellence Sartorius research Wärmeschrank Memmert UK 400 Wasseraufreinigung Reinstwassersystem Milli-Q Academic A10, Millipore Wasserbäder Schüttelwasserbad 3047, Köttermann Wbn 14, Memmert Zählkammer Neubauer improved, Assistent Germany Zentrifugen 5804R, Eppendorf 5402 Eppendorf 5415 Eppendorf R Avanti , J-E. Beckman Coulter Biofuge fresco, Heraeus Mikro 22R, Hettich R Sprout Minizentrifuge, Kleinfeld Labor- technik Anhang C Verbrauchsmaterialien Bezeichnung Typ, Hersteller 4-Kompartiment-Schalen Cellview glas bottom dish 627870, Greiner BioOne Abdeckfolien für ELISA-Platten 900110, HJ-Bioanalytik Abdeckmatten für HPLC 96-Well-Platten 5042-1389, Agilent Technologies Combitips 12,5 ml 1 = 0,25 ml, Eppendorf Deckgläschen 20 x 26 mm für Neubauer improved Zählkammer, Menzel Einwegpipetten Costar Stripette 5 ml 4487, 10 ml 4488, 25 ml 4489, Corning Filterspitzen R TipOne S1121-3810 10 µl, Starlab R TipOne S1120-1810 20 µl, Starlab R TipOne Pipette Filter Tips 1-100 µl S1120-1840, Starlab R TipOne S1126-7810 1000 µl, Starlab R TipOne RPT Tips, 0,1-10 µl S1181-3810, Starlab Glasgefäße für HPLC-Proben 5182-0716, Agilent Technologies zugehörige Deckel 5182-0717, Agilent Technologies Glasperlen für Zellaufschluß 425–600 µm G8772, Sigma Kryoröhrchen R Nalgene CyrowareTM 5000-0020, Nalgene Nunc Int. Lösungsmittelfilter RC60 Membrane Circles (regenerierte Zellulose) 2602255100, Whatman Multiwellplatten 6-Well-Platten 657160, Greiner Bio-One 164 24-Well-Platten 662160, Greiner Bio-One 96-Well-Platten für ELISA high-bindig 675061, Greiner Bio-One 96-Well-Platten 353916, BD Falcon CytoOne 96-Well Plate CC7682-7596, Starlab 96-Well-Platten volumenreduziert 3697, Corning 96-Well-Platten für HPLC 5042-1385, Agilent Technologies 384-Well-Platten 3701, Corning PCR Gefäße 8er Streifen mit Deckel 781320 und 781340, Brand 0,2 ml 781330, Brand Pasteurpipetten aus Glas 747720, Brand Petrischalen Polystyrol, 94 x 16 mm rund 5408047, Omnilab Pipettenspitzen epT.I.P.S. Standard 2 - 200 µl 0030000.870, Eppendorf epT.I.P.S. Standard 50 - 1000 µl 0030000.919, Eppendorf R TipOne S1111-3000 10 µl R TipOne S1111-0006 200 µl R TipOne S1111-2021 1000 µl QIAShredder Zellaufschlusssäulen 79654, Qiagen Reaktionsgefäße Safe-Lock Tubes 0,5 ml 0030 121.023, Eppendorf Safe-Lock Tubes 0,5 ml PCR clean 0030 123.301, Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 ml 0030 120.086, Eppendorf Safe-Lock Tubes 2 ml 0030 120.094, Eppendorf Spritzen Einmalspritzen Omnifix, Luer Lock, 2 ml 3201218, Fisher Scientific Spritzenfilter für HPLC-Proben 0,2 µm AFO320352, Phenomenex Sterilfilter Minisart 0,2 µm 17573, Sartorius Bottletop 500 ml Filter 0,2 µm 595-4520, Nalgene Zellkulturflaschen 25 cm2 CE48.1, Roth 75 cm2 430641, Corning 175 cm2 660175, Greiner Bio-One Zellschaber 23 cm 179693, Nalge Nunc Zentrifugenröhrchen 15 ml 430829 , 50 ml 430791 und 430897, Corning Anhang D Chemikalien Bezeichnung Bestellnummer, Hersteller 7AAD 559925, BD PharmingenTM 10 mM dNTP mix 18427013, Invitrogen α-Ketoglutarat 127205, Böhringer γ-Amino-n-Butansäure A2129, Sigma Acetonitril für die HPLC HZI Lager Äpfelsäure 800384, Merck AlamarBlue R Aminosüre-Standard 1nmol/µl 5061-3330, Agilent Technologies Ammoniumformiat 09739, Fluka Ammoniumsulfat A3920, Sigma Annexin 560931, BD PharmingenTM L-Arginin 13940, Serva Bacto Agar 40017, HZI-Lager Bersteinsäure 820151, Merck Bindungspuffer, 10x 556454, BD PharmingenTM Boratpuffer 5061-3339, Agilent Technologies Borax B9876, Sigma Brenztraubensäure 6619, Merck Calcofluor-White 18909, Sigma CFSE 21888, Sigma Dimethylsulfoxid (cell culture grade) EMR385250, Biozol di-Natriumhydrogenphosphat P030.1, Roth Ethanol (pro analysi) HZI Lager Ethanol (vergällt) HZI Lager 167 Ethylendiamintetraacetat 27270, Riedel-de Haën FBS DE14-801F, Lonza Formalin 10 % HT501128, Sigma Fumarsäure F4633, Sigma Glucose(D+) Monohydrat 221293, Riedel-de Haën Glycerin 87 % (pro analysi) HZI Lager HEPES H3375, Sigma L-Histidin 1697.1, Roth Isocitrat 12116, Merck Kaliumchlorid 4936, Merck Kaliumhydrogenphosphat 4873, Merck Kaliumhydroxid 6751, Roth R LightCycler 480 SYBR Green I Master 4887352001, Roche LL-37 Peptid H-6224.0001, Bachem Holding AG L-Prolin A3453, AppliChem myo-Inositol I5125, Sigma Methanol (pro analysi) HZI Lager 2-Mercaptoethanol M6250, Sigma MOPS BK/00004004/000500, Geyer Natriumacetat 67732, Roth Natriumazid K305.1, Roth Natriumchlorid 3957.2, Roth Natriumcitrat 6448, Merck Natriumformiat 6443, Merck Natriumlactat 71718, Sigma OPA-Reagenz 5061-3335, Agilent Technologies Phosphorsäure 30417, Riedel-de Haën R ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI p-36931, Invitrogen R RNase AWAY 83931, Sigma RNase free DNase Set 605157, Qiagen RPMI with L-Glutamine BE12-702F, Lonza Schwefelsäure 95 - 97 % 4623.4, Roth Superscript II 18064-014, Invitrogen Trypsin-Versene BE17-161E, Lonza R 20 Tween 9127.1, Roth Wasser Nuklease-frei AM9938, Ambion YPD-Broth Y1375, Sigma YNB w/o Aminoacids Y0626, Sigma Anhang E Inhaltsverzeichnis des digitalen Anhangs Dieser Arbeit liegen folgende Dateien bei: Ordner S_ 01 Rohdaten der C. albicans-Mikroarrays Ordner S_ 02 R-Skript zur Erstellung von Listen mit logarithmischen Fold Changes, statistischen Werten und Annotation der Gene (Skript S_ Scr_ 01) verwendete Annotationsdatei vom 15. Juli 2012 (Tabelle S_ Tab_ 04) Zuordnung der Datensets (Tabelle S_ Tab_ 03) Tabelle S_ Tab_ 01 Metadaten der C. albicans-Mikroarrays im GEOFormat Tabelle S_ Tab_ 02 Normalisierte Daten der C. albicans-Mikroarrays Tabelle S_ Tab_ 05 Genexpression von C. albicans nach LL-37- Behandlung im Vergleich zur unbehandelten Probe bei Betrachtung der Datensets 1-3 Tabelle S_ Tab_ 06 signifikant regulierte Gene bei Betrachtung der Datensets 1-3 und p-Wert < 0,05 Tabelle S_ Tab_ 07 Genexpression von C. albicans nach LL-37- Behandlung im Vergleich zur unbehandelten Probe bei Betrachtung der Datensets 2 und 3 Tabelle S_ Tab_ 08 signifikant regulierte Gene bei Betrachtung der Datensets 2 und 3 und p-Wert < 0,05 Abbildung S_ Abb_ 01 Abbildung 3.23 der Dissertation 170 Danksagungen Diese Arbeit würde in dieser Form nicht vorliegen, wenn ich nicht durch viele Menschen unterstützt worden wäre. An dieser Stelle möchte ich Freunden und Kollegen dafür danken. Mein erster und besonderer Dank geht an meine Mentorin Prof. Dr. Ursula Bilitewski. Ich danke ihr für die Möglichkeit an diesem interessanten Projekt mitarbeiten zu dürfen und für ihr Vertrauen, dass sie stets in mich gesetzt hat. Ihre Unterstützung und Anregungen sowie ihr kritisches Hinterfragen von Ergebnissen haben die Arbeit positiv beeinflußt. Ich danke Prof. Dr. Michael Steinert für die freundliche Übernahme des Koreferats und die damit verbundenen Mühen. Des weiteren möchte ich den Mitgliedern meines Thesis-Kommittees danken. André Fleissner begleitete mich in dieser Funktion über den gesamten Zeitraum meiner Forschungsarbeit und lieferte mit seinen Fragen und Betrachtungsweisen aus einem ganz anderen Forschungsblickwinkel immer neue Anregungen. Gleichzeitig bedanke ich mich bei ihm, für die Bereitschaft, den Prüfungsvorsitz zu übernehmen. Marcus Gereke sprang netterweise ab dem zweiten Treffen als Mitglied in mein ThesisKommittee ein und unterstütze mich mit vielen Ideen und Vorschlägen. Ich danke der HZI Graduate School für die finanzielle Unterstützung von Dienstreisen und Tagungsbesuchen. Ein großer Dank geht an die Gruppe MWIS um Wolfgang Kessler, insbesondere an Axel Schulz und Andrew Perreth, die mich in die Techniken und Tücken der HPLC einwiesen. Danke, dass ich mit allen großen und kleinen Problemen jederzeit zu euch kommen konnte und ihr mit guter Laune und vielen kleinen Schrauben und Schläuchen weitergeholfen habt (vielleicht fahren wir ja doch noch irgendwann nach Stockholm, Axel....) Des weiteren möchte ich den Damen der „Array-Facility“, Sabrina Kaser und Petra Hagendorff, danken, die mir bei der Herstellung der Arrays mit Rat und Tat beiseite standen. Ebenso möchte ich mich bei meinen jetzigen und allen ehemaligen Kollegen der 171 gesamten Arbeitsgruppe BISA bedanken. Bei Fragen und Problemem war immer einer da, der gerne weitergeholfen hat. Ohne die ein oder andere Diskussion am Mittagstisch wäre die Lösung mancher Problem auf der Strecke geblieben. Ein besonderer Dank gilt hier Anna Buschart, die für meine Fragen und Hilfegesuche zu der Auswertung der Arraydaten stets Zeit gefunden hat sowie meinen lieben Büromitinsassen Caroline (Angie) Kanzler und Katja Gremmer, die mich durch wissenschaftliche Diskussionen und praktische Hilfe im Labor unterstützten aber dabei den „überwasserhaltenden“Spaß nicht zu kurz kommen ließen. Das schließt auch meine ehemaligen Büro-Kollegen Bianca Lüderitz und Dörthe Jones mit ein, die mir ihre Hilfe und Unterstützung auch nach den HZI-Zeiten zukommen ließen. (Katja, in 5 Jahren... Plan B steht!) Vielen Freunden möchte ich danken, die ich während dieser 3 Jahre viel zu wenig gesehen habe, die dafür aber immer Verständinis gezeigt haben. Danke, für eure aufbauenden Worte, eure „offenen Ohren“ und die Gewissheit, dass ihr immer da seit, wenn ich euch brauche. Außerdem geht ein großer Dank an alle die, die dazu beigetragen haben, dass ich meine Arbeit unbeschwert und sorgenfrei ausführen konnte, da ich meine Kinder in liebevoller Obhut wusste. Dies gilt insbesondere für Gabi, Swenja und Sabine aus dem Kindergarten der Lebenshilfe. Danke, dass ihr nie über meine akademische Viertelstunde des Zuspätkommens geklagt habt. Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern, meine Schwester und Familie sowie an meine Schwiegereltern. Danke, dass ihr mich mit eurem Vertrauen, euren Worten und eurer Hilfe in den letzten Jahren unterstützt habt. Ohne die Gewissheit, euch im Rücken zu haben, hätte ich diesen Weg nicht gewagt. Gleicher Dank gilt meinen Kindern Nele und Meike und ganz besonders Tim, für seine Geduld und Hilfe sowie seine verordneten Zwangspausen. Ich danke euch, dass ihr mich auf diesem Weg begleitet und unterstützt habt und immer für mich da seid. Lebenslauf Persönliche Daten Vor- und Nachname Daniela Evers (geb. Wild) Geburtsdatum/ -ort geboren am 11.07.1977 in Berlin Familienstand verheiratet, 2 Kinder Staatsangehörigkeit Deutsch Schulausbildung 1991 - 1994 Käthe-Kollwitz-Gymnasium Berlin 1994 - 1997 Hölty-Gymnasium Wunstorf Abschluß: Abitur Studium 09/1997 - 01/2003 Studium der Biologie an der Technischen Universität Carola-Wilhelmina zu Braunschweig Vorprüfung: 15.10.1999 Hauptstudium: Hauptfach: Mikrobiologie, Nebenfächer: Zellbiologie, Botanik, Zellbiologie, Ökologie Diplomarbeit an der GBF Braunschweig in der Abteilung Mikrobielle Pathogenität und Impfstoffforschung Arbeitsgruppe Prof. Dr. Hammerschmidt: „Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Plasminogenbindungsproteins Enolase von Streptococcus pneumoniae“ Abschluß: Diplom 173 Berufstätigkeit 03/2003 - 09/2004 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Universitätsklinikum Magdeburg, Institut für Experimentelle Innere Medizin 09/2004 - 03/2009 Elternzeit Geburt des ersten Kindes im Oktober 2004 Geburt des zweiten Kindes im August 2006 04/2009 - 07/2009 Wissenschaftliche Hilfskraft im Institut für Mikrobiologie an der TU-Braunschweig ab 09/2009 Promotion am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH in der Arbeitsgruppe Biologische Systemanalyse zum Thema „Der Einfluss des antimikrobiellen Peptides LL-37 auf Candida albicans und den Infektionsprozess in vitro“
