Finke_rhabdo_reo_birna_WS2016 3 MB

Molekulare Virologie
WS 2016/17
Viren mit negativem ssRNA-Genom
(Rhabdoviren)
Viren mit segmentierter dsRNA
(Reoviren)
(Birnaviren)
Mi 12.10.16
PD Dr. rer. nat. Stefan Finke
Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald - Insel Riems
[email protected]
Nachklausur „Allgemeine Virologie“:
Vor20.10.2016, 15:00 Hörsaal Mikrobiologie
Klausur Molekulare Virologie: 13.02.2017
Nachklausur: 10.4.2017
Seminar: „Neue Entwicklungen in der Virologie“
Donnerstags von 17.15-18.45 Uhr im Seminarraum
des Friedrich Loeffler Institutes für Medizinische
Mikrobiologie, Martin-Luther-Str. 6
Vergabe der Vortragsthemen: 20.10.16
Praktikum:
ganztägiges Blockpraktikum Bachelor
vom 13.03. bis 24.03.2017
am Friedrich Loeffler Institut, Insel Riems
Datum
Thema
Dozent
12.10.16
Umhüllte Viren mit negativem ssRNA-Genom (Rhabdoviren), Viren
mit segmentierter dsRNA (Reoviren)
S. Finke
19.10.16
Umhüllte Viren mit negativem ssRNA-Genom
(Paramyxo-, Filo-, Bornaviren)
26.10.16
Umhüllte Viren mit positivem ssRNA-Genom
(Toga-, Flaviviren)
02.11.16
Umhüllte Viren mit positivem ssRNA-Genom
(Coronaviren)
09.11.16
Umhüllte Viren mit segmentiertem ssRNA-Genom (Orthomyxo-,
Bunya-, Arenaviren)
J. Stech
16.11.16
Viren mit einer reversen Transkriptase (Retroviren)
23.11.16
ssDNA- und dsDNA-Viren ohne Hülle (Parvo-, Papillom-,
Polyomaviren)
J. Stech
R. Ulrich
30.11.16
Hepatitisviren (HCV, HBV, HDV)
J. Stech
07.12.16
T. Mettenleiter
14.12.16
Große umhüllte dsDNA-Viren I (Herpesviren)
Adeno- und DNA-Tumorviren
04.01.17
entfällt
11.01.17
Nichtumhüllte Viren mit positivem ssRNA-Genom (Picorna-, Calici-,
Astroviren)
T. M ettenleiter
18.01.17
Subvirale Pathogene und andere virusähnliche infektiöse Agenzien
T. Mettenleiter
25.01.17
Große dsDNA-Viren II (Pocken-, Baculoviren), Aufbau von
Virusvektoren
R. Ulrich
S. Finke
S. Finke
S. Finke
R. Ulrich
Molekulare Virologie – WS 2015/16
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Ordner: Vorlesung Molekulare Virologie 2016/17
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Besuch der Vorlesung!
Moleculare Virology - Modrow et al.
Principles of Virology - Flint et al.
Fields Virology - Knipe et al.
Umhüllte Viren mit negativem ssRNA-Genom
(Rhabdoviren)
Viren mit segmentierter dsRNA
(Reoviren)
(Birnaviren)
RNA Viren (I)
• genetisches Material: RNA
• 2 mögliche Replikationsstrategien:
– RNA-abhängige RNA Synthese (RNA-Replikation)
– RNA-abhängige DNA Synthese (Reverse Transkription)
dann DNA Replikation und RNA-Transkription
(Retroviren)
• Enzyme
– RNA-abhängige RNA-Polymerase
– Reverse Transkriptase


Viren müssen diese Enzyme kodieren
teilweise Verpackung der Enzyme in Virionen
RNA Viren (II)
• kritischer Schritt: Expression der Gene als mRNAs
• RNA Virus-Taxonomie richtet sich u.a. nach der
Strategie, vom Genom zur mRNA zu kommen
• mRNA: positive Polarität
• komplementärer Strang: negative Polarität
Klassifikation nach Baltimore:
Vom Genom zur mRNA
I:
dsDNA Viren (z.b. AdenoHerpes-, Poxviren)
II: ssDNA Viren (z.b. Parvoviren)
III: dsRNA Viren (z.b. Rotaviren)
IV: (+)ssRNA Viren (z.b. Picorna-,
Togaviren)
V: (-)ssRNA Viren (z.b. Rhabodo-,
Influenzaviren)
VI: ssRNA RT-Viren (Retroviren)
VII: dsDNA RT-Viren (Hepadnaviren)
aus Flint et al. 2004, Principles of Virology
RNA Replikation und Transkription
Genom mit mRNA-Polarität
Protein
Proteinbiosynthese direkt vom
Genom möglich
(+) RNA Viren
+
vRNA
RNA-abhängige
RNA-Polymerase
(-) RNA Viren
RNA-abhängige
RNA-Polymerase
mRNA
Genom komplementär zur mRNA
Protein
Transkription von mRNAs
essentiell für Proteinbiosynthese
Klassifizierung von animalen RNA-Viren
aus Flint et al. 2004, Principles of Virology
Klassifizierung von animalen RNA-Viren
aus Flint et al. 2004, Principles of Virology
Negativ-Strang RNA Viren (NSV)
• genomische RNA negativer Polarität
• Kapsidsymmetrie: immer helikal
(Ribonukleoprotein-Komplex)
• immer behüllt
• RNA-abhängige RNA-Polymerase im Virion
• Genom: segmentiert (Ortho-, Arena und Bunyaviren)
nicht segmentiert (Ordnung Mononegavirales)
• Genomorganisation bei nicht segmentierten NegativStrang RNA Viren (NNSV) konserviert
NSV infizieren unterschiedlichste Wirtsorganismen
Invertebraten
Vertebraten
Arthropode-borne Virus:
Vesicular Stomatitis Virus (VSV; Rhabdoviridae)
Pflanzen
Ordnung Mononegavirales
Viren (-virales) mit nicht-segmentierten (Mono-) RNA Genome negativer Polarität (-nega-)
wichtige Familien, Gattungen und Vertreter
Familie
Gattung
Wichtige Vertreter
Bornaviridae
Bornavirus
Virus der Bornaschen Krankheit
Filoviridae
Marburg-ähnliche Viren
Ebolavirus-ähnliche Viren
Marburgvirus
Ebolavirus
Paramyxoviridae
Respirovirus
Rubulavirus
Morbillivirus
Henipavirus
Avulavirus
Parainfluenzavirus Typ 1/3
Mumpsvirus
Maservirus
Hendravirus, Nipahvirus
Newcastle Disease Virus
Pneumoviridae
Pneumovirus
Metapneumovirus
Respiratorisches Synzytialvirus
Humanes Metapneumovirus
Rhabdoviridae
Lyssavirus
Vesiculovirus
Tollwutvirus (Rabies virus; RABV)
Vesicular Stomatitis (VSV)
Ordnung Mononegavirales
Viren (-virales) mit nicht-segmentierten (Mono-) RNA Genome negativer Polarität (-nega-)
wichtige Familien, Gattungen und Vertreter
Familie
Gattung
Bornaviridae
Bornavirus
Filoviridae
Marburg-ähnliche Viren
Ebolavirus-ähnliche Viren
Paramyxoviridae
Pneumoviridae
Pneumovirus
Metapneumovirus
Rhabdoviridae
Lyssavirus
Ordnung Mononegavirales
Viren (-virales) mit nicht-segmentierten (Mono-) RNA Genome negativer Polarität (-nega-)
wichtige Familien, Gattungen und Vertreter
Familie
Gattung
Wichtige Vertreter
Bornaviridae
Bornavirus
Virus der Bornaschen Krankheit
Filoviridae
Marburg-ähnliche Viren
Ebolavirus-ähnliche Viren
Marburgvirus
Ebolavirus
Paramyxoviridae
Respirovirus
Rubulavirus
Morbillivirus
Henipavirus
Avulavirus
Parainfluenzavirus Typ 1/3
Mumpsvirus
Maservirus
Hendravirus, Nipahvirus
Newcastle Disease Virus
Pneumoviridae
Pneumovirus
Metapneumovirus
Respiratorisches Synzytialvirus
Humanes Metapneumovirus
Rhabdoviridae
Lyssavirus
Vesiculovirus
Tollwutvirus (Rabies virus; RABV)
Vesicular Stomatitis (VSV)
Familie Rhabdoviridae
Gattung
Typspezies
Wirt
Cytorhabdovirus
Lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus
Pflanzen
Dichorhavirus
Orchid fleck dichorhavirus
Orchideen
Ephemerovirus
Bovine fever ephemerovirus
Rinder, Arthropoden
Lyssavirus
Rabies Virus
Säugetiere
Novirhabdovirus
Oncorhynchus 1 novirhabdovirus
Fische
Nucleorhabdovirus
Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus
Pflanzen
Perhabdovirus
Perch perrhabdovirus
Fische
Sigmavirus
Drosophila melanogaster sigmavirus
Insekten
Sprivivirus
Carp sprivivirus
Fische
Tibrovirus
Tibrogargan tibrovirus
Stechinsekten, Säuger, Vögel
Tupavirus
Durham tupavirus
Vögel
Varicosavirus
Lettuce big-vein associated varicosavirus
Pflanzen
Vesiculovirus
Indiana vesiculovirus (Vesicular Stomatitis Virus; VSV)
Vertebraten, Insekten
Familie Rhabdoviridae
Gattung
Typspezies
Wirt
Cytorhabdovirus
Lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus
Pflanzen
Dichorhavirus
Orchid fleck dichorhavirus
Orchideen
Ephemerovirus
Bovine fever ephemerovirus
Rinder; Arthropoden
Lyssavirus
Rabies Virus
Säugetiere
Novirhabdovirus
Oncorhynchus 1 novirhabdovirus
Fische
Nucleorhabdovirus
Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus
Pflanzen
Perhabdovirus
Perch perrhabdovirus
Fische
Sigmavirus
Drosophila melanogaster sigmavirus
Insekten
Sprivivirus
Carp sprivivirus
Fische
Tibrovirus
Tibrogargan tibrovirus
Stechinsekten, Säuger, Vögel
Tupavirus
Durham tupavirus
Vögel
Varicosavirus
Lettuce big-vein associated varicosavirus
Pflanzen
Vesiculovirus
Indiana vesiculovirus (Vesicular Stomatitis Virus; VSV)
Vertebraten, Arthropoden
Akzessorische Gene von Rhabdoviren
from: Dietzgen (2012): Morphology, Genome Organisation, Transcription and Replication of Rhabdoviruses; in Rhabdoviruses:
Molecular Taxonomie, Evolution, Genomics, Ecology, Host-Vector Interactions, Cytopathology and Control, Caister Academic Press
Lyssaviren
- Tollwut und tollwutähnlichen Viren > 55,000 lethal human infections / year
~ 10 000 000 humans / year receive Post Exposure Prophylaxe (PEP)
LYSSA was the goddess or daimona (spirit) of rage, fury,
raging madness, frenzy, and, in animals, of the madness of
rabies.
Museum of Fine Arts, Boston, Massachusetts, USA
Tollwut (Rabies)
Ausbreitung über Nervensystem: Augen,
Speicheldrüse, Haut u.a. Organe
Infektion Rückenmark, Hirnstamm,
Cerebellum und andere Hirnregionen
Transport im Rückenmark
Replikation in
Spinalganglien
Virion gelangt in das
periphere Nervensystem
(Replikation im Muskel?)
Virus Inokulation
(Biß/Kratzer)
Tollwut - Rabies
Inkubationszeit: 2 bis 7 Wochen (Monate-Jahre)
Symptome: Kopfschmerz, Gelenksteife, Fieber, Hyperaktivität, Konvulsion,
Hyperventilation, Lähmungserscheinungen, Hydrophobie, Aerophobie,
Schluckkrämpfe, Speichelfluß,Verwirrtheit, bei 20% sog. „stille Wut“,
Lähmung, Koma, Tod durch Atemstillstand
Pathogenese:
Infektion von peripheren Nerven
Retrograder axonaler Transport ins ZNS ( ~ 20 mm/d)
Replikation v.a. im Ammonshorn, Hippocampus, Hirnstamm
Enzephalitis, Myelitis, Zerstörung von Neuronen
spät: Axonal in Augen, Speichel- Hautdrüsen
Prophylaxe:
Vakzinierung expositionsgefährdete Personen mit inaktiviertem
Virus (i.m. 0, 7, 21 d),
Waldarbeiter, Laborpersonal, Reise (Indien, Thailand, Indonesien)
PostexpositionsProphylaxe (PEP):
aktive Immunisierung + passive Immunisierung
wichtig: so frühzeitig wie möglich!
indiziert:
Kontakt mit tollwutverdächtigem Tier
(Tier beibringen!!)
Kontakt mit Inhalt von Fuchs-Impfstoffködern
Louis Pasteur (1885)‫‏‬
Tierpassagen: virus fixe
Rückenmark infizierter Tiere
Inaktivierung durch Trocknung?
 Joseph Meister
Humane Impfstoffe heute:
b-Propiolacton-inaktiviertes
Zellkulturvirus
Orale Immunisierung der Überträger
Köder mit Lebendimpfstoff:
• Attenuierte Rabies Viren
• Rekombinante Vaccinia Viren mit
Tollwutvirus G Gen
Krankheitsverlauf und Post-Exposure-Prophylaxe
from: Rupprecht and Slate (2012): Rabies Prevention and Control: Advances and Challenges; in Rhabdoviruses:
Molecular Taxonomie, Evolution, Genomics, Ecology, Host-Vector Interactions, Cytopathology and Control, Caister Academic Press
Tollwut ist weltweit verbreitet,
kann aber durch Impfungen bekämpft werden
presence of rabies
„rabies free“ in terrestrial animals
„rabies free“ in terrestrial animals and bats
Deutschland mittlerweile
frei von terrestrischer Tollwut
 müsste grün sein
Der Erfolg von Wildtierimmunisierungen
hängt stark vom Wirtsreservoir ab.
Polarfuchs
Polarfuchs
Marderhund
Waschbär
Polar Fox
Rotfuchs
Rotfuchs
Rotfuchs
Skunk
Kojote
Hund
Hund
Hyäne
Fledermaus
Mungo
Hund
Grafuchs
Mungo
Graufuchs
Hund
Hund
Deutschland gilt seit April 2008 als tollwutfrei:
1980:
1991:
1995:
2001:
2004:
6800 Fälle
3500 Falle
855 Fälle
50 Fälle
12 Fälle
seit dem 2.Quartal 2006: in Deutschland keine Fälle von
Tollwut bei Wild- oder Haustieren
aber: 2005 – 2007 insgesamt 32 Fledermaustollwutfälle
sogar: Entdeckung einer neuen Lyssavirus Spezies in
Fledermäusen (Bokeloh Bat Lyssavirus; BBLV)
Weltweite Verbreitung von Fledermaus-Lyssaviren
EBLV-1,
EBLV-2,
BBLV,
WCBV
ARV,
KUV,
IKV
RABV
LBV,
DUVV,
SHIBV
ABLV
Lyssavirus Species
Aravan lyssavirus
Australian bat lyssavirus
Bokeloh bat lyssavirus
Duvenhage lyssavirus
European bat 1 lyssavirus
European bat 2 lyssavirus
Ikoma lyssavirus
Irkut lyssavirus
Khujand lyssavirus
Lagos bat lyssavirus
Wirt
Schutz durch Impfstoff
Fledermaus
Nein
Fledermaus
Fledermaus
Fledermaus
Fledermaus
Fledermaus
Fledermaus
Fledermaus
Fledermaus
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Nein
Nein
Nein
Fledermaus
Nein
Fledermaus ?
Nein
Rabies lyssavirus
Säugetiere (Carnivoren) / Fledermäuse
Ja
Shimoni bat lyssaviurs
Fledermaus
Nein
West Caucasian bat lyssavirus
Fledermaus
Nein
Mokola lyssavirus
Stammen Lyssaviren von Insektenviren ab?
Anpassung an
Fledermaus-Wirt
Fledermaus-Lyssavirus
InsektenRhabdoviren
insektivore
Fledermäuse
terrestrische
Säuger
• Tollwut weltweit verbreitet
• Formen:
>> Urbane Tollwut (Haustiertollwut)
>> Sylvatische Tollwut (Wildtollwut)
• auf Nordhalbkugel überwiegt Sylvatische Tollwut
Europa u. Asien: v.a. Füchse, Wölfe, Dachse

in Westeuropa weitgehend eliminiert (Köderimpfstoffe)

Fledermäuse Reservoir für Lyssaviren
Europäische Fledermaus Lyssaviren Typen 1 und 2 (EBLV-1/2)
Bokeloh Bat Lyssavirus (BBLV)
Rhabdovirus Partikel
Hüllmembran
genomische RNA
Matrixprotein M
Nukleoprotein N
Glykoprotein G
large Polymerase
L
RNP
Rhabdovirus Partikel und Genomorganisation (Rabies Virus)
3‘
N
P
M
G
L
(-)-Strang ssRNA 12 kb RNA; 5 Gene
5‘
Relaxed (nicht kondensiertes) RNP
vs kondensiert
RNP = Ribonukleoprotein
Rhabdovirus Zyklus
rezeptorvermittelte Endozytose
pH-abhängige Membranfusion
Replikation im Zytoplasma
Assembly an Zytoplasmamembran
Primary Transcription and Secondary RNA
Replication/Transcription
1. Entry
2. Release of RNP in Cytoplasm
3. Primary Transcription
4. Virus Protein Synthesis
5. Inclusion Body Formation
6. Secondary Transcription and
RNA replication
7. Virus Assembly / Release
Rabies Virus Zyklus in Neuronen
Rezeptoren: p75NTR
NCAM
nAChR
NCAM: Neural Cell Adhesion Molecule
p75NTR: Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor
NAChR: Nicotinic acetylcholine receptor
Rabies Virus Zyklus in Neuronen
Rabies Virus Zyklus in Neuronen
Rabies Virus Zyklus in Neuronen
• Rezeptorbindung / Internalisation
• Retrograder axonaler Transport entlang
von Mikrotubuli (Dynein vermittelt)
• Primärtranskription / Virusproteinsynthese
• Genomreplikation
• Transsynaptische Ausbreitung neuer
Virionen
Genomorganisation NNSV (Mononegavirales)
3‘
1
2
N
P
3‘
N
C
V
P M
3‘
N
P
M
3‘
N
P
M
NS1 NS2
M
SH
G
F
F
HN
2-1 -2
L
Pneumoviridae, RSV
L
Paramyxoviridae
GP
L
Filoviridae, Ebola
G
L
Rhabdoviridae
Genreihenfolge (N-P-M-G-L) konserviert
Rhabdoviren haben “minimales Genom” (VSV, RABV)
Akzessorische Proteine bei Paramyxo- und Filoviren
Rhabdovirus Transkription und Replikation
lea
lea und
5 mRNAs
P L
3‘ gp
N
P
RNP-abhängige RNA Polymerase
M
N P L
5‘
lea = leader RNA
gp = Genompromotor
agp = Antigenompromotor
G
(-) RNP
L
N P L
agp (+) RNP
Stop-Start Mechanismus: Termination und Reinitiation
an intergenischen Signalsequenzen
1. mRNA Transkription bis
(A)7-Sequenz und stoppt
2. Polymerase gleitet vor und zurück
(polymerase slippage)
 poly(A)-tail und Termination
3. Reinitiation und 5‘-Capping an
der folgenden TranskriptionsStartsequenz
intergenische Sequenz zwischen
Stop- und Startsignalen wird nicht
transkribiert
teilweise Dissoziation der Polymerase
vom Template  Transkriptionsgradient
aus Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press
Rhabdovirus Transkription und Replikation
lea
lea und
5 mRNAs
P L
3‘ gp
N
P
RNP-abhängige RNA Polymerase
M
N P L
5‘
lea = leader RNA
gp = Genompromotor
agp = Antigenompromotor
G
(-) RNP
L
N P L
agp (+) RNP
Rhabdovirus Transkription und Replikation
• sequentielle Transkription monocistronischer,
polyadenylierter mRNAs mit 5’-Cap-Struktur
(Stop-Startmechanismus)
• Transkriptionsgradient
• Virale RNA-Polymerase (P/L) ist sowohl Transkriptase
als auch Replikase
• Ko-replikative Verpackung der neu synthetisierten
genomischen RNA (Ribonukleoprotein-Komplex; RNP)
• RNP-abhängige Polymerase
Relaxed (nicht kondensiertes) RNP
Ribonukleoprotein (RNP):
Nur das RNP, nicht aber die
freie genomische RNA kann
von der viralen RNP-abhängigen
RNA Polymerase als Matrize für
die virale RNA-Synthese
Verwendet werden.
vs kondensiert
Knospung
Matrixprotein
RNP
Kondensierung
• RNP abhängige mRNA Transkription
• RNP abhängige RNA Replikation der genomischen RNA
Rhabdovirus Transkription und Replikation
• RNA-Synthese (Replikation und Transkription) am
nicht kondensierten, relaxierten RNP
• Kondensierung durch Matrixprotein im Zuge der
Virusassemblierung “friert”‫‏‬RNP‫‏‬und‫‏‬damit assoziierte
RNP-abhängige RNA Polymerase ein
• RNP und Polymerase werden in Virionen verpackt
• Infektion neuer Zellen
• Freisetzung relaxiertes (M-loses RNP) ins Zytoplasma
• Primärtranskription durch RNP-assoziierte Polymerase
Polymerase-Template: Ribonukleoprotein (RNP)
RNA ist nur als RNP Template für die RNA-Polymerase
RNP: RNAse resistente Verpackung der genomischen und
antigenomischen Virus RNA durch Nukleoprotein N (9 Basen pro N)
 stabile Genomstruktur
 intermolekulare Rekombinationsereignisse unwahrscheinlich
Structure of nucleoprotein of VSV: Green et al., Science 2006
Polymerase-Template: Ribonukleoprotein (RNP)‫‏‬
Während der RNA-Synthese (Transkription + Replikation) muss die
RNA partiell „entpackt“ werden, damit ein komplementärer RNA
Strang synthetisiert werden kann
 Konformationsänderungen im N-Protein
Structure of RV nucleoprotein with RNA: Albertini et al., Science 2006
Reverse Genetik
Reverse Genetik (reverse genetics)
gezielten genetische Veränderung  Funktion
Klassische Genetik (forward genetics)
Veränderung von Merkmalen  genetische Basis
Gezielte Mutagenese von Rhabdoviren?
Probleme?
Lösung?
Gezielte Mutagenese von Rhabdoviren?

genomische RNA nicht infektiös
keine direkte Translation der Virusproteine vom RNA-Genom
Verpackung des RNA-Genoms in Ribonukleoproteinkomplex
(RNP) essentiell für die RNA-Replikation und Transkription

Rekombination unwahrscheinlich (homolog od. nicht-homolog)
RNP-Struktur des Genoms / RNA-Genom

gezielte genetische Manipulation der Genomsequenz nur
auf DNA-Ebene möglich
Manipulationen auf cDNA (komplementäre DNA)
Transkription der genomischen full length RNA
Rekonstituierung eines RNPs durch in transKomplementierung mit Proteinen, die für die virale RNPReplikation und mRNA-Synthese essentiell sind
Nukleoprotein N
koreplikative Verpackung der
genomischen RNA
Phosphoprotein P
Chaperonfunktion für N / Polymerasekofaktor
Polymerase L
katalytische Untereinheit des RNP-abhängigen
RNA-Polymerasekomplexes P/L
Manipulation von Rhabdoviren
RNA-Genom
Targets für Manipulationen:
cDNA
• Interne Transkriptionssignale
• Terminale Promotoren
RNA (nicht infektiös!) • Genreihenfolge
• Virale Proteine
• Fremdgenexpression (Virusvektor)
RiboNukleoProtein
(RNP)
Recovery of NNSV:
Reconstitution of RNPs inside a cell
N
P
M
G
L
(+) RNA
P L
3‘ gp
N
(+) FL RNA
P M
G
„illegitimate“ N-encapsidation!
N P
L
(-) RNP
L
N P L
5‘
agp (+) RNP
RNP-like?
Fremdgenexpression von Rhabdoviren
CAT Aktivitäten in Zellkultur
Insertion einer zusätzlichen
Transkriptionseinheiten
N
P
M
G
N
P
M
G
L
CAT
L
CAT Aktivitäten in vivo (Mäusehirn)
CAT
STOP START
(Mebatsion et al., 1996)
Fremdgenexpression von Rhabdoviren
keine homologe Rekombination
Insertion einer zusätzlichen
Transkriptionseinheiten
N
P
M
G
N
P
M
G
stabile Expression in vitro und
in vivo
L
CAT
CAT
L
Beispiele für Fremdgenexpression
von NNSV:
Reporter: CAT, luciferase, GFP
viral:
STOP START
HIV gag, env; HCV E1,
E2; Flu HA
zellulär: IFN, Interleukine, CD4,
CXCR4
(Mebatsion et al., 1996)
Umhüllte Viren mit negativem ssRNA-Genom
(Rhabdoviren)‫‏‬
Viren mit segmentierter dsRNA
(Reoviren)
Klassifizierung von animalen RNA-Viren
aus Flint et al. 2004, Principles of Virology
RNA Replikation und Transkription
Protein
(+) RNA viruses
+
vRNA
RNA-abhängige
RNA-Polymerase
(-) RNA viruses
RNA-abhängige
RNA-Polymerase
mRNA
Genom komplementär zur mRNA
Protein
Transkription von mRNAs
essentiell für Proteinbiosynthese
dsRNA Viren
• Virionen haben keine Hüllmembran
(Ausnahme: dsRNA Viren in Bakterien)
•
•
•
•
meist segmentierte Genome
Transkription teilw. in intakten Partikeln
Replikation zytoplasmatisch
viele Viren infizieren Pilze und niedere
Eukaryoten
Viren mit doppelsträngigem (ds) RNA-Genom
1. Familie Reoviridae (segmentiert; 10-12)‫‏‬
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Genus Orthoreovirus (Vertebraten)
Genus Orbivirus (Vertebraten)
Genus Rotavirus (Vertebraten)
Genus Coltivirus (Vertebraten)
Genus Aquareovirus (Vertebraten)
Genus Cypovirus (Invertebraten)
Genus Fijivirus (Pflanzen)
Genus Phytoreovirus (Pflanzen)
Genus Oryzavirus (Pflanzen)
3. Familie Totiviridae (nicht segmentiert)
1.Genus Totivirus (Pilze)
2.Genus Giardiavirus (Protozoa)
3.Genus Leishmaniavirus (Protozoa)
4. Familie Partitiviridae (segmentiert)
1.Genus Partitivirus (Pilze)
2.Genus Chrysovirus (Pilze)
3.Genus Alphacryptovirus (Pilze)
4.Genus Betacryptovirus (Pilze)
5. Familie Hypoviridae (segmentiert)
1.Genus Hypovirus (Pilze)
2. Familie Birnaviridae (segmentiert; 2-3)
1.
•
•
Genus Aquabirnavirus (Vertebraten)
Genus Avibirnavirus (Vertebraten)
Genus Entomobirnavirus (Invertebraten)
6. Familie Cystoviridae (segmentiert, umhüllt)
1.Genus Cystovirus (Bacteria)
Familie Reoviridae
Genus
Segmente
Wirt
Vector
Orthoreovirus
10
Mammals
None
Orbivirus
11
Mammals
Mosquitoes, flies
Rotavirus
11
Mammals
None
Coltivirus
12
Mammals
Ticks
Seadornavirus
12
Mammals
Ticks
Aquareovirus
11
Fish
None
Idnoreovirus
10
Mammals
None
Cypovirus
10
Insect
None
Fijivirus
10
Plant
Planthopper
Phytoreovirus
12
Plant
Leafhopper
Oryzavirus
10
Plant
Planthopper
Mycoreovirus
11 or 12
Fungi
None?
Reovirus Erkrankung
• REO- Respiratory Enteric Orphan virus
• Humane Reoviren oft assoziiert mit respiratorischen
Erkrankungen, besonders bei Kindern
• Rotavirus (lat. Rota: das Rad): Diarrhöe bei Kindern
• Bluetongue virus: Blauzungenkrankheit bei Wiederkäuer,
hauptsächlich Schafe
Rotaviruses are Major Causes of Diarrhea
Rotavirus ranks 6th among the worlds global killers
•
schwere Gastroenteritis
Vermehrung in Dünndarmzotten  Nekrosen  Malabsorption
•
entdeckt 1973 in Menschen
•
Transmission: fäkal-oral
•
jährlich 125 Millionen Diarrhöe-Fälle weltweit
•
20 Millionen Klinikbesuche, 2 Millionen Hospitalisierungen
•
Bis zu 600 000 Todesfälle jährlich (meist Kinder)
•
Inkubationszeit: 1 bis 2 Tage
•
Dauer: 1 Woche
•
Behandlung: Rehydratation (bes. Kinder)
•
Impfung von STIKO empfohlen (attenuierter Impfstoff, Schluckimpfung)
weltweite Verteilung der Todesfälle ist wie folgt:
( nach Glass et al., Nat Med 1997;3:p10-11)‫‏‬
Gemeldete Rotavirus-Infektionen in Deutschland
Blauzungenvirus
(Bluetongue Virus)
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•
•
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Familie Reoviridae, Genus Orbivirus
24 Serotypen weltweit
nicht kontagiös
Insect-borne Viruskrankheit
Wiederkäuer: Hauptwirt: Schafe
andere: Rind, Ziege, Rehe
bei Schafen: Morbidität bis zu 100%
Mortalität 0 – 50%
Klinische Symptome
• Schleimhauterosionen und Geschüre
• Zunge
– geschwollen, heraushängend
– zyanotische = “Blauzunge”
• Entzündungen am Klauensaum
( Lahmheit)
August 2006:
Blauzungenkrankheit (Bluetongue Disease) erstmals in
Mitteleuropa (Holland, Belgien)
Bis Ende 2006: Nordrhein-Westfalen, Rheinland-Pfalz, Hessen, Saarland
Niedersachsen
Oktober 2007: 16488 gemeldete Fälle
Quelle: FLI Riems
Erreger: Bluetongue Virus Serotyp 8 (BTV 8)
(bisher nur südlich der Sahara / Mittel- und Südamerika / Pakistan)
Überträger: Stechmücken (Gnitzen) der Gattung Culicoides
Einschleppung: unklar (illegaler Import infizierter Tiere oder
Eintrag infizierter Vektoren, beispielsweise
mit Waren oder bei Tiertransporten)
Übersicht der Fälle von Blauzungenkrankheit in Deutschland
01.05.08 – 06.03.2009
Quelle: FLI Riems
Frühjahr 2008: Impfpflicht (inaktivierter Impfstoff)
November 2009: letzter Fall in Deutschland
2010: Aufhebung Impflicht
seit 2012 Deutschland offiziell frei von Blauzungenkrankheit
Orbivirus: Viruspartikel und dsRNA Genomsegemente
Rotavirus: Viruspartikel und dsRNA Genomsegemente
Rotavirus
VP1 (RdRp)
VP2 (IK)
VP3 (IK)
VP4 (AK)
VP5 (AK)
VP8 (AK)
NSP1
VP6 (MK)‫‏‬
NSP3
NSP2
VP7 (AK)
NSP4
NSP5
NSP6
`5‘-GGCA/UA/UUA/UAA/UA/U---
---A/UUG/UU/GG/UA/GCC-3‘
Zelle
Zytoplasma
ZK
• wichtige Vertreter der Reoviridae: Rotavirus
Blauzungenvirus
Orthoreovirus
• Virion: mehrschichtige Proteinhülle
• Genomorganisation: 10-12 dsRNA Genomsegmente
(22-28 kb Gesamtgenom; Segmente von 0.8-4.5 kb)
• jedes Genomsegment enthält individuelle,
konservierte Enden, die für die Verpackung je einer
Kopie eines Genomsegmentes in Virionen verantwortlich ist
• Reassortment bei Doppelinfektion möglich
Orthoreovirus:
2 Hüllproteinschichten
1. äußeres Kapsid
2. Core
Rotavirus: 3 Hüllproteinschichten
Reovirus Entry
• Attachment an Rezeptor über s1
• Endozytose
• Proteolyse und Umlagerungen in
Lysosomen (u.a. Freisetzung von s3)
 Infektiöse Subvirale Partikel (ISVP)
(Membranfusionseigenschaften des µ1Proteins vermutlich vorher maskiert
durch Proteinhülle)
• Freisetzung des Core in das Zytoplasma
Mammalian orthoreovirus 3 structure and genome organization
Electron micrograph
Infectious subviral
particle (ISVP)
Virion
Core
One copy of each
dsRNA per particle
Core
Core
turret
Core
RdRp
Methyltransferase,
guanylyltransferase
Helicase
Core
NTPase
Outer
capsid
Nonstruct.
Membrane
penetration
Outer
Core Non- Outer
capsid
struct. capsid
Attachment
Assembly?
Subcellular
localization
Modified from Flint et al., Principles of Virology 2nd Ed., ASM Press
dsRNA 1
dsRNA 2
dsRNA 3
dsRNA 4
dsRNA 5
dsRNA 6
dsRNA 7
dsRNA 8
dsRNA 9
dsRNA 10
Reoviruses contain
exactly one segment of
each of the 10-12
segments of dsRNA
that constitute the viral
genome, encapsidated
in a single complex
virus particle
comprised of 6-8
proteins
Modified From Alan Cann by BIH
mRNAs are likely
transcribed at the
transcription
complexes at each
of 12 vertices of the
icosahedral particles
Modified From Alan Cann by BIH
Capped, methylated
mRNAs are transcribed
by reovirus core
particles
Modified From Alan Cann by BIH
ReovirusEntry / Transkription / Replikation
• proteolytische Prozessierung des äußeren Kapsids:
 Infectious subviral particle (ISVP)
• kein Uncoating, Genomsegmente verbleiben im Core
• mRNA = (+)-Strang der dsRNA Helix; 5’-Cap; nicht
polyadenyliert
• Replikation, 5’-Capping und mRNA-Transkription
innerhalb der Core-Partikel
• Wichtige Studien mit Reoviren:
– Entdeckung des mRNA-Cappings (Aaron Shatkin)
– Translationsinitiation (Marilyn Kozak)
Viren mit doppelsträngigem (ds) RNA-Genom
1. Familie Reoviridae (segmentiert; 10-12)
•
•
•
•
•
•
•
•
Genus Orthoreovirus (Vertebraten)
Genus Orbivirus (Vertebraten)
Genus Rotavirus (Vertebraten)
Genus Coltivirus (Vertebraten)
Genus Aquareovirus (Vertebraten)
Genus Cypovirus (Invertebraten)
Genus Fijivirus (Pflanzen)
Genus Phytoreovirus (Pflanzen)
Genus Oryzavirus (Pflanzen)
3. Familie Totiviridae (nicht segmentiert)
1.Genus Totivirus (Pilze)
2.Genus Giardiavirus (Protozoa)
3.Genus Leishmaniavirus (Protozoa)
4. Familie Partitiviridae (segmentiert)
1.Genus Partitivirus (Pilze)
2.Genus Chrysovirus (Pilze)
3.Genus Alphacryptovirus (Pilze)
4.Genus Betacryptovirus (Pilze)
5. Familie Hypoviridae (segmentiert)
1.Genus Hypovirus (Pilze)
2. Familie Birnaviridae (segmentiert; 2-3)
1.
•
•
Genus Aquabirnavirus (Vertebraten)
Genus Avibirnavirus (Vertebraten)
Genus Entomobirnavirus (Invertebraten)
6. Familie Cystoviridae (segmentiert, umhüllt)
1.Genus Cystovirus (Bacteria)
Familie Birnaviridae
1.Genus Aquabirnavirus
Virus der infektiösen Pankreasnekrose
der Salmoniden
Aalvirus
Yellowtail Ascites Virus
2.Genus Avibirnavirus (Vertebraten)‫‏‬
Virus der infektiösen Bursitis
3. Genus Entomobirnavirus (Invertebraten)‫‏‬
Drosophila X-Virus
Infektiöse Bursitis
(IBD)
Harderian
gland
Thymus
Gut
tonsilles
Spleen
• IB ist eine hoch kontaktiöse Erkrankung
Bursa
Fabricii
Bone
marrow
• IB ist eine immunsuppressive Erkrankung junger Küken
(hämorrhagische Inflammation der Bursa fabricii, Enteritis,
Blutungen in der Muskulatur)
• IB wird durch das Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) verursacht .
• Die Bursa Fabricii ist das Organ, dass die stärksten morphologischen
Veränderungen erfährt (primäres lymphatisches Organ
 Differenzierung von T- und B-Lymphozyten)
Genomorganisation Birnaviridae
Birna = Bi RNA = zwei Genomsegmente
Segment A
5‘-NKR
VP5
VP2 - VP4 - VP3
3‘-NKR
Segment B
5‘-NKR
VP1
3‘-NKR
Segment A
VP5
Polyprotein
?
1. Cleavage by VP4
pVP2
VP4
VP3
2. Cleavage by ?
VP2c
VP2
VP4
VP3
Strukturprotein Protease Strukturprotein
Segment B
VP1
RNA-abhängige RNA-Polymerase